CN108473589B - 结合前列腺特异性膜抗原(psma)的分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的结合分子，特别是单人可变重链结构域抗体，并且涉及用于治疗癌症的相关方法。

Description

结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的分子
发明领域
本发明涉及前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合分子，以及这类结合分子在治疗疾病中的用途。
介绍
前列腺癌是发达国家男性中最常见的非皮肤相关性恶性肿瘤。据估计，六分之一的男性将被诊断患有前列腺癌。
目前用于前列腺癌的治疗包括手术、放疗和辅助激素治疗。虽然这些疗法在疾病的早期阶段相对有效，但最初诊断为局限性前列腺癌的大多数患者最终复发。虽然化疗是对抗晚期前列腺癌最广泛使用的方法之一，但由于缺乏特异性和相关毒性，其疗效通常不足。缺乏针对前列腺癌细胞的靶向递送是实现可行治疗效果的主要障碍之一。因此，对于增加抗前列腺癌剂的选择性的策略仍然存在迫切需求(Barve等,J Control Release.2014August 10；0:118–132)。
在使用基于血清的标志物例如前列腺特异性抗原(PSA)之后，前列腺癌的诊断已经大大改善。此外，前列腺肿瘤相关抗原为肿瘤成像、诊断和靶向治疗提供了靶点。前列腺特异性膜抗原(PSMA)(是一种前列腺肿瘤相关标志物)就是这样一种靶标。
PSMA是一种高度限制于前列腺分泌上皮细胞膜的750个残基的II型跨膜糖蛋白。它在前列腺癌细胞和非前列腺实体瘤新血管系统中高度表达，并在其他组织(包括健康的前列腺，肾，肝，小肠和脑)中表达较低。PSMA表达随着前列腺疾病进展和转移而增加，并且其表达水平因此与肿瘤侵袭性相关。在良性前列腺上皮细胞中，各种免疫组织学研究已经证实在几乎所有前列腺癌病例中PSMA水平均增加。在疾病的所有阶段均可发现强烈的PSMA染色，包括前列腺上皮内瘤变，晚期雄激素非依赖性前列腺癌和局限于淋巴结、骨、软组织和肺的继发性前列腺肿瘤。因此PSMA被广泛用作前列腺癌细胞的生物标志物。
PSMA具有3部分结构：19个氨基酸的内部部分，24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的外部部分。它基于其处理神经肽N-乙酰天冬氨酰谷氨酸盐和谷氨酸缀合的叶酸衍生物的能力而形成具有谷氨酸羧肽酶活性的非共价同二聚体。PSMA通过胞吞途径快速有效地内化，并迅速再循环回到膜上。
基于抗体的疗法已经成为治疗肿瘤、炎症和传染病等领域中越来越多的人类恶性肿瘤的重要组分。在大多数情况下，治疗功能的基础是基于抗体的药物对其靶抗原具有高度的特异性和亲和力。用药物、毒素或放射性核素结合单克隆抗体(mAb)是单克隆抗体可能诱导治疗效果的另一种策略。通过将抗体的靶向特异性与毒性效应分子的肿瘤杀死力相结合，免疫缀合物允许靶标与正常组织之间的敏感区分，从而导致比大多数常规化学治疗药物更少的副作用。
然而，由于它们的大小和其他物理性质，单克隆抗体必须静脉内(iv)或皮下(sc)施用，因此具有较高的全身暴露量。因此，它们的递送途径通常可能不是最理想的，导致抗体在非疾病部位与靶抗原结合(可能损害正常、非疾病组织的健康功能)或导致次优PK/PD特征。由于次优的施用途径，任何一种结果都可能导致功效丧失和/或安全性受损。
随后开发并商业化了报道的第一种PSMA特异性mAb，即鼠mAb 7E11作为肿瘤成像的诊断剂(ProstaScint,Cytogen,Princeton,N.J.)。然而，该抗体识别细胞死亡后暴露的PSMA的细胞内表位，这限制了其作为用于检测PSMA的显像剂的用途。最近，鉴定了识别PSMA的细胞外部分的mAb，如J591。
本发明的目的是解决用于治疗前列腺癌的替代性抗体治疗的需要。
发明概述
本发明涉及结合人PSMA的结合分子。具体而言，本发明涉及结合包含两个或更多个单人重链可变(VH)结构域抗体的人PSMA的多价/多互补位结合分子。特别地，结合天然形式的人PSMA。在优选的实施方案中，单VH结构域由在表达人V基因座转基因并用PSMA抗原免疫的啮齿动物中产生的仅有重链的抗体产生。本发明结合分子中使用的单结构域抗体以单价形式结合靶标。单结构域抗体小于常规单克隆抗体形式，并且发明人已经显示与单克隆抗体基准相比，这样的分子促进了高水平的特异性肿瘤靶向、快速渗透进肿瘤中并高积累。如本文所示，与单价单结构域抗体相比，结合分子具有改善的性质，特别是它们表现出改善的细胞内化。与单克隆基准抗体相比，它们也显示出不同的性质。发明人还显示单结构域抗体以高亲和力结合人PSMA，非常稳定且表达水平高。此外，本发明的单VH结构域抗体比鼠抗体具有更低的免疫原性，并且不需要人源化。这些性质使得本发明的化合物特别适用于不同形式，例如以多价/多互补位形式并与毒素或半衰期延长部分缀合。这些化合物因此可用于治疗疾病，特别是癌症。一方面，本发明提供了包含多于一个本文所述的单VH结构域抗体的免疫缀合物。以下进一步总结本发明的各方面。
在一个方面，本发明因此涉及包含能够结合人PSMA的第一单人重链可变免疫球蛋白(VH)结构域抗体和能够结合人PSMA的第二单VH结构域抗体的结合分子。
在一个实施方案中，所述第一VH结构域和所述第二VH结构域结合人PSMA上的相同表位。
在一个实施方案中，所述第一单VH结构域抗体结合PSMA上的第一表位，并且所述第二单VH结构域抗体结合PSMA上的第二表位，其中所述第一表位和所述第二表位不相同。
本发明还涉及根据前一权利要求所述的结合分子，其中所述第一或第二单VH结构域抗体包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二单VH结构域抗体包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.83或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.183或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.279或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.295或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.303或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.331或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.363或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.367或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一和/或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.371或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一和/或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.375或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.379或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.383或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.387或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及结合分子，其中所述第一或第二VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.391或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
本发明还涉及根据权利要求3所述的结合分子，其中a)第一单VH结构域抗体选自家族2、3、4、7、9、10、11或14的单VH结构域抗体，并且其中b)第二单VH结构域抗体选自家族1、5、6、12或13。
本发明还涉及结合分子，其中a)第一单VH结构域抗体选自家族2的单VH结构域抗体，其中b)第二单VH结构域抗体选自家族1的单VH结构域抗体。所述第一单VH结构域抗体位于C或N端，使得任一方向都在本发明的范围内。
本发明还涉及结合分子，其中a)所述第一VH结构域能够与包含SEQ ID NO:4的
Figure BDA0001725348400000051
竞争结合PSMA和/或能够交叉阻断包含SEQ ID NO:4的
Figure BDA0001725348400000052
与PSMA的结合并且其中b)所述第二VH结构域能够与包含SEQ ID NO:76的
Figure BDA0001725348400000053
竞争结合PSMA和/或能够交叉阻断包含SEQ ID NO:76的
Figure BDA0001725348400000054
与PSMA的结合。
另一方面，本发明涉及包含本文所述的结合分子和药物载体的药物组合物。
另一方面，本发明涉及治疗前列腺癌或前列腺疾病的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述的结合分子或药物组合物。
另一方面，本发明涉及用作药物的本文所述的结合分子或药物组合物。
另一方面，本发明涉及用于治疗前列腺癌或前列腺疾病的本文所述的结合分子或药物组合物。
另一方面，本发明涉及本文所述的结合分子或药物组合物在制备用于治疗前列腺癌或前列腺疾病的药物中的用途。
另一方面，本发明涉及用于降低人PSMA活性的体内或体外方法，其包括使人PSMA与本文所述的结合分子接触。
另一方面，本发明涉及通过免疫测定确定测试样品中PSMA存在的方法，其包括使所述样品与本文所述的结合分子和至少一个可检测标记接触。
另一方面，本发明涉及包含本文所述的核酸的核酸构建体。
另一方面，本发明涉及包含本文所述的核酸或构建体的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及用于产生本文所述的结合分子的方法，其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸，并从宿主细胞培养物中分离所述结合分子。
另一方面，本发明涉及包含本文所述的结合分子或药物组合物的试剂盒。
另一方面，本发明涉及包含本文所述的一个或多个单结构域抗体的双互补位、二价或多特异性结合分子。
附图
图1.家族1序列。该图显示家族1中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图2.家族2序列。该图显示家族2中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图3.家族3序列。该图显示家族3中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图4.家族4序列。该图显示家族4中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图5.家族5序列。该图显示家族5中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图6.家族6序列。该图显示家族6中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图7.家族7序列。该图显示家族7中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图8.家族8序列。该图显示家族8中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图9.家族9序列。该图显示家族9中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图10.家族10序列。该图显示家族10中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图11.家族11序列。该图显示家族11中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图12.家族12序列。该图显示家族12中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图13.家族13序列。该图显示家族13中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图14.家族14序列。该图显示家族14中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图15.家族15序列。该图显示家族15中单结构域抗体的全长VH序列。框架(FR)和互补决定区(CDR)被标记。CDR1，CDR2和CDR3以粗体突出显示。
图16.纯化的抗PSMA VH在FMAT Mirrorball测定中的结合。16a●1.1,■3.1,▲2.10,▼2.1,16b●2.1,▲2.13,▼2.17◇2.15,○2.12Δ2.22 16c如从上至下由符号表示的测试的单结构域抗体●1.8,■1.10,▲1.11,▼1.12,1.13,○1.14,1.16,Δ1.17,1.18d)如从上至下由符号表示的测试的双互补位结合分子:L＝(G4S)6 1.1-L-2.1；1.16-L-2.1；1.11-L-2.1,1.18-L-2.1,1.17-2.1,1.1-2.17,1.16-L-2.17,1.11-L-2.17,1.18-L-2.17,1.17-L-2.17；e)1.1-L-2.15,1.16-L-2.15,1.11-L-2.15,1.18-L-2.15,1.17-L-2.15,1.1-L-2.22,1.16-L-2.22,1.11-L-2.22,1.11-L-2.22,1.18-L-2.22,1.17-L-L2.22
图17.纯化的抗PSMA单结构域抗体的
Figure BDA0001725348400000081
Green内化。使用单结构域抗体(图例中的从上到下的符号)：2.20、12.1、3.1、3.2、4.1、5.1、9.1、14.1、10.1、7.1。
图18.用抗-PSMA单结构域抗体A.2.1B.1.1杀伤cynoPSMA和人PSMA CHO。
图19.用抗-PSMA单结构域抗体杀伤LNCap。使用的单结构域抗体(图例中的从上到下的符号)：1.1、2.1、7.1、3.1、12.1、4.1。
图20.使用VH2.1-HIS的定位研究。VH染色主要定位于细胞膜上(由大箭头表示)，但在4℃和37℃下也可观察到一些内化(细箭头)，其形式为与LAMP-1(b)和EEA-1(a)一起定位的单个中心簇。
图21.定位研究使用二价VH构建体2.1-6GS-2.1-HIS。在4℃时，VH染色主要定位于细胞膜(大箭头)。在37℃下2小时后，膜染色显示更点状化(大箭头)，并且通过细胞内与LAMP-1(a)和EEA-1(b)一起定位的小VH簇的存在显示内化(细箭头)。
图22.使用VH1.1-HIS的定位研究。VH染色主要定位于细胞膜上(由大箭头表示)，但在4℃和37℃下也可存在一些内化(细箭头)，其形式为与LAMP-1(b)和EEA-1(a)一起定位的单个中心簇。
图23.定位研究使用双互补位VH构建体2.1-6GS-1.1-HIS。在4℃时，VH染色主要定位于细胞膜(大箭头)。在37℃下2小时后，膜染色几乎消失(大箭头)，并且如细胞内与LAMP-1(b)和EEA-1(a)一起定位的点状染色所示，VH被内化(细箭头)。
图24.使用基准抗PSMA IgG的定位研究。在4℃时，VH染色主要定位于细胞膜(大箭头)。在37℃下2小时后，膜染色更稀疏(大箭头)，并且大部分VH被内化，如通过细胞内与LAMP-1(b)和EEA-1(a)一起定位的簇所显示(细箭头)。
图25.使用1.1-6GS-2.1-HIS(上图)和2.1-6GS-1.1-HIS(下图)使用表达人PSMA的CHO细胞的定位研究。
图26.显示单体MMAE缀合的VH(A和B)，二价VH(C和D)和双互补位VH(E和F)对稳定表达人PSMA蛋白的人细胞和匹配的亲本细胞(PSMA阴性)在48小时的温育时间点的体外细胞毒性。
图27.显示了MMAE缀合的VH对稳定表达人PSMA蛋白的人类细胞在72小时温育时间点的体外细胞毒性。
图28显示用于制备HumabodyTM药物缀合物(HDC)的HiPEGTM val-cit-PAB-MMAE试剂(MW＝2805g/mol)。
图29.示出了用于产生Pro_006对照抗体药物缀合物(ADC)的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对-氨基苯甲酰基氧基羰基-单甲基澳瑞他汀E(mc-val-cit-PAB-MMAE)缀合试剂(MW＝1317g/mol)。
图30.A&B显示在PSMA-DU145细胞毒性测定(72h)中的IC50值：对照ADC mAb-MMAE(■)，2.1 6G4S-1.1-MMAE双互补位(▲)，2.16GS-1.1-MMAE-HLE半衰期延长的双互补位(▼)，HEL4-MMAE单价(●)和HEL4-HLE-MMAE单价半衰期延长的(I)，针对(A)表达PSMA的DU145细胞和(B)未经修饰以表达PSMA的DU145亲本细胞。
详述
现在将进一步描述本发明。在下面的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反指示，否则如此定义的每个方面可以与任何其他方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。
通常，与细胞和组织培养，病理学，肿瘤学，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及技术是本领域众所周知和常用的。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学，合成有机化学以及药物和药学化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制剂，配制品和递送以及患者的治疗。
本发明提供了与人PSMA结合的分离的形式化的结合分子，特别是包含至少两个结合人PSMA的单VH结构域抗体的那些，提供了包含这类结合分子的药物组合物，以及用于制备这类结合蛋白和片段的分离的核酸构建体、重组表达载体和分离的宿主细胞。还提供了使用本文公开的结合蛋白检测人PSMA，体外或体内抑制人PSMA的方法和治疗疾病的方法。本发明的一个方面提供了分离的人抗人PSMA结合分子，特别是包含多于一个以高亲和力和缓慢解离速率结合人PSMA的单VH结构域抗体或由其组成的那些。
本发明的PSMA结合分子结合野生型人PSMA(登录号NO.Q04609)。单体的序列如下所示(SEQ ID NO.529)。
Figure BDA0001725348400000101
在一个实施方案中，本发明的PSMA结合分子结合野生型人PSMA和/或食蟹猴PSMA。术语“PSMA结合分子”，“PSMA结合蛋白”，“抗PSMA单结构域抗体”或“抗PSMA抗体”如本文所用，都是指能够结合人PSMA抗原的分子。术语“PSMA结合分子”包括PSMA结合蛋白。可以通过标准方法(定性测定)显示结合反应，所述方法包括例如结合测定，竞争测定或用于确定PSMA与其受体结合的抑制的生物测定或任何种类的结合测定，参照其中具有不相关特异性的抗体的阴性对照试验。合适的测定显示在实施例中。
本发明的抗体或结合分子(包括本文所述的单结构域抗体和多价或多特异性结合剂)“结合”或“能够结合”感兴趣的抗原，例如，PSMA是以足够的亲和力结合PSMA抗原，使其可用于靶向表达抗原的细胞或组织的治疗中。
本发明的结合分子特异性结合人PSMA。换句话说，与PSMA抗原的结合明显不同于非特异性相互作用。优选地，用于本发明的结合分子中的单结构域抗体结合人PSMA并且还结合食蟹猴PSMA。针对本文使用的特定多肽靶标或特定多肽靶标上的表位的术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“是特异性的”可以例如通过针对所述靶标具有以下KD的分子来展示：至少约10-4M、备选地至少约10-5M、备选地至少约10-6M、备选地至少约10-7M、备选地至少约10-8M、备选地至少约10-9M、备选地至少约10-10M、备选地至少约10-11M、备选地至少约10-12M或更多。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。
一方面，本发明涉及包含能够结合人PSMA的第一单VH结构域抗体和能够结合人PSMA的第二部分的结合分子。单VH结构域抗体和第二部分优选共价连接，例如经由肽接头。第二部分可以是抗体，仅有重链的抗体(HCAb)，其片段或抗体拟似物。
一方面，本发明涉及包含能够结合人PSMA的第一单VH结构域抗体和能够结合人PSMA的第二单VH结构域抗体的结合分子。单VH结构域抗体优选共价连接，例如经由肽接头。
一方面，本发明涉及包括包含如本文所述能够结合人PSMA的VH结构域的HCAb和能够结合人PSMA的第二HCAb的结合分子。HCAb优选例如经由肽接头共价连接。
在一个实施方案中，仅有重链的抗体包含人可变区。在一个实施方案中，HCAb缺少CH1结构域。在一个实施方案中，HCAb包含鼠C区。在一个实施方案中，结合分子包含至少一个单VH结构域抗体。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的多价/多互补位的分离的结合分子，其包含如图1至15中任一图所示(参考表1至15)的包含CDR3序列的重链可变免疫球蛋白结构域(VH)或与其具有至少60％，70％，80％，90％，95％或更多序列同一性的序列。在一个实施方案中，结合分子包含一组CDR1、2和3序列，所述序列选自如图1至15中任一图中(参考表1至15)的任何克隆所显示的CDR1、2和3序列组。在一个实施方案中，结合分子包含具有一组CDR1、2和3序列的VH结构域，所述序列选自如图1至15中任一图中(参考表1至15)的任何克隆所显示的CDR1、2和3序列组。本发明的结合分子包含多于一个的单VH结构域抗体。
术语“单结构域抗体，可变单结构域或免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”在本领域中都是公知的，并描述了与靶抗原结合的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。如下所述，本发明各方面的优选实施方案涉及在不存在轻链的情况下结合PSMA抗原的单重链可变结构域抗体/免疫球蛋白重链单可变结构域。与人PSMA结合的单结构域抗体，可变单结构域或免疫球蛋白单可变结构域的片段也在本发明的范围内。单重链可变结构域抗体(VH)不包含免疫球蛋白轻链。人重链单可变(VH)结构域抗体是特别优选的。人重链单可变VH通常缩写为VH结构域。单VH结构域抗体在本文中也称为
Figure BDA0001725348400000121
Figure BDA0001725348400000122
是Crescendo Biologics Ltd.的注册商标。
因此，在一些优选的实施方案中，本发明的分离的结合剂/分子包含至少两个单VH结构域抗体，其中所述结构域优选为人重链可变结构域。因此，一方面，本发明的结合剂包含至少两个人免疫球蛋白单重链可变区；它们没有VL结构域。
每个单VH结构域抗体包含三个CDR和四个FR，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，在本发明的一个实施方案中，该结构域是具有以下式FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的人可变重链(VH)结构域。
术语“分离的”单结构域抗体是指基本上不含其他单结构域抗体，具有不同抗原特异性的抗体或抗体片段的单结构域抗体。此外，分离的单结构域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
在一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域抗体包含图1至15中任一图(参考表1至15)所示的CDR3序列或与其具有至少60％，70％，80％，90％，95％或更多的序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域包含一组CDR1、2和3序列，所述序列选自如图1至15中任一图(参考表1至15)的任何克隆所显示的CDR1、2和3序列组。在一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域抗体包含一组CDR1、2和3序列，所述序列选自如图1至15中任一图(参考表1至15)的任何克隆所显示的CDR1、2和3序列组。在一个实施方案中，结合分子是仅有重链的抗体(HCAb)。
在一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域抗体包含图1至15和表1至15中任一个所示的CDR3序列或与其具有至少60％，70％，80％，90％，95％或更多的序列同一性的序列。
在一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域抗体包含一组CDR1、2和3序列，所述序列选自如图1至15和表1至15中任一的任何sdAb所显示的CDR1、2和3序列组。在另一个实施方案中，所述第一或第二单VH结构域抗体从以下单VH结构域抗体1.1至1.20、2.1至2.25、3.1至3.24、4.1至4.4、5.1-5.2、6.1至6.7、7.1至7.8、8.1、9.1、10.1、11.1、12.1、13.1、14.1或15.1中进行选择。
在一个实施方案中，所述序列同源性或同一性为至少60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
“同源性"通常是指在引入缺口(如果需要)以获得最大百分比同源性之后，在一些实施方案中在比对序列后，候选序列中与其比较的多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。因此，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。N-或C-端延伸，标签或插入都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。
术语“抗体”广泛地指由四个多肽链(两个重链(H)和两个轻链(L)或其任何功能片段，突变体，变体或衍生物)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分(其保留了Ig分子的基本表位结合特征)。此类突变体，变体或衍生物抗体形式是本领域已知的。在全长抗体中，每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布于称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab')2，Fab，Fv，sFv等。全长抗体的功能片段保留全长抗体的靶特异性。因此，重组功能性抗体片段如Fab(片段，抗体)，scFv(单链可变链片段)和单结构域抗体(dAb)已被用于开发治疗剂作为基于mAb的治疗剂的替代方案。scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域VH和VL组成。自然地，VH和VL结构域通过疏水相互作用非共价缔合并倾向于解离。然而，通过将结构域与亲水性柔性接头连接以产生单链Fv(scFv)，可以构建稳定的片段。最小的抗原结合片段是单可变片段，即VH或VL结构域。靶标结合不需要分别与轻链/重链配偶体结合。这种片段用于单结构域抗体。单结构域抗体(～12至15kDa)因此具有VH或VL结构域。
因此，在本发明的一些优选实施方案中，结合分子不包含轻链。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH2和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含铰链区和重链结构域CH2和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH1，CH2和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH1，铰链区重链结构域CH2和重链结构域CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含轻链，重链结构域CH1，铰链区重链结构域CH2和重链结构域CH3。
每个VH结构域由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。可以对VH框架进行修饰以改善结合性质。例如，VH结构域可以包含C或N端延伸。在一个实施方案中，VH结构域包含1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外氨基酸的C端延伸。在一个实施方案中，VH结构域包含1至12个氨基酸残基的C端延伸，例如CH1结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸。在一个实施方案中，所述延伸包含至少1个丙氨酸残基，例如单个丙氨酸残基，一对丙氨酸残基或三联丙氨酸残基。这种延伸的VH结构域在本发明的范围内。同样在本发明的范围内的是包含VH结构域的结合分子，所述VH结构域包含另外的C或N末端残基，例如接头残基和/或His标签，例如六-His(HHHHHH，SEQ ID NO.530)或myc标签。例如，除了标签之外，也可以存在载体的另外残基。使用的结合分子可以具有另外的残基LEGGGSEQKLISEEDLNHHHHHHGS(SEQ ID NO.531)。
根据本发明的各个方面和实施方案，单结构域抗体的可变结构域优选为人可变结构域(VH)。如本文所用，人VH结构域包括完全人或基本完全人VH结构域。如本文所用，术语人VH结构域还包括从仅有重链的抗体分离的VH结构域，所述抗体由完全表达人免疫球蛋白重链基因座的转基因小鼠特别是应答于用感兴趣的抗原进行免疫(例如如WO 2016/062990和实施例中所描述的)而制备。在一个实施方案中，人VH结构域还可以包括源自或基于编码这种VH结构域的人VH结构域氨基酸或核酸序列的VH结构域。因此，该术语包括源自人种系免疫球蛋白序列或由其编码的可变重链区。基本上人VH结构域或源自或基于人VH结构域的VH结构域可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外引入的突变，例如通过随机或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变引入的)。因此术语“人VH结构域”还包括其中一个或多个氨基酸残基已被修饰的基本上人VH结构域。例如，与完全人序列相比，基本上人VH结构域的VH结构域可以包括多达10个，例如1、2、3、4或5个氨基酸修饰。然而，术语“人VH结构域”或“基本上人VH结构域”不意图包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。优选地，本文所用的术语“人VH结构域”也不打算包括骆驼化VH结构域，即，已经例如通过以下被在体外特异性修饰的人VH结构域：利用常规诱变方法选择VH结构域序列中的预定位置并在预定位置引入一个或多个点突变以将一个或多个预定残基改变为可在骆驼VHH结构域中发现的特定残基。
如本文所用，术语VH或“可变结构域”指由Kabat等,Sequences of ImmunologicalInterest,5th ed.,U.S.Dept.Health&Human Services,Washington,D.C.(1991)定义的免疫球蛋白可变结构域。CDR氨基酸残基在可变结构域内的编号和定位符合公知的Kabat编号惯例。
更特别地，本发明提供单VH结构域抗体或结合分子单VH结构域抗体，其中所述单VH结构域抗体以在此进一步描述的特别是在实施例中的亲和力，Kon-速率，Koff速率，KD和/或KA，EC50和IC50值与人PSMA结合。实施例中还显示了适用于测量这些值的测定。
本发明的结合分子包含氨基酸序列和优选的序列和/或其部分(如本文所定义的CDR)或由其组成。
术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，对于每个可变区，其被命名为CDR1，CDR2和CDR3。术语“CDR组”指出现在能够结合抗原的单个可变区中的一组三个CDR。根据不同的系统对这些CDR的确切边界进行了不同的定义。此处使用由Kabat描述的系统。术语“Kabat编号”，“Kabat定义”和“Kabat标记”在此可互换使用。本领域公认的这些术语是指编号氨基酸残基的系统，这些氨基酸序列比抗体或其抗原结合部分中重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更易变(即高变)(Kabat等,(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat,等,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。
结合分子可以是多价的，例如二价或多互补位，例如双互补位。因此，结合分子可以具有下式：VH(A)-VH(B)。每个VH包含CDR和FR区域。因此，结合分子可具有下式：FR1(A)-CDR1(A)-FR2(A)-CDR2(A)-FR3(A)-CDR3(A)-FR4(A)-FR1(B)-CD R1(B)-FR2(B)-CDR2(BA)-FR3(B)-CDR3(B)-FR4(B)。免疫球蛋白单可变结构域A(第一单VH结构域抗体)和B(第二单VH结构域抗体)的次序没有特别限制，使得在本发明的多肽内，免疫球蛋白单可变结构域A可位于N端并且免疫球蛋白单可变结构域B可以位于C端，反之亦然。VH结构域可以经由接头连接。
在一个实施方案中，结合分子是双互补位的。在双互补位结合分子中，两个结合部分结合靶分子上的不同表位。优选的双互补位结合分子包含与靶蛋白PSMA结合但在不同位点上结合的两个不同的单VH结构域抗体。这些位点可能会重叠。完整或部分阻断可以在表位分库(binning)研究中评估。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白，抗体或抗体片段(包括VH单结构域抗体)特异性结合的抗原(例如PSMA)表面上的位点。通常，抗原具有若干个或许多个不同的表位并与许多不同的抗体反应。该术语具体包括线性表位和构象表位。蛋白质抗原内的表位可以由连续的氨基酸(通常是线性表位)或通过蛋白质三级折叠(通常为构象性表位)并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个独特空间构象的氨基酸。确定给定抗体或抗体片段结合哪些表位的方法(即表位作图)在本领域中是公知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试了来自给定抗体或抗体片段的重叠或连续肽的反应性。当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体结合“基本上相同的表位”作为参考抗体。用于确定两个表位与相同或空间上重叠的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可以使用标记的抗原或标记的抗体以不同的形式配置。
在一个实施方案中，结合分子是二价的。二价结合分子包含两个
Figure BDA0001725348400000181
VH，它在相同的位点与相同的靶蛋白(PSMA)结合。在一个实施方案中，这样的分子可以包含相同的
Figure BDA0001725348400000182
VH。在另一个实施方案中，此类分子可以包含两个
Figure BDA0001725348400000183
VH，其是同一
Figure BDA0001725348400000184
VH家族的部分。在另一个实施方案中，此类分子可以包含两个
Figure BDA0001725348400000185
VH，其不是相同
Figure BDA0001725348400000186
VH的部分，但结合相同的位点。可以使用本领域已知的方法构建本发明的双互补位和二价结合分子。
如实验部分中更详细描述的，基于CDR3序列中的序列同源性，可以将可用于本发明的多互补位或多价结合分子的单VH结构域抗体分离并分为15个家族。通过优化过程，还产生了一组具有衍生自亲本CDR序列的CDR序列的变体单VH结构域抗体，以与亲本分子相比改善对PSMA的亲和力和/或改善效价。每个单VH结构域抗体具有一组CDR序列(CDR1、2和3)，如图1至15所示。进行表位结合研究以评估表位结合，如实施例11所示。例如，证明家族1中的单VH结构域抗体与家族2中的那些结合不同的表位。家族1单VH结构域抗体和家族2单VH结构域抗体的组合因此是本发明的双互补位结合分子的一个实施方案。家族1单VH结构域抗体可以位于C或N末端。在一个优选实施方案中，它位于N末端。
在一些实施方案中，第一或第二单VH结构域抗体是亲本分子(特别是选自sdAb1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、6.1、7.1、8.1、9.1、10.1、11.1、12.1、13.1、14.1或15.1的亲本VH单结构域抗体)的变体VH单结构域抗体，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或其它修饰，并且保留单结构域抗体的生物学功能。因此，变体VH单结构域抗体可以被序列工程化。修饰可包括编码单结构域抗体或多肽的一个或多个密码子的一个或多个取代、缺失或插入，与天然序列VH单结构域抗体或多肽相比，其导致氨基酸序列发生改变。氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸取代亮氨酸，即保守氨基酸取代。插入或缺失可以任选地在约1至5个氨基酸的范围内。所允许的变化可以通过系统地进行序列中氨基酸的插入、缺失或取代并针对全长或成熟天然序列所显示的活性测试所得变体来确定。本文所述的VH单结构域抗体的变体与非变体分子具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％,97％，98％或99％的序列同源性，优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，98％或99％的序列同源性。
在一个实施方案中，修饰是保守序列修饰。如本文所用，术语“保守序列修饰”意指不显着影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代，添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的结合分子，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括以下氨基酸：具有碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，单结构域抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定测试改变的抗体的保留功能(即，以上(c)至(l)所述的功能)。
在一些实施方案中，作为选自表1至15中所示的单结构域抗体的变体的VH单结构域抗体包含一个或多个序列修饰并且与未修饰的单结构域抗体相比，具有例如结合亲和力、特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、降低的免疫原性或溶解性等一种或多种性质的改善。
技术人员将知道，有不同的方式来鉴定、获得和优化如本文所述的抗原结合分子，包括体外和体内表达文库。这在实施例中进一步描述。可以使用本领域已知的优化技术，例如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如易错突变)。因此本发明还包含本文所述的单结构域抗体的序列优化的变体。
在一个实施方案中，可以进行修饰以降低单结构域抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基回复到相应的人种系序列。更具体而言，经历体细胞突变的单结构域抗体可含有不同于单结构域抗体所源自的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将单结构域抗体框架序列与单结构域抗体所源自的种系序列进行比较来鉴定。为了使框架区序列中的一个或多个氨基酸残基返回其种系构型，体细胞突变可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变被“回复突变”为种系序列。
另一种类型的框架修饰包括突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。在又一个实施方案中，抗体的糖基化被修改。例如，可以制备非糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。
在一个方面，结合分子包含单VH结构域抗体，其包含家族1或家族1样序列。在一个实施方案中，包含家族1或家族1样序列的两个VH结构域可以组合用于二价结合分子。在另一个实施方案中，包含家族1或家族1样序列的第一VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。在一个实施方案中，第一VH结构域包含SEQ ID NO:4，并且第二VH结构域包含SEQ ID NO:4。
在一个实施方案中，包含家族1或家族1样序列的第一VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或14或家族2、3、4、7、9、10、11或14样序列。在一个实施方案中，第一VH结构域包含SEQ ID NO:4，并且第二VH结构域包含SEQ ID NO:84。
家族1的单VH结构域抗体可以包括亲本(1.1；SEQ ID NO.4)或其部分的序列，例如CDR3序列，以及通过优化过程从亲本1.1衍生的序列，例如如图1所示的序列。如下所示，家族1中的CDR序列和全长VH序列根据表1进行编号。
Figure BDA0001725348400000211
Figure BDA0001725348400000221
Figure BDA0001725348400000231
表1.这显示了属于本发明范围内的家族1CDR序列和家族1全长VH序列的SEQ IDNO.。图1显示了相应的序列。家族1样序列是与本文中列出的家族1序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含选自SEQ IDNO.3，7，11，15，19，23，27，31，35，39，43，47，51，55，59，63，67，71，75或79的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或与其具有至少70％,至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或与其具有至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％同源性的序列。例如，CDR可以是从图1中所示的CDR中选择的CDR。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO.3或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图1中针对单VH结构域抗体1.1至1.20或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1，5，9，13，17，21，25，29，33，37，41，45，49，53，57，61，65，69，73或77或由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2，6，10，14，18，22，26，30，34，38，42，46，50，54，58，62，66，70，74或78或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3，7，11，15，19，23，27，31，35，39，43，47，51，55，59，63，67，71，75或79或由其组成。在一个实施方案中，CDR是SEQ ID NO.33。
在一个方面，如图1中的克隆1.1至1.20所示，单VH结构域抗体具有CDR1、CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.1，CDR2是SEQ ID NO.2并且CDR3是SEQ ID NO.3。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.5，CDR2是SEQ ID NO.6并且CDR3是SEQ ID NO.7。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.9，CDR2是SEQ ID NO.10并且CDR3是SEQ ID NO.11。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.13，CDR2是SEQ ID NO.14并且CDR3是SEQ ID NO.15。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.17，CDR2是SEQ ID NO.18并且CDR3是SEQ ID NO.19。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.21，CDR2是SEQ ID NO.22并且CDR3是SEQ ID NO.23。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.25，CDR2是SEQ ID NO.26并且CDR3是SEQ ID NO.27。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.29，CDR2是SEQ ID NO.30并且CDR3是SEQ ID NO.31。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.33，CDR2是SEQ ID NO.34并且CDR3是SEQ ID NO.35。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.37，CDR2是SEQ ID NO.38并且CDR3是SEQ ID NO.39。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.41，CDR2是SEQ ID NO.42并且CDR3是SEQ ID NO.43。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.45，CDR2是SEQ ID NO.46并且CDR3是SEQ ID NO.47。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.49，CDR2是SEQ ID NO.50并且CDR3是SEQ ID NO.51。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.53，CDR2是SEQ ID NO.54并且CDR3是SEQ IDNO.55。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.57，CDR2是SEQ ID NO.58并且CDR3是SEQID NO.59。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.61，CDR2是SEQ ID NO.62并且CDR3是SEQ ID NO.63。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.65，CDR2是SEQ ID NO.66并且CDR3是SEQ ID NO.67。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.69，CDR2是SEQ ID NO.70并且CDR3是SEQ ID NO.71。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.73，CDR2是SEQ ID NO.74并且CDR3是SEQ ID NO.75。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.77，CDR2是SEQ ID NO.78并且CDR3是SEQ ID NO.79。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体具有VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.4或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由它们组成。这些序列的CDR序列显示在图1中。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48，52，56，60，64，68，72 76或80或者由其组成。在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，例如SEQ ID NO.4，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4相比在框架区中包含一个或多个氨基酸取代(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代)的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQID NO.32或由其组成。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48，52，56，60，64，68，72，76或80或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含如SEQ ID NO.4或其变体所示的VH结构域，其中在所述变体中，残基33是T，36是L，残基57是D，残基59是N，R，A，D，H，残基63是D，Y，残基65是V，残基66是A，和/或残基67是F，N，A，D，V，T，S，Y。
在一个实施方案中，VH结构域如SEQ ID NO.4或其变体所示，其中所述变体与SEQID NO.4相比包括以下变化
-S77→N并且M78→T(如1.8所示)
-M34→L，D55→N，G56→H，D62→A，S63→T并且任选地S77→N并且M78→T(如1.20所示)
-M34→L，D55→N，G56→A，S63→F并且任选地S77→N并且M78→T(如1.10所示)
-M34→L，D55→N，G56→D，S63→F并且任选地S77→N并且M78→T(如1.11所示)
-M34→L，D55→N，G56→A，S63→A并且任选地S77→N并且M78→T(如1.12所示)
-M34→L，D55→N，G56→H，D62→A，S63→D并且任选地S77→N并且M78→T(如1.13所示)
-M34→L，D55→N，G56→A，S63→V并且任选地S77→N并且M78→T(如1.14所示)
-M34→L，D55→N，G56→H，D62→A，S63→F并且任选地S77→N并且M78→T(如1.15所示)
-M34→L，D55→N，G56→H，S63→T并且任选地S77→N并且M78→T(如1.16所示)
-M34→L，D55→N，G56→H，S63→T并且任选地S77→N并且M78→T(如1.17所示)
-M34→L，D55→N，G56→D，D62→A，S63→S并且任选地S77→N并且M78→T(如1.18所示)
-M34→L，D55→N，G56→A，D62→A，S63→Y并且任选地S77→N并且M78→T(如1.19所示)。
在一个实施方案中，可以包括另外的改变。在另一个实施方案中，上面列出的变体不包括另外的变化。
家族1中的单VH结构域抗体具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。术语“KD”如本申请中所用，是指“平衡解离常数”并且是指在平衡时的滴定测量中获得的值，或者通过将解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)得到的值。本申请中使用的“KA”是指亲和常数。结合速率常数，解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法在本领域中是公知的。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡状态下检查生理缓冲液中样品的能力。其他实验方法和仪器如
Figure BDA0001725348400000271
(生物分子相互作用分析)测定和实施例中描述的测定可用于测试本发明的结合分子。
在一个方面，本发明的结合分子包含一个或多个包含家族2或家族2样序列的人VH结构域。因此，在一个实施方案中，结合分子包含至少两个家族2的能够结合PSMA(优选人PSMA)的单VH结构域抗体或由其组成。在另一个实施方案中，一个包含家族2或家族2样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族2或家族2样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族2单VH结构域抗体可以包括衍生自亲本(2.1；SEQ ID NO:84)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本2.1衍生的VH序列或其部分，例如如图2所示。如下所示，家族2中的克隆的CDR序列和全长序列根据表2进行编号。
Figure BDA0001725348400000281
Figure BDA0001725348400000291
Figure BDA0001725348400000301
Figure BDA0001725348400000311
Figure BDA0001725348400000321
表2.这显示了属于本发明范围内的家族2CDR序列和家族2全长VH序列的SEQ IDNO。图2显示了相应的序列。家族2样序列是与本文中列出的家族2序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.83或与SEQID NO.83具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.83，87，91，95，99，103，107，111，115，119，123，127，131，135，139，143，147，151，155，159，163，167，171，175或179的CDR3。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个包含CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.75或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族2家族2样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的人VH结构域，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.81或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.82或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.83或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.81或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.82或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.83或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图2中针对sdAb 2.1至2.25或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.81，85，89，93，97，101，105，109，113，117，121，125，129，133，137，141，145，149，153，157，161，165，169，173或177或由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.82，86，90，94，98，102，106，110，114，118，122,126，130，134，138，142，146，150，154，158，162，166，170，174或178或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.SEQ ID NO.783，87，91，95，99，103，107，111，115，119，123，127，131，135，139，143，147，151，155，159,163，167，171，175或179或由其组成。
在一个方面，单VH结构域抗体具有如图2中的2.1至2.25所示的CDR1、CDR2和CDR3的组合。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.81，CDR2是SEQ ID NO.82并且CDR3是SEQID NO.83。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.85，CDR2是SEQ ID NO.86并且CDR3是SEQ ID NO.87。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.89，CDR2是SEQ ID NO.90并且CDR3是SEQ ID NO.91。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.93，CDR2是SEQ ID NO.94并且CDR3是SEQ ID NO.95。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.97，CDR2是SEQ ID NO.98并且CDR3是SEQ ID NO.99。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.101，CDR2是SEQ IDNO.102并且CDR3是SEQ ID NO.103。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.104，CDR2是SEQ ID NO.105并且CDR3是SEQ ID NO.106。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.108，CDR2是SEQ ID NO.109并且CDR3是SEQ ID NO.110。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.112，CDR2是SEQ ID NO.113并且CDR3是SEQ ID NO.115。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.117，CDR2是SEQ ID NO.118并且CDR3是SEQ ID NO.119。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.121，CDR2是SEQ ID NO.122并且CDR3是SEQ ID NO.123。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.125，CDR2是SEQ ID NO.127并且CDR3是SEQ ID NO.127。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.129，CDR2是SEQ ID NO.130并且CDR3是SEQ ID NO.131。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.133，CDR2是SEQ ID NO.134并且CDR3是SEQ IDNO.135。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.137，CDR2是SEQ ID NO.138并且CDR3是SEQ ID NO.139。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.140，CDR2是SEQ ID NO.141并且CDR3是SEQ ID NO.142。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.144，CDR2是SEQ IDNO.145并且CDR3是SEQ ID NO.146。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.148，CDR2是SEQ ID NO.149并且CDR3是SEQ ID NO.150。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.152，CDR2是SEQ ID NO.153并且CDR3是SEQ ID NO.154。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.157，CDR2是SEQ ID NO.158并且CDR3是SEQ ID NO.159。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.161，CDR2是SEQ ID NO.162并且CDR3是SEQ ID NO.163。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.165，CDR2是SEQ ID NO.166并且CDR3是SEQ ID NO.167。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.169，CDR2是SEQ ID NO.170并且CDR3是SEQ ID NO.171。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.173，CDR2是SEQ ID NO.174并且CDR3是SEQ ID NO.175。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.177，CDR2是SEQ ID NO.178并且CDR3是SEQ IDNO.179。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.84或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图2中。例如，单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，144，148，152，156，160，164，168，172，176或180或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，例如SEQ ID NO.84，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.84或其变体，其中所述变体与SEQ ID NO.76相比具有以下氨基酸取代：残基34是L，V，M，Q，T，F，残基50是H，V，L，I，残基55是E，K，A，L，残基58是R，残基62是E，P，R，S，A，残基63是E，残基64是N，K，P，L，G，S，残基79是K，残基是L，Q，残基84是K，A，残基是D。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含如SEQ ID NO.4所示的VH或其变体或由其组成，其中所述变体与SEQ ID NO.84相比包括以下变化：
1)M34→L34，G55→A55并且S63→N63(如2.13所示),
2)G55→A55，G55→A55并且S63→N63(如2.17所示),
3)M34→L34，G55→K55并且S63→K63(如2.15所示),
4)G55→K55，并且S63→K63(如2.15所示)或
5)M34→L34，G55→E55并且D62→S62(如2.11所示)。
在一个实施方案中，可以包括另外的改变。在另一个实施方案中，上面列出的变体不包括另外的变化。在一个实施例中，变体不包括以下变化的组合：G55→A55，S63→N63，D99→N99以及P100→T100；G34→L34，G55→K55以及S63→K63；G55→T55，S63→R63，D99→G99以及P100→R100。
家族2或家族2样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，能够结合人PSMA的结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族3或家族3样序列。
在一个实施方案中，包含家族3或家族3样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族3或家族3样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族3或家族3样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族3或家族3样单VH结构域抗体可以包括亲本序列和衍生自亲本(3.1；SEQ IDNO:184)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本3.1衍生的VH序列或其部分，例如如图3所示。如下所示，家族3中的克隆的CDR序列和全长序列根据表3进行编号。
Figure BDA0001725348400000361
Figure BDA0001725348400000371
Figure BDA0001725348400000381
Figure BDA0001725348400000391
表3.这显示了属于本发明范围内的家族3CDR序列和家族3全长VH序列的SEQ IDNO。图3显示了相应的序列。家族3样序列是与本文中列出的家族3序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族3或家族3-样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.183或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.183或与SEQ ID NO.183具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中,同源性是至少90％。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO.183或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族3家族3样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.181或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.182或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.183或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.181或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.182或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.183或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图3中针对sdAb 3.1至3.24或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.181，185，189，193，197，201，205，209，213，217，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269或273或由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.182，186，190，194，198，202，206，210，214，218，222，226，230，234，238，242，246，250，254，258，262，266，270或274或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.183，187，191，195，199，203，207，211，215，219，223，227，231，235，239，243或247，251，255，259，263，267，271或275或由其组成。
在一个方面，本发明涉及单VH结构域抗体，其具有如图3中的3.1至3.24所示的CDR1，CDR2和CDR3的组合。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.181，CDR2是SEQ IDNO.182并且CDR3是SEQ ID NO.183。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.185，CDR2是SEQID NO.186并且CDR3是SEQ ID NO.187。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.189，CDR2是SEQ ID NO.190并且CDR3是SEQ ID NO.191。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.193，CDR2是SEQ ID NO.194并且CDR3是SEQ ID NO.195。在一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.197，CDR2是SEQ ID NO.198并且CDR3是SEQ ID NO.199。在一个实施方案中，CDR1是SEQID NO.201，CDR2是SEQ ID NO.202并且CDR3是SEQ ID NO.203。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.205，CDR2是SEQ ID NO.206并且CDR3是SEQ ID NO.207。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.209，CDR2是SEQ ID NO.210并且CDR3是SEQ ID NO.211。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.213，CDR2是SEQ ID NO.214并且CDR3是SEQ ID NO.215。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.217，CDR2是SEQ ID NO.218并且CDR3是SEQ ID NO.219。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.221，CDR2是SEQ ID NO.222并且CDR3是SEQ ID NO.223。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.225，CDR2是SEQ ID NO.226并且CDR3是SEQ IDNO.227。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.229，CDR2是SEQ ID NO.230并且CDR3是SEQID NO.231。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.233，CDR2是SEQ ID NO.234并且CDR3是SEQ ID NO.235。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.237，CDR2是SEQ ID NO.238并且CDR3是SEQ ID NO.239。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.241，CDR2是SEQ ID NO.242并且CDR3是SEQ ID NO.243。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.245，CDR2是SEQ IDNO.246并且CDR3是SEQ ID NO.247。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.249，CDR2是SEQID NO.250并且CDR3是SEQ ID NO.251。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.253，CDR2是SEQ ID NO.254并且CDR3是SEQ ID NO.255。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.257，CDR2是SEQ ID NO.258并且CDR3是SEQ ID NO.259。在一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.261，CDR2是SEQ ID NO.262并且CDR3是SEQ ID NO.263。在一个实施方案中，CDR1是SEQID NO.265，CDR2是SEQ ID NO.266并且CDR3是SEQ ID NO.267。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.269，CDR2是SEQ ID NO.270并且CDR3是SEQ ID NO.271。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.273，CDR2是SEQ ID NO.274并且CDR3是SEQ ID NO.275。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.180或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图3中。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.184，188，192，196，200，204，208，212，216，220，224，228，232，236，240，244，248，252，256，260，264，268，272或276或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.184，188，192，196，200，204，208，212，216，220，224，228，232，236，240，244，248，252，256，260，264，268，272或276或与其具有至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。下面列出了这些序列的CDR序列。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族3或家族3样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，能够结合人PSMA的结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族4或家族4样序列。
在一个实施方案中，包含家族4或家族4样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族4或家族4样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族4或家族4样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族4单VH结构域抗体包括亲本序列和衍生自亲本(4.1；SEQ ID NO:279)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本4.1衍生的VH序列或其部分，例如如图4所示。如下所示，家族4中的CDR序列和全长序列根据表4进行编号。
Figure BDA0001725348400000441
表4.这显示了属于本发明范围内的家族4CDR序列和家族4全长VH序列的SEQ IDNO。图4显示了相应的序列。家族4样序列是与本文中列出的家族4序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族4或家族4样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.279或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.279，282，287或291的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.279或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族4或家族4样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.277或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.278或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.279或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.277或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.278或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.279或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图4中针对克隆4.1至4.4或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.277，281，285或289或由其组成；CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.278，282，286或290或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.279，283，287或291或由其组成。
在一个方面，单VH结构域抗体具有如图4中针对4.1至4.4所示的CDR1，CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.277，CDR2是SEQ ID NO.278并且CDR3是SEQ ID NO.279。因此，CDR1是SEQ ID NO.281，CDR2是SEQ ID NO.282并且CDR3是SEQ IDNO.283。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.285，CDR2是SEQ ID NO.286并且CDR3是SEQID NO.287。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.289，CDR2是SEQ ID NO.290并且CDR3是SEQ ID NO.291。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.280或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图4中。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.280，284，288或290或由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.280，284，288或290或与其具有至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。下面列出了这些序列的CDR序列。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族4或家族4样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族5或家族5样序列。
在一个实施方案中，结合分子包含以下结合分子或由其组成，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA(优选人PSMA)的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域并且其中所述PSMA结合分子包含家族5或家族5序列。在一个实施方案中，包含家族5或家族5样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族5或家族5样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
在一个实施方案中，一个包含家族5或家族5样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或14或家族2、3、4、7、9、10、11或14样序列。
家族5的单VH结构域抗体包括衍生自亲本(5.1；SEQ ID NO:292)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本5.1衍生的VH序列或其部分，例如如图5所示。如下所示，家族5中的CDR序列和全长序列根据表5进行编号。
Figure BDA0001725348400000471
表5.这显示了属于本发明范围内的家族5CDR序列和家族5长度VH序列的SEQ IDNO。图5显示了相应的序列。家族5样序列是与本文中列出的家族5样序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族5或家族5样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.295或与SEQ ID NO.295具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.295和299的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.295或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族5或家族5样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.293或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.294或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.295或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.293或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.294或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.295或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图5中针对克隆5.1和5.2或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.293或297或由其组成；CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.294或2984或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.295或299或由其组成。
在一个方面，本发明涉及VH结构域，其具有图5中针对5.1至5.2所示的CDR1，CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.293，CDR2是SEQ ID NO.294并且CDR3是SEQ ID NO.295。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.297，CDR2是SEQ IDNO.298并且CDR3是SEQ ID NO.299。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.296或300与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图5中。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.296或300或由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族5或家族5样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族6或家族6样序列。
在一个方面，能够结合人PSMA的结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族6或家族6样序列。在一个实施方案中，包含家族6或家族6样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族6或家族6样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
在一个实施方案中，一个包含家族6或家族6样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或14或家族2、3、4、7、9、10、11或14样序列。
家族6单VH结构域抗体包括亲本(6.1；SEQ ID NO:304)或其部分(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本6.1衍生的VH序列或其部分，例如如图3所示。如下所示，家族6中的CDR序列和全长序列根据表6进行编号。
Figure BDA0001725348400000501
Figure BDA0001725348400000511
表6.这显示了属于本发明范围内的家族6CDR序列和家族6全长VH序列的SEQ IDNO。图6显示了相应的序列。家族6样序列是与本文中列出的家族6序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族6或家族6样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.303或与SEQ ID NO.303具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中,同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.303，307，311，315，319，323或327的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.303或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族6或家族6样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.301或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.302或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.303或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.301或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.302或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.303或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图6中针对克隆6.1至6.7或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.301，305，309，313，317，321，325或由其组成；CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.302，306，310，314，318，322，326或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.303，307，311，315，319，323，327或由其组成。
在一个方面，单VH结构域抗体具有如图6中针对6.1至6.7所示的CDR1，CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.301，CDR2是SEQ ID NO.302并且CDR3是SEQ ID NO.303。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.305，CDR2是SEQ ID NO.306并且CDR3是SEQ ID NO.307。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.309，CDR2是SEQ IDNO.310并且CDR3是SEQ ID NO.311。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.313，CDR2是SEQID NO.314并且CDR3是SEQ ID NO.315。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.317，CDR2是SEQ ID NO.318并且CDR3是SEQ ID NO.319。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.321，CDR2是SEQ ID NO.322并且CDR3是SEQ ID NO.323。在一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.325，CDR2是SEQ ID NO.326并且CDR3是SEQ ID NO.327。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.304与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图6中。例如，VH结构域包含304，308，312，316，320，324或328或由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.304，308，312，316，320，324或328或与其具有至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族6或家族6样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族7或家族7样序列。
在一个方面，能够结合人PSMA的结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族7或家族7样序列。在一个实施方案中，包含家族7或家族7样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族7或家族7样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在一个实施方案中，一个包含家族7或家族7样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族7或家族7样序列包括亲本序列和衍生自亲本(7.1)或其部分的克隆的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本7.1衍生的VH序列或其部分，例如如图7所示。如下所示，家族7中的CDR序列和全长序列根据表7进行编号。
Figure BDA0001725348400000541
Figure BDA0001725348400000551
Figure BDA0001725348400000561
表7.这显示了属于本发明范围内的家族7CDR序列和家族7全长VH序列的SEQ IDNO。图7显示了相应的序列。家族7样序列是与本文中列出的家族7序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族7或家族7样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.331或与SEQ ID NO.331具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中,同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.331，335，339，343，347，351，355或359的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.331或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族7或家族7样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.329或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.330或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.331或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.329或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.330或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.331或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图7中针对克隆7.1至7.8或其组合所示。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.329，333，337，341，345，349，353或357或由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.330，334，338，342，346，350，354或358或由其组成并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.331，335，339，343，347，351，355或359或由其组成。
在一个方面，单VH结构域抗体具有如图7中针对7.1至7.8所示的CDR1，CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.329，CDR2是SEQ ID NO.330并且CDR3是SEQ ID NO.331。因此，在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.333，CDR2是SEQ ID NO.334并且CDR3是SEQ ID NO.335。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.337，CDR2是SEQ IDNO.338并且CDR3是SEQ ID NO.339。在一个实施方案中，n CDR1是SEQ ID NO.341，CDR2是SEQ ID NO.342并且CDR3是SEQ ID NO.343。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.345，CDR2是SEQ ID NO.346并且CDR3是SEQ ID NO.347。在一个实施方案中，CDR1是SEQ IDNO.349，CDR2是SEQ ID NO.350并且CDR3是SEQ ID NO.351。在一个实施方案中，CDR1是SEQID NO.353，CDR2是SEQ ID NO.354并且CDR3是SEQ ID NO.355。在一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.357，CDR2是SEQ ID NO.358并且CDR3是SEQ ID NO.359。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.332与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，同源性为至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。这些序列的CDR序列显示在图2中。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.332，336，340，344，348，352，356或360或由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.332，336，340，344，348，352，356，360或与其具有至少70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族7或家族7样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族8或家族8样序列。
家族8或家族8样序列包括亲本序列和衍生自亲本(8.1，SEQ ID NO.36)或其部分的克隆的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本8.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，8.1中的CDR序列和全长序列根据表8进行编号。
Figure BDA0001725348400000581
Figure BDA0001725348400000591
表8.这显示了属于本发明范围内的家族8CDR序列和家族8全长VH序列的SEQ IDNO。图8显示了相应的序列。家族8样序列是与本文中列出的家族8序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族8或家族8样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.363或与SEQ ID NO.363具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含具有SEQ ID NO.363的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.363或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族8或家族8样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.361或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.362或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.363或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.361或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.362或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.363或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图8中针对sdAb 8.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.364或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族8或家族8样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族9或家族9样序列。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族9或家族9样序列。在一个实施方案中，包含家族9或家族9样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族9或家族9样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族9或家族9样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族9或家族9序列包括亲本序列和衍生自亲本(9.1，SEQ ID NO.368)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本9.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，9.1中的CDR序列和全长序列根据表9进行编号。
Figure BDA0001725348400000611
表9.这显示了属于本发明范围内的家族9CDR序列和家族9全长VH序列的SEQ IDNO。图9显示了相应的序列。家族9样序列是与本文中列出的家族9序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族9或家族9样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.367或与SEQ ID NO.367具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.367或与SEQ IDNO.367具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中,同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.367的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含CDR3，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ IDNO.363或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族9或家族9样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.365或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.366或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO.367或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.365或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.366或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.367或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图9中针对克隆9.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.368或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族9或家族9样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族10或家族10样序列。
在一个实施方案中，包含家族10或家族10样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族10或家族10样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族10或家族10样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。家族10或家族10序列包括亲本序列和衍生自亲本(10.1)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本10.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，10.1中的CDR序列和全长序列根据表10进行编号。
Figure BDA0001725348400000631
表10.这显示了属于本发明范围内的家族10CDR序列和家族10全长VH序列的SEQID NO。图10显示了相应的序列。家族10样序列是与本文中列出的家族10序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个方面，本发明涉及包含人VH结构域的家族10或家族10样结合分子，所述人VH结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.371或与SEQ ID NO.371具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，家族10和家族10样结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.371或与SEQ ID NO.371具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.371的CDR3。
在一个实施方案中，所述结构域并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.369或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.370或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.371或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.369或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.370或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.371或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图10中针对克隆10.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.372或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族10或家族10样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含VH结构域，所述VH结构域包含家族11或家族11样序列。在一个实施方案中，包含家族11或家族11样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族11或家族11样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族11或家族11样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族11或家族11序列包括亲本序列和衍生自亲本(11.1，SEQ ID NO.376)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本11.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，11.1中的CDR序列和全长序列根据表11进行编号。
Figure BDA0001725348400000661
表11.这显示了属于本发明范围内的家族11CDR序列和家族11全长VH序列的SEQID NO。图11显示了相应的序列。家族11样序列是与本文中列出的家族11序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.375或与SEQ ID NO.375具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.375的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.375或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族11或家族11样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.373或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.374或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.375或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.373或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.374或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.375或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图11中针对sdAb 11.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.376或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族11或家族11样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族12或家族12样序列。在一个实施方案中，包含家族12或家族12样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族12或家族12样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
在一个实施方案中，一个包含家族12或家族12样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或14或家族2、3、4、7、9、10、11或14样序列。
家族12或家族12样序列包括亲本序列和衍生自亲本(12.1，SEQ ID NO.380)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本12.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，12.1中的CDR序列和全长序列根据表12进行编号。
Figure BDA0001725348400000681
表12.这显示了属于本发明范围内的家族12CDR序列和家族12全长VH序列的SEQID NO。图12显示了相应的序列。家族12样序列是与本文中列出的家族12序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.379或与SEQ ID NO.379具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.379的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.379或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族12或家族12样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.377或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.378或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.379或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.377或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.378或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.379或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图12中针对克隆12.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.380或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族12或家族12样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族13或家族13样序列。在一个实施方案中，包含家族13或家族13样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族13或家族13样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
在一个实施方案中，一个包含家族13或家族13样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或14或家族2、3、4、7、9、10、11或14样序列。
家族13或家族13样序列包括亲本序列和衍生自亲本(13.1，SEQ ID NO.384)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本13.1衍生的克隆的VH序列或其部分，如下所示，13.1中的CDR序列和全长序列根据表13进行编号。
Figure BDA0001725348400000701
Figure BDA0001725348400000711
表13.这显示了属于本发明范围内的家族13CDR序列和家族13全长VH序列的SEQID NO。图13显示了相应的序列。家族13样序列是与本文中列出的家族13序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.383或与SEQ ID NO.383具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.383的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.383或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族13或家族13样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.381或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.382或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.383或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.381或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.382或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.383或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图13中针对克隆13.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.384或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族13或家族13样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族14或家族14样序列。在一个实施方案中，包含家族14或家族14样序列的两个VH结构域可以组合成二价结合分子。在另一个实施方案中，一个包含家族14或家族14样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成二价结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的相同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族2、3、4、7、9、10、11或家族2、3、4、7、9、10、11样序列。
在另一个实施方案中，一个包含家族14或家族14样序列的VH结构域可以与如本文所述的第二VH结构域组合成双互补位结合分子，所述第二VH结构域结合PSMA的不同表位、部分、结构域、亚基或确认。第二VH结构域可以选自家族1、5、6、12或13或家族1、5、6、12或13样序列。
家族14或家族14序列包括亲本序列和衍生自亲本(14.1)或其部分的克隆的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本14.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，14.1中的CDR序列和全长序列根据表14进行编号。
Figure BDA0001725348400000731
表14.这显示了属于本发明范围内的家族14CDR序列和家族14全长VH序列的SEQID NO。图14显示了相应的序列。家族14样序列是与本文中列出的家族14序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.387或与SEQ ID NO.387具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.387的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.385或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族14或家族14样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.385或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.386或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.387或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.385或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.386或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.387或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图14中针对克隆14.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.388或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族14或家族14样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值
在一个方面，本发明涉及能够结合人PSMA的结合分子，所述结合分子包含人VH结构域，所述人VH结构域包含家族15或家族15样序列。在一个实施方案中，结合分子包含至少两个一个家族15或家族15序列的能够结合PSMA(优选人PSMA)的单VH结构域抗体。家族15单VH结构域抗体包括亲本序列和衍生自亲本(15.1)或其部分的序列(例如CDR3序列)以及通过优化过程从亲本15.1衍生的VH序列或其部分，如下所示，15.1中的CDR序列和全长序列根据表15进行编号。
Figure BDA0001725348400000751
表15.这显示了属于本发明范围内的家族15CDR序列和家族15全长VH序列的SEQID NO。图15显示了相应的序列。家族15样序列是与本文中列出的家族15序列具有特定百分比序列同一性的变体。
在一个实施方案中，VH结构域包含至少一个抗原结合位点，所述抗原结合位点包含CDR3序列，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.391或与SEQ ID NO.391具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，同源性是至少90％。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.391的CDR3。
在一个实施方案中，单VH结构域抗体包含至少一个包含高变区CDR3的抗原结合位点，所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO.391或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列。在一个实施方案中，家族15或家族15样序列包含结合分子，所述结合分子包含至少一个能够结合PSMA的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述PSMA结合分子包含至少一个包含高变区CDR1，CDR2和CDR3的抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.389或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.390或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.391或与其具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.389或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.390或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQID NO.391或与其具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％,80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列如图15中针对克隆15.1所示。
在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.392或与其具有至少40％，50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列之一，但包含一个或多个氨基酸取代，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代在一个或多个框架区中。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在一个或多个CDR中。在一个实施方案中，氨基酸取代在框架和CDR序列中。
家族15或家族15样结合分子具有如本文进一步描述和如实施例中所示的KD，Koff，KA，Kd，EC50和IC50值。
一方面，单VH结构域抗体包含与来自本文所列另一家族的CDR1和CDR2序列组合的选自以下的CDR3序列：家族1或家族1样，家族2或家族2样，家族3或家族3样，家族4或家族4样，家族5或家族5样，家族6或家族6样，家族7或家族7样，家族8或家族8样，家族9或家族9样，家族10或家族10样，家族11或家族11样，家族12或家族12样，家族13或家族13样，家族14或家族14样，或家族15或家族15样CDR3序列。
例如，单VH结构域抗体包含与来自如表2至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族1或家族1样CDR3序列。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1，3至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族2或家族2样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1，2，4至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族3或家族3样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至3，5至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族4或家族4样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至4，6至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族5或家族5样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至5，7至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族6或家族6样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至6，8至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族7或家族7样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至7，9至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族8或家族8样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至8，10至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族9或家族9样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至4，11至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族10家族10样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至10，12至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族11或家族11样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至11，13至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族12或家族12样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至12，14至15中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族13或家族13样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
另一方面，单VH结构域抗体包含与来自如表1至14中任一个所示的一个或两个其他家族的CDR1和CDR2序列组合的家族15或家族15样CDR3序列。本领域技术人员可以理解，各种组合是可能的。
本发明还涉及结合分子，所述结合分子包含选自以上描述的并且在表1至15中的任一个中列出的VH结构域之一的第一VH结构域，所述第一VH结构域连接至选自上文描述的并且表1至15中的任一个中列出的第二VH结构域，其中所述第一VH结构域在竞争性测定中与第二VH结构域竞争结合PSMA。
本发明还涉及结合分子，所述结合分子包含选自以上描述的并且在表1至15中的任一个中列出的VH结构域之一的第一VH结构域，所述第一VH结构域连接至选自上文描述的并且表1至15中的任一个中列出的第二VH结构域，其中所述第一VH结构域在竞争性测定中不与第二VH结构域竞争结合PSMA。
在优选的实施方案中，结合分子是双互补位或多互补位的并且包含选自如表1中所示的单结构域抗体1.1至1.20的第一单VH结构域抗体，以及选自表2中所示的2.1至2.25的第二单VH结构域抗体。例如，第一单VH结构域抗体选自如表1所示的单结构域抗体1.1，1.8-1.20，并且第二单VH结构域抗体选自如表2所示的2.1，2.2，2.11-2.19，2.22-2.25。在另一个实施方案中，结合分子包含选自如表2中所示的单结构域抗体2.1至2.25的第一单结构域抗体和如表1中所示的选自1.1至1.20的第二VH单结构域抗体。例如，第一单VH结构域抗体选自如表2所示的单结构域抗体2.1，2.2，2.11-2.19，2.22-2.25，并且第二单VH结构域抗体选自如表1所示的1.1，1.8-1.20。单结构域抗体用(G4S)n接头(优选(G4S)n)连接。在进一步优选的实施方案中，结合分子选自包含以下组分的结合分子：单VH结构域抗体-接头-单VH结构域抗体，如下：
1.1-6GS-2.1，1.8-6GS-2.1，1.1-6GS-2.17，1.1-6GS-2.15，1.1-6GS-2.22，1.16-6GS-2.1，1.16-6GS-2.17，1.16-6GS-2.15，1.16-6GS-2.22，1.11-6GS-2.1，1.11-6GS-2.17，1.11-6GS-2.15，1.11-6GS-2.22，1.18-6GS-2.1，1.18-6GS-2.17，1.18-6GS-2.15，1.18-6GS-2.22，1.17-6GS-2.1，1.17-6GS-2.17，1.17-6GS-2.15或1.17-6GS-2.22。
在另一个实施方案中，如上所述的单VH结构域抗体可以用与单结构域抗体结合人PSMA上的相同表位的结合分子例如抗体，抗体片段或抗体拟似物(即，具有与本文所述任何单结构域抗体交叉竞争结合PSMA的能力的抗体)来代替。因此本文所述的单结构域抗体可以用作参照抗体。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体是单结构域抗体1.1，2.1，3.1，4.1，5.1，6.1，7.1，8.1，9.1，10.1，11.1，12.1，13.1，14.1或15.1。这种交叉竞争抗体可基于它们在标准PSMA结合测定中与本文所述的任何单结构域抗体交叉竞争的能力来鉴定。例如，
Figure BDA0001725348400000801
分析，ELISA测定或流式细胞术可用于证明与本发明的单结构域抗体的交叉竞争。在一个实施方案中，本发明提供了能够结合人PSMA的结合剂，其中在竞争性测定中以上描述的任何一种单结构域抗体取代所述结合剂。
本文所述的结合分子可以作为与一个或多个另外的蛋白质部分的融合蛋白提供。
第二部分可以包含对人PSMA也是特异性的VH结构域，从而提供二价结合分子。在一个实施方案中，结合分子是双互补位的。双互补位结合分子包含结合不同表位的抗原结合部分。本发明的双互补位结合分子可以使用已知技术的方法构建。
连接结合分子的各部分的合适接头包括肽接头，例如包含GS残基的接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-10，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10。如本文所用，GS表示Gly4Ser。(Gly4Ser)n也在本文中表示为nGS。
在另一个实施方案中，结合分子可以包含对不同抗原具有特异性的另外部分以提供双特异性结合分子。如本文所用，术语“双特异性结合分子”因此是指多肽，所述多肽包含如本文所述的结合分子(其具有对PSMA具有结合特异性的结合位点)以及第二多肽域(其具有对第二靶标具有结合特异性的结合位点)，即双特异性结合分子具有对两个靶标的特异性。第一靶标和第二靶标不相同，即是不同的靶标，例如蛋白质；两者都可能存在于细胞表面。因此，如本文所述的双特异性结合分子可以选择性且特异性地结合表达第一靶标和第二靶标(或显示在其细胞表面上)的细胞。在另一个实施方案中，结合分子包含多于两个抗原结合部分。
在另一个实施方案中，超过两个部分连接在一起提供多特异性结合分子。如本文所述的多特异性多肽试剂除了可以结合PSMA之外还可以结合一个或多个另外的靶标，即多特异性多肽可以结合至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个或更多个靶标，其中多特异性多肽试剂分别具有至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个或更多个靶结合位点。
如本文所使用的，术语“靶标”指具有结合位点的多肽结构域可选择性结合的生物分子(例如，抗原，肽，多肽，蛋白质，脂质，碳水化合物)。靶标可以是例如细胞内靶标(例如细胞内蛋白质靶标)或细胞表面靶标(如膜蛋白，例如受体蛋白)。优选地，靶标是细胞表面靶标，例如细胞表面蛋白质。优选地，第一细胞表面靶标和第二细胞表面靶标都存在于细胞上。在一个实施方案中，靶标是免疫肿瘤学靶标。
本发明的多特异性抗体可以使用已知技术的方法构建。
如果需要，双特异性或多特异性结合分子可以与包含CH2和CH3结构域中的一个或两个以及任选的铰链区的抗体Fc区或其片段连接。例如，编码作为单个核苷酸序列连接到Fc区或其片段的双特异性或多特异性结合分子的载体可用于制备这样的多肽。
在一个实施方案中，另外的部分可用于延长结合分子的半衰期。第二部分可以包含结合血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA)的蛋白质，例如抗体或其部分。另外的部分可以包含结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或小鼠血清白蛋白(MSA))的VH结构域。
其他部分可以包含血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或其变体如HSA C34S。还提供了如本文所述的包含VH结构域和Fc结构域的结合分子，例如，其中VH结构域与Fc结构域融合。还提供了结合分子，其包含特异性结合第二抗原的第二可变结构域，其中所述第二抗原是除人PSMA之外的抗原。第二抗原可以是分化簇(CD)分子或主要组织相容性复合体(MHC)II类分子。
在一个实施方案中，本发明的结合分子用可检测性或功能性标记进行标记。标记可以是产生或可被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光剂，放射性标记，酶，化学发光剂，核磁共振活性标记或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光，放射性，酶活性或光吸收来检测和/或测量结合。
在其他实施方案中，本发明的结合分子偶联至少一种治疗部分，如药物，酶或毒素。在一个实施方案中，所述治疗部分是毒素，例如细胞毒性放射性核素，化学毒素或蛋白质毒素。例如，本发明的PSMA结合分子可以与放射性同位素例如α-，β-或γ-发射体，或β-和γ-发射体偶联。
毒素可以选自加利车霉素，埃斯佩拉霉素(esperamicin)，甲氨蝶呤，多柔比星，美法仑，苯丁酸氮芥，ARA-C，长春地辛，丝裂霉素C，顺铂，依托泊苷，博来霉素，5-氟尿嘧啶，雌莫司汀，长春新碱，依托泊苷，多柔比星，紫杉醇，多西他赛，多拉司他汀(dolastatin)10，澳瑞他汀(auristatin)E和澳瑞他汀PHE。在其他实施方案中，所述治疗部分是免疫刺激剂或免疫调节剂。
一方面，本发明提供了包含多于一个本文所述的单VH结构域抗体的免疫缀合物。
本发明的PSMA结合分子的毒素缀合形式优选在皮摩尔浓度下介导对表达PSMA的细胞的特异性细胞杀伤。
另一方面，本发明的PSMA结合分子被修饰以增加半衰期，例如通过化学修饰，特别是通过聚乙二醇化，或通过掺入脂质体或使用血清白蛋白蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是共价修饰的。术语“共价修饰的/共价修饰”包括根据本发明的结合分子的修饰，例如本文指定序列的修饰；用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂修饰，与异源多肽序列的融合以及翻译后修饰。例如特定序列的共价修饰的多肽仍具有本文所述的功能特性，例如结合人PSMA的能力，或共价修饰通常通过使靶向氨基酸残基与有机衍生剂(其能够与选定的侧链或末端残基反应)反应来引入，或通过利用在选择的重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰机制来引入。某些翻译后修饰是重组宿主细胞对表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常在翻译后脱氨基成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下被脱氨基。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰、酪氨酸或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的[α]-氨基的甲基化。共价修饰，例如，包括包含根据本发明的例如具有特定序列及其氨基酸序列变体的PSMA结合分子(如免疫粘附素)的融合蛋白，以及与异源信号序列的N端融合物。
如下面进一步描述的，本发明的结合分子具有某些功能特性。本发明的结合分子的这些和其他药理学活性可以用例如本领域所述的标准测试方法来证明。
本发明的结合分子可以与前列腺特异性膜抗原一起内化到细胞中。本发明的结合分子特异性结合人PSMA的细胞外结构域上的表位。在一个实施方案中，本发明的结合分子特异性结合二聚体形式的PSMA。本发明的结合分子可以与毒性部分缀合并用于消除或杀死表达PSMA的前列腺或癌细胞。
如实施例和附表中所示，本发明的结合分子可以结合活细胞，例如肿瘤细胞或前列腺细胞，例如表达人PSMA的CHO细胞，LNCaP细胞。另一方面，本发明提供以如下EC 50值结合PSMA的单结构域抗体：100nM至100pM，如平均EC50值为100nM或更低，甚至更优选地平均EC50值为90nM或更低，如低于80、70、60、50、40、30、20、10、5nM或甚至更低，如低于4、3、2、或1nM或甚至更低，如低于500、400、300、200、100pM或甚至更低，如低于4pM，优选地如在FMAT结合测定中所测量的。具体而言，EC50值显示在表19中。在一个实施方案中，本发明的结合分子能够特异性结合人PSMA和食蟹猴PSMA。
除非另有说明，效价通常以IC50值表示，单位为nM。在功能测定中，IC50是将生物学应答降低至其最大值的50％的结合成员的浓度。可以通过绘制作为结合成员浓度的对数函数的最大生物学应答的百分比并使用软件程序将数据拟合成S形函数来产生IC50值来计算IC50。用于测量IC50的方法是本领域已知的。例如，为了确定IC50，可以采用HIS ZAP细胞杀伤测定来确定IC50。EC50表示半数最大有效浓度。
另一方面，本发明涉及包含至少一个针对PSMA(优选人PSMA)的免疫球蛋白单结构域抗体或由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域并且当在实施例中如所描述的进行测试时具有约0.2至约1000nM或更多，例如0.2至900，0.2至800，0.2至700，0.2至600，0.2至500，0.2至400，0.2至300，0.2至200，0.2至100，0.2至50，0.2至40，0.2至30，0.2至20，0.2至10，0.2至9，0.2至8，0.2至7，0.2至6，0.2至5，0.2至4，0.2至3，0.2至2或0.2至1的IC50。
此外，本发明的PSMA结合分子结合PSMA的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数KD)可以例如使用表面等离子体共振如
Figure BDA0001725348400000841
或Octet来确定，或者KD可以从pA2分析来估计。特别地，本发明的分子是非常有效的(即，例如在实验部分中所测量的在pM范围内的EC50值)。
另一方面，本发明提供了如本文所述的单结构域抗体，其中所述sdAb以如下平均KD值结合所述PSMA：100nM至10pM，如平均KD值是90nM或更低，甚至更优选平均KD值是80nM或更低，如低于70、60、50、40、30、20、10、5nM或甚至更低，如低于4、3、2、或1nM，如低于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20pM或更低，如低于10pM。优选地，如实施例中所示确定KD。
在一个实施方案中，根据本发明的结合分子对PSMA具有至少约107M-1，优选约109M-1，更优选约1010M-1至1011M-1或更高的亲和力常数。在一个实施方案中，根据本发明的结合分子具有1.00E+04至1.00E+6(1/Ms)的Kon。在一个实施方案中，根据本发明的结合分子具有1.00E-03至1.00E-05(1/s)的Koff。
本发明的结合分子显示出优异的稳定性，包括热和血清稳定性(参见实施例)。此外，如实施例中所示，本发明的结合分子显示出快速的肿瘤靶向。此外，本发明的结合分子还显示对人PSMA的高度特异性和非靶组织中的低摄取(参见实施例)。
在一个实施方案中，本发明的结合分子显示快速血液清除。在一个实施方案中，本发明的结合分子显示低的肾滞留。在一个实施方案中，结合分子可以抑制例如竞争性抑制另一抗体(例如J591)与人PSMA的结合。
在一个实施方案中，本发明的结合分子可具有选自以下非限制性列表的一种或多种性质：
a)对肿瘤细胞表面上存在的天然形式的人和/或食蟹猴前列腺特异性膜抗原的高亲和力结合，
b)被肿瘤细胞内化，
c)非靶组织中的低摄取，
d)快速的肿瘤靶向，
e)与LNCaP细胞强烈结合，但不与或仅最低限度地与缺乏前列腺特异性膜抗原表达的细胞结合和/或
f)与PSMA上的独特表位结合。
本发明进一步提供了编码本发明结合分子的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个方面，本发明提供编码如上定义的CDR或一组CDR或VH的核酸。
下文描述了本文所述的单结构域抗体的核酸。这些可以使用本文所述的接头进行组合以产生用于表达的核酸构建体。
包含如下所示的SEQ ID NO.393至410或由其组成的序列，其编码家族1的VH结构域(包含SEQ ID NO.4至80或由其组成)。
SEQ ID NO.393(编码VH结构域1.1)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATGATGGTACCACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGTATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.394(编码VH结构域1.2)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGATAATAATAATAGCACAGAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGCGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.395(编码VH结构域1.3)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGATAATAATAATAGCACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGTACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.396(编码VH结构域1.4)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGATGGAACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGTTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.397(编码VH结构域1.5)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCACTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAAAATGATCGAACCACATACTACGTAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.398(编码VH结构域1.6)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGATAATAATAGAACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.399(编码VH结构域1.7)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGATGGAACCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAGCACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.400(编码VH结构域1.8)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATGATGGTACCACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.401(编码VH结构域1.9)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGATACCACAGACTACGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.402(编码VH结构域1.10)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGCTACCACAGACTACGCAGACTTCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.403(编码VH结构域1.11)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGCTACCACAGACTACGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.404(编码VH结构域1.12)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGCTACCACAGACTACGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.405(编码VH结构域1.13)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACCATACCACAGACTACGCAGCCGACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.406(编码VH结构域1.14)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGCTACCACAGACTACGCAGACGTCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.407(编码VH结构域1.15)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACCATACCACAGACTACGCAGCCTTCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.408(编码VH结构域1.16)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACCATACCACAGACTACGCAGACACCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.409(编码VH结构域1.17)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGATACCACAGACTACGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.410(编码VH结构域1.18)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGCTACCACAGACTACGCAGCCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.411(编码VH结构域1.19)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACGATACCACAGACTACGCAGCCTACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.412(编码VH结构域1.20)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTTAGCAGCTATGCCCTCAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGGTGAGAATAACCATACCACAGACTACGCAGCCACCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTGTGAAAGATGGTGTCCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
如以下所示的SEQ ID NO.413至437编码家族2的VH结构域，所述VH结构域包含SEQID NO.84至180或由其组成。
SEQ ID NO.413(编码VH结构域2.1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.414(编码VH结构域2.2)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.415(编码VH结构域2.3)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACATATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGAATCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATTCCAAGAACACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTCCTATGATTTTGACATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.416(编码VH结构域2.4)
CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTCCTATGATTTTGAAATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.417(编码VH结构域2.5)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTCCTATGATTTTGAAATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.418(编码VH结构域2.6)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAACTATCGTCCTATAAATTTGAAATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.419(编码VH结构域2.7)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGCAATCGTCCTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.420(编码VH结构域2.8)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGCAATCGTCCTATGCTTTTGAAATCTGGGGCCAAGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.421(编码VH结构域2.9)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGCAATCGTCCTATGCTTTTGAAATCCGGGGCCAGGGGACAACGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.422(编码VH结构域2.10)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAGACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCATATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.423(编码VH结构域2.11)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCCTCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGACGAGAGTAATAAATACTATGCACCCAGCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.424(编码VH结构域2.12)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATAAGAGTAATAAATACTATGCAGACAAGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.425(编码VH结构域2.13)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCCTCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGCGAGTAATAAATACTATGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.426(编码VH结构域2.14)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCGTGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGCGAGTAATAAATACTATGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.427(编码VH结构域2.15)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCCTCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATAAGAGTAATAAATACTATGCAGACAAGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.428(编码VH结构域2.16)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCGCGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATAAGAGTAATAAATACTATGCAGACAAGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.429(编码VH结构域2.17)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGCGAGTAATAAATACTATGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.430(编码VH结构域2.18)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCCAGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGCGAGTAATAAATACTATGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.431(编码VH结构域2.19)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCTTCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGATGCGAGTAATAAATACTATGCAGACAACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.432(编码VH结构域2.20)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGAAATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.433(编码VH结构域2.21)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTCTCTACAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGAAATTATCGTCCTATGATTTTGAAATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.434(编码VH结构域2.22)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCACGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGACGGGAGTAATAAATACTATGCAGCCCCGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGACGCGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.435(编码VH结构域2.23)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCACGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGACGAGAGTAATAAATACTATGCATCCAGCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGACCGGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.436(编码VH结构域2.24)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGACGAGAGTAATAAATACTATGCAAGGCTGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGACACGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.437(编码VH结构域2.25)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCTATGGCCTCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCATATATATCATATGACCTGAGTAATAAATACTATGCAAGGGGGGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGACGTGGCCTGGGGATTACGTTTGGGGGAGTCATCGTCCTATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
在一个方面，本发明涉及核酸序列，所述核酸序列包含如下所示的SEQ ID NO.438至461或由其组成，其编码家族3的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO.184至276或由其组成。
