BR112016020643B1 - Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos - Google Patents

Anticorpos específicos para receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e uso dos mesmos Download PDF

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Kristin Kemmerich
Arsalan S. Haqqani
Traian Sulea
Mehdi Arbabi-Ghahroudi
Bernard Massie
Rénald Gilbert
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Abstract

ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA TIPO 1 E USO DOS MESMOS. A barreira hematoencefálica (BHE) impede o transporte de moléculas maiores do que 500 Daltons do sangue para o cérebro. A transcitose mediada por receptor (RMT) facilita o transporte através da BHE de moléculas específicas que ligam os receptores em células endoteliais cerebrais que formam a BHE. Um anticorpo de ligação a receptor de fator de crescimento semelhante à Insulina tipo 1 (IGF 1R) ou fragmento do mesmo é identificado que transmigra a BHE por RMT. O anticorpo ou fragmento é usado para entregar uma molécula de carga através da BHE, em que a molécula de carga pode ser um agente terapêutico ou detectável. O anticorpo é um VHH de camelídeo preparado imunizando-se uma lhama com um polipeptídeo de IGF 1R com 933 aminoácidos. Formas humanizadas do VHH de camelídeo são também geradas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1, e usos dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 que transmigram a barreira hematoencefálica e usos dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer e Parkinson, são um fardo crescente na sociedade em envelhecimento porque não há atualmente nenhum tratamento eficaz para essas afecções incapacitantes. O tratamento assim como o diagnóstico precoce dessas e de outras doenças que se originam no cérebro permanecem desafiadores por que a maioria dos diagnósticos e moléculas terapêuticas adequadas não podem penetrar a barreira hematoencefálica (BHE) estreita e altamente restritiva (Abbott, 2013). A BHE constitui uma barreira física que é formada por células endoteliais cerebrais (BECs) que alinham os vasos sanguíneos e se conectam umas às outras através de junções estreitas (Abbott, 2013). As junções estreitas formadas entre as BECs são essenciais para a integridade da BHE e impedem o transporte paracelular de moléculas maiores do que 500 daltons (Da). Como as células endoteliais cerebrais exibem taxas de pinocitose muito baixas (Abbott, 2013), o transporte transcelular de moléculas maiores é limitado à trajetória de transcitose mediada por receptor altamente específico (RMT) e à transcitose mediada por adsorção com base em carga passiva (Abbott, 2013; Pardridge, 2002). Adicionalmente, a alta densidade de bombas de efluxo, tais como P-glicoproteína ou a proteína-1 de resistência a múltiplos fármacos (MDR-1), contribui para a remoção de substâncias indesejadas do cérebro (Abbott, 2013).
[003] Embora todas essas características protejam o cérebro de patógenos e toxinas, as mesmas igualmente impedem a entrada da maioria dos produtos terapêuticos. Na realidade, menos do que 5% dos produtos terapêuticos de moléculas pequenas e virtualmente nenhum dos produtos terapêuticos maiores podem atravessar a BHE em concentrações farmacologicamente relevantes (isto é, suficientes para engatar um alvo de sistema nervoso central (CNS) e obter resposta farmacológica/terapêutica) a não ser que os mesmos são especificamente ‘transportados’, isto é, acoplados a uma molécula transportadora. Devido à falta de ‘carreadores’ eficazes para transportar moléculas através da BHE, inúmeros fármacos contra doenças neurodegenerativas foram ‘arquivados’ ou eliminados do desenvolvimento adicional na medida em que os mesmos não podem ser entregues ao cérebro em quantidade suficiente.
[004] Diferentes abordagens para entregar moléculas maiores ao cérebro foram exploradas. Por exemplo, a integridade da BHE pode ser rompida, resultando em uma BHE vazada que, por sua vez, permite a entrada paracelular irrestrita de moléculas maiores no cérebro. Junções estreitas podem ser afrouxadas ou rompidas de modo bem-sucedido por várias abordagens. Por exemplo, a injeção de substâncias que induzem o choque osmótico (por exemplo, manitol, soluções hipertônicas) na corrente sanguínea causa encolhimento celular e resulta na ruptura das junções estreitas comprometendo severamente, assim, a BHE (Guillaume, 2010). Outros moduladores de junções estreitas incluem alquilgliceróis, bradicinina e diversos análogos dos mesmos, assim como vírus que modulam a expressão das proteínas envolvidas na manutenção das junções estreitas (Erdlenbruch et al., 2003; Preston et al., 2008; Gan et al., 2013). Uma ruptura mais localizada da BHE é possível através da aplicação de ultrassom (Nhan et al., 2013). Entretanto, esses períodos durante os quais a BHE é rompida são suficientes para alterar a homeostase cerebral e permitir que produtos químicos prejudiciais, toxinas e patógenos entrem no cérebro; isso pode resultar em sérios efeitos colaterais, por exemplo, convulsões ou inchaço do cérebro, infecção e alterações neuropatológicas possivelmente permanentes. Conforme seria evidente para aqueles versados na técnica, tratamentos repetidos com essas tecnologias para doenças do cérebro crônicas e difusas que afetam múltiplas regiões do cérebro não são práticos. A maioria desses tratamentos são custosos, necessitam de hospitalização, e algumas abordagens exigem anestesia.
[005] Outra abordagem para circundar a BHE é a injeção direta de moléculas terapêuticas no fluido cérebro-espinhal (CSF), no espaço do parênquima, ou outras partes do cérebro. Diversos métodos de entrega foram desenvolvidos, incluindo: entrega intracerebral (intraparenquimatoso), intraventricular e intratecal por meio da infusão ou bombas de difusão aprimorada por convecção (CED). Entretanto, qualquer tipo de injeção direta no cérebro ou implante intracerebral é um procedimento invasivo e custoso, na medida em que exige hospitalização, anestesia e frequentemente cirurgia. Além disso, as taxas de difusão pobres dos produtos terapêuticos, particularmente biologias maiores, dentro do parênquima do cérebro limitam a penetração dos produtos terapêuticos a apenas pequenas áreas que circundam o sítio de injeção/implantação. A colocação correta de injeções, cateteres e implantes é desafiadora, mas crucial para alcançar a difusão do fármaco à região alvejada do cérebro. Adicionalmente, cateteres e implantes fornecem um sítio para infecção e/ou resposta imunológica contra o material estranho.
[006] Em outra tentativa de aumentar a entrega através da BHE, fármacos CNS foram modificados para aumentar a absorção cerebral. Tais modificações podem incluir uma alteração de sua carga de superfície, uma redução no tamanho de molécula e alteração à lipofilicidade dos fármacos. Entretanto, quaisquer modificações para aumentar a penetração do cérebro são também prováveis de alterar a farmacologia geral do fármaco, incluindo sua atividade e/ou especificidade desejada. Adicionalmente, as moléculas lipofílicas são mais propensas a serem exportadas do cérebro através da bomba de efluxo de P-glicoproteína.
[007] Finalmente, os mecanismos de transporte endógenos através da BHE foram explorados. Os mecanismos fisiológicos que permitem o transporte de moléculas grandes através da BHE podem ser divididos nas trajetórias de transcitose mediada por receptor altamente específica (RMT) e de endocitose mediada adsortiva com base em carga não específica. A endocitose é ativada mediante a ligação do ligante específico a seu receptor ou mediante a interação eletrostática entre o ligante catiônico ou fármaco e os grupos funcionais aniônicos na superfície celular endotelial cerebral (lado luminal), respectivamente. Subsequentemente, o endossoma recém-formado é submetido à transcitose através da célula para o lado abluminal para liberar sua carga.
[008] Como a transcitose mediada adsortiva é uma interação mediada por carga não específica, a mesma ocorre em todos os órgãos e leitos vasculares, limitando a disponibilidade do fármaco para a entrega no cérebro. Portanto, explorar a trajetória de RMT permanece o único método de entrega cerebral fisiológico não invasivo, porém, altamente específico para receptor.
[009] Apenas alguns receptores são presentemente conhecidos por passar por RMT na BHE e ‘transportar’ através de seus ligantes naturais: o bem estudado receptor de transferrina (TfR), o receptor de insulina (IR), as proteínas relacionadas a receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LRP-1 e -2), receptor da toxina da difteria e TMEM30A. Peptídeos, ligantes naturais e anticorpos ou fragmentos de anticorpo foram desenvolvidos que se ligam a esses receptores (Pardridge et al., 1991; Yu et al., 2011; Muruganandam et al., 2001; Abulrob et al., 2005; Demeule, 2008; Sumbria et al., 2013), funcionando como transportadores de fármaco para o cérebro que utilizam trajetórias de RMT endógenas. Entretanto, até a data, apenas um único peptídeo (Angiopep ANG1005, LRP-1 de direcionamento) foi analisado em estudos clínicos de fase I, embora outros candidatos estejam sendo estudados em ambientes laboratoriais. A trajetória de RMT parece ser a trajetória mais promissora para o transporte de fármacos para o cérebro, mas as abordagens atuais têm limitações, incluindo: a expressão não seletiva do receptor alvo na BHE, a competição entre o carreador e os ligantes naturais ao receptor, transcitose ineficaz de um receptor assim como a degradação lisossômica de carreadores endocitados (Xiao e Gun, 2013). Peptídeos de ligação IGF1R foram descritos como parte de proteínas de fusão para mediar cruzar a barreira hematoencefálica em WO2011/15061, enquanto WO2011/044542 descreve fusões de anticorpos para uma carga atravessar a barreira hematoencefálica, em que o anticorpo pode, dentre outros, ser direcionado a IGF1R. Anticorpos especificamente ligando IGF1R em geral são conhecidos de, por exemplo, WO2011/066721.
[010] A falta de carreadores de BHE de alta capacidade e alta seletividade atrasa o desenvolvimento de novos produtos terapêuticos e diagnósticos para doenças que se originam no cérebro, incluindo tumores cerebrais e doenças neurodegenerativas. Há claramente uma necessidade de um método não invasivo para entregar moléculas diagnósticas e terapêuticas pequenas e grandes em doses farmacologicamente eficazes ao cérebro sem perturbar a fisiologia e a homeostase da BHE.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[011] A presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R) e usos dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 que transmigram a barreira hematoencefálica, e usos dos mesmos.
[012] A presente invenção fornece fragmentos de anticorpo isolados ou purificados que se ligam especificamente a um epítopo de Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R) em que o fragmento de anticorpo transmigra a barreira hematoencefálica, e em que o epítopo é especificamente ligado pelo anticorpo de SEQ ID NO:5. O epítopo de IGF1R pode estar no domínio extracelular de IGF1R e pode compreender a sequência FENFLHNSIFVPR (SEQ ID NO:11) ou fragmentos da mesma.
[013] A presente invenção fornece adicionalmente um fragmento de anticorpo isolado ou purificado que compreende: uma sequência de região determinante de complementaridade (CDR) 1 de GRTIDNYA (SEQ ID NO:1); uma sequência de CDR2 de IDWGDGGX (SEQ ID NO:2), em que X é A ou T; e uma sequência de CDR3 de AMARQSRVNLDVARYDY (SEQ ID NO:3), em que o fragmento de anticorpo se liga especificamente ao Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R). Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado compreende uma sequência de CDR2 de IDWGDGGA.
[014] Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado específico para IGF1R pode ser X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6 X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14 LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS (SEQ ID NO:4), em que X1 é E ou Q; X2é K ou Q; X3 é V ou E; X4 é A ou P; X5 é V ou S; X6 é D ou G; X7 é L ou R; X8 é F ou W; X9 é A ou S; X10 é A ou T; X11 é A ou S; X 2 é G ou N; X13 é ou L; X14 é N ou R; X15 é E ou R; X16 é P ou A; X17 é S ou Y; e X18 é Q ou L, ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma. Em exemplos não limitantes mais específicos, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFV ATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5), referida no presente documento como IGF1R-5; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEW VSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6), referida no presente documento como IGF1R-5_H1; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEW VATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYY CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), referida no presente documento como IGF1R-5_H2; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKGLEFV ATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8), referida no presente documento como IGF1R-5_H3; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREF VATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKGTMYLQMNSLRAEDTAVYS CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), referida no presente documento como IGF1R-5_H5; e EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFV STIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA MARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10), referida no presente documento como IGF1R-5_H6, ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma.
[015] O fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito acima pode ser um anticorpo de domínio único (sdAb); o sdAb pode ser de origem camelídea. O fragmento de anticorpo pode se ligar a um epítopo que compreende a sequência FENFLHNSIFVPR (SEQ ID NO:11).
[016] O fragmento de anticorpo isolado ou purificado da presente invenção pode ser apresentado em um formato de exibição multivalente. Em um formato de exibição multivalente, o fragmento de anticorpo pode ser ligado a um fragmento Fc; o fragmento Fc pode ser o Fc2b de camundongo ou Fc1 humano. Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado em exibição multivalente pode compreender a sequência de SEQ ID NO:42 (referida no presente documento como fusão de consenso de IGF1R-5-mFc) ou 43 (referida no presente documento como consenso de mFc-IGF1R-5), SEQ ID NO: 12 (referida no presente documento como IGF1R-5-mFc) ou 13 (referida no presente documento como mFc-IGF1R-5).
[017] O fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento, em qualquer formato, pode transmigrar a barreira hematoencefálica.
[018] A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento. Um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico como descrita é também fornecido.
[019] O anticorpo isolado ou purificado ou fragmento do mesmo conforme descrito no presente documento pode ser imobilizado em uma superfície.
[020] A presente invenção fornece adicionalmente o fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento ligado a uma molécula de carga; a molécula de carga pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 1 kD a cerca de 200 kDa. A molécula de carga ligada ao fragmento de anticorpo pode ser um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, um fator de crescimento, uma citocina, um coletor de receptor, um composto químico, uma porção química de carboidrato, uma enzima, um anticorpo ou fragmentos do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral ou um agente citotóxico; um ou mais lipossomas ou nanocarreadores carregados com um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, uma enzima, um anticorpo ou fragmentos do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral, ou um agente citotóxico; ou uma ou mais nanopartículas, nanofios, nanotubos ou pontos quânticos.
[021] Adicionalmente, a presente invenção fornece uma composição que compreende um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[022] Um método in vitro para detectar IGF1R é também fornecido, sendo que o método compreende: a) colocar uma amostra de tecido em contato com um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento ligado a um agente detectável; e b) detectar o agente detectável ligado ao fragmento de anticorpo ligado ao IGF1R na amostra de tecido.
[023] No método descrito acima, a amostra pode ser uma amostra de soro, amostra de tecido vascular, amostra de tecido tumoral, ou uma amostra de tecido cerebral de um indivíduo humano ou animal. No método conforme descrito, a etapa de detecção (etapa b)) pode ser realizada com o uso de formação de imagem óptica, imuno-histoquímica, formação de imagem diagnóstica molecular, ELISA, espectrometria de massa de formação de imagem ou outro método adequado.
[024] É adicionalmente fornecido um método in vivo para detectar a expressão de IGF1R em um indivíduo, sendo que o método compreende: a) administrar um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento ligado a um agente detectável ao indivíduo; e b) detectar o agente detectável ligado ao anticorpo ou fragmento do mesmo ligado ao IGF1R.
[025] No método descrito acima, a etapa de detecção (etapa b)) pode ser realizada com o uso de PET (tomografia por emissão de pósitrons), SPECT (tomografia computadorizada por emissão único fóton), formação de imagem de fluorescência ou qualquer outro método adequado.
[026] É presentemente fornecido um método para transportar uma molécula de interesse através da barreira hematoencefálica (BHE), sendo que o método compreende: a) administrar um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento ligado à molécula de interesse a um indivíduo, sendo que o fragmento de anticorpo isolado ou purificado transmigra a barreira hematoencefálica, em que o um ou mais do que um fragmento de anticorpo passa a molécula de interesse através da BHE. No método conforme recém-descrito, a molécula de interesse pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 1 kD a cerca de 200 kDa; a molécula de interesse pode ser um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, um fator de crescimento, uma citocina, um coletor de receptor, um composto químico, uma porção química de carboidrato, uma enzima, um anticorpo ou fragmento do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral ou um agente citotóxico; um ou mais lipossomas carregados com um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, uma enzima, um anticorpo ou fragmento do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral, ou um agente citotóxico; ou uma ou mais nanopartículas, nanofios, nanotubos ou pontos quânticos. No método conforme descrito, a administração pode ser intravenosa (iv), subcutânea (sc) ou intramuscular (im).
[027] A invenção também abrange um método para quantificar uma quantidade de uma molécula de carga entregue através da BHE de um indivíduo em que a molécula de carga é ligada a um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado, conforme descrito no presente documento, sendo que o método compreende: a) coletar o fluido cérebro-espinhal (CSF) do indivíduo; e b) usar métodos de proteômica direcionada para quantificar a quantidade da molécula de carga ligada a um ou mais do que um anticorpo isolado ou purificado ou fragmento no CSF.
[028] A molécula de carga pode ser qualquer molécula desejada, incluindo as moléculas de carga anteriormente descritas; o fragmento de anticorpo transmigra a BHE; e a molécula pode ser “ligada” ao fragmento de anticorpo, conforme anteriormente descrito. No método acima, o CSF é coletado a partir de um indivíduo com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. A quantidade de CSF exigida para o método de proteômica direcionada na etapa b) pode estar entre cerca de 1 a 10 μl. Os métodos de proteômica direcionada usados para quantificar a quantidade do um ou mais do que um fragmento de anticorpo ligado à molécula de carga pode ser qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, e sem ser limitante, o método de proteômica direcionada pode ser um método de espectrometria de massa, tais como monitoramento de múltiplas reações com padrões internos identificados com isótipo (MRM - ILIS).
[029] A entrega pobre de diagnósticos ou fármacos através da BHE estreita e altamente seletiva compromete o desenvolvimento de tratamentos para doenças cerebrais, tais como, porém, sem limitação, tumores cerebrais e doenças neurodegenerativas. A falta de carreadores para transportar moléculas através da BHE atrasa o desenvolvimento de novos terapêuticos e diagnósticos para tais doenças. Conforme descrito no presente documento, um VHH de ligação a IGF1R foi produzido que fornece uma plataforma de transporte eficaz para a entrega de fármacos conjugados ao anticorpo através da BHE a seus alvos no cérebro. Os fragmentos de anticorpo presentemente descritos exploram a trajetória de RMT natural do IGF1R do lado luminal para o abluminal das células endoteliais cerebrais que formam a BHE. Após a ligação do fragmento de anticorpo ao IGF1R, a RMT é iniciada, e o fragmento de anticorpo, juntamente com uma molécula conjugada (carga), é submetido à transcitose através da célula para o lado abluminal em que os mesmos são ambos liberados no microambiente do cérebro. Isso é a primeira identificação e demonstração do fragmento de anticorpo de domínio de ligação anti- IGF1R que transmigra a BHE por RMT. Confirmou-se que o VHH de IGF1R se liga ao IGF1R (Figura 2B), se internaliza nas células de BHE (Figura 4) e atravessa para o lado abluminal do modelo de BHE in vitro (Figura 5B). Os estudos de entrega de fármaco ao cérebro in vivo também mostraram que o VHH de IGF1R ‘carregou’ um peptídeo conjugado (Galanina; cerca de 3 kDa) assim como uma grande proteína de fusão (cerca de 80 kDa) através da BHE (Figura 7 A e B; Figura 9).
[030] Os resultados também mostram que o VHH anti-IGF1R pode ser expresso em fusão com o fragmento Fc (fragmento cristalizável) para prolongar a meia-vida de circulação por cerca de 75 vezes (cerca de 25 h em comparação a cerca de 20 min para VHH sozinho). Esse construto de fusão de alto peso molecular (cerca de 80 kDa) é também eficientemente transportado através da BHE. A meia-vida de plasma longa aumenta a exposição a CSF do conjugado de VHH-mFc de IGF1R (mFc = Fc de camundongo) significativamente em comparação ao VHH sozinho e é útil como um carreador de entrega de BHE para o tratamento de doenças crônicas com alvos no CNS. O conjugado é prontamente detectado no parênquima do cérebro com o uso de detecção por imunofluorescência. Os resultados demonstram que o carreador de VHH de IGF1R pode “transporta” moléculas grandes (similares em tamanho a: anticorpos, enzimas, fatores de crescimento, peptídeos, citocinas, coletores de receptor) através da BHE.
[031] Assim, a entrega de anticorpo pode não apenas ser útil para o tratamento a curto prazo (por exemplo, convulsão epiléptica), mas pode também ser útil para tratamentos a médio prazo (por exemplo, câncer) e longo prazo (por exemplo, doença de Alzheimer ou Parkinson).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[032] Esses e outros recursos da invenção serão agora descritos a título de exemplo, em referência aos desenhos anexos, em que:
[033] A Figura 1 é um diagrama esquemático do receptor de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1R). O IGF1R é encontrado na superfície celular e compreende duas subunidades: a subunidade alfa e a subunidade beta. A subunidade alfa (que compreende uma parte extracelular com o sítio de ligação de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1) é conectada por uma ligação de dissulfeto à subunidade beta (que compreende um domínio extracelular pequeno, uma região transmembranar e uma porção intracelular). O Receptor de IGF1 pode formar um dímero. Um fragmento com 933 aminoácidos de comprimento que compreende a subunidade alfa e a porção extracelular da subunidade beta, conforme indicado dentro da caixa cinza, (M1 - F933, n° de acesso no SwissProt P08069; consulte a Figura 2) foi recombinantemente produzido e usado para imunização de uma lhama.
[034] A Figura 2 mostra a sequência de IGF1R (n° de acesso ao SwissProt P08069). O fragmento de proteína com 933 aminoácidos de comprimento usado para a imunização e panning é mostrado em negrito; o ectodomínio completo é 2 aminoácidos mais longo. O sítio de clivagem de furina, separando as subunidades alfa e beta, é mostrado em letras minúsculas em itálico. O peptídeo de sinalização é mostrado em negrito e itálico. O epítopo putativo ao qual VHH de IGF1R-5 pode se ligar está sublinhado.
[035] A Figura 3A mostra uma cromatografia de exclusão de tamanho da IGF1R- 5 de VHH de ligação a IGF1R executada através de uma coluna Superdex 75. O perfil sugere que o VHH é monomérico e não agregador. A Figura 3B mostra a temperatura de fusão (Tm) conforme determinada por dicroísmo circular (CD) para VHH de IGF1R-5 e suas variantes humanizadas (identificadas como 5H1, 5H2, 5H3, 5H5, 5H6). As proteínas foram aquecidas a acima de 90 °C, e as medições foram tomadas no instrumento CD para determinar a curva de fusão (círculos preenchidos ou pretos) e a Tm. Subsequentemente, as proteínas foram resfriadas até a temperatura ambiente, aquecidas mais uma vez e analisadas por CD (curva ou quadrados cinzas). Isso permitiu a determinação da fração da proteína redobrada. A Figura 3C mostra uma sobreposição de sensograma de ressonância de plásmon de superfície (SPR) para ligação de VHH de IGF1R-5 a 0,1 a 10 nM e suas variantes humanizadas (identificadas com 5H1, 5H2, 5H3, 5H5, 5H6) à porção extracelular recombinante do fragmento de IGF1R humano (h-IGF1R). Os dados obtidos com esse método específico e definição experimental encaixam bem em um modelo de a 1:1, gerando valores de KD na faixa nanomolar (nM) baixa (0,6 a 16,4 nM), conforme detalhado na Tabela 2. A Figura 3D mostra sensogramas SPR de VHH de IGF1R-5 que se liga à porção extracelular recombinante do fragmento de IGF1R humano e a adição subsequente de IGF1 que pode se ligar simultaneamente ao receptor. O experimento foi repetido duas vezes, conforme mostrado no gráfico.
[036] A Figura 4 mostra resultados de formação de imagem da absorção celular de VHH de IGF1R-5 identificado com Cy-5.5 e VHH de controle. VHH de IGF1R-5 identificados com Cy5.5 (ou VHH de FC5 como um controle positivo; Muruganandam et al., 2002; Haqqani et al., 2012) foram incubados com células endoteliais cerebrais de rato imortalizadas SV40 (svARBEC) a 4 °C (painéis superiores) ou a 37 °C (painéis inferiores) para avaliar se IGF1R-3 é internalizado passivamente (4 °C) ou através de mecanismos ativos (37 °C) tais como endocitose mediada por receptor. O comanchamento com aglutinina do germe de trigo e DAPI foi executado para visualizar a superfície celular e o núcleo, respectivamente. Painel superior: Quando incubados a 4 °C, VHH de FC5 e IGF1R-5 foram encontrados fora das células (pontas de setas), ligados à membrana celular (colocalizados com a aglutinina do germe de trigo). Painel inferior: A 37 °C, VHH de FC5 e IGF1R-5 se acumularam dentro das células em estruturas semelhantes à vesícula (pontas de setas), provavelmente endossomas, sugerindo a internalização através de um mecanismo de transporte ativo.
[037] A Figura 5A mostra a sequência para a fusão de C-terminal do VHH de IGF1R-5 com o fragmento de Fc murino (IGF1R-5-mFc) enquanto a Figura 5B mostra a sequência de fusão de N-terminal (mFc-IGF1R-5-Gal). Uma representação esquemática da proteína de fusão montada é mostrada na Figura 5C. Os VHH de IGF1R-5 são mostrados em preto, e os Fc murinos (CH2 e CH3) são mostrados em cinza nas Figuras 5A a 5C.
[038] A Figura 6A é um fluxograma que resume o uso do modelo de BHE in vitro para avaliar a capacidade de vários VHHs de atravessar a BHE. Quantidades equimolares (5,6 μM ou 1,25 μM) de IGF1R-5 e VHHS de controle positivo (FC5) e negativo (A20.1, um VHH de ligação a toxina A de Clostridium difficile; e EG2, um VHH de ligação a EGFR) foram testadas simultaneamente quanto a sua capacidade de atravessar um modelo de BHE in vitro de rato. Células endoteliais cerebrais imortalizadas por SV40 de rato adulto (svARBECs) são cultivadas em uma monocamada na membrana de um inserto na presença de meio condicionado com astrócito de rato na câmara inferior e meio padrão na câmara superior. Após a coadição de quantidades equimolares dos vários VHH ao lado luminal do modelo de BHE, amostras foram retiradas da câmara inferior após 15, 30 e 60 min. As concentrações de cada VHH foram, então, quantificadas por espectrometria de massa (monitoramento de múltiplas reações com padrões internos identificados com isótipo; MRM-ILIS) nessas amostras. O valor de Papp [Qr/dt = quantidade cumulativa no compartimento receptor versus tempo; A = área da monocamada celular; CO = concentração inicial da solução de dosagem] é comumente usado para determinar a capacidade de uma molécula através da BHE. A Figura 6B mostra os valores de Papp dos quatro VHH coadministrados. IGF1R-5 tem um valor de Papp similar ao FC5, enquanto que os controles negativos tenham ambos valores de Papp bastante baixos, indicando o transporte facilitado de VHH de FC5 e IGF1R5 em comparação ao transporte paracelular ou transporte não específico bastante baixo de VHHs de controle. Os resultados são valores de Papp médios obtidos em 5 a 6 experimentos independentes. A Figura 6C mostra os valores de Papp dos anticorpos de domínio único de IGF1R-5 humanizados (H1, H2, H3, H5, H6) (barras pretas) em comparação a VHH de A20.1 (barras brancas) que foi testado como um controle na mesma cavidade; o valor de A20.1 e FC5 médio é indicado por uma linha pontilhada cinza. A Figura 6D mostra os valores de Papp da fusão de C-terminal e N-terminal de IGF1R-5 ao Fc de camundongo (cinza claro), em comparação ao Fc de camundongo de A20.1 (A20.1 mFc) (cinza escuro) que foi testado na mesma cavidade que o controle e tem um valor de Papp muito baixo. Os valores médios de Papp de FC5-Fc (FC5 fundido a um Fc), FC5 (VHH), IGF1R-5 (VHH) e A20.1 (VHH) são indicados por linhas pontilhadas para comparação.
[039] A Figura 7 mostra o esquema para síntese química do conjugado de VHH de IGF1R-5 e Galanina. O IGF1R-5 foi primeiro conjugado ao grupo NHS de um reticulador Sulfo-SMCC (1); então IGF1R-5-sulfo-SMCC ativado por maleimida foi conjugado à cisteína reduzida da Galanina (2).
[040] A Figura 8 mostra a entrega cerebral mediada por IGF1R-5 do peptídeo quimicamente conjugado Galanina. A Figura 8A é um gráfico que mostra a capacidade de IGF1R-5 de entregar doses farmacologicamente eficazes do peptídeo analgésico conjugado Galanina (3,2 kD) no cérebro com o uso do modelo de dor de Hargraeves. Nesse modelo, dor crônica localizada é induzida em ratos Wistar machos (4 a 6 semanas de idade) injetando-se 100 μl de adjuvante de Freund completo (CFA) na superfície plantar esquerda, causando uma inflamação local dentro de algumas horas. Após a injeção na veia da cauda do conjugado de fármaco e VHH de carreador de BHE ou Galanina sozinha, os ratos foram colocados em invólucros de Plexiglas estabelecidos em uma superfície de vidro. Um estímulo térmico é focado na pata inflamada ou contralateral por meio de um espelho angulado. A latência entre a aplicação de estímulo e a retirada da pata (lambida ou toque da pata) é interpretada como uma medida do efeito analgésico (inibição da hiperalgesia térmica). O peptídeo Galanina sozinho não pode penetrar a BHE, conforme demonstrado pela falta de efeito analgésico após a injeção sistêmica (veia da cauda) de 3 mg/kg de Galanina (círculos cinzas sólidos). A injeção sistêmica do conjugado de IGF1R-5 e Galanina (2,93 mg/kg ou 5,85 mg/kg) induziu um efeito analgésico dependente de dose ao longo de um período de 3 horas, mais pronunciado do que este observado com os 6 mg/kg do conjugado de FC5 e Galanina. A Figura 8B mostra esses resultados como a área sob a curva (AUC) da resposta farmacodinâmica em comparação ao efeito máximo possível (MPE; pata de controle). 2,93 mg/kg de IGF1R-5-Galanina induziram 28% de MPE, enquanto que 5,85 mg/kg de IGF1R-5-Galanina induziram 55% de MPE ao longo de um período de 3 horas, demonstrando uma penetração no cérebro significativa do conjugado em comparação à Galanina sozinha após a injeção sistêmica (<5% de MPE). A Figura 8C é um gráfico que mostra a capacidade do mFc-IGF1R-5-Gal de suprimir a hiperalgesia térmica no modelo de dor de Hargreaves após a injeção intravenosa de diferentes concentrações. A Figura 8D mostra uma resposta dependente de dose (porcentagem de reversão em resposta de pico) da hiperalgesia térmica no modelo de Hargreaves após a injeção iv d conjugado de IGF1R-5-mFc-Gal ou mFc-IGF1R-5- Gal.
[041] A Figura 9 mostra a farmacocinética de plasma e CSF do VHH de controle e IGF1R-5-mFc, da fusão de Fc de camundongo de A20.1 (A20.1-mFc) após a administração sistêmica (veia da cauda) de 5 mg/kg. A cisterna magna foi canulada para coletas de CSF em série (1 a 48 h). Os níveis de plasma e CSF de IGF1R-5- mFc e A20.1-mFc foram determinados com o uso do método de MRM-ILIS que ‘rastreia’ e quantifica assinaturas de peptídeo de proteína específicas. Os níveis de albumina no CSF foram concomitantemente determinados por MRM. Todas as amostras de CSF que têm uma razão entre plasma/CSF menor do que 1.500 foram excluídas como potencialmente contaminadas por sangue. A meia-vida do plasma de IGF1R-5-mFc e A20.1-mFc foi similar (23 h e 25 h, respectivamente). A razão de plasma/CSF foi 2% e 0,04% para IGF1R-5-mFc e A20.1-mFc, respectivamente, 24 h após a injeção sistêmica da proteína de fusão.
[042] A Figura 10 mostra a imunodetecção de IGF1R-5-mFc em seções cerebrais 48 h após a administração na veia da cauda de uma dose de 5 mg/kg. A perfusão de sacrifício com PBS foi executada nos ratos, e as seções cerebrais (35 μm) foram obtidas com o uso do vibrátomo. O IGF1R-5-mFc foi imunodetectado com o uso de um anticorpo Fc anticamundongo. Os vasos sanguíneos na seção de córtex foram detectados com o uso de lectina RCA1 (parte superior esquerda). Os astrócitos foram detectados na mesma seção por um anticorpo contra a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (parte superior direita). IGF1R-5-mFc poderia ser detectado em ambos os vasos e fora dos vasos (isto é, no parênquima cerebral, transmigrado através da BHE) (parte inferior esquerda) conforme indicado pelas pontas de setas. Um micrógrafo compósito de todos os manchamentos é mostrado na parte inferior direita, indicando a transmigração de IGF1R-5-mFc do lado luminal do vaso sanguíneo, através da BHE no parênquima do cérebro.
[043] A Figura 11 mostra que o IGF1R-5 não interfere com a sinalização por insulina ou IGF-1 através do receptor de insulina ou IGF1R. A Figura 11 A é um Western blot representativo que mostra que nem IGF1R-5, nem qualquer um dos outros VHH anti-IGF1R testados (IGF1R-1, -3, -4 ou -6) induz a fosforilação de Akt a jusante sozinho a uma concentração de 100 nM. Nem a presença de 100 nM de IGF1R-5, ou qualquer um dos outros VHHS anti-IGF1R inibem a fosforilação de Akt conforme induzida por 10μg/ml de insulina. A quantificação das densidades de banda de Western blot de 3 experimentos independentes é mostrada no gráfico de barras (média +/- SD) abaixo da imagem de gel. A Figura 11 B é um Western blot representativo que mostra que nem IGF1R-5, nem qualquer um dos outros VHH anti- IGF1R testados (IGF1R -3, -4 ou -6) a 100 nM induzem a fosforilação de Akt por si próprios e nem inibem a fosforilação de Akt induzida por IGF-1 (isto é, a sinalização) induzida mediante a estimulação com 200 ng/ml de IGF-1. A quantificação das densidades de banda de Western blot de 3 experimentos independentes é mostrada no gráfico de barras (média +/- SD) abaixo da imagem de gel. A Figura 11 C mostra Western blots sondados para IGF1R fosforilado.
[044] As células foram incubadas com IGF1R-3 a 100 nM ou 500 nM, ou qualquer um dos outros VHHS anti-IGF1R (IGF1R-1, -3 ou -4) fundidos em seu C- terminal a um Fc murino (por exemplo IGF1R-5-mFc) sozinho ou estimulado com 200 ng/ml de IGF-1 na presença das respectivas proteínas de fusão de IGF1R-VHH- ITIFC. Os Western blots indicam que nenhum dos construtos de fusão inibiu a fosforilação induzida por IGF-1 do IGF1R e nem induziu a fosforilação de receptor por si próprios.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[045] A presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1, e usos dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a fragmentos de anticorpo específicos para Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 que transmigram a barreira hematoencefálica e usos dos mesmos.
[046] A presente invenção fornece fragmentos de anticorpo isolados ou purificados que se ligam especificamente a um epítopo de Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R) em que o anticorpo ou fragmento do mesmo transmigra a barreira hematoencefálica, e em que o epítopo é especificamente ligado pelo anticorpo de SEQ ID NO:5. O epítopo de IGF1R pode estar no domínio extracelular de IGF1R e pode compreender a sequência FENFLHNSIFVPR (SEQ ID NO:11) ou fragmentos da mesma.
[047] A presente invenção fornece adicionalmente um fragmento de anticorpo isolado ou purificado que compreendem:uma sequência de região determinante de complementaridade (CDR) 1 de GRTIDNYA (SEQ ID NO:1); uma sequência de CDR2 de IDWGDGGX (SEQ ID NO:2), em que X é A ou T; e uma sequência de CDR3 de AMARQSRVNLDVARYDY (SEQ ID NO:3), em que o fragmento de anticorpo se liga especificamente ao Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R). Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado compreende uma sequência de CDR2 de IDWGDGGA.
[048] O termo “anticorpo”, também referido na técnica como “imunoglobulina” (Ig), conforme usado no presente documento refere-se a uma proteína construída a partir de cadeias de polipeptídeo pesadas e leves pareadas; vários isótipos de Ig existem, incluindo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Quando um anticorpo é corretamente dobrado, cada cadeia se dobra em vários domínios globulares distintos unidos por mais sequência de polipeptídeos lineares. Por exemplo, a cadeia leve de imunoglobulina se dobra em um domínio variável (VL) e um constante (CL), enquanto que a cadeia pesada se dobra em um domínio variável (VH) e três constantes (CH, CH2, CH3). A interação dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL) resulta na formação de uma região de ligação a antígeno (Fv). Cada domínio tem uma estrutura bem estabelecida familiar àqueles versados na técnica.
[049] As regiões variáveis de cadeia leve e pesada são responsáveis por ligar o antígeno alvo e pode, portanto, mostrar uma diversidade de sequência significativa entre anticorpos. As regiões constantes mostram menos diversidade de sequência e são responsáveis por ligar várias proteínas naturais para produzir eventos bioquímicos importantes. A região variável de um anticorpo contém os determinantes de ligação a antígeno da molécula e, assim, determina a especificidade de um anticorpo em relação a seu antígeno alvo. A maior parte da variabilidade de sequência ocorre em seis regiões hipervariáveis, três cada por cadeia variável pesada (VH) e leve (VL); as regiões hipervariáveis se combinam para formar o sítio de ligação a antígeno e contribuem para a ligação e o reconhecimento de um determinante antigênico. A especificidade e a afinidade de um anticorpo em relação a seu antígeno são determinadas pela estrutura das regiões hipervariáveis, assim como seu tamanho, formato e a química da superfície que os mesmos apresentam ao antígeno. Vários esquemas existem para a identificação das regiões de hipervariabilidade, sendo que os dois mais comuns são aqueles de Kabat e de Chothia e Lesk. Kabat et al (1991) definem as “regiões determinantes de complementaridade” (CDR) com base na variabilidade de sequência nas regiões de ligação a antígeno dos domínios de VH e VL. Chothia e Lesk (1987) definem os “laços hipervariáveis” (H ou L) com base na localização das regiões de laço estruturais nos domínios de VH e VL. Na medida em que esses esquemas individuais definem CDR e regiões são usadas hipervariáveis que são adjacentes ou sobrepostas, aqueles versados na técnica de anticorpos utilizam frequentemente os termos “CDR” e “laço hipervariável” de modo intercambiável, e os mesmos podem ser usados assim no presente documento. Os CDR/laços são referidos no presente documento de acordo com o sistema de numeração IMGT mais recente (Lefranc, M.-P. et al., 2003) que foi desenvolvido para facilitar a comparação de domínios variáveis. Nesse sistema, os aminoácidos conservados (tais como Cys23, Trp41, Cys104, Phe/Trp118 e um resíduo hidrofóbico na posição 89) têm sempre a mesma posição. Adicionalmente, uma delimitação padronizada das regiões da armação (FR1: posições 1 a 26; FR2: 39 a 55; FR3: 66 a 104; e FR4: 118 a 129) e da CDR (CDR1: 27 a 38, CDR2: 56 a 65; e CDR3: 105 a 117) é fornecida.
[050] Um “fragmento de anticorpo” conforme referido no presente documento pode incluir qualquer fragmento de anticorpo de ligação a antígeno adequado conhecido na técnica. O fragmento de anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo de ocorrência natural ou pode ser obtido pela manipulação de um anticorpo de ocorrência natural ou com o uso de métodos recombinantes. Por exemplo, um fragmento de anticorpo pode incluir, porém, sem limitação, um Fv, Fv de cadeia única (scFv; uma molécula que consiste em VL e VH conectadas com um ligante peptídico), Fab, F(ab’)2, anticorpo de domínio único (sdAb; um fragmento composto de uma única VL ou VH) e apresentações multivalentes de qualquer um dos mesmos. Os fragmentos de anticorpo tais como aqueles recém-descritos podem exigir sequências ligantes, ligações de dissulfeto ou outro tipo de ligação covalente para ligar diferentes porções dos fragmentes; aqueles versados na técnica serão familiares às exigências dos diferentes tipos de fragmentos e várias abordagens para sua construção.
[051] Em um exemplo não limitante, o fragmento de anticorpo pode ser um sdAb derivado de fontes de ocorrência natural. Os anticorpos de cadeia pesada de origem camelídea (Hamers-Casterman et al, 1993) não têm cadeias leves e, assim, seus sítios de ligação a antígeno consistem em um domínio, chamado de VHH. sdAb também foram observados em tubarões e são chamados de VNAR (Nuttall et al, 2003). Outros sdAb podem ser modificados com base em sequências de cadeia pesada e leve de Ig humana (Jespers et al, 2004; To et al, 2005). Conforme usado no presente documento, o termo “sdAb” inclui aqueles sdAb diretamente isolados do reservatório de VH, VHH, VL ou VNAR de qualquer origem através da exibição de fago ou outras tecnologias, sdAb derivados dos sdAb mencionados anteriormente, sdAb recombinantemente produzidos, assim como aqueles sdAb gerados através da modificação adicional de tais sdAb por humanização, maturação de afinidade, estabilização, solubilização, camelização ou outros métodos de modificação de anticorpo. São também abrangidos pela presente invenção homólogos, derivados ou fragmentos que retêm a função de ligação a antígeno e especificidade dos sdAb.
[052] SdAb possuem propriedades desejáveis para moléculas de anticorpo, tais como termoestabilidade, alta resistência a detergente, resistência relativamente alta a proteases (Dumoulin et al, 2002) e alto rendimento de produção (Arbabi-Ghahroudi et al, 1997); os mesmos podem também ser modificados para ter uma afinidade muito alta pelo isolamento de uma biblioteca imunológica (Li et al, 2009) ou pela maturação por afinidade in vitro (Davies & Riechmann, 1996). Modificações adicionais para aumentar a estabilidade, tais como a introdução de ligações de dissulfeto não canônicas (Hussack et al, 2011; Kim et al, 2012), podem também ser induzidas aos sdAb.
[053] Uma pessoa versada na técnica seria bem familiarizada com a estrutura de um anticorpo de domínio único (consulte, por exemplo, 3DWT, 2P42 no Banco de Dados de Proteína). Um sdAb compreende um único domínio de imunoglobulina que retém a dobra de imunoglobulina; mais notavelmente, apenas três CDR/laços hipervariáveis formam o sítio de ligação a antígeno. Entretanto, e conforme seria entendido por aqueles versados na técnica, nem toda CDR pode ser exigida para ligar o antígeno. Por exemplo, e sem ser limitante, uma, duas ou três das CDR podem contribuir para a ligação e o reconhecimento do antígeno pelo sdAb da presente invenção. As CDR do sdAb ou domínio variável são referidas no presente documento como CDR1, CDR2 e CDR3 e numeradas conforme definido por Lefranc, M.-P. et al. (2003).
[054] O fragmento de anticorpo da presente invenção é específico para o Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R), um receptor encontrado em superfícies celulares. O IGF1R compreende uma subunidade alfa que compreende uma parte extracelular que tem o sítio de ligação de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 conectada por uma ligação de dissulfeto à subunidade beta que compreende um domínio extracelular pequeno, uma região transmembranar e uma porção intracelular. O Receptor de IGF1 se reúne em um homodímero ou pode formar um heterodímero com o receptor de insulina. A sequência de IGF1R pode ser, porém, sem limitação, essa mostrada na Figura 2 (n° de acesso ao SwissProt P08069; SEQ ID NO: 14), ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma.
[055] O fragmento de anticorpo conforme descrito no presente documento não deve interferir com a sinalização através do Receptor de Insulina (IR) ou IGF1R. Especificamente, os fragmentos de anticorpo conforme descritos no presente documento não devem inibir a fosforilação de AKT induzida por insulina, nem devem induzir a fosforilação do IR por si próprios ou inibir a sinalização induzida por insulina; adicionalmente, os fragmentos de anticorpo descritos no presente documento não devem inibir a fosforilação induzida por IGF-1 do IGF1R. Além disso, os mesmos não devem se ligar ao Receptor de Insulina.
[056] Conforme declarado anteriormente, o fragmento de anticorpo pode ser um sdAb. O sdAb pode ser de origem camelídea ou derivado de um VHH camelídeo e, assim, pode ter base nas regiões de armação camelídeas; alternativamente, a CDR descrita acima pode ser enxertada em regiões de armação de VNAR, VHH, VH ou VL. Em ainda outra alternativa, os laços hipervariáveis descritos acima podem ser enxertados nas regiões de armação dos outros tipos de fragmento de anticorpo (Fv, scFv, Fab) de qualquer fonte (por exemplo, camundongo) ou proteínas de tamanho e natureza similares em quais a CDR pode ser enxertada (por exemplo, consulte Nicaise et al, 2004).
[057] A presente invenção abrange adicionalmente um anticorpo ou fragmento que é “humanizado” com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, porém, sem limitação, enxerto e inativação de CDR. A humanização de um fragmento de anticorpo compreende substituir um aminoácido na sequência por sua contraparte humana, conforme encontrada na sequência de consenso humana, sem a perda da capacidade de ligação a antígeno ou especificidade; essa abordagem reduz a imunogenecidade do fragmento de anticorpo quando introduzido em indivíduos humanos. No processo de enxerto de CDR, uma ou mais do que uma das CDR definidas no presente documento pode ser fundida ou enxertada a uma região variável humana (VH ou VL), a outro anticorpo humano (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), a regiões de armação de fragmento de anticorpo (Fv, scFv, Fab) ou a proteínas de tamanho e natureza similares nas quais as CDR podem ser enxertadas (Nicaise et al, 2004). Em tal caso, a conformação do dito um ou mais do que um laço hipervariável é provavelmente preservada, e a afinidade e a especificidade do sdAb em relação a seu a alvo (isto é, IGF1R) são provavelmente afetadas minimamente. A enxerto de CDR é conhecida na técnica e é descrita pelo menos nos seguintes: Patente n° US 6180370, Patente n° US 5693761, Patente n° US 6054297, Patente n° US 5859205 e Patente n° EU 626390. A inativação, também referida na técnica como “recomposição de região variável”, envolve a humanização de posições expostas a solvente do fragmento de anticorpo; assim, resíduos não humanizados ocultados, que podem ser importantes para a conformação de CDR, são preservados enquanto o potencial para a reação imunológica contra regiões expostas a solvente é minimizado. A inativação é conhecida na técnica e é descrita pelo menos nos seguintes: Patente n° US 5869619, Patente n° US 5766886, Patente n° US 5821123 e Patente n° EU 519596. As pessoas versadas na técnica também seriam amplamente familiares com os métodos para preparar tais fragmentos de anticorpo humanizados e humanizar posições de aminoácidos.
[058] Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado específico para IGF1R pode ser: X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6 X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14 LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS (SEQ ID NO:4), em que X1 é E ou Q; X2 é K ou Q; X3 é V ou E; X4 é A ou P; X5 é V ou S; X6 é D ou G; X7 é L ou R; X8 é F ou W; X9 é A ou S; X10 é A ou T; X11 é A ou S; X12 é G ou N; X13 é M ou L; X14 é N ou R; X15 é E ou R; X16 é P ou A; X17 é S ou Y; e X18 é Q ou L,ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma. Alternativamente, o anticorpo isolado ou purificado pode compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFV ATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5), referida no presente documento como IGF1R-5; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEW VSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6), referida no presente documento como IGF1R-5_H1; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEW VATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYY CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7), referida no presente documento como IGF1R-5_H2; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKGLEFV ATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8), referida no presente documento como IGF1R-5_H3; QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREF VATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKGTMYLQMNSLRAEDTAVYS CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), referida no presente documento como IGF1R-5_H5; e EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFV STIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA MARQSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10), referida no presente documento como IGF1R-5_H6, ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma.
[059] Uma sequência substancialmente idêntica pode compreender uma ou mais mutações conservativas de aminoácido. Sabe-se na técnica que uma ou mais mutações conservativas de aminoácido a uma sequência de referência pode render um peptídeo mutante sem nenhuma alteração substancial nas propriedades fisiológicas, químicas, físico-químicas ou funcionais; em tal caso, as sequências de referência e mutantes seriam consideradas polipeptídeos “substancialmente idênticos”. Uma substituição conservativa de aminoácido é definida no presente documento como a substituição de um resíduo de aminoácidos por outro resíduo de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, tamanho, carga ou polaridade). Essas mutações conservativas de aminoácido podem ser feitas às regiões de armação do sdAb enquanto se mantém as sequências de CDR listadas acima e a estrutura geral da CDR do fragmento de anticorpo; assim, a especificidade e ligação do fragmento de anticorpo são mantidas.
[060] Em um exemplo não limitante, uma mutação conservativa pode ser uma substituição de aminoácido. Tal substituição conservativa de aminoácido pode substituir um aminoácido básico, neutro, hidrofóbico ou ácido por outro do mesmo grupo. Pelo termo “aminoácido básico” entende-se aminoácidos hidrofílicos que têm um valor de pK de cadeia lateral maior do que 7 que são tipicamente carregados positivamente em pH fisiológico. Os aminoácidos básicos incluem histidina (His ou H), arginina (Arg ou R) e lisina (Lys ou K). Pelo termo “aminoácido neutro” (também “aminoácido polar”), entende-se aminoácidos hidrofílicos que têm uma cadeia lateral que não é carregada em pH fisiológico, mas que tem pelo menos uma ligação na qual o par de elétrons compartilhado em comum por dois átomos é retido mais estreitamente por um dos átomos. Os aminoácidos polares incluem serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), cisteína (Cys ou C), tirosina (Tyr ou Y), asparagina (Asn ou N) e glutamina (Gin ou Q). O termo “aminoácido hidrofóbico” (também “aminoácido não polar”) destina-se a incluir aminoácidos que exibem uma hidrofobicidade maior do que zero de acordo com a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg (1984). Os aminoácidos hidrofóbicos incluem prolina (Pro ou P), isoleucina (lie ou I), fenilalanina (Phe ou F), valina (Val ou V), leucina (Leu ou L), triptofano (Trp ou W), metionina (Met ou M), alanina (Ala ou A) e glicina (Gly ou G). “Aminoácido ácido” refere-se a aminoácidos hidrofílicos que têm um valor de pK de cadeia lateral menor do que 7 que são tipicamente carregados negativamente em pH fisiológico. Os aminoácidos ácidos incluem glutamato (Glu ou E) e aspartato (Asp ou D).
[061] A identidade de sequência é usada para avaliar a similaridade de dias sequências; a mesma é determinada calculando-se a porcentagem de resíduos que são iguais quando as duas sequências são alinhadas para correspondência máxima entre as posições de resíduo. Qualquer método conhecido pode ser usado para facilitar a identidade de sequência; por exemplo, um software de computador está disponível para calcular a identidade de sequência. Sem ser limitante, a identidade de sequência pode ser calculada por software tal como o serviço NCBI BLAST2 mantido pelo Instituto Suíço de Bioinformática (e conforme encontrado em ca.expasy.org/tools/blast/), BLAST-P, Blast-N ou FASTA-N, ou qualquer outro software apropriado que seja conhecido na técnica.
[062] As sequências substancialmente idênticas da presente invenção podem ser pelo menos 90% idênticas; em outro exemplo, as sequências substancialmente idênticas podem ser pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idênticas, ou qualquer porcentagem entre as mesmas, no nível de aminoácido às sequências descritas no presente documento. Com importância, as sequências substancialmente idênticas retêm a atividade e a especificidade da sequência de referência. Em uma modalidade não limitante, a diferença na identidade de sequência pode ser devido à mutação(ões) conservativa(s) de aminoácido. Em um exemplo não limitante, a presente invenção pode ser direcionada a um fragmento de anticorpo que compreende uma sequência pelo menos 95%, 98%, ou 99% idêntica a esta dos fragmentos de anticorpo descritos no presente documento.
[063] O fragmento de anticorpo da presente invenção pode também compreender sequências adicionais para auxiliar na expressão, detecção ou purificação de um fragmento de anticorpo recombinante. Quaisquer tais sequências ou etiquetas conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas. Por exemplo, e sem ser limitante, o fragmento de anticorpo pode compreender uma sequência de sinais ou alvejamento (por exemplo, porém, sem limitação, ompA), uma etiqueta de detecção/purificação (por exemplo, porém, sem limitação, c-Myc, His5 ou His6) ou uma combinação dos mesmos. Em outro exemplo, a sequência adicional pode ser um sítio de reconhecimento de biotina tal como este descrito por Cronan et al em WO 95/04069 ou Voges et al em WO/2004/076670. Conforme é também conhecido por aqueles versados na técnica, as sequências ligantes podem ser usadas em conjunto com as sequências ou etiquetas adicionais ou podem servir como uma etiqueta de detecção/purificação.
[064] O fragmento de anticorpo da presente invenção pode também estar em um formato de exibição multivalente, também referido no presente documento como apresentação multivalente. A multimerização pode ser alcançada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, a multimerização pode ser alcançada com o uso de moléculas de automontagem tais como aquelas descritas em Zhang et al (2004a; 2004b) e WO2003/046560, em que pentacorpos são produzidos expressando-se uma proteína de fusão que compreende o fragmento de anticorpo da presente invenção e o domínio de pentamerização da subunidade B de uma família de toxina AB5 (Merritt & Hol, 1995). Um multímero pode também ser formado com o uso de domínios de multimerização descritos por Zhu et al. (2010); essa forma, referida no presente documento como uma forma “combody”, é uma fusão do fragmento de anticorpo da presente invenção com um peptídeo de hélice superenrolada resultando em uma molécula multimérica. Outras formas de exibição multivalente são também abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, e sem ser limitante, o fragmento de anticorpo pode ser apresentado como um dímero, um trímero ou qualquer outro oligômero adequado. Isso pode ser alcançado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, conexão por ligação direta (Nielson et al, 2000), interação de c-jun/Fos (de Kruif & Logtenberg, 1996), interação de “Knob into holes” (Ridgway et al, 1996).
[065] Outro método conhecido na técnica para multimerização é dimerizar o fragmento de anticorpo com o uso de um domínio Fc, por exemplo, porém, sem limitação, domínios Fc humanos. Os domínios Fc podem ser selecionados dentre várias classes incluindo, porém, sem limitação, IgG, IgM ou várias subclasses incluindo, porém, sem limitação, lgG1, lgG2, etc. Nessa abordagem, o gene Fc é inserido em um vetor juntamente com o gene sdAb para gerar a proteína de fusão sdAb-Fc (Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010); a proteína de fusão é expressa de modo recombinante, então, purificada. Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, os formatos de exibição multivalentes podem abranger formatos quiméricos de VHH de anti-IGF1R-5 ligado a um domínio Fc, ou fusões de anticorpo bi ou triespecíficas com dois ou três epítopos exclusivos de reconhecimento de VHH anti- IGF1R-5. Tais fragmentos de anticorpo são fáceis de modificar e produzir, podem estender significativamente a meia-vida do sdAb e podem ser excelentes reagentes de formação de imagem de tumor (Bell et al., 2010).
[066] O domínio Fc no complexo multimérico conforme recém-descrito pode ser qualquer fragmento Fc adequado conhecido na técnica. O fragmento Fc pode ser de qualquer fonte adequada; por exemplo, o Fc pode ser de origem humana ou de camundongo. Em um exemplo específico, não limitante, o Fc pode ser o fragmento Fc2b de camundongo ou fragmento Fc1 humano (Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010). Em um exemplo não limitante específico, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado multimerizado conforme recém-descrito pode compreender a sequência de SEQ ID NO:42, 43, 12 ou 13.
[067] Cada subunidade dos multímeros descritos acima pode compreender fragmentos de anticorpo iguais ou diferentes da presente invenção que podem ter especificidade igual ou diferente. Adicionalmente, os domínios de multimerização podem ser ligados ao fragmento de anticorpo com o uso de um ligante, conforme exigido; tal ligante deve ter comprimento suficiente e composição apropriada para fornecer uma ligação flexível das duas moléculas, mas não deve prejudicar as propriedades de ligação a antígeno do fragmento de anticorpo.
[068] O fragmento de anticorpo conforme descrito no presente documento pode transmigrar através da barreira hematoencefálica. O cérebro é separado do resto do corpo por um tecido endotelial especializado conhecido como a barreira hematoencefálica (BHE). As células endoteliais da BHE são conectadas por junções estreitas e impedem eficazmente muitos compostos terapêuticos de entrar no cérebro. Adicionalmente às taxas baixas de transporte vesicular, um recurso específico da BHE é a existência de barreira(s) enzimática(s) e alto(s) nível(is) de expressão de transportadores dependentes de ATP no lado abluminal (cérebro) da BHE, incluindo a P-glicoproteína (Gottesman et al., 1993; Watanabe, 1995) que transporta ativamente várias moléculas do cérebro para a corrente sanguínea (Samuels, 1993). Apenas moléculas pequenas (<500 Daltons) e hidrofóbicas (Pardridge, 1995) podem atravessar mais prontamente a BHE. Assim, a capacidade do fragmento de anticorpo conforme descrito acima de ligar especificamente o receptor de superfície, se internalizar nas células endoteliais cerebrais e passar por transcitose através da BHE através da evasão da degradação lisossômica é útil no campo neurológico.
[069] A presente invenção também abrange as sequências de ácido nucleico que codificam as moléculas conforme descrito no presente documento. Dada a degenerescência do código genético, várias sequências de nucleotídeos teriam o efeito de codificar o polipeptídeo, conforme seria prontamente entendido por um versado na técnica. A sequência de ácidos nucléicos pode ser otimizada por códon para a expressão em vários micro-organismos. A presente invenção também abrange vetores que compreendem os ácidos nucleicos conforme recém-descritos. Ademais, a invenção abrange células que compreendem o ácido nucleico e/ou vetor conforme descrito.
[070] A presente invenção abrange adicionalmente os fragmentos de anticorpo isolado ou purificado imobilizados em uma superfície com o uso de várias metodologias; por exemplo, e sem ser limitante, o fragmento de anticorpo pode ser ligado ou acoplado à superfície por meio de acoplamento de etiqueta de His, ligação de biotina, ligação covalente, adsorção e similares. A imobilização do fragmento de anticorpo da presente invenção pode ser útil em várias aplicações para capturar, purificar ou isolar proteínas. A superfície sólida pode ser qualquer superfície adequada, por exemplo, porém, sem limitação, a superfície de cavidade de uma placa de microtitulação, canais de chips sensoriais de ressonância de plásmon de superfície (SPR), membranas, esferas (tais como esferas com base magnética ou à base de sefarose ou outra resina para cromatografia), vidro, plástico, aço inoxidável, um filme, ou qualquer outra superfície útil tais como nanopartículas, nanofios e superfícies de cantiléver.
[071] A invenção também abrange o fragmento de anticorpo conforme descrito acima ligado a uma molécula de carga. A molécula de carga pode ser qualquer molécula adequada que é entregue através da BHE pelo fragmento de anticorpo. A molécula de carga pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 1kD a cerca de 200 kDa; por exemplo, a molécula de carga pode ter um peso molecular de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 ou 200 kDa ou qualquer peso entre os mesmos ou qualquer faixa de pesos definida por quaisquer dois pesos mencionados anteriormente. Em exemplos não limitantes específicos, a molécula de carga pode ter um peso molecular de 1 kDa (por exemplo, porém, sem limitação, uma molécula pequena tal como Cy5.5), 1 a 10 kDa (por exemplo, porém, sem limitação, um peptídeo tal como galanina, 3 kDa), cerca de 80 kDa (por exemplo, porém, sem limitação, um fragmento Fc, enzima, proteína, anticorpo, etc.), ou cerca de 200 kDa (por exemplo, porém, sem limitação, um anticorpo monoclonal).
[072] Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, a molécula de carga pode ser um agente detectável, um agente terapêutico, um fármaco, um peptídeo, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, um coletor de receptor, um anticorpo ou fragmento do mesmo (por exemplo, IgG, scFv, Fab, VHH, VH, VL, etc.), um composto químico, uma porção química de carboidrato, moléculas à base de DNA (oligonucleotídeo antissenso, microRNA, siRNA, plasmídeo), um agente citotóxico, vetor viral (adeno, lenti, retro), um ou mais lipossomas ou nanocarreadores carregados com qualquer um dos tipos anteriormente citados de moléculas de carga, ou uma ou mais nanopartículas, nanofios, nanotubos ou pontos quânticos. A molécula de carga conforme descrita acima pode ser um agente detectável. Por exemplo, o fragmento de anticorpo específico para IGF1R pode ser ligado a um radioisótopo, uma identificação paramagnética, um fluoróforo, um agente fluorescente, fluorocromo ou corante no Infravermelho Próximo (NIR; por exemplo, Cy5.5), uma microbolha ecogênica, uma identificação de afinidade, uma molécula à base de proteína detectável, nucleotídeo, ponto quântico, nanopartícula, nanofio ou nanotubo ou qualquer outro agente adequado que pode ser detectado por métodos de formação de imagem. O fragmento de anticorpo pode ser ligado à molécula de carga com o uso de qualquer método conhecido na técnica (tecnologia recombinante, conjugação química, etc.).
[073] A molécula de carga conforme descrita no presente documento pode ser ligada, também referido no presente documento como “conjugada”, ao fragmento de anticorpo por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, e sem ser limitante, a molécula de carga pode ser ligada ao peptídeo por uma ligação covalente ou interação iônica. A ligação pode ser alcançada através de uma reação de reticulação química ou através da fusão com o uso de metodologia de DNA recombinante combinada com qualquer sistema de expressão de peptídeo, tais como bactérias, leveduras ou sistemas à base de célula de mamífero. Ao conjugar a molécula de carga ao fragmento de anticorpo, um ligante adequado pode ser usado. Os métodos para ligar um fragmento de anticorpo a uma molécula de carga tal como um agente terapêutico ou detectável seriam bem conhecidos por um versado na técnica.
[074] Em um exemplo não limitante, a molécula de carga pode ser uma identificação detectável, um radioisótopo, uma identificação paramagnética tal como gadolínio ou óxido de ferro, um fluoróforo, fluorocromo ou corante no Infravermelho Próximo (NIR), uma microbolha ecogênica, uma identificação de afinidade (por exemplo, biotina, avidina, etc.), enzimas ou qualquer outro agente adequado que possa ser detectado por métodos de formação de imagem diagnóstica. Em um exemplo não limitante específico, o anti-IGF1R-5 ou fragmento do mesmo pode ser ligado a um corante de formação de imagem por fluorescência no infravermelho próximo (NIRF), por exemplo, e sem ser limitante, Cy5.5, Alexa680, Dylight680 ou Dylight800.
[075] Assim, a presente invenção fornece adicionalmente um método in vitro para detectar IGF1R que compreende colocar uma amostra de tecido em contato com um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado da presente invenção ligado a um agente detectável. O complexo de IGF1R e anticorpo pode, então, ser detectado com o uso de tecnologias de detecção e/ou formação de imagem conhecidos na técnica. A amostra de tecido no método conforme recém- descrita pode ser qualquer amostra de tecido adequada, por exemplo, porém, sem limitação, uma amostra de soro, uma amostra de tecido vascular, uma amostra de tecido tumoral ou uma amostra de tecido cerebral; a amostra de tecido pode ser de um indivíduo humano ou animal. A etapa de contatar é feita sob condições adequadas, conhecidas por aqueles versados na técnica, para a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento do mesmo e IGF1R. A etapa de detecção pode ser realizada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, porém, sem limitação, formação de imagem óptica, imuno-histoquímica, formação de imagem diagnóstica molecular, ELISA, espectrometria de massa de formação de imagem ou outro método adequado. Por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, o fragmento de anticorpo isolado ou purificado ligado a um agente detectável pode ser usado em imunoensaios (IA) incluindo, porém, sem limitação, IA de enzima (EIA), ELISA, “captura rápida de antígeno”, “IA cromatográfico rápido” e “EIA rápido”. (Por exemplo, consulte Planche et al, 2008; Sloan et al, 2008; Russmann et al, 2007; Musher et al, 2007; Turgeon et al, 2003; Fenner et al, 2008).
[076] A presente invenção também fornece um método in vivo para detectar a expressão de IGF1R em um indivíduo. O método compreende administrar um ou mais do que um anticorpo isolado ou purificado ou fragmento do mesmo conforme descrito no presente documento ligado a um agente detectável ao indivíduo, então, detectar o fragmento de anticorpo identificado ligado a IGF1R. A etapa de detectar pode compreender qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, porém, sem limitação, PET, SPECT ou formação de imagem de fluorescência ou qualquer outro método adequado. O método conforme recém-descrito pode ser útil na detecção da expressão de IGF1R em vasos sanguíneos ou tecidos, por exemplo,porém, sem limitação, tecidos tumorais.
[077] A etapa de detecção in vivo nos métodos descritos acima pode ser a formação de imagem de corpo inteiro para propósitos diagnósticos ou a formação de imagem local em sítios específicos, tais como, porém, sem limitação, vasos cerebrais ou vasos de tumor cerebral, de uma maneira quantitativa para avaliar a progressão da doença ou resposta de hospedeiro a um regime de tratamento. A etapa de detecção nos métodos conforme descritos acima pode ser imuno- histoquímica ou uma tecnologia de formação de imagem diagnóstica não invasiva (molecular) incluindo, porém, sem limitação: • Formação de imagem óptica; • Tomografia por emissão de pósitrons (PET), em que o agente detectável é um isótopo tal como 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 62Cu, 124l, 76Br, 82Rb e 68Ga, com 18F sendo o mais usado clinicamente; • Tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), em que o agente detectável é um radiossinalizador tal como 99mTc, 111ln, 123l, 201 TI, 133Xe, dependendo da aplicação específica; • Formação de imagem por ressonância magnética (IRM), em que o agente detectável pode ser, por exemplo, e não limitado a gadolínio, nanopartículas de óxido de ferro e nanopartículas de ferro e cobalto revestidas com carbono aumentando, assim, a sensibilidade da IRM para a detecção de placas. • Ultrassonografia Realçada por Contraste (CEUS) ou ultrassom, em que o agente detectável é pelo menos uma microbolha preenchida com gás e acusticamente ativa. O ultrassom é uma tecnologia comum para a triagem e a detecção precoce de doenças humanas. O mesmo é menos custoso do que a IRM ou cintilografia e mais seguro do que as modalidades de formação de imagem molecular tal como a formação de imagem de radionuclídeos por que não envolve radiação.
[078] A presente invenção fornece adicionalmente um método para transportar uma molécula de interesse através da barreira hematoencefálica. O método compreende administrar a molécula ligada a um fragmento de anticorpo conforme descrito no presente documento a um indivíduo; o fragmento de anticorpo transmigra a barreira hematoencefálica. A molécula pode ser qualquer molécula desejada, incluindo as moléculas de carga conforme anteriormente descritas; a molécula pode ser “ligada” ao fragmento de anticorpo com o uso de qualquer método adequado, incluindo, porém, sem limitação, a conjugação ou expressão em uma proteína de fusão. A administração pode ser por qualquer método adequado, por exemplo, administração parenteral, incluindo, porém, sem limitação, administração intravenosa (iv), subcutânea (sc) e intramuscular (im). Nesse método, o fragmento de anticorpo da presente invenção ‘transporta’ a molécula de interesse através da BHE para seu alvo no cérebro.
[079] A presente invenção também abrange uma composição que compreende um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado conforme descrito no presente documento. A composição pode compreender um único fragmento de anticorpo conforme descrito acima ou pode ser uma mistura de fragmentos de anticorpo. Ademais, em uma composição que compreende uma mistura de fragmentos e anticorpos da presente invenção, os anticorpos podem ter a mesma especificidade ou pode se diferir em suas especificidades; por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, a composição pode compreender fragmentos de anticorpo específicos para IGF1R (epítopo igual ou diferente).
[080] A composição pode também compreender um diluente, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável. O diluente, excipiente ou carreador pode ser qualquer diluente, excipiente ou carreador conhecido na técnica e deve ser compatível com outros ingredientes na composição, com o método de entrega da composição e não é prejudicial ao receptor da composição. A composição pode estar em qualquer forma adequada; por exemplo, a composição pode ser fornecida em forma de suspensão, forma em pó (por exemplo, porém, sem limitação, liofilizada ou encapsulada), forma de cápsula ou tablete. Por exemplo, e sem ser limitante, quando a composição é fornecida em forma de suspensão, o carreador pode compreender água, solução salina, um tampão adequado ou aditivos para melhorar a solubilidade e/ou a estabilidade; a reconstituição para produzir a suspensão é efetuada em um tampão a um pH adequado para garantir a disponibilidade do anticorpo ou fragmento do mesmo. Pós secos podem também incluir aditivos para melhorar a estabilidade e/ou carreadores para aumentar a massa/volume; por exemplo, e sem ser limitante, a composição de pó seco pode compreender sacarose e trealose. Em um exemplo não limitante específico, a composição pode ser formulada assim para entregar o fragmento de anticorpo ao trato gastrointestinal do indivíduo. Assim, a composição pode compreender a encapsulação, liberação temporizada ou outras tecnologias adequadas para a entrega do fragmento de anticorpo. Estaria dentro da competência de um versado na técnica preparar composições adequadas que compreendem os presentes compostos.
[081] A invenção também abrange um método para quantificar uma quantidade de uma molécula de carga entregue através da BHE de um indivíduo em que a molécula de carga é ligada a um ou mais do que um fragmento de anticorpo isolado ou purificado, conforme descrito no presente documento, sendo que o método compreende: a) coletar o fluido cérebro-espinhal (CSF) do indivíduo; e b) usar métodos de proteômica direcionada para quantificar a quantidade da molécula de carga ligada a um ou mais do que um fragmento de anticorpo no CSF.
[082] A molécula de carga pode ser qualquer molécula desejada, incluindo as moléculas de carga conforme anteriormente descritas; o fragmento de anticorpo isolado ou purificado transmigra a barreira hematoencefálica; e a molécula pode ser “ligada” ao fragmento de anticorpo com o uso de qualquer método adequado, incluindo, porém, sem limitação, a conjugação ou expressão em uma proteína de fusão, conforme anteriormente descrito. No método acima, o CSF é coletado a partir de um indivíduo com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. A quantidade de CSF exigida para o método de proteômica direcionada na etapa b) pode estar entre cerca de 1 a 10 μl; por exemplo, a quantidade de CSF exigida pode ser cerca de 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10 μl, ou qualquer quantidade entre as mesmas, ou qualquer faixa definida pela quantidade recém-descrita. O anticorpo ou fragmento ligado à molécula de carga pode ter sido administrado ao indivíduo antes da coleta do CSF. Um atraso adequado entre a administração e a entrega do anticorpo ou fragmento ligado à molécula de carga através da BHE pode ser exigido. O atraso pode ser pelo menos 30 minutos após a administração do fragmento de anticorpo ligado à molécula de carga; por exemplo, e sem ser limitante de qualquer maneira, o atraso pode ser pelo menos 30 minutos, 1 hora, 1,5 hora, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 4,5 horas ou 5 horas. Os métodos de proteômica direcionada usados para quantificar a quantidade do um ou mais do que um anticorpo ou fragmento do mesmo ligado à molécula de carga pode ser qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, e sem ser limitante, o método de proteômica direcionada pode ser um método de espectrometria de massa, tal como, porém, sem limitação, monitoramento de múltiplas reações com o uso de um padrão interno isotopicamente identificado (MRM-ILIS; consulte, por exemplo, Haqqani et al., 2013). MRM é vantajoso em que o mesmo permite a quantificação rápida, sensível e específica de analitos direcionados não identificados (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo conforme descrito no presente documento) em uma amostra biológica. A capacidade de multiplexação do ensaio pode permitir a quantificação tanto do fragmento de anticorpo quanto da molécula de carga.
[083] A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos exemplos a seguir. Entretanto, deve ser entendido que esses exemplos são para propósitos de ilustração apenas e não devem ser usados para limitar o escopo da presente invenção de qualquer maneira.
Exemplo 1: purificação de fragmento recombinante de IGF1R
[084] Um fragmento recombinante com 933 aminoácidos de comprimento do domínio extracelular de IGF1R (mostrado pela caixa cinza na Figura 1; consulte também os aminoácidos 1 a 933 de SEQ ID NO: 14) foi preparado. O fragmento compreendida um peptídeo de sinalização com 30 aminoácidos de N-terminal, a subunidade alfa completa, um sítio de clivagem de furina (RKRR, SEQ ID NO: 15; separando as subunidades alfa e beta), assim como a maior parte da porção extracelular da subunidade beta (Figuras 1 e 2).
[085] Clonagem. A sequência do ectodomínio de IGF1R de interesse foi amplificada por PCR com o uso dos iniciadores a seguir:5’-CGGGATCCGCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAG-3’ (direto; SEQ ID NO: 16) 5’-GCTCTAGATCAGAAGTTTTCATATCCTGTTTTGG-3’ (inverso; SEQ ID NO:17) e subclonada no sítio Smal de Pud 9. A sequência de IGF1R933 foi, então, subclonada em pCDN4/myc-His (Invitrogen) para gerar pIGF1 R933-His que permite a expressão de um ectodomínio identificado com His conforme descritos anteriormente (Samani et al. 2004).
[086] Transfecção temporária. Partículas de lentivírus que expressam IGF1R933- His foram geradas na linhagem de células de empacotamento 293SF-PacLV, conforme detalhado anteriormente (Broussau et al., 2008). Resumidamente, as células foram transfectadas com o vetor com o uso de polietilenoimina. O meio fresco (LC-SFM), contendo 1 μg/ml de doxiciclina e 10 μg/ml de cumato, foi adicionado às células 5 horas após a transfecção, e os sobrenadantes contendo partículas de LV foram coletados após 48 a 72 horas, concentrados por ultracentrifugação a 100.000xg por 2 h a 4 °C em uma almofada de sacarose 20% (Gaillet B et al. 2007), ressuspensos em meio LC-SFM suplementado com FBS 1 % e armazenados a -70 °C até serem usados.
[087] Expressão estável. Uma linhagem de células estável, 293SF-cum2-CR5- IGF1R-His, foi gerada pela transdução de linhagens de células 293SF-Cum2 com as respectivas partículas de lentivírus com o uso de um protocolo anteriormente descrito (Gaillet B. et al. 2010). Resumidamente, 0,5 a 1,0 X 105 células 293SF- Cum2 foram inoculadas em placas de 24 cavidades em 200 μl de meio LC-SFM sem sulfato de dextrano. A suspensão de LV foi preparada misturando-se 200 a 500 μl de LV com 8 μg/ml de polibreno e incubando a mesma por 30 min a 37 °C. A suspensão de LV recém-preparada foi adicionada às células 4 horas após a inoculação. Após 24 h, 500 μl do meio suplementado com sulfato de dextrano foram adicionados às células. Para aumentar o nível de expressão, as células foram transduzidas novamente até 6 vezes com o uso do mesmo protocolo após 3 a 4 dias de recuperação das células. Finalmente, as células foram expandidas em placas de 6 cavidades e frascos agitadores.
[088] Purificação e produção de proteína em larga escala. O clone identificado como o maior produtor foi expandido em frascos giratórios ou agitadores. A produção de proteína foi iniciada pela adição de 1 μg/ml de cumato em meio fresco, seguida por uma incubação de 24 h a 37 °C e uma incubação de 4 a 8 dias a 30 °C. As células foram removidas por centrifugação, e os sobrenadantes filtrados e concentrados (10x) com o uso dos Sistemas de Filtração de Fluxo Tangencial (cassetes de ultrafiltração Pellicon, EMD Millipore).
[089] O IGF1R933-His foi purificado com o uso de uma coluna HisPrep (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, a amostra concentrada foi aplicada a uma coluna His-prep FF (16/10) (GE Healtcare), equilibrada e lavada com fosfato de sódio a 50 mM, NaCI a 300 mM, imidazol a 5 mM pH 7,5 e eluída com o fosfato de sódio a 50 mM, NaCI a 300 mM, imidazol a 500 mM pH 7,5. Uma eluição em etapas com citrato de sódio a 0,1 M pH 4,5 a pH 2,5 foi usada para eluir a proteína, e as frações de pico foram agrupadas. A troca de tampão foi realizada por ultrafiltração com o uso de uma membrana de corte de 50 kDa ou uma coluna de dessalinização com um tampão contendo fosfato de sódio a 50 mM, NaCI a 150 mM e Tween-80 0,01%, pH 7,2. A pureza de ambas as proteínas foi verificada por SDS-PAGE, e as mesmas foram armazenadas a -80 °C até serem usadas (consulte os exemplos subsequentes).
Exemplo 2: imunização de lhama e resposta sérica
[090] Para isolar VHHs que alvejam o domínio extracelular de IGF1R, uma lhama foi imunizada com o fragmento de IGF1R933-His recombinante obtido no Exemplo 1.
[091] Um lhama macho (Lama glama) foi imunizado por injeção lombar subcutânea de antígeno recombinante de IGF1R933-His (Exemplo 1). No dia 1, 200 μg de antígeno diluídos em PBS a 1 ml foram injetados juntamente com 1 ml de Adjuvante de Freund Completo (Sigma, St. Louis, MO). Três injeções adicionais de 100 μg de antígeno de IGF1R933-His mais Adjuvante de Freund Incompleto (Sigma) foram realizadas nos dias 22, 36 e 50. Uma injeção final de 100 μg de antígeno sem nenhum adjuvante foi realizada no dia 77. Sangue pré-imune foi retirado antes da primeira injeção no dia 1 e serviu como um controle negativo. Sangue (10 a 15 ml) foi coletado nos dias 29, 43, 57 e 84. O sangue do dia 84 foi processado imediatamente para isolar as células mononucleares de sangue periférico (PBMC). O sangue foi diluído a 1:1 com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e as PBMCs foram purificadas a partir do sangue com o uso do Tubo Lymphoprep (Axis Shield). As células foram contadas e armazenadas como alíquotas de cerca de 1 x 107 células a -80 °C para uso futuro.
[092] O soro total pré-imune e pós-imune foi analisado quanto a uma resposta específica ao antígeno de IGF1R933-His por ELISA no dia 57. Os soros de lhama do dia 84 foram fracionados conforme anteriormente descrito (Doyle et al, 2008). As frações resultantes A1 (HCAb), A2 (HCAb), G1 (HCAb) e G2 (clgG) foram analisados para a ligação específica ao antígeno de IGF1R933-His por ELISA. Resumidamente, 5 μg de antígeno recombinante de IGF1R933-His diluídos em PBS foram incubados de um dia para o outro (100 μl/cavidade, 18 h, 4 °C) em placas Maxisorp de 96 cavidades (Nalgene, Nunc) para revestir as placas. As placas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA), lavadas com PBS-T (PBS + Tween-20 0,05% (v/v)), e diluições seriadas de soro total pré-imune, soro total pós-imune (dia 57) e soro fracionado (dia 84) foram aplicadas. Após a incubação à temperatura ambiente por 1,5 h, as placas foram lavadas com PBS-T, antes da IgG antilhama de cabra (1:1.000 em PBS) ter sido adicionada, e as placas foram incubadas por 1 h a 37 °C. Após a lavagem com PBS-T, o conjugado de IgG-HRP anticabra de porco (1:3.000 em PBS) foi adicionado e as placas foram incubadas por 1 h a 37 °C. Uma lavagem de PBS-T final foi executada antes da adição de 100 μl/cavidade de substrato de TMB (KPL, Gaithersburg, MD); o substrato foi incubado por 10 min. A reação foi parada com 100 μl/cavidade de H3PO4 a 1 M. A absorvância foi lida a 450 nm.
Exemplo 3: construção de biblioteca e seleção de VHHS de ligação à IGF1R
[093] Uma biblioteca de VHH de lhama hiperimunizada foi construída com base no RNA isolado das PBMCs no Exemplo 2.
[094] A construção e panning da biblioteca foram realizados essencialmente conforme anteriormente descrito (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009a, 2009b; Tanha et al, 2003). O RNA total foi isolado de aproximadamente 107 PBMCs coletadas no dia 84 após a imunização (Exemplo 2) com o uso do Mini Kit de Sangue de RNA QIAamp (Qiagen). Cerca de 5 μg do RNA total foram usados como modelo para a síntese de cDNA de primeiro filamento com iniciadores oligo dT com o uso do Kit de Síntese de cDNA de Primeiro Filamento (GE Healthcare). O cDNA foi amplificado por uma mistura equimolar de três iniciadores senso específicos para região variável: MJ1: 5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCSMKGTGCAGCTGGTGGAKTCTGGGGGA- 3’ (SEQ ID NO: 18) MJ2: 5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGA- 3’ (SEQ ID NO:19) MJ3: 5’-GCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTCAGGTACAGCTGGTGGAGTCT- 3’ (SEQ ID NO:20), e dois iniciadores específicos para CH2 antissenso: CH2: 5’-CGCCATCAAGGTACCAGTTGA-3’ (SEQ ID NO:21) CH2b3: 5’-GGGGTACCTGTCATCCACGGACCAGCTGA-3’ (SEQ ID NO:22).
[095] Resumidamente, a mistura de reação de PCR foi definida em um volume total de 50 μl com os componentes a seguir: 1 a 3 μl de cDNA, 5 μmol de mistura de iniciador MJ1-3, 5 μmol de iniciadores de CH2 ou CH2b3, 5 μl de tampão de reação 10x, 1 μl de dNTP a 10 mM, 2,5 unidades de Taq DNA polimerase (Hoffmann-La Roche). O protocolo de PCR consistiu em uma (i) etapa inicial a 94 °C por 3 min, (ii) seguida por 30 ciclos de 94 °C por 1 min, 55 °C por 30 s, 72 °C por 30 s e (iii) uma etapa de extensão final a 72 °C por 7 min. Os produtos de PCR amplificados foram executados em um gel de agarose 2%, e duas bandas principais foram observadas: uma banda de cerca de 850 bp, correspondendo à IgG convencional, e uma segunda banda de cerca de 600 bp, correspondendo à região de VHH-CH2 dos anticorpos de cadeia pesada de camelídeo. As bandas menores foram cortadas e purificadas com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen) e reamplificadas em uma segunda PCR em um volume total de 50 μl com o uso de 1 μl (30 ng) de modelo de DNA, 5 μmol de cada iniciador MJ7 (5’- CATGTGTAGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’ SEQ ID NO:23) e iniciador MJ8 (5 - CATGTGTAGATTCCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGG- 3’ SEQ ID NO:24), 5 μl de tampão de reação 10x, 1 μl de dNTP a 10 mM, 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. O protocolo de PCR consistiu em (i) uma etapa inicial a 94 °C por 3 min, (ii) seguida por 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 57 °C por 30 s e 72 °C por 1 min e (iii) uma etapa de extensão final a 72 °C por 7 min. Os produtos de PCR amplificados, na faixa dentre 340 bp e 420 bp e correspondendo aos fragmentos de VHH dos anticorpos de cadeia pesada, foram purificados com o uso do Kit de Purificação por PCR QIAquick (Qiagen), digeridos com enzima de restrição Sfil (New England BioLabs) e purificados novamente com o uso do mesmo kit.
[096] 80 μg do vetor de fagomídio pMEDI (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b) foram digeridos com Sfil de um dia para o outro a 50 °C. Para minimizar a autoligação, 20 unidades de enzimas de restrição Xhol e Pstl foram adicionadas para cortar o fragmento extirpado, e a reação de digestão foi incubada por mais 2 h a 37 °C. 60 μg do DNA de fagomídio digerido foram ligados a 6 μg de fragmentos de VHH digeridos (Sfil por 5 h a 50 °C) (razão molar 1:1) por 3 h à temperatura ambiente com o uso do Sistema de Ligação de DNA Rápido LigaFast (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos ligados foram purificados com o uso do Kit de Purificação por PCR QIAquick (Qiagen), eluídos em um volume final de 100 μl e transformados em TG1 E. coli eletrocompetente (Stratagene) com o uso de 5 μl de alíquota de DNA ligado por reação de transformação, conforme descrito (Arbabi- Ghahroudi et al, 2009b). O tamanho da biblioteca foi determinado para ser 5 x 107 conforme descrito em (Arbabi-Ghahroudi et al, 2009b). 20 clones foram sequenciados e continham todas as sequências exclusivas de VHH. A E. coli contendo a biblioteca foi proliferada por 2 a 3 h a 37 °C, 250 rpm na presença de 2% (em p/v) de glicose. As bactérias foram, então, peletizadas, ressuspensas em 2xYT/Amp/Glu (meio 2xYT com 100 μg/ml de ampicilina e 2% (em p/v) de glicose) com 35% (em v/v) glicerol e armazenadas a -80 °C em pequenas alíquotas.
[097] Os experimentos de panning foram essencialmente realizados conforme descrito em (Arbabi et al, 1997). Dois mililitros da biblioteca (2,0 x 1010 bactérias) foram descongelados em gelo e proliferados em 2xYT/Amp/Glu por cerca de 2 h a 37 °C (A600 = 0,4 - 0,5). As E. coli foram subsequentemente infectadas com fago auxiliar M13K07 em excesso 20x (New England Biolabs) por 1 h a 37 °C. A cultura foi, então, centrifugada a 4 °C, e os péletes bacterianos infectados foram ressuspensos em 200 ml de 2xYT/Amp com 50 μg/ml de canamicina e incubados a 37 °C e 250 rpm. As partículas de fago no sobrenadantes de cultura foram incubadas com 1/5 de volume de PEG 8000 20%/NaCI a 2,5 M em gelo por 1 h e centrifugadas a 10.000 rpm por 15 min. Os péletes de fago foram ressuspensos em 1,5 ml de PBS estéril, titulados e usados como fago de entrada para panning. Para o ciclo de panning 1, placas com 96 cavidades Maxisorp™ foram revestidas com 10 μg de IGF1R933-His recombinante por cavidade em 100 μl de PBS de um dia para o outro a 4 °C. As cavidades foram enxaguadas com PBS e bloqueadas com PBS mais caseína 1% (em p/v) por 2 h a 37 °C. Aproximadamente 1012 fagos foram adicionados às cavidades bloqueadas e incubados por 2 h a 37 °C. Após lavagem 10x com PBS/Tween 20 0,1% (em v/v), os fagos ligados foram eluídos com trietilamina a 0,1 M, neutralizados (50 μl de Tris-HCI a 1 M, pH 7,4) e misturados com TG1 E. coli se proliferando exponencialmente. A titulação do fago eluído foi realizada, e as bactérias infectadas foram superinfectadas com M13K07 e proliferadas de um dia para o outro a 37 °C. O fago purificado da cultura de um dia para o outro foi usado como a entrada para o próximo ciclo de panning. O panning foi continuado por mais três ciclos. O mesmo protocolo conforme descrito acima foi usado, exceto que a quantidade de antígeno recombinante para revestir as placas foi reduzida para 7 μg, 5 μg e 5 μg para o segundo, o terceiro e o quarto ciclos de panning, respectivamente.
[098] As colônias de TG1 individuais obtidas após o ciclo quatro de panning foram submetidas à triagem por ELISA de fago, essencialmente conforme descrita em outra parte (Doyle et al, 2008), com a exceção de que 5 μg/ml de antígeno recombinante de IGF1R933-His foram usados para revestir as placas de microtitulação. Todos os clones positivos foram enviados para o sequenciamento de DNA. Os clones exclusivos que geraram os sinais de ELISA de fago superiores foram selecionados para a expressão e purificação em larga escala com o uso de métodos conhecidos (consulte o Exemplo 4). Um clone nomeado IGF1R-5 foi identificado para estudo adicional; sua sequência é mostrada abaixo. QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFV ATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSC AMARQSRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5)
Exemplo 4: humanização de IGF1R-5
[099] Para evitar a imunogenicidade potencial do IGF1R-5 derivado de lhama quando aplicado como o carreador de BHE para produtos terapêuticos, o sdAb derivado de camelídeo foi “humanizado” pela mutação de resíduos de “camelídeo” no VHH. Deve ser notado que, para o propósito de humanização, a numeração de Kabat (Kabat et al, 1991) foi usada para a identificação de resíduos de CDR.
[100] Modelagem de estrutura 3D de VHHs camelídeos. As estruturas de modelo similares a VHH de IGF1R-5 foram identificadas com o uso de pesquisas BLAST contra o Banco de Dados de Proteína (PDB). A estrutura 3D do IGF1R-5 foi aproximada com o uso de modelagem de homologia com base em 4KRP|B (PDB código | Cadeia ID) como o modelo principal, com informações adicionais de 4FHB|D. A estrutura de VHH de IGF1R-5 foi, então, construída através da mutação da estrutura de modelo principal à sequência de IGF1R-3; isso incluiu 35 mutações em várias posições. O modelo de VHH de IGF1R-5 foi, então, refinado pela minimização de energia com o campo de força AMBER e uma liberação gradual de restrições, variando dos laços de CDR, que foram relaxados primeiros, aos átomos pesados de cadeia principal da região de armação, que foram completamente relaxados apenas no último estágio. O laço de CDR-H3 do modelo de VHH foi, então, refinado por amostragem conformacional de minimização de Monte-Carlo (MCM), em que os ângulos diédricos na região CDR-H3 foram amostrados seguidos pela minimização de energia.
[101] A seleção da armação de cadeia pesada humana para a CDR camelídea. A armação de cadeia pesada humana foi selecionada por comparação de homologia de sequência padrão a bancos de dados de linhagem germinativa humana (VBASE), a outros bancos de dados de sequências (Genbank e SwissProt) e às sequências de consenso de armação humanas. Pesquisas BLAST foram conduzidas para recuperar as correspondências de sequência com a maior homologia na região de armação apenas (isto é, excluindo a CDR) enquanto correspondem o comprimento da CDR. As armações humanas mais próximas identificadas para VHH de IGF1R-5 corresponderam ao subgrupo VH-3 humano. Diversas sequências de armação de VH-3 de linhagem germinativa humana que foram mais similares a VHH de IGF1R-5 foram também retidas adicionalmente à sequência de consenso de VH-3 humana. As sequências de armação de VHH de IGF1R-5 exigiram 18 mutações a fim de chegar à sequência de VH-3 humana de consenso para 100% de humanização de armação.
[102] Identificação de resíduos de armação para retromutações. O modelo de VHH de IGF1R-5 e sua contraparte completamente humanizada foram caracterizados por estimar o índice de humanidade, índice de propensão a contato de antígeno, por delinear a CDR, resíduos canônicos, resíduos de armação incomuns, sítio de glicosilação potenciais, resíduos ocultados, resíduos de zona de Vernier e proximidade à CDR. A análise desses dados sugeriu o projeto de diversas variantes humanizadas para o VHH anti-IGF1R, sendo que cada variante tem números variados de retromutações aos resíduos de camelídeo progenitores em várias posições. 5 variantes humanizadas foram projetadas para VHH de IGF1R-5 (H1, H2, H3, H5, H6 de IGF1R-5), em que as variantes continham até 10 retromutações. Alguns desses resíduos de retromutações de camelídeo foram ocultados dentro do núcleo de domínio de VHH e, portanto, não se espera que induzam uma resposta imunológica.
Exemplo 5: expressão e purificação de construtos de VHH selecionados
[103] O IGF1R-5 identificado no Exemplo 3 e as versões humanizadas construídas no Exemplo 4 (coletivamente referidas no presente documento como “construtos de VHH”) foram subclonadas em plasmídeos de expressão para a expressão e a purificação de proteína.
[104] Um vetor de fagomídio que contém o DNA do clone de IGF1R-5 foi purificado com o uso do Kit MiniPrep (Qiagen). O IGF1R-5 de VHH de ligação a IGF1R foi amplificado por PCR a partir do vetor de fagomídio pMED1, adicionando o sítio de clivagem de Bbsl de N-terminal e um sítio de clivagem de BamHI no C- terminal, com o uso de iniciadores:5’-TATGAAGACACCAGGCCCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCT-3’ (direto; SEQ ID NO:25) 5’-TTGTTCGGATCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3’ (inverso; SEQ ID NO:26)
[105] O fragmento de PCR e o vetor de expressão pSJF2H foram digeridos com as enzimas de restrição Bbsl e BamHI (NEB) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento de VHH de IGF1R-5 digerido foi ligado ao vetor de expressão pSJF2H digerido, com o uso de métodos similares àqueles descritos em Arbabi-Ghahroudi et al. (2009b); os produtos de ligação foram, então, transformados em TG1 E. coli eletrocompetente. Os clones foram selecionados em placas de ágar LB + 100 μg/ml de ampicilina e verificados por sequenciamento de DNA.
[106] Os clones humanizados foram sintetizados e diretamente clonados em pSJF2H, com o uso de métodos similares àqueles descritos acima, e subsequentemente transformados em E. coli TG1; os clones foram selecionados conforme descrito acima.
[107] Expressão de Proteína. Todos os construtos de VHH de IGF1R-5 foram expressos na TG1 E. coli. Uma cultura de um dia para o outro em meio de LB/amp/glu (meio LB suplementado com 100μg/ml de ampicilina e glicose 1%) foi subcultivadas a uma diluição de 1:100 em 1 l de LB/amp/glu. A expressão de proteína foi induzida a um OD600 de 0,8 a 0,9 pela adição de IPTG a uma concentração final de 0,2 mM. A cultura foi cultivada a 220 rpm de um dia para o outro a 37 °C. As bactérias foram peletizadas por centrifugação a 6.000 rpm por 12 min; o pélete foi ressuspenso em 35 ml de tampão TES frio (Tris-CI a 0,2 M pH 8,0, sacarose 20%, EDTA a 0,5 mM). A suspensão foi incubada em gelo e centrifugada a cada 10 min por 1 hora. Então, 45 ml de TES frio (1/8 de volume do volume total) foram adicionados e imediatamente centrifugados por 1 minuto e por 15 segundos a cada 10 min posteriormente por 1 hora para extrair a proteína do periplasmo. O sobrenadante resultante contendo VHH foi filtrado através de uma membrana de 0,22 μm e dialisado de um dia para o outro em um tampão A de cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) (HEPES a 10 mM pH 7,0, NaCI a 500 mM). A proteína foi purificada com o uso de colunas HP Quelantes HiTrap (GE Healthcare) conforme descrito anteriormente (Arbabi-Ghahroudi 2009b). As frações de proteína eluídas foram analisadas por SDS-PAGE e Western blotting antes de serem dialisadas contra PBS conforme descrito anteriormente (Arbabi-Ghahroudi 2009b). As frações de proteína purificadas foram agrupadas e dialisadas contra PBS + EDTA a 3 mM, e a concentração de proteína foi determinada.
Exemplo 6: caracterização biofísica de IGF1R-5 de VHH anti-IGF1R
[108] Os construtos de IGF1R-5 de VHH anti-IGF1R expressos e purificados no Exemplo 5 foram caracterizados com o uso de cromatografia de exclusão de tamanho, análise por ressonância de plásmon de superfície e análise de temperatura de fusão. O mapeamento de epítopo do VHH de IFG1R-5 foi também realizado.
[109] Cromatografia de exclusão por tamanho: A cromatografia de exclusão de tamanho que emprega Superdex™ 75 (GE Healthcare) foi usada para eliminar quaisquer agregados possíveis antes da análise por Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR). O tampão de corrida usado foi HEPES a 10 mM, pH 7,4 contendo NaCI a 150 mM, EDTA a 3 mM e P20 0,005%. As concentrações de frações usadas para a análise por SPR foram determinadas medindo-se a absorvância a um comprimento de onda de 280 nm. A análise de SEC sugeriu que os anticorpos eram monoméricos, com base no volume de eluição em comparação aos padrões (Figura 3A).
[110] Temperatura de fusão: A estabilidade térmica dos construtos de VHH de IGF1R-5 foi avaliada com o uso da medição da temperatura de fusão (Tm) por espectroscopia CD. Um espectropolarímetro Jasco J-815 equipado com um sistema de controle de temperatura do tipo termoelétrico Peltier (Jasco, Easton, MD, EUA) foi usado para executar experimentos. Um cadinho CD com um comprimento de trajeto de 1 mm foi usado. Os espectros foram gravados ao longo de uma faixa de comprimento de onda de 180 a 260 nm com velocidade de varredura de 50 nm/min, tempo de integração digital (DIT) de 4 s, uma largura de banda de 1 nm, afastamento de dados de 1 nm e um tempo de integração de 1 s. Para medir a temperatura de fusão ou Tm (Greenfield, 2006a; 2006b), espectros de CD foram gravados ao longo de uma faixa de temperatura de 30 °C a 96 °C. Todos os espectros de CD foram subtraídos do valor bruto que corresponde aos espectros de tampão. As medições foram realizadas com 50 μg/ml de VHH em tampão de fosfato de sódio a 100 mM, pH 7,4. A desnaturação de proteína induzida por calor foi monitorada a 210 nm para todas as variantes. A fração dobrada (ff) foi obtida por uma fórmula conforme descrito (Greenfield, 2006a; 2006b):ff=([θ]T-[θ]U)/( [θ]F-[θ]U) fórmula I em que [Θ]T é a elipticidade molar a qualquer temperatura, [θ]F é a elipticidade molar da proteína completamente dobrada a 30 °C e [θ]u é a elipticidade molar da proteína desdobrada a 90 °C. A temperatura de fusão (Tm) foi obtida como um ponto médio da curva de desdobramento (fração dobrada (ff) versus temperatura) por um encaixe de curva de regressão não linear (equação sigmoide de Boltzman) com o uso de software de gráficos GraphPad Prism (versão 4.02 para Windows). As temperaturas de fusão (Tm) de VHH foram determinadas com base nos dados de elipticidade presumindo um sistema de dois estados que está de acordo com as curvas de desnaturação observadas que correspondem a uma transição abrupta para a desnaturação (Figura 2D). Os valores de Tm foram tomados no ponto médio das curvas de desnaturação sigmoides da fração dobrada (ff) versus temperatura. Os resultados são mostrados na Figura 3B. As temperaturas de fusão de todos os VHH humanizados foram melhoradas (maiores) em comparação ao VHH de IGF1R-5, sugerindo propriedades biofísicas aprimoradas.
[111] Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR): A ligação de construtos de VHH de IGF1R-5 monoméricos ao IGF1R humano recombinante imobilizado (Exemplo 1) foi determinada por SPR com o uso de BIACORE 3000 (GE Healthcare). Aproximadamente 3.000 Unidades de Ressonância (RU) do IGF1R humano recombinante (R&D Systems) foram imobilizadas em um chip sensorial CM5. A imobilização foi executada a uma concentração de 10μg/ml em acetato a 10 mM a pH 4,0 com o uso do kit de acoplamento de amina fornecido pelo fabricante. Os sítios de ligação restantes foram bloqueados com etanolamina a 1 M pH 8,5. Uma superfície bloqueada com etanolamina foi usada como uma superfície de referência. Para os estudos de ligação, análises foram executadas a 25 °C em HEPES a 10 mM, pH 7,4 contendo NaCI a 150 mM, EDTA a 3 mM e tensoativo P20 0,005% (Polioxietilenossorbitano; GE Healthcare). Várias concentrações do VHH de IGF1R-5 foram injetadas através do IGF1R humano imobilizado e das superfícies de referência a uma taxa de fluxo de 20 μl/min. As superfícies foram regeneradas com glicina a 10 mM pH 2,0 com um tempo de contato de 24 segundos. Os dados foram analisados com o software BIAevaluation 4.1 (GE Healthcare). Os resultados (consulte a Figura 3C) mostram que os dados encaixam bem em um modelo de 1:1, gerando o KD mostrado na Tabela 1. Isso mostra que IGF1R-5 e as variantes humanizadas são ligantes de anticorpo de domínio único de alta afinidade ao domínio extracelular do IGF1R humano.Tabela 1. Afinidade de construtos de VHH de IGF1R-5 para (h) IGF1R humano conforme determinado pela ressonância de plásmon de superfície.
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[112] As análises por SPR foram adicionalmente usadas para demonstrar que VHH de IGF1R-5 não se liga ao mesmos epítopo no receptor que o ligante natural IGF-1 (Figura 3D). O experimento foi definido, executado e analisado conforme descrito acima. A ligação a uma superfície de IGF1R humano recentemente imobilizado foi estudada pela injeção de VHH de IGF1R-5 a uma concentração de 25xKD seguida pela coinjeção de IGF1R-5 e ligante de IGF-1 humano, ambos a concentrações de 25xKD, com taxas de fluxo de 20 μl/min e tempos de injeção de 5 minutos. As superfícies foram regeneradas pela lavagem com tampão de corrida. O VHH de IGF1R-5 se ligou ao receptor, com uma saturação alcançada a cerca de 38 RU na superfície não regenerada. O ligante de IGF-1 teve a capacidade de se ligar ao receptor IGF1R na presença do VHH de IGF1R-5 com as ~70 RU (unidades relativas) esperadas. A ligação simultânea de VHH de IGF1R-5 e IGF-1 ao receptor demonstra que ambos se ligam a diferentes epítopos. A análise por SPR de VHH de IGF1R-5 e do receptor de insulina sugeriu que o VHH de IGF1R-5 não pode se ligar ao receptor de insulina (dados não mostrados). Apesar das diferentes unidades relativas (RU) da ligação de IGF1R-5 a uma superfície regenerada versus não regenerada fresca, a afinidade de ligação determinada em ambas as superfícies foi altamente similar e poderia ser reproduzida em diferentes experimentos (dados não mostrados).
[113] Mapeamento de Epítopo: Serviços de mapeamento de epítopo foram fornecidos pela Pepscan (Lelystad, Holanda; pepscan.com). A sequência de comprimento completo do IGF1R é mostrada na Figura 2. Com base nos resultados do mapeamento de epítopo e na renderização tridimensional da estrutura de receptor de insulina relacionada (conforme publicado no Banco de Dados de Proteína de n° de acesso 2DTG, não mostrado), sugeriu-se que o epítopo ao qual VHH de IGF1R-5 se liga é FENFLHNSIFVPR (SEQ ID NO:11).
Exemplo 7: intemalização do IGF1R-5 por células endoteliais cerebrais
[114] Para determinar se IGF1R-5 é internalizado nas células, células svARBEC foram incubadas com IGF1R-5 identificado com Cy5-5.
[115] VHH de IGF1R-5 foi identificado com NHS-Cy5.5. A identificação foi feita através de uma ligação de amina estável entre as aminas primárias (no N-terminal e/ou nas cadeias laterais de lisina da proteína) e o éster NHS. Tipicamente, 10% em v/v de tampão de carbonato/bicarbonato a 1M (bicarbonato a 759 mM, carbonato a 258 mM) pH 9,3 foram adicionados a 4 mg de VHH preparados em PBS (KH2PO4 1,06 mM, NaCI a 154 mM, Na2HPO4 5,6 mM) pH 7,4 e ajustados a uma concentração final de 4 mg/ml. O NHS-Cy5.5, dissolvido em DMSO a 10 mg/ml, foi adicionado a uma razão molar de 2X entre corante e proteína. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 2 h com diversas inversões em um tubo para microcentrífuga de 1,5 ml. Após a incubação, o corante não ligado e subprodutos de reação foram filtrados com o uso de Colinas de Dessalinação Zeba Spin, 7K MWCO (Pierce) e medidos com o uso de um espectrofotômetro Beckman DU530 (Beckman Coulter). IGF1R-5 identificado com Cy5.5 ou FC5 como um controle positivo (1 mg/ml) foram incubados com células endoteliais cerebrais de rato imortalizadas SV40 (svARBEC) a 4 °C (Figura 4, painéis superiores), permitindo assim que apenas o mecanismo de transporte não específico passivo ocorra, ou a 37 °C (Figura 4, painéis inferiores) para permitir que o transporte ativo tal como a endocitose mediada por receptor ocorra. O comanchamento com aglutinina do germe de trigo e DAPI foi executado para visualizar a superfície celular e o núcleo, respectivamente. As células foram observadas sob microscópio fluorescente, e imagens foram capturadas.
[116] Se incubado a 4 °C, o IGF1R-5 foi encontrado fora das células que se colocalizam com a membrana celular manchada com aglutinina do germe de trigo. Em contraste, quando incubado a 37 °C, o IGF1R-5 se acumulou em vesículas dentro das células, provavelmente endossomas, sugerindo que o anticorpo se internalizou nas células através de um mecanismo de transporte ativo. Um comportamento similar foi observado para FC5 que mostrou, anteriormente, entrar nas células por endocitose dependente de energia por meio de vesículas revestidas com clatrina (Abulrob et al. 2005)
Exemplo 8: produção de construtos de IGF1R-5-FC
[117] Construtos que compreendem VHH de IGF1R-5 fundido a um fragmento de anticorpo murino cristalizável (Fc; mFc2b) foram preparados, expressos e isolados. Tanto um construto de C-terminal (IGF1R-5-mFc) quanto um construto de fusão de Fc de camundongo de IGF1R-5 de N-terminal (mFc-IGF1R-5) foram produzidos, cujas sequências são mostradas nas Figuras 5A-B, com um esquema das moléculas mostrado na Figura 5C. As proteínas de fusão (~80 kDa) também compreenderam um peptídeo de sinal de N-terminal (MEFGLSWVFLVAILKGVQC; SEQ ID NO:40) que não é mostrado na sequência das Figuras 5A-B já que o mesmo é clivado após a secreção.
[118] O cDNA de IGF1R-5 foi clonado no vetor de expressão de mamífero pTT5 (Durocher, 2002) que contém o fragmento Fc2b de camundongo. Poliplexos do vetor resultante foram pré-formados misturando-se 25 ml de solução de DNA de plasmídeo contendo 187,5 μg de pTT5-IR5mFc2b, 56,25 μg de pTT-AKTdd (mutante ativado de Proteína Quinase B), 18,75 μg de pTTo-GFP (para monitorar a eficácia de transfecção) e 112,5 μg de DNA de testículos de salmão (Sigma-Aldrich); e 25 ml de solução PEI contendo 1,125 mg de PEIproTM (PolyPlus Transfection), ambas feitas em meio F17. A mistura foi incubada por 10 minutos antes da adição à cultura celular. Uma cultura de 450 ml de células CHO expressando estavelmente uma proteína EBNA1 truncada (CHO-3E7) e cultivada em meio F17 (Invitrogen) foi transfectada com 50 ml de poliplexos. Vinte e quatro horas após a transfecção, a cultura foi alimentada com 12,5 ml de solução de triptona N1 40% (em p/v) (Organotechnie) e 1,25 ml de solução de ácido valproico a 200 mM. A cultura foi coletada 8 dias após a transfecção e clarificada por centrifugação. O meio clarificado foi filtrado através de uma membrana de 0,22 μm antes de sua aplicação em uma coluna empacotada com 5 ml de resina MabSelect SuRe de proteína A (GE Healthcare). Após o carregamento, a coluna foi lavada com 5 volumes de solução salina tamponada com fosfato pH 7,1 (PBS), e o anticorpo foi eluído com tampão de citrato de sódio a 100 mM pH 3.0. As frações contendo o anticorpo eluído foram agrupadas, e uma troca de tampão foi realizada pelo carregamento em uma coluna de dessalinização Econo-Pac (BioRad) equilibrada em PBS. O anticorpo dessalinizado foi, então, esterilizado por filtração passando através de uma unidade de filtro Millex GP (Millipore) (0,22 μm) e aliquotado.
Exemplo 9: farmacocinética de IGF1R-5-MFC em CSF e plasma
[119] Um ensaio in vivo foi executado para determinar se IGF1R-5-mFc (Exemplo 8) tem a capacidade de atravessar para o cérebro e especificamente para o fluido cérebro-espinhal (CSF), assim como quantificar sua presença no CSF e soro.
[120] A técnica usada para a amostragem múltipla do CSF da cisterna magna foi desenvolvida em NRC pela modificação de métodos descritos anteriormente (Huang et al.,1995; Kornhuber et al., 1986; Yaksh e Rudy, 1976). Os animais foram alojados sozinhos em gaiolas de polipropileno e tiveram acesso livre a alimento e água. Os experimentos foram feitos em um ciclo de luz/escuro de 12 h a uma temperatura de 24 °C e uma umidade relativa de 50 ± 5%. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados de Animais e estavam de acordo com o Conselho canadense de diretrizes para Cuidados de Animais.
[121] Ratos machos Wistar com 8 a 10 semanas de idade (faixa de peso, 230 a 250 g) foram anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina (45/12 mg/kg, i.p.) e montados em um instrumento estereotáxico (qualquer outro dispositivo que reterá a cabeça do animal firmemente poderia ser usado). Uma incisão começando em uma linha que une as orelhas e se estendendo cerca de 3 cm em uma direção da cauda foi feita na linha média: a fáscia foi retraída do crânio expondo uma camada superficial dos músculos do pescoço que foram, então, separados por uma incisão na linha média começando na crista occipital e se estendendo caudalmente cerca de 2 cm. A separação da musculatura superficial expôs uma camada subjacente de músculos que foi facilmente separada ao longo da linha média por dissecção romba. Uma ferramenta de raspagem foi usada para soltar os músculos de seu ponto de origem no osso occipital por cerca de 0,5 cm em ambos os lados da linha média; a retração suave da musculatura do pescoço expôs a membrana atlanto-occipital; a cabeça do rato foi, então, girada para baixo a um ângulo de cerca de 45°. Um pequeno orifício foi feito com o uso da ponta de uma agulha descartável 27G; quando a incisão é realizada corretamente, CSF claro deve jorrar imediatamente através da fenda; uma tubulação de polietileno (PE-20) foi, então, inserida 0,5 cm na fenda. A cânula foi, então, fixada à membrana atlanto-occipital com o auxílio de cola Histoacryl ou cola Vetbond, permitindo a coleta de amostra por longos períodos de tempo (mais do que uma semana) e também impedindo infecções ou outros contaminantes de entrar no CSF; a cânula foi, então, enxaguada completamente com CSF artificial. A porção de coleta da cânula foi firmemente fixada ao osso occipital com cimento dental. Uma vez que a cânula foi fixada, a parte solta (4 a 5 cm) foi rosqueada através da pele com uma agulha 20G, o músculo e a pele foram, então, fechados, a porção exposta foi cortada ao comprimento desejado, e a ponta foi levemente aquecida para impedir o refluxo de CSF. Finalmente, o animal foi colocado em um quarto de recuperação por pelo menos uma semana para permitir o fechamento da cisterna magna. Essa técnica não envolve perfuração através do crânio, conforme descrito por outros métodos, evitando danos das meninges e do tecido nervoso adjacente.
[122] Uma semana após a canulação pós-cisternal, 5 mg/kg de IGF1R-5mFc ou fusão de A20.1 mFc de controle foram injetados na veia da cauda. Os ratos foram anestesiados com isoflurano 3%; os primeiros 10 μl do CSF acumulados na cânula foram descartados. 10 μl do CSF foram coletados a 0,5, 1, 2, 24 e 48 h após a injeção. Amostras de sangue (50 μl) foram retiradas da veia da cauda (Fluttert et al., 2000) com o uso de tubos de gel de polímero (Becton, Dickinson and Company Franklin Lakes, NJ EUA) nos mesmos pontos no tempo; as amostras foram centrifugadas (15 min a 1.600 rcf; temperatura ambiente). As amostras foram armazenadas a -80 °C até serem analisadas. No final dos experimentos, os ratos foram sacrificados por decapitação sob anestesia.
[123] As amostras de soro e CSF foram analisadas por espectrometria de massa e quantificação com base em nanoLC-SRM conforme descrito no Exemplo 7.
[124] A coleta de CSF é um procedimento delicado durante o qual o CSF pode ser facilmente contaminado com sangue. Já que se espera que as quantidades de VHH sejam muito menores no CSF (<0,1%) do que no sangue, até mesmo uma contaminação leve com sangue poderia comprometer seriamente o valor de uma amostra individual de CSF. Foi, portanto, necessário desenvolver critérios de exclusão rigorosos para as amostras de CSF contaminadas com sangue. Para avaliar a razão de albumina no sangue-CSF, um método de nanoLC-SRM foi desenvolvido para quantificar os níveis de albumina no plasma e CSF. Um peptídeo de albumina APQVSTPTLVEAAR (SEQ ID NO:38) foi selecionado com base em seu tempo de retenção exclusivo e valor de m/z (Mol Pharm) a fim de ter uma interferência mínima com os outros picos de peptídeo no ensaio multiplex. A intensidade do peptídeo foi quantificada em amostras de CSF e plasma com o suo de SRM conforme descrito acima. A razão de albumina foi calculada conforme segue para cada rato:Razão de Albumina = Intensidade por nl de plasma analisado / Intensidade por nl de CSF analisado Uma razão de 1.500 e menor foi considerada como contaminada com sangue.
[125] Os resultados são mostrados na Figura 9 e Tabela 2. A figura mostra um perfil farmacocinético sérico ‘típico’ da molécula contendo Fc. Os níveis de CSF de IGF1R-5Fc aumentam ao longo do tempo, com pico 24 h após a injeção, quando os mesmos atingem 2% de níveis séricos. Embora o declínio/níveis séricos sejam similares para as moléculas de fusão de A20.1 Fc de controle, seus níveis de CSF são mínimos, atingindo 0,04% de níveis séricos em 24 h. A Tabela 2 mostra os parâmetros farmacocinéticos do IGF1R5-Fc e A20.1-Fc de controle no CSF e no soro após a administração intravenosa sistêmica de doses equimolares (5 mg/kg de fusões de VHH-Fc). As meias-vidas séricas do IGF1R5-Fc e do A20.1-Fc de controle foram 23 h e 25 h, respectivamente.
[126] O A20.1 Fc de controle negativo (75 kD) mostra uma razão entre soro/CSF em 24 h similar àquelas descritas na literatura para moléculas de tamanho similar. A razão típica entre soro/CSF (lombar) para albumina (60 kD) em estado de equilíbrio é 0,1% enquanto que a razão entre soro/CSF para IgG é 0,07 (Shen et al., 2004; Lin, 2008). A razão entre soro/CSF de IGF1R5-Fc em 24 h é 50 vezes maior do que para A20.1 mFc.
[127] A razão AUC entre CSF/soro para cada molécula é indicativa da ‘exposição’ a CNS do construto ao longo de um período de 48 h. IGF1R-5-FC mostra uma exposição a CNS 33 vezes maior em comparação a A20.1 Fc. Os resultados indicam que IGF1R-5Fc ganha acesso facilitado ao CSF em comparação à molécula de fusão de VHH-Fc de controle; isso poderia ocorrer por meio de uma ‘secreção’ específica pelo plexo coroide, ou por meio da ‘eliminação’ (difusão através da camada ependimária que forra o sistema ventricular do cérebro ou por meio de um fluxo volumoso de fluido intersticial) do parênquima do cérebro após atravessar a BHE, ou ambos (Abbott 2004; DeLange, 2002; Groothius, 2007).
[128] Os construtos adicionais de ~110 kDa e 180 kDa também mostraram ser transportados através da BHE por IGF1R-5 e uma versão humanizada (dados não mostrados).Tabela 2. Parâmetros farmacocinéticos de IGF1R-5FC e A20.1 fc sistematicamente injetados em soro e CSF da cisterna magna de ratos.
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Exemplo 10: transporte do IGF1R-5 através do modelo de barreira hematoencefálica in vitro
[129] Para avaliar se o VHH de IGF1R-5 e os construtos do Exemplo 8 transmigram a barreira hematoencefálica, um ensaio in vitro foi usado conforme descrito abaixo. Um fluxograma que resume o experimento é mostrado na Figura 6A.
[130] Células Endoteliais Cerebrais de Rato Adulto imortalizadas com SV40 (Sv- ARBEC) foram usadas para gerar um modelo de barreira hematoencefálica in vitro (BHE) conforme descrito (Garberg et al., 2005; Haqqani et al., 2012). Sv-ARBEC (80.000 células/membrana) foram inoculadas em 0,1 mg/ml de insertos de cultura de tecido revestidos com colágeno de cauda de rato tipo I (tamanho de poro- 1 μm; área de superfície 0,9 cm2, Falcon) em 1 ml de meio de crescimento. A câmara inferior da montagem de inserto continha 2 ml de meio de crescimento suplementado com meio condicionado com astrócitos de rato neonatais imortalizados em uma razão de 1:1 (v/v).
[131] Quantidades equimolares (5,6 μM) de controles positivo (FC5) ou negativo (A20.1, um VHH de ligação a toxina A de Clostridium difficile; e EG2, um VHH de ligação a EGFR), IGF1R-5 VHH e dos construtos de mFc-IFG1R-5 de C- e N-terminal do Exemplo 8 foram testadas quanto a sua capacidade de atravessar esse modelo de BHE in vitro de rato.
[132] Após a exposição das quantidades equimolares do sdAb ao lado luminal da BHE, amostras foram coletadas após 15, 30 e 60 min do lado abluminal. O teor de sdAb de cada amostra foi, então, quantificado por espectrometria de massa (monitoramento de múltiplas reações com padrões internos identificados com isótipo; MRM - ILIS) conforme descrito por Haqqani et al.(2012) (consulte a descrição do método abaixo).
[133] Determinação do coeficiente de permeabilidade aparente: Os valores quantificados podem ser diretamente plotados, ou os valores de Papp (coeficiente de permeabilidade aparente) podem ser determinados com a fórmula dada (Figura 5A) e plotados. O valor de Papp é comumente usado para determinar a capacidade de uma molécula de atravessar a BHE. [Qr/dt = quantidade cumulativa no compartimento receptor versus tempo; A = área da monocamada celular; CO = concentração inicial da solução de dosagem]. Os valores de Papp são uma medição da permeabilidade específica do composto através da monocamada endotelial cerebral.
[134] Os resultados são mostrados nas Figuras 6B-D. Os resultados dados são os valores médios de Papp obtidos a partir de diversos experimentos independentes. Ambos os controles negativos têm um valor muito baixo de Papp, indicando que o transporte não específico ou o transporte paracelular desses VHHs através do modelo de BHE é mínimo. O VHH de IGF1R-5 tem um valor alto de Papp, indicando uma alta taxa de transporte através do modelo de BHE in vitro. O Papp para VHH de IGF1R-5 (Figura 6B) é similar a este de um controle positivo - VHH FC5 permeável a BHE (WO 02/057445). As variantes de IGF1R-5 humanizadas mostraram valores de Papp similares ou maiores ao IGF1R-5 de tipo selvagem (Figura 6C). Notavelmente, H2 de IGF1R-5 mostrou um aumento significativo de 35% no valor de Papp em comparação ao IGF1R5 de tipo selvagem (Figura 6C). Duas variantes humanizadas, H1 de IGF1R-5 e H2 de IGF1R, que mostraram travessia de BHE in vitro melhorada (valores de Papp), também mostraram 'dissociações' mais rápidas nos estudos de ligação de receptor por SPR executados aqui (Figura 3C), sugerindo que 'dissociações' mais rápidas são desejáveis para melhorar a transcitose dos anticorpos que se ligam ao receptor de transcitose mediada por receptor de BHE IGF1R. IGF1R-5 fundido ao N- ou C-terminal de Fc murino (80 kD) tinha valores similares de Papp ao IGF1R-5 de anticorpo de domínio único (15 kD), mostrando que moléculas de 80 kD podem atravessar eficazmente a BHE in vitro quando fundidas ao IGF1R. Notavelmente, a fusão ao N-terminal de Fc forneceu alguma vantagem (15% de melhora em Papp). Esses dados mostram que IGF1R-5 pode ser usado como uma plataforma para modificar anticorpos biespecíficos em particular para serem fundidos ao C-terminal de uma IgG completa com função terapêutica que exige o transporte para o cérebro. Esses resultados fornecem forte indicação de que o IGF1R-5 passa por um transporte transcelular facilitado através de células endoteliais cerebrais in vitro e poderia ter propriedades similares in vivo. É digno de nota que os construtos que compreendem IGF1R-5 ou uma versão humanizada ligada a uma molécula de carga (MW ~110 kDa ou 180 kDa) também mostraram ser transportados através da BHE (dados não mostrados).
[135] Quantificação absoluta de VHH com o uso do método de MRM-ILIS. Os métodos são todos conforme descrito em Haqqani et al. (2012). Resumidamente, para desenvolver o SRM (monitoramento de reação selecionada também conhecido como ensaio de monitoramento de múltiplas reações (MRM)) para VHHs, cada VHH foi primeiramente analisado por nanoLC-MS/MS com o uso da aquisição dependente de dados para identificar todos os peptídeos ionizáveis. Para cada peptídeo, os 3 a 5 íons de fragmento mais intensos foram escolhidos. Um ensaio de SRM inicial foi desenvolvido para monitorar esses fragmentos a quantidades em attomol do digesto (cerca de 100 a 300 amoles). Os fragmentos que mostraram razões de intensidade reproduzíveis em quantidades baixas (isto é, tinham Pearson r2 > 0,95 em comparação a quantidades maiores) foram considerados estáveis e foram escolhidos para o ensaio de SRM final. Para otimizar adicionalmente o ensaio, os tempos de eluição para cada peptídeo foram também incluídos, tomando cuidado para não escolher peptídeos que têm tempos de eluição e m/z (razão entre massa e carga) estreitos.
[136] Uma análise por SRM multiplexada típica do VHH em meios celulares ou fluidos corporais (soro ou fluido cérebro-espinhal (CSF)) envolveu elevar uma quantidade conhecida de ILIS (0,1 a 10 nM) seguida pela injeção de 100 a 400 ng de CSF ou proteínas de meio cultivado (0,3 a 1 μl) ou cerca de 50 a 100 ng de proteínas séricas (1 a 3 nanolitros) no sistema nanoLC-MS. A m/z precursora de cada íon de peptídeo alvo foi selecionada no coletor de íons (e os íons não relacionados restantes foram descartados) no tempo de eluição especificado para o alvo, seguido pela fragmentação de dissociação induzida por colisão (CID) e seleção apenas dos íons de fragmento desejados no coletor de íons para monitoramento pelo detector. Para a análise de quantificação, os arquivos brutos gerados pelo LTQ (ThermoFisher) foram convertidos no formato de dados de espectrometria de massa padrão mzXML, e as intensidades foram extraídas com o uso de um software interno chamado Q-MRM (MRM Quantitativo; consulte Haqqani et al. 2012), que é uma versão modificada do software MatchRx. Para cada VHH, cromatogramas de íon extraído foram gerados para cada um de seus íons de fragmento que consistiam em intensidades combinadas dentro de 0,25 Da da m/z de fragmento ao longo do tempo de eluição inteiro. Para obter um valor de intensidade final para cada fragmento, todas as intensidades dentro de 0,5 min dos tempos de retenção esperados foram somadas. Um VHH foi definido como detectável em uma amostra se os fragmentos de pelo menos um de seus peptídeos mostrassem as razões de intensidade esperadas, isto é, os valores de intensidade finais mostraram uma forte correlação de Pearson r>0,95 e p<0,05 em comparação aos valores de intensidade finais de seu VHH puro correspondente.
[137] As amostras que contêm misturas de VHH (meio, soro, CSF) foram reduzidas, alquiladas e digeridas por tripsina conforme anteriormente descrito (Haqqani et al., 2012; Gergov et al., 2003). Os digestos (peptídeos trípticos) foram acidificados com ácido acético (5% de concentração final) e analisados em um nanoAcquity UPLC de fase inversa (Waters, Milford, MA) acoplado ao espectrômetro de massa LTQ XL ETD ou LTQ Orbitrap ETD (ThermoFisher, Waltham, MA). A alíquota desejada da amostra foi injetada e carregada em um coletor de 300 μm I.D. x 0,5 mm 3 μm PepMaps C18 (ThermoFisher), então, eluída em uma coluna de 100 μm I.D. x 10 cm 1,7 μm BEH130C18 nanoLC (Waters) com o uso de um gradiente de 0% a 20% de acetonitrila (em fórmico 0,1 %) em 1 minuto, 20% a 46% em 16 min e 46% a 95% em 1 min a uma taxa de fluxo de 400 nl/min. Os peptídeos eluídos foram ionizados no espectrômetro de massa por ionização por eletroaspersão (ESI) para análise por MS/MS e SRM com o suo de CID para a fragmentação dos íons de peptídeo. A CID foi realizada com hélio como o gás de colisão a uma energia de colisão normalizada de 35% e 30 ms de tempo de ativação. Os tempos de injeção de íon no coletor de íons linear foram ajustados pelo instrumento com o uso de um valor alvo de controle de ganho automático (AGC) de 6 x 103 e um tempo de acumulação máximo de 200 ms
[138] Os peptídeos específicos para VHH usados para a detecção e a quantificação de cada VHH em um ensaio multiplexado são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Os peptídeos usados na detecção nanoLC-SRM de FC5, FC5-ILIS, EG2, A20.1, IGF-1 R-5 e albumina. (a) Em vários estudos descritos, os ensaios foram multiplexados em diferentes combinações para o monitoramento simultâneo na mesma amostra; (b) Peptídeo identificado como pesado; (c) Limites de detecção e quantificação do ensaio de SRM para cada peptídeo na faixa de 1,5 a 2,5 ng/ml. 1 ng/ml corresponde a cerca de 60 a 70 pM de VHH. A20-1 conforme descrito em Hussack et al, 2011b; EG2 conforme descrito em Iqbal et al, 2010.
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Exemplo 11: conjugação de IGF1R-5 à Galanina
[139] Para determinar se VHH de IGF1R-5 pode cruzar a barreira hematoencefálica (BHE) in vivo e ‘transportar’ através da BHE uma molécula que não pode atravessar a BHE sozinha, o neuropeptídeo Galanina foi quimicamente conjugado ao VHH de IGF1R-5 ou IGF1R-5 fundido ao Fc murino de C- ou N- terminal e administrado sistemicamente. A Galanina é um peptídeo neuroativo que produz analgesia através da ligação de GalR1 e GalR2 expressos no tecido cerebral. Quando dada perifericamente, a Galanina não tem nenhum efeito analgésico porque a mesma não pode atravessar a BHE sozinha (Robertson et al., 2011).
[140] O VHH de IGF1R-5 e os construtos de fusão de Fc foram conjugados a um fragmento de Galanina (Gal) de rato com C-terminal modificado por cisteamida (Biomatic) (GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-cisteamida, SEQ ID NO:39). O esquema para a conjugação é mostrado na Figura 7.
[141] Resumidamente, 5 mg de VHH de IGF1R-5 (Exemplo 5) em PBS 0,5X, EDTA a 2,5 mM a [2 mg/ml] foram misturados com 436,4 μl de 2,5 mg/ml de sulfossuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) (razão molar de excesso 7,5x). A mistura foi, então, enxaguada com gás nitrogênio e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente (TA) para permitir que o braço de éster NHS do Sulfo-SMCC reaja com aminas no VHH. Subsequentemente, o Sulfo- SMCC não reagido foi removido do VHH de IGF1R-5 ativado por maleimida com o uso de uma coluna de 10 ml 7K Zeba (Pierce). Antes do carregamento de amostra, a coluna foi lavada 3 vezes com 5 ml de PBS e girada a 1.000xg por 2 min. Após o carregamento de amostra, a coluna foi completada com 200 μl de PBS e foi girada por 2 min a 1.000xg. Para os construtos de IGF1R-Fc, 5 μg foram reagidos com ~68 μl de Sulfo-SMCC (razão molar de excesso 6,5x) conforme descrito acima.
[142] Separada e concomitantemente, a galanina C-TERM modificada por cisteamida (Gal-cya) foi preparada dissolvendo-se 10 mg de pó liofilizado em 10 ml de água livre de endotoxina para produzir um estoque de 1mg/ml (a galanina-cya em pó tem uma pequena quantidade de DTT para impedir a formação de ponte de dissulfeto durante a purificação). Finalmente, 100 μl de EDTA a 0,5 M foram adicionados (concentração final de 5 mM).
[143] Os construtos de VHH de IGF1R-5 e IGF1R-Fc ativados por maleimida purificados (2,6 ml) foram diluídos a 5 ml com PBS 0,5X, EDTA a 2,5 mM e, então, 5 ml ou 1ml deGal-cya, respectivamente, foi adicionado durante a centrifugação. As amostras foram enxaguadas com nitrogênio, vedadas e incubadas de um dia para o outro a 4 °C. No dia seguinte, a Gal-cya não reagida foi removida com o uso da coluna Amicon-15 10K e 30K (Millipore), respectivamente. As amostras foram adicionadas à coluna e giradas a 4.000xg por 7 minutos até o volume ter sido reduzido a 5 ml. 5 ml de PBS 0,5X, EDTA a 2,5 mM foram adicionados à amostra de 5 ml restante no inserto da coluna e foram girados novamente até a amostra ter sido reduzida a 4 ml. As amostras conjugadas foram, então, adicionadas a uma coluna de 10 ml 7K Zeba (Pierce), preparadas conforme descrito acima e, então, giradas por 2 min a 1.000xg.
[144] As amostras de IGF1R-5-Gal e IGF1R-Fc-Gal conjugadas foram, então, executadas em um gel não redutor SDS-PAGE de 16% ou 10% e manchado com prata para confirmar o desvio no tamanho de peso molecular após a conjugação. A reação foi titulada para alcançar ~1 a 2 moléculas de galanina por construto de VHH ou IGF1R-Fc.
[145] Remoção de endotoxina e determinação dos níveis de endotoxina: As endotoxinas foram removidas com o uso de colunas de centrifugação de membrana de celulose de corte de peso molecular Amicon Ultra (Millipore). Primeiro, 15 ml da preparação de VHH foram passados através de uma coluna Amicon-15-50K MWCO por centrifugação a 4.000xg por 10 minutos; a eluição foi coletada. Essa eluição foi, então, adicionada a uma coluna Amicon-15-10K MWCO e girada a 4.000xg por 7 a 10 minutos resultando em uma redução do volume de sobrenadante de 15 ml a 7,5 ml. O volume de sobrenadante na coluna foi ajustado de volta para 15 ml adicionando-se PBS. A coluna foi girada novamente conforme descrito acima. O sobrenadante foi coletado, e os níveis de endotoxina foram medidos com sistema EndoSafe-PTS com o uso de cartuchos com uma faixa da sensibilidade de 10 a 0,1 EU/ml (Charles River Laboratories International). 25 μl de amostra foram carregados em cada uma das 4 cavidades no cartucho e diluídas se necessário. Apenas as amostras com EU<1 por 1 mg foram usadas para estudos em animais.
[146] Os construtos