PT1597382E - Células e mamíferos não humanos geneticamente modificados - Google Patents
Células e mamíferos não humanos geneticamente modificados Download PDFInfo
- Publication number
- PT1597382E PT1597382E PT04714849T PT04714849T PT1597382E PT 1597382 E PT1597382 E PT 1597382E PT 04714849 T PT04714849 T PT 04714849T PT 04714849 T PT04714849 T PT 04714849T PT 1597382 E PT1597382 E PT 1597382E
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- human
- cell
- endogenous
- genetically modified
- mammal
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 177
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 214
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 106
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 76
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 76
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 76
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 75
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 57
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 52
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 claims description 49
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 43
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 43
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 42
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 32
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 28
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 28
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 25
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 23
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 20
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 17
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 10
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 10
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 10
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 9
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 121
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 50
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 29
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 17
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 16
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 description 14
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 3
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 102100030886 Complement receptor type 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 2
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150067056 Epsilon gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000854886 Homo sapiens Immunoglobulin iota chain Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100020744 Immunoglobulin iota chain Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102220483064 Metabotropic glutamate receptor 8_F21C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710193739 Protein RecA Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 101150076615 ck gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
CÉLULAS E MAMÍFEROS NÃO HUMANOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Esta invenção refere-se a mamíferos não humanos geneticamente modificados, em particular a roedores geneticamente modificados tais como ratinhos, que não codificam para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina endógena. A invenção também se refere a células não humanas geneticamente modificadas, particularmente células estaminais embrionárias, especialmente células de roedores, tais como células de ratinhos, que não codificam para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina endógena. A invenção também se refere a células não humanas geneticamente modificadas, particularmente células estaminais embrionárias e aos mamíferos não humanos geneticamente modificados daí produzidos, e à sua utilização na produção de células e mamíferos não humanos dos quais todos os genes da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena (de Cp a Ca) foram deletados do genoma.
Esta invenção refere-se ainda a mamíferos não humanos geneticamente modificados, em particular a roedores tais como ratinhos geneticamente modificados, nos quais a deleção dos genes da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena foi usada para permitir a inserção de outros genes, tais como genes de imunoglobulina exógenos ou segmentos destes, para assegurar e permitir a expressão do gene específico para o locus da cadeia pesada da imunoglobulina. Além disso, a invenção refere-se à expressão de tais genes produzidos por tais mamíferos, e à utilização de tais animais ou suas células na produção de sistemas imunitários 1 modificado com ênfase particular na produção de imunoglobulinas ou anticorpos.
Além disso, a invenção refere-se a mamíferos não humanos sem quaisquer genes da região constante endógenos cruzados com mamíferos não humanos compatíveis capazes de expressar genes de imunoglobulina exógena seja na forma de entidades rearranjadas introduzidas ou entidades na configuração de linha germinal e em fragmentos cromossómicos de grandes dimensões tais como BACs, YACs e HACs (cromossomas artificiais bacterianos, de levedura e humanos). Os transgenes e locus transgénicos podem ser de ADN humano.
Antecedentes da Invenção A estrutura básica de um anticorpo (imunoglobulina) é uma unidade de quatro polipéptidos, formadas por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves mantidas juntas através de ligações dissulfureto entre as cadeias. Cada cadeia é formada por uma região constante e uma região variável; VL e CL são os termos genéricos para estas regiões na cadeia leve, VH e CH especificam as regiões variável e constante da cadeia pesada. Num anticorpo convencional, cada par de cadeias pesadas é idêntico assim como cada par de cadeias leves.
As imunoglobulinas (Igs) são agrupadas em classes ou isotipos (com referência à região constante) na base da estrutura da sua região constante da cadeia pesada (CH) . Em humanos e em ratinhos, existem cinco classes: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. As subclasses adicional em humanos são IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2 e em ratinhos IgGl, IgG3, IgG2a e IgG2b. 0 isotipo é definido pelos genes C distintos (μ, δ, γ, ε, α) 2 que são característicos para uma espécie de mamíferos particular e estão presentes em todos os membros daquela espécie. No entanto, podem existir diferenças, geralmente mutações pontuais ou pequenas alterações, em genes da imunoglobulina entre membros de uma espécie (por exemplo, ratinhos BALB/c versus ratinhos C57/B16). Estas diferenças definem determinantes alotípicos. Encontram-se determinantes alotípicos nas imunoglobulinas (Igs) de alguns, mas não todos, os membros de uma espécie particular (por exemplo, mus musculus). Determinantes alotípicos reflectem o polimorfismo genético da região constante da cadeia pesada de Igs no interior de uma espécie e foram usados como marcadores genéticos. Os anticorpos que permitem o reconhecimento de determinantes isotípicos foram estimulados através da injecção de imunoglobulinas de uma espécie noutra espécie (por exemplo, IgM humana num ratinho) ou entre membros de espécies que lhes permite produzir anticorpos anti-alotípicos (MALB/c IgMa em C57/B16 que produzem IgMb) .
As regiões constantes da cadeia leve existem em formas isotípicas (k) e (λ) , estas cadeias leves podem potencialmente associar-se a todos os isotipos de cadeia pesada. As cadeias leves num dado anticorpo são idênticas, pelo que as imunoglobulinas têm ou as cadeias leves κ ou λ, mas não cadeias leves mistas, a não ser que o anticorpo tenha sido modificado artificialmente.
Existem determinantes idiotípicos como resultado de estruturas únicas geradas pelas sub-regiões hipervariáveis (ou regiões determinantes de complementaridade, CDRs) nas regiões variáveis de cadeia leve (L) e pesada (H) e foram identificadas por variabilidade de sequência. 3
Foram desenvolvidas técnicas para a produção de anticorpos monoclonais utilizando células derivadas de pequenos animais de laboratório, tais como ratinhos Kõhler, G. & Milstein, C. 'Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. ' Nature 256, 495-497 (1975).) que descreveram pela primeira vez a produção de anticorpos monoclonais através da fusão de uma célula formadora de anticorpos individual com uma célula-B tumoral para produzir um clone de células que se divide constantemente (uma linha celular de hibridoma) dedicada á produção de um anticorpo particular (anticorpo monoclonal).
Um anticorpo monoclonal (mAb) tem a capacidade de reconhecer uma estrutura ou uma sequência definida ou de se ligar a um epitopo especifico. Assim, um anticorpo monoclonal pode ser usado unicamente para identificar moléculas que têm o epitopo específico ou podem ser dirigidas, isoladamente ou em conjunto com outra porção, para um locus específico para diagnóstico ou terapia. A utilização de anticorpos monoclonais como agentes terapêuticos foi restringida pelo desenvolvimento de uma resposta anti-imunoglobulina no indivíduo tratado. Uma vez que a sequência da região constante é especifica para a espécie a partir da qual é produzido o anticorpo, a introdução de um anticorpo estranho (xenogénico ou exógeno) no sistema vascular do hospedeiro pode produzir uma resposta imunitária. Quando o anticorpo xenogénico é introduzido repetidamente, por exemplo no tratamento de doenças crónicas, torna-se impraticável administrar o anticorpo, uma vez que uma é provocada uma resposta imunitária e resultará na eliminação da eficiência do alvo de acção do anticorpo 4 administrado através da geração de efeitos secundários extremos, tais como choque anafilático. Por esta razão, foram realizados vários esforços para "humanizar" anticorpos de roedores já utilizados com sucesso para intervenção terapêutica e, mas recentemente, para estabelecer ratinhos transgénicos que produzem anticorpos totalmente humanos (Bruggemann, M. e Taussig, M.J. (1997) Production of human antibody repertoires in transgenic mice. Curr. Opin. Biotechnol., 8 455-458). A produção de animais transgénicos foi revolucionada por técnicas que permitem a cultura de células estaminais embrionárias murinas e pela introdução de modificações genéticas nestas células que podem ser transmitidas à linha germinal de ratinho. Os genes endógenos podem ser modificados e podem ser introduzidos genes estranhos (exógenos), tais como genes humanos, num hospedeiro para proporcionar estirpes de animais capazes de produzir produtos novos tais como proteínas de ligação xenogénicas (estranhas), em particular imunoglobulinas.
Como alternativa à utilização de bibliotecas artificiais, é possível criar animais transgénicos com locais de imunoglobulina humanos, na configuração da linha germinal, em antecedentes genéticos nos quais os locais Ig endógenos são deficientes. 0 silenciamento dos genes de imunoglobulina foi levado a cabo através da inserção de genes e da remoção de genes utilizando a introdução de construções dirigidas para genes em células estaminais embrionárias (Bot, A., Immunoglobulin deficient mice generated by gene targeting as models for studying the immune response. Int. Rev. Immunol., 13, 327-40,1996; Loffert et al, Early B-cell development in 5 the mouse: insights from mutations introduced by gene targeting. Imm. Rev. 137, 135-53, 1994) . Nestes animais, mostrou-se que os locais introduzidos podem substituir a função de genes silenciados; são expressos e, para genes da imunoglobulina, são rearranjados com eficiência similar àquela dos genes silenciados. A ontogenia dos linfócitos B é iniciada através do rearranjo do ADN e da expressão de IgH de superfície. Na fase inicial da diferenciação, a cadeia Η μ é associada como um preBCR (receptor de células-B) com a cadeia L sucedânea, consistindo em VpreB e X5, que é substituída pela cadeia L convencional para formar um BCR na fase de célula B imatura. A isto segue-se a expressão de IgM e IgD à superfície de uma célula-B madura com desenvolvimento suplementar na periferia para uma célula de plasma que secreta anticorpos que foi trocada de Cy para outro gene C, γ, ε, ou α, enquanto manteve a sua região V (variável) original.
Briiggemann et al (PNAS 1989; 86: 6709 - 6723) descrevem a produção de ratinhos com um mini-locus da cadeia pesada humana com elementos variável (V) , de diversidade (D) e de junção (J) de Ig não rearranjados, ligados a um gene μ constante de cadeia pesada humana, que codifica para o isotipo da imunoglobulina IgM. Os genes da imunoglobulina estranhos (humanos) são inseridos na linha germinal do ratinho transgénico, com o resultado de que a inserção estranha está presente além dos genes Ig endógenos. Nestes ratinhos, os genes estranhos podem se rearranjar para codificar para um repertório de imunoglobulinas do isotipo IgM. 6 0 trabalho desenvolvido por Bruggemann et al (ibid) é também descrito na Patente US No. 5,545, 807 que se refere a um método para a produção de uma imunoglobulina obtida a partir de células ou fluido corporal de um animal transgénico que tinha inserido na sua linha germinal material genético que codifica para pelo menos parte de uma imunoglobulina de origem estranha ou que se pode rearranjar para codificar para um repertório de imunoglobulinas. Aí, é sugerido que "pode ser conveniente utilizar um animal hospedeiro que inicialmente não contenha material genético que codifique para regiões constantes da imunoglobulina de modo que o animal transgénico resultante apenas utilize apenas o material genético estranho quando produz as imunoglobulinas. Isto pode ser conseguido ou através da utilização de um mutante que ocorra naturalmente e não possua o material genético relevante ou, através da produção artificial de mutantes, por exemplos em linhas celulares com o objectivo final de criar um hospedeiro do qual o material genético relevante tenha sido removido." No entanto, não é feita qualquer sugestão relativamente ao modo como proporcionar um tal animal hospedeiro deficiente em IgC e os ensinamentos apenas incidem na inserção de material genético humano; não é fornecido qualquer exemplo no qual a região constante da cadeia pesada de Ig é deletada.
As alterações pretendidas focaram-se em genes da região-C individuais, mas a remoção de Cp, Cõ, ou Cs não alteraram significativamente a progressão do desenvolvimento das células-B [1-3]. Parece que o silenciamento de genes C individuais ou a sua substituição [4,5] tem efeitos reduzidos na progressão do desenvolvimento devido à sua redundância funcional. Do mesmo modo, apesar da remoção da região 7 estimuladora Εμ reduziu o rearranjo do ADN [6,7] e a substituição do estimulador oí3 ' afectou as trocas [8], estas são apenas pequenas perturbações praticamente desprezáveis no desenvolvimento imunitário.
Conseguiu-se evitar a utilização de genes da região C da cadeia H com um bloqueio subsequente no desenvolvimento das células B através de duas abordagens opostas. A remoção dos segmentos J(junção)H eliminou o rearranjo D(diversidade)-J [9,10] e os ratinhos são desprovidos de células Ig+B mas continuam a desenvolver precursores B220+ de células B presentes em níveis algo reduzidos. EP 0 463 151 divulga ratinhos nos quais é removido um fragmento de 2,3 kb do locus da cadeia pesada de ratinho endógena, contendo os genes D e Jl-4, e substituído (através de recombinação homóloga) pelo gene de resistência à neomicina. Os genes IgH C de ratinho endógenos estão presentes no ratinho, mas dado que os genes D e J estão ausentes, o rearranjo do locus não pode ocorrer e a expressão dos genes IgH C endógenos está bloqueada, evitando a produção de uma mensagem funcional que codifique para uma subunidade IgH C.
Kitamura et al [11] (Nature 1991; 350: 423 - 426) descrevem a produção de ratinhos com disrupção na região Cy (ratinhos μΜΤ) . Isto conseguiu-se através de alvejamento genético, no qual se inseriu um fragmento genómico de 9 kb de Cy e Cõ, com um codão de terminação e flanqueado por um gene de resistência à neomicina 5' e um gene tk HSV 3', nos exões da membrana de Cy utilizando células estaminais embrionárias. As células ES foram utilizadas para gerar animais quiméricos, os 8 quais foram cruzados para obter ratinhos heterozigóticos e depois homozigóticos para a região Cy com disrupção. Os ratinhos homozigóticos para o exão transmembranar Cy com disrupção foram deficientes para Ig. 0 desenvolvimento das células B é dependente da expressão de y de superfície na fase pré célula B, mas dado que a expressão de y de superfície não ocorreu em ratinhos com a região Cy com disrupção (mutação yMT), o desenvolvimento de células B foi parado na fase da maturação pré-célula B e assim não se produziram quaisquer células B maduras ou secretoras de anticorpos.
Nas linhas celulares com as regiões JH removidas ou com o disrupção no exão Cy, ocorre algum rearranjo da cadeia L e também parece que os animais com o exão transmembranar Cy com disrupção cruzados para homozigocidade em diferentes estirpes de ratinhos podem em grande medida ultrapassar o bloqueio na expressão de Ig. Isto foi particularmente pronunciado nos antecedentes Balb/c que revelaram expressão de IgG, IgA e IgE em animais "knock-out" homozigóticos [12,13], enquanto que no antecedente C57BL/6 original apenas a IgA foi expressa selectivamente, o que foi interpretado como um reminiscente de um sistema imunitário antigo talvez mais primitivo [14].
Existe o desejo de produzir mamíferos não humanos geneticamente modificados, por exemplo, roedores tais como ratinhos, nos quais os genes IgH endógenos foram silenciados, ou removidos, de modo a produzir anticorpos de origem estranha, expressos por genes introduzidos.
Foram utilizadas diversas abordagens para silenciar (por exemplo, disrupção), ou remover, genes de Ig endógenos 9 únicos, em combinação com a introdução simultânea de um gene humano exógeno.
Pluschke et al (J. Immunol. Methods 1998; 215 (1-2): 27 - 37) utilizaram uma estratégia de alvejamento genético convencional (Stief et al., J. Immunol. 1994; 152: 3378) em células estaminais embrionárias para substituir o segmento de gene constante gama 2a (Cy2a) de IgH de ratinho pelo constante gama 1 (Cyl) de IgH humano; além disso, foram geradas células ES nas quais o segmento do gene kappa de IgL de rato foi substituído pelo seu equivalente humano. As células ES foram usadas para gerar ratinhos quiméricos.
Zou et al (Science, 19 93; 262, 1271 - 1274) descreve um sistema de recombinação Cre-loxP que opera em células de mamífero e que foi usado para experiências de alvejamento genético em ratinhos para gerar deleções "limpas" de genes alvo na linha germinal, assim como para inactivar genes de um modo condicional (com base na expressão regulada da recombinase Cre) .