SEQ ID NO.438(编码VH结构域3.1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATGACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGATGAGGACACGGCTCTATATTACTGTGCGAGAGATCGTATAGTGGGAGGTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.439(编码VH结构域3.2)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCGTATAGTGGGAGCCAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.440(编码VH结构域3.3)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCCTCATTAGCTATGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATAGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.441(编码VH结构域3.4)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGCGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATATTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.442(编码VH结构域3.5)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.443(编码VH结构域3.6)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.444(编码VH结构域3.7)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGGACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.445(编码VH结构域3.8)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.446(编码VH结构域3.9)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.447(编码VH结构域3.10)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.448(编码VH结构域3.11)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.449(编码VH结构域3.12)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.450(编码VH结构域3.13)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.451(编码VH结构域3.14)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.452(编码VH结构域3.15)
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.453(编码VH结构域3.16)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTCATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.454(编码VH结构域3.17)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.455(编码VH结构域3.18)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.456(编码VH结构域3.19)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATGACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTATAGTGGGAGGTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.457(编码VH结构域3.20)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTCAGACATATGATGGCAGTAATAGATACTATGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTATAGTGGGAGGTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.458(编码VH结构域3.21)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTCAGACATATGATGGCAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTATAGTGGGAGGTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.459(编码VH结构域3.22)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTCAGACATATGATGCCAGTAATAGATACTATGCAGACGCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTATAGTGGGAGGTAGGGTCCCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO.460(编码VH结构域3.23)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.461(编码VH结构域3.24)
AGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTAATTAGCTATGGCATGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATAACATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTATTGTGGGAGCTAGGGTCCCTGATGCTTATGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.4462，463，464和465编码家族4的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO.280至292或由其组成。
SEQ ID NO.462(编码VH结构域4.1)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCTTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCCCCTTCATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCGGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAAAGAGAGGATTTTTGGAGTGCTTACCCCTGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.463(编码VH结构域4.2)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTCATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGAGAGGATTTTTGGAGTGCTTACCCCTGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAACGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID NO.464(编码VH结构域4.3)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCCCCTTCATTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAGCTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAAAGAGAGGATTTTTGGCGTGCTTACCCCTGATGATTTTGAAATCTGGGGCCAAGGGACAACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.465(编码VH结构域4.4)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCACTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGAGAGGATTTTTGGAGCGCTTACCCCTGATGATTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAACGGTCACCGTCTCTTCA
如下所示的SEQ ID NO.466或467编码家族5的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.296和300或由其组成。
SEQ ID NO.466(编码VH结构域5.1)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAATACTAAATATTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGTTTATGGCCTTCGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID NO.467(编码VH结构域5.2)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGATGGAAATAGTAAATATTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGTTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGTTTATGGCCTTCGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.468至474编码家族6的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.304和328或由其组成。
SEQ ID NO.468(编码VH结构域6.1)
CAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGGTCCGCCAGCACCCAGGGAAGGACCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTATCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAAATGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.469(编码VH结构域6.2)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTATCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAAATGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.470(编码VH结构域6.3)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGGTCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTATCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.471(编码VH结构域6.4)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTATCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.472(编码VH结构域6.5)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGGTCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAAATGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.473(编码VH结构域6.6)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGGTCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.474(编码VH结构域6.7)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAATAGTGGTTATTACTGGAGCTGGGTCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCTATTACAATGGGAGCATCCACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGGGATGACTACGGTGACTACTTGAGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.475至482编码家族7的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.332至360或由其组成。
SEQ ID NO.475(编码VH结构域7.1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.476(编码VH结构域7.2)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATAACCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.477(编码VH结构域7.3)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACGGGGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACT
SEQ ID NO.478(编码VH结构域7.4)
GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACCAGGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.479(编码VH结构域7.5)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACCCCGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.480(编码VH结构域7.6)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACGAGGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.481(编码VH结构域7.7)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACATCGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATTCCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.482(编码VH结构域7.8)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAATCACGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCGAGAGATACCCTTATAGTGGGAGAGAGGGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.483编码家族8的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.364或由其组成。
SEQ ID NO.483
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCCATACCAGCCACTGCTATACCCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.484编码家族9的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.368或由其组成。
SEQ ID NO.484
GAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTCACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGACATAAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAATCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGACTACGGTGACTCCCGTAGCCTTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
如下所示的SEQ ID NO.485编码家族10的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.372或由其组成。
SEQ ID NO.485
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCATTTATGTCATATGATGGCAGTAATAAATACTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGCGATTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCGACTACGATATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.486编码家族11的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.376或由其组成。
SEQ ID NO.486
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAACTTGATTAGCTATGGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGGGAATGCCTTGTATAGCAGTGGCTGGCCCGATGATGGTTTTGATATCAGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.487编码家族12的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.380或由其组成。
SEQ ID NO.487
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTTTGGCATGCACTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTAATATCATATGATGGAAATAGTAAATACTATGCAGACACCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGGAAATGAACAGCCTGAGAGCTGATGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGCCTATGGCCCCCAATGGACGTCAGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
如下所示的SEQ ID NO.488编码家族13的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.384或由其组成。
SEQ ID NO.488
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTGACTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTATATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGAGGAGGAGCAGTGGCCCTTTATCACAACGGTATGGACATGGGGGGCCAAGGGACCACGGTCACTGTCTCTTCA
如下所示的SEQ ID NO.489编码家族14的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.388或由其组成。
SEQ ID NO.489
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGGTAACACAGGCTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGAACGGGCCCGGTATAACTGGAACTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
如下所示的SEQ ID NO.490编码家族15的VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO.392或由其组成。
SEQ ID NO.490
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGATCGTACCGGTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGGGAGAGAGAATGTTATAGTACCAGCTGCTACCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA，并且可以全部或部分合成或重组产生。除非上下文另有要求，否则本文提出的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有其中U取代T的特定序列的RNA分子。
核酸可以是构建体的形式，例如质粒，载体，转录或表达盒。
本发明还涉及包含如上所述的一种或多种核酸构建体的分离的重组宿主细胞。宿主细胞可以是细菌，病毒，哺乳动物或其他合适的宿主细胞。在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方案中，细胞是酵母细胞。在另一个实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
使用体外表达文库制备或产生本文所述的多肽，核酸，宿主细胞，产品和组合物的方法可以包括以下步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的合集，集合或文库；和
b)筛选所述合集，集合或文库中的可以结合PSMA/对其有亲和力的氨基酸序列，并且
c)分离可以结合PSMA/对其有亲和力的氨基酸序列。
在上述方法中，氨基酸序列的合集，集合或文库可以展示在噬菌体，噬菌粒，核糖体或合适的微生物(如酵母)上，例如以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的合集，集合或文库)的合适方法，技术和宿主生物体对于本领域技术人员而言是清楚的(参见例如Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press；1stedition(October 28,1996)Brian K.Kay,Jill Winter,John McCafferty)。
本文所述的包括VH结构域的结合分子可以在转基因啮齿动物中表达。转基因啮齿动物，例如小鼠，可具有降低的表达内源性抗体基因的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿动物表达内源性轻链和/或重链抗体基因的能力降低。啮齿动物因此可以包含修饰以破坏内源性轻链和/或重链抗体基因的表达，从而不产生功能性的轻链和/或重链。
可以通过包括以下的方法来生产能够结合人PSMA的仅有重链的人抗体：
a)用PSMA抗原免疫转基因啮齿动物，其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链V基因的核酸构建体并且不能够产生功能性内源轻链或重链，
b)分离仅有重链的人抗体。
VH结构域可以通过包括以下的方法产生
a)用PSMA抗原免疫转基因小鼠，其中所述小鼠表达包含人重链V基因的核酸构建体并且不能够产生功能性内源轻链或重链，
b)产生包含来自所述小鼠的VH结构域序列的序列文库，
c)从所述文库分离包含VH结构域序列的序列。
进一步的步骤可以包括鉴定结合人PSMA的单VH结构域抗体或仅有重链的抗体，例如通过使用如实施例中所示的功能测定。
在一个实施例中，啮齿动物是小鼠。小鼠可以包含非功能性内源λ轻链基因座。因此，小鼠不会产生功能性内源λ轻链。在一个实施方案中，通过插入，倒位，重组事件，基因编辑或基因沉默，部分或完全缺失λ轻链基因座或使其变得无功能。例如，如上所述，至少恒定区基因C1，C2和C3可以通过插入或其他修饰而被删除或变得无功能。在一个实施方案中，所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性λ轻链。
此外，小鼠可以包含非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源κ轻链。在一个实施方案中，通过插入，倒位，重组事件，基因编辑或基因沉默，部分或完全缺失κ轻链基因座或使其变得无功能。在一个实施方案中，所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性κ轻链。
例如，可以如WO 2003/000737(其在此通过引用整体并入)中所公开的那样制备具有功能沉默的内源λ和κL链基因座的小鼠。
此外，小鼠可以包含非功能性内源重链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源重链。在一个实施方案中，通过插入，倒位，重组事件，基因编辑或基因沉默，部分或完全缺失重链基因座或使其变得无功能。在一个实施方案中，所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性重链。
例如，如WO 2004/076618(全文以引用的方式并入本文中)中所述，全部8个内源性重链恒定区免疫球蛋白基因(μ，δ，γ3，γ1，γ2a，γ2b，ε和α)在小鼠中不存在或部分不存在达到其失去功能的程度，或者基因δ，γ3，γ1，γ2a，γ2b和ε不存在并且侧翼基因μ和α部分不存在达到其失去功能的程度，或者基因μ，δ，γ3，γ1，γ2a，γ2b和ε不存在并且α部分不存在达到其失去功能的程度，或者δ，γ3，γ1，γ2a，γ2b，ε和α不存在并且μ部分不存在达到其失去功能的程度。部分缺失是指内源基因座基因序列例如通过插入被删除或破坏，以至于没有功能性内源基因产物被基因座编码，即没有功能性产物从基因座表达。在另一个实施方案中，所述基因座功能性沉默。
在一个实施方案中，小鼠包含非功能性内源重链基因座，非功能性内源λ轻链基因座和非功能性内源κ轻链基因座。因此小鼠不产生任何功能性内源轻链或重链。因此，小鼠是三重敲除(TKO)小鼠。
转基因小鼠可以包含载体，例如用于表达异源重链基因座的酵母人工染色体(YAC)。YAC是可用于在酵母中克隆非常大的DNA插入片段的载体。除了包含与天然酵母染色体行为必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)，着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))外，它们接受大量DNA插入片段的能力使它们达到染色体样稳定性以及酵母细胞中传递的保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用在本领域是公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopedia of LifeSciences,2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group/www.els.net)。
例如，YAC可以包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的人VH，D和J基因。
本领域已知的替代方法可用于内源小鼠或大鼠免疫球蛋白基因的缺失或失活以及与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的人VH，D和J基因的导入。
转基因小鼠可以根据实施例中所示的标准技术产生。用于产生转基因小鼠的两种最具特征的途径是通过将遗传物质原核显微注射到新鲜受精的卵母细胞中或通过将稳定转染的胚胎干细胞引入桑椹胚或囊胚期胚胎。无论遗传物质是如何引入的，被操纵的胚胎都会转移到怀孕的雌性受孕者身上，在那里妊娠继续并且候选转基因幼仔出生。
这些广泛的方法之间的主要区别在于ES克隆可以在用于产生转基因动物之前被广泛筛选。相反，原核显微注射依赖于在引入遗传物质后整合到宿主基因组，并且一般而言，转基因的成功整合直到幼仔出生后才能被证实。
本领域已知许多方法可协助并确定是否发生转基因的成功整合。转基因动物可以通过多种手段产生，包括将构建体随机整合到基因组中，位点特异性整合或同源重组。有多种工具和技术可用于驱动和选择转基因整合和随后的修饰，包括使用耐药性标志物(阳性选择)，重组酶，重组介导的盒式交换，阴性选择技术和核酸酶以改善重组效率。大多数这些方法通常用于修饰ES细胞。然而，一些技术可用于增强通过原核注射介导的转基因。
可以使用进一步的改进来在所需背景下更有效地产生转基因系。如上所述，在优选的实施方案中，内源性小鼠免疫球蛋白表达被沉默以允许仅使用引入的转基因来表达可用于药物发现的仅有重链的储库。如上所述，可以使用遗传操作的小鼠，例如针对所有内源性免疫球蛋白基因座(小鼠重链，小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的TKO小鼠。任何引入的转基因转移到这种TKO背景可以通过育种(常规或包含IVF步骤以提供该过程的有效缩放)来实现。然而，在转基因过程中也可能包括TKO背景。例如，对于显微注射，卵母细胞可以来自TKO供体。类似地，来自TKO胚胎的ES细胞可以衍生用于转基因。导入了转基因的三重基因敲除小鼠在本文中称为TKO/Tg。在一个实施方案中，小鼠如WO 2016/062990中所述。
在本发明的另一方面，提供了包含根据本发明的PSMA结合分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的结合分子或组合物可以通过任何便利的途径施用。化合物可以可以通过任何途径施用，包括口服和胃肠外施用。肠胃外施用包括例如静脉内，肌内，动脉内，腹膜内，鼻内，直肠，膀胱内，皮内，局部或皮下施用。组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。
本发明的组合物可以是液体形式，例如溶液，乳液或悬浮液。该液体可用于注射，输注(例如IV输注)或皮下递送。本发明的液体组合物，无论它们是溶液，悬浮液还是其他类似形式，还可以包括以下一种或多种：无菌稀释剂，例如水，盐水溶液，优选生理盐水，林格溶液(Ringer's solution)，等渗氯化钠，不挥发油如合成的甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；和张力调节剂例如氯化钠或右旋糖。组合物可以封装在安瓿，一次性注射器或由玻璃、塑料或其他材料制成的多剂量小瓶中。
在具体的实施方案中，可希望的是将本发明的一种或多种结合分子或组合物局部施用于需要治疗的区域，或通过静脉内注射或输注。
在治疗特定失调或病症中有效/有活性的本发明结合分子的量将取决于失调或病症的性质，并且可以通过标准临床技术来确定。此外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重程度，并应根据医师的判断和每位患者的情况来决定。
本发明的组合物包含有效量的本发明的结合分子，从而将获得合适的剂量。化合物的正确剂量将根据具体的配方，应用模式以及其特定部位，宿主和疾病治疗而变化。应考虑年龄，体重，性别，饮食，施用时间，排泄率，宿主病情，药物组合，反应敏感性和疾病严重程度等因素。可以在最大耐受剂量内连续或定期进行施用。
典型地，该量为按组合物重量算至少约0.01％的本发明的结合分子。
制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01重量％至约2重量％的本发明的结合分子。
对于静脉内施用，组合物可以包含约通常约0.1mg/kg至约250mg/kg动物体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重，以及更多优选约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。
本发明的组合物可以采用合适的载体的形式，例如气溶胶，喷雾剂，悬浮液或适合使用的任何其他形式。合适的药物载体的其他实例描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”。
药物组合物可以使用制药领域公知的方法制备。例如，可通过将本发明的结合分子与水混合以形成溶液来制备意欲通过注射施用的组合物。可加入表面活性剂以促进形成均匀溶液或悬浮液。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症特别是前列腺癌的方法，其包括向患者施用本发明的结合分子，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子和/或药物组合物。特别地，本发明涉及用于预防和/或治疗癌症特别是前列腺癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子或药物组合物。
本发明还涉及用于治疗疾病的本发明的结合分子。本发明还涉及用于治疗癌症特别是前列腺癌或前列腺疾病的本发明的结合分子。“前列腺癌”指由前列腺组织产生的所有阶段和所有形式的癌症。本发明还涉及治疗以PSMA异常表达为特征的疾病。
另一方面，本发明涉及本发明的结合分子在治疗疾病中的用途。另一方面，本发明涉及本发明的结合分子在制备用于治疗癌症特别是前列腺癌或前列腺疾病的药物中的用途。
本发明的结合分子也可用于治疗，预防或改善癌症特别是前列腺癌或前列腺疾病。前列腺疾病是指任何折磨男性生殖系统中的前列腺的疾病。前列腺依赖于睾丸的激素分泌。在其他癌症中已经检测到PSMA的表达，更具体地在与这些癌症相关的新血管系统中检测到PSMA的表达。包括常规(透明细胞)肾细胞，膀胱移行细胞，睾丸-胚胎，神经内分泌，结肠和乳房以及不同类型的恶性肿瘤在内的多种癌症在其新生血管系统中一致且强烈表达PSMA。
本发明的结合分子可以作为唯一活性成分或与一种或多种其他治疗和/或细胞毒性部分组合施用。在一个实施方案中，结合分子可以与毒性部分缀合。
在前列腺疾病例如前列腺癌的治疗中，抗PSMA结合分子可以与现有的治疗方法联合使用。在一个实施方案中，单结构域抗体与现有的治疗或治疗剂(例如抗癌治疗)组合使用。因此，另一方面，本发明还涉及包括施用本发明的单结构域抗体或药物组合物和抗癌治疗的组合疗法。抗癌疗法可以包括治疗剂或放射疗法，并且包括基因疗法，病毒疗法，RNA疗法骨髓移植，纳米疗法，靶向抗癌疗法或溶瘤药物。其他治疗剂的实例包括其他检查点抑制剂，抗肿瘤剂，免疫原性试剂，减毒癌细胞，肿瘤抗原，抗原呈递细胞例如用肿瘤衍生抗原或核酸脉冲的树突细胞，免疫刺激细胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，靶向小分子和生物分子(例如信号转导途径的组分，例如酪氨酸激酶的调节剂和受体酪氨酸激酶的抑制剂，以及与肿瘤特异性抗原结合的试剂，包括EGFR拮抗剂)，抗炎剂，细胞毒性剂，放射性毒剂，或免疫抑制剂和用编码免疫刺激性细胞因子(例如GM-CSF)的基因转染的细胞，化学疗法。在一个实施方案中，单结构域抗体与手术组合使用。本发明的结合分子可与其他治疗同时或在不同时间施用，例如同时，分开或顺序施用。
另一方面，本发明提供了包含本发明的结合分子的检测前列腺癌的试剂盒，用于诊断，治疗，预后或监测。试剂盒还可以包含使用说明。试剂盒可以包括如上所述的本发明的标记的结合分子和一种或多种用于检测所述标记的化合物。本发明另一方面提供了以冻干形式包装或包装在水性介质中的本发明的结合分子。
本发明还涉及使用本发明的结合分子的检测方法。考虑到它们结合人PSMA的能力，本文公开的人PSMA结合分子可以用于使用常规免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学)检测PSMA(例如，在生物样品例如血清或血浆中)。特别地，本发明还涉及用于诊断或监测癌症特别是前列腺癌的进展的体外或体内方法。体外方法包括检测测试样品中PSMA蛋白的存在并将其与正常受试者的对照样品或正常受试者的标准值或标准值范围进行比较。样品可以选自血液，血浆，血清，精液，尿液或组织活检。
该方法可以包括：(a)使样品(和任选的参照物，例如阳性和/或阴性对照样品)与本发明的PSMA结合分子接触，和(b)检测样品中与PSMA结合的结合分子或未结合的结合分子，从而检测生物样品中的PSMA。结合分子可以用可检测物质直接或间接标记，以便于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料和放射性材料。
本发明还涉及通过标记所述结合分子来评估本发明的PSMA结合分子内化的测定。在实施例中描述了这种测定。
体内方法可包括检测体内PSMA的存在，例如通过在受试者中成像。在该方法中，标记本发明的PSMA结合分子以检测结合。
作为标记本发明的结合分子的替代方法，可以通过竞争免疫测定在生物液体中测定人PSMA，所述竞争免疫测定利用标记有可检测物质的PSMA标准品和未标记的人PSMA结合分子。在该测定中，组合生物样品，标记的PSMA标准品和人PSMA结合分子，并确定与未标记的结合分子结合的标记的PSMA标准品的量。生物样品中人PSMA的量与结合至PSMA结合分子的标记的PSMA标准品的量成反比。类似地，还可以通过竞争免疫测定在生物流体中测定人PSMA，所述竞争免疫测定利用标记有可检测物质的PSMA标准品和未标记的人PSMA结合分子。
本文公开的结合分子可以用于抑制例如在含有PSMA的细胞培养物中的、在具有与本文公开的结合分子交叉反应的PSMA的人受试者中或其他哺乳动物中的PSMA活性。在一个实施方案中，提供了抑制或增加PSMA活性的方法，包括将PSMA与本文公开的结合分子接触，使得PSMA活性被抑制或增加。例如，在含有或怀疑含有PSMA的细胞培养物中，可以将本文公开的结合分子加入到培养基中以抑制培养物中的PSMA活性。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及消融或杀死表达PSMA的细胞例如癌性或非癌性前列腺细胞的方法。本发明的方法包括使细胞与足以消融或杀死细胞的量的本发明的PSMA结合分子接触。这些方法可用于培养中的细胞，例如体外或离体。
除非在此另外定义，否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供了包括本发明的范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员实施本发明的技术并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其他方面和实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本说明书中提及的所有文献均通过引用整体并入本文，包括对基因登录号的参考。
本文中使用的术语“和/或”被认为是两个特定特征或部件在具有或不具有另一的情况下每一个的具体公开。例如“A和/或B”应被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中每一个的具体披露，就像每个在此单独列出一样。除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施例。
在非限制性实施例中进一步描述了本发明。
实施例
实施例1.Tg/TKO小鼠的构建
在针对内源重链和轻链抗体表达被沉默(三重敲除，或TKO)的背景中携带种系构型中的重链抗体转基因基因座的小鼠如先前所述产生(WO2004/076618和WO2003/000737,Ren等,Genomics,84,686,2004；Zou等,J.Immunol.,170,1354,2003)。简言之，用酵母人工染色体(YAC)原核显微注射新鲜受精的卵母细胞之后产生转基因小鼠，所述酵母人工染色体包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的人VH，D和J基因。酵母人工染色体(YAC)是可用于在酵母中克隆非常大的DNA插入片段的载体。除了包含与天然酵母染色体行为必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)，着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))外，它们接受大量DNA插入片段的能力使它们达到染色体样稳定性以及酵母细胞中传递的保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用在本领域是公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopedia of Life Sciences,2002，Macmillan Publishers Ltd,Nature PublishingGroup/www.els.net)。
将转基因创始小鼠与缺乏内源性免疫球蛋白表达的动物反交，以产生用于所述免疫研究的Tg/TKO系。
实施例2.用于免疫的抗原
免疫使用重组纯化蛋白或人细胞系LNCap。重组人PMSA购自R&D(cat.no.4234-ZN)，而LNCap细胞来自Sigma Aldrich(cat.no.89110211-1VL)。
实施例3.免疫方案
简而言之，8-12周龄的Tg/TKO小鼠各自接受总共50μg的重组纯化的人PSMA蛋白(在完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)中乳化并皮下递送)，或者腹膜内递送的在PBS中的1000万个LNCap细胞，接着用1-10μg的重组蛋白(在不完全弗氏佐剂中乳化，也在皮下施用，在初次引发后以不同的间隔施用)加强。在没有佐剂的情况下，腹膜内施用在磷酸盐缓冲盐水中的最终剂量的纯化的重组人PSMA蛋白抗原。
也可以采用替代的免疫途径和程序。例如，可以使用不同的佐剂或免疫加强程序来代替弗氏佐剂。DNA免疫通常是肌内注射或通过基因枪注射。虽然不是唯一的，但来自这些细胞的转染细胞或膜制剂通常经腹膜内施用。
实施例4.血清ELISA
免疫期间和之后，从小鼠收集血清并通过ELISA检查是否存在对免疫原的重链抗体应答。Nunc Maxisorp板(Nunc cat.no.443404)在4℃用50μl/孔的1μg重组抗原/ml PBS溶液包被过夜。倾析抗原溶液后，使用补充有0.05％(v/v)
Figure BDA0001725348400001261
20(Sigma P1379)的PBS(制备自PBS Tablets,Oxoid cat.no.BR0014G)洗涤平板，随后用未添加Tween 20的PBS洗涤。为了阻断非特异性蛋白质相互作用，向孔中加入在PBS中的3％(w/v)脱脂奶粉
Figure BDA0001725348400001262
溶液并将板在室温下温育至少1小时。在聚丙烯管或板中制备在3％MarvelTM/PBS中的血清稀释液并在室温下温育至少1小时，然后转移至封闭的ELISA板中，在此进一步温育至少1小时。然后用PBS/Tween20并且随后用PBS重复洗涤掉未结合的蛋白质。然后将在PBS/3％Marvel中制备的生物素缀合的山羊抗小鼠IgG，Fcγ亚类1特异性抗体(Jacksoncat.no.115-065-205)的溶液加入到每个孔中并在室温进一步温育至少一小时。通过使用PBS/Tween20和PBS重复洗涤除去未结合的检测抗体。然后将在3％Marvel/PBS中的Neutravidin-HRP溶液(Pierce cat.no.31030)加入到ELISA板中并使其结合至少30分钟。进一步洗涤后，使用TMB底物(Sigma cat.no.T0440)显色ELISA，并且10分钟后通过添加0.5M H2SO4溶液(Sigma cat.no.320501)停止反应。通过在450nm的光密度读数来确定吸光度。另外的测定，例如ELISPOT测定，也可用于检查免疫诱导的重链抗体应答。
实施例5.从免疫的小鼠产生文库
a)处理组织，RNA提取和cDNA制备
将来自每只免疫动物的脾脏，腹股沟和臂部淋巴结收集到
Figure BDA0001725348400001274
中。对于每只动物，分别处理1/2个脾和4个淋巴结。首先，将组织匀化；随后将组织转移至裂解基质D珠管(MP Bio.Cat.no.116983001)，加入600μl的含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(来自Qiagen
Figure BDA0001725348400001271
kit cat.no.74104)，之后在MP Bio Fastprep96匀浆器(cat#116010500)中以1600rpm匀浆60秒。将含有均化组织的试管转移至冰中，并通过以1200rpm离心5分钟使碎片沉淀。取出400μl上清液样品用于RT-PCR。
首先，使用Qiagen
Figure BDA0001725348400001272
试剂盒(cat.no.74104)按照生产商的方案提取RNA。然后使用Superscript III RT-PCR高保真试剂盒(Invitrogen cat.no.12574-035)将每种RNA样品用于制备cDNA。对于每个脾脏和淋巴结RNA样品，进行5次RT-PCR反应，每个反应都利用与VH1，VH2，VH3，VH4或VH6家族的引物组合的VH_J/F(长)引物。引物的细节如下。
表16.V10的引物
Figure BDA0001725348400001273
Figure BDA0001725348400001281
粗体残基与pUCG3具有同源性表17.V23的引物
Figure BDA0001725348400001282
Figure BDA0001725348400001291
粗体残基与pUCG3具有同源性
下面显示了简并引物核苷酸选择的编码。
Figure BDA0001725348400001292
根据以下管反应组分制备主混合物(Mastermix)进行RT-PCR反应：
12.5μl 2x反应混合物
0.5μl正向引物(10μM)
0.5μl反向引物(10μM)
0.5μl酶混合物
500ng-1μg RNA
用水补到25μl
使用以下条件在热循环仪中进行RT-PCR反应：
55℃20min
94℃2min
35个循环的94℃15sec
58℃30sec
68℃30sec
68℃5min
保持在4℃
通过凝胶电泳证实370bp范围内的产物。
对于每只小鼠，然后汇集来自1/2个脾脏和4个淋巴结中的每一个的针对给定家族扩增的VH产物以用于使用Thermo/Fermentas GeneJet PCR纯化试剂盒(cat.no.K0702，其根据制造商的说明使用)进行纯化，产品在50μl水中洗脱。
a)克隆入噬菌粒载体
这些研究中使用了噬菌粒载体pUCG3。使用基于PCR的方法从扩增的VH序列构建VH噬菌粒文库。使用以下程序：
使用PCR产生线性化的pUCG3版本；用以下引物：
pUCG3-pHENAPmut4GGCCATGGCCGGCTGGGCCGCGAG SEQ ID No.511
pUCG3-pHENAPmut5mycHis
TCATCGAGGGTGGCGAGCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAATCTGAATCATCACACATCACACGGGAGCTAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACC SEQ ID No.512
Phusion高保真PCR主混合物和GC缓冲液(cat.no.F532L,NEB)用于包含以下试剂的PCR反应：
Figure BDA0001725348400001311
使用的循环条件是：
98℃ 30秒
10循环的
98℃ 10秒
58℃ 20秒
68℃ 2分钟30秒
20循环的
Figure BDA0001725348400001312
使用Fermentas GeneJet Gel纯化试剂盒(cat.no.K0691)根据制造商的说明书将PCR产物(3152bp)凝胶纯化，最后洗脱在40μl的洗脱缓冲液中。
基于以下反应，纯化的VH RT-PCR产物作为大引物与线性化的pUCG3一起用于产生用于转化和文库生成的噬菌粒产物；
Figure BDA0001725348400001313
如下进行PCR：
98℃30sec
Figure BDA0001725348400001321
72℃5min
保持在10℃
PCR产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分析。
根据制造商的说明使用Fermentas PCR纯化试剂盒(cat.no.K0702)纯化各家族VH/噬菌粒产物，在25μl H2O中最终洗脱；使用BioRad 2×0.2cm比色杯(BioRadcat.no.165-2086)在Bio-Rad GenePulser Xcell和预温的回复培养基(Lucigen,proprietary mix)中通过电穿孔将该洗脱物用于转化TG1大肠杆菌(Lucigen,cat.no.60502-2)。将22μl纯化产物加入到160μl电穿孔细胞中，在2000v对每种VH/噬菌粒产物进行2次电穿孔。将电穿孔的细胞合并并回收于50ml Falcon管中，在37℃下以150rpm振荡温育1小时。将转化物的等分试样进行10倍系列稀释并接种到含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂的培养皿中。在这些皿上产生的菌落被用于估计文库大小。将剩余的转化物涂布在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂的大规格生物测定皿上。所有琼脂平板在30℃温育过夜。将10ml 2xTY液体培养基加入到大规格生物测定皿中，刮落菌落并测量OD600(1.0的OD＝5×108个细胞/ml)。在加入50％(v/v)甘油溶液后将等分试样在-80℃保存在冷冻管中或直接用于噬菌体选择过程。
实施例6.分离PSMA结合剂的选择策略
根据公开的方法(Antibody Engineering,edited by Benny Lo,chapter 8,p161-176,2004)进行文库噬菌体原液的制备和噬菌体展示选择。在大多数情况下，将与淘选方法结合的噬菌体展示用于分离结合VH结构域。然而，本领域已经很好地描述了各种不同的选择方法，包括可溶性选择和在胁迫(例热)下进行的选择。还利用单价和多价噬菌体进行了促进内化抗PSMA VH的选择(专利US2009170792(A1)―2009-07-02)。简而言之，将冰冷的细胞培养基中的封闭噬菌体加入到含有2.5×106LnCAP细胞的4ml冰冷的细胞培养基中。将噬菌体和细胞在冰上温育2小时，偶尔混合以防止细胞结块。通过在冰冷的PBS中洗涤5次除去未结合的或弱结合的噬菌体。然后通过在37℃在培养基中培养细胞使噬菌体内化，之后在4℃在低pH细胞剥离缓冲液中用5分钟的洗涤步骤去除结合于细胞外部的噬菌体。然后裂解细胞以使用三甲胺收获内化的噬菌体。在用于感染大肠杆菌之前，用Tris缓冲液中和剥离和内化的级分。如上所述分析噬菌体输出，以对重组蛋白进行淘选选择。
实施例7.测定目标结合
在一个或多个以下测定中筛选来自不同选择的VH以鉴定能够结合PMSA的特定VH。
a)结合ELISA
选择文库后，按照公布的方法(Antibody Engineering,edited by Benny Lo,chapter 8,p161-176,2004)通过噬菌体ELISA鉴定特异性VH抗体。噬菌体ELISA是针对靶蛋白和作为对照的无关抗原进行的。在一些情况下，通过ELISA而不是使用噬菌体ELISA来分析VH结构域的纯化提取物或粗提取物。在这些情况下，使用细菌周质提取物或纯化的VH。
从1ml培养物(生长在深孔板中)制备小规模细菌周质提取物。使用起始培养物接种包含2XTY液体培养基的96孔深孔板(Fisher,cat.no.MPA-600-030X)，所述2XTY液体培养基补充有0.1％(w/v)葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素，在37℃以250rpm振荡。当OD600达到0.6-1时，通过加入100μl 2XTY(补充有IPTG(终浓度1mM)和氨苄青霉素)诱导VH产生，培养物在30℃下以250rpm振荡过夜生长。通过以3200rpm离心10分钟使大肠杆菌沉淀，弃去上清液。通过轻轻吹打将细胞沉淀重悬于30-100μl冰冷的提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖，1mM EDTA和50mM Tris-HCl pH 8.0)中。将细胞在冰上温育30分钟，并且然后在4℃以4500rpm离心15分钟。将上清液转移至聚丙烯板中并在Marvel/PBS封闭溶液中温育后在ELISA中使用。
通过使用VH C-末端6xHIS标签用于周质提取物的Ni-NTA亲和色谱得到纯化的VH。每种VH的起始培养物在补充有2％(w/v)葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素的5ml 2XTY液体培养基(Melford cat.no.M2103)中在30℃以250rpm摇动生长过夜。然后用50μl该过夜培养物接种补充有2％(w/v)葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素的50ml 2XTY，并在37℃以250rpm振荡温育约6-8小时(直到OD600＝0.6-1.0)。然后将培养物以3200rpm离心10分钟，并将细胞沉淀物重新悬浮于含有100μg/ml氨苄青霉素+1mM IPTG的50ml新鲜2XTY液体培养基中。然后将摇瓶在30℃和250rpm下温育过夜。将培养物再次以3200rpm离心10分钟并丢弃上清液。通过轻轻移液将细胞沉淀重悬于1ml冰冷的提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖，1mM EDTA和50mM Tris-HClpH 8.0)中，然后再加入1.5ml 1:5稀释的冰冷提取缓冲液。将细胞在冰上温育30分钟，并且然后在4℃以4500rpm离心15分钟。将上清液转移至含有咪唑(Sigma cat.no.I2399-终浓度10mM)和0.5ml用PBS缓冲液预平衡的镍琼脂糖珠(Qiagen,Ni-NTA 50％soln,cat.no.30210)的50ml Falcon试管。在4℃温和摇动下，允许VH与镍琼脂糖珠结合2小时。然后将镍琼脂糖珠转移到polyprep柱(BioRad cat.no.731-1550)中，并且通过重力流动弃去上清液。然后用5ml PBS+0.05％
Figure BDA0001725348400001341
洗涤柱子3次，随后用5ml含有浓度为20mM的咪唑的PBS洗涤3次。然后通过加入250μl含有浓度为250mM的咪唑的PBS从柱中洗脱VH。然后通过用NAP-5柱(GE Healthcare，17-0853-01)进行缓冲液交换然后用1ml的PBS洗脱从纯化的VH制备物中除去咪唑。通过分光光度法估计纯化的VH的产量，并使用SDS PAGE评估纯度。
或者从具有pJExpress载体的W3110大肠杆菌的上清液中纯化抗PSMA VH。对于这个程序，多达400ml培养物在37℃下在TB培养基中以250rpm振荡培养，然后用1mM IPTG过夜诱导过夜。收获得到的上清液，并使用Ni-Sepharose excel柱(HiScale 16，GEHealthcare)在AKTA Pure上纯化VH。通过分光光度法估计纯化的VH的产量，并使用SDS PAGE评估纯度。
粗制或纯化的VH的结合ELISA与先前描述的血清ELISA和噬菌体ELISA相似，主要差异在最终检测步骤中。简而言之，通过加入50μl体积(以0.1-2μg/ml，在PBS中)并在4℃温育过夜，将抗原固定在Maxisorb平板(Nunc 443404)上。在包被之后，吸出抗原溶液并且使用补充有0.05％
Figure BDA0001725348400001351
20(Sigma cat.no.P1379)的PBS(制备自PBS Tablets,Oxoidcat.no.BR0014G)洗涤平板，随后用未添加
Figure BDA0001725348400001352
20的PBS洗涤。为了阻断非特异性蛋白质相互作用，向孔中加入在PBS中的3％脱脂奶粉
Figure BDA0001725348400001353
溶液并将板在室温下温育至少1小时。在聚丙烯管或板中制备3％
Figure BDA0001725348400001354
/PBS中的周质提取物或纯化的VH的稀释液，并在室温下温育至少1小时，然后转移至封闭的ELISA板中，在此进一步温育至少1小时。然后用PBS/Tween并且随后用PBS重复洗涤掉未结合的蛋白质。然后将在PBS/3％Marvel中以1:50稀释度制备的HRP缀合的抗Myc Ab(Santa Cruzcat.no.SC-40)的溶液加入到每个孔中并在室温进一步温育至少一小时。通过使用PBS/
Figure BDA0001725348400001355
和PBS重复洗涤除去未结合的检测抗体。使用TMB底物(Sigma cat.no.T0440)显色ELISA，并且10分钟后通过添加0.5M H2SO4溶液(Sigma cat.no.320501)停止反应。通过在450nm处读数来确定吸光度。
b)FMAT直接细胞结合测定
针对PSMA-结合-His-标记的VH的产生，使用荧光微量测定技术(FMAT)筛选来自大肠杆菌的周质提取物，荧光微量测定技术(FMAT)是一种基于荧光的平台，其检测定位于微珠上或微孔底部的细胞上的荧光(Dietz等,Cytometry23:177-186(1996),Miraglia等,J.Biomol.Screening4:193-204(1999)。使用标准程序使用全长人和食蟹猴PSMA在内部生成CHO TREX人和食蟹猴细胞系。LnCAP细胞购自Sigma Aldrich。
在FMAT直接结合测定中，通过单点筛选测试针对特异性结合CHO人PSMA，CHO食蟹猴PSMA和LnCAP细胞但不结合CHO亲本细胞的VH的存在测试Peripreps。将细胞以0.1x 106个细胞/ml重悬浮于添加至细胞悬液的含有PBS，0.1％牛血清白蛋白，0.01％叠氮钠和120nMDRAQ5(Thermo Scientific cat.no.62251)的FMAT测定缓冲液(pH 7.4)中。将Peripreps(10μl)转移到384孔黑色透明底平板测定板(Costar cat.no.3655)并添加10μl的6nM小鼠抗His(Millipore cat.no.05-949)/12nM山羊抗小鼠Alexa Fluor-488(JacksonImmunolabs cat.no.115-545-071)混合物。然后加入DRAQ5染色的细胞(每孔20μl)，并将测定板在室温下温育2小时。在488nm和640nm激发后，在TTP Mirrorball读板仪上的FL2(502nm-537nm)和FL5(677-800nm)通道读板。数据在FL5周界和峰强度上被门控，使用门控数据的FL2中值平均荧光强度来确定结合。
对于滴定，通过末端His标签纯化的VH在FMAT测定缓冲液中连续稀释，然后如上所述测量结合(图16)。改进的单价变体显示与亲本VH相似的性质(图16b和16c)。还测试了双互补位结合分子(16d和e)并显示出与人PSMA CHO细胞的良好结合。所使用的接头长度为(G4S)6。下表显示了鉴定的VH家族的不同CDR3序列及其结合特征。
表18(由噬菌粒和peripreps制备)
Figure BDA0001725348400001361
Figure BDA0001725348400001371
表19抗PSMA VH与表达PSMA的细胞系结合的EC50值。(制备自纯化的VH)
Figure BDA0001725348400001372
Figure BDA0001725348400001381
表20抗PSMA VH结合人PSMA-CHO的EC50值。所使用的连接子长度是(G4S)6。
No 构建体 EC50
1 1.1-2.1 3.616E-10
2 1.1-2.17 2.639E-10
3 1.1-2.15 1.948E-10
4 1.1-2.22 1.784E-10
5 1.16-2.1 3.057E-10
6 1.16-2.17 3.327E-10
7 1.16-2.15 1.967E-10
8 1.16-2.22 2.250E-10
9 1.11-2.1 2.871E-10
10 1.11-2.17 2.805E-10
11 1.11-2.15 2.100E-10
12 1.11-2.22 2.187E-10
13 1.18-2.1 2.938E-10
14 1.18-2.17 2.778E-10
15 1.18-2.15 1.921E-10
16 1.18-2.22 1.958E-10
17 1.17-2.1 3.252E-10
18 1.17-2.15 2.986E-10
19 1.17-2.17 1.921E-10
20 1.17-2.22 1.989E-10
如上鉴定的每个单独的VH克隆从噬菌粒测序，并基于VH种系和CDR3氨基酸相似性分组为不同的家族。代表性克隆进一步被表征。通过亲本克隆例如1.1和2.1的标准方法产生变体，包括种系变体。图1显示了如上文所述分离并且分组为单个家族的克隆1.1至1.20的序列。克隆1.8-1.20是1.1的变体。图2显示了如上文所述分离并且分组为单个家族的克隆2.1至2.25的序列。克隆2.2，2.11-2.19，2.22-2.25是2.1的变体。图3显示了如上文所述分离并且分组为单个家族的克隆3.1至3.24的序列。克隆3.20-3.25是3.1的变体。
实施例8-VH的表征
a)抗PMSA的特异性
按照实施例7(a)中所述的方法，通过ELISA确认单独VH对靶抗原的特异性。测试VH与PMSA的结合并显示不与无关蛋白质交叉反应。
b)使用Octet测量结合动力学和表位结合
在ForteBio Octet RED 384仪器上测量纯化的抗PSMA VH抗体的结合动力学。将重组PMSA在pH 5的乙酸钠缓冲液(ForteBio,cat.no.18-1069)中稀释至20μg/ml并使用胺偶联化学(NHS-EDC胺偶联,ForteBio cat.no.18-1067和18-1033)随后在乙醇胺中淬灭(ForteBio cat.no.18-1071)而偶联至ARG2G生物传感器(ForteBio cat.no.18-5092)。然后通过以下确定抗PSMA VH抗体的结合动力学：制备每种VH抗体的稀释系列(通常以VH的最高浓度15μg/ml开始的1:2稀释系列)，并且然后测量不同VH浓度与PSMA偶联的生物传感器的结合。然后使用1:1结合模型和ForteBio Octet DataAnalysis软件从(空白扣除的)传感图迹线确定VH结合动力学。检测了1-150nM和亚纳摩尔范围内的结合亲和力，结合参数的实例显示在下表21中。
表21
Figure BDA0001725348400001391
Figure BDA0001725348400001401
另外的家族成员，特别是母体分子的变体也如下使用从0.375μg/ml开始的1:2稀释系列进行测试。如表22和23所示检测了纳摩尔和皮摩尔范围的结合亲和力。
表22家族1
克隆 KD(nM) Kdis(1/s)
1.8 1.95 1.04E-03
1.10 0.67 4.18E-04
1.11 0.80 4.95E-04
1.12 0.55 4.28E-04
1.14 0.46 3.35E-04
1.16 0.44 3.65E-04
1.17 0.61 5.51E-04
1.18 0.59 5.72E-04
表23家族2
Figure BDA0001725348400001402
还测试了如实施例7a中使用Ni-NTA色谱法(通过C-末端His-标签)从周质提取物纯化的单结构域抗体。结果显示在下表中。检测到纳摩尔范围的结合亲和力。
表24
Figure BDA0001725348400001411
c)使用荧光微量测定技术测量食蟹猴PSMA结合VH的内化
使用pH敏感性荧光染料
Figure BDA0001725348400001412
green测量纯化的VH的内化。根据制造商的说明书用
Figure BDA0001725348400001413
Green STP酯(Molecular Probes cat.no.P35369)标记抗His抗体(Millipore cat.no.05-949)。所有样品和试剂均在含有PBS和0.1％牛血清白蛋白的内化缓冲液(pH 7.4)中制备。将表达食蟹猴PSMA的CHO细胞以0.1×106个细胞/ml重新悬浮并将120nM DRAQ5加入到细胞悬液中。将VH(10μl)转移到384-孔黑色透明底板测定板(Costarcat.no.3655)中，加入10μl 40nM
Figure BDA0001725348400001414
green标记的抗His抗体，接着加入20μl DRAQ5染色的细胞。平板在37℃温育2小时，然后平衡至室温。在488nm和640nm激发后，在TTPMirrorball读板仪上测量FL2(502nm-537nm)和FL5(677-800nm)通道中的荧光发射。数据在FL5周界和峰强度上被门控，使用门控数据的FL2中值平均荧光强度测定VH内化(图17)。
使用如上所述的pH敏感性荧光染料
Figure BDA0001725348400001421
green来测量单结构域抗体1.1和1.2的变体的内化，不同之处在于在室温将系列稀释的VH与
Figure BDA0001725348400001422
green标记的抗His抗体预温育30分钟，之后加入DRAQ5染色的CHO人PSMA克隆1A10细胞(20μl)。将平板在室温下温育2小时，然后测量荧光发射。测定中VH的活性显示在下表25中。
表25
Figure BDA0001725348400001423
d)使用His-ZAP测定测量结合PSMA的VH的内化
使用缀合至皂草素毒素的抗His抗体(His-ZAP Advanced targeting SystemsIT52)评估His标记的结合PSMA的VH的内化。His-ZAP试剂与VH结合并通过VH与细胞表面上的PSMA相互作用而内化。皂草素毒素从内体中的复合物释放并使核糖体失活，最终导致细胞死亡。
将表达小鼠或食蟹猴PSMA的CHO细胞(30μl体积中的400个细胞/孔)接种到384孔黑色透明底组织培养物处理的测定板(Costar cat.no.3712)中的Hams F12培养基(Sigmacat.no.N6658)中并在37℃在CO2培养箱中温育过夜，所述Hams F12培养基含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10μg/ml杀稻瘟菌素，300μg/ml博来霉素，青霉素/链霉素，1μg/ml四环素。将纯化的VH在培养基中连续稀释，然后加入等体积的40nM His-ZAP。在37℃温育30分钟后，将VH/His-ZAP样品(10μl)转移至细胞测定板中，并在37℃在CO2培养箱中温育48小时。在每个平板上设置His-ZAP对照孔(具有His-ZAP试剂的细胞)和背景对照(仅培养基)用于数据归一化。根据制造商的说明书，使用Cell Titer-Glo细胞生存力测定(Promegacat.no.G7571)在48小时温育后测定细胞生存力。使用BMG PHERAstar平板读数器测量相对发光信号(RLU)。通过减去在不存在细胞时获得的RLU信号并表达为His-ZAP对照孔的背景校正信号的百分比将数据归一化(图18)。
对于LnCAP测定，将细胞(每孔2000个，100μl体积)接种到96孔TC-处理的板(Costar 3340)中的RPMI 1640培养基中，所述RPMI 1640含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。纯化的VH在培养基中连续稀释，然后加入等体积的60nM His-ZAP。在37℃温育30分钟后，将VH/His-ZAP样品(100μl)转移至细胞测定板中，并在37℃在CO2培养箱中温育96小时。使用Cell Titer-Glo细胞生存力测定测量细胞生存力并如上所述分析数据。实例如图19所示。
确定单结构域抗体1.1和2.1的变体与结合的皂草素缀合的抗His抗体内化导致毒素介导的细胞死亡的能力。如上所述进行测定，不同之处在于CHO人PSMA克隆1A10细胞用于人PSMA测定，并且在测量细胞生存力之前将平板在37℃在CO2培养箱中温育72小时。测定中测试的单结构域抗体的活性显示在下表26中。
表26
Figure BDA0001725348400001431
测试双互补位分子并显示以下EC50值。
表27
Figure BDA0001725348400001441
实施例9-VH的稳定性
测试来自不同CDR3家族的VH的可显影性特征。
a)热稳定性：HPLC尺寸排阻色谱
将纯化的VH进行尺寸排阻色谱。简而言之，将纯化的VH在4℃或40℃下在PBS缓冲液中储存0-14天，然后使用含有PDA检测器(在280nm处检测)的Waters H-Class Bio UPLC在不同时间点进行分析，其中在Waters ACQUITY BEH
Figure BDA0001725348400001442
SEC柱上进行分离。样品以10μl体积注射，并以0.4ml/分钟的流速在含有200mM NaCl，100mM磷酸钠，pH 7.4+5％丙-1-醇的流动相中运行。收集数据6分钟，并计算储存后与开始时(T＝0)存在的单体相比的剩余单体的百分比。亲本分子显示出高稳定性。变体也进行了测试。
应该注意的是，这些数据是在未优化的缓冲条件下收集的。
样品浓度变化：单价1.1变体：5.0mg/ml
单价2.1变体：3.5mg/ml
结果显示在下表中。
表27
Figure BDA0001725348400001451
表28
Figure BDA0001725348400001452
表29
Figure BDA0001725348400001453
Figure BDA0001725348400001461
还测试了长达35天的单价单结构域抗体的长期稳定性并显示出良好的特征。
b)热稳定性：镜球
将纯化的VH样品在40℃下温育0-8天，然后使用如实施例7(b)中详述的FMAT直接结合测定来测试与表达食蟹猴PSMA的CHO细胞的结合。分子测试显示良好的稳定性。
c)使用均相时间分辨荧光(HTRF)评估评估VH血清稳定性。
将纯化的VH与食蟹猴血清混合并在37℃温育0-7天。然后使用HTRF测定评估样品与PSMA的结合。简言之，使用Pierce EZ-Link Micro-Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(Thermo Scientificcat.no.21935)对PSMA(R&D Systems cat.no.4234-ZN)进行生物素化。对于HTRF结合测定，所有样品和试剂均在含有PBS，0.1％(w/v)BSA和0.4M氟化钾的HTRF测定缓冲液中制备。在黑色384-浅孔板(Costarcat.no.3676)中以10μl的总测定体积，将VH(经C末端His-Myc标记)与3nM生物素化的PSMA，1.5nM链霉亲和素穴状化合物(Cisbiocat.no.610SAKLA)和10nM Anti-Myc-Alexa Fluor-647(AbD Seroteccat.no.MCA2200AF647)在室温下温育至少3小时。在BMG PHERAstar平板读数器上在337nm激发后测量620nm和665nm处的时间分辨荧光发射。
在另一个实验中，将纯化的VH与人血清在37℃混合0-7天，然后如
实施例7(b)FMAT直接细胞结合测定中所述评估与huPSMA CHO 1A10细胞的结合。获得的数据和EC50值显示在下面的表29和30中。
表29
Figure BDA0001725348400001462
Figure BDA0001725348400001471
表30
VH EC50
1.8第0天 4.09E-10
1.8第1天 4.86E-10
1.8第4天 4.96E-10
1.8第7天 5.42E-10
1.11第0天 2.34E-10
1.11第1天 2.08E-10
1.11第4天 2.27E-10
1.11第7天 2.78E-10
1.16第0天 1.65E-10
1.16第1天 2.43E-10
1.16第4天 2.42E-10
1.16第7天 2.36E-10
1.17第0天 2.73E-10
1.17第1天 2.53E-10
1.17第4天 2.59E-10
1.17第7天 2.74E-10
1.18第0天 3.04E-10
1.18第1天 3.11E-10
1.18第4天 3.19E-10
1.18第7天 3.13E-10
为了评估不同双互补位组合的血清稳定性，将纯化的双互补位VH与人血清在37℃混合0-7天，然后如实施例7(b)FMAT直接细胞结合测定中所述评估与huPSMA CHO细胞的结合。表31显示了细胞结合的EC50值。
表31：双互补位抗PSMA VH与表达PSMA的细胞系的结合的EC50值。
Figure BDA0001725348400001481
d)评估VH热稳定性
使用MicroCal VP-Capillary DSC(Malvern)进行差示扫描量热法(DSC)。在10和90℃之间使用60℃/分钟的扫描速率运行300μl在PBS中的0.25mg/ml的蛋白质。使用MicroCal软件分析数据。针对单价单结构域抗体的结果显示于表32中并且针对双互补位结合分子的结果显示于表33中。
表32
Figure BDA0001725348400001491
表32
Figure BDA0001725348400001492
实施例10小鼠中的成像研究
将VH(VH1.1，VH2.1和具有延长的半衰期的VH2.1)注射入小鼠。小鼠含有PSMA阳性(+)和PSMA阴性(-)肿瘤。研究进行如下：
·每只小鼠～100MBq的Tc-99m注射活性
·在5min、30min、60min、3hr、6hr&24hr的SPECT/CT。
·不同时间点生成的图像
·成像后离体生物分布和放射自显影
·阴性对照VH(αHEL4)
半衰期延长的VH包含具有以下序列的抗小鼠血清白蛋白(抗MSA)VH：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDSGSSADYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYNWNPRALGIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:528)
特别是与对照单克隆IgG抗PSMA抗体相比，这些实验显示出高水平的特异性肿瘤靶向，更快的渗透和注射剂量对PSMA+肿瘤的更大累积。这可以通过延长VH的半衰期来进一步改善。此外，数据显示裸
Figure BDA0001725348400001501
VH的快速清除。
实施例11表位作图
结合PSMA的VH针对彼此的串联表位作图使用Octet RED 384进行。然后使用1:1结合模型和ForteBio Octet DataAnalysis软件从(减去参考传感器的)传感图迹线确定VH结合。另见实施例8b。表33中显示了表位结合结果。有些克隆显示部分阻断。
表33
组1 组2
3.6 1.4
2.1 12.1
11.1 5.1
4.1 13.1
7.1 6.1
14.1
10.1
9.1
在进一步的实验中，单结构域抗体1.1和2.1之间的表位竞争被进一步表征。使用胺偶联第二代试剂盒(ForteBio)将PSMA偶联到AR2G生物传感器上，然后用于使用OctetRED384进行的表位分库实验。在这些实验中，每个VH被稀释至4μg/ml的浓度。生物传感器不加载VH或加载2.1或1.1之一，直到与PSMA结合达到饱和水平。然后将这些传感器在进行第二缔合骤之前短暂地浸入PBS/Tween中。第二个缔合步骤涉及将生物传感器浸入仅含有相同VH或含有2.1和1.1的孔中。后一组合中第一VH的存在确保了它继续饱和它的PSMA结合位点。然后使用ForteBio分析软件研究结合谱。获得的这些数据证明单结构域抗体2.1和1.2结合PSMA上不同的表位。
实施例12成像研究
这些研究中测试了以下构建体：
VH 2.1
VH 2.1-HIS,1.2mg/ml
序列:
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPAWGLRLGESSSYDFDIWGQGTMVTVSSLEGGGSEQKLISEEDLNHHHHHH(SEQ ID NO.532)
VH 1.1
VH 1.1-HIS
序列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIGENDGTTDYADSVKGRFTISRDNSKSMLYLQMNSLRVEDTAVYYCVKDGVHWGQGTLVTVSSLEGGGSEQKLISEEDLNHHHHHH(SEQIDNO.533)
Hel4
HEL-4-HIS
序列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRISDEDMGWVRQAPGKGLEWVSSIYGPSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASALEPLSEPLGFWGQGTLVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO.534)
VH 2.1-VH 2.1
VH 2.1-6GS-VH 2.1
序列:
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPAWGLRLGESSSYDFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPAWGLRLGESSSYDFDIWGQGTMVTVSSAAAHHHHHH(SEQID NO.535)
VH 2.1-VH 1.1
VH 2.1-6GS-VH 1.1
序列:
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPAWGLRLGESSSYDFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIGENDGTTDYADSVKGRFTISRDNSKSMLYLQMNSLRVEDTAVYYCVKDGVHWGQGTLVTVSSAAAHHHHHH(SEQ ID NO.536)
本研究中使用的所有VH结构域均在大肠杆菌中表达。如实施例7a所述，使用镍亲和色谱和尺寸排阻色谱(SEC)从过滤的上清液中纯化蛋白质。缓冲液交换为储存缓冲液后，使用旋转浓缩器浓缩一些蛋白质。使用SDS-PAGE和分析型SEC分析蛋白质纯度。使用重组蛋白和/或表达PSMA的细胞检查与PSMA的结合。通过将蛋白质加热至40℃保持长时间(范围从过夜至4周)并测量蛋白质降解程度来检查稳定性。将等分试样的蛋白质储存在-80℃直至使用。
共聚焦荧光显微术方法以测试表达PSMA的细胞系中感兴趣的VH(以单价，二价和双互补位形式)与胞吞作用的标志物LAMP-1(染色溶酶体)和EEA-1(染色早期内体)之间共定位的发生。使用结合PSMA的IgG基准抗体作为阳性对照。结果显示在图20-24中并证明二价和双互补位VH构建体的改进的内化。
实验方案
使用的细胞系是CHO T-REx huPSMA细胞系。
1)实验前一天用四环素诱导CHO T-REx huPSMA细胞进行PSMA表达，并涂布在盖玻片上。
2)第二天，将细胞与包含500nM的测试VH(以其单价，二价或双互补位形式)的培养基或与阳性对照温育。
3)首先将样品在冰上温育30分钟以阻断胞吞，然后在室温下用4％PFA固定10分钟，然后在PBS中洗涤3次。重复的样品在37℃下进一步温育2小时以触发胞吞作用，然后固定。
4)固定样品后，用缓冲液渗透化。
5)与阳性对照温育的细胞使用在0.5％BSA/PBS+0.05％Tween中1:2000稀释的抗人488抗体染色1小时，随后在PBS+0.05％Tween中洗涤三次(每次5分钟)。
6)将用单价或二价/双互补位测试VH温育的细胞用一级抗HIS抗体(小鼠)染色1小时，随后洗涤，然后与二级抗小鼠488抗体温育1小时，随后洗涤。
7)使用针对早期内体抗原1(EEA-1)或溶酶体膜抗原1(LAMP-1)(都是兔)的第一抗体染色溶酶体和内体1小时。将细胞进一步与抗兔647二抗温育1小时，然后洗涤。
8)所有样品还用HOECHST 1:1000(0.5ug/ml)染色5分钟，然后洗涤。
9)盖玻片安装在灰白端玻片上，并使用NIKON A1R共聚焦系统成像。
图片是使用NIS-ELEMENTS AR程序拍摄的。
使用的激光线是：407.7nm(HOECHST)，487.7nm(VH/单克隆基准)，639.7(LAMP-1，EEA-1)
物镜：Apo 60x油λS DIC N2
对于共聚焦模式：针孔尺寸(μm)：39.6，Z步长：0.49um。
进一步的成像研究使用表达人PSMA的CHO细胞(15000/孔)进行，所述细胞接种到96孔聚-L-赖氨酸(Sigma P4707)包被板(Perkin Elmer6005550)中的Hams F12(SigmaN6658)培养基中并在CO2培养箱中于37℃温育过夜，所述Hams F12培养基含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10μg/ml杀稻瘟菌素，300μg/ml博来霉素，青霉素/链霉素，1μg/ml四环素。将VH加入平板并在4℃下温育30分钟，然后在37℃温育2小时。将平板用PBS洗涤三次，然后将细胞固定在4％多聚甲醛中并用0.5％皂苷进行渗透化。通过用抗His(Millipore 05-949)和抗小鼠AF488(JacksonImmunoResearch 115-545-098)染色检测内化的VH。溶酶体用LAMP-1(Abcam Ab24170)和抗兔AF647(Jackson ImmunoResearch 111-605-008)染色。细胞核使用Hoescht染色剂(Life technologies H3570)染色。使用IN CellAnalyzer 6000对板进行成像，并使用ImageJ软件对图像进行处理。结果如图25所示。
实施例13与结合分子缀合的MMAE毒素的体外效力
使用体外细胞毒性测定确定缀合MMAE毒素的VH内化至表达PSMA的细胞中从而导致细胞杀伤的能力。
将稳定表达人PSMA的人细胞(DU-145，ATCC HTB-81)或匹配的PSMA阴性细胞以每孔3000个细胞接种到384孔黑色透明底组织培养物处理的测定板中的RPMI 1640培养基中并在37℃的CO2培养箱中温育过夜，所述培养基含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，1X青霉素/链霉素。然后将细胞与连续稀释的缀合MMAE毒素的VH温育48或72小时。未处理的对照孔(不存在缀合毒素的VH的细胞)和背景对照孔(仅培养基)设置于每个平板上用于数据归一化。根据制造商的说明书，使用Cell Titer-Glo细胞生存力测定(Promega G7571)在温育后测定细胞杀伤。使用BMGPHERAstar平板读数器测量相对发光信号(RLU)。通过减去背景对照孔中获得的RLU信号将数据归一化，然后表示为未处理对照孔的％(％存活率)。图26说明在代表性实验(48小时温育)中使用表达人PSMA的人细胞系和匹配的亲本(即未转染的)PSMA阴性细胞系获得的剂量应答曲线。表20总结了缀合MMAE的构建体获得的IC50值和最大％细胞杀伤。使用HiPEGTM技术(WO 2009/047500；Cong等,(2012)BioconjugateChem.2012,23,248-263)将Crescendo的
Figure BDA0001725348400001552
VH缀合至MMAE；使用ThioBridgeTM技术(WO 2016063006；WO 2005/007197；Balan等,(2007)Bioconjugate Chem.,18,61-76)产生阳性ADC对照。抗PSMA-MMAE缀合的VH特异性杀伤PSMA阳性细胞，对于PSMA阴性对照细胞系观察到最小的细胞杀伤。由靶向PSMA不同表位的两个VH组成的双互补位比单价或二价PSMA VH构建体更有效。DU145测定用48小时和72小时HDC温育进行。这对测量的IC50值和％最大杀伤有影响，但不会影响不同HDC形式的排名。对于筛选，48小时温育对于更高通量是优选的。使用48小时温育，没有任何测试的构建体达到100％细胞杀伤(即使在测试的最高浓度下)。最大的应答在约70-85％(见表34)。表35显示了IC50值，图27显示了使用72小时温育时间(n＝1数据)观察到的更高的最大％细胞杀伤。
表34.48小时温育后用表达人PSMA的人细胞系获得的体外细胞毒性数据总结。
Figure BDA0001725348400001551
Figure BDA0001725348400001561
表35.72小时温育后用表达人PSMA的人细胞系获得的体外细胞毒性数据总结。
Figure BDA0001725348400001562
观察到的单价构建体的效价顺序为VH2.1>VH1.1>VH3.1。
观察到VH2.1二价构建体比VH2.1单价构建体效力大约3倍，然而当使用二价构建体时，最大杀伤％降低。
观察到VH1.1二价构建体比VH1.1单价构建体的效力低大约6倍。
VH3.1二价构建体具有与VH3.1单价构建体相当的活性，观察到最大杀伤％略有改善。
发现双互补位构建体中VH的顺序影响活性，观察到2.5-4.6倍的差异。观察到取向(N-C)VH2.1-VH1.1的双互补位构建体的活性低于取向VH1.1-VH2.1时的活性。
观察到接头长度在所进行的实验中对活性具有最小影响(1.2至2.2倍)。然而对于一些被测试的构建体，(G4S)6接头版本稍微更具活性。
双互补位构建体显示出比单价构建体更高的活性。发现最具活性的双互补位比最具活性的单价的活性高约7倍。
最具活性的双互补位比对照抗PSMA mAb活性低4.7倍；然而，mAb的DAR是4，而双互补位构建体的DAR是1。当计算相对于毒素浓度的IC50时，所有构建体显示出预期效价，双互补位1.1-2.1HDC与对照ADC相比具有相当的效价。
制备HumabodyTM药物缀合物(HDC)的程序
在进行缀合反应之前，在MeCN中制备缀合试剂HiPEGTMval-cit-PAB-MMAE(图28)的储备溶液。将HumabodyTM(在PBS中0.9mg/mL；20mM EDTA，pH7.5)的溶液与HiPEGTMval-cit-PAB-MMAE试剂(1.5当量/HumabodyTM；5％(v/v)最终MeCN浓度)轻轻混合并在22℃温育19小时。19小时后，将缀合反应物与等体积的pH 7.5的600mM磷酸钠缓冲液(150mM NaCl；20mMEDTA)混合并冷却至4℃。在0.1M NaOH中制备1mg/mL NaBH4溶液的储备溶液。将NaBH4溶液的两份等分试样(每个试剂10当量)加入到冷却的缀合反应中，加入之间间隔30分钟。再过30分钟后，通过使用TOSOH ToyoPearl Phenyl-650S柱的疏水相互作用色谱(HIC)纯化粗混合物。将样品结合在柱上并使用50mM磷酸钠(2MNaCl)，pH 7(缓冲液A)洗涤，并使用pH 7的50mM磷酸钠(20％v/v异丙醇)(缓冲液B)梯度洗脱。将含有单加载产物的级分合并并使用配有5kDa MWCO PES膜的Vivaspin20浓缩器进行浓缩。使用PD10柱将浓缩级分缓冲液交换到DPBS中，并且使用0.2μm PVDF注射器过滤单元无菌过滤缓冲液交换材料。
HiPEG val-cit-PAB-MMAE部分通过VH上的C端His6标签附接。每个“有效载荷”毒素分子的附接需要两个组氨酸。Humabody VH,DAR＝1的那些被纯化用于细胞毒性研究，在某些情况下未达到精确的DAR 1(见下表)。在本文的实施例中，单个MMAE部分被附接，但多个有效载荷是可能的(DAR>1)。
药物:抗体比率(DAR)为3.5的对照ADC的制备程序
阳性对照抗体Pro_006是由US8470330内所述的重链和轻链序列组成的抗PSMA抗体，并且示例为抗体006。
缀合1：将mAb Pro_006(5.07mg/mL)在反应缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl；20mMEDTA，pH 7.5)中的溶液加热至40℃15分钟。将TCEP(5mM，2当量/mAb)加入mAb溶液中，轻轻混合并在40℃温育1小时。以2.8mM在DMF中制备缀合试剂mc-val-cit-PAB-MMAE(图29)的储备溶液。将还原的mAb冷却至22℃，用反应缓冲液稀释至4.2mg/mL，并加入mc-val-cit-PAB-MMAE(5.25当量/mAb)。缀合混合物在22℃温育2小时。在22℃下用50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(20当量，超过试剂)处理粗缀合混合物30分钟。使用装有30kDa MWCO PES膜的Vivaspin20浓缩器将反应混合物针对DPBS进行渗滤。使用Centripure P50柱将渗滤的ADC溶液缓冲液交换到DPBS中。样品的DAR通过HIC评估(平均DAR＝3.21)。
缀合2：将mAb Pro_006(5.07mg/mL)在反应缓冲液(20mM磷酸钠150mM NaCl；20mMEDTA)pH 7.5中的溶液加热至40℃15分钟。将TCEP(5mM，2.75当量/mAb)加入mAb溶液中，轻轻混合并在40℃温育1小时。以4.0mM在DMF中制备缀合试剂mc-val-cit-PAB-MMAE(图29)的储备溶液。将还原的mAb冷却至22℃，用反应缓冲液稀释至4.2mg/mL，并加入mc-val-cit-PAB-MMAE(7当量/mAb)。缀合混合物在22℃温育2小时。在22℃下用50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(20当量，超过试剂)处理粗缀合混合物30分钟。使用装有30kDa MWCO PES膜的Vivaspin20浓缩器将反应混合物针对DPBS进行渗滤。使用Centripure P50柱将渗滤的ADC溶液缓冲液交换到DPBS中。样品的DAR通过HIC评估(平均DAR＝4.52)。
产生平均DAR 3.5ADC:ADC 1(DAR 3.21)和ADC 2(DAR 4.52)以4:1摩尔比混合以制备具有中间DAR的ADC。所得样品使用0.2μm PVDF注射器过滤单元进行无菌过滤。样品的DAR通过HIC评估(平均DAR＝3.45)。
半衰期延长HDC的体外效力
使用DU145细胞杀伤测定评估半衰期延长的HDC的体外效力(72小时)。
产生表36中所述的这一物质以测试向HDC添加半衰期延长部分的效果。使用结合MSA的VH(SEQ ID NO.528)产生半衰期延长版本(HLE)。使用DU145细胞杀伤测定评估体外效力(72h)。图30A&B显示在PSMA-DU145细胞毒性测定(72h)中观察到的IC50值：对照ADCmAb-MMAE(■)，2.1 6GS-1.1-MMAE双互补位(▲)，2.1-6GS-1.1-MMAE-HLE半衰期延长的双互补位(▼)，HEL4-MMAE单价(●)和HEL4-HLE-MMAE单价半衰期延长的(I)，(A)表达PSMA的DU145和(B)未经修饰以表达PSMA的DU145亲本细胞。
表36IC50值PSMA-DU145细胞毒性测定(72h)：
Figure BDA0001725348400001591
Figure IDA0001725348440000011
Figure IDA0001725348440000021
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Claims (29)

1.结合分子，其包含能够结合人PSMA的第一单人重链可变免疫球蛋白(VH)结构域抗体和能够结合人PSMA的第二单VH结构域抗体，其中所述第一和所述第二单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.1的CDR1序列、SEQ ID NO.2的CDR2序列和SEQ ID NO.3的CDR3序列；SEQ IDNO.41的CDR1序列、SEQ ID NO.42的CDR2序列和SEQ ID NO.43的CDR3序列；SEQ ID NO.61的CDR1序列、SEQ ID NO.62的CDR2序列和SEQ ID NO.63的CDR3序列；SEQ ID NO.69的CDR1序列、SEQ ID NO.70的CDR2序列和SEQ ID NO.71的CDR3序列；SEQ ID NO.81的CDR1序列、SEQID NO.82的CDR2序列和SEQ ID NO.83的CDR3序列；SEQ ID NO.137的CDR1序列、SEQ IDNO.138的CDR2序列和SEQ ID NO.139的CDR3序列；SEQ ID NO.145的CDR1序列、SEQ IDNO.146的CDR2序列和SEQ ID NO.147的CDR3序列；和/或SEQ ID NO.165的CDR1序列、SEQ IDNO.166的CDR2序列和SEQ ID NO.167的CDR3序列。
2. 根据权利要求1所述的结合分子，其中任选地所述第一或第二单VH结构域抗体包含SEQ ID NO.4、44、64、72、84、140、148或168的序列。
3.根据权利要求1或2任一项所述的结合分子，其中所述第一和第二VH结构域是相同的VH结构域。
4.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述第一单VH结构域抗体位于C端或N端。
5.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述第一和第二VH结构域通过肽接头共价连接。
6.根据权利要求5所述的结合分子，其中所述肽接头的长度是3至50个氨基酸。
7.根据权利要求5或6所述的结合分子，其中所述肽接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述肽接头由式(Gly4Ser)n组成，其中n=1至10。
9.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子包含延长半衰期的部分。
10.根据权利要求9所述的结合分子，其中所述延长半衰期的部分与所述第一或第二VH结构域共价连接。
11.根据权利要求10所述的结合分子，其中所述延长半衰期的部分选自由以下各项组成的组：白蛋白结合部分，转铁蛋白结合部分，聚乙二醇分子，重组聚乙二醇分子，人血清白蛋白，人血清白蛋白的片段和白蛋白结合肽。
12.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子能够被细胞内化。
13.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子与细胞毒性部分缀合。
14.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子与标记缀合。
15.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子缺乏轻链。
16.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述第一和第二VH结构域从获自敲除小鼠的文库获得，在所述小鼠中轻链和重链基因座在功能上沉默并且所述小鼠表达具有一个或多个人重链基因的转基因。
17.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的结合分子和药物载体。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物，其用作药物。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物，其用于治疗前列腺癌或前列腺疾病。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物在制备用于治疗前列腺癌或前列腺疾病的药物中的用途。
21.将细胞毒性部分递送到肿瘤细胞中的体外方法，其包括将所述细胞暴露于根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物在制备用于在患者中成像的试剂中的用途。
23.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物用于制备放射性标记的化合物的用途。
24.根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物在制备用于对一种或多种PSMA肿瘤或细胞成像的试剂中的用途。
25.分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子的核苷酸序列。
26.构建体，其包含根据权利要求25所述的核酸分子。
27.宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的核酸分子或根据权利要求26所述的构建体。
28.试剂盒，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子或根据权利要求17所述的药物组合物。
29.产生根据权利要求1至16中任一项所述的结合分子的方法，其包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸并从宿主细胞培养物中分离所述结合分子。
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