JP2019511201A - 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）と結合する分子 - Google Patents

前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）と結合する分子 Download PDF

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Abstract

本開示は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と特異的に結合する結合分子、特に、単一ヒト可変重鎖ドメイン抗体および癌の処置のための関連法に関する。

Description

本発明は、前立腺特異的膜抗原(prostate specific membrane antigen)（ＰＳＭＡ）結合分子、および疾患の処置におけるこのような結合分子の使用に関する。
序論
前立腺癌は、先進国の男性において最も多く診断されている非皮膚関連悪性腫瘍である。６人に１人が前立腺癌と診断されると推計される。
前立腺癌の現行治療には、手術、放射線、および補助ホルモン療法が含まれる。これらの療法は疾患の早期段階では比較的有効であるが、限局性前立腺癌と最初に診断された患者の大多数は最終的には再発する。化学療法は進行した前立腺癌との対抗において最も広く用いられているアプローチの１つであるが、その治療効力は通常、特異性の欠如と関連毒性のために十分ではない。前立腺癌細胞への標的化送達の欠如は、実現可能な治療効果を達成する上で主要な障害の１つである。よって、抗前立腺癌薬の選択性を高める戦略の重要な必要性が依然としてある(Barve et al., J Control Release. 2014 August 10; 0: 1 18-132)。
前立腺癌の診断は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの血清に基づくマーカーの使用の後に著しく改善された。加えて、前立腺腫瘍関連抗原は、腫瘍イメージング、診断、および標的化療法のための標的となる。前立腺腫瘍関連マーカーである前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もこのような標的である。
ＰＳＭＡは、前立腺分泌上皮細胞膜に極めて限定された７５０残基のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡは前立腺癌細胞胞および非前立腺固形腫瘍新生血管に発現が高く、健康な前立腺、腎臓、肝臓、小腸、および脳を含む他の組織では低レベルで発現する。ＰＳＭＡ発現は、前立腺疾患の進行および転移とともに増大し、よって、その発現レベルは、腫瘍の悪性度との相関が見出されている。様々な免疫組織学的研究では、良性前立腺上皮細胞でのレベルに比べ、実質的に前立腺癌腫の総ての症例でＰＳＭＡレベルの増大が証明されている。前立腺上皮内新生物、後期アンドロゲン非依存性前立腺癌ならびにリンパ節、骨、軟組織、および肺に限局された続発性前立腺腫瘍を含む、この疾患のあらゆる病期で、強いＰＳＭＡ染色が見られる。よって、ＰＳＭＡは前立腺癌細胞のバイオマーカーとして広く使用されている。
ＰＳＭＡは、１９アミノ酸の内部部分、２４アミノ酸の膜貫通部分、および７０７アミノ酸の外部部分の、３部構造を有する。ＰＳＭＡは、ニューロペプチドＮ−アセチルアスパルチルグルタミン酸およびグルタミン酸コンジュゲート葉酸誘導体を処理するその能力に基づくグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を有する非共有結合性のホモ二量体を形成する。ＰＳＭＡは、内部移行経路によって迅速かつ効率的に内部移行を受け、迅速に再循環して膜に戻る。
抗体に基づく療法は、腫瘍学、炎症性疾患および感染性疾患などの分野で数を増しているヒト悪性腫瘍に対する療法の重要な成分として登場した。ほとんどの場合、この療法の機能の基礎は、抗体に基づく薬物がその標的抗原に対して有する高い程度の特異性および親和性である。薬物、毒素、または放射性核種を伴う武装モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ｍＡｂが治療効果を誘導し得るさらに別の戦略である。抗体の標的化特異性と毒性エフェクター分子の腫瘍死滅力を合わせることによって、免疫複合体は標的と正常組織の間の高感度の識別を可能とし、それによって、ほとんどの従来化学療法薬より副作用を少なくする。
しかしながら、ｍＡｂはそれらの大きさおよびその他の物理的特性のために、静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）のいずれかに投与しなければならず、従って、高い全身暴露を有する。よって、それらの送達経路が最適と言えないことが多く、いずれの場合でも、非罹患部の標的抗原に結合する抗体をもたらし得る（正常な非罹患組織の健常な機能を損なうおそれがある）か、または最適とは言えないＰＫ／ＰＤ特徴をもたらし得る。どちらの転帰も、最適とは言えない投与経路のために有効性の低下および／または安全性特性の障害をもたらし得る。
報告された最初のＰＳＭＡ特異的ｍＡｂであるマウスｍＡｂ ７Ｅ１１は、その後、腫瘍イメージング用の診断薬として開発および商品化された（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎ、プリンストン、Ｎ．Ｊ．）。しかしながら、この抗体は、細胞死の際に露出するＰＳＭＡの細胞内エピトープを認識し、ＰＳＭＡの検出のための造影剤としてのその有用性を限定する。さらに最近では、ＰＳＭＡの細胞外部分を認識するＪ５９１などのｍＡｂが同定された。
本発明の目的は、前立腺癌の治療において使用するための別の、抗体に基づく処置の必要に対処することである。
発明の概要
本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合する結合分子に関する。特に、本発明は、２以上の単一ヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメイン抗体を含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合する多価／多重パラトープ性結合分子に関する。特に、結合は、その天然型のヒトＰＳＭＡに対するものである。好ましい実施形態では、単一ＶＨドメインは、ヒトＶ遺伝子遺伝子座を発現しかつＰＳＭＡ抗原で免疫されたトランスジェニック齧歯類で産生される重鎖単独抗体から生成される。本発明の結合分子において使用される単一ドメイン抗体は一価形態で標的と結合する。単一ドメイン抗体は従来のモノクローナル抗体形式よりも小さく、本発明者らは、このような分子がモノクローナル抗体の水準と比較して高いレベルの特異的腫瘍標的化、迅速な浸透および腫瘍での高い蓄積を助長することを示した。本明細書で示されるように、結合分子は、一価単一ドメイン抗体に比べて改善した特性を有し、特に、それらの結合分子は改善された細胞内部移行を示す。それらの結合分子はまた、モノクローナル水準抗体とは異なる特性を示す。本発明者らはまた、単一ドメイン抗体がヒトＰＳＭＡと高い親和性で結合し、極めて安定で、高レベルで発現されることも示した。さらに、本発明の単一ＶＨドメイン抗体は、マウス抗体よりも免疫原性が低く、ヒト化は必要とされない。これらの特性は、本発明の化合物を、種々の形式で、例えば、多価／多重パラトープ性形式で、および毒素または半減期延長部分とコンジュゲートして特に有用とする。よって、本化合物は疾患、特に、癌の処置において有用である。１つの態様では、本発明は、２以上の本明細書に記載の単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる免疫複合体を提供する。本発明の態様を以下でさらにまとめる。
よって、１つの態様では、本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第１の単一ヒト重鎖可変免疫グロブリン（ＶＨ）ドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第２の単一ＶＨドメイン抗体とを含んでなる結合分子に関する。
１つの実施形態では、前記第１のＶＨドメインと前記第２のＶＨドメインは、ヒトＰＳＭＡ上の同じエピトープと結合する。
１つの実施形態では、前記第１の単一ＶＨドメイン抗体は、ＰＳＭＡ上の第１のエピトープと結合し、前記第２の単一ＶＨドメイン抗体は、ＰＳＭＡ上の第２のエピトープと結合し、前記第１のエピトープと前記第２のエピトープは同一でない。
本発明はまた、前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体が、配列番号３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、前記請求に記載の結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体が、配列番号８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号１８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２７９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２９５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３０３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３３１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１および／または第２のＶＨドメインが、配列番号３７１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１および／または第２のＶＨドメインが、配列番号３７５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３９１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる結合分子に関する。
本発明はまた、ａ）第１の単一ＶＨドメイン抗体が系列２、３、４、７、９、１０、１１または１４の単一ＶＨドメイン抗体から選択され、かつ、ｂ）第２の単一Ｈドメイン抗体が系列１、５、６、１２または１３から選択される、請求項３に記載の結合分子に関する。
本発明はまた、ａ）第１の単一ＶＨドメイン抗体が系列２の単一ＶＨドメイン抗体から選択され、ｂ）第２の単一ＶＨドメイン抗体が系列１の単一ＶＨドメイン抗体から選択される結合分子に関する。前記第１の単一ＶＨドメイン抗体はＣまたはＮ末端のいずれかに位置し、従って、いずれの配向も本発明の範囲内である。
本発明はまた、ａ）第１のＶＨドメインが、ＰＳＭＡとの結合に関して、配列番号４を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）と競合することができ、かつ／または配列番号４を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）とＰＳＭＡとの結合を交差遮断することができ、かつ、ｂ）第２のＶＨドメインが、ＰＳＭＡとの結合に関して、配列番号７６を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）と競合することができ、かつ／または配列番号７６を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）とＰＳＭＡとの結合を交差遮断することができる結合分子に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の結合分子と医薬担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、結合分子または本明細書に記載の医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる前立腺癌または前立腺障害を処置するための方法に関する。
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための本明細書に記載の結合分子または医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、前立腺癌または前立腺障害の治療において使用するための本明細書に記載の結合分子または医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、前立腺癌または前立腺障害の治療のための薬剤の製造における本明細書に記載の結合分子または医薬組成物の使用に関する。
別の態様では、本発明は、ヒトＰＳＭＡを本明細書に記載の結合分子と接触させることを含んでなるヒトＰＳＭＡ活性を低減するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
別の態様では、本発明は、試験サンプル中のＰＳＭＡの存在をイムノアッセイにより決定するための方法であって、前記サンプルを本明細書に記載の結合分子および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させることを含んでなる方法に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸を含んでなる核酸構築物に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸または構築物を含んでなる宿主細胞に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の結合分子を生産するための方法であって、前記結合分子をコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、および前記結合分子を前記宿主細胞培養物から単離することを含んでなる方法に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の結合分子または医薬組成物を含んでなるキットに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１以上の単一ドメイン抗体を含んでなる二重パラトープ性、二価または多重特異性結合分子に関する。
系列１の配列。この図は、系列１における単一ドメイン抗体のための全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク(Framework)（ＦＲ）および相補性決定領域(complementarity determining region)（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は太字で強調されている。 系列２の配列。この図は、系列２の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列３の配列。この図は、系列３の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列４の配列。この図は、系列４の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列５の配列。この図は、系列５の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列６の配列。この図は、系列６の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列７の配列。この図は、系列７の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列８の配列。この図は、系列８の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列９の配列。この図は、系列９の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１０の配列。この図は、系列１０の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１１の配列。この図は、系列１１の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１２の配列。この図は、系列１２の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１３の配列。この図は、系列１３の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１４の配列。この図は、系列１４の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 系列１５の配列。この図は、系列１５の単一ドメイン抗体の全長ＶＨ配列を示す。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が標識されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、太字で強調されている。 ＦＭＡＴミラーボールアッセイにおける精製抗ＰＳＭＡ ＶＨの結合。１６ａ ●１．１、黒四角３．１、▲２．１０、▼２．１、１６ｂ ●２．１、▲２．１３、▼２．１７ ◇２．１５、○２．１２ △２．２２ １６ｃ 上から下へ記号で示されるように供試した単一ドメイン抗体 ●１．８、黒四角１．１０、▲１．１１、▼１．１２、１．１３、○１．１４、１．１６、△１．１７、１．１８ ｄ）上から下へ記号で示されるように供試した二重パラトープ性結合分子：Ｌ＝（Ｇ４Ｓ）６ １．１−Ｌ−２．１；１．１６−Ｌ−２．１；１．１１−Ｌ−２．１、１．１８−Ｌ−２．１、１．１７−２．１、１．１−２．１７、１．１６−Ｌ−２．１７、１．１１−Ｌ−２．１７、１．１８−Ｌ−２．１７、１．１７−Ｌ−２．１７；ｅ）１．１−Ｌ−２．１５、１．１６−Ｌ−２．１５、１．１１−Ｌ−２．１５、１．１８−Ｌ−２．１５、１．１７−Ｌ−２．１５、１．１−Ｌ−２．２２、１．１６−Ｌ−２．２２、１．１１−Ｌ−２．２２、１．１１−Ｌ−２．２２、１．１８−Ｌ−２．２２、１．１７−Ｌ−Ｌ２．２２。 精製抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体のｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ内部移行。使用した単一ドメイン抗体（上から下へ凡例の記号）：２．２０、１２．１、３．１、３．２、４．１、５．１、９．１、１４．１、１０．１、７．１。 抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体を用いたｃｙｎｏＰＳＭＡおよびヒトＰＳＭＡ ＣＨＯの死滅化。Ａ．２．１、Ｂ．１．１。 抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体を用いたＬＮＣａｐの死滅化。使用した単一ドメイン抗体（上から下へ凡例の記号）：１．１、２．１、７．１、３．１、１２．１、４．１。 ＶＨ２．１−ＨＩＳを用いた局在研究。ＶＨ染色は主として細胞膜に局在するが（太い矢印で示す）、４℃および３７℃の両方で、ＬＡＭＰ−１（ｂ）およびＥＥＡ−１（ａ）の両方とともに局在する単一中央クラスターの形態でいくらかの内部移行も見られた（細い矢印）。 二価ＶＨ構築物２．１−６ＧＳ−２．１−ＨＩＳを用いた局在研究。４℃で、ＶＨ染色は、主として細胞膜に局在する（太い矢印）。３７℃で２時間後、膜染色はより断続的に見られ（太い矢印）、ＬＡＭＰ−１（ａ）およびＥＥＡ−１（ｂ）の両方とともに局在する細胞内部の小ＶＨクラスターの存在により内部移行が示される（細い矢印）。 ＶＨ １．１−ＨＩＳを用いた局在研究。ＶＨ染色は、細胞膜（太い矢印で示す）主として細胞膜に局在するが（太い矢印で示す）、４℃および３７℃の両方で、ＬＡＭＰ−１（ｂ）およびＥＥＡ−１（ａ）の両方とともに局在する単一中央クラスターの形態でいくらかの内部移行が存在する（細い矢印）。 二重パラトープ性ＶＨ構築物２．１−６ＧＳ−１．１−ＨＩＳを用いた局在研究。４℃で、ＶＨ染色は、主として細胞膜に局在する（太い矢印）。３７℃で２時間後、膜染色はほとんど消失し（太い矢印）、ＬＡＭＰ−１（ｂ）およびＥＥＡ−１（ａ）の両方とともに局在する細胞内部の断続的染色により示されるように、ＶＨは内部移行を受ける（細い矢印）。 水準抗ＰＳＭＡ ＩｇＧを用いた局在研究。４℃で、ＶＨ染色は、主として細胞膜に局在する（太い矢印）。３７℃で２時間後、膜染色は薄くなり（太い矢印）、ＬＡＭＰ−１（ｂ）およびＥＥＡ−１（ａ）の両方とともに局在する細胞内部のクラスターの存在により示されるように、ほとんどのＶＨが内部移行を受ける（細い矢印）。 ヒトＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞を用いる、１．１−６ＧＳ−２．１−ＨＩＳ（上のパネル）および２．１−６ＧＳ−１．１−ＨＩＳ（下のパネル）を用いた局在研究。 図２６は、４８時間インキュベーション時点でのヒトＰＳＭＡタンパク質を安定に発現するヒト細胞および合致する親細胞（ＰＳＭＡ陰性）に対する単量体ＭＭＡＥコンジュゲートＶＨ（ＡおよびＢ）、二価ＶＨ（ＣおよびＤ）ならびに二重パラトープ性ＶＨ（ＥおよびＦ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 図２７は、７２時間インキュベーション時点でのヒトＰＳＭＡタンパク質を安定に発現するヒト細胞に対するＭＭＡＥコンジュゲートＶＨのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す。 図２８は、Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）薬物コンジュゲート（ＨＤＣ）を作製するために使用されるＨｉＰＥＧ（商標）ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ試薬（ＭＷ＝２８０５ｇ／ｍｏｌ）を示す。 図２９は、Ｐｒｏ＿００６対照抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製するために使用されるマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−モノメチルオーリスタチンＥ（ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）コンジュゲーション試薬（ＭＷ＝１３１７ｇ／ｍｏｌ）を示す。 ＡおよびＢは、（Ａ）ＰＳＭＡを発現するＤＵ１４５細胞および（Ｂ）ＰＳＭＡを発現するように改変されていないＤＵ１４５親細胞の場合の、ＰＳＭＡ−ＤＵ１４５細胞傷害性アッセイ（７２時間）でのＩＣ５０値を示す：対照ＡＤＣ ｍＡｂ−ＭＭＡＥ（黒四角）、２．１ ６Ｇ４Ｓ−１．１−ＭＭＡＥ二重パラトープ性（▲）、２．１ ６ＧＳ−１．１−ＭＭＡＥ−ＨＬＥ 半減期延長二重パラトープ性（▼）、ＨＥＬ４−ＭＭＡＥ一価（●）およびＨＥＬ４−ＨＬＥ−ＭＭＡＥ一価半減期延長（ｌ）。
詳細な説明
以下、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の種々の態様をより詳細に定義する。このように定義される各態様は、そうでないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の態様とも組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されたいずれの特徴も、好ましいまたは有利であると示された他のいずれの１または複数の特徴とも組み合わせることができる。
一般に、本明細書に記載の細胞・組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質・核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術に関して使用される術語は、当技術分野で周知かつ慣用されるものである。本開示の方法および技術は、一般に、特に断りのない限り、本明細書で引用および考察される種々の一般的およびより特殊な参照文献に記載されているような従来法に従って一般に実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)参照。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従い、当技術分野で一般に実施されているようにまたは本明細書に記載されているように行う。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、および医・製薬化学に関して使用される術語、ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野で周知かつ慣用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、処方、および送達、ならびに患者の治療には標準的な技術が使用される。
本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合する、単離され、形式化された結合分子、特に、ヒトＰＳＭＡと結合する少なくとも２つの単一ＶＨドメイン抗体を含んでなるもの、そのような結合分子を含んでなる医薬組成物、ならびにそのような結合タンパク質およびフラグメントを作製するための単離された核酸構築物、組換え発現ベクターおよび単離された宿主細胞を提供する。また、ヒトＰＳＭＡを検出するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでヒトＰＳＭＡを阻害するために本明細書に開示される結合タンパク質を使用する方法、ならびに疾患を治療する方法も提供される。本発明の一態様は、単離されたヒト抗ヒトＰＳＭＡ結合分子、具体的には、ヒトＰＳＭＡと高い親和性、かつ緩慢な解離速度で結合する２以上の単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる、またはからなるものを提供する。
本発明のＰＳＭＡ結合分子は、野生型ヒトＰＳＭＡ（受託番号Ｑ０４６０９）と結合する。単量体の配列を以下に示す（配列番号５２９）。
１つの実施形態では、本発明のＰＳＭＡ結合分子は、野生型ヒトＰＳＭＡおよび／またはｃｙｎｏ ＰＳＭＡと結合する。用語「ＰＳＭＡ結合分子」、「ＰＳＭＡ結合タンパク質」、「抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体」または「抗ＰＳＭＡ抗体」は、本明細書で使用する場合、総てヒトＰＳＭＡ抗原と結合し得る分子を意味する。用語「ＰＳＭＡ結合分子」は、ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む。この結合反応は、例えば、結合アッセイ、競合アッセイまたはその受容体と結合するＰＳＭＡの阻害を判定するためのバイオアッセイ、またはいずれの種類の結合アッセイも含む標準的方法（定性的アッセイ）によって、抗体が無関連の特異性である陰性対照試験を参照して示すことができる。好適なアッセイを例に示す。
対象抗原、例えば、ＰＳＭＡ「と結合する」または「と結合し得る」本明細書に記載の単一ドメイン抗体および多価または多重特異性結合剤を含む本発明の抗体または結合分子は、ＰＳＭＡ抗原と、その抗原を発現する細胞または組織を標的化するという療法において有用である十分な親和性で結合するものである。
本発明の結合分子は、ヒトＰＳＭＡと特異的に結合する。言い換えれば、ＰＳＭＡ抗原との結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる。好ましくは、本発明の結合分子において使用される単一ドメイン抗体はヒトＰＳＭＡと結合し、また、ｃｙｎｏ ＰＳＭＡとも結合する。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的結合」または「と特異的に結合する」または「に特異的」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、標的に対するＫＤが少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれを超える分子によって示され得る。１つの実施形態では、用語「特異的結合」は、分子が、他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピトープとも実質的に結合せずに特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープと結合する場合の結合を意味する。
１つの態様では、本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第１の単一ＶＨドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第２の部分とを含んでなる結合分子に関する。単一ＶＨドメイン抗体および第２の部分は、好ましくは、例えば、ペプチドリンカーを介して、共有結合的に連結される。第２の部分は、抗体、重鎖単独抗体（ＨＣＡｂ）、そのフラグメントまたは抗体模倣剤であり得る。
１つの態様では、本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第１の単一ＶＨドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第２の単一ＶＨドメイン抗体とを含んでなる結合分子に関する。単一ＶＨドメイン抗体は、好ましくは、例えば、ペプチドリンカーを介して、共有結合的に連結される。
１つの態様では、本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合し得る、本明細書に記載されるようなＶＨドメインを含んでなるＨＣＡｂと、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第２のＨＣＡｂとを含んでなる結合分子に関する。これらのＨＣＡｂは、好ましくは、例えば、ペプチドリンカーを介して、共有結合的に連結される。
１つの実施形態では、重鎖単独抗体はヒト可変領域を含んでなる。１つの実施形態では、ＨＣＡｂはＣＨ１ドメインを欠く。１つの実施形態では、ＨＣＡｂは、マウスＣ領域を含んでなる。１つの実施形態では、結合分子は、少なくとも１つの単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる。
１つの態様では、本発明は、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかに示されるようなＣＤＲ３配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれを超える配列同一性を有する配列を含んでなる重鎖可変免疫グロブリンドメイン（ＶＨ）を含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る多価／多重パラトープ性の単離された結合分子に関する。１つの実施形態では、結合分子は、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかのクローンのいずれかに関して示されるようなＣＤＲ１、２および３配列のセットから選択される１セットのＣＤＲ１、２および３配列を含んでなる。１つの実施形態では、結合分子は、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかのクローンのいずれかに関して示されるようなＣＤＲ１、２および３配列のセットから選択される１セットのＣＤＲ１、２および３配列を有するＶＨドメインを含んでなる。本発明の結合分子は、２以上の単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる。
用語「単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」は総て、当技術分野で周知であり、標的抗原と結合する抗体の単一可変フラグメントを表す。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。以下に説明するように、本発明の種々の態様の好ましい実施形態は、軽鎖の不在下でＰＳＭＡ抗原と結合する単一重鎖可変ドメイン抗体／免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインを意味する。ヒトＰＳＭＡと結合する単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメインのフラグメントも本発明の範囲内にある。単一重鎖可変ドメイン抗体（ＶＨ）は、免疫グロブリン軽鎖を含まない。ヒト重鎖単一可変（ＶＨ）ドメイン抗体が特に好ましい。ヒト重鎖単一可変ＶＨは一般にＶＨドメインと略される。単一ＶＨドメイン抗体はまた、本明細書ではＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）とも呼称される。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）は、Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄの登録商標である。
よって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明の単離された結合剤／分子は、少なくとも２つの単一ドメイン抗体を含んでなり、前記ドメインは好ましくはヒト重鎖可変ドメインである。よって、１つの態様では、本発明の結合剤は、少なくとも２つのヒト免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインを含んでなり、それらはＶＬドメインを欠いている。
各単一ＶＨドメイン抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲを含んでなる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。よって、本発明の１つの実施形態では、ドメインは、下式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである。
用語「単離された」単一ドメイン抗体とは、異なる抗原特異性を有する他の単一ドメイン抗体、抗体または抗体フラグメントを実質的に含まない単一ドメイン抗体を意味する。さらに、単離された単一ドメイン抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
１つの実施形態では、前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかに示されるようなＣＤＲ３配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれを超える配列同一性を有する配列を含んでなる。１つの実施形態では、前記第１または第２の単一ＶＨドメインは、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかのクローンのいずれかに関して示されるようなＣＤＲ１、２および３配列のセットから選択される１セットのＣＤＲ１、２および３配列を含んでなる。１つの実施形態では、第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、表１〜１５を参照し、図１〜１５のいずれかのクローンのいずれかに関して示されるようなＣＤＲ１、２および３配列のセットから選択される１セットのＣＤＲ１、２および３配列を含んでなる。１つの実施形態では、結合分子は重鎖単独抗体（ＨＣＡｂ）である。
１つの実施形態では、第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、図１〜１５および表１〜１５のいずれかに示されるようなＣＤＲ３配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれを超える配列同一性を有する配列を含んでなる。
１つの実施形態では、第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、図１〜１５および１〜１５のいずれかのｓｄＡｂのいずれかに関して示されるようなＣＤＲ１、２および３配列のセットから選択される１セットのＣＤＲ１、２および３配列を含んでなる。別の実施形態では、第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、下記の単一ＶＨドメイン抗体１．１〜１．２０、２．１〜２．２５、３．１〜３．２４、４．１〜４．４、５．１〜５．２、６．１〜６．７、７．１〜７．８、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１または１５．１のいずれかから選択される。
１つの実施形態では、前記配列相同性または同一性は、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
「相同性」は一般に、候補配列において、配列をアラインした後に、いくつかの実施形態では、最大相同性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、それが比較されるポリペプチドの残基と同一である内のアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。よって、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、それらの２配列間の同一性パーセントに等しい。Ｎ末端またはＣ末端延長部、タグまたは挿入はいずれも同一性または相同性を低下させると解釈されるべきでない。アラインメントの方法およびコンピュータープログラムは周知である。
用語「抗体」は広義には、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重(heavy)（Ｈ）鎖および２本の軽(light)（Ｌ）鎖、またはその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体、もしくは誘導体から構成され、Ｉｇ分子の必須のエピトープ結合特性を保持するいずれの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはその抗原結合部分も意味する。このような突然変異体、変異体、または誘導体抗体形式は、当技術分野で公知である。全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ下記の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡＩおよびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
抗体フラグメントは、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓＦｖなどである。全長抗体の機能的フラグメントは、全長抗体の標的特異性を保持する。従って、組換え機能的抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ（フラグメント、抗体）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖フラグメント）および単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ｍＡｂに基づく治療薬に代わるものとしての治療薬を開発するために使用されてきた。ｓｃＦｖフラグメント（約２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬからなる。当然のことながら、ＶＨおよびＶＬドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合的に会合され、解離する傾向がある。しかしながら、安定なフラグメントは、これらのドメインと親水性のフレキシブルリンカーを連結して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作出することによって工作することができる。最小の抗原結合フラグメントは、単一可変フラグメント、すなわち、ＶＨまたはＶＬドメインである。標的結合のためには、軽鎖／重鎖相手それぞれとの結合が必要なわけではない。このようなフラグメントが単一ドメイン抗体において使用される。よって、単一ドメイン抗体（−１２〜１５ｋＤａ）はＶＨまたはＶＬドメインのいずれかを有する。
よって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、結合分子は軽鎖を含まない。いくつかの実施形態では、結合分子は重鎖ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含まない。いくつかの実施形態では、結合分子は、ヒンジ領域および重鎖ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含まない。いくつかの実施形態では、結合分子は、重鎖ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含まない。いくつかの実施形態では、結合分子は、重鎖ドメインＣＨ１、ヒンジ領域重鎖ドメインＣＨ２および重鎖ドメインＣＨ３を含まない。いくつかの実施形態では、結合分子は、軽鎖、重鎖ドメインＣＨ１、ヒンジ領域重鎖ドメインＣＨ２および重鎖ドメインＣＨ３を含まない。
各ＶＨドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端へ下記の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲを含んでなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。結合特性を改善するためにＶＨフレームワークに修飾を行ってもよい。例えば、ＶＨドメインは、ＣまたはＮ末端延長部を含んでなり得る。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、１〜１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の付加的アミノ酸のＣ末端延長部を含んでなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、ＣＨ１ドメインの１〜１２個のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の付加的アミノ酸のＣ末端延長部を含んでなる。１つの実施形態では、前記延長部は、少なくとも１個のアラニン基、例えば、単一のアラニン残基、２個のアラニン残基または３個のアラニン残基を含んでなる。このような延長されたＶＨドメインは本発明の範囲内にある。また、付加的ＣまたはＮ末端残基、例えば、リンカー残基および／またはＨｉｓタグ、例えば、ヘキサＨｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号５３０）またはｍｙｃタグを含んでなるＶＨドメインを含んでなる結合分子も本発明の範囲内にある。ベクターの付加的残基が、例えば、タグに加えて存在してもよい。使用される結合分子は、付加的残基ＬＥＧＧＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号５３１）を有してもよい。
本発明の種々の態様および実施形態によれば、単一ドメイン抗体の可変ドメインは、好ましくはヒト可変ドメイン（ＶＨ）である。本明細書で使用する場合、ヒトＶＨドメインとしては、完全なヒトまたは実質的に完全なヒトＶＨドメインを含む。本明細書で使用する場合、用語ヒトＶＨドメインとしてはまた、例えば、ＷＯ２０１６／０６２９９０およびその実施例に記載されているように、特に対象抗原での免疫に応答して完全ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスにより生成された重鎖単独抗体から単離されたＶＨドメインも含む。１つの実施形態では、ヒトＶＨドメインとしてはまた、ヒトＶＨドメインアミノ酸から誘導される、もしくは、ヒトＶＨドメインアミノ酸に基づくＶＨドメイン、またはそのようなＶＨドメインをコードする核酸配列も含み得る。よって、この用語には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導されるまたはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされる可変重鎖領域を含む。ヒトＶＨドメインから誘導されるまたは基づく実質的ヒトＶＨドメインまたはＶＨドメインには、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、ランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により導入された、またはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。よって、用語「ヒトＶＨドメイン」にはまた、１以上のアミノ酸残基が修飾された実質的ヒトＶＨドメインも含む。例えば、実質的ヒトＶＨドメイン ＶＨドメインは、完全ヒト配列と比較して最大１０、例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸修飾を含み得る。しかしながら、用語「ヒトＶＨドメイン」または「実質的ヒトＶＨドメイン」は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系にから誘導されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むこと意図しない。好ましくは、用語「ヒトＶＨドメイン」は、本明細書で使用する場合、ラクダ化ＶＨドメイン、すなわち、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで従来の突然変異誘発法によってＶＨドメイン配列内の所定の位置を選択し、その位置に、１以上の所定の残基をラクダ科動物ＶＨＨドメインに見られ得る特異的残基に変えるように１以上の点突然変異を導入するために特異的に修飾されたヒトＶＨドメインを含むことも意図しない。
本明細書で使用する場合、用語ＶＨまたは「可変ドメイン」は、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 第5版, U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)により定義された免疫グロブリン可変ドメインを意味する。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基のナンバリングおよび位置決定は、周知のＫａｂａｔナンバリング規則に従う。
より詳しくは、本発明は、単一ＶＨドメイン抗体または結合分子単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる結合分子を提供し、前記単一ＶＨドメイン抗体は、ヒトＰＳＭＡと、本発明に、特に、実施例にさらに記載されるような親和性、Ｋｏｎ速度、Ｋｏｆｆ速度、ＫＤおよび／またはＫＡ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値で結合する。これらの値を測定するのに好適なアッセイもまた実施例で示される。
本発明の結合分子は、本明細書に定義されるような、アミノ酸配列および好ましい配列および／またはその一部、例えば、ＣＤＲを含んでなる、またはからなる。
用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在し、それらは可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼称される。用語「ＣＤＲセット」は、抗原と結合し得る単一可変領域内に存在する一群の３つのＣＤＲを意味する。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムによって違った定義がされている。本明細書ではＫａｂａｔにより記載されているシステムを用いる。用語「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔラベリング」は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域、またはその抗原結合部分内の他のアミノ酸残基よりも可変性の大きい（すなわち、超可変）アミノ酸残基をナンバリングするシステムを意味する(Kabat et al, (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391およびKabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
結合分子は、多価、例えば、二価、または多重パラトープ性、例えば、二重パラトープ性であり得る。よって、結合分子は、下式を有し得る：ＶＨ（Ａ）−ＶＨ（Ｂ）。各ＶＨは、ＣＤＲおよびＦＲ領域を含んでなる。よって、結合分子は、下式を有し得る：ＦＲ１（Ａ）−ＣＤＲ１（Ａ）−ＦＲ２（Ａ）−ＣＤＲ２（Ａ）−ＦＲ３（Ａ）−ＣＤＲ３（Ａ）−ＦＲ４（Ａ）−ＦＲ１（Ｂ）−ＣＤＲ１（Ｂ）−ＦＲ２（Ｂ）−ＣＤＲ２（ＢＡ）−ＦＲ３（Ｂ）−ＣＤＲ３（Ｂ）−ＦＲ４（Ｂ）。免疫グロブリン単一可変ドメインＡ（第１の単一ＶＨドメイン抗体）およびＢ（第２の単一ＶＨドメイン抗体）の順序は特に限定されず、従って、本発明のポリペプチド内で、免疫グロブリン単一可変ドメインＡがＮ末端側に位置してもよく、免疫グロブリン単一可変ドメインＢがＣ末端側に位置してもよく、またはっその逆でもよい。ＶＨドメインは、リンカーを介して連結されてよい。
１つの実施形態では、結合分子は二重パラトープ性である。二重パラトープ性結合分子では、２つの結合部分は標的分子上の異なるエピトープと結合する。好ましい二重パラトープ性結合分子は、標的タンパク質ＰＳＭＡと、ただし異なる部位で結合する、２つの異なる単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる。これらの部位は重複してもよい。遮断が完全か部分的かはエピトープ結合試験で評価することができる。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、ＶＨ単一ドメイン抗体を含む、免疫グロブリン、抗体または抗体フラグメントが特異的に結合する抗原（例えば、ＰＳＭＡ）の表面の部位を意味する。一般に、抗原は数個または多数の異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。特異的にという用語は、直線状エピトープおよび構造的エピトープを含む。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸（通常、直線状エピトープ）またはタンパク質の三次元折りたたみにより並置された不連続アミノ酸（通常、構造的エピトープ）から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、常にではないが一般に、変性溶媒に曝されても保持されるが、三次元折りたたみにより形成されるエピトープは一般に、変性溶媒で処理すると消失する。エピトープは一般に、ユニークな空間的立体配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。ある抗体または抗体フラグメントによってどのエピトープが結合されるかを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は当技術分野で周知であり、例えば、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが含まれ、重複するまたは連続するペプチドが、ある抗体または抗体フラグメントとの反応性に関して試験される。２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合に、抗体は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」と結合する。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するために最も広く使用されている迅速な方法が競合アッセイであり、標的抗原か標的抗体のいずれかを用いて種々の形式で構成することができる。
１つの実施形態では、結合分子は二価である。二価結合分子は、同じ標的タンパク質（ＰＳＭＡ）と同じ部位で結合する２つのＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨを含んでなる。１つの実施形態では、このような分子は、同じＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨを含んでなり得る。別の実施形態では、このような分子は、同じＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨ系列の一部である２つのＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨを含んでなり得る。別の実施形態では、このような分子は、同じＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨの一部ではないが同じ側に結合する２つのＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨを含んでなり得る。本発明の二重パラトープ性および二価結合分子は、当技術分野で公知の方法を用いて構築することができる。
実験の部でより詳細に記載されるように、本発明の多重パラトープ性または多価結合分子において使用可能な単一ＶＨドメイン抗体が単離され、ＣＤＲ３配列の配列相同性に基づいて１５系列に分類された。最適化の過程で、親分子と比較してＰＳＭＡに対する親和性を改善するため、かつ／または効力を改善するために親ＣＤＲ配列から誘導されるＣＤＲ配列を有する変異体単一ＶＨドメイン抗体のパネルも作製した。各単一ＶＨドメイン抗体は、図１〜１５に示されるような１セットのＣＤＲ配列（ＣＤＲ１、２および３）を有する。エピトープ結合を評価するために実施例１１に示すようにエピトープ結合試験を行った。例えば、系列１の単一ＶＨドメイン抗体は、系列２とは異なるエピトープと結合することが示された。よって、系列１単一ＶＨドメイン抗体と系列２単一ＶＨドメイン抗体の組合せは、本発明の二重パラトープ性結合分子の１つの実施形態である。系列１単一ＶＨドメイン抗体は、ＣまたはＮ末端に位置し得る。好ましい実施形態では、それはＮ末端に位置する。
いくつかの実施形態では、第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体は、親分子の、特に、１以上のアミノ酸置換、欠失、挿入またはその他の修飾を有し、かつ、単一ドメイン抗体の生物学的機能を保持するｓｄＡｂ １．１、２．１、３．１、４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１または１５．１から選択される親ＶＨ単一ドメイン抗体の、変異体ＶＨ単一ドメイン抗体である。よって、変異体ＶＨ単一ドメイン抗体は、配列操作が可能である。修飾は、天然配列ＶＨ単一ドメイン抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列に変化をもたらす、単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１以上のコドンの１以上の置換、欠失または挿入を含み得る。アミノ酸置換は、ロイシンのセリンでの置換など、あるアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、場合により、約１〜５個のアミノ酸の範囲内であり得る。許容される変形形態は、その配列内でアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に作出し、生じた変異体を全長または成熟天然配列により示される活性に関して試験することによって決定することができる。本明細書に記載のＶＨ単一ドメイン抗体の変異体は、非変異体分子と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
１つの実施形態では、修飾は、保存的配列修飾である。本明細書で使用する場合、用語「保存的配列修飾」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響または変化を及ぼさないアミノ酸修飾を意味するものとする。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技術によって本発明の結合分子に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の系列は、当技術分野で定義されている。これらの系列としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、単一ドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖系列からの他のアミノ酸残基で置換可能であり、変更された抗体を、本明細書に記載の機能アッセイを用いて、保持されている機能（すなわち、上記（ｃ）〜（Ｉ）に示す機能）に関して試験することができる。
いくつかの実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は、１以上の配列修飾を含んでなり、かつ、非修飾単一ドメイン抗体と比較して結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低減、または溶解度などの特性の１以上に改善を有する、表１〜１５に示されるものから選択される単一ドメイン抗体の変異体である。
当業者ならば、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ発現ライブラリーを含む本明細書に記載の抗原結合分子を同定、取得および最適化するために種々の方法が存在することが分かるであろう。これはさらに実施例に記載する。ディスプレー（例えば、リボソームおよび／またはファージディスプレー）および／または突然変異誘発（例えば、エラープローン突然変異誘発）などの当技術分野で公知の最適化技術が使用可能である。よって、本発明はまた、本明細書に記載の単一ドメイン抗体の配列最適化変異体を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ドメイン抗体の免疫原性を低減するために修飾を行うことができる。例えば、１つのアプローチは、１以上のフレームワーク残基を対応するヒト生殖細胞系配列に復帰させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体が誘導される生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、単一ドメイン抗体フレームワーク配列を、その単一ドメイン抗体が誘導される生殖細胞系配列と比較することによって同定することができる。フレームワーク領域配列のアミノ酸残基の１以上をそれらの生殖細胞系構成に戻すためには、体細胞突然変異を例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖細胞系配列に「復帰突然変異させる」ことができる。
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去してそれによって抗体の潜在的免疫原性を低減するために、フレームワーク領域内、または１以上のＣＤＲ領域内でさえも、１以上の残基を突然変異させることを含む。さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体が作製可能である（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために変更することができる。このような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を除去する１以上のアミノ酸置換が作出できる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。
１つの態様では、結合分子は、系列１または系列１様配列を含んでなる単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる。１つの実施形態では、系列１または系列１様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせることができる。別の実施形態では、系列１または系列１様配列を含んでなる第１のＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーション(confirmation)と結合する本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせることができる。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。１つの実施形態では、第１のＶＨドメインは配列番号４を含んでなり、第２のＶＨドメインは配列番号４を含んでなる。
１つの実施形態では、系列１または系列１様配列を含んでなる第１のＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子としてＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４または系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択され得る。１つの実施形態では、第１のＶＨドメインは配列番号４を含んでなり、第２のＶＨドメインは配列番号８４を含んでなる。
系列１単一ＶＨドメイン抗体は、親の配列（１．１；配列番号４）またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１．１から誘導される配列、例えば、図１に示されるような配列を含み得る。系列１のＣＤＲ配列および全長ＶＨ配列は、以下に示すように表１に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、ＶＨドメインは、配列番号３または配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５または７９から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるＣＤＲ３配列を含んでなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる。例えば、前記ＣＤＲは、図１に示されるものから選択されるＣＤＲであり得る。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１のような単一ＶＨドメイン抗体１．１〜１．２０またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、６９、７３または７７のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４または７８のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号３、７、１１、１５、１９、２３、２７、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５または７９のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＣＤＲは配列番号３３である。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、図１のクローン１．１〜１．２０に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する。よって、１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、ＣＤＲ１、２および３配列を含んでなり、ＣＤＲ１は配列番号１であり、ＣＤＲ２は配列番号２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号５であり、ＣＤＲ２は配列番号６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号９であり、ＣＤＲ２は配列番号１０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１３であり、ＣＤＲ２は配列番号１４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１７であり、ＣＤＲ２は配列番号１８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２１であり、ＣＤＲ２は配列番号２２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２５であり、ＣＤＲ２は配列番号２６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２９であり、ＣＤＲ２は配列番号３０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３３であり、ＣＤＲ２は配列番号３４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３７であり、ＣＤＲ２は配列番号３８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号４１であり、ＣＤＲ２は配列番号４２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号４３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号４５であり、ＣＤＲ２は配列番号４６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号４７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号４９であり、ＣＤＲ２は配列番号５０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号５１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号５３であり、ＣＤＲ２は配列番号５４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号５５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号５７であり、ＣＤＲ２は配列番号５８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号５９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号６１であり、ＣＤＲ２は配列番号６２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号６３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号６５であり、ＣＤＲ２は配列番号６６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号６７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号６９であり、ＣＤＲ２は配列番号７０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号７１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号７３であり、ＣＤＲ２は配列番号７４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号７５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号７７であり、ＣＤＲ２は配列番号７８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号７９である。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号４またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなるＶＨドメインを有する。このような配列のＣＤＲ配列は図１に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６または８０を含んでなる、またはからなる。別の実施形態では、ＶＨドメインは、例えば配列番号４など、上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４または配列番号４と比較してフレームワーク領域内に１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸置換を含んでなる配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３２を含んでなる、またはからなる。
よって、１つの実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子に関し、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＶＨドメインは、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６もしくは８０またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号４に示されるようなＶＨドメイン、またはその変異体を含んでなり、前記変異体において、残基３３はＴであり、３６はＬであり、残基５７はＤであり、残基５９はＮ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈであり、残基６３はＤ、Ｙであり、残基６５はＶであり、残基６６はＡであり、かつ／または残基６７はＦ、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ｙである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４に示される通り、またはその変異体であり、前記変異体は、配列番号４と比較して下記の変更を含む
−Ｓ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．８に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｈ、Ｄ６２→Ａ、Ｓ６３→Ｔおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．２０に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ａ、Ｓ６３→Ｆおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１０に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｄ、Ｓ６３→Ｆおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１１に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ａ、Ｓ６３→Ａおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１２に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｈ、Ｄ６２→Ａ、Ｓ６３→Ｄおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１３に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ａ、Ｓ６３→Ｖおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１４に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｈ、Ｄ６２→Ａ、Ｓ６３→Ｆおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１５に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｈ、Ｓ６３→Ｔおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１６に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｈ、Ｓ６３→Ｔおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１７に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ｄ、Ｄ６２→Ａ、Ｓ６３→Ｓおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１８に関して示される通り）
−Ｍ３４→Ｌ、Ｄ５５→Ｎ、Ｇ５６→Ａ、Ｄ６２→Ａ、Ｓ６３→Ｙおよび場合によりＳ７７→ＮおよびＭ７８→Ｔ（１．１９に関して示される通り）。
１つの実施形態では、付加的変更が含まれてもよい。別の実施形態では、上記に挙げた変異体は付加的変更を含まない。
系列１の単一ＶＨドメイン抗体は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。用語「ＫＤ」は、本出願で使用する場合、「平衡解離定数」を意味し、平衡時の滴定測定で、または解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることによって得られる値を意味する。「ＫＡ」は、本出願で使用する場合、親和性定数を意味する。結合速度定数、解離速度定数および平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定するための方法は当技術分野で周知である。蛍光に基づく技術を使用すれば、高感度が得られ、平衡状態で生理学的バッファー中のサンプルを調べることができる。他の実験アプローチおよびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの機器および実施例に記載のアッセイを本発明の結合分子を試験するために使用することができる。
１つの態様では、本発明の結合分子は、系列２または系列２様配列を含んでなる１以上のヒトＶＨドメインを含んでなる。よって、１つの実施形態では、結合分子は、系列２の、ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡと結合し得る少なくとも２つの単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる、またはからなる。別の実施形態では、系列２または系列２様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列２または系列２様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２または１３または系列１、５、６、１２または１３様配列から選択され得る。
系列２単一ＶＨドメイン抗体は、親（２．１；配列番号８４）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図２に示されるように、最適化の過程で親２．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み得る。系列２のクローンのＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表２に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、ＶＨドメインは、配列番号８３または配列番号８３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５または１７９から選択されるＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列２系列２様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインは、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなるヒトＶＨドメインであり、前記ＣＤＲ１は、配列番号８１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号８２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号８１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号８２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図２のようなｓｄＡｂ ２．１〜２．２５またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３または１７７のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４または１７８のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号７８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５または１７９のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、図２で２．１〜２．２５に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号８１であり、ＣＤＲ２は配列番号８２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号８３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号８５であり、ＣＤＲ２は配列番号８６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号８７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号８９であり、ＣＤＲ２は配列番号９０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号９１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号９３であり、ＣＤＲ２は配列番号９４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号９５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号９７であり、ＣＤＲ２は配列番号９８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号９９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１０１であり、ＣＤＲ２は配列番号１０２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１０３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１０４であり、ＣＤＲ２は配列番号１０５であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１０６である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１０８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０９であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１１０である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１１２であり、ＣＤＲ２は配列番号１１３であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１１５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１１７であり、ＣＤＲ２は配列番号１１８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１１９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１２１であり、ＣＤＲ２は配列番号１２２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１２３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１２５であり、ＣＤＲ２は配列番号１２７であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１２７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１２９であり、ＣＤＲ２は配列番号１３０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１３１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１３３であり、ＣＤＲ２は配列番号１３４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１３５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１３７であり、ＣＤＲ２は配列番号１３８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１３９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１４０であり、ＣＤＲ２は配列番号１４１であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１４２である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１４４であり、ＣＤＲ２は配列番号１４５であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１４６である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１４８であり、ＣＤＲ２は配列番号１４９であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１５０である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１５２であり、ＣＤＲ２は配列番号１５３であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１５４である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１５７であり、ＣＤＲ２は配列番号１５８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１５９である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１６１であり、ＣＤＲ２は配列番号１６２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１６３である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１６５であり、ＣＤＲ２は配列番号１６６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１６７である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１６９であり、ＣＤＲ２は配列番号１７０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１７１である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１７３であり、ＣＤＲ２は配列番号１７４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１７５である。別の実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１７７であり、ＣＤＲ２は配列番号１７８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１７９である。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号８４またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図２に示される。例えば、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６または１８０を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは、例えば配列番号８４など、上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号８４またはその変異体を含んでなり、前記変異体は、配列番号７６と比較して下記のアミノ酸置換を有する：残基３４はＬ、Ｖ、Ｍ、Ｑ、Ｔ、Ｆであり、残基５０はＨ、Ｖ、Ｌ、Ｉであり、残基５５はＥ、Ｋ、Ａ、Ｌであり、残基５８はＲであり、残基６２はＥ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ａであり、残基６３はＥであり、残基６４はＮ、Ｋ、Ｐ、Ｌ、Ｇ、Ｓであり、残基７９はＫであり、残基はＬ、Ｑであり、残基８４はＫ、Ａであり、残基はＤである。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号４に示されるようなＶＨ、またはその変異体を含んでなり、またはからなり、前記変異体は、配列番号８４と比較して下記の変更を含む：
１）Ｍ３４→Ｌ３４、Ｇ５５→Ａ５５およびＳ６３→Ｎ６３（２．１３に関して示される通り）、
２）Ｇ５５→Ａ５５、Ｇ５５→Ａ５５およびＳ６３→Ｎ６３（２．１７に関して示される通り）、
３）Ｍ３４→Ｌ３４、Ｇ５５→Ｋ５５およびＳ６３→Ｋ６３（２．１５に関して示される通り）、
４）Ｇ５５→Ｋ５５、およびＳ６３→Ｋ６３（２．１５に関して示される通り）または
５）Ｍ３４→Ｌ３４、Ｇ５５→Ｅ５５およびＤ６２→Ｓ６２（２．１１に関して示される通り）。
１つの実施形態では、付加的変更が含まれてもよい。別の実施形態では、上記に挙げた変異体は付加的変更を含まない。１つの実施形態では、変異体は、下記の変更の組合せ：Ｇ５５→Ａ５５、Ｓ６３→Ｎ６３、Ｄ９９→Ｎ９９とＰ１００→Ｔ１００；Ｇ３４→Ｌ３４、Ｇ５５→Ｋ５５とＳ６３→Ｋ６３；Ｇ５５→Ｔ５５、Ｓ６３→Ｒ６３、Ｄ９９→Ｇ９９と、Ｐ１００→Ｒ１００とを含まない。
系列２または系列２様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子は、系列３または系列３様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる。
１つの実施形態では、系列３または系列３様配列を含んでなるＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列３または系列３様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列３または系列３様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２または１３または系列１、５、６、１２または１３様配列から選択され得る。
系列３または系列３様単一ＶＨドメイン抗体は、親配列および親（３．１；配列番号１８４）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図３に示されるように、最適化の過程で親３．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含む。系列３のクローンのＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表３に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号１８３または配列番号１８３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列３または系列３様結合分子に関する。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１８３または配列番号１８３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号１８３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる。１つの実施形態では、系列３または系列３様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号１８１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号１８２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号１８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号１８１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号１８２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号１８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図３のようなｓｄＡｂ ３．１〜３．２４またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号１８１、１８５、１８９、１９３、１９７、２０１、２０５、２０９、２１３、２１７、２２１、２２５、２２９、２３３、２３７、２４１、２４５、２４９、２５３、２５７、２６１、２６５、２６９または２７３のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２６、２３０、２３４、２３８、２４２、２４６、２５０、２５４、２５８、２６２、２６６、２７０または２７４のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号１８３、１８７、１９１、１９５、１９９、２０３、２０７、２１１、２１５、２１９、２２３、２２７、２３１、２３５、２３９、２４３または２４７、２５１、２５５、２５９、２６３、２６７、２７１または２７５のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、本発明は、図３で３．１〜３．２４に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する単一ＶＨドメイン抗体に関する。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１８１であり、ＣＤＲ２は配列番号１８２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１８３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１８５であり、ＣＤＲ２は配列番号１８６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１８７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１８９であり、ＣＤＲ２は配列番号１９０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１９１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１９３であり、ＣＤＲ２は配列番号１９４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１９５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号１９７であり、ＣＤＲ２は配列番号１９８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号１９９である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２０１であり、ＣＤＲ２は配列番号２０２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２０３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２０５であり、ＣＤＲ２は配列番号２０６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２０７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２０９であり、ＣＤＲ２は配列番号２１０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２１１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２１３であり、ＣＤＲ２は配列番号２１４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２１５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２１７であり、ＣＤＲ２は配列番号２１８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２１９である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２２１であり、ＣＤＲ２は配列番号２２２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２２３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２２５であり、ＣＤＲ２は配列番号２２６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２２７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２２９であり、ＣＤＲ２は配列番号２３０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２３１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２３３であり、ＣＤＲ２は配列番号２３４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２３５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２３７であり、ＣＤＲ２は配列番号２３８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２３９である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２４１であり、ＣＤＲ２は配列番号２４２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２４３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２４５であり、ＣＤＲ２は配列番号２４６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２４７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２４９であり、ＣＤＲ２は配列番号２５０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２５１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２５３であり、ＣＤＲ２は配列番号２５４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２５５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２５７であり、ＣＤＲ２は配列番号２５８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２５９である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２６１であり、ＣＤＲ２は配列番号２６２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２６３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２６５であり、ＣＤＲ２は配列番号２６６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２６７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２６９であり、ＣＤＲ２は配列番号２７０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２７１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２７３であり、ＣＤＲ２は配列番号２７４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２７５である。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、配列番号１８０またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図３に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８、２３２、２３６、２４０、２４４、２４８、２５２、２５６、２６０、２６４、２６８、２７２または２７６を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８、２３２、２３６、２４０、２４４、２４８、２５２、２５６、２６０、２６４、２６８、２７２もしくは２７６、またはそれと少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。このような配列のＣＤＲ配列を以下に挙げる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列３または系列３様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子は、系列４または系列４様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる。
１つの実施形態では、系列４またはａ系列４様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列４または系列４様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。１つの実施形態では、系列４または系列４様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２または１３または系列１、５、６、１２または１３様配列から選択され得る。
系列４単一ＶＨドメイン抗体は、親配列および親（４．１、配列番号２７９）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図４に示されるように、最適化の過程で親４．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含む。系列４のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表４に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号２７９または配列番号２７９と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列４または系列４様結合分子に関する。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２７９、２８２、２８７または２９１から選択されるＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号２７９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列４または系列４様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号２７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号２７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号２７９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号２７７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号２７８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号２７９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図４のようなクローン４．１〜４．４またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２７７、２８１、２８５または２８９のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり；ＣＤＲ２は、配列番号２７８、２８２、２８６または２９０のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり；かつ、ＣＤＲ３は、配列番号２７９、２８３、２８７または２９１のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、図４の４．１〜４．４に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２７７であり、ＣＤＲ２は配列番号２７８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２７９である。よって、ＣＤＲ１は配列番号２８１であり、ＣＤＲ２は配列番号２８２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２８３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２８５であり、ＣＤＲ２は配列番号２８６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２８７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２８９であり、ＣＤＲ２は配列番号２９０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２９１である。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２８０またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図４に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号２８０、２８４、２８８または２９０を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２８０、２８４、２８８もしくは２９０、またはそれと少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。このような配列のＣＤＲ配列を以下に挙げる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列４または系列４様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列５または系列５様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
１つの実施形態では、結合分子は、ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなるまたはからなる結合分子を含んでなり、またはからなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、系列５または系列５配列を含んでなる。１つの実施形態では、系列５または系列５様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列５または系列５様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列５または系列５様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４または系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択され得る。
系列５の単一ＶＨドメイン抗体は、親（５．１；配列番号２９２）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図５に示されるように、最適化の過程で親５．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含む。系列５のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表５に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号２９５または配列番号２９５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列５または系列５様結合分子に関する。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２９５および２９９から選択されるＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号２９５のアミノ酸配列またはその少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列５または系列５配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなるまたはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号２９３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号２９４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号２９５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号２９３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号２９４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号２９５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図５のようなクローン５．１および５．２またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号２９３または２９７のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号２９４または２９８４のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号２９５または２９９のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、本発明は、図５の５．１〜５．２に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有するＶＨドメインに関する。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２９３であり、ＣＤＲ２は配列番号２９４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２９５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号２９７であり、ＣＤＲ２は配列番号２９８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号２９９である。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２９６もしくは３００またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図５に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号２９６または３００を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列５または系列５結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列６または系列６様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
１つの態様では、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子は、系列６または系列６様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる。１つの実施形態では、系列６または系列６様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列６または系列６様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列６または系列６様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションに結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４または系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択され得る。
系列６単一ＶＨドメイン抗体は、親（６．１；配列番号３０４）またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図３に示されるように、最適化の過程で親６．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含む。系列６のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表６に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号３０３または配列番号３０３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列６または系列６様結合分子に関する。
１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３または３２７から選択されるＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３０３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列６または系列６様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３０１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３０２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３０３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３０１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３０２のアミノ酸配列またはその少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３０３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図６のようなクローン６．１〜６．７またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号３０１、３０５、３０９、３１３、３１７、３２１、３２５のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号３０２、３０６、３１０、３１４、３１８、３２２、３２６のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号３０３、３０７、３１１、３１５、３１９、３２３、３２７のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、図６の６．１〜６．７に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３０１であり、ＣＤＲ２は配列番号３０２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３０３である。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３０５であり、ＣＤＲ２は配列番号３０６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３０７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３０９であり、ＣＤＲ２は配列番号３１０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３１１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３１３であり、ＣＤＲ２は配列番号３１４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３１５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３１７であり、ＣＤＲ２は配列番号３１８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３１９である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３２１であり、ＣＤＲ２は配列番号３２２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３２３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３２５であり、ＣＤＲ２は配列番号３２６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３２７である。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３０４またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図６に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４または３２８を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４もしくは３２８またはそれと少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列６または系列６様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列７または系列７様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
１つの態様では、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子は、系列７または系列７様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる。１つの実施形態では、系列７または系列７様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列７または系列７様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列７または系列７様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
系列７または系列７様配列は、親配列および親（７．１）から誘導されるクローンの配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および例えば図７に示されるように、最適化の過程で親７．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含む。系列７のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表７に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号３３１または配列番号３３１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列７または系列７様結合分子に関する。
１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３３１、３３５、３３９、３４３、３４７、３５１、３５５または３５９から選択されるＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列７または系列７様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなるまたはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３２９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３３０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３３１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３２９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３３０のアミノ酸配列または少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図７のようなクローン７．１〜７．８またはそれらの組合せに関して示される通りである。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は、配列番号３２９、３３３、３３７、３４１、３４５、３４９、３５３または３５７のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、ＣＤＲ２は、配列番号３３０、３３４、３３８、３４２、３４６、３５０、３５４または３５８のアミノ酸配列を含んでなり、またはからなり、かつ、ＣＤＲ３は、配列番号３３１、３３５、３３９、３４３、３４７、３５１、３５５または３５９のアミノ酸配列を含んでなる、またはからなる。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、図７の７．１〜７．８に関して示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを有する。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３２９であり、ＣＤＲ２は配列番号３３０であり、かつＣＤＲ３は配列番号３３１である。よって、１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３３３であり、ＣＤＲ２は配列番号３３４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３３５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３３７であり、ＣＤＲ２は配列番号３３８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３３９である。１つの実施形態では、ｎ ＣＤＲ１は配列番号３４１であり、ＣＤＲ２は配列番号３４２であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３４３である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３４５であり、ＣＤＲ２は配列番号３４６であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３４７である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３４９であり、ＣＤＲ２は配列番号３５０であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３５１である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３５３であり、ＣＤＲ２は配列番号３５４であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３５５である。１つの実施形態では、ＣＤＲ１は配列番号３５７であり、ＣＤＲ２は配列番号３５８であり、かつ、ＣＤＲ３は配列番号３５９である。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３３２またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、相同性は、少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。このような配列のＣＤＲ配列は図２に示される。例えば、ＶＨドメインは、配列番号３３２、３３６、３４０、３４４、３４８、３５２、３５６または３６０を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３３２、３３６、３４０、３４４、３４８、３５２、３５６、３６０またはそれと少なくとも７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列７または系列７様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列８または系列８様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
系列８または系列８様配列は、親配列および親（８．１、配列番号３６）から誘導されるクローンの配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親８．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、８．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表８に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号３６３または配列番号３６３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列８または系列８様結合分子に関する。
１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３６３のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列８または系列８様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなるまたはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３６２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３６２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図８のようなｓｄＡｂ ８．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３６４またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列８または系列８様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列９または系列９様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
１つの態様では、本発明は、系列９または系列９様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、系列９または系列９様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列９または系列９様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列９または系列９様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
系列９または系列９配列は、親配列および親（９．１；配列番号３６８）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親９．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、９．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表９に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号３６７または配列番号３６７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列９または系列９様結合分子に関する。
１つの実施形態では、結合分子は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ヒトＶＨドメインは、配列番号３６７または配列番号３６７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３６７のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、ＣＤＲ３を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列９または系列９様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３６６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３６６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３６７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図９のようなクローン９．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３６８またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列９または系列９様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１０または系列１０様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。
１つの実施形態では、系列１０または系列１０様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列１０または系列１０様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列１０または系列１０様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。系列１０または系列１０配列は、親配列および親（１０．１）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１０．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、１０．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１０に従ってナンバリングされる。
１つの態様では、本発明は、配列番号３７１または配列番号３７１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる系列１０または系列１０様結合分に関する。
１つの実施形態では、系列１０または系列１０様結合分子は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ヒトＶＨドメインは、配列番号３７１または配列番号３７１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７１のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、前記ＶＨドメインおよび前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３６９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１０のようなクローン１０．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７２またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１０または系列１０様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１１または系列１１様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、系列１１または系列１１様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列１１または系列１１様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列１１または系列１１様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
系列１１または系列１１配列は、親配列および親（１１．１、配列番号３７６）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１１．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、１１．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１１に従ってナンバリングされる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７５または配列番号３７５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７５のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列１１または系列１１様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３７３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、かつ、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３７３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１１のようなｓｄＡｂ １１．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７６またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１１または系列１１様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１２または系列１２様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、列１２または系列１２様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列１２または系列１２様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２または１３または系列１、５、６、１２または１３様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列１２または系列１２様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４または系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択され得る。
系列１２または系列１２様配列は、親配列および親（１２．１、配列番号３８０）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１２．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、１２．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１２に従ってナンバリングされる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７９または配列番号３７９と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７９のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列１２または系列１２様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３７７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３７８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３７９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１２のようなクローン１２．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８０またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１２または系列１２様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１３または系列１３様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、系列１３または系列１３様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列１３または系列１３様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列１３または系列１３様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４または系列２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択され得る。
系列１３または系列様１３配列は、親配列および親（１３．１、配列番号３８４）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１３．１から誘導されるクローンＶＨ配列またはその一部を含み、１３．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１３に従ってナンバリングされる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８３または配列番号３８３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８３のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列１３または系列１３様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３８２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３８２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１３のようなクローン１３．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８４またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１３または系列１３様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１４または系列１４様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、系列１４または系列１４様配列を含んでなる２つのＶＨドメインを二価結合分子として組み合わせ得る。別の実施形態では、系列１４または系列１４様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二価結合分子として、ＰＳＭＡの同じエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列２、３、４、７、９、１０、１１または系列２、３、４、７、９、１０、１１様配列から選択され得る。
１つの実施形態では、系列１４または系列１４様配列を含んでなる１つのＶＨドメインを、二重パラトープ性結合分子として、ＰＳＭＡの異なるエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたはコンファメーションと結合する、本明細書に記載されるような第２のＶＨドメインと組み合わせ得る。第２のＶＨドメインは、系列１、５、６、１２もしくは１３または系列１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択され得る。
系列１４または系列１４配列は、親配列および親（１４．１）から誘導されるクローンの配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１４．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、１４．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１４に従ってナンバリングされる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８７または配列番号３８７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８７のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列１４または系列１４様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３８６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３８６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３８７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１４のようなクローン１４．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３８８またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１４または系列１４様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、本発明は、系列１５または系列１５様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの態様では、本発明は、系列１５または系列１５様配列を含んでなるヒトＶＨドメインを含んでなる、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合分子に関する。１つの実施形態では、結合分子は系列１５または系列１５配列の、ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡと結合し得る少なくとも２つ １つの単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる。系列１５単一ＶＨドメイン抗体は、親配列および親（１５．１）から誘導される配列またはその一部、例えば、ＣＤＲ３配列、および最適化の過程で親１５．１から誘導されるＶＨ配列またはその一部を含み、１５．１のＣＤＲ配列および全長配列は、以下に示すように表１５に従ってナンバリングされる。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９１または配列番号３９１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなる。１つの実施形態では、相同性は少なくとも９０％である。１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９１のＣＤＲ３を含んでなる。
１つの実施形態では、単一ＶＨドメイン抗体は、超可変領域ＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３９１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する。１つの実施形態では、系列１５または系列１５様配列は、ＰＳＭＡと結合し得る少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子を含んでなり、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、前記ＰＳＭＡ結合分子は、超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなる少なくとも１つの抗原結合部位を含んでなり、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ２は、配列番号３９０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、またはからなり、前記ＣＤＲ３は、配列番号３９１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
１つの実施形態では、前記ＣＤＲ１は、配列番号３８９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ２は、配列番号３９０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、前記ＣＤＲ３は、配列番号３９１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。１つの実施形態では、ＶＨドメインのＣＤＲ配列は、図１５のようなクローン１５．１に関して示される通りである。
１つの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３９２またはそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる。
別の実施形態では、ＶＨドメインは上記の配列の１つから選択されるが、１以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を含んでなる。１つの実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域の１以上にある。別の実施形態では、１以上のアミノ酸置換は、ＣＤＲの１以上にある。１つの実施形態では、アミノ酸置換は、フレームワーク配列およびＣＤＲ配列内にある。
系列１５または系列１５様結合分子は、本発明にさらに記載され、実施例に示されるようなＫＤ、Ｋｏｆｆ、ＫＡ、Ｋｄ、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を有する。
１つの態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１または系列１様、系列２または系列２様、系列３または系列３様、系列４または系列４様、系列５または系列５様、系列６または系列６様、系列７または系列７様、系列８または系列８様、系列９または系列９様、系列１０または系列１０様、系列１１または系列１１様、系列１２または系列１２様、系列１３または系列１３様、系列１４または系列１４様または系列１５または系列１５様ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ３配列を、本明細書に挙げられている別の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。
例えば、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１または系列１様ＣＤＲ３配列を、表２〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列２または系列２様ＣＤＲ３配列を、表１、３〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列３または系列３様ＣＤＲ３配列を、表１、２、４〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列４または系列４様ＣＤＲ３配列を、表１〜３、５〜１５に示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列５または系列５様ＣＤＲ３配列を、表１〜４、６〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列６または系列６様ＣＤＲ３配列を、表１〜５、７〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列７または系列７様ＣＤＲ３配列を、表１〜６、８〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列８または系列８様ＣＤＲ３配列を、表１〜７、９〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列９または系列９様ＣＤＲ３配列を、表１〜８、１０〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１０系列１０様ＣＤＲ３配列を、表１〜４、１１〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１１または系列１１様ＣＤＲ３配列を、表１〜１０、１２〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１２または系列１２様ＣＤＲ３配列を、表１〜１１、１３〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１３または系列１３様ＣＤＲ３配列を、表１〜１２、１４〜１５のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
別の態様では、単一ＶＨドメイン抗体は、系列１５または系列１５様ＣＤＲ３配列を、表１〜１４のいずれかに示されるような１または２つの他の系列に由来するＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と合わせて含んでなる。当業者により認識されるように種々の組合せが可能である。
本発明はまた、上記のおよび表１〜１５のいずれかに挙げられたＶＨドメインの１つから選択される第１のＶＨドメインを、上記のおよび表１〜１５のいずれかに挙げられたものから選択される第２のＶＨドメインと連結して含んでなる結合分子に関し、前記第１のＶＨドメインは、競合アッセイにおいてＰＳＭＡとの結合に関して第２のＶＨドメインと競合する。
本発明はまた、上記のおよび表１〜１５のいずれかに挙げられたＶＨドメインの１つから選択される第１のＶＨドメインを、上記および表１〜１５のいずれかに挙げられるものものから選択される第２のＶＨドメインと連結して含んでなる結合分子に関し、前記第１のＶＨドメインは、競合アッセイにおいてＰＳＭＡとの結合に関して第２のＶＨドメインと競合しない。
好ましい実施形態では、結合分子は二重パラトープ性または多重パラトープ性であり、表１に示されるような単一ドメイン抗体１．１〜１．２０から選択される第１の単一ＶＨドメイン抗体と、表２に示されるような２．１〜２．２５から選択される第２の単一ＶＨドメイン抗体とを含んでなる。例えば、第１の単一ＶＨドメイン抗体は、表１に示されるような単一ドメイン抗体１．１、１．８〜１．２０から選択され、第２の単一ＶＨドメイン抗体は、表２に示されるような２．１、２．２、２．１１〜２．１９、２．２２〜２．２５から選択される。別の実施形態では、結合分子は、表２に示されるような単一ドメイン抗体２．１〜２．２５から選択される第１の単一ドメイン抗体と、表１に示されるような１．１〜１．２０から選択される第２のＶＨ単一ドメイン抗体とを含んでなる。例えば、第１の単一ＶＨドメイン抗体は、表２に示されるような単一ドメイン抗体２．１、２．２、２．１１〜２．１９、２．２２〜２．２５から選択され、第２の単一ＶＨドメイン抗体は、表１に示されるような１．１、１．８〜１．２０から選択される。単一ドメイン抗体は（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー、好ましくは、（Ｇ４Ｓ）ｎで連結される。さらなる好ましい実施形態では、結合分子は、下記の成分：次のような単一ＶＨドメイン抗体−リンカー−単一ＶＨドメイン抗体：１．１−６ＧＳ−２．１、１．８−６ＧＳ−２．１、１．１−６ＧＳ−２．１７、１．１−６ＧＳ−２．１５、１．１−６ＧＳ−２．２２、１．１６−６ＧＳ−２．１、１．１６−６ＧＳ−２．１７、１．１６−６ＧＳ−２．１５、１．１６−６ＧＳ−２．２２、１．１１−６ＧＳ−２．１、１．１１−６ＧＳ−２．１７、１．１１−６ＧＳ−２．１５、１．１１−６ＧＳ−２．２２、１．１８−６ＧＳ−２．１、１．１８−６ＧＳ−２．１７、１．１８−６ＧＳ−２．１５、１．１８−６ＧＳ−２．２２、１．１７−６ＧＳ−２．１、１．１７−６ＧＳ−２．１７、１．１７−６ＧＳ−２．１５または１．１７−６ＧＳ−２．２２を含んでなる結合分子から選択される。
別の態様では、上記のような単一ＶＨドメイン抗体は、単一ドメイン抗体としてヒトＰＳＭＡ上の同じエピトープと結合する結合分子、例えば、抗体、抗体フラグメントまたは抗体模倣剤（すなわち、ＰＳＭＡとの結合に関して本明細書に記載の単一ドメイン抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）に取って代わり得る。よって、本明細書に記載の単一ドメイン抗体は参照抗体として使用可能である。好ましい実施形態では、交差競合試験用の参照抗体は、単一ドメイン抗体１．１、２．１、３．１、４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１または１５．１である。このような交差競合抗体は、標準的ＰＳＭＡ結合アッセイにおいて、本明細書に記載の単一ドメイン抗体のいずれかと交差競合する能力に基づいて同定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーが、本発明の単一ドメイン抗体との交差競合を証明するために使用可能である。１つの実施形態では、本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合し得る結合剤を提供し、競合アッセイでは、上記の単一ドメイン抗体のいずれか１つが結合剤に取って代わる。
本明細書に記載の結合分子は、１以上の付加的タンパク質部分との融合タンパク質として提供される。
第２の部分は、それもヒトＰＳＭＡに特異的であるＶＨドメインを含んでなり得るので、二価結合分子が提供される。１つの実施形態では、結合分子は二重パラトープ性である。二重パラトープ性結合分子は、異なるエピトープと結合する抗原結合部分を含んでなる。本発明の二重パラトープ性結合分子は、既知技術の方法を用いて構築することができる。
結合分子の部分を接続するために好適なリンカーとしては、ペプチドリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのＧＳ残基を含むリンカーが含まれ、式中、ｎ＝１〜１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。本明細書で使用する場合、ＧＳは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒを表す。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎもまた本明細書ではｎＧＳと表す。
別の実施形態では、第２の部分は、二重特異性結合分子を提供するために、異なる抗原に特異的なＶＨドメインまたは別の抗体フラグメントを含んでなり得る。よって、本明細書で使用する場合、用語「二重特異性結合分子」は、ＰＳＭＡに対して結合特異性を有する結合部位を有する本明細書に記載されるような結合分子と、第２の標的に対して結合特異性を有する結合部位を有する第２のポリペプチドドメインとを含んでなるポリペプチドを意味し、すなわち、二重特異性結合分子は、２つの標的に対して特異性を有する。第１の標的と第２の標的は同じでなく、すなわち、異なる標的、例えば、タンパク質であり；両方とも細胞表面に存在し得る。よって、本明細書に記載されるような二重特異性結合分子は、第１の標的と第２の標的を発現する（またはその細胞表面に展示する）細胞と選択的かつ特異的に結合し得る。別の実施形態では、結合分子は、３以上の抗原結合部分を含んでなる。
別の実施形態では、３以上の部分が相互連結されて多重特異性結合分子を提供する。本明細書に記載されるような多重特異性ポリペプチド剤は、ＰＳＭＡと結合する他、１以上の付加的標的と結合し、すなわち、多重特異性ポリペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれを超える標的と結合することができ、多重特異性ポリペプチド剤は、それぞれ少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、またはそれを超える標的結合部位を有する。
本明細書で使用する場合、用語「標的」は、１つの結合部位を有するポリペプチドドメインが選択的に結合する生体分子（例えば、抗原、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を意味する。標的は、例えば、細胞内標的（例えば、細胞内タンパク質標的）または細胞表面標的（例えば、膜タンパク質、例えば、受容体タンパク質）であり得る。好ましくは、標的は、細胞表面標的、例えば、細胞表面タンパク質である。好ましくは、第１の細胞表面標的および第２の細胞表面標的は、両方とも細胞上に存在する。１つの実施形態では、標的は免疫腫瘍学的標的である。
本発明の多重特異性抗体は、既知技術の方法を用いて構築することができる。
場合により、二重特異性または多重特異性結合分子は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方および場合によりヒンジ領域を含んでなる、抗体Ｆｃ領域またはそのフラグメントと連結することができる。このようなポリペプチドを作製するために、例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域またはそのフラグメントに連結された二重特異性または多重特異性結合分子をコードするベクターを使用することができる。
１つの実施形態では、第２の部分は、結合分子の半減期を延長する働きをし得る。第２の部分は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と結合する、タンパク質、例えば、抗体またはその一部を含んでなり得る。第２の部分は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）と結合するＶＨドメインを含んでなり得る。
さらなる部分は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその変異体、例えば、ＨＳＡ Ｃ３４Ｓを含んでなり得る。さらに、ＶＨドメインおよびＦｃドメインを含んでなる、例えば、ＶＨドメインがＦｃドメインに融合された、本明細書に記載されるような結合分子も提供される。さらに、第２の抗原と特異的に結合する第２の可変ドメインを含んでなる、第２の抗原がヒトＰＳＭＡ以外の抗原である、結合分子も提供される。第２の抗原は、分化抗原群（ＣＤ）分子または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子であり得る。
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、検出可能標識または機能的標識で標識される。標識は、限定されるものではないが、蛍光剤、放射性標識、酵素、化学発光剤、核磁気共鳴活性標識または光増感剤を含む、シグナルを生成するまたは生成するために誘導され得る任意の分子であり得る。よって、結合は、蛍光または発光、放射能、酵素活性または吸光度を検出することによって出および／または測定され得る。
さらに他の実施形態では、本発明の結合分子は、薬物、酵素または毒素などの少なくとも１つの治療用成分とカップリングされる。１つの実施形態では、治療用成分は、毒素、例えば、細胞傷害性放射性核種、化学毒素またはタンパク質毒素である。例えば、本発明のＰＳＭＡ結合分子は、α−、β−、もしくはγ−放射体、またはβ−およびγ−放射体などの放射性同位体とカップリングさせ得る。
毒素は、カリケアマイシン、エスペラマイシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチナム、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＰＨＥから選択され得る。他の実施形態では、治療用成分は、免疫刺激剤または免疫調節剤である。
１つの態様では、本発明は、本明細書に記載の２以上の単一ＶＨドメイン抗体を含んでなる免疫複合体を提供する。
本発明のＰＳＭＡ結合分子の毒素コンジュゲート形態は、好ましくは、ピコモル濃度でＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞死を媒介する。
別の態様では、本発明のＰＳＭＡ結合分子は、例えば、化学修飾により、特に、ペグ化により、またはリポソーム中への封入により、または血清アルブミンタンパク質を用いて、半減期を延長するように修飾される。
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、共有結合的に修飾される。用語「共有結合的に修飾される／共有結合的修飾」とは、本発明による結合分子の、例えば、本明細書に明示される配列の、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導体化剤、異種ポリペプチド配列との融合、および翻訳後修飾による修飾を含む。例えば、明示された配列の、共有結合修飾ポリペプチドは、本明細書に記載の機能的特性、例えば、ヒトＰＳＭＡと結合する能力をなお有するか、または共有結合的修飾は一般に、標的アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞で機能的な翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。特定の翻訳後修飾は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、多くの場合、翻訳後に脱アミド化されて対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基となる。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミノ化される。他の翻訳後修飾として、プロリンおよびリシンの水酸化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖の［α］−アミノ基のメチル化が含まれる。共有結合的修飾としては、例えば、本発明による、例えば、指定の配列のＰＳＭＡ結合分子およびそれらのアミノ酸配列変異体を含んでなる融合タンパク質、例えば、イムノアドヘシン、および異種シグナル配列とのＮ末端融合物が含まれる。
本発明の結合分子は、以下にさらに記載されるような特定の機能的特性を有する。本発明の結合分子のこれらのおよびその他の薬理学的活性は、例えば、当技術分野で記載されるような標準的試験法で証明することができる。
本発明の結合分子は、前立腺特異的膜抗原とともに細胞内に移行され得る。本発明の結合分子はヒトＰＳＭＡの細胞外ドメイン上のエピトープと特異的に結合する。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、その二量体形態でＰＳＭＡと特異的に結合する。本発明の結合分子は、毒性部分とコンジュゲートし、ＰＳＭＡ発現前立腺細胞または癌細胞を除去または死滅させるために使用することができる。
本発明の結合分子は、腫瘍細胞または前立腺細胞、実施例および添付の表に示されるように、例えば、ヒトＰＳＭＡ発現ＣＨＯ細胞、ＬＮＣａＰ細胞などの生細胞と結合することができる。さらなる態様において、本発明は、好ましくはＦＭＡＴ結合アッセイで測定した場合に、１００ｎＭ〜１００ｐＭの間のＥＣ５０値、例えば、１００ｎＭ以下の平均ＥＣ５０値、いっそうより好ましくは、９０ｎＭ以下の平均ＥＣ５０値、例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎＭ未満またはさらにはそれより低い、例えば、４、３、２、または１ｎＭ未満またはさらにはそれより低い、例えば、５００、４００、３００、２００、１００ｐＭ未満、またはさらにはそれより低い、例えば、４ｐＭ未満でＰＳＭＡと結合する単一ドメイン抗体を提供する。特に、ＥＣ５０値は、表１９に示される。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、ヒトＰＳＭＡおよびカニクイザルＰＳＭＡと特異的に結合し得る。
効力は、そうではないことが述べられない限り、通常、ＩＣ５０値としてｎＭで表される。機能アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大の５０％低下させる結合メンバーの濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的応答の％を結合メンバー濃度の対数の関数としてプロットし、ソフトウエアプログラムを使用し、データにシグモイド関数を当てはめてＩＣ５０値を得ることによって計算することができる。ＩＣ５０を測定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、ＩＣ５０を決定するためには、ＨＩＳ ＺＡＰ細胞死滅化アッセイを用いてＩＣ５０を求めることができる。ＥＣ５０は、最大半分有効濃度と呼称する。
別の態様では、本発明は、ＰＳＭＡ、好ましくは、ヒトＰＳＭＡに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子に関し、前記ドメインはヒトＶＨドメインであり、実施例に記載されるように試験した場合に、約０．２〜約１０００ｎＭ以上、例えば、０．２〜９００、０．２〜８００、０．２〜７００、０．２〜６００、０．２〜５００、０．２〜４００、０．２〜３００、０．２〜２００、０．２〜１００、０．２〜５０、０．２〜４０、０．２〜３０、０．２〜２０、０．２〜１０、０．２〜９、０．２〜８、０．２〜７、０．２〜６、０．２〜５、０．２〜４、０．２〜３、０．２〜２または０．２〜１のＩＣ５０を有する。
さらに、結合ＰＳＭＡに対する本発明のＰＳＭＡ結合分子の結合動態および親和性（平衡解離定数ＫＤとして表される）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはＯｃｔｅｔなどの表面プラズモン共鳴を用いて決定可能であり、またはＫＤはｐＡ２分析から見積もることもできる。特に、本発明の分子は、極めて有効である（すなわち、例えば実験の部にてｐＭ範囲で測定されるようなＥＣ５０値）。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるような単一ドメイン抗体を提供し、前記ｓｄＡｂは、１００ｎＭ〜１０ｐＭの間の平均ＫＤ値、例えば、９０ｎＭ以下の平均ＫＤ値、いっそうより好ましくは、８０ｎＭ以下、例えば、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎＭ未満またはさらにはそれより低い、例えば、４、３、２、または１ｎＭ未満、例えば、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０ｐＭ未満、またはさらにはそれより低い、例えば、１０ｐＭ未満の平均ＫＤ値で前記ＰＳＭＡと結合する。好ましくは、ＫＤは、実施例に示されるように決定される。
１つの実施形態では、本発明による結合分子は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは、約１０９Ｍ−１、より好ましくは、約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１以上の親和定数で、ＰＳＭＡに結合親和性を有する。１つの実施形態では、本発明による結合分子は、１．００Ｅ＋０４〜１．００Ｅ＋６（１／Ｍ）のＫｏｎを有する。１つの実施形態では、本発明による結合分子は、１．００Ｅ−０３〜１．００Ｅ−０５（１／ｓ）のＫｏｆｆを有する。
本発明の結合分子は、熱安定性および血清安定性を含む優れた安定性を示した（実施例参照）。さらに、本発明の結合分子は、実施例に示されるように、迅速な腫瘍の標的化を示す。さらに、本発明の結合分子はまた、ヒトＰＳＭＡに対する高い特異性と非標的組織への低い取り込みを示す（実施例参照）。
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、急速な血液クリアランスを示す。１つの実施形態では、本発明の結合分子は、低い腎臓滞留を示す。１つの実施形態では、結合分子は、ヒトＰＳＭＡへの別の抗体、例えば、Ｊ５９１の結合を阻害、例えば競合的に阻害することができる。
１つの実施形態では、本発明の結合分子は、下記の非限定リストから選択される１以上の特性を持ち得る：
ａ）腫瘍細胞の表面に見られるその天然型のヒトおよび／またはカニクイザル前立腺特異的膜抗原に対する高親和性結合、
ｂ）腫瘍細胞による内部移行、
ｃ）非標的組織における低い取り込み、
ｄ）迅速な腫瘍の標的化、
ｅ）ＬＮＣａＰ細胞には強く結合するが、前立腺特異的膜抗原の発現を欠く細胞には結合しないか、または最小の結合しかしない、および／または
ｆ）ＰＳＭＡ上のユニークなエピトープに結合する。
本発明はさらに、本発明の結合分子をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。１つの態様では、本発明は、上記で定義されるようなＣＤＲまたはＣＤＲセットまたはＶＨドメインをコードする核酸を提供する。
本明細書に記載の単一ドメイン抗体の核酸を以下に示す。これらは、発現用の核酸構築物を作出するために本明細書に記載のリンカーを用いて組み合わせることができる。
以下に示すような配列番号３９３〜４１０を含んでなるまたはからなる配列は、配列番号４〜８０を含んでなるまたはからなる系列１のＶＨドメインをコードする。
配列番号３９３（ＶＨドメイン１．１をコードする）
配列番号３９４（ＶＨドメイン１．２をコードする）
配列番号３９５（ＶＨドメイン１．３をコードする）
配列番号３９６（ＶＨドメイン１．４をコードする）
配列番号３９７（ＶＨドメイン１．５をコードする）
配列番号３９８（ＶＨドメイン１．６をコードする）
配列番号３９９（ＶＨドメイン１．７をコードする）
配列番号４００（ＶＨドメイン１．８をコードする）
配列番号４０１（ＶＨドメイン１．９をコードする）
配列番号４０２（ＶＨドメイン１．１０をコードする）
配列番号４０３（ＶＨドメイン１．１１をコードする）
配列番号４０４（ＶＨドメイン１．１２をコードする）
配列番号４０５（ＶＨドメイン１．１３をコードする）
配列番号４０６（ＶＨドメイン１．１４をコードする）
配列番号４０７（ＶＨドメイン１．１５をコードする）
配列番号４０８（ＶＨドメイン１．１６をコードする）
配列番号４０９（ＶＨドメイン１．１７をコードする）
配列番号４１０（ＶＨドメイン１．１８をコードする）
配列番号４１１（ＶＨドメイン１．１９をコードする）
配列番号４１２（ＶＨドメイン１．２０をコードする）
以下に示すような配列番号４１３〜４３７は、配列番号８４〜１８０を含んでなるまたはからなる系列２のＶＨドメインをコードする。
配列番号４１３（ＶＨドメイン２．１をコードする）
配列番号４１４（ＶＨドメイン２．２をコードする）
配列番号４１５（ＶＨドメイン２．３をコードする）
配列番号４１６（ＶＨドメイン２．４をコードする）
配列番号４１７（ＶＨドメイン２．５をコードする）
配列番号４１８（ＶＨドメイン２．６をコードする）
配列番号４１９（ＶＨドメイン２．７をコードする）
配列番号４２０（ＶＨドメイン２．８をコードする）
配列番号４２１（ＶＨドメイン２．９をコードする）
配列番号４２２（ＶＨドメイン２．１０をコードする）
配列番号４２３（ＶＨドメイン２．１１をコードする）
配列番号４２４（ＶＨドメイン２．１２をコードする）
配列番号４２５（ＶＨドメイン２．１３をコードする）
配列番号４２６（ＶＨドメイン２．１４をコードする）
配列番号４２７（ＶＨドメイン２．１５をコードする）
配列番号４２８（ＶＨドメイン２．１６をコードする）
配列番号４２９（ＶＨドメイン２．１７をコードする）
配列番号４３０（ＶＨドメイン２．１８をコードする）
配列番号４３１（ＶＨドメイン２．１９をコードする）
配列番号４３２（ＶＨドメイン２．２０をコードする）
配列番号４３３（ＶＨドメイン２．２１をコードする）
配列番号４３４（ＶＨドメイン２．２２をコードする）
配列番号４３５（ＶＨドメイン２．２３をコードする）
配列番号４３６（ＶＨドメイン２．２４をコードする）
配列番号４３７（ＶＨドメイン２．２５をコードする）
１つの態様では、本発明はまた、配列番号１８４〜２７６を含んでなるまたはからなる系列３のＶＨドメインをコードする、以下に示すような配列番号４３８〜４６１を含んでなるまたはからなる核酸配列に関する。
配列番号４３８（ＶＨドメイン３．１をコードする）
配列番号４３９（ＶＨドメイン３．２をコードする）
配列番号４４０（ＶＨドメイン３．３をコードする）
配列番号４４１（ＶＨドメイン３．４をコードする）
配列番号４４２（ＶＨドメイン３．５をコードする）
配列番号４４３（ＶＨドメイン３．６をコードする）
配列番号４４４（ＶＨドメイン３．７をコードする）
配列番号４４５（ＶＨドメイン３．８をコードする）
配列番号４４６（ＶＨドメイン３．９をコードする）
配列番号４４７（ＶＨドメイン３．１０をコードする）
配列番号４４８（ＶＨドメイン３．１１をコードする）
配列番号４４９（ＶＨドメイン３．１２をコードする）
配列番号４５０（ＶＨドメイン３．１３をコードする）
配列番号４５１（ＶＨドメイン３．１４をコードする）
配列番号４５２（ＶＨドメイン３．１５をコードする）
配列番号４５３（ＶＨドメイン３．１６をコードする）
配列番号４５４（ＶＨドメイン３．１７をコードする）
配列番号４５５（ＶＨドメイン３．１８をコードする）
配列番号４５６（ＶＨドメイン３．１９をコードする）
配列番号４５７（ＶＨドメイン３．２０をコードする）
配列番号４５８（ＶＨドメイン３．２１をコードする）
配列番号４５９（ＶＨドメイン３．２２をコードする）
配列番号４６０（ＶＨドメイン３．２３をコードする）
配列番号４６１（ＶＨドメイン３．２４をコードする）
以下に示すような配列番号４４６２、４６３、４６４および４６５は、配列番号２８０〜２９２を含んでなるまたはからなる系列４のＶＨドメインをコードする。
配列番号４６２（ＶＨドメイン４．１をコードする）
配列番号４６３（ＶＨドメイン４．２をコードする）
配列番号４６４（ＶＨドメイン４．３をコードする）
配列番号４６５（ＶＨドメイン４．４をコードする）
以下に示すような配列番号４６６または４６７は、配列番号２９６および３００を含んでなるまたはからなる系列５のＶＨドメインをコードする。
配列番号４６６（ＶＨドメイン５．１をコードする）
配列番号４６７（ＶＨドメイン５．２をコードする）
以下に示すような配列番号４６８〜４７４は、配列番号３０４〜３２８を含んでなるまたはからなる系列６のＶＨドメインをコードする。
配列番号４６８（ＶＨドメイン６．１をコードする）
配列番号４６９（ＶＨドメイン６．２をコードする）
配列番号４７０（ＶＨドメイン６．３をコードする）
配列番号４７１（ＶＨドメイン６．４をコードする）
配列番号４７２（ＶＨドメイン６．５をコードする）
配列番号４７３（ＶＨドメイン６．６をコードする）
配列番号４７４（ＶＨドメイン６．７をコードする）
以下に示すような配列番号４７５〜４８２は、配列番号３３２〜３６０を含んでなるまたはからなる系列７のＶＨドメインをコードする。
配列番号４７５（ＶＨドメイン７．１をコードする）
配列番号４７６（ＶＨドメイン７．２をコードする）
配列番号４７７（ＶＨドメイン７．３をコードする）
配列番号４７８（ＶＨドメイン７．４をコードする）
配列番号４７９（ＶＨドメイン７．５をコードする）
配列番号４８０（ＶＨドメイン７．６をコードする）
配列番号４８１（ＶＨドメイン７．７をコードする）
配列番号４８２（ＶＨドメイン７．８をコードする）
以下に示すような配列番号４８３は、配列番号３６４を含んでなるまたはからなる系列８のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８３
以下に示すような配列番号４８４は、配列番号３６８を含んでなるまたはからなる系列９のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８４
以下に示すような配列番号４８５は、配列番号３７２を含んでなるまたはからなる系列１０のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８５
以下に示すような配列番号４８６は、配列番号３７６を含んでなるまたはからなる系列１１のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８６
以下に示すような配列番号４８７は、配列番号３８０を含んでなるまたはからなる系列１２のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８７
以下に示すような配列番号４８８は、配列番号３８４を含んでなるまたはからなる系列１３のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８８
以下に示すような配列番号４８９９は、配列番号３８８を含んでなるまたはからなる系列１４のＶＨドメインをコードする。
配列番号４８９
以下に示すような配列番号４９０は、配列番号３９２を含んでなるまたはからなる系列１５のＶＨドメインをコードする。
配列番号４９０
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなり得、完全もしくは部分的合成または組換え生産され得る。本発明に示される場合、ヌクレオチド配列という場合には、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈がそうではいことを必要としない限り、ＴがＵに置換された指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
核酸は、構築物、例えば、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態であり得る。
本発明はまた、上記のように１以上の核酸構築物を含んでなる、単離された組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌、ウイルス、哺乳動物または他の好適な宿主細胞であり得る。１つの実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。別の実施形態では、細胞は酵母細胞である。別の実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ライブラリーを用いて本明細書に記載のポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物および組成物を調製または作製するための方法は、
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーを準備する工程；および
ｂ）ＰＳＭＡと結合し得る／ＰＳＭＡに対して親和性を持ち得るアミノ酸配列に関して前記セット、コレクションまたはライブラリーをスクリーニングする工程、および
ｃ）ＰＳＭＡと結合し得る／ＰＳＭＡに対して親和性を持ち得るアミノ酸配列を単離する工程
を含んでなり得る。
上記の方法において、アミノ酸配列のセット、コレクションまたはライブラリーは、例えばスクリーニングを容易にするためにファージ、ファージミド、リボソームまたは好適な微生物（例えば、酵母）上に展示することができる。アミノ酸配列（のセット、コレクションまたはライブラリー）を展示およびスクリーニングするために好適な方法、技術および宿主生物は、当業者には自明である（例えば、Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press;第1版(1996年10月28日) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty参照）。
ＶＨドメインを含む、本明細書に記載の結合分子は、トランスジェニック齧歯類で発現させることができる。トランスジェニック齧歯類、例えば、マウスは、内因性抗体遺伝子の発現能が低減されていてもよい。よって、１つの実施形態では、齧歯類は、内因性の軽鎖および／または重鎖抗体遺伝子の発現能が低減されている。従って、この齧歯類は、機能的な軽鎖および／または重鎖が産生されないように内因性の軽鎖および／または重鎖抗体遺伝子の発現を破壊するための修飾を含んでなり得る。
ヒトＰＳＭＡと結合し得るヒト重鎖単独抗体は、
ａ）非再構成ヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現しかつ機能的内因性軽鎖または重鎖を生成できないトランスジェニック齧歯類をＰＳＭＡ抗原で免疫すること、
ｂ）ヒト重鎖単独抗体を単離すること
を含んでなる方法によって産生され得る。
ＶＨドメインは、
ａ）ヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現しかつ機能的内因性軽鎖または重鎖を生成できないトランスジェニックマウスをＰＳＭＡ抗原で免疫すること、
ｂ）前記マウス由来のＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリーを作製すること、および
ｃ）前記ライブラリーからＶＨドメイン配列を含んでなる配列を単離すること
を含んでなる方法によって生産され得る。
さらなる工程は、例えば、実施例に示されるような機能アッセイを用いることによって、ヒトＰＳＭＡと結合する単一ＶＨドメイン抗体または重鎖単独抗体を同定することを含み得る。
１つの実施形態では、齧歯類はマウスである。マウスは、非機能的内因性λ軽鎖遺伝子座を含んでなり得る。よって、マウスは、機能的内因性λ軽鎖を生成しない。１つの実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、部分的もしくは完全に欠失されるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集もしくは遺伝子サイレンシングを介して非機能的とされる。例えば、少なくとも定常領域遺伝子Ｃ１、Ｃ２およびＣ３が、欠失されてもよいし、または上記のように挿入もしくはその他の修飾を介して非機能的とされてもよい。１つの実施形態では、マウスが機能的λ軽鎖を生成しないように遺伝子座が機能的にサイレンシングされる。
さらに、マウスは、非機能的内因性κ軽鎖遺伝子座を含んでなってもよい。よって、マウスは機能的内因性κ軽鎖を生成しない。１つの実施形態では、κ軽鎖遺伝子座は、部分的もしくは完全に欠失されるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集もしくは遺伝子サイレンシングを介して非機能的とされる。１つの実施形態では、マウスが機能的κ軽鎖を生成しないように遺伝子座が機能的にサイレンシングされる。
内因性λおよびκＬ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされているマウスは、例えば、引用することによりその全内容が本明細書の開示の一部とされるＷＯ２００３／０００７３７に開示されているように作出され得る。
さらに、マウスは、非機能的内因性重鎖遺伝子座を含んでなってもよい。よって、マウスは、機能的内因性重鎖を生成しない。１つの実施形態では、重鎖遺伝子座は、部分的もしくは完全に欠失されるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集もしくは遺伝子サイレンシングを介して非機能的とされる。１つの実施形態では、マウスが機能的重鎖を生成しないように遺伝子座が機能的にサイレンシングされる。
例えば、ＷＯ２００４／０７６６１８（引用することによりその全内容が本明細書の開示の一部とされる）に記載されるように、８つの内因性重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子（μ、δ、γ３、γ１、ｙ２ａ、ｙ２ｂ、εおよびａ）の総てがマウスに存在しないか、またはそれらが非機能的となる程度まで部分的に存在せず、または遺伝子δ、γ３、γ１、ｙ２ａ、ｙ２ｂおよびεが存在せずに、隣接遺伝子のμおよびａがそれらが非機能的となる程度まで部分的に存在せず、または遺伝子μ、δ、γ３、γ１、ｙ２ａ、ｙ２ｂおよびεが存在せずに、ａがそれが非機能的となる程度まで部分的に存在せず、またはδ、γ３、γ１、ｙ２ａ、ｙ２ｂ、εおよびａが存在せずに、μがそれが非機能的となる程度まで部分的に存在しない。部分的欠失とは、機能的内因性遺伝子産物がその遺伝子座によってコードされない、すなわち、その遺伝子座から機能的産物が発現されない程度まで、例えば、挿入によって、内因性遺伝子座の遺伝子配列が欠失または破壊されていることを意味する。別の実施形態では、遺伝子座は機能的にサイレンシグされる。
１つの実施形態では、マウスは、非機能的内因性重鎖遺伝子座、非機能的内因性λ軽鎖遺伝子座および非機能的内因性κ軽鎖遺伝子座を含んでなる。従って、マウスは、機能的内因性軽鎖または重鎖を産生しない。よって、このマウスはトリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスである。
トランスジェニックマウスは、異種重鎖遺伝子座を発現するためのベクター、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含んでなってよい。ＹＡＣは、酵母において非常に大きなＤＮＡ挿入をクローニングするために使用可能なベクターである。天然酵母染色体のように挙動するために不可欠な３つのシス作用構造エレメント（自立複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）および２つのテロメア（ＴＥＬ））の総てを含んでなるとともに、それらの大きなＤＮＡ挿入の許容能は、それらを染色体様の安定性および酵母細胞における伝達の忠実性のために必要とされる最小サイズ（１５０ｋｂ）に到達させることを可能とする。ＹＡＣの構築および使用は当技術分野で周知である（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net）。
例えば、ＹＡＣは、過多のヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を、ＣＨ１ドメインを欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウスエンハンサーおよび調節領域と組み合わせて含んでなり得る。
内因性マウスまたはラット免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活性化およびヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子と、ＣＨ１ドメインを欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウスエンハンサーおよび調節領域との組合せの挿入のために、当技術分野で公知の別法を用いてもよい。
トランスジェニックマウスは、実施例に示されるような標準的技術に従って作出することができる。トランスジェニックマウスを作出するための２つの最も特徴付けられた経路は、新しく受精した卵母細胞への遺伝物質の前核マイクロインジェクションを介するもの、または桑実胚もしくは胚盤胞段階の胚への安定トランスフェクト胚性幹細胞の導入を介するものである。どのようにして遺伝物質が導入されたかによらず、操作された胚は偽妊娠雌レシピエントに移植され、そこで妊娠を継続し、候補トランスジェニック仔が産まれる。
これらの広範な方法の間の主要な違いは、ＥＳクローンは、トランスジェニック動物を作出するためのそれらの使用の前に徹底的にスクリーニングできることである。これに対して、前核マイクロインジェクションは、その導入後の宿主ゲノムへの遺伝物質の組み込みに頼り、一般的に言えば、導入遺伝子の組み込みの成功は、子が産まれる後まで確認できない。
導入遺伝子の組込みの成功を補助する、および導入遺伝子の組込みの成功が見られるか否かを決定する両方のために、当技術分野で公知の多くの方法が存在する。トランスジェニック動物は、構築物のゲノムへぼランダムな組込み、部位特異的組込み、または相同組換えを含む複数の手段によって作出することができる。導入遺伝子組込みならびに薬物耐性マーカー（正の選択）、リコンビナーゼ、組換え媒介カセット交換、負の選択技術、および組換え効率を改善するためのヌクレアーゼの使用を含むその後の修飾のための駆動および選択の両方を目的として使用可能な種々のツールおよび技術が存在する。これらの方法のほとんどのものはＥＳ細胞の修飾において慣用されている。しかしながら、これらの技術のいくつかは、前核注入により媒介される遺伝子導入を促進するために有用性を持ち得る。
所望のバックグラウンド内でトランスジェニック系統のより効率的な作出を得るためにさらなる精密化が使用可能である。上記のように、好ましい実施形態では、創薬に利用可能な重鎖単独レパートリーの発現のために導入された導入遺伝子の単独使用を可能とするために、内因性マウス免疫グロブリン発現がサイレンシグされる。遺伝子操作マウス、例えば、総ての内因性免疫グロブリン遺伝子座（マウス重鎖、マウスκ鎖およびマウスλ鎖）がサイレンシングされたＴＫＯマウスが上記のように使用可能である。導入された導入遺伝子のＴＫＯバックグラウンドへの移入は、育種（従来のまたはプロセスの効率的スケーリングを得るためにＩＶＦ工程を含めた）を介して達成され得る。しかしながら、遺伝子導入手順にＴＫＯバックグラウンドを含めることも可能である。例えば、マイクロインジェクションのために、卵母細胞がＴＫＯドナーから誘導されてもよい。同様に、ＴＫＯ胚由来のＥＳ細胞を遺伝子導入する使用するために誘導することもできる。導入遺伝子が導入されたトリプルノックアウトマウスは本明細書ではＴＫＯ／Ｔｇと呼称する。１つの実施形態では、マウスは、ＷＯ２０１６／０６２９９０に記載の通りである。
本発明の別の態様では、本発明によるＰＳＭＡ結合分子と場合により薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。本発明の結合分子または組成物は、いずれの都合のよい経路によって投与することもできる。これらの化合物は、経口投与および非経口投与を含むいずれの経路によって投与してもよい。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸、膀胱内、皮内、局所的または皮下投与が含まれる。組成物は１以上の投与単位の形態を採り得る。
本発明の組成物は、液体、例えば、溶液、エマルションまたは懸濁液の形態であり得る。液体は、注射、注入（例えば、ＩＶ注入）または皮下による送達に有用であり得る。本発明の液体組成物は、それらが溶液であれ、懸濁液であれ、または他の同様の形態であれ、以下の１以上も含み得る：水、塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、硬化油（例えば、合成モノまたはジグリセリド）、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはその他の溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力調整剤。組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の材質から製造されたアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアル中に封入することができる。
特定の実施形態では、本発明の１以上の結合分子または組成物を、治療の必要な領域に局所的に、または静脈注射または注入によって投与することが望ましい場合がある。
特定の障害または病態の治療において効果的／有効な本発明の結合分子の量は、その障害または病態の性質によって異なり、標準的臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な用量範囲を特定する助けとして場合によりｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用することもできる。その組成物中で使用される正確な用量はまた投与経路、および疾患または障害の重篤度によっても異なり、医師の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。
本発明の組成物は、有効量の本発明の結合分子を含んでなり、その結果、好適な用量がる取得される。これらの化合物の適正な用量は、特定の処方物、適用様式、およびその特定の部位、宿主および処置される疾患によって異なる。齢、体重、性、食餌、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物組合せ、反応感受性および疾患の重篤度のような他の因子も考慮するべきである。投与は、最大耐用量内で連続的または周期的に行うことができる。
一般に、この量は、組成物の重量により少なくとも約０．０１％の本発明の結合分子である。
本発明の好ましい組成物は、非経口投与単位が約０．０１％〜約２重量％の本発明の結合分子を含有するように調製される。
静脈投与では、組成物は、一般に約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ動物体重、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ動物体重の間、より好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ動物体重を含んでなり得る。
本組成物は、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に好適な他の任意の形態などの好適な担体の形態と採り得る。好適な医薬担体の他の例は、E. W. Martinによる "Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
医薬組成物は、製薬技術で周知の方法論を用いて調製することができる。例えば、注射により投与することが意図される組成物は、本発明の結合分子を水と合わせて溶液を形成することによって調製することができる。均質な溶液または懸濁液の形成を助けるために界面活性剤を添加することができる。
本発明さらに、本発明の結合分子を患者に投与することを含んでなる、癌、特に、前立腺癌の予防および／または治療のための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の本発明の結合分子および／または医薬組成物を投与することを含んでなる。特に、本発明は、癌、特に、前立腺癌の予防および／または治療の方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、薬学的に有効な量の本発明の結合分子または医薬組成物を投与することを含んでなる。
本発明はまた、疾患の治療において使用するための本発明の結合分子に関する。本発明はまた、癌、特に、前立腺癌または前立腺障害の治療において使用するための本発明の結合分子に関する。「前立腺癌」は、前立腺の組織から生じるあらゆる病期およびあらゆる形態の癌を意味する。本発明はまた、ＰＳＭＡの異常な発現を特徴とする疾患の治療に関する。
別の態様では、本発明は、疾患の治療における本発明の結合分子の使用に関する。別の態様では、本発明は、癌、特に、前立腺癌または前立腺障害の治療のための薬剤の製造における本発明の結合分子の使用に関する。
本発明の結合分子はまた、癌、特に、前立腺癌または前立腺障害の治療、予防、または改善にも有用である。前立腺障害とは、雄性生殖器の前立腺を侵すいずれの疾患も意味する。前立腺は、精巣のホルモン分泌に依存する。ＰＳＭＡの発現は、他の癌で、より具体的には、これらの癌に関連する新生血管で検出されている。通常型（淡明細胞型）腎細胞、膀胱の移行上皮細胞、精巣−胎児性、神経内分泌、結腸、および乳房を含む広範な癌腫、ならびに種々のタイプの悪性腫瘍が、それらの新生血管でＰＳＭＡを一貫して強く発現することが見出されている。
本発明の結合分子は、単独の有効成分として投与してもよいし、または１以上の他の治療部分および／または細胞傷害性部分と組み合わせて投与してもよい。１つの実施形態では、結合分子は、毒性部分とコンジュゲートしてもよい。
前立腺障害、例えば、前立腺癌の療法では、抗ＰＳＭＡ結合分子は、既存の療法と組み合わせて使用可能である。１つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、既存の療法または治療薬、例えば、抗癌療法と組み合わせて使用される。よって、別の態様では、本発明はまた、本発明の単一ドメイン抗体または医薬組成物の投与と抗癌療法を含んでなる併用療法に関する。抗癌療法は治療薬または放射線療法を含んでよく、遺伝子療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法 骨髄移植、ナノ療法、標的抗癌療法または腫瘍溶解薬を含む。他の治療薬の例としては、他のチェックポイント阻害剤、抗悪性腫瘍剤、免疫剤、弱毒癌性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスした樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、標的化小分子および生体分子（例えば、シグナル伝達経路の成分、例えば、チロシンキナーゼの調節剤および受容体チロシンキナーゼの阻害剤、ならびにＥＧＦＲアンタゴニストを含む、腫瘍特異的抗原と結合する薬剤）、抗炎症剤、細胞傷害性薬剤、放射性毒性剤、または免疫抑制剤および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞、化学療法を含む。１つの実施形態では、単一ドメイン抗体は、手術と組み合わせて使用される。本発明の結合分子は、他の療法と同じ時点または異なる時点で、例えば、同時に、個別にまたは逐次に投与され得る。
別の態様では、本発明は、本発明の結合分子を含んでなる、診断、治療、予後または経過観察のために前立腺癌を検出するためのキットを提供する。キットはまた、使用説明書も含んでなり得る。キットは、標識された上記のような本発明の結合分子と標識を検出するための１以上の化合物を含み得る。本発明は、別の態様において、凍結乾燥形態でパッケージされた、または水性媒体中でパッケージされた本発明の結合分子を提供する。
本発明はまた、本発明の結合分子を使用する検出方法に関する。ヒトＰＳＭＡと結合するそれらの能力を考えれば、本明細書に開示されるヒトＰＳＭＡ結合分子は、従来のイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を用いてＰＳＭＡ（例えば、血清または血漿などの生体サンプル中）を検出するために使用可能である。特に、本発明はまた、癌、特に、前立腺癌の進行を診断または経過観察するためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、試験サンプル中でＰＳＭＡタンパク質の存在を検出すること、およびこれを正常対象からの対照サンプルまたは正常対象の標準値もしくは標準値範囲と比較することを含んでなる。これらのサンプルは、血液、血漿、血清、精液、尿または組織生検から選択され得る。
本方法は、（ａ）サンプル（および場合により、参照、例えば、陽性および／または陰性対照サンプル）を本発明のＰＳＭＡ結合分子と接触させること、および（ｂ）サンプル中のＰＳＭＡと結合した結合分子または結合していない結合分子のいずれかを検出し、それにより生体サンプル中のＰＳＭＡを検出することを含み得る。結合分子は、結合したまたは結合していない抗体の検出を容易にするために検出可能な物質で直接または間接的に標識することができる。好適な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光物質および放射性物質が含まれる。
本発明はまた、前記結合分子を標識することによって本発明のＰＳＭＡ結合分子の内部移行を評価するためのアッセイに関する。このようなアッセイは例に記載されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ法は、例えば、対象におけるイメージングによりｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＭＡの存在を検出することを含んでなり得る。この方法では、本発明のＰＳＭＡ結合分子は、結合を検出するために標識される。
本発明の結合分子を標識するための別法として、検出可能な物質で標識したＰＳＭＡ標準と非標識ヒトＰＳＭＡ結合分子を使用する競合イムノアッセイによって、体液中でヒトＰＳＭＡをアッセイすることができる。このアッセイでは、生体サンプル、標識されたＰＳＭＡ標準およびヒトＰＳＭＡ結合分子を合わせ、非結合分子に結合した標識ＰＳＭＡ標準の量を決定する。生体サンプル中のヒトＰＳＭＡの量は、ＰＳＭＡ結合分子に結合した標識ＰＳＭＡ標準の量に反比例する。同様に、検出可能な物質で標識したＰＳＭＡ標準と非標識ヒトＰＳＭＡ結合分子を使用する競合イムノアッセイによって、体液中でヒトＰＳＭＡをアッセイすることもできる。
本明細書に開示される結合分子は、例えば、ＰＳＭＡを含有する細胞培養物、ヒト対象、または本明細書に開示される結合分子が交差反応するＰＳＭＡを有する他の哺乳動物対象において、ＰＳＭＡ活性を阻害するために使用することができる。１つの実施形態では、ＰＳＭＡを本明細書に開示される結合分子と接触させることを含んでなり、その結果、ＰＳＭＡ活性が阻害または増強される、ＰＳＭＡ活性を阻害または増強するための方法が提供される。例えば、ＰＳＭＡを含有する、または含有が疑われる細胞培養物において、本明細書に開示される結合分子を、その培養物においてＰＳＭＡ活性を阻害するために培養培地に添加することができる。
よって、１つの実施形態では、本発明はまた、ＰＳＭＡを発現する細胞、例えば、癌性または非癌性前立腺細胞を除去するまたは死滅させる方法に関する。本発明の方法は、細胞を本発明のＰＳＭＡ結合分子と、前記細胞の除去または死滅化に十分な量で接触させることを含む。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養中の細胞に対して使用することができる。
本明細書でそうではないことが定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般に理解されている意味を持つ。以上の開示で、本発明を作製および使用する方法ならびにそれらの最良の様式を含め、本発明の範囲内に包含される対象の全般的説明を提供するが、さらに当業者が本発明を実施できるよう、また、その完全な記述的説明を提供するために下記の実施例を示す。しかしながら、当業者は、これらの実施例の明細が本発明の限定として読み取られるべきでなく、その範囲は本開示に付属する特許請求の範囲およびその等価物から理解されるべきであることを認識するであろう。本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示に照らして当業者に自明である。
本明細書に記載される総ての文献は、遺伝子受託番号の参照を含め、引用することによりその全内容が本明細書の開示の一部とされる。
「および／または」は、本明細書で使用する場合、２つの明示された特徴または成分のそれぞれの、他を伴うまたは伴わない具体的開示として理解されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書に個々に示されているかのごとくの（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的開示と理解されるべきである。文脈がそうではないことを示さない限り、上記に示される特徴の記載および定義は本発明のいずれの特定の態様または実施形態にも限定されず、記載される総ての態様および実施形態に等しく当てはまる。
本発明を限定されない例でさらに説明する。
実施例１．Ｔｇ／ＴＫＯマウスの構築
内因性重鎖および軽鎖抗体発現に関してサイレンシグされた（トリプルノックアウトまたはＴＫＯ）バックグラウンド内の生殖細胞系構成中に重鎖抗体トランスジェニック遺伝子座）を有するマウスを従前に記載のように作出した（ＷＯ２００４／０７６６１８およびＷＯ２００３／０００７３７、Ren et al., Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003）。簡単に述べれば、トランスジェニックマウスは、新しく受精した卵母細胞卵母細胞の、過多のヒトＶＨ、ＤおよびＪ遺伝子を、ＣＨ１ドメインを欠くマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウスエンハンサーおよび調節領域と組み合わせて含んでなる酵母人工染色体（ＹＡＣ）による前核マイクロインジェクションの後に誘導された。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、酵母における非常に大きなＤＮＡ挿入のクローニングのために使用可能なベクターである。天然酵母染色体のように挙動するために不可欠な３つのシス作用構造エレメント（自立複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）および２つのテロメア（ＴＥＬ））の総てを含んでなるとともに、それらの大きなＤＮＡ挿入の許容能は、それらを染色体様安定性および酵母細胞における伝達の忠実性のために必要とされる最小サイズ（１５０ｋｂ）に到達させることを可能とする。ＹＡＣの構築および使用は当技術分野で周知である（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002, Macmillan Publishers Ltd., Nature Publishing Group / www.els.net）。
これらのトランスジェニック創始マウスを、内因性免疫グロブリン発現を欠いた動物に戻し交配して、記載の免疫研究で使用されるＴｇ／ＴＫＯ系統を作出した。
実施例２．免疫のための抗原
免疫には組換え精製タンパク質またはヒト細胞株ＬＮＣａｐを使用した。組換えヒトＰＭＳＡはＲ＆Ｄ（カタログ番号４２３４−ＺＮ）から購入し、ＬＮＣａｐ細胞はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号８９１１０２１１−１ＶＬ）から購入した。
実施例３．免疫プロトコール
簡単に述べれば、８〜１２週齢のＴｇ／ＴＫＯマウスのそれぞれに、フロイントの完全アジュバントに乳化させ皮下送達する合計５０μｇの組換え精製ヒトＰＳＭＡタンパク質、または腹膜内送達するＰＢＳ中１０００万個のＬＮＣａｐ細胞を施し、その後、これもまた皮下に投与されるフロイントの不完全アジュバントに乳化させた１〜１０μｇの組換えタンパク質を、初期プライミングの後に種々の間隔で与えて追加免疫を行った。最終用量の組換え精製ヒトＰＳＭＡタンパク質抗原は、アジュバントの不在下、リン酸緩衝生理食塩水中で腹膜内投与した。
別の免疫経路および手順も使用可能である。例えば、フロイントのアジュバントの代わりに異なるアジュバントまたは免疫増強手順を使用してもよい。ＤＮＡ免疫は筋肉内にまたは遺伝子銃を介して送達される場合が多い。腹膜内投与されるトランスフェクト細胞またはそのような細胞からの膜調製物が、排他的ではないが多い。
実施例４．血清ＥＬＩＳＡ
免疫中およびその後に、マウスから血清を回収し、免疫原に対する重鎖抗体応答の存在をＥＬＩＳＡによって確認した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号４４３４０４）を４℃にて一晩、５０μｌ／ウェルの１μｇ組換え抗原／ＰＢＳ溶液ｍｌでコーティングした。抗原溶液のデカンテーションの後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン（商標）２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ１３７９）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ錠剤、オキソイド カタログ番号ＢＲ００１４Ｇから調製）を用いてプレートを洗浄した後、ツィーン２０を添加しないＰＢＳで洗浄した。非特異的タンパク質相互作用をブロッキングするために、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ（商標））の溶液をウェルに加え、これらのプレートを少なくとも１時間室温でインキュベートした。３％Ｍａｒｖｅｌ（商標）／ＰＢＳ中の血清の希釈液をポリプロピレンチューブまたはプレートに調製し、少なくとも１時間室温でインキュベートした後、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、そこでさらに少なくとも１時間インキュベーションを行った。次に、結合していないタンパク質を、ＰＢＳ／ツィーン２０、次いでＰＢＳでの反復洗浄を用いて洗い流した。次に、ＰＢＳ／３％Ｍａｒｖｅｌ中に調製したビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγサブクラス１特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５−０６５−２０５）の溶液を各ウェルに加え、さらに室温で少なくとも１時間インキュベーションを行った。結合していない検出抗体を、ＰＢＳ／ツィーン２０およびＰＢＳを用いて反復洗浄することによって除去した。次に、３％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中、ニュートラビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３１０３０）をＥＬＩＳＡプレートに加え、少なくとも３０分間結合させた。さらなる洗浄後、ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）を用いて現像し、１０分後に０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３２０５０１）の添加によって反応を停止させた。吸光度を、４５０ｎｍでの光学密度を読み取ることによって決定した。免疫により誘導される重鎖抗体応答を確認するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの別のアッセイも使用可能である。
実施例５．免疫マウスからのライブラリーの作製
ａ）組織の処理、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ作製
各免疫動物から脾臓、鼠径部および上腕リンパ節をＲＮＡｌａｔｅ（商標）へ回収した。各動物に関して、脾臓および４つのリンパ節の１／２を別個に処理した。まず、組織をホモジナイズし、組織をライジングマトリックスＤビーズチューブ（ＭＰ Ｂｉｏ．カタログ番号１１６９８３００１）に移した後、β−メルカプトエタノールを含有する６００μlのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓ（商標）キットから カタログ番号７４１０４）を加え、その後、ＭＰ Ｂｉｏ Ｆａｓｔｐｒｅｐ９６ホモジナイザー（カタログ番号１１６０１０５００）にて１６００ｒｐｍで６０秒間ホモジナイゼーションを行った。ホモジナイズ組織を含有するチューブを氷中に移し、１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって残渣をペレットとした。４００μｌの上清サンプルを取り出し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。
まず、製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）キット（カタログ番号７４１０４）を用いてＲＮＡを抽出した。次に、各ＲＮＡサンプルを用い、スーパースクリプトＩＩＩ ＲＴ−ＰＣＲ ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５７４−０３５）を用いてｃＤＮＡを作製した。各脾臓およびリンパ結節ＲＮＡサンプルについて、ＶＨ＿Ｊ／Ｆ（長鎖）プライマーをＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４またはＶＨ６系列のプライマーと組み合わせて用い、５回のＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーの詳細は以下の通りである。
縮重プライマーに対するヌクレオチドの選択肢のコードを以下に示す。
Ｒ Ａ、Ｇ
Ｙ Ｃ、Ｔ
Ｍ Ａ、Ｃ
Ｋ Ｇ、Ｔ
Ｓ Ｃ、Ｇ
Ｗ Ａ、Ｔ
Ｂ Ｃ、Ｇ、Ｔ
Ｖ Ａ、Ｃ、Ｇ
Ｄ Ａ、Ｇ、Ｔ
Ｎ Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ
ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、下記の試験管反応成分に基づきマスターミックスを調製した。：
１２．５μｌ ２倍反応混合物
０．５μｌフォワードプライマー（１０μΜ）
０．５μｌリバースプライマー（１０μΜ）
０．５μｌ酵素混合物
５００ｎｇ−１μｇ ＲＮＡ
水で２５μｌまで
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにて下記の条件を用いて行った：
５５℃２０分
９４℃２分
３５サイクルの９４℃１５秒
５８℃３０秒
６８℃３０秒
６８℃５分
４℃で保持
３７０ｂｐの範囲の産物をゲル電気泳動により確認した。
次に、各マウスについて、１／２の脾臓および各４リンパ節からの所与の系列に関して増幅されたＶＨ産物を、製造者の説明書に従って使用したＴｈｅｒｍｏ／Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）を用いる精製のためにプールし、５０μｌの水中に産物が溶出された。
ａ）ファージミドベクターへのクローニング
ファージミドベクターｐＵＣＧ３をこれらの研究に使用した。ＰＣＲに基づく方法を用いて、増幅されたＶＨ配列からＶＨファージミドライブラリーを構築した。以下の手順を用いた：
下記のプライマーとともにＰＣＲを用い、線状化型のｐＵＣＧ３を作製した：
下記の試薬を含んでなるＰＣＲ反応に、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲマスターミックスをＧＣバッファー（カタログ番号Ｆ５３２Ｌ、ＮＥＢ）とともに用いた：
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＧＣ ２倍混合物 ２５μｌ
ｐＵＣＧ３ ５〜１０ｎｇ
プライマー（１０μΜ） 各１．２５μｌ
ＤＭＳＯ １．５μｌ
ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ 終容量５０μｌまで
使用したサイクル条件は以下であった。：
９８℃３０秒
１０サイクルの
９８℃１０秒
５８℃２０秒
６８℃２分、３０秒
２０サイクルの
９８℃１０秒
５８℃２０秒
６８℃３分
６８℃５分
４℃保持
ＰＣＲ産物（３１５２ｂｐ）を、ＧｅｎｅＪｅｔゲル精製キット（カタログ番号Ｋ０６９１）を製造者の説明書に従って用いてゲル精製し、最終的に４０μｌの溶出バッファー中に溶出した。
精製したＶＨ ＲＴ−ＰＣＲ産物をメガプライマーとして、線状化したｐＵＣＧ３ともに使用し、下記の反応に基づき、形質転換およびライブラリー作製のためのファージミド産物を得た。
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＧＣ ２倍混合物 ２５μｌ
線状化ｐＵＣＧ３ ８００ｎｇ
ＶＨ ＰＣＲ産物 ２００ｎｇ
ＤＭＳＯ １．５μｌ
ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ 終用量５０μｌまで
ＰＣＲは次のように行った：
ＰＣＲの産物を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分析した。
種々の系列ＶＨ／ファージミド産物を、ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）を製造者の説明書に従って用いて精製し、最終溶出は２５μｌ Ｈ２Ｏ中であり、この溶出液をＢｉｏ−Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ内のＢｉｏＲａｄ ２×０．２ｃｍキュベット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６５−２０８６）および予温した回復培地（Ｌｕｃｉｇｅｎ、特許混合物）を用いたエレクトロポレーションによるＴＧ１大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２−２）の形質転換のために使用した。２２μｌの精製産物をエレクトロポレーションのために１６０μｌの細胞に加え、各ＶＨ／ファージミド産物について２０００ｖで２回のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション済みの細胞をプールし、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブで回復させ、１５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換アリコートの１０倍希釈を行い、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２倍ＴＹ寒天を含有するペトリ皿に播種した。生じたこれらのペトリ皿上のコロニーを用いてライブラリーサイズを評価した。形質転換の残りのものを、２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２倍ＴＹ寒天を含有する大形式のバイオアッセイディッシュに播種した。総ての寒天プレートを一晩３０℃でインキュベートした。１０ｍｌの２×ＴＹ培養液を大形式のバイオアッセイディッシュに加え、コロニーを崩し、ＯＤ６００を測定した（１．０＝５×１０８細胞／ｍｌのＯＤ）。アリコートは、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液の添加の後に、クリオバイアルにて−８０℃で保存するか、または直接ファージ選択プロセスに使用した。
実施例６．ＰＳＭＡ結合剤の単離のための選択戦略
ライブラリーファージストックの作製およびファージディスプレー選択は、公開されている方法(Antibody Engineering, Benny Lo編, chapter 8, p161-176, 2004)に従って行った。ほとんどの場合、パンニングアプローチと組み合わせたファージディスプレーを用いて結合ＶＨドメインを単離した。しかしながら、可溶性選択およびストレス（例えば、加熱）下で行われる選択を含む、様々な異なる選択方法が当技術分野において十分に記載されている。また、抗ＰＳＭＡ ＶＨの内部移行を増進するための選択も一価および多価ファージを用いて行われた（特許ＵＳ２００９１７０７９２（Ａ１）−２００９−０７−０２）。簡単に述べれば、氷冷細胞培地中でブロッキングしたファージを、２．５×１０６ ＬｎＣＡＰ細胞を含有する４ｍｌ氷冷細胞培地に加えた。ファージおよび細胞を、細胞の塊状化を防ぐために時々混合しながら氷上で２時間インキュベートした。結合していないまたは結合の弱いファージを、氷冷ＰＢＳ中で５回洗浄することによって除去した。次に、ファージを、細胞を培地中、３７℃でインキュベートすることによって内部移行させた後、細胞の外側に結合したファージを、低ｐＨの細胞ストリッピングバッファー中４℃で５分の洗浄工程で除去した。次に、これらの細胞を、トリメチルアミンを用いて溶解させて内部移行したファージを採取した。ストリッピング画分と内部移行画分の両方をトリスバッファーで中和した後、大腸菌(E.coli)感染に用いた。ファージ生産物を、組換えタンパク質でのパンニング選択に関して記載したように分析した。
実施例７．標的結合のためのアッセイ
ＰＭＳＡと結合し得る特異的ＶＨを同定するために、種々の選択からのＶＨを下記のアッセイのうち１以上でスクリーニングした。
ａ）結合ＥＬＩＳＡ
ライブラリーの選択後、特異的ＶＨ抗体を、(Antibody Engineering, Benny Lo編, chapter 8, p161-176, 2004)に従ってファージＥＬＩＳＡによって同定した。標的タンパク質および対照としての無関連抗原に対してファージＥＬＩＳＡを行った。いくつかの場合では、ＶＨドメインの精製または未精製抽出物を、ファージＥＬＩＳＡを用いる代わりにＥＬＩＳＡによってアッセイした。これらの場合では、細菌原形質周辺抽出物または精製ＶＨを使用した。
小規模細菌原形質周辺抽出物を、ディープウェルプレートで増殖させた１ｍｌの培養から調製した。開始培養物を用い、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら、０．１％（ｗ／ｖ）グルコース＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２倍ＴＹ培養液（Ｍｅｌｆｏｒｄカタログ番号Ｍ２１３０）を含有する９６ウェルディープウェルプレート（フィッシャー、カタログ番号ＭＰＡ−６００−０３０Ｘ）に接種した。ＯＤ６００が０．６〜１に達した際に、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）およびアンピシリンを添加した１００μｌの２倍ＴＹを添加することによってＶＨ生産を誘導し、培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。３２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって大腸菌をペレットとし、上清を廃棄した。細胞ペレットを穏やかなピペット操作により３０〜１００μｌの氷冷抽出バッファー（２０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０）に再懸濁させた。細胞を氷上で３０分間インキュベートした後、４℃にて１５分間４５００ｒｐｍで遠心分離した。上清をポリプロピレンプレートに移し、Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳブロッキング溶液中でのインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡに使用した。
原形質周辺抽出物のＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー精製のためにＶＨ Ｃ末端 ６×ＨＩＳタグを使用することによって精製ＶＨを得た。各ＶＨの開始培養物を、２％（ｗ／ｖ）グルコース＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した５ｍｌ ２倍ＴＹ培養液（Ｍｅｌｆｏｒｄカタログ番号Ｍ２１０３）中、３０℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。次に、５０μｌのこの一晩培養物を用いて、２％（ｗ／ｖ）グルコース＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した５０ｍｌ ２倍ＴＹに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながらおよそ６〜８時間（ＯＤ６００＝０．６〜１．０まで）インキュベートした。その後、培養物を３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する５０ｍｌの新鮮な２倍ＴＹ培養液に再懸濁させた。次に、振盪フラスコを一晩、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養物を再び３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを穏やかなピペット操作により１ｍｌの氷冷抽出バッファー（２０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０）に再懸濁させた後、さらに１．５ｍｌの１：５希釈した氷冷抽出バッファーを加えた。細胞を氷上で３０分間インキュベートした後、４℃、１５分間４５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、イミダゾール（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｉ２３９９−終濃度１０ｍＭ）およびＰＢＳバッファーで予め平衡化した０．５ｍｌのニッケルアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｉ−ＮＴＡ ５０％ ｓｏｌｎ、カタログ番号３０２１０）を含有する５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。ニッケルアガロースビーズへのＶＨの結合を穏やかに振盪しながら４℃で２時間進行させた。次に、ニッケルアガロースビーズをポリプレップカラム（ＢｉｏＲａｄカタログ番号７３１−１５５０）に移し、重力流により上清を廃棄した。次に、カラムを５ｍｌのＰＢＳ＋０．０５％ツィーン（商標）で３回洗浄した後、２０ｍＭ濃度のイミダゾールを含有する５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、２５０ｍＭ濃度のイミダゾールを含有する２５０μｌのＰＢＳの添加により、ＶＨをカラムから溶出させた。次に、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０８５３−０１）を用いてバッファー交換した後、１ｍｌのＰＢＳで溶出させることによってイミダゾールを精製ＶＨ調製物から除去した。精製ＶＨの収量は分光光度的に見積もり、純度はＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて評価した。
あるいは、抗ＰＳＭＡ ＶＨは、Ｗ３１１０大腸菌の上清からｐＪＥｘｐｒｅｓｓベクターを用いて精製した。この手順のために、最大４００ｍｌの培養物をＴＢ培地中、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧで一晩誘導した。得られた上清を採取し、ＶＨを、Ｎｉ−セファロースエクセルカラム（ＨｉＳｃａｌｅ １６、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ上で精製した。精製ＶＨの収量は分光光度的に見積もり、純度はＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて評価した。
未精製または精製ＶＨに関する結合ＥＬＩＳＡは、従前に記載した血清ＥＬＩＳＡおよびファージＥＬＩＳＡと同様であり、主に最終検出工程が異なった。簡単に述べれば、ＰＢＳ中０．１〜２μｇ／ｍｌで５０μｌ容量を加え、４℃で一晩インキュベートすることによって抗原をＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ ４４３４０４）上に固定化した。コーティング後、抗原溶液を吸引し、これらのプレートを、０．０５％ツィーン（商標）２０（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ１３７９）を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ錠剤、オキソイド カタログ番号ＢＲ００１４Ｇから調製）を用いて洗浄した後、ツィーン（商標）２０を添加しないＰＢＳで洗浄した。非特異的タンパク質相互作用をブロッキングするために、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ（商標））の溶液をウェルに加え、このプレートを少なくとも１時間室温でインキュベートした。３％Ｍａｒｖｅｌ（商標）／ＰＢＳ中の原形質周辺抽出物の希釈液をポリプロピレンチューブまたはプレートに調製し、少なくとも１時間室温でインキュベートした後、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに移し、そこでさらに少なくとも１時間インキュベーションを行った。次に、結合していないタンパク質を、ＰＢＳ／ツィーン、次いでＰＢＳでの反復洗浄を用いて洗い流した。次に、ＰＢＳ／３％Ｍａｒｖｅｌ中に１：５０希釈で調製したＨＲＰコンジュゲート抗Ｍｙｃ Ａｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚカタログ番号ＳＣ−４０）の溶液を各ウェルに加え、さらに室温で少なくとも１時間インキュベーションを行った。結合していない検出抗体を、ＰＢＳ／ツィーン（商標）およびＰＢＳを用いて反復洗浄することによって除去した。次に、ＥＬＩＳＡを、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０４４０）を用いて現像し、１０分後に０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３２０５０１）の添加によって反応を停止させた。吸光度を、４５０ｎｍでの読み取りによって決定した。
ｂ）ＦＭＡ直接細胞結合アッセイ
大腸菌からの原形質周辺抽出物を、マイクロウェルの底部に設置したビーズまたはセルに局在した蛍光を検出する蛍光に基づくプラットフォームとしてのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）(Dietz et al., Cytometry 23: 177-186 (1996), Miraglia et al., J. Biomol. Screening 4: 193-204 (1999)を用いてＰＳＭＡ結合ＨｉｓタグＶＨに関してスクリーニングした。ＣＨＯ ＴＲＥＸヒトおよびカニクイザル細胞株は、標準的な手順を用い、全長ヒトおよびカニクイザルＰＳＭＡを用いて自家作製した。ＬｎＣＡＰ細胞はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
ペリプレップを、ＦＭＡＴ直接結合アッセイでＣＨＯ親細胞と結合せずに、ＣＨＯヒトＰＳＭＡ、ＣＨＯ ｃｙｎｏ ＰＳＭＡおよびＬｎＣＡＰ細胞と特異的に結合したＶＨの存在に関して単一点スクリーニングにより試験した。細胞を、ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＦＭＡＴアッセイバッファー（ｐＨ７．４）中に０．１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、その細胞懸濁液に１２０ｎＭ ＤＲＡＱ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号６２２５１）を加えた。ペリプレップ（１０μｌ）を３８４ウェル黒色透明底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６５５）に移し、１０μｌの６ｎＭマウス抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号０５−９４９）／１２ｎＭヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓカタログ番号１１５−５４５−０７１）ミックスを加えた。次に、ＤＲＡＱ５染色細胞（２０μｌ／ウェル）を加え、これらのアッセイプレートを２時間室温でインキュベートした。プレートを４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起した後、ＴＴＰミラーボールプレートリーダーにてＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルで読み取った。データはＦＬ５周囲長にゲートを設定し、ゲーティングデータのピーク強度およびＦＬ２中央平均蛍光強度をＶＨ結合の決定に用いた。
力価測定については、末端Ｈｉｓタグによって精製したＶＨをＦＭＡＴアッセイバッファーで連続希釈した後、上記のように結合を測定した（図１６）。改善した一価変異体は、親ＶＨと同等の特性を示す（図１６ｂおよび１６ｃ）。二重パラトープ性結合分子もまた試験し（１６ｄおよびｅ）、ヒトＰＳＭＡ ＣＨＯ細胞との良好な結合を示した。以下の表は、同定されたＶＨ系列の種々のＣＤＲ３配列をそれらの結合の特徴とともに示す。用いたリンカー長は（Ｇ４Ｓ）６であった。下表は、同定されたＶＨ系列の種々のＣＤＲ３配列をそれらの結合特徴とともに示す。
上記で同定した各個のＶＨクローンをファージミドから配列決定し、ＶＨ生殖細胞系およびＣＤＲ３アミノ酸類似性に基づいて個別の系列に分類した。代表的なクローンをさらに特性決定した。生殖細胞系変異体を含む変異体を、親クローン、例えば、１．１および２．１の標準的方法により作製した。図１は、本明細書で上記したように単離され、単一系列に分類されたクローン１．１〜１．２０の配列を示す。クローン１．８〜１．２０は、１．１の変異体である。図２は、本明細書で上記したように単離され、単一系列に分類されたクローン２．１〜２．２５の配列を示す。クローン２．２、２．１１〜２．１９、２．２２〜２．２５は２．１の変異体である。図３は、本明細書で上記したように単離され、単一系列に分類されたクローン３．１〜３．２４の配列を示す。クローン３．２０〜３．２５は３．１の変異体である。
実施例８−Ｖ Ｈ の特性決定
ａ）抗ＰＭＳＡの特異性
標的抗原に対する個々のＶＨの特異性は、実施例７（ａ）に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡにより確認した。ＶＨをＰＭＳＡとの結合に関して試験し、無関連タンパク質と交差反応しないことが示された。
ｂ）Ｏｃｔｅｔを用いた結合動態およびエピトープ結合の測定
精製抗ＰＳＭＡ ＶＨ抗体の結合動態は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４装置で測定した。組換えＰＭＳＡを酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−１０６９）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、アミンカップリング化学（ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリング、ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−１０６７および１８−１０３３）を用いてＡＲＧ２Ｇバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−５０９２）にカップリングした後、エタノールアミン（ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号１８−１０７１）で急冷した。次に、抗ＰＳＭＡ ＶＨ抗体の結合動態を、各ＶＨ抗体を希釈系（一般に、最高濃度のＶＨ１５μｇ／ｍｌで始める１：２希釈系）として調製した後、ＰＳＭＡカップリングバイオセンサーへの種々のＶＨ濃度の結合を測定することによって決定した。その後、ＶＨ結合動態を、（ブランク減算）センサーグラムトレースから１：１結合モデルおよびＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウエアを用いて決定した。１〜１５０ｎＭおよびナノモル未満の範囲の結合親和性が検出され、結合パラメーターの例を以下の表２１に示す。
さらなる系列メンバー、特に、親分子の変異体も、０．３７５μｇ／ｍｌで始め、１：２希釈系を用いて以下のように試験した。表２２および２３に示されるように、ナノモルおよびピコモル範囲の結合親和性が検出された。
実施例７のように、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｃ末端Ｈｉｓタグによる）を用いて原形質周辺抽出物から精製した単一ドメイン抗体も試験した。結果を下表に示す。ナノモル範囲の結合親和性が検出された。
ｃ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いたカニクイザルＰＳＭＡ結合ＶＨの内部移行の測定
精製ＶＨの内部移行を、ｐＨ感受性蛍光色素ｐＨｒｏｄｏ（商標）グリーンを用いて測定した。抗Ｈｉｓ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号０５−９４９）を製造者の説明書に従ってｐＨｒｏｄｏ（商標）グリーンＳＴＰエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号Ｐ３５３６９）で標識した。総てのサンプルおよび試薬を、ＰＢＳおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含有する内部移行バッファー（ｐＨ７．４）で調製した。カニクイザルＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞を０．１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、その細胞懸濁液に１２０ｎＭ ＤＲＡＱ５を加えた。ＶＨ（１０μｌ）を３８４ウェル黒色透明底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６５５）に移し、１０μｌの４０ｎＭ ｐＨｒｏｄ（商標）グリーン標識抗Ｈｉｓ抗体、次いで、２０μｌのＤＲＡＱ５染色細胞を加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした後、室温に平衡化した。ＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルでの蛍光放出を、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起した後に、ＴＴＰミラーボールプレートリーダーで測定した。データはＦＬ５周囲長にゲートを設定し、ゲーティングデータのピーク強度およびＦＬ２中央平均蛍光強度をＶＨ内部移行の決定に用いた（図１７）。
単一ドメイン抗体１．１および１．２の変異体の内部移行は、連続希釈したＶＨをｐＨｒｏｄｏ（商標）グリーン標識抗Ｈｉｓ抗体とともに室温で３０分間プレインキュベートした後にＤＲＡＱ５染色ＣＨＯヒトＰＳＭＡクローン１Ａ１０細胞（２０μｌ）を加えたこと以外は、上記の通りにｐＨ感受性蛍光色素ｐＨｒｏｄｏ（商標）グリーンを用いて測定した。プレートを２時間室温でインキュベートした後、蛍光放出を測定した。このアッセイにおけるＶＨの活性を以下の表２５に示す。
ｄ）Ｈｉｓ−ＺＡＰアッセイを用いたＰＳＭＡ結合ＶＨの内部移行の測定
ＨｉｓタグＰＳＭＡ結合ＶＨの内部移行を、サポリン毒素にコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ−ＺＡＰ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＩＴ５２）を用いて評価した。このＨｉｓ−ＺＡＰ試薬はＶＨと結合し、細胞表面のＰＳＭＡとのＶＨ相互作用を介して内部移行を受ける。サポリン毒素はエンドソーム内の複合体から放出され、リボソームを不活化し、やがて細胞死をもたらす。
マウスまたはカニクイザルＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞（３０μｌ容量中、４００細胞／ウェル）を３８４ウェル黒色透明底組織培養処理アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３７１２）中の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌブラストサイジン、３００μｇ／ｍｌゼオシン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＨａｍｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｎ６６５８）培地に播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。精製したＶＨを培地で連続希釈した後、等容量の４０ｎＭ Ｈｉｓ−ＺＡＰを加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＶＨ／Ｈｉｓ−ＺＡＰサンプル（１０μｌ）を細胞アッセイプレートに移し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４８時間インキュベートした。データの正規化のために各プレートについてＨｉｓ−ＺＡＰ対照ウェル（細胞とＨｉｓ−ＺＡＰ試薬）およびバックグラウンド対照（培地のみ）を設定した。細胞生存率は、４８時間のインキュベーションの後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７１）を製造者の説明書に従って用いて決定した。相対的発光シグナル（ＲＬＵ）を、ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーを用いて測定した。データは、細胞の不在下で得られたＲＬＵシグナルの減算により正規化し、Ｈｉｓ−ＺＡＰ対照ウェルのバックグラウンド補正シグナルのパーセンテージとして表した（図１８）。
ＬｎＣＡＰアッセイについては、細胞（１００μｌ容量中、２０００／ウェル）を９６ウェルＴＣ処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３３４０）中、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に播種した。精製したＶＨを培地で連続希釈し、等容量の６０ｎＭ Ｈｉｓ−ＺＡＰを加えた。３７で℃３０分間インキュベートした後、ＶＨ／Ｈｉｓ−ＺＡＰサンプル（１００μｌ）を細胞アッセイプレートに移し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で９６時間インキュベートした。細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイを用いて測定し、データを上記のように分析した。例を図１９に示す。
単一ドメイン抗体１．１および２．１の変異体がサポリンコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体とともに内部移行して毒素により媒介される細胞死をもたらす能力を決定した。アッセイは、ヒトＰＳＭＡアッセイにＣＨＯヒトＰＳＭＡクローン１Ａ１０細胞を使用し、プレートをＣＯ２インキュベーターにて３７℃で７２時間インキュベートした後に細胞生存率を測定したこと以外は、上記の通りに行った。このアッセイで試験した単一ドメイン抗体の活性を以下の表２６に示す。
二重パラトープ性分子を試験したところ、下記のＥＣ５０値を示した。
実施例９−Ｖ Ｈ の安定性
種々のＣＤＲ３系列からのＶＨを、現像性特徴に関して試験した。
ａ）熱安定性：ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー
精製したＶＨにサイズ排除クロマトグラフィーを行った。簡単に述べれば、精製したＶＨをＰＢＳバッファー中、４℃または４０℃のいずれかで０〜１４日間保存した後、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ １２５Å ＳＥＣカラムでの分離とともに、ＰＤＡ検出器（２８０ｎｍでの検出）を含むＷａｔｅｒｓ Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ ＵＰＬＣを用い、種々の時点で分析した。サンプルは１０μｌ容量で注入し、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋５％プロパン−１−オールを含有する移動相で、流速０．４ｍｌ／分にて流した。データを６分間収集し、開始時（Ｔ＝０）に存在するものに比べて保存後に残留する単量体のパーセンテージを計算した。親分子は高い安定性を示した。変異体もまた試験した。
これらのデータが非最適バッファー条件下で採集されたことに留意されたい。
種々のサンプル濃度：一価１．１変異体：５．０ｍｇ／ｍｌ
一価２．１変異体：３．５ｍｇ／ｍｌ
結果を下表に示す。
３５日までの一価単一ドメイン抗体の長期安定性もまた試験し、良好なプロフィールを示した。
ｂ）熱安定性：ミラーボール
精製したＶＨサンプルを０〜８日間４０℃でインキュベートした後、カニクイザルＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞に対する結合を、実施例７（ｂ）に詳説されるようなＦＭＡＴ直接結合アッセイを用いて試験した。供試した分子は良好な安定性を示した。
ｃ）均一時間分解蛍光(Homogenous Time Resolved Fluorescence)（ＨＴＲＦ）アッセイを用いたＶＨ血清安定性の評価
精製したＶＨをカニクイザル血清と混合し、０〜７日間（day）３７℃でインキュベートした。次に、サンプルを、ＨＴＲＦアッセイを用いてＳＭＡとの結合に関して評価した。簡単に述べれば、ＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４２３４−ＺＮ）を、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ−スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号２１９３５）を用いてビオチン化した。ＨＴＲＦ結合アッセイについては、総てのサンプルおよび試薬を、ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．４Ｍフッ化カリウを含有するムＨＴＲＦアッセイバッファーで調製した。ＶＨ（Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｍｙｃタグ）を黒色３８４シャローウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６７６）中、総アッセイ容量１０μｌの３ｎＭビオチン化ＰＳＭＡ、１．５ｎＭストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏカタログ番号６１０ＳＡＫＬＡ）および１０ｎＭ抗Ｍｙｃ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６４７（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号ＣＡ２２００ＡＦ６４７）とともに最低３時間、室温でインキュベートした。３３７ｎｍで励起した後に、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでの時間分解蛍光放出をＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーで測定した。
別の実験で、精製したＶＨを、３７℃で０〜７日間ヒト血清と混合した後、実施例７（ｂ）ＦＭＡＴ直接細胞結合アッセイに記載の通りに、ｈｕＰＳＭＡ ＣＨＯ １Ａ１０細胞との結合に関して評価した。得られたデータを示し、ＥＣ５０値を以下の表２９および３０に示す。
種々の二重パラトープ性組合せの血清安定性を評価するために、精製した二重パラトープ性ＶＨを３７℃で０〜７日間ヒト血清と混合した後、実施例７（ｂ）ＦＭＡＴ直接細胞結合アッセイに記載のとおりにｈｕＰＳＭＡ ＣＨＯ細胞との結合に関して評価した。表３１は、細胞結合に関するＥＣ５０値を示す。
ｄ）ＶＨ熱安定性の評価
示差走査熱量測定(Differential scanning calorimetry)（ＤＳＣ）は、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−キャピラリーＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて行った。ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌの ３００μｌのタンパク質を、１０〜９０℃の間で、６０℃／分の走査速度を用いて流した。ＭｉｃｒｏＣａｌソフトウエアを用いてデータを分析した。結果は、一価単一ドメイン抗体に関して表３２に示し、二重パラトープ性結合分子に関して表３３に示す。
実施例１０ マウスにおけるイメージング試験
ＶＨをマウスに注射した（半減期が延長したＶＨ１．１、ＶＨ２．１およびＶＨ２．１）。マウスはＰＳＭＡ陽性（＋）およびＰＳＭＡ陰性（−）腫瘍を含む。試験は次のように行った：
・マウスごとの約１００ＭＢｑのＴｃ−９９ｍ注射活性
・５分、３０分、６０分、３時間、６時間および２４時間の時点でのＳＰＥＣＴ／ＣＴ
・種々の時点に関して生成された画像
・イメージング後のｅｘ ｖｉｖｏ生体分布およびオートラジオグラフィー
・陰性対照ＶＨ（αＨＥＬ４）
半減期延長ＶＨは、下記の配列を有する抗マウス血清アルブミン（抗ＭＳＡ）ＶＨを含んでなる：
これらの試験は、ＰＳＭＡ＋腫瘍に対して、特に、対照モノクローナルＩｇＧ抗ＰＳＭＡ抗体に比べて、高レベルの特異的腫瘍標的化、より速い浸透および注射用量のより多い蓄積を示した。これはＶＨの半減期を延長することによりさらに改善され得る。さらに、データは、裸のＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨの迅速なクリアランスを示す。
実施例１１ エピトープマッピング
互いに対するＰＳＭＡ結合ＶＨのタンデムエピトープマッピングを、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４を用いて行った。次に、ＶＨ結合をセンサーグラムトレースから、１：１結合モデルおよびＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウエアを用いて決定した（参照センサーを減算）。実施例８ｂも参照。エピトープビニング結果を表３３に示す。いくつかのクローンは部分的遮断を示した。
さらなる実験では、単一ドメイン抗体１．１と２．１の間のエピトープ競合をさらに特性評価した。アミンカップリング第二世代キット（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用い、ＰＳＭＡをＡＲ２Ｇバイオセンサーに結合させた後、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４を用いて行うエピトープビニング実験に使用した。これらの実験では、各ＶＨを４μｇ／ｍｌ濃度に希釈した。バイオセンサーにはＶＨを負荷しないか、または２．１もしくは１．１のいずれかをＰＳＭＡに対する結合が飽和レベルに達するまで負荷した。次に、これらのセンサーを短時間ＰＢＳ／ツィーンに浸した後、第２の結合工程を行った。第２の結合工程は、同じＶＨを単独でまたは２．１と１．１の両方を含有するウェルにバイオセンサーを浸すことを含んだ。後の組合せに第１のＶＨが存在することが、そのＰＳＭＡ結合部位の飽和が続いていたことを保証した。次に、結合プロフィールを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウエアを用いて調べた。得られたこれらのデータは、単一ドメイン抗体２．１および１．２がＰＳＭＡ上の異なるエピトープに結合することを示す。
実施例１２イメージング研究
これらの研究に以下の構築物を供試した。
Ｖ Ｈ ２．１
Ｖ Ｈ ２．１−ＨＩＳ． １．２ｍｇ／ｍｌ
配列：
Ｖ Ｈ １．１
Ｖ Ｈ １．１−ＨＩＳ
配列：
Ｈｅｌ４
ＨＥＬ−４−ＨＩＳ
配列：
ＶＨ２．１−ＶＨ２．１
ＶＨ２．１−６ＧＳ−ＶＨ２．１
配列：
ＶＨ２．１−ＶＨ１．１
ＶＨ２．１−６ＧＳ−ＶＨ１．１
配列：
本研究で使用した総てのＶＨドメインは大腸菌で発現させた。これらのタンパク質を濾過上清から実施例７ａに記載のようにニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を精製した。保存バッファーへのバッファー交換後、回転濃縮器を用いていくつかのタンパク質を濃縮した。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ＳＥＣを用いて分析した。ＰＳＭＡに対する結合を、組換えタンパク質および／またはＰＳＭＡを発現する細胞を用いて確認した。安定性は、タンパク質を長期間（一晩〜４週間の範囲）４０℃に加熱し、タンパク質分解の程度を測定することによって確認した。タンパク質のアリコートを使用まで−８０℃で保存した。
ＰＳＭＡ発現細胞株において対象ＶＨ（一価、二価および二重パラトープ性形式）と内部移行ＬＡＭＰ−１のマーカー（染色リソソーム）およびＥＥＡ−１のマーカー（染色初期エンドソーム）の間の同時局在の存在を調べるための共焦点蛍光顕微鏡法。ＰＳＭＡと結合するＩｇＧ水準抗体を陽性対照として使用した。結果を図２０〜２４に示し、二価および二重パラトープ性ＶＨ構築物の内部移行の改善を示す。
試験プロトコール
使用した細胞株は、ＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ ｈｕＰＳＭＡ細胞株であった。
１）試験前日にＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ ｈｕＰＳＭＡ細胞をＰＳＭＡ発現のためにテトラサイクリンで誘導し、カバーガラスに播種した。
２）翌日、細胞を、５００ｎＭの試験ＶＨ（それらの一価、二価または二重パラトープ性形式のいずれか）を含んでなる培地または陽性対照とともにインキュベートした。
３）サンプルをまず氷上で３０分間インキュベートして内部移行を遮断し、次に、室温で１０分間、４％ＰＦＡで固定した後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。二反復のサンプルをさらに３７℃で２時間インキュベートして、内部移行を誘発した後に固定した。
４）固定後、サンプルにバッファーで透過処理を施した。
５）陽性対照とともにインキュベートした細胞を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．０５％ツィーン中で１：２０００希釈した抗ヒト４８８抗体を用いて１時間染色した後、ＰＢＳ＋０．０５％ツィーン中で３回洗浄した（各５分）。
６）一価または二価／二重パラトープ性試験ＶＨとともにインキュベートした細胞を、一次抗ＨＩＳ抗体（マウス）を用いて１時間染色した後、洗浄し、その後、二次抗マウス４８８抗体で１時間インキュベートした後、洗浄した。
７）リソソームおよびエンドソームを初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ−１）またはリソソーム膜抗原１（ＬＡＭＰ−１）のいずれかに対する一次抗体（両方ともウサギ）を用いて１時間染色した。細胞をさらに室温で抗ウサギ６４７二次抗体とともに１時間インキュベートした後、洗浄した。
８）総てのサンプルはまた、ＨＯＥＣＨＳＴ １：１０００（０．５μｇ／ｍｌ）での５分間染色した後、洗浄した。
９）カバーガラスをすりガラス端スライドにかけ、ＮＩＫＯＮ Ａ１ Ｒ共焦点システムを用いて画像を得た。
写真は、プログラムＮＩＳ−ＥＬＥＭＥＮＴＳ ＡＲを用いて撮影した。
使用したレーザー線は、４０７．７ｎｍ（ＨＯＥＣＨＳＴ）、４８７．７ｎｍ（ＶＨ／モノクローナルベンチマーク）、６３９．７（ＬＡＭＰ−１、ＥＥＡ−１）であった。
対物レンズ：Ａｐｏ ６０× Ｏｉｌ ＡＳ ＤＩＣ Ｎ２
共焦点モード： Ｐｉｎｈｏｌｅ Ｓｉｚｅ（μｍ）：３９．６、Ｚステップ：０．４９μｍ。
さらなるイメージング研究を、ヒトＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞（１５０００／ウェル）を用いて行い、９６ウェルポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ４７０７）コーティングプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ６００５５５０）の、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｐｇ／ｍｌブラストサイジン、３００μｇ／ｍｌゼオシン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｐｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＨａｍｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ｎ６６５８）培地中に播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。ＶＨをプレートに加え、４℃で３０分間、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．５％サポニンで透過処理を施した。内部移行したＶＨは、抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０５−９４９）および抗マウスＡＦ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １１５−５４５−０９８）での染色によって検出した。リソソームは、ＬＡＭＰ−１（Ａｂｅａｍ Ａｂ２４１７０）および抗ウサギＡＦ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １１ １−６０５−００８）で染色した。核は、ヘキストステイン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈ３５７０）を用いて染色した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００を用いてプレートをイメージングし、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて画像を処理した。結果を図２５に示す。
実施例１３ 結合分子にコンジュゲートされたＭＭＡＥ毒素のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効力
ＭＭＡＥ毒素コンジュゲートＶＨの、ＰＳＭＡ発現細胞内へ内部移行して細胞死滅をもたらす能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを用いて決定した。
ヒトＰＳＭＡを安定に発現するヒト細胞（ＤＵ−１４５、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８１）または適合するＰＳＭＡ陰性細胞を、３８４ウェル黒色透明底組織培養処理アッセイプレートの、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１倍ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に３０００細胞／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を、連続希釈したＭＭＡＥ毒素コンジュゲートＶＨとともに４８時間または７２時間インキュベートした。データの正規化のために各プレートについて非処理対照ウェル（毒素コンジュゲートＶＨの不在下の細胞）およびバックグラウンド対照ウェル（培地のみ）を設定した。細胞死滅は、インキュベーション後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１）を製造者の説明書に従って用いて決定した。相対的発光シグナル（ＲＬＵ）を、ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーを用いて測定した。データは、バックグラウンド対照ウェルで得られたＲＬＵシグナルの減算により正規化した後、非処理対照ウェルの％（生存率％）として表した。図２６は、代表的試験（４８時間インキュベーション）で、ヒトＰＳＭＡ発現ヒト細胞株および適合する親（すなわち、非トランスフェクト）ＰＳＭＡ陰性細胞株を用いて得られた用量応答曲線を示す。ＭＭＡＥコンジュゲート構築物について得られたＩＣ５０値および最大％細胞死滅を表２０にまとめた。ＨｉＰＥＧ（商標）技術（ＷＯ２００９／０４７５００；Cong et al., (2012) Bioconjugate Chem. 2012, 23, 248-263）を用い、クレシェンドのＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）ＶＨをＭＭＡＥにコンジュゲートし、陽性ＡＤＣ対照はＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ（商標）技術（ＷＯ２０１６０６３００６；ＷＯ２００５／００７１９７；Balan et al., (2007) Bioconjugate Chem., 18, 61-76）を用いて作製した。抗ＰＳＭＡ−ＭＭＡＥコンジュゲートＶＨは、ＰＳＭＡ陽性細胞を特異的に死滅させ、ＰＳＭＡ陰性対照細胞株に関して最小細胞死滅が見られた。ＰＳＭＡの異なるエピトープを標的とする２つのＶＨからなる二重パラトープは、一価または二価ＰＳＭＡＶＨ構築物よりも有効であった。ＤＵ１４５アッセイは４８時間および７２時間ＨＤＣインキュベーションで行った。これは測定ＩＣ５０値および最大死滅率％に影響を及ぼしたが、種々のＨＤＣ形式のランク付けに影響するとは思われなかった。スクリーニングについては、より高いスループットには４８時間インキュベーションが好ましかった。４８時間インキュベーションを用いた場合、供試した構築物に１００％細胞死滅に達したものは無かった（供試した最高濃度でも）。最大応答は約７０〜８５％で水平となった（表３４参照）。表３５はＩＣ５０値を示し、図２７は７２時間のインキュベーション時間を用いた場合に見られたより高い最大％細胞死滅を示す（ｎ＝１ データ）。
一価構築物に関して見られた効力の順序は、ＶＨ２．１＞ＶＨ１．１＞ＶＨ３．１であった。
ＶＨ２．１二価構築物は、ＶＨ２．１一価構築物のおよそ３倍の効力であると見られたが、より、二価構築物を用いた場合には、最大死滅率％は低下した。
ＶＨ１．１二価構築物は、ＶＨ１．１一価構築物のおよそ６分の１の効力であると見られた。
ＶＨ３．１二価構築物は、ＶＨ３．１一価構築物に匹敵する活性を有し、若干改善した最大死滅率％が見られた。
二重パラトープ性構築物におけるＶＨの順序は活性に影響を及ぼすことが判明し、２．５〜４．６倍の違いが見られた。配向（Ｎ−Ｃ）ＶＨ２．１−ＶＨ１．１の二重パラトープ性構築物は、配向ＶＨ１．１−ＶＨ２．１の場合よりも活性が低いと見られた。
リンカー長は、行った実験では、活性に及ぼす影響は最小である（１．２〜２．２倍）と見られた。しかしながら、供試した一部の構築物では、（Ｇ４Ｓ）６リンカー型がやや活性が高かった。
二重パラトープ性構築物は、一価構築物よりも向上した活性を示した。最も活性の高い二重パラトープ性は、最も活性の高い一価のおよそ７倍の活性であることが判明した。
最も活性の高い二重パラトープ性は、対照抗ＰＳＭＡ ｍＡｂの４．７分の１であったが、このｍＡｂのＤＡＲは４であり、一方、二重パラトープ性構築物のＤＡＲは１であった。総ての構築物が予想された効力を示し、毒素濃度に対してＩＣ５０を計算した場合、二重パラトープ性１．１−２．１ ＨＤＣは対照ＡＤＣに比べて匹敵する効力であった。
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）薬コンジュゲート（ＨＤＣ）の調製のための手順
コンジュゲーション試薬ＨｉＰＥＧ（商標）ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図２８）の保存溶液は、コンジュゲーション反応を行う前にＭｅＣＮで調製した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）の溶液（ＰＢＳ中０．９ｍｇ／ｍＬ；２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）をＨｉＰＥＧ（商標）ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ試薬（１．５当量／Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）；５％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ終濃度）と穏やかに混合し、２２℃で１９時間インキュベートした。１９時間後、コンジュゲーション反応物を等容量の６００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５と混合し、４℃に冷却した。１ｍｇ／ｍＬ ＮａＢＨ４溶液の保存溶液は、０．１Ｍ ＮａＯＨで調製した。各２アリコートのＮａＢＨ４溶液（１０当量／試薬）を、添加間を３０分空けて、冷却したコンジュゲーション反応物に加えた。さらに３０分間隔の後、粗混合物を、ＴＯＳＯＨ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｓカラムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により精製した。サンプルを結合させ、カラム上で５０ｍＭリン酸ナトリウム（２Ｍ ＮａＣｌ）、ｐＨ７（バッファーＡ）を用いて洗浄し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（２０％ｖ／ｖイソプロパノール）、ｐＨ７（バッファーＢ）の勾配を用いて溶出させた。モノロード(mono-loaded)産物を含有する画分をプールし、５ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を用いて濃縮した。濃縮した画分を、ＰＤ１０カラムを用いてＤＰＢＳへバッファー交換し、バッファー交換材料を、０．２μｍＰＶＤＦシリンジ濾過装置を用いて無菌濾過した。
ＨｉＰＥＧ ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ部分を、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを介してＶＨに結合される。２つのヒスチジンは各「弾頭」毒素分子の結合のために必要とされる。Ｈｕｍａｂｏｄｙ ＶＨ、ＤＡＲ＝１種を細胞傷害性試験で使用するために精製し、いくつかの場合では、正確なＤＡＲ １は達成されなかった（下表参照）。本明細書の実施例では、単一ＭＭＡＥ部分を結合させたが、複数の弾頭が可能である（ＤＡＲ＞１）。
薬物：抗体比（ＤＡＲ）３．５の対照ＡＤＣの調製のための手順
陽性対照抗体Ｐｒｏ＿００６は、ＵＳ８４７０３３０内に記載され、抗体００６として例示される、重鎖および軽鎖配列から構成される抗ＰＳＭＡ抗体である。
コンジュゲーション１：反応バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中、ｍＡｂ Ｐｒｏ＿００６（５．０７ｍｇ／ｍＬ）の溶液を１５分間４０℃に温めた。ＴＣＥＰ（５ｍＭ、２当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に加え、穏やかに混合し、４０℃で１時間インキュベートした。コンジュゲーション試薬ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図２９）の保存溶液をＤＭＦ中２．８ｍＭで調製した。還元したｍＡｂを２２℃に冷却し、反応バッファーで４．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（５．２５当量／ｍＡｂ）を加えた。コンジュゲーション混合物を２２℃で２時間インキュベートした。粗コンジュゲーション混合物を２２℃にて３０分間、５０ｍＭ／Ｖ−アセチル−Ｌ−システイン（試薬の２０当量超）で処理した。反応混合物に、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を用い、ＤＰＢＳに対するダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションを行ったＡＤＣ溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｕｒｅ Ｐ５０カラムを用いてＤＰＢＳへバッファー交換した。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価した（平均ＤＡＲ＝３．２１）。
コンジュゲーション２：反応バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ；２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５中、ｍＡｂ Ｐｒｏ＿００６（５．０７ｍｇ／ｍＬ）の溶液を１５分間４０℃に温めた。ＴＣＥＰ（５ｍＭ、２．７５当量／ｍＡｂ）をｍＡｂ溶液に加え、穏やかに混合し、４０℃で１時間インキュベートした。コンジュゲーション試薬ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図２９）の保存溶液をＤＭＦ中４．０ｍＭで調製した。還元したｍＡｂを２２℃に冷却し、反応バッファーで４．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（７当量／ｍＡｂ）を加えた。コンジュゲーション混合物を２２℃で２時間インキュベートした。粗コンジュゲーション混合物を２２℃にて３０分間、５０ｍＭ／Ｖ−アセチル−Ｌ−システイン試薬の２０当量超）で処理した。反応混合物に、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を用い、ＤＰＢＳに対するダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションを行ったＡＤＣ溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｕｒｅ Ｐ５０カラムを用いてＤＰＢＳへバッファー交換した。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価した（平均ＤＡＲ＝４．５２）。
平均ＤＡＲ３．５のＡＤＣの生産： ＡＤＣ１（ＤＡＲ３．２１）およびＡＤＣ２（ＤＡＲ４．５２）を４：１モル比で混合して、間的なＤＡＲを有するＡＤＣを調製した。得られたサンプルを、０．２μｍＰＶＤＦシリンジ濾過装置を用いて無菌濾過した。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価した（平均ＤＡＲ＝３．４５）。
半減期延長ＨＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力
半減期延長ＨＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、ＤＵ１４５細胞死滅アッセイ（７２時間）を用いて評価した。
表３６に記載のこの材料は、ＨＤＣに半減期延長部分を付加する効果を試験するために作製した。半減期延長型（ＨＬＥ）は、ＭＳＡ結合ＶＨ（配列番号５２８）を用いて作製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力は、ＤＵ１４５細胞死滅アッセイを用いて評価した（７２時間）。図３０ＡおよびＢは、（Ａ）ＰＳＭＡを発現するＤＵ１４５細胞および（Ｂ）ＰＳＭＡを発現するように改変されていないＤＵ１４５親細胞の場合の、ＰＳＭＡ−ＤＵ １４５細胞傷害性アッセイ（７２時間）でのＩＣ５０値を示す：対照ＡＤＣ ｍＡＢ−ＭＭＡＥ（黒四角）、２．１ ６ＧＳ−１．１−ＭＭＡＥ二重パラトープ性（▲）、２．１−６ＧＳ−１．１−ＭＭＡＥ−ＨＬＥ半減期延長二重パラトープ性（▼）、ＨＥＬ４−ＭＭＡＥ一価（●）およびＨＥＬ４−ＨＬＥ−ＭＭＡＥ一価半減期延長（Ｉ）。

Claims (81)

  1. ヒトＰＳＭＡと結合し得る第１の単一ヒト重鎖可変免疫グロブリン（ＶＨ）ドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡと結合し得る第２の単一ＶＨドメイン抗体とを含んでなる、結合分子。
  2. 前記第１のＶＨドメインおよび前記第２のＶＨドメインがヒトＰＳＭＡ上の同じエピトープと結合する、請求項１に記載の結合分子。
  3. 前記第１の単一ＶＨドメイン抗体がＰＳＭＡ上の第１のエピトープと結合し、前記第２の単一ＶＨドメイン抗体がＰＳＭＡ上の第２のエピトープと結合し、前記第１のエピトープと前記第２のエピトープが同一でない、請求項１に記載の結合分子。
  4. 前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体が、配列番号３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  5. 前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体がＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含んでなり、前記ＣＤＲ１配列が、配列番号１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、かつ前記ＣＤＲ２配列が、配列番号２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項４に記載の結合分子。
  6. 前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体が、配列番号４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項４または５に記載の結合分子。
  7. 前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体が、配列番号８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  8. 前記第１または第２の単一ＶＨドメイン抗体がＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含んでなり、前記ＣＤＲ１配列が、配列番号８１またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、かつＣＤＲ２配列が、配列番号８２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有する、請求項７に記載の結合分子。
  9. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号８４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項７または８に記載の結合分子。
  10. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号１８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  11. 前記第１または第２のＶＨドメインがＣＤＲ１および２配列を含んでなり、前記ＣＤＲ１配列が、配列番号１８１またはそれと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなり、かつ前記ＣＤＲ２配列が、配列番号１８２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１０に記載の結合分子。
  12. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号１８４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項１０または１１に記載の結合分子。
  13. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２７９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  14. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２７７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号２７８またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項１３に記載の結合分子。
  15. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２８０またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項１３または１４に記載の結合分子。
  16. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２９５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  17. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２９３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号２９４またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列ＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項１６に記載の結合分子。
  18. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号２９６またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項１６または１７に記載の結合分子。
  19. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３０３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  20. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３０１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３０２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項１９に記載の結合分子。
  21. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３０４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項１９または２０に記載の結合分子。
  22. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３３１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  23. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３２９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３３０またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項２２に記載の結合分子。
  24. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３３２またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項２２または２３に記載の結合分子。
  25. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  26. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３６２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項２５に記載の結合分子。
  27. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項２５または２６に記載の結合分子。
  28. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  29. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３６６またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項２８に記載の結合分子。
  30. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６８またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項２８または２９に記載の結合分子。
  31. 前記第１および／または第２のＶＨドメインが、配列番号３７１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  32. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３６９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３７０またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項３１に記載の結合分子。
  33. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７２またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項３１または３２に記載の結合分子。
  34. 前記第１および／または第２のＶＨドメインが、配列番号３７５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の
    結合分子。
  35. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３７４またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項３４に記載の結合分子。
  36. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７６またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項３４または３５に記載の結合分子。
  37. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  38. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３７７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３７８またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項３７に記載の結合分子。
  39. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８０またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項３７または３８に記載の結合分子。
  40. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８３またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  41. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３８２またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項４０に記載の結合分子。
  42. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８４またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項４０または４１に記載の結合分子。
  43. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８７またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  44. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８５またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３８６またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項４３に記載の結合分子。
  45. 前記第１または第２のＶＨドメインが、を含んでなり、前記ＶＨドメインが、配列番号３８８またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項４３または４４に記載の結合分子。
  46. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３９１またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
  47. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３８９またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３９０またはそれと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の相同性を有する配列を有するＣＤＲ２配列とを含んでなる、請求項４６に記載の結合分子。
  48. 前記第１または第２のＶＨドメインが、配列番号３９２またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列を含んでなる、またはからなる、請求項４６または４７に記載の結合分子。
  49. 前記第１および第２のＶＨドメインが同じＶＨドメインである、請求項１、２および４〜４８のいずれか一項に記載の結合分子。
  50. ａ）第１の単一ＶＨドメイン抗体が請求項７〜１５、２２〜２４、２８〜３６、４３〜４５のいずれか一項に記載の単一ＶＨドメイン抗体から選択され、かつｂ）第２の単一ＶＨドメイン抗体が請求項４〜６、１６〜２１、３７〜４２のいずれか一項に記載の単一ＶＨドメイン抗体から選択される、請求項３に記載の結合分子。
  51. ａ）第１の単一ＶＨドメイン抗体が請求項７〜９のいずれか一項に記載の単一ＶＨドメイン抗体から選択され、ｂ）第２の単一ＶＨドメイン抗体が請求項４〜６のいずれか一項に記載の単一ＶＨドメイン抗体から選択される、請求項４記載の結合分子。
  52. 第１の単一ＶＨドメイン抗体がＣまたはＮ末端に位置する、請求項３または４に記載の結合分子。
  53. ａ）第１のＶＨドメインが、ＰＳＭＡとの結合に関して、配列番号４を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）と競合することができ、かつ／または配列番号４を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）とＰＳＭＡとの結合を交差遮断することができ、かつｂ）第２のＶＨドメインが、ＰＳＭＡとの結合に関して、配列番号７６を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）と競合することができ、かつ／または配列番号７６を含んでなるＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）とＰＳＭＡとの結合を交差遮断することができる、請求項３に記載の結合分子。
  54. 前記第１および第２のＶＨドメインがペプチドによって共有結合的に連結される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の結合分子。
  55. 前記ペプチドが３〜５０アミノ酸長の間である、請求項５４に記載の結合分子。
  56. リンカーがグリシンおよびセリンアミノ酸残基を含んでなる、請求項５４または５５に記載の結合分子。
  57. ペプチドリンカーが式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎからなり、式中、ｎ＝１〜１０である、請求項５６に記載の結合分子。
  58. 半減期延長部分を含んでなる、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の結合分子。
  59. 前記半減期延長部分が前記第１または第２のＶＨドメインに共有結合的に連結される、請求項５８に記載の結合分子。
  60. 前記半減期延長部分が、アルブミン結合部分、トランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのフラグメント、およびアルブミン結合ペプチドからなる群から選択される、請求項５９に記載の結合分子。
  61. 前記結合分子が細胞によって内部移行され得る、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の結合分子。
  62. 前記結合分子が細胞傷害性部分にコンジュゲートされる、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の結合分子。
  63. 前記結合分子が標識にコンジュゲートされる、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の結合分子。
  64. 前記結合分子が軽鎖を欠く、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の結合分子。
  65. 前記第１および第２のＶＨドメインが、軽鎖および重鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされ、かつ１以上のヒト重鎖遺伝子を有する導入遺伝子を発現するノックアウトマウスから得られるライブラリーから得られる、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の結合分子。
  66. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子と、医薬担体とを含んでなる医薬組成物。
  67. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含んでなる、前立腺癌または前立腺障害を治療するための方法。
  68. 薬剤として使用するための、１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項１〜６６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  69. 前立腺癌または前立腺障害の治療において使用するための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物。
  70. 前立腺癌または前立腺障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物の使用。
  71. 細胞傷害性部分を腫瘍細胞に送達するための方法であって、前記細胞を請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物に曝すことを含んでなる、方法。
  72. 患者におけるイメージング法で使用するための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物。
  73. 放射性標識化合物の調製のための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物の使用。
  74. １以上のＰＳＭＡ腫瘍または細胞をイメージングするための方法であって、１以上の腫瘍または細胞を有効量の請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物に接触させることを含んでなる、方法。
  75. 試験サンプルにおいてＰＳＭＡの存在を決定する、またはイムノアッセイによって腫瘍細胞を検出するための方法であって、前記サンプルを請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物および少なくとも１種類の検出可能な標識に接触させることを含んでなる、方法。
  76. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
  77. 請求項７６に記載の核酸分子を含んでなる構築物。
  78. 請求項７６に記載の核酸または請求項７７に記載の構築物を含んでなる宿主細胞。
  79. 請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物を含んでなる、キット。
  80. 宿主細胞において前記結合分子をコードする核酸を発現させること、および宿主細胞培養から前記結合分子を単離することを含んでなる、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子を作製するための方法。
  81. 対象が癌を有するか否かを決定する方法であって、前記対象に、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の結合分子または請求項６６に記載の医薬組成物を含んでなる組成物を投与すること、および対象の画像を取得すること、それにより対象が癌を有するか否かを決定することを含んでなる、方法。
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