Cre é uma proteína recombinase de 38 kDa do bacteriófago PI que medeia a recombinação sítio-específica intramolecular (por excisão ou inversão) e intermolecular (integrativa) entre locais loxP; para uma revisão do sistema ver Sauer em Methods of Enzymology; 1993, Vol. 225, 890-900. Um local loxP (o local de entrecruzamento) consiste em duas repetições invertidas de 13 pb separadas por uma região assimétrica de espaçamento de 8 pb. Liga-se uma molécula de Cre por repetição invertida, ou são alinhadas duas moléculas Cre num local loxP. A recombinação ocorre na região assimétrica de espaçamento. Aquelas 8 bases são também responsáveis pela 10 direccionalidade do local. Duas sequências loxP com uma orientação oposta uma em relação à outra invertem a pela de ADN interveniente, dois locais em orientação directa ditam a excisão do ADN interveniente entre os locais, deixando para trás um local loxP. Esta remoção precisa do ADN pode ser usada para eliminar genes (deleção de genes) ou para activar genes. 0 sistema Cre-loxP pode também ser utilizado para introduzir genes (introdução de genes). Um gene flanqueado por dois locais loxP numa orientação directa é referido como um gene "floxed".
Zou et ai (Current Biology 1994; 4: (12) 1099 - 2003) descrevem a utilização do sistema Cre-loxP em células estaminais embrionárias para substituir o gene de ratinho ΟγΙ, que codifica para a região constante da cadeia pesada de anticorpos IgGl, com o gene humano correspondente ΟγΙ. Foi gerada uma construção de alvejamento na qual se clonou um local loxP na extremidade 3' da sequência genética alvo (neste caso ΟγΙ de ratinho) e, numa posição 5' do gene alvo, realizou-se uma inserção (de 5' para 3') de um gene mutante de interesse (neste exemplo, CyI humano), um local loxP, um marcador de selecção negativa (HSV-tk) e um marcador de selecção positiva (neor) . Na construção, os locais loxP estavam na orientação directa. A construção de alvejamento foi introduzida por transfecção em células ES, seleccionaram-se transformantes em G418 por resistência à neomicina. Introduziu-se uma construção Cre nas células transformadas para se conseguir a expressão transiente de Cre. Ocorreu recombinação, ou seja, excisão da sequência entre os dois locais loxP (que codificam para HSV-tk, neor e o gene endógeno alvo Cyl de ratinho) apenas nas células que expressam a recombinase Cre. A sequência Cyl humana situou-se 11 fora dos locais loxP e permaneceu assim inserida no interior do genoma de ratinho. Utilizou-se a selecção negativa usando aciclovir ou ganciclovir para identificar as células nas quais ocorreu a deleção, uma vez que apenas células que não expressam HSV-tk, isto é aquelas nas quais o gene ΟγΙ endógeno de ratinho foi também deletado, foram capazes de sobreviver naqueles meios.
Assim, Zou et al (1994) utilizou o sistema Cre-loxP para introduzir um gene ΟγΙ humano e depois deletar um único gene da região constante da cadeia pesada de Ig endógena, Cyl. Os exões que codificam para as porções transmembranar e citoplasmát ica de ΟγΙ de IgH de ratinho não foram substituídas por sequências humanas, estas foram retidas para minimizar o risco de perturbar a expressão membranar e a sinalização da IgGl humanizada no ratinho. 0 gene ΟγΙ humano introduzido foi transmitido ao longo da linha germinal de ratinho e os ratinhos mutantes resultantes foram cruzados com ratinhos que expressam cadeias leves kappa com uma região constante humana, em vez de uma região constante de ratinho. Os ratinhos homozigóticos para ambas as inserções produzem anticorpos IgGl com cadeia kappa humanizada.
Nicholson et al (J Immunol. 1999; 6888 - 6906) produziram ratinhos que têm transloci de ambas as cadeias leves κ e λ e pesada de Ig humano baseado em YAC com um antecedente em que os loci IgH e Igx endógenos foram inactivados. A inactivação do locus IgH foi conseguida utilizando os ratinhos Cy (mutante μΜΤ) descritos por Kitamura (1991) supra, realizou-se a disrupção da expressão de Igx através da inserção de uma cassete Neo no gene Ck (Zou et al Eur J Immunol 1995, 25, 2154). 12
Um problema técnico abordado por esta invenção é a produção de um mamífero não humano que não é capaz de expressar quaisquer dos seus genes C de IgH e que é deste modo imunodeficiente. Um problema particular abordado pela presente invenção é a produção de um roedor, em particular um ratinho, que é incapaz de expressar qualquer um dos seus 8 genes C de IgG endógenos. Para o conseguir, é necessário gerar um mamífero não humano mutante, em particular um roedor tal como um ratinho, no qual os genes da região constante da cadeia pesada endógena já não estão presentes ou não são funcionalmente activos.
Deste modo, a presente invenção proporciona um mamífero não humano geneticamente modificado ou uma célula de mamífero não humano geneticamente modificada caracterizados por não compreenderem uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina endógena e por estarem presentes uma ou mais sequências de ácidos nucleicos da região Variável Ig H endógena, um ou mais de segmentos Ig H D endógenos, e um ou mais segmentos Ig H J endógenos. A presente invenção proporciona também um mamífero não humano geneticamente modificado ou uma célula de mamífero não humano geneticamente modificada caracterizados por não compreenderem uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina endógena e por estarem presentes todas sequências de ácidos nucleicos das região Variável Ig H, e segmentos D e J.
Descrevemos também um ratinho geneticamente modificado ou transgénico em que as células germinais não têm o locus do 13 gene C da imunoglobulina endógeno. Descrevemos ainda um ratinho transgénico geneticamente modificado ou a sua descendência, em que as células somáticas e germinais não têm o locus do gene C da imunoglobulina.
Num aspecto da invenção, a célula ou o mamífero não humano geneticamente modificado da invenção não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido de locus de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina. Em células e mamíferos não humanos geneticamente modificados preferidos da invenção, todas as sequências de genes da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (IgH C) estão ausentes ou parcialmente ausentes do genoma. Preferentemente, cada um dos genes da região C de IgH endógena está ausente; mais preferentemente, a totalidade da região C endógena (de Cy a Ca) está ausente.
Aqui, define-se endógeno como autêntico, nativo, não estranho e não modificado por engenharia genética tal como por alvejamento genético ou introdução de genes.
Podem ser obtidas células ou mamíferos não humanos geneticamente modificados por deleção dirigida de todas ou de essencialmente todas as sequências de genes de C de IgH endógenas. A deleção pode ser de todos os genes da região de C de IgH endógenos e sequências intervenientes (remoção completa de exão/intrão ou deleção "limpa") ou essencialmente todas as sequências de C de IgH endógenas por deleção de uma parte extensa da sequência do gene da região C de IgH endógena de tal modo que a é evitada a expressão de qualquer um dos genes de C de IgH. A deleção dirigida pode ser realizada através de um processo de recombinação-excisão, por 14
Assim, exemplo por recombinação Cre-loxP. Assim, a invenção proporciona ainda um mamifero não humano transgénico ou geneticamente modificado tal como agui descrito ou uma célula de mamifero não humano transgénica ou geneticamente modificada, preferentemente uma célula estaminal embrionária tal como agui descrita, gue pode ser obtido por um método de recombinação especifica, preferentemente por um método de recombinação Cre-loxP.
Em métodos de recombinação sitio-especificos para deleção dirigida, é excisada uma região de uma seguência de ácido nucleico flanqueada por duas sequências de recombinação sitio-especificas; após a excisão, permanece no genoma uma única sequência de recombinação sitio-especifica. Prefere-se que a sequência de recombinação sitio-especifica seja um local de recombinação sitio-especifico não endógeno (NESSR). Podem ser usados vários métodos para produzir uma célula de mamífero não humano na qual a sequência alvo para deleção, isto é, o locus C de IgH endógeno, é flanqueado por locais NESSR. Num método destes, os locais NESSR são sequencialmente integrados no genoma de uma célula de mamífero não humana, preferentemente uma célula estaminal embrionária, de tal modo que se introduz primeiramente um local NESSR numa célula e integra-se numa extremidade da sequência alvo e segundamente se introduz um local NESSR e integra-se na outra extremidade da sequência alvo. Num método alternativo, os locais NESSR são introduzidos simultaneamente na célula para integração em cada uma das extremidades da sequência alvo. As células com um local NESSR numa ou outra extremidade da sequência alvo podem ser usadas para produzir mamíferos não humanos geneticamente modificados com sequências NESSR presentes no genoma numa ou noutra extremidade da sequência alvo. Um 15 mamífero não humano com um único local NESSR numa extremidade da sequência alvo do locus de C de IgH pode ser cruzado com um mamífero não humano com um local NESSR na outra extremidade da sequência alvo do locus de C de IgH, para produzir descendência com locais NESSR que flanqueiam a sequência alvo. Células com locais NESSR que flanqueiam a sequência alvo do locus C de IgH podem ser usadas para produzir mamíferos não humanos geneticamente modificados com sequências NESSR presentes no interior do genoma que flanqueiam o locus de C de IgH endógeno. A presente invenção proporciona uma célula ou um animal não humano geneticamente modificado com pelo menos uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena presente no genoma a jusante de, ou no interior do último gene do locus C de IgG e/ou a montante de, ou no interior do primeiro gene do locus C de IgG. Numa realização preferida, integram-se dois locais NESSR, preferentemente locais loxP, no genoma a jusante de, ou no interior do último gene do locus C de IgG e a montante de, ou no interior do último gene do locus C de IgG.
Um local NESSR pode estar presente a montante numa posição adjacente ao primeiro gene do locus C de IgH e/ou a jusante numa posição adjacente ao último gene do locus IgH. Por "adjacente a" entende-se que o local NESSR posiciona-se a 5' ou 3' do início do primeiro gene, ou no final do último gene do locus IgH C. Isto implica que o primeiro ou o último gene do locus IgH C é a região codificante mais próxima do NESSR. A invenção proporciona um mamífero não humano geneticamente modificado, ou uma célula de mamífero geneticamente 16 modificada tal como aqui descrito com locais NESSR, que são preferentemente locais loxP, que flanqueiam os genes da região C de IgH, ou inseridos nos genes a cada extremidade dos genes da região de C de IgH. A invenção proporciona um mamífero não humano geneticamente modificado, ou uma célula de mamífero não humano geneticamente modificado no qual estão ausentes os genes de C de IgC tal como aqui descrito e está presente um local de recombinação sítio-específico não endógeno (NESSR) no genoma, preferentemente o local de recombinação sítio-específico não endógeno é um local de recombinação loxP.
Prefere-se que os genes de C de IgH endógeno sejam deletados, mas que seja retida pelo menos uma parte de pelo menos uma sequência estimuladora de C de IgH endógena. Isto tem a vantagem de melhorar a expressão de genes estranhos quando estes são expressos no locus e permite a regulação específica para o locus de genes introduzidos de forma sítio-específica, (por exemplo, usando inserção Cre-loxP utilizando o local loxP remanescente no agrupamento génico de C de IgH deletado) . A retenção de pelo menos uma parte da sequência estimuladora intrónica J-C endógena e/ou pelo menos parte da sequência estimuladora 3' α é particularmente preferida.
Numa célula ou mamífero não humano geneticamente modificado, estão presentes sequências de ácidos nucleicos da região variável H ou dos segmentos D e/ou J de Ig. Numa realização prefere-se particularmente que estejam presentes as sequências de ácidos nucleicos da região variável H e do segmento D e do segmento J de Ig. Numa realização alternativa está presente uma região variável exógena, preferentemente 17 uma região variável de mamífero, mais preferentemente uma região variável humana. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado da invenção pode compreender um ou mais marcadores de selecção integrados no genoma. 0 marcador seleccionável pode ser posicionado a montante de, ou a jusante de, uma sequência de recombinação sítio-específica. Pelo menos um marcador de selecção pode ser integrado no genoma a montante de, e/ou a jusante de, pelo menos uma sequência de recombinação sítio específica não endógena.
Numa realização preferida, a invenção proporciona um mamífero não humano geneticamente modificado, ou uma células de mamífero não humano geneticamente modificada, com um marcador de selecção integrado a montante ou a jusante do primeiro e/ou do último gene de C de IgH endógeno e/ou a montante ou a jusante de uma sequência loxP. 0 marcador de selecção é preferentemente um ou mais de: um gene de resistência à neomicina; um gene de resistência à puromicina; um gene de resistência de higromicina. 0 marcador de selecção pode ser um gene da timidina cinase do vírus herpes simplex.
Um mamífero não humano geneticamente modificado, ou uma célula de mamífero não humano geneticamente modificada tal como aqui descrito pode ter um marcador de selecção diferente em cada extremidade da região C de IgH.
Assim, um mamífero não humano ou uma célula de mamífero não humano, tal como uma célula de roedor, por exemplo uma célula 18 de ratinho, em particular uma células estaminal embrionária de ratinho, pode estar livre do locus da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e pode compreender um ou mais gene(s) que codificam para um marcador de selecção.
Um mamifero não humano geneticamente modificado de invenção pode ser um roedor, murino, ovino, porcino, equino, canino, felino ou semelhante mas é preferentemente um roedor, mais preferentemente murino, preferivelmente um ratinho. Uma células de mamifero não humano geneticamente modificada da invenção pode ser uma célula estaminal embrionária ou um ovócito; e é preferentemente uma célula de roedor, murino, ovino, porcino, equino, canino ou felino, ou semelhante, preferentemente uma célula murina, mais preferentemente uma célula de ratinho. São particularmente preferidos os ratinhos uma vez que o seu repertório imunitário é extenso e são fáceis de manusear e de criar. A presente invenção proporciona um ratinho ou uma célula de ratinho geneticamente modificada na qual todos os 8 genes de imunoglobulina da região constante da cadeia endógenos (μ, δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό, ε e α) estão ausentes, ou parcialmente ausentes na medida em que não são funcionais ou em que os genes δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό e ε estão ausentes e os genes flanqueadores μ e α estão parcialmente ausentes na medida em que são tornados não funcionais, ou em que os genes δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό e ε estão ausentes e α está parcialmente ausente na medida em que é tornado não funcional, ou em que os genes μ, δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό, ε e α estão ausentes e μ está parcialmente ausente na medida em que é tornado não funcional. 19
Por parcialmente ausente significa que a sequência genética da região constante de IgH endógena foi deletada ou teve uma ruptura na medida em que não é codificado qualquer produto funcional do gene de C de IgH endógeno no local C de IgH, ou seja, não poderia ser expresso do locus nenhum produto genético de C de IgH endógeno funcional. A presente invenção proporciona ainda uma célula estaminal embrionária de mamífero não humano (ES) caracterizada pelos genes da região constante de cadeia pesada Ig endógena estarem ausentes ou parcialmente ausentes. Preferentemente, todos os genes da região C de IgH endógenos estão ausentes; mais preferentemente todos os genes de C de IgH endógenos conhecidos estão ausentes.
Numa realização preferida a célula ES é uma célula estaminal embrionária de rato mutante de deleção na qual a totalidade dos 8 genes de imunoglobulina da região constante da cadeia endógenos μ, δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό, ε e α estão ausentes ou parcialmente ausentes na medida em que não são funcionais ou em que os genes δ, γ3, γΐ, Y2a, y2b e ε estão ausentes e os genes flanqueadores μ e α estão parcialmente ausentes na medida em que são tornados não funcionais, ou em que os genes δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό e ε estão ausentes e α está parcialmente ausente na medida em que é tornado não funcional, ou em que os genes μ, δ, γ3, γΐ, y2a, γ2ό, ε e α estão ausentes e μ está parcialmente ausente na medida em que é tornado não funcional. 0 mutante de deleção mamífero não humano, preferentemente um roedor, mais preferentemente um ratinho, pode ser cruzado com um mamífero não humano compatível que é capaz para expressar 20 um ou mais genes de C de IgH funcionalmente activos, preferentemente um ou mais genes de C de IgH humanos funcionalmente activos, por exemplo, um ratinho mutante de deleção pode ser cruzado com um ratinho capaz de expressar um ou mais genes de C de IgH humanos funcionalmente activos. A descendência heterozigótica (Fl) deste cruzamento pode ser intra-cruzada para produzir uma descendência heterozigótica e homozigótica (F2) de um mamífero não humano, preferentemente um ratinho, que não é capaz de expressar os genes de C de IgH endógenos e em vez disso é capaz de expressar apenas gene(s) de C de IgH estranhos, preferentemente humanos.
Tal como ilustrado noutras estirpes de ratinho "knock-out" Ig que expressam transgenes Ig, a presença de genes C pode resultar na produção de cadeias de Ig quiméricas ratinho-humano (isto é, estranhas) através de mecanismos de "trans-switching" ou de "trans-splicing" que juntam segmentos genéticos de diferentes localizações cromossómicas (revisto em Bruggemann e Taussig, Curr. Opin. Biotechn., 8, 455-458, 1997). Assim, uma vantagem de se ter a totalidade ou essencialmente a totalidade da região do gene de C de IgH deletada é que na descendência F2, com e expressando um, por exemplo, locus ou gene de IgH exógeno, o locus do gene de C de IgH não pode ser reactivado para produzir produtos de "switch" ou de "splice" não convencionais. Deste modo, uma vantagem de produzir um animal não humano com genes Ig endógenos silenciados e genes Ig humanos introduzidos é que não podem ser produzidas moléculas mistas (por exemplo IgH de ratinho e IgL humana) e assim a imunização daquele animal permite a produção de anticorpos humanos totalmente específicos. 21 A invenção proporciona um método para a produção de uma células não humana geneticamente modificada compreendendo: (a) (i) a transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento uma seguência de recombinação sítio específica não endógena e um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação, e, (ii) a transfecção de um célula produzida em (a)(i) com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento um marcador de selecção e uma sequência de recombinação sitio especifica não endógena, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação; ou, (b) (i) a transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento uma sequência de recombinação sítio especifica não endógena e um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está presente o 22 marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação, e, (ii) a transfecção de um célula produzida em (b)(i) com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento um marcador de selecção e uma sequência de recombinação sítio específica não endógena, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação; ou, (c) a co-transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH e com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo cada uma das referidas construções de alvejamento uma sequência de recombinação sítio específica não endógena e compreendendo cada uma um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está ou estão presentes o ou os marcadores de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação; e opcionalmente, (d) proporcionar a uma célula obtida em (a) (ii), (b) (ii) ou (c) uma recombinase activa na sequência sítio especifica não endógena e o rastreio de acontecimentos de deleção. 23 A recombinase no passo (d) opcional pode ser proporcionada por um vector de expressão, isto é, através da introdução de um vector de expressão no interior da célula. Num método preferido, a sequência de recombinação sitio especifica não endógena é um local loxP e no passo (d) opcional, a recombinase é uma recombinase Cre. É preferido que as células não humanas geneticamente modificadas sejam uma célula estaminal embrionária ou um ovócito. A célula não humana geneticamente modificada pode ser uma célula de roedor, mais preferentemente uma célula de ratinho.
Pode ser usado qualquer vector de clonagem para gerar a construção de alvejamento, sendo descritas estratégias de clonagem por Sambrook, Fritsch e Maniatis em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Desejavelmente, a construção de alvejamento pode conter um ou mais genes marcadores; são conhecidos marcadores adequados, especialmente adequados são aqueles que permitem para uma selecção positiva. É de particular interesse a utilização do gene para a neomicina fosfotransferase ("neo"), que confere resistência a G418, é também adequado o gene de resistência à puromicina ("puro") ou o gene de resistência à higromicina; são preferidos genes de resistência à neomicina e/ou à puromicina.
Na construção de alvejamento, a montante e/ou a jusante do gene alvo, pode ser um gene que proporciona a identificação de se ocorreu ou não um entrecruzamento duplo homólogo (selecção negativo) . 0 gene da timidina cinase do vírus Herpes simplex (HSV-tk) pode ser usado como um marcador de selecção negativa, uma vez que as células que produzem a timidina cinase pode ser mortas por aciclovir ou ganciclovir.
Uma vez preparada uma construção de alvejamento e removidas quaisquer sequências indesejadas, a construção pode ser introduzida no interior da célula alvo, por exemplo uma célula ES ou um ovócito. Pode ser utilizada qualquer técnica conveniente para introduzir o ADN no interior da célula alvo. Para o alvejamento genético convencional (geralmente construções até 20 kb), introduz-se mais frequentemente o ADN por electroporação (ver Zou et al. , Eur. J. Immunol. , 25, 2154-62, 1995) enquanto que para modificações secundárias, tais como integração mediada por Cre-loxP, pode ser utilizada a electroporação para a integração de construções mais pequenas e outros métodos tais como lipofecção e fusão de células/esferoplastos de leveduras para transferência de ADN mediada por fosfato de cálcio e YACs (cromossomas artificiais de levedura) para fragmentos de cromossoma ou cromossomas artificiais de mamífero que permitiram a integração de várias 100 kb até à gama de Mb. Assim, a electroporação é a técnica preferida para a introdução de pequenos fragmentos de ADN (até 50 kb) na célula alvo, e os outros métodos listados são adequados e talvez vantajosos para a introdução de sequências de ADN maiores (> 50 kb).
Após a transformação ou a transfecção das células alvo, podem ser seleccionadas por intermédio de marcadores positivos e/ou negativos. Tal como indicado anteriormente, podem ser usados marcadores positivos tais como genes de resistência à neomicina e/ou à puromicina. Aquelas células com o fenótipo desejado podem ser ainda analisadas por análise de restrição, 25 electroforese, semelhantes. análise de
Southern blot", PCR, ou
Pode também utilizar-se PCR para detectar a presença de recombinação homóloga. Podem ser utilizados iniciadores de PCR que são complementares a uma sequência no interior da construção de alvejamento, e complementares a uma sequência fora da construção e no locus alvo. As moléculas de ADN são obtidas na reacção de PCR apenas quando ambos os iniciadores são capazes de se ligar às sequências complementares, ou seja, apenas se ocorreu recombinação homóloga. A demonstração dos fragmentos de tamanho esperado, verificada por sequenciação, sustenta a conclusão que ocorreu recombinação homóloga.
Enquanto que a presença do gene marcador no genoma indica que a integração ocorreu, é necessário determinar se ocorreu integração homóloga. Os métodos para o conseguir são conhecidos na técnica, tais como utilizando análise de ADN por hibridação por "Southern blot" para estabelecer a localização da integração. Através da utilização de sondas para tanto o inserto como para as sequências nas regiões 5' e 3' distantes em relação à região flanqueadora em que ocorreria a integração homóloga, pode mostrar-se que se conseguiu o alvejamento homólogo. Uma vantagem é que sondas externas adjacentes ao ADN de alvejamento e locais de restrição introduzidos de novo, por exemplo por intermédio de um gene marcador de selecção, podem ser usados para a identificação da alteração alvo.
Assim, o rastreio, preferentemente por PCR, pode ser usado para confirmar a integração de locais NESSR tais como locais 26 loxP na posição correcta, no mesmo alelo e na orientação correcta (directa) para permitir a remoção do gene por deleção. 0 rastreio usando métodos tais como PCR podem também ser utilizados para detectar eventos de deleção.
Uma célula estaminal embrionária tal como aqui descrita, por exemplo que pode ser obtida pelo método acima, pode ser usada para a produção de um mamifero não humano geneticamente modificado.
Os processos descritos acima podem ser realizados primeiramente para inactivar os loci de cadeia pesada constantes numa célula estaminal embrionária, as células podem então ser injectados em blastocistos do hospedeiro e desenvolverem-se num animal quimérico. São descritos métodos adequados, por exemplo, em Hogan et al, (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., e Lacy, E. (1994). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Press NY) . Os animais quiméricos são cruzados para obter hospedeiros heterozigóticos. Depois, através do cruzamento dos hospedeiros heterozigóticos, pode ser obtido um hospedeiro homozigótico.
Deste modo, a invenção proporciona um método para a produção de um mamifero não humano geneticamente modificado caracterizado por se introduzir uma células estaminal embrionária tal como aqui descrita num blastocisto do hospedeiro e desenvolvida num animal quimérico.
Isto pode ser conseguido através de um método caracterizado por: 27 (a) introduzir uma célula estaminal embrionária não humana tal como aqui descrita num blastocisto de mamifero não humano compatível, e (b) transplantar o blastocisto obtido em (a) numa mãe de acolhimento de mamífero não humano para obter um mamífero não humano quimérico, e opcionalmente, o rastreio para o ou os marcadores de selecção, e/ou sequência ou sequências de recombinação sítio específicas não endógenas, e/ou para deleção de todas ou de essencialmente todas as sequências de genes de C de IgH endógenas.
Um mamífero não humano quimérico produzido por estes métodos podem ser cruzados para obter uma descendência heterozigótica. A descendência heterozigótica pode ser inter-cruzada para se obter uma descendência homozigótica. Assim, a invenção proporciona um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado por se levar a cabo um método da invenção para se obter um mamífero não humano quimérico e se cruzar o referido mamífero não humano quimérico para se obter uma descendência heterozigótica. Proporciona-se ainda um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado por se levar a cabo um método da invenção para se obter uma descendência heterozigótica e inter-cruzar a referida descendência heterozigótica para se obter uma descendência homozigótica.
Um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com a invenção pode compreender: 28 (a) a injecção de um clone de célula ES de mamífero não humano com dois locais loxP tal como aqui descrito num blastocisto de mamífero não humano. (b) o transplante do blastocisto numa mãe de acolhimento de mamífero não humano compatível para obter uma descendência quimérica de mamífero não humano, (c) a selecção opcional para loxP, (d) o cruzamento da descendência para obter um mamífero não humano com dois locais loxP no mesmo alelo, (e) voltar a cruzar um mamífero não humano com dois locais loxP integrados com um mamífero não-humano compatível que expresse Cre, (f) realizar o rastreio da descendência relativamente a mutantes de deleção, preferentemente por PCR, ou (g) gerar mamíferos não-humanos geneticamente modificados, por exemplo, ratinhos, com dois locais loxP integrados num alelo, ou num locus ou em 2 alelos ou loci separados, por cruzamento de ratinhos derivados ou por transgénese ou pela via da célula ES, (h) deleção de locus inter- ou intra-alélico aquando da expressão Cre. A invenção proporciona também um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado pela realização de um método da invenção para obter um mamífero não humano geneticamente modificado homozigótico relativamente à integração de uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena a montante de, ou no interior, do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH e do cruzamento do referido mamífero não humano geneticamente modificado homozigótico relativamente à integração de uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena a 29 montante de, ou no interior, do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH com um mamífero não humano geneticamente modificado compatível homozigótico relativamente à integração de uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena a jusante de, ou no interior, do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH, para obter uma descendência heterozigótica e opcionalmente cruzar a descendência heterozigótica para obter uma descendência homozigótica para ambas as integrações. A descendência homozigótica para ambas as integrações pode ser cruzada com um mamífero não humano compatível capaz de expressar uma recombinase activa na sequência de recombinação sítio-específica não endógena para obter descendência, com deleção do gene de C de IgH, que pode ser opcionalmente rastreado utilizando métodos adequados para detectar a deleção do gene de C de IgH. A ou as sequências de recombinação sítio-específica não endógena podem ser locais loxP e a recombinase uma recombinase Cre. A descendência heterozigótica ou homozigótica para loxP a ambos os loci e pode ser cruzada com um mamífero não humano compatível capaz de expressar a recombinase Cre para obter uma descendência de mamífero não humano que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido do locus da região constante da cadeia pesada de Ig endógena num ou em ambos os alelos.
Um mamífero não humano transgénico capaz de expressar uma recombinase Cre pode ser preparado por micro-injecção de um 30 plasmídeo Cre linearizado num pro-núcleo de mamífero de embriões de mamífero não humanos F1 para produzir uma estirpe de mamífero não humana que expressa Cre.
Usando métodos da invenção aqui descritos pode-se obter um mamífero não humano qeneticamente modificado que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido da reqião constante da cadeia pesada de Ig endógena. Uma ou mais sequências de ácidos nucleicos da região Variável Ig H endógena, de um ou mais de segmentos Ig H D endógenos, e de um ou mais segmentos Ig H J endógenos estarão presentes na descendência, nalguns aspectos a totalidade das sequências de ácidos nucleicos da região Variável Ig H endógena, do segmento D e J estão presentes na descendência. A invenção proporciona um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos, caracterizado por se levar a cabo um método da invenção para obter um mamífero não humano geneticamente modificado da invenção que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido do locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e o cruzamento do referido mamífero não humano geneticamente modificado da invenção que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido do locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, com um mamífero não humano compatível que codifica e que é capaz de expressar um ou mais genes exógenos, para obter uma descendência heterozigótica para o um ou mais genes exógenos, e opcionalmente cruzar a 31 descendência heterozigótica para produzir uma descendência homozigótica para o um ou mais genes exógenos.
Um gene exógeno é um gene que é estranho, ou seja, não nativo, relativamente à célula ou mamífero não humano hospedeiro.
Assim, a invenção pode ser usada para produzir um mamífero não humano que é preferentemente um roedor, mais preferentemente um ratinho, que é capaz de expressar gene(s) estranhos, preferentemente de imunoglobulina humana, através do cruzamento do mamífero não humano geneticamente modificado, tal como aqui definido que não é capaz de expressar os genes de C de IgH (endógenos) funcionalmente activos, com um mamífero não humano compatível, preferentemente um roedor, mais preferentemente um ratinho, que é capaz de expressar um ou mais genes estranhos funcionalmente activos, preferentemente de C de IgH humana. Isto permite a permuta de gene/locus inter-espécie para produzir uma descendência seleccionada (heterozigótica ou homozigótica) com um ou mais genes exógenos funcionalmente activos, preferentemente humanos, das características desejadas num antecedente genético em que os genes correspondentes do mamífero não humano são silenciados ou removidos.
Proporciona-se um método para a produção de uma célula ou de um mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos compreendendo a introdução de um ou mais genes exógenos numa célula de mamífero não humana da invenção que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer 32 polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena. Prefere-se que a célula de mamífero não humana seja uma célula estaminal embrionária ou um ovócito. Quando a célula de mamífero não humana é uma célula ES, prefere-se que o um ou mais genes exógenos sejam introduzidos por transfecção. Quando a célula de mamífero não humano é um ovócito (célula de óvulo) prefere-se que o um ou mais genes exógenos sejam introduzidos por micro-injecção de ADN. Preferentemente, o um ou mais genes exógenos são inseridos no genoma da célula ou mamífero não humano, mais preferentemente o um ou mais genes exógenos são inseridos numa sequência de recombinação sítio-específica não endógena.
Proporciona-se um método alternativo para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos, que compreende a realização de um método da invenção para obter um mamífero não humano da invenção que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e em que estão presentes uma ou mais sequências de ácido nucleico da região Variável de Ig H endógena, um ou mais segmentos D de IgH endógenos, e um ou mais segmentos J de IgH endógenos e o cruzamento do referido mamífero não humano assim obtido com um mamífero transgénico compatível com um ou mais genes exógenos associados com ou flanqueados por uma sequência de recombinação sítio-específica e com uma recombinase activa na sequência de recombinação sítio-específica não endógena para obter uma descendência e opcionalmente realizar o rastreio da descendência para a inserção de um ou mais genes exógenos. 33 É proporcionado outro método alternativo para produzir um mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos, que compreende a realização de um método da invenção para obter um mamífero não humano da invenção que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno e no qual estão presentes todas as sequências de ácido nucleico da região Variável de Ig H, segmentos D e J endógenos e o cruzamento do referido mamífero não humano assim obtido com um mamífero transgénico compatível com um ou mais genes exógenos associados com ou flanqueados por uma sequência de recombinação sítio-específica e com uma recombinase activa na sequência de recombinação sítio-específica não endógena para obter uma descendência e opcionalmente realizar o rastreio da descendência para a inserção de um ou mais genes exógenos.
Nos métodos acima para produzir um mamífero não humano geneticamente modificado ou uma célula de mamífero não humano geneticamente modificada, capaz de expressar um ou mais genes exógenos, prefere-se que a sequência de recombinação sítio-específica não endógena seja uma sequência loxP e a inserção seja por integração Cre - lox P. 0 mamífero não humano geneticamente modificado é preferentemente um roedor, mais preferentemente um ratinho.
De modo a proporcionar a produção de proteínas de ligação xenogénicas (exógenas), num hospedeiro (por exemplo proteínas de anticorpos estranhos), é necessário que o hospedeiro seja competente para proporcionar os enzimas necessários e outros factores envolvidos com a produção de anticorpos (por 34 exemplo, a maquinaria de recombinação celular), enquanto não dispõe dos genes endógenos para a expressão das subunidades de IgC pesadas de imunoglobulinas e é assim incapaz de expressar os segmentos V, D e J remanescentes após rearranjo do ADN. Assim, aqueles enzimas e outros factores associados com o rearranjo, junção, mutação somática e outros da linha germinal, são preferentemente funcionais no hospedeiro. No entanto, uma região natural funcional compreendendo os vários exões associados com a produção de regiões constantes da cadeia pesada da imunoglobulina endógena estarão ausentes /deletados em certas realizações da invenção.
Numa estratégia de deleção e substituição, o material genético exógeno para inserção pode ser produzido a partir de uma fonte de mamífero, preferentemente uma fonte humana, ou pode ser produzida por via sintética. 0 material pode codificar para pelo menos parte de uma imunoglobulina conhecida ou pode ser modificado para codificar para pelo menos parte de uma imunoglobulina alterada. São bem conhecidas técnicas adequadas para estes processos.
No caso da estratégia de deleção e substituição, em que o inserto de ADN xenogénico é de grandes dimensões, poderiam ser inseridos loci de Ig completos (1-3 Mb). A utilização da estratégia de substituição Cre-loxP poderia então permitir a remoção do locus e a inserção de um locus diferente. 0 gene ou genes exógenos são preferentemente um gene de Ig H ou genes de Ig H, mais preferentemente um gene de C de IgH ou genes de C de IgH. 0 gene ou genes exógenos podem ser um gene ou genes humanos, preferentemente o gene ou genes exógenos são genes da região constante de cadeia pesada de Ig humana, 35 mais preferentemente o locus da região constante da cadeia pesada de Ig humana, ou um locus da cadeia pesada de Ig humana, com regiões V, D, J e/ou C.
Em humanos, o locus da cadeia pesada de imunoglobulina está localizado no cromossoma 14. Na direcçao 5' -3 ' da transcrição , o locus compreende um grande agrupamento de genes da região variável (VH) , dos genes da região de diversidade (D) , seguidos pelos genes da região de ligação (JH) e pelo agrupamento de genes constante (CH) . Estima-se que o tamanho do locus seja de cerca de 2500 quilobases (kb) . Durante o desenvolvimento das células B, são justapostos segmentos genéticos descontínuos do local IgH da linha germinal por intermédio de um rearranjo físico do ADN. De modo a se produzir um polipéptido Ig de cadeia pesada funcional, devem ser ligados três segmentos de ADN descontínuos, das regiões VH, D e JH de um modo sequencial específico; VH a DJH, gerando a unidade funcional VHDJH. Uma vez formado VHDJH, produzem-se cadeias pesadas específicas após a transcrição do locus Ig, utilizando como molde a unidade VHDJHCH compreendendo exões e intrões. Existem dois loci para as cadeias leves de Ig, o locus κ no cromossoma humano 2 e o locus λ no cromossoma humano 22. A estrutura dos loci IgL é similar àquela do locus IgH, excepto que a região D não está presente. Após o rearranjo de IgH, o rearranjo do locus da cadeia leve é de modo semelhante levado a cabo pela junção VL e JL da cadeia κ ou λ. Os tamanhos dos loci λ ou κ são cada um 1-3 Mb. A expressão IgH rearranjado e uma cadeia leve Igx ou IgX numa célula B particular permite a geração de moléculas de anticorpo. 36 0 locus das regiões V, D, J e/ou C da cadeia pesada de Ig humana pode estar na configuração da linha germinal, ou pode ser arranjado produtivamente. Na configuração da linha germinal, os exões são espaçados por seguências intervenientes, assim a sequência genética deve ser rearranjada para a expressão dos genes. Quando arranjados produtivamente, as sequências intervenientes foram removidas da sequência genética e assim o rearranjo da sequência genética não é necessário para a expressão do ou dos genes.
Uma célula ou mamífero não humano capaz de expressar um ou mais genes, exógenos, que pode ser obtida por um método aqui descrito pode ser usada na produção de imunoglobulina exógena, preferentemente imunoglobulina humana.
Uma imunoglobulina exógena é uma imunoglobulina que é não nativa relativamente ao hospedeiro mamífero ou à célula na qual é produzida; nalgumas realizações da invenção prefere-se que a imunoglobulina exógena compreende uma região variável de mamífero que é não nativa à célula ou mamífero hospedeiro no qual é produzida, mais preferentemente a região variável de mamífero é uma região variável humana.
Descobriu-se que um mamífero não humano transgénico pode produzir imunoglobulina quimérica ou estranha (derivada de material genético exógeno inserido) em resposta a um imunogénio subsequentemente introduzido no mamífero não humano transgénico. Deste modo, através da introdução de material genético estranho, por exemplo humano, que codifica para substancialmente a totalidade das regiões específicas para a espécie de uma imunoglobulina, pode ser possível estimular o mamífero a produzir imunoglobulina estranha como 37 resposta a qualquer antigénio introduzido no animal. 0 animal transgénico poderia então proporcionar uma fonte bastante útil, conveniente e valiosa de imunoglobulinas a uma grande gama de antigénios. Além disso, não haveria qualquer interferência devido ao polipéptido de C de IgH endógeno ser expresso em simultâneo.
Deste modo, a presente invenção proporciona um método para a produção de uma imunoglobulina exógena compreendendo um método para a produção de uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado da invenção que é capaz de expressar um ou mais genes exógenos, sendo a imunoglobulina uma imunoglobulina exógena relativamente à célula ou ao mamífero na qual é produzida. Num aspecto preferido, a imunoglobulina exógena compreende uma região variável de mamífero que não é nativa relativamente à célula ou ao mamífero na qual é produzida, mais preferentemente a região variável de mamífero é uma região variável humana. Noutro aspecto preferido a imunoglobulina exógena é uma imunoglobulina humana. Quando se utiliza um mamífero não humano numa utilização ou método para a produção de uma imunoglobulina exógena, o mamífero não humano é preferentemente um roedor, mais preferentemente um ratinho. Quando uma célula de mamífero não humano é utilizada numa utilização ou método para a produção de uma imunoglobulina exógena, a célula de mamífero não humano é preferentemente uma célula de roedor, mais preferentemente uma célula de ratinho.
Proporciona-se ainda um método para a produção de um medicamento compreendendo um método da invenção para a produção de uma imunoglobulina exógena. 38
Descrição das Figuras A Figura 1 ilustra a estratégia para a remoção do gene da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Inseriu-se uma sequência loxP a montante de um gene de um marcador de selecção (puromicina) no gene C mais a 5' e outro gene de marcador de selecção (neomicina) a montante de uma sequência loxP foi inserido a jusante do último gene Cot mais a 3' no estimulador 3'. Aquando da expressão Cre, esta estratégia resultou na remoção de uma região de 200 kb com todos os genes C. A Figura 2 ilustra a construção de alvejamento para a região 3', sendo proporcionadas digestões de restrição no lado esquerdo para confirmar a construção correcta. A Figura 3 ilustra um teste de "Southern blot" mostrando os fragmentos da linha germinal (GL) quando hibridam com a sonda 3'ext (erna) indicada. As amostras com integração homóloga ou "knock-out" (KO) produzem um Sad adicional de 10 kb e uma banda BamHI de 4 kb além de uma banda mais fraca da linha germinal para o alelo modificado
As Figuras 4 e 5 ilustram que após a transfecção de ZX3 (ZX3 é uma designação interna para células estaminais embrionárias usando métodos descritos por Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, e E. Lacy. 1994 em Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press), seleccionaram-se e rastrearam-se células estaminais e dos 601 clones de células ES, foi identificado um evento de alvejamento, o 39 clone nO. 355. Além disso, mostra-se a análise por Southern blot do clone 355 do lado esquerdo da Figura 5. A Figura 6 ilustra a construção Cy de alvejamento e a análise de sequência de loxP nas duas construções de alvejamento, que verificaram a sua orientação correcta para permitir a remoção por deleção mediada por Cre de todos os genes C. A Figura 7 ilustra o esquema para integração dirigida e deleção do agrupamento de genes C. A Figura 8 ilustra a análise por "Southern blot" de potenciais 355 homozigóticos (3Έ) do clone ES 255 e do seu cruzamento até homozigocidade. A banda de ~4 kb indica o evento de alvejamento, a banda de ~6,5 kb é a banda da linha germinal e ++ indica a integração dirigida em ambos os alelos. A Figura 9 mostra a célula do clone ES 355 que foi usada para novo alvejamento com o vector de alvejamento Cy. São indicadas sondas externas como A e B. Isto resultou num evento de duplo alvejamento, clone 212. A Figura 10 mostra como se verificou a integração. O clone 212 contém duas integrações alvejadas, a montante e a jusante do agrupamento genético C. A transfecção das células ES com um vector Cre permitiu a análise de deleção e sugeriu que ambos os eventos de alvejamento estavam num alelo. 40 A Figura 11 mostra que dois clones após a transfecção Cre parecem produzir uma banda de PCR usando iniciadores 1 e 4 ilustrados na Figura 7. No entanto, permaneceu uma banda indicando integração dirigida, iniciadores 1 e 2. Isto pode indicar clones mistos ou que a remoção mediada por Cre-loxP não foi conseguida em todas as células dos clones. A Figura 12 mostra a análise por PCR de potenciais ratinhos de transmissão de linha germinal (seleccionados por cor de pelagem) para ambas as integrações dirigidas 3Έ e μ. Inesperadamente, cerca de metade do número de ratinhos de transmissão de linha germinal tinham um alelo com qualquer um dos eventos de alvejamento 5' ou 3', mas não com ambos os eventos. Dos 19 ratinhos, 6 foram negativos, 7 positivos para integração dirigida em 3Έ, 5 positivos para integração dirigida em μ e um foi positivo para ambos os eventos de alvejamento. Como a transmissão de linha germinal foi de cerca de 50% (metade dos ratinhos com a cor de pelagem correcta não apresentavam a modificação alvo) parece que as duas integrações alvo estão num alelo mas que o cruzamento separou com frequência as duas regiões. A Figura 13 ilustra os resultados de análise por PCR de um número mais elevado de potenciais ratinhos de transmissão de linha germinal (seleccionados por cor de pelagem) que resultou na identificação de 7 ratinhos que contêm ambos os eventos de alvejamento 3Έ e μ. Dos 51 ratinhos, 22 foram negativos, 14 positivos para integração dirigida em 3Έ, 7 positivos para integração 41 dirigida em μ e 7 foram positivos para ambos os eventos de alvejamento 3Έ e μ. A Figura 14 mostra o esquema de análise por PCR do ratinho de "knock out" (deleção) de IgHC. A Figura 15 mostra os resultados de análise por PCR da descendência de primeira e segunda geração obtida após cruzamento de dois ratinhos de transmissão de linha germinal com ambos os eventos de alvejamento, μΐ0Χ e 3'Elox, com animais Cre+. A Figura 16 apresenta os resultados de análise por citometria de fluxo de células da medula e do baço para ratinhos homozigóticos CA (deleção IgHC). A Figura 17 ilustra (A) os resultados da análise de rearranjos D-J e V-D-J por PCR, realizados para testar o envolvimento do locus IgH no rearranjo do ADN de células de medula óssea, e (B) análises transcricionais por RT-PCR num só passo do ARN preparado a partir de células da medula óssea e RT-PCR num só passo. A Figura 18 mostra os resultados de ELISA realizada a cabo em soro de ratinhos Fl, CA e μΜΤ; no soro de ratinhos CA, não se encontrou a presença de qualquer Ig ou de fracções individuais de IgM, IgG ou IgA.
Exemplos
Exemplo 1: Preparação da construção de alvejamento para a região 5' Cp 42
Uma biblioteca de fagos λ, obtida do ADN da célula ES (estaminal embrionária) E14 (Sambrook, Frisch, Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), foi hibridada com um fragmento BamHI de 4,5 kb compreendendo Cy (Zou et al, Int. Immunol. 13, 1489-1499, 2001), vários clones positivos foram identificados e mapeados. Os métodos de hibridação estão bem documentados na literatura e são conhecidos pelos investigadores competentes na técnica.
Adicionou-se um local loxP ao gene da puromicina (Tucker et al., Genes Dev., 10, 1008-1020, 1996) por PCR (iniciador no sentido directo oligo BamHI-loxP-puro: 5 ' TTTGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGACCTCGAAAT-TCTACCGGG3' (SEQ ID NO: 1) e iniciador no sentido inverso oligo BcII-puro: 5' TTTGATCAGCTGATCTCGTTCTTCAGGC 3' (SEQ ID NO: 2) que permitiu recuperar loxP-puro num fragmento BamHI-BclI). O fragmento de ~6,5 kb de JH3/4 a Cyl e o fragmento de -5,5 kb de Cy2 a Cõ foram ligados com um gene de resistência à puromicina-loxP num fragmento -2 kb BamHI-BcII (ver Figura 6) . A construção de alvejamento para Cy (ylox) foi construída através da subclonagem de fragmentos BamHI-BglII em pUC19 (Invitrogen). O local 3’ EcoRI foi substituído por Notl usando digestão parcial e inserção de um agente de ligação de extremidades cegas. Na construção de alvejamento 5' resultante para Cy, foi inserida uma sequência loxP a montante de um marcador de selecção (puromicina) que foi inserido no gene Cy. 43
Exemplo 2: Preparação da construção de alvejamento para a região <x 3' A biblioteca de fagos λ (ver acima) , obtida a partir de ADN de células ES (estaminais embrionárias) E14 foi hibridada com um fragmento BglII de 3,5 kb compreendendo o estimulador α 3' de rato (Pettersson et al, Nature, 344, 165-168, 1990) e foram identificados e mapeados vários clones positivos. A região estimuladora a. 3' num fragmento -9 kb Saci foi clonada em pUC19 e o local interno EcoRV foi alterado para Spel através da digestão parcial e inserção do agente de ligação de extremidades cegas. Este local único permitiu a integração de um gene ~1,3 kb Neomicina-loxP num fragmento Nhel compatível (ver Figura 2). Adicionou-se um local loxP ao gene de resistência à neomicina (Stratagene, La Jolla, CA) por inserção de extremidade cega de loxP de pGEM-30 (Gu, H., Y.-R. Zou, e K. Rajewsky. Cell, 73, 1155-1164, 1993) e por inserção de um oligonucleótido (Sauer, Mol. Cell. Biol., 7, 2087-2096, 1987) na construção de alvejamento cx3' (3'Elox) a jusante do gene da neomicina.
Exemplo 3: Confirmação da orientação dos locais loxP A orientação correcta do local loxP em cada construção e alvejamento foi verificada por sequenciação de ADN (ver Figura 6). Os locais loxP devem estar na mesma orientação linear relativamente uns aos outros de modo que aquando da inserção dirigida de ambos os locais loxP mediados por Cre possa ser obtida a remoção por deleção. Aqui, isto permite a remoção de ambos os genes dos marcadores de selecção 44 inseridos e a região entre Cp e o estimulador 3'a na extremidade do agrupamento de genes C.
Exemplo 4: Preparação das células ES
As células ZX3 ES, obtidas a partir da estirpe de ratinho 129 sv foram produzidas usando os métodos descritos por Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, e E. Lacy. 1994 em Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. ZX3 é uma designação interna para estas células estaminais embrionárias murinas obtidas por Zou Xiangang na sua 3_a tentativa.
Exemplos 5: Transfecção de células ES e hibridação de Southern A construção de alvejamento Cp foi linearizada utilizando BamHI e Notl e a construção de alvejamento do estimulador cx3' foi linearizada com BglII e EcoRV (ver Figura 3) . Para cada construção em separado, misturou-se cerca de 10 pg de fragmento purificado (kit de purificação #28304, Qiagen, Crawley, West Sussex, Reino Unido) com ~107 células ES ZX3, obtidas da estirpe de ratinho 129sv, e submetida a electroporação e selecção tal como descrito (Zou et al, Eur. J. Immunol., 25, 2154-2162, 1995; Zou et al, Int. Immunol. 13, 1489-1499, 2001). Preparou-se ADN de clones resistentes a G418 (Neor) para a construção do estimulador α 3' e analisou-se em "Southern blots" tal como descrito (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Isto permitiu a identificação de um clone alvejado correctamente (355) para ser usado para introdução de Cp, construção e selecção com puromicina gue 45 resultou num clone alvejado directamente (212) identificado com a inserção correcta em Cp e o estimulador 3'oí.
As sondas de hibridação foram um fragmento EcoRV-SacI externo 3' ~0,4 kb para o estimulador α 3' (ver Figura 5) e as sondas externas 5' e 30 para Cp, descritas em Zou et al. , Int. Immunol. 13, 1489-1499, 2001 (ver Figuras 9 e 10) . Estas foram a sonda externa 5', um fragmento -0,5 kb de BamHI- BGIII, e uma sonda externa 3' de 335 pb, obtida por PCR utilizando um ADN plasmidico com os seguintes oligonucleótidos: iniciador no sentido directo 5' AACCTGACATGTTCCTCC 3' (SEQ ID NO: 3) e iniciador inverso 5' GGGATTAGCTGAGTGTGG 3' (SEQ ID NO: 4). As condições de PCR foram 95°C 1 min, 58°C 1 min e 72°C 30 seg durante 30 ciclos.
Realizaram-se "Southern blots" tal como acima com os resultados apresentados nas Figuras 3, 4 e 5 que apresentam os fragmentos da linha germinal (GL) quando hibridam com a sonda 3' ext(erna) indicada. As amostras com integração homóloga ou "knock-out" (KO) produziram uma banda -10 kb Saci e ~4 kb (3,8 kb) BamHI além de uma banda mais fraca da linha germinal para o alelo não modificado. A Figura 9 apresenta resultados do clone de células ES 355 que foi usado para mais integração do vector de alvejamento Cp. A análise de "Southern blot" foi levada a cabo utilizando a sonda B e a sonda A (não ilustrado) que identificaram um evento de duplo alvejamento, clone 212.
Para a deleção mediada por Cre em transfecção transiente, misturou-se 10 pg de plasmídeo superenrolado pBS 185 (Gibco, Cat. No. 10347-011) com 107 células ES em 0,8 mL de meio de 46 células ES e mantém-se à temperatura ambiente durante 10 min. Após transferência para uma cuvete com um espaçamento de 0,4 cm (Bio-Rad, 65-2088) aplicaram-se duas vezes pulsos eléctricos a 230V e 500yF. As células foram cultivadas a 37°C durante 30 min e depois transferidas a baixa densidade para placas de 6 poços contendo células de matriz. Após 8 a 10 dias em cultura os clones foram recolhidos e divididos igualmente de modo a testar a sua sobrevivência em meio selectivo. Cerca de 10% dos clones definharam e nas suas fracções separadas identificou-se a deleção por análise por PCR e Southern. A Figura 10 mostra como a integração foi verificada por análise de "Southern blot" tal como descrito acima. O clone 212 contém duas integrações alvo, a montante e a jusante do agrupamento dos genes C. A transfecção das células ES com o vector Cre permitiu a deleção que aumentou a banda resultante da hibridação tal como esperado. A remoção da totalidade dos 8 genes da região numa região -200 kb envolveu a integração dirigida de construções de homologia flanqueados por ΙοχΡ (μ1οχ e 3'Eloj em exões Cy 1 e 2, com a remoção de um fragmento de 330 pb BglII-BamHI, e no estimulador 3', localizado ~ 15 kb a jusante de Ca (Fig. 7) . A integração homóloga foi identificada por hibridação de Southern utilizando sondas externas (Fig. 10). Isto produziu numa digestão de BglII e hibridação com a sonda 5' JH uma banda de linha germinal de 8,3 kb e uma banda de alvejamento de 7,8 kb, enquanto que a sonda 3Έ identificou uma banda da linha germinal de 11,2 kb e uma banda de alvejamento de 12,5 kb. Utilizando a sonda 3Έ numa digestão com BamHI identificou-se uma banda da linha germinal de 6,5 kb e uma 47 banda de alvejamento de 4 kb. Para avaliar a eficiência da remoção do gene C mediada por Cre-loxP, realizou-se a transfecção do plasmideo Cre pBS185 e expressou-se de forma transiente em células ES duplamente alvejadas. Aquando da deleção do gene C, obteve-se um fragmento BglII de 15 kb quando se hibridou com o 5' JH e, separadamente, com a sonda 3Έ e numa digestão BamHI obteve-se um fragmento de 11,5 kb com a sonda 3Έ. Estas descobertas concordavam com o mapa do locus. A análise de colónias individuais por "Southern blotting" e PCR, com exemplos apresentados na Fig. 10, mostraram deleção de locus em cerca de 10% dos clones. Isto esteve em concordância com a avaliação inicial da assimilação celular e expressão do gene Cre que foi verificada através da transferência de parte de cada colónia em meio selectivo no qual cerca de 1 em 10 clones morreram. O clone 212 de célula ES com duplo alvejamento foi usado para produzir ratinhos como deleção in vitro foi facilmente obtido o que sugeriu que ambas as modificações integradas no mesmo alelo e que a deleção in vivo poderia ser possivelmente conseguida através do cruzamento dos ratinhos de transmissão da linha germinal com aqueles que expressam Care [15]. A verificação dos dois eventos de integração dirigidos a montante (5'Cy) e a jusante (a3') do agrupamento de genes de C foi confirmada no clone 212 através da transfecção das células ES com o vector Cre e a análise de deleção por PCR usando o par de iniciadores 1-4 (ver Figuras 7 e 14, para PI e P4 ver Exemplos) que mostraram a deleção do agrupamento de genes C e sugeriu que a integração dirigida das duas construções ocorreu num alelo (ver Figura 11). 48 A Figura 11 mostra que os clones após a transfecção Cre parecem produzir uma banda de PCR usando os iniciadores 1 e 4 ilustrados nas figuras 7 e 14, e no Exemplo 8. No entanto, permaneceu uma banda indicando a integração dirigida, iniciadores 1 e 2. Isto pode indicar clones mistos ou que a remoção mediada por Cre-loxP não foi conseguida em todas as células do clone. Note-se que, dado que isto não é observado nas hibridações de "Southern blot", Figura 10, é provável que represente uma contaminação de baixo nível detectada por uma amplificação por PCR muito eficiente.
Exemplo 6: Geração de ratinhos e cruzamento
Os clones de células ES com eventos de alvejamento (355 para o evento de alvejamento único do estimulador cx 3', integração de 3'Elox no estimulador oí3 ', e 212 para os eventos de alvejamento do estimulador α 3' (3'Elox) e 5' Cy (ylox) ) foram injectados em blastocistos BALB/c, transplantados em mães de acolhimento F1 (C57BL/6 x CBA) e obtiveram-se ratinhos quiméricos e transmissão da linha germinal tal como descrito (Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, e E. Lacy. 1994. Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Analisaram-se ainda os ratinhos por PCR tal como descrito em baixo e foram obtidos, cruzados e investigados de acordo com as regulamentações das licenças de projectos UK Home Office. O cruzamento de animais com ambos os eventos de alvejamento com ratinhos Cr (para métodos ver referência 15, Zou et al (2003)) resultou na deleção de locus. 49 de ratinhos
Exemplo 7: Análise por "Southern blot" de transmissão da linha germinal a partir do clone 355 de ES A análise por "Southern blot" de ratinhos de transmissão da linha germinal a partir do clone 355 de ES com os ratinhos deles derivados cruzados até homozigocidade foi levada a cabo utilizando a sonda E externa 3' (C na Figura 7) . A banda de ~4 kb indica o evento de alvejamento, a banda de ~6,5 kb é a banda da linha germinal e ++ indica a integração dirigida de ambos os alelos. Os resultados do "Southern blot" são apresentados na Figura 8.
Para se obter os ratinhos transgénicos que expressam de forma ubíqua a proteína Cre, o plasmídeo Cre pBS 185 GibcoBRL, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) foi linearizado com Seal utilizando um kit de purificação de ADN (#28304, Qiagen, Crawley, West Sussex, Reino Unido). Introduziu-se ADN por microinjecção no pro-núcleo macho de embriões F1 (CBA x C57B1/6) de acordo com métodos convencionais (Hogan, ver acima) e foram produzidos vários fundadores, dois dos quais apresentaram uma elevada taxa de deleção de gene/locus quando cruzados com ratinhos loxP. A Figura 12 mostra que, inesperadamente, cerca de metade do número de ratinhos de transmissão da linha germinal obtidos a partir do clone 212 tinham um alelo com um dos eventos de alvejamento 5' ou 3', mas não cm ambos os eventos. Uma vez que a transmissão da linha germinal foi cerca de 50% (metade dos ratinhos com a cor de pelagem correcta não tinham a modificação sítio-específica) parece que as duas integrações alvo estão num alelo mas que o cruzamento separou frequentemente as duas regiões. 50 A análise de um número superior de ratinhos analisados por PCR identificou 7 ratinhos que continham ambos os eventos de alvejamento (Figura 13). 0 cruzamento destes ratinhos com ratinhos que expressam Cre mostrou a deleção de locus, resultando a produção de um ratinho com a deleção do agrupamento de genes de C de IgH num alelo.
Exemplo 8: Rastreio por PCR para ratinhos "knock-out" (deleção) de C de IgH
Iniciadores NOME NOME COMPRIMENTO SEQUÊNCIA (5' a 3') (J. Coadwell) (L. Ren) AGAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGG 5, este é um iniciador no sua região. pb TGGATGTGGAATGTGTGCGAGGC 6, este é um iniciador no região μ. PI V00818f.pri MIgHKOlF 27pb PI corresponde a SEQ ID NO: sentido directo que se liga à P2 Puromicinr.pri MIgHK02R 23 P2 corresponde to SEQ ID NO: sentido inverso que se liga a
P3 Neomicinf.pri MIgHK03 23 pb TGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC P3 corresponde to SEQ ID NO: 7, este é um iniciador no sentido directo que se liga à região do estimulador 3'.
P4 X96607r.pri MIgHK04 22 pb GAGTCCCCATCCCCAAGGCTGG 51 Ρ4 corresponde a SEQ ID NO: 8, este é um iniciador no sentido inverso que se liga à região do estimulador 3'.
Métodos PCR
Para cada um dos PCRs utilizados no ratinho "knock-out" IgH o
rastreio das reacções foi preparado como se segue • Por 20 pL de reacção: 10 x tampão 2,0 yL 2 mM de dNTPs O CM pL 20 mM de iniciador no sentido directo 0,8 pL 20 mM de iniciador no sentido inverso O co pL prep-lab. Taq \—1 o pL ADN de cauda diluído o \—1 pL Água 13,3 pL
Os pares de iniciadores no sentido directo e inverso usados para cada tipo de PCR foram: i. 212 PCR MIgHKOlF (SEQ ID NO: 5) e MIgHK02R (SEQ ID NO: 6) ii. 355 PCR MIgHK03 (SEQ ID NO: 7) e MIgHK04 (SEQ ID NO: 8) iii. deleção PCR MIgHKOlF (SEQ ID NO: 5) e MIgHK04 (SEQ ID NO: 8) 0 tampão lOx usado foi: 500 mM de KC1 0,05% de Tween20 100 mM de Tris-Cl pH 9,0 1,5 mM de MgCl2. 52
As reacções foram realizadas como se segue: 5 minutos a 95°C durante 1 ciclo, 30 segundos a 94°C, depois 45 segundos à temperatura de emparelhamento apropriada, seguidos por 1 minuto a 72°C durante 30 ciclos, depois 10 minutos a 72°C durante 1 ciclo. Após o que as reacções foram mantidas a 6°C até se proceder à análise.
[0123] As temperaturas de emparelhamento usadas para cada tipo de reacção foram:
i. PCR 212 62°C
ii. PCR 355 62°C iii. PCR de deleção 66°C.
Exemplo 9: O mosaicismo alélico é transmitido ao longo da linha germinal
Os resultados dos cruzamentos nos primeiros 2 ratinhos de transmissão da linha germinal apresentarem ambos os eventos, ylox e 3'Elox, com animais Cre+ (Ia geração) e o cruzamento suplementar de ratinhos de deleção C (CA) para obter animais homozigóticos sem quaisquer genes C de IgH remanescentes (2a geração) são ilustrados na tabela 1 53
Tabela 1: Taxa de transmissão da integração homóloga e da deleção de locus.
Genótipo: 1 a geraçao3 Genótipo: 2 a geraçaob integração deleção número integração deleção número homóloga (%) homóloga (%) - + 0 (0) - + 4 (11) + + 2 (5)* + + 0 (0) + — 24 (60) + - 10 (26) nativo 14 (35) nativo 24 (63) (a) Ratinhos de transmissão da linha germinal com ambos os eventos (μΐ0Χ e 30Elox) foram cruzados com ratinhos Cre heterozigóticos. Dos 71 ratinhos de primeira geração analisados por PCR, 40 foram Cre+ e para aqueles animais a presença da integração dirigida e deleção de locus é apresentada. (b) Os ratinhos de deleção da Ia geração (*) foram ainda cruzados com ratinhos F1 normais que resultaram em 38 animais analisados por PCR com qualquer um dos locus de deleção ou, separadamente, os eventos de alvejamento ou sem qualquer modificação.
Na Ia geração de ratinhos produzida, a transmissão Cre foi de algum modo melhor do que os 50% esperados com um elevado número de ratinhos com os eventos de alvejamento. Isto implicou que ambas as integrações dirigidas ocorreram num alelo apesar da dimensão e da complexidade do locus IgH não permitiu a determinação da ligação cromossómica por meios moleculares. No entanto, nestes animais de Ia geração, apenas se conseguiu CA, que também retiveram as bandas de PCR para eventos de alvejamento (Fig. 15) . Tal baixo nivel de deleção mediada por Cre-loxP acompanhado por mosaicismo de locus não 54 foi aparente nos cruzamentos anteriores usando os ratinhos pBS185 Cre [15]. Isto poderia ser devido a uma diminuição da eficiência de deleção em ratinhos heterozigóticos devido a níveis Cre reduzidos ou alternativamente a inacessibilidade ao locus IgH. As combinações de cruzamentos dos animais Cre+ macho ou fêmea com ratinhos ylox3'Elox não alteraram este resultado. No entanto, as descobertas sugeriram que a deleção de locus poderia ser conseguida mas não com uma elevada eficiência em todas as células. Provou-se ser correcto trabalhar na hipótese que a deleção mediada por Cre-loxP pode ser operativa cedo no desenvolvimento fetal, dado que o cruzamento suplementar de ratinhos com a deleção pretendida e os 2 eventos de integração homóloga resultaram numa descendência com a deleção transmitida e sem qualquer integração dirigida remanescente (Fig. 15, pistas 4 e 5). A frequência com a qual se obtiveram ratinhos heterozigóticos CA a partir do acasalamento de fundadores mosaico foi consideravelmente inferior do que a transmissão das integrações alvejadas ou do que o número de ratinhos nativos, o que sugere os seguintes eventos. Um evo fertilizado contém um alelo IgH nativo, um alelo IgH duplamente alvejado e Cre integrado aleatoriamente no genoma. A deleção mediada por Cre opera de forma desproporcionada, e no estádio de 4 células apenas um blastómero tem o alelo deletado e um alelo nativo enquanto que os outros 3 blastómeros têm cada um um alelo duplamente alvejado e um alelo nativo. Este padrão de distribuição é mantido no desenvolvimento e aquando da meiose, 4 de 8 células germinais (50%) têm o alelo nativo, 3 de 8 (37,5%) o alelo alvejado e 1 de 8 (12,5%) a deleção. Apesar dos números na tabela 1 serem demasiado pequenos para concordarem de forma precisa com este cálculo, mostram que a maioria dos ratinhos de 2a geração são do tipo nativo, e que 55 um número intermédio de ratinhos contém as integrações alvejadas e, a 11%, obtém-se uma correspondência próxima para o número de ratinhos CA o que suporta fortemente a previsão que a recombinação mediada por Cre pode ser desproporcionada em fases de desenvolvimento precoces.
Exemplo 10: Análise por PCR de delegão e rearranjo A integração homóloga em Cp e o estimulador oí3 ' foi identificada utilizando 2 conjuntos de oligonucleótidos (ver Fig. 1): (1) Cp directo (5' AGAGCCCCCTGTCTGATAA GAATCTGG 3' SEQ ID NO: 5) e (2) puro (5' TGGATGTGGAATGTGT GCGAGGC 3' SEQ ID NO: 6), produziu um fragmento de -485 pb; enquanto (3) neo (5' TGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC 3' SEQ ID NO: 7) e (4) 3Έ (5' GAGTCCCCATCCCCAAGGCTGG 3' SEQ ID NO: 8) produziu um fragmento de -500 pb. Aquando da remoção do gene C os oligos (1) e (4) produziram uma banda de deleção de -613 pb. A presença do transgene Cre e o gene y2a gene no locus IgH foram identificados usando os seguintes oligonucleótidos: Cre directo 5' GGACATGTTCAGGGATCGCCAGG 3' SEQ ID NO: 9 e Cre inverso 5' GATAGCTGGCTGGTGGCAGATGG 3' SEQ ID NO: 10, e y2a directo 5' GGCTGGGA TGGGCATAAGGATAAAGGTC 3' SEQ ID NO: 11 e uma mistura 1 para 1 de y2aa inverso 5' GTAGCTATTTCTTTCCACCCAGTTCTTC 3' SEQ ID NO: 12 e y2ab inverso 5' GAAAAGACTTCCTCTTTCCCAAGTGCTC 3' SEQ ID NO: 13 que são específicas do alotipo. As condições óptimas para PCR foram 94°C 45 seg, 60°C (Cre, y2a) ou 62°C (Cp-puro, neo-3'Ε) ou 66°C (Cp-3'Ε) 1 min ou 45 seg (Cre) e 72°C 45 seg durante 30 ciclos seguindo-se por 10 min a 72°C para completar a reacção.
Para a análise do rearranjo D-J e V-D-J, preparou-se ADN e 56 ARN a partir de células de medula óssea usando Tri Reagent (Sigma) e o sistema One-Step RT-PCR (Invitrogen, life technologies). Utilizaram-se combinações dos seguintes oligonucleótidos: uma mistura 1:1 de DF (5' GCATGTCTCAAAGCACAATG 3' SEQ ID NO: 14) e DQ5 2 (5' ACCCTGGACACAGGAAACAC 3' SEQ ID NO: 15) iniciadores directos; uma mistura 1:1 de VJ558L (5' ATGGGATGGAGCTGGATCTT 3' SEQ ID NO: 16) e VJ558CL (5' ATGGAATGGAGCTGGGTCTT 3' SEQ ID NO: 17) iniciadores directos; iniciador inverso JH1-4 (5' GAGACDGTGASHRDRGTBCCTKSRCC 3' SEQ ID NO: 18 com R = A + G, K = G + T, H = A + T + C, B = G + T + CeD = G + A + T); e lamina Bl, um gene expresso ubiquamente como controlo, lamina directo 5' GTATGAGGCGGCACTAAACTCTAA 3' SEQ ID NO: 19, e uma mistura 1:1 de lamina inverso genómica 5' GAAGCCACTGAAGAACACAAATAG 3' SEQ ID NO: 20 e lamina inverso cADN 5' TACGAAACTCCAAGTCCTCAGTAA 3' SEQ ID NO: 21. As condições de PCR foram 35 ciclos de 92°C 15 seg, 60°C 30 seg e 72°C 40 seg e as condições de RT-PCR foram 30 min 50°C e 2 min 94°C seguido de 35 ciclos de 92°C 15 seg, 50°C 30 seg e 72°C 40 seg, seguido de 10 min a 72°C para completar a reacção.
Exemplo 11: Bloqueio no desenvolvimento na fase pré B-I
Para investigar a capacidade de desenvolvimento da população de linfócitos em ratinhos CA homozigóticos, analisaram-se células de baço e de medula óssea por citometria de fluxo (Fig. 16) .
Análise por citometria de fluxo
Prepararam-se suspensões de células de baço e de medula óssea 57 de F1 (C57/BL6 x CBA) normais, ratinhos μΜΤ (ratinhos mutantes homozigóticos μΜΤ_/~ (Ομ) [11]) e ratinho de deleçao CA. As células de medula óssea foram coradas em quatro combinações de cores (ver Fig. 4) com c-kit anti-ratinho conjugado com PE (CD117, 09995B, BD PharMingen, San Diego, CA) , CD45R anti-ratinho conjugado com APC (B220, 01129A, BD PharMingen), CD25 anti-ratinho conjugado com biotina (01092A, BD PharMingen), IgM monoclonal de rato anti-ratinho conjugado com FITC (μ, cadeia específico, 04-6811, Zymed, São Francisco, CA), CD43 anti-ratinho conjugado com biotina (01602D, BD PharMingen), IgD anti-ratinho conjugado com FITC (02214D, BD PharMingen) e/ou cadeia L de Igx anti-ratinho conjugado com PE (559940, BD PharMingen). Coraram-se células de baço com CD45R anti-ratinho conjugado com APC, IgM anti-ratinho conjugado com biotina (μ cadeia especifico, 02082D, BD PharMingen), Igx anti-ratinho conjugado com PE e CD21/CD35 anti-ratinho conjugado com FITC (CR2/CR1, 553818, BD PharMingen). As reacções com anticorpos conjugados com biotina foram subsequentemente incubadas com estreptavidina conjugada Tricolor (SA10006, Caltag). As células foram analisadas num equipamento FACSVantage e usou-se o programa CELLQuest para análise de dados.
Para a coloração da superfície celular, utilizaram-se anticorpos marcados contra o marcador de células B, B220 (CD45R) em combinação com anticorpos que permitiram a identificação dos vários passos sucessivos de diferenciação no desenvolvimento das células B. Na medula óssea (Fig. 16A) isto mostrou que populações na fase progenitora e precursora, são mantidas pro e pré células B c-kit+ B220+ e pré células B CD43+ B220+, mas que faltam linfócitos B220+ mais maduros. A ausência de uma grande proporção de células B B220+ é 58 igualmente pronunciada em ratinhos CA e μΜΤ com exões de membrana com ruptura [16] e estabelece-se que na fase pré B-II com a falta de células B CD25+ que normalmente expressam um pré BCR com cadeia Η μ e uma cadeia L sucedânea. A remoção do agrupamento de genes C conduziu a um desaparecimento completo de células B imaturas e maduras que expressam a cadeia H e L de Ig e a coloração para a cadeia L de Igx, IgM, IgD de superfície e células B maduras CD21/35 positivas (Fig. 16B) revela a sua total ausência.
Exemplo 12: Inactividade transcricional apesar do rearranjo de ADN A preservação dos níveis normais de pro células B em ratinhos CA sugere que os acontecimentos iniciais da diferenciação podem ser mantidos. Para testar o envolvimento do locus IgH no rearranjo de ADN, preparou-se ADN de células de medula óssea e analisou-se o rearranjo D-J e V-D-J por PCR. Para a região entre DQ52 e JH, um fragmento ~ 1200 pb indicou a configuração da linha germinal enquanto que bandas de amplificação de menores dimensões foram o produto de recombinação D-JH e VH-D-JH bem sucedida. Em ratinhos CA identificou-se um extenso rearranjo de ADN para o desenvolvimento de junções precoces D-J assim como para recombinação V-D-J (Fig. 17A) . Os fragmentos de PCR de -500 pb para D-J e >300 pb para o rearranjo V-D-J foram previstos, em que as bandas maiores representam amplificações dos JhS distais remanescentes após a recombinação. Os ratinhos CA produziram bandas da gama de tamanhos esperada que apresentavam um padrão e uma intensidade similar àquelas encontradas em ratinhos normais e ratinhos μΜΤ analisados em paralelo. Para análises de transcrição, preparou-se ARN a 59 partir de células de medula óssea e RT-PCR num só passo usando ARN de ~106 células por reacção revelou que poucos ou nenhuns transcritos da cadeia H rearranjados foram produzidos em ratinhos CA (Fig. 17B) . Um nível baixo de transcrição remanescente podia ser indicado pelas leves bandas nalgumas das reacções, alternativamente, isto pode representar o ruído de fundo devido à baixa restringência da reacção ou dos oligonucleótidos usados para a amplificação. No entanto, usando ARN de ratinhos normais assim como de ratinhos μΜΤ produziu bandas de RT-PCR perceptíveis da gama de tamanhos esperada que estabeleceu uma diferença marcada após rearranjo do ADN da cadeia H entre ratinhos μΜΤ apresentando uma transcrição da cadeia H totalmente funcional e ratinhos CA com uma cadeia H transcricionalmente silenciosa. Repetiu-se a análise de PCR e de RT-PCR com ~105 e -5 x 105 células de medula óssea CD43+ B220+, respectivamente, isoladas por citometria de fluxo. Obtiveram-se bandas distintas mas com padrões menos diversificados para ratinhos normais e μΜΤ, mas de novo os ratinhos CA não resultaram em quaisquer produtos de RT-PCR (dados não apresentados). A amplificação da lamina Bl, um gene expresso de forma ubíqua usado como controlo, produziu um fragmento genómico de -433 pb e um produto de cADN de -215 pb, identificados em todos os ratinhos. A descoberta de que os ratinhos CA são transcricionalmente inactivos é concordante com a sua carência de anticorpos no soro.
ELISA
Capturaram-se anticorpos do soro por ELISA [33] em placas Falcon (353911, Becton Dickinson) revestidas com 50 pL de 10 60 yg/mL de anti-IgM (cadeia-μ específico) (Sigma M-8644), anti-IgG (cadeia-y específico) (Binding Site AU272), anti-IgA (cadeia-α específico) (Sigma M-8769) ou cadeia L κ anti-ratinho (Sigma K-2132). 0 anticorpo ligado foi identificado usando anti-Ig biotinilado (diluição 1/500, Amersham RPN 1001) ou anti-κ (diluição 1/200, Zymed 04-6640) seguindo-se por uma diluição 1/200 de peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina (Amersham 1052) . Mediu-se a A492 num aparelho Titertek Multiskan MCC/340.
Em ELISA, não se detectou a presença de qualquer Ig ou de quaisquer fracções individuais de IgM, IgG ou IgA no soro de ratinhos CA (Fig. 18) enquanto que a expressão de Ig em ratinhos μΜΤ pareceu ser similar aos níveis de expressão anteriormente reportados [12-14]. O défice na produção de Ig, enfatizado pela ausência de Igx mostra que nenhumas cadeias L ou fragmentos de cadeias H do anticorpo por si só estão a ser expressas em ratinhos CA. A inserção dirigida de locais loxP, a 5' e 3' do agrupamento de genes CH, permitiu a remoção mediada por Cre de uma região -200 kb que produziu uma linha de ratinhos deficientes em Ig.
Enquanto que a deleçao in vitro foi levada a cabo com a eficiência esperada por intermédio de expressão Cre transiente, a remoção do gene C in vivo por cruzamento com animais que expressam Cre de forma ubíqua mostrou ser difícil. Como resultado, e apesar da transmissão normal do transgene Cre, poucos animais apresentavam a deleção do gene C (ver Tabela 1). Esta falta de eficiência não foi observada quando se removeram -400 kb do locus da cadeia L de IgX por cruzamento com a linha de ratinhos Cre [15, 17 e ENSEMBL Mouse Release 17.30.1 (NCBI 30 assembly)] e não é clara a 61 razão pela qual diferentes níveis de eficiência operam nos dois loci de Ig alvejados. Na primeira geração de ratinhos com a deleção do gene C (ninhadas de ratinhos Cre+ foram cruzados com ratinhos ylox 3'Elox), analisados por PCR de ADN de cauda, a banda de deleção foi sempre acompanhada pela presença de bandas para os eventos de alvejamento. Um problema com a eficiência de recombinação mediada por Cre foi associado ao seu promotor e mostrou-se que promotor precoce imediato principal do citomegalovírus humano (CMV), usando nos nossos ratinhos Cre, é muito menos eficiente do que o promotor CMV murino equivalente [18]. Tanto a expressão condicional como ubíqua do gene Cre mostraram uma variação na eficiência [19, 20] e isto pode explicar a razão pela qual a deleção do locus do gene C mediada por Cre foi apenas conseguida com sucesso numa proporção variada de células e tecidos produzindo um padrão de mosaico. No entanto, a deleção do gene C pode ser conseguida mais cedo para assegurar o desenvolvimento de células germinais modificadas que permitiram ratinhos homozigóticos sem serem estabelecidos os genes C remanescentes por cruzamento.
As experiências mostram que a remoção de todos os genes C silencia o locus IgH ao nível transcricional, mas não na fase de rearranjo de ADN. Isto implica que a activação do locus é totalmente mantida e efectivamente os níveis das células B precoces no estádio de diferenciação de pro a pré células B, c-kit+ B220+ e CD43+ B220+, são comparáveis àqueles em ratinhos normais. No entanto, com a ausência de células CD25+ B220+ (ver Fig. 16), é conseguido um bloqueio completo no desenvolvimento na fase pré B-II quando as cadeias H de Ig deviam ser transcritas e expressas. A coloração de populações de células B da medula óssea e do baço com anticorpos 62 específicos para marcadores de diferenciação revelou um padrão de desenvolvimento muito similar para ratinhos μΜΤ e CA o que é também confirmado ao nível do ADN em que ambas as estirpes apresentam um extenso rearranjo (ref. 14 e Fig. 17). No entanto, relativamente à expressão de Ig existem diferenças fundamentais entre as estirpes CA e μΜΤ que não são aparentes usando análise por citometria de fluxo do desenvolvimento de células B em que pequenas populações de células B podem escapar a detecção. Que estas células B maduras estão presentes na medula óssea de ratinhos μΜΤ, mas não em ratinhos CA, tornou-se claro em reacções de RT-PCR. Aqui, os ratinhos CA parecem não produzir transcritos IgH, que estão presentes em abundância em células de medula óssea de ratinhos μΜΤ. Para excluir eventuais artefactos, o cADN para a identificação de transcritos de Ig foi produzido com iniciadores Jh internos. Isto evitou a amplificação selectiva de ARN poliadenilado, um produto pouco provável de cadeia H em ratinhos CA que não possuem a região 3' não traduzida essencial para o processamento e a expressão de mARN. A expressão de Ig pôde ser identificada no soro de ratinhos μΜΤ, mas não nos ratinhos CA, que apresentou uma completa carência de Ig em ELISA. Isto estabeleceu que com a remoção de todos os genes C o locus IgH torna-se totalmente inoperativo ao nível transcricional após estar completo o rearranjo do ADN. Identificámos de forma inesperada uma quantidade significativa de IgG no soro dos animais μΜΤ a níveis que não foram observados em ratinhos μΜΤ de antecedente C57BL/6 [14]. Uma razão poderia ser que os ratinhos μΜΤ mantidos como colónia de cruzamento durante um tempo prolongado perderam o verdadeiro antecedente C57BL/6, e assim permite a expressão de IgG [12, 13]. No entanto, os níveis de IgA intermédios dos ratinhos μΜΤ são bastante 63 similares aos niveis registados para μΜΤ no antecedente C57BL/6 e a análise de ratinhos individuas mostrou que os níveis nativos tais como em μΜΤ do antecedente BALB/c [12, 13] não poderia ser atingido (dados não apresentados).
Relativamente a outras abordagens de silenciamento da cadeia H a remoção de agrupamentos de segmentos de genes, tais como Vs, Ds, Js ou genes-C, parece garantir a insuficiência do locus. Isto foi ilustrado em ratinhos de deleção JH em que foi também registado um bloqueio no desenvolvimento de células B na fase precursora CD34+ [9, 21], e foi detectada uma carência de transcritos μ do alelo que contém a deleção [10]. Um locus da cadeia H disfuncional silencia a expressão da cadeia L e apesar do locus Igx poder se arranjar ao mesmo tempo ou mesmo mais cedo do que o locus IgH, uma cadeia L rearranjada produtivamente é apenas expressa aquando da produção da cadeia H ([22] e [9] e suas refs). Em ratinhos de deleção JH, o rearranjo em κ de C em populações de células seleccionadas foi bastante similar aos níveis nativos, enquanto que apenas um baixo nível de transcritos de linha germinal pôde ser detectado em análise por "Northern blot" [9] . Pelo contrário, a remoção de Ομ, o primeiro gene C expresso e considerado essencial para conduzir o desenvolvimento das células B, não produziu ratinhos silenciados na cadeia Η [1]. Uma razão provável para isto é que a função de um gene C poder ser substituída por outro. Em ratinhos de deleção de Cp isto foi conseguido por substituição Cõ e em Cy2a, um talvez menos importante gene C a jusante, assumindo responsabilidade outros Cys [4]. Similarmente, a remoção de Cõ foi bem tolerada e talvez compensada pelo aumento da expressão de Igp [2] . A suposição que a maturação de células B após rearranjo de ADN pode ser dependente de forma crítica da expressão de Igy proveio de modelos de ratinhos transgénicos, em que nas abordagens iniciais Cy foi o único gene C num locus IgH introduzido na configuração da linha germinal ([23] e suas refs). No entanto, isto não implica que outros genes C, por exemplo Cy, não iniciem processos de desenvolvimento similares, que podem ser esclarecidos quando estão a ser produzidos ratinhos com deleção Cy e Cõ. Sugestões que talvez um sistema imunitário evolucionário primitivo ou antigo pode ser operativo provêm da observação que IgA é expresso nos ratinhos yMT [14] e que anticorpos apenas com cadeia H em Camelidae parecem contornar a fase de célula precursora Igy [24, 25] . Isto pode ser testado nos ratinhos CA pela inserção de genes dirigida mediada por Cre-IoxP.
Referências [1] C. Lutz, et al., IgD can largely substitute for loss of IgM function in B cells, Nature 393 (1998) 797-801.
[2] L. Nitschke, M.H. Kosco, G. Kohler, M.C. Lamers, Immunoglobulin D-deficient mice can mount normal immune responses to thymus-independent and - dependent antigens, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 90 (1993) 1887-1891.
[3] G. Achatz, L. Nitschke, M.C. Lamers, Effect of transmembrane and cytoplasmic domains of IgE on the IgE response, Science 276 (1997) 409-411.
[4] G. Pluschke et al., Generation of chimeric monoclonal antibodies from mice that carry human immunoglobulin CyI heavy of Ck light chain gene segments, Immunol. Methods 215 (1998) 27-37.
[5] Y.R. Zou, W. Miiller, H. Gu, K. Rajewsky, Cre-loxP- 65 mediated gene replacement: a mouse strain producing humanized antibodies, Current Biology 4 (1994) 1099-1103.
[6] M. Serwe, F. Sablitzky, V(D)J recombination in B cells is impaired but not blocked by targeted deletion of the immunoglobulin heavy chain intron enhancer, EMBO J. 12 (1993) 2321-2227.
[7] J. Chen, F. Young, A. Bottaro, V. Stewart, R.K. Smith, F. W. Alt, Mutations of the intronic IgH enhancer and its flanking sequences differentially affect accessibility of the JH locus, EMBO J. 12 (1993) 4635-4645.
[8] M. Cogne et al., A class switch control region at the 3' end of the immunoglobulin heavy chain locus, Cell 77 (1994) 737-747.
[9] J. Chen et al., Immunoglobulin gene rearrangement in B cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus, Int. Immunol. 5 (1993) 647-656.
[10] H. Gu, Y.R. Zou, K. Rajewsky, Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting, Cell 73 (1993) 1155-1164.
[11] D. Kitamura, J. Roes, R. Kuhn, K. Rajewsky, A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin μ chain gene, Nature 350 (1991) 423-426 .
[12] Z. Orinska et al., Novel B cell population producing functional IgG in the absence of membrane IgM expression, Eur. J. Immunol. 32 (2002) 3472-3480.
[13] M. Hasan, B. Polic, M. Bralic, S. Jonjic, K. Rajewsky, Incomplete block of B cell development and immunoglobulin production in mice carrying the μΜΤ mutation on the BALB/c background, Eur. J. Immunol. 32 (2002) 3463-3471.
[14] A.J. Macpherson et al., IgA production without μ or δ Chain expression in developing B cells, Nat. Immunol. 2 (2001) 625-631.
[15] X. Zou, T.A. Piper, J.A. Smith, N.D. Allen, J. Xian, M. Bruggemann, Block in development at the pre-B-II to immature B cell stage in mice without Igx and IgX light chain, J. Immunol. 170 (2003) 1354-1361.
[16] T. Nikolic, G.M. Dingjan, P.J. Leenen, R.W. Hendriks, A subfraction of B220+ cells in murine bone marrow and spleen does not belong to the B cell lineage but has dendritic cell characteristics. Eur. J. Immunol. 32 (2002) 686-692.
[17] M. Clamp et al., Ensembl 2002: accommodating comparative genomics. Nucleic Acids Res. 31 (2003) 38-42.
[18] C.E. Appleby et al., A novel combination of promoter and enhancers increases transgene expression in vascular smooth muscle cells in vitro and coronary arteries in vivo after adenovirus-mediated gene transfer, Gene Ther. 10 (2003) 1616-1622 .
[19] K. Sakai et al., Stage-and tissue-specific expression of a Col2al-Cre fusion gene in transgenic mice, Matrix Biol. 19 (2001) 761-767.
[20] H. Guo et al., Specificity and efficiency of Cre-mediated recombination in Emxl-Cre knock-in mice, Biochem. Biophys. Res. Commun. 273 (2000) 661-665.
[21] A. Jakobovits et al., Analysis of homozygous mutant chimeric mice: deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 2551-2555.
[22] T.I. Novobrantseva, V.M. Martin, R. Pelanda, W. Muller, K. Rajewsky, A. Ehlich, Rearrangement and expression of immunoglobulin light chain genes can precede heavy chain 67 expression during normal B cell development in mice, J. Exp. Med. 189 (1999) 75-88.
[23] M. Bruggemann, Human monoclonal antibodies from translocus mice. in Molecular Biology of B-cells. (2004) F.W. Alt, T. Honjo, M.S. Neuberger (Eds.), pp 547-561.
[24] V.K. Nguyen, A. Desmyter, S. Muyldermans, Functional Heavy-chain Antibodies in Camelidae, Adv. Immunol. 79 (2001) 261-296 .
[25] V.K. Nguyen, X. Zou, M. Lauwereyes, L. Brys, M. Bruggemann, S. Muyldermans, Heavy-chain only antibodies derived from dromedary are secreted and displayed by mouse B-cells, Immunology 109 (2003) 93-101.
[26] B. Sauer, N. Henderson, Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase, New Biol. 2 (1990) 441-449.
[27] X. Zou, C. Ayling, J. Xian, T.A. Piper, P.J. Barker, M. Bruggemann, Truncation of the μ heavy chain alters BCR signalling and allows recruitment of CD5+ B cells, Int. Immunol. 13 (2001) 1489-1499.
[28] S. Pettersson, G.P. Cook, M. Bruggemann, G.T. William, M.S. Neuberger, A second B cell-specific enhancer 3' of the immunoglobulin heavy-chain locus, Nature 344 (1990) 165-168.
[29] K.L. Tucker et al., Germ-line passage is required for establishment of methylation and expression patterns of imprinted but not of nonimprinted genes, Genes Dev. 10 (1996) 1008-1020.
[30] X. Zou, J. Xian, A.V. Popov, I.R. Rosewell, M. Miiller, M. Bruggemann. Subtle differences in antibody responses and hypermutation of λ light chains in mice with a disrupted κ constant region, Eur. J. Immunol. 25 (1995) 2154-2162. 68 [31] J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[32] B. Hogan, R. Beddington, F. Costantini, E. Lacy, Manipulating the mouse embryo, A Laboratory Manual (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[33] A.V. Popov, X. Zou, J. Xian, I.C. Nicholson, M. Bruggemann, A human immunoglobulin λ locus is similarly well expressed in mice and humans. J. Exp. Med. 189 (1999) 1611-1619 .
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Babraham Institute <120> Células e mamíferos não humanos geneticamente modificados <130> WPP286912 <150> GB 0304374.2 <151> 2003-02-26 <160> 21 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 64 <212> ADN <213> Artificial 69 <40 0> 1 tttggatcca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatcgacctc gaaattctac 60 cggg 64 <210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <400> 2 tttgatcagc tgatctcgtt cttcaggc 28 <210> 3 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <400> 3 aacctgacat gttcctcc 18 <210> 4 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <400> 4 gggattagct gagtgtgg 18 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial 70 <400> 5 agagccccct gtctgataag aatctgg 27 <210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <400> 6 tggatgtgga atgtgtgcga ggc 23 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <400> 7 tgctttacgg tatcgccgct ccc 23 <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <400> 8 gagtccccat ccccaaggct gg 22 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial 71 < 4 Ο Ο > 9 ggacatgttc agggatcgcc agg 23 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <400> 10 gatagctggc tggtggcaga tgg 23 <210> 11 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <400> 11 gtagctattt ctttccaccc agttcttc 28 <210> 12 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <400> 12 gtagctattt ctttccaccc agttcttc 28 <210> 13 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial 72 <40 0> 13 gaaaagactt cctctttccc aagtgctc 28 <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <400> 14 gcatgtctca aagcacaatg 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <400> 15 accctggaca caggaaacac 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <400> 16 atgggatgga gctggatctt 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial 73 <40 0> 17 atggaatgga gctgggtctt 20 <210> 18 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <400> 18 gagacdgtga shrdrgtbcc tksrcc 26 <210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <400> 19 gtatgaggcg gcactaaact ctaa 24 <210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <400> 20 gaagccactg aagaacacaa atag 24 <210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial 74 <400> 21 tacgaaactc caagtcctca gtaa 24 11-07-2012 75
Claims (62)
- REIVINDICAÇÕES 1. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado por não compreender uma sequência de ácido nucleico que por si codifique para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e em que estão presentes sequências de ácidos nucleicos de uma ou mais região Variável de H de Ig endógena, ou um ou mais fragmento D de H de Ig endógeno, e um ou mais segmentos J de H de Ig endógenos.
- 2. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado por não compreender uma sequência de ácido nucleico que por si codifique para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena e em que estão presentes todas as sequências de ácidos nucleicos da região Variável de H, segmentos D e J de H de Ig endógeno.
- 3. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 caracterizado por não compreender uma sequência de ácido nucleico que por si codifique para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (C de IgH) .
- 4. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado por todas as sequências genéticas da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina estarem ausentes ou parcialmente ausentes do genoma. 1
- 5. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por poder ser obtido por deleção dirigida de todas ou de essencialmente todas as sequências genéticas de C de IgH endógenas.
- 6. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por poder ser ou ser obtido por recombinação Cre loxP.
- 7. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por poder pelo menos uma parte de pelo menos uma sequência de um estimulador do gene de C de IgH estar presente.
- 8. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por poder estar presente no genoma uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena.
- 9. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por poder ter uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena a jusante de, ou no interior do último gene do locus de C de IgH.
- 10. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo a reivindicação 9, caracterizado por poder ter outra sequência de recombinação sítio-específica não endógena a montante do locus de C de Sigh. 2
- 11. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por estar presente no genoma um ou mais marcadores de selecção.
- 12. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo a reivindicação 9, caracterizado por poder estar presente pelo menos um marcador de selecção a montante de, ou a jusante de, a sequência de recombinação sítio-específica não endógena.
- 13. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo a reivindicação 10, caracterizado por pelo menos um marcador de selecção estar integrado no genoma a montante de, e/ou a jusante de, pelo menos uma sequência de recombinação sítio-específica não endógena.
- 14. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo ou pelos marcadores de selecção serem um ou mais marcadores de selecção seleccionado do grupo compreendendo um gene de resistência à neomicina, um gene de resistência à puromicina, e um gene de resistência à higromicina.
- 15. Uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado de acordo qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pela sequência de recombinação sítio-específica não endógena ser um local loxP. 3
- 16. Um mamífero não humano geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por ser um ratinho.
- 17. Uma célula não humana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 caracterizada por ser uma célula de ratinho.
- 18. Um mamífero geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 16, ou uma célula de ratinho geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pela totalidade dos genes de C de IgH endógenos μ, δ, γ3, γΐ, Y2a, γ2ό, ε e α estarem ausentes ou parcialmente ausentes.
- 19. Uma célula não humana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou reivindicação 17 ou 18 caracterizada por ser uma célula estaminal embrionária.
- 20. Um método para a produção de uma célula não humana geneticamente modificada compreendendo: (a) (i) a transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento uma sequência de recombinação sítio específica não endógena e um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e 4 fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação, e, (ii) a transfecção de um célula produzida em (a)(i) com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento um marcador de selecção e uma sequência de recombinação sítio específica não endógena, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação; ou, (b) (i) a transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento uma sequência de recombinação sitio específica não endógena e um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação, e, (ii) a transfecção de um célula produzida em (b) (i) com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo a referida construção de alvejamento 5 um marcador de selecção e uma sequência de recombinação sítio específica não endógena, seleccionando para uma célula na qual está presente o marcador de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para inteqração da sequência de recombinação; ou, (c) a co-transfecção de uma célula não humana com uma construção de alvejamento para integração a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH e com uma construção de alvejamento para integração a jusante de, ou no interior do último gene de C de IgH do locus de C de IgH, compreendendo cada uma das referidas construções de alvejamento uma sequência de recombinação sítio específica não endógena e compreendendo cada uma um marcador de selecção, seleccionando para uma célula na qual está ou estão presentes o ou os marcadores de selecção e fazendo o rastreio da referida célula para integração da sequência de recombinação; e opcionalmente, (d) proporcionar a uma célula obtida em (a) (ii), (b) (ii) ou (c) uma recombinase activa na sequência sítio específica não endógena e, opcionalmente, o rastreio de acontecimentos de deleção.
- 21. Um método de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pela sequência de recombinação sítio-específica não endógena ser um local loxP.
- 22. Um método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado 6 por, no passo opcional (d), a recombinase ser uma recombinase Cre.
- 23. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 à reivindicação 22 caracterizado pela recombinase ser proporcionada por um vector de expressão.
- 24. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23 caracterizado pela célula não humana geneticamente modificada ser uma célula de ratinho.
- 25. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24 caracterizado pela célula não humana geneticamente modificada ser uma célula estaminal embrionária.
- 26. A utilização de uma célula estaminal embrionária da reivindicação 19 para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado.
- 27. Um método para a produção de um mamífero não humano geneticamente modificado caracterizado por uma célula estaminal embrionária da reivindicação 19 ser introduzida num blastocisto não humano hospedeiro e desenvolvida num animal quimérico.
- 28. Um método de acordo com a reivindicação 27 caracterizado por: (a) introduzir uma célula estaminal embrionária não humana de acordo com a reivindicação 19 num blastocisto de mamífero não humano compatível, e 7 (b) transplantar o blastocisto obtido em (a) numa mãe de acolhimento de mamifero não humano para obter um mamifero não humano quimérico, e opcionalmente, o rastreio para o ou os marcadores de selecção, e/ou sequência ou sequências de recombinação sitio especificas não endóqenas, e/ou para deleção de todas ou de essencialmente todas as sequências de genes de C de IgH endógenas.
- 29. Um método para a produção de um mamifero não humano geneticamente modificado caracterizado por se realizar um método da reivindicação 27 ou 28 para obter um mamifero não humano quimérico e cruzar o referido mamifero não humano quimérico para obter uma descendência heterozigótica.
- 30. Um método para a produção de um mamifero não humano geneticamente modificado caracterizado por se levar a cabo um método de acordo com a reivindicação 29 para obter uma descendência heterozigótica e o inter-cruzamento da referida descendência heterozigótica para obter uma descendência homozigótica.
- 31. Um método para produzir um mamifero não humano geneticamente modificado caracterizado por se levar a cabo um método da reivindicação 30 para obter um mamifero não humano geneticamente modificado homozigótico para integração de uma sequência de recombinação sitio especifica a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH e um cruzamento do referido mamifero não humano geneticamente modificado homozigótico de uma sequência de recombinação sitio especifica não endógena a montante de, ou no interior do primeiro gene de C de IgH do locus de C de IgH com um mamífero não humano geneticamente modificado homozigótico para integração de uma sequência de recombinação sítio específica não endógena a jusante, ou no interior do gene de C de IgH do locus de C de IgH, para obter uma descendência heterozigótica e opcionalmente inter-cruzamento da descendência heterozigótica para obter uma descendência homozigótica para ambas as integrações.
- 32. Um método de acordo com a reivindicação 31 caracterizado por compreender ainda o cruzamento da descendência homozigótica para ambas as integrações com um mamífero não humano compatível capaz de expressar uma recombinase activa na sequência de recombinação sítio específica não endógena para obter descendência; e opcionalmente rastrear a descendência obtida para a deleção do gene de C de IgH.
- 33. Um método de acordo com a reivindicação 31 ou a reivindicação 32 caracterizado pela ou pelas sequências de recombinação sítio específica não endógena são locais loxP.
- 34. Um método de acordo com a reivindicação 33 caracterizada pela recombinase ser uma recombinase Cre.
- 35. Um método de acordo com a reivindicação 33 caracterizado por compreender ainda o cruzamento da descendência heterozigótica ou homozigótica para loxP em ambos os loci com um mamífero não humano compatível capaz de expressar a recombinase Cre para obter um mamífero não humano descendente que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada de Ig endógena em um ou em ambos os alelos. 9
- 36. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35 caracterizada por estarem presentes na descendência uma ou mais sequências de ácidos nucleicos da região Variável de H de Ig endógena, um ou mais segmentos D de H de Ig endógenos, e um ou mais segmentos J de H de Ig endógenos.
- 37. Um método de qualquer uma das reivindicações 32 a 36 caracterizados por estarem presentes na descendência a totalidade das sequências de ácidos nucleicos da região Variável de H de Ig, segmentos D e J endógenos.
- 38. Um método para a produção de um mamifero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos, caracterizado por levar a cabo um método de qualquer uma das reivindicações 35 a 37 para obter um mamifero não humano geneticamente modificado de acordo com as reivindicações 1 a 7 ou reivindicações 10 a 16 ou reivindicação 18 que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena, e cruzar o referido mamifero não humano geneticamente modificado de acordo com as reivindicações 1 a 7 ou reivindicações 10 a 16 ou reivindicação 18 com um mamifero não humano compatível que codifica para e que é capaz de expressar um ou mais genes exógenos, para obter uma descendência heterozigótica para um ou mais genes exógenos, e opcionalmente inter-cruzar a descendência heterozigótica para produzir uma descendência homozigótica para um ou mais genes exógenos.
- 39. Um método para a produção de um mamífero ou célula não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais 10 genes exógenos caracterizado por compreender a introdução de um ou mais genes exógenos numa célula de mamífero não humano de acordo com reivindicações 1 a 7 ou reivindicações 10 a 15 ou reivindicações 17 ou 18 que não compreende uma sequência de ácido nucleico que por si só codifica para qualquer polipéptido da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógena.
- 40. Um método de acordo com a reivindicação 39 caracterizado pela célula de mamífero não humano ser uma célula estaminal embrionária.
- 41. Um método de acordo com a reivindicação 40 caracterizada por um ou mais genes exógenos serem introduzidos por transfecção.
- 42. Um método de acordo com a reivindicação 39 caracterizado pela célula de mamífero não humano ser um ovócito (célula de óvulo).
- 43. Um método de acordo com a reivindicação 42 caracterizada por um ou mais genes exógenos serem introduzidos por micro-injecção de ADN.
- 44. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 9 a 43 caracterizado por um ou mais genes exógenos são inseridos no genoma do mamífero ou da célula não humana.
- 45. Um método de acordo com a reivindicação 44 caracterizado por um ou mais genes exógenos são inseridos numa sequência de recombinação sítio específica endógena. 11
- 46. Um método para a produção de uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos caracterizado por se levar a cabo um método de gualquer uma das reivindicações 35 a 37 para obter mamíferos não humanos que não compreendem uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno e em que estão presentes sequências de ácidos nucleicos de uma ou mais região Variável de H de Ig endógena, ou um ou mais fragmento D de H de Ig endógeno, e um ou mais segmentos J de H de Ig endógeno e se cruzar o referido mamífero não humano assim obtido com um mamífero não humano transgénico com um ou mais genes exógenos associados com ou flanqueados por uma sequência de recombinação sítio específica e tendo uma recombinase activa na sequência de recombinação sítio específica não endógena para obter uma descendência e opcionalmente rastrear a descendência para inserção de um ou mais genes exógenos.
- 47. Um método para a produção de uma célula ou mamífero não humano geneticamente modificado capaz de expressar um ou mais genes exógenos caracterizado por se levar a cabo um método de qualquer uma das reivindicações 35 a 37 para obter mamíferos não humanos que não compreendem uma sequência de ácido nucleico que por si codifica para qualquer polipéptido de locus da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina endógeno e em que estão presentes todas as sequências de ácidos nucleicos da região Variável de H, segmentos D e J de H de Ig endógenos, e se cruzar o referido mamífero não humano assim obtido com um mamífero não humano transgénico com um ou mais genes exógenos associados com ou flanqueados por uma sequência de recombinação sítio específica e tendo uma 12 recombinase activa na sequência de recombinação sítio específica não endógena para obter uma descendência e opcionalmente rastrear a descendência para inserção de um ou mais genes exógenos.
- 48. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47 caracterizados pela sequência de recombinação sítio específica não endógena ser uma sequência loxP e a inserção ser por integração Cre - loxP.
- 49. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 48 caracterizado pelo mamífero não humano geneticamente modificado ser um ratinho.
- 50. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 49 caracterizado pelo gene ou genes exógenos ser ou serem um gene ou genes de H de Ig.
- 51. Um método de acordo com a reivindicação 50 caracterizado pelo gene ou genes de Ig H ser um gene de C de IgH ou genes de C de IgH.
- 52. Um método de acordo com qualquer das reivindicações 38 a 51 caracterizado pelos genes exógenos ou genes serem um gene humano ou genes humanos.
- 53. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52 caracterizado pelos genes exógenos serem um locus da cadeia pesada da Ig humana com regiões V, D, J e/ou C. 13
- 54. Um método de acordo com a reivindicação 53 em que as regiões V, D, J e/ou C do locus da cadeia pesada da Ig humana estão na configuração da linha germinal.
- 55. Um método de acordo com a reivindicação 53 em que as regiões V, D, J e/ou C do locus da cadeia pesada da Ig humana estão arranjados de forma produtiva.
- 56. Um método para a produção da imunoglobulina exógena compreendendo um método de qualquer uma das reivindicações 38 a 55.
- 57. Um método para a produção da imunoglobulina humana compreendendo um método de qualquer uma das reivindicações 38 a 55.
- 58. Um método de acordo com a reivindicação 56 ou 57 em que o mamífero não humano é um roedor.
- 59. Um método de acordo com a reivindicação 56 ou 57 em que o mamífero não humano é um ratinho.
- 60. Um método de acordo com a reivindicação 56 ou 57 em que a célula não humana é uma célula de roedor.
- 61. Um método de acordo com a reivindicação 56 ou 57 em que a célula não humana é uma célula de ratinho.
- 62. Um método para a produção de um medicamento compreendendo um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 61. 11-07-2012 14
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0304374A GB2398784B (en) | 2003-02-26 | 2003-02-26 | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT1597382E true PT1597382E (pt) | 2012-07-19 |
Family
ID=9953689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT04714849T PT1597382E (pt) | 2003-02-26 | 2004-02-26 | Células e mamíferos não humanos geneticamente modificados |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7932431B2 (pt) |
| EP (1) | EP1597382B1 (pt) |
| DK (1) | DK1597382T3 (pt) |
| ES (1) | ES2386545T3 (pt) |
| GB (1) | GB2398784B (pt) |
| PT (1) | PT1597382E (pt) |
| WO (1) | WO2004076618A2 (pt) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2398784B (en) * | 2003-02-26 | 2005-07-27 | Babraham Inst | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
| GB0700194D0 (en) * | 2007-01-05 | 2007-02-14 | Univ Edinburgh | Humanisation of animals |
| HUE037302T2 (hu) | 2007-06-01 | 2018-08-28 | Open Monoclonal Tech Inc | Készítmények és eljárások endogén immunglobulin gének gátlására és transzgenikus humán idiotipikus antianyagok elõállítása |
| US20100138946A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-06-03 | Origen Therapeutics | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus |
| WO2009023800A1 (en) * | 2007-08-14 | 2009-02-19 | Origen Therapeutics | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus |
| CA3038954A1 (en) | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Ablexis, Llc | Non-human mammals for the production of chimeric antibodies |
| CN102292445A (zh) * | 2008-12-18 | 2011-12-21 | 伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心 | 表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途 |
| US20120204278A1 (en) * | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| LT3241435T (lt) | 2009-07-08 | 2021-10-25 | Kymab Limited | Gyvūnų modeliai ir terapinės molekulės |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| WO2011123708A2 (en) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | Ablexis Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
| CA2806233C (en) | 2010-07-26 | 2021-12-07 | Trianni, Inc. | Transgenic animals and methods of use |
| US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| EP3960865A1 (en) | 2010-08-02 | 2022-03-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| EP2758535B1 (en) | 2011-09-19 | 2016-11-09 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains&chains tailored for human use |
| EP2761008A1 (en) | 2011-09-26 | 2014-08-06 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| EP3527070A1 (en) | 2011-12-20 | 2019-08-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized light chain mice |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| ES2859373T3 (es) | 2013-10-01 | 2021-10-01 | Kymab Ltd | Modelos animales y moléculas terapéuticas |
| KR20230158661A (ko) | 2014-03-21 | 2023-11-21 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물 |
| AU2015231025A1 (en) | 2014-03-21 | 2016-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
| WO2016062988A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Crescendo Biologics Limited | Vh scaffold |
| AU2014409276A1 (en) * | 2014-10-22 | 2017-04-06 | Crescendo Biologics Limited | Transgenic mice |
| GB201500464D0 (en) | 2015-01-12 | 2015-02-25 | Crescendo Biolog Ltd | Method of producing optimised therapeutic molecules |
| GB201500461D0 (en) | 2015-01-12 | 2015-02-25 | Cresendo Biolog Ltd | Therapeutic molecules |
| WO2016141234A1 (en) | 2015-03-03 | 2016-09-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Etv2 and uses thereof |
| AU2016232715A1 (en) | 2015-03-19 | 2017-09-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| US10897880B2 (en) | 2015-06-30 | 2021-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Humanized heart muscle |
| MX2018000273A (es) * | 2015-06-30 | 2018-03-08 | Univ Minnesota | Musculo esqueletico humanizado. |
| EP3384030A4 (en) | 2015-12-03 | 2019-07-03 | Trianni, Inc. | IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY |
| CN108473589B (zh) | 2016-01-12 | 2023-05-02 | 克雷森多生物制剂有限公司 | 结合前列腺特异性膜抗原(psma)的分子 |
| US11053288B2 (en) | 2016-02-04 | 2021-07-06 | Trianni, Inc. | Enhanced production of immunoglobulins |
| GB201612043D0 (en) | 2016-07-11 | 2016-08-24 | Crescendo Biologics Ltd | Composition for treatment of disorders |
| MA46753A (fr) | 2016-11-14 | 2019-09-18 | Amgen Inc | Protéines de liaison à l'antigène bispécifiques ou biparatopiques et utilisations de celles-ci |
| WO2018127711A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Crescendo Biologics Limited | Single Domain Antibodies to Programmed Cell Death (PD-1) |
| GB201711068D0 (en) | 2017-07-10 | 2017-08-23 | Crescendo Biologics Ltd | Therapeutic molecules binding PSMA |
| EP3710477A1 (en) | 2017-11-13 | 2020-09-23 | Crescendo Biologics Limited | Single domain antibodies that bind to cd137 |
| GB201802573D0 (en) | 2018-02-16 | 2018-04-04 | Crescendo Biologics Ltd | Therapeutic molecules that bind to LAG3 |
| GB201818460D0 (en) | 2018-11-13 | 2018-12-26 | Crescendo Biologics Ltd | Single domain antibodies that bind human serum albumin |
| JP2022532370A (ja) | 2019-05-15 | 2022-07-14 | クレシェンド・バイオロジックス・リミテッド | 結合分子 |
| GB201914468D0 (en) | 2019-10-07 | 2019-11-20 | Crescendo Biologics Ltd | Binding Molecules |
| GB202205589D0 (en) | 2022-04-14 | 2022-06-01 | Crescendo Biologics Ltd | Mesothelin binders |
| WO2023199069A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Crescendo Biologics Limited | Chimeric antigen receptor that binds mesothelin |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| EP0463151B1 (en) | 1990-01-12 | 1996-06-12 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
| US5625126A (en) * | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| DE4228162C1 (de) | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
| US6130364A (en) * | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
| JPH1023677A (ja) * | 1996-07-03 | 1998-01-23 | Uniden Corp | 無接点充電装置、充電器、コードレス機器および無接点充電器 |
| GB9711167D0 (en) * | 1997-05-31 | 1997-07-23 | Babraham The Inst | Telomere-associated chromosome fragmentation |
| GB2398784B (en) * | 2003-02-26 | 2005-07-27 | Babraham Inst | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
-
2003
- 2003-02-26 GB GB0304374A patent/GB2398784B/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-02-26 PT PT04714849T patent/PT1597382E/pt unknown
- 2004-02-26 US US10/547,066 patent/US7932431B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-26 EP EP04714849A patent/EP1597382B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-26 WO PCT/GB2004/000768 patent/WO2004076618A2/en active Application Filing
- 2004-02-26 DK DK04714849.9T patent/DK1597382T3/da active
- 2004-02-26 ES ES04714849T patent/ES2386545T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-04-06 US US13/081,035 patent/US8329981B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2386545T3 (es) | 2012-08-22 |
| WO2004076618A3 (en) | 2004-10-28 |
| WO2004076618A2 (en) | 2004-09-10 |
| WO2004076618A9 (en) | 2005-10-06 |
| GB2398784B (en) | 2005-07-27 |
| GB2398784A (en) | 2004-09-01 |
| WO2004076618A8 (en) | 2005-04-28 |
| US7932431B2 (en) | 2011-04-26 |
| US8329981B2 (en) | 2012-12-11 |
| US20060236418A1 (en) | 2006-10-19 |
| EP1597382A2 (en) | 2005-11-23 |
| US20110277047A1 (en) | 2011-11-10 |
| DK1597382T3 (da) | 2012-07-23 |
| GB0304374D0 (en) | 2003-04-02 |
| EP1597382B1 (en) | 2012-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1597382B1 (en) | Genetically modified non-human mammals and cells | |
| US11104743B2 (en) | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies | |
| JP2023009136A (ja) | 動物モデルおよび治療用分子 | |
| JP2022159413A (ja) | ヒト可変領域を保有している抗体を産生するために有用な繁殖可能遺伝子導入動物 | |
| RU2601297C2 (ru) | Мыши, экспрессирующие гибридную легкую цепь иммуноглобулина | |
| US7049426B2 (en) | Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions | |
| KR101711222B1 (ko) | 인간화 항체들을 발현하는 비-인간 유전자이식 동물들 및 그의 이용 | |
| KR20190095511A (ko) | Ｖｌ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스 | |
| JP2020508639A (ja) | Ｖｈｈ含有重鎖抗体およびその製造 | |
| AU743883B2 (en) | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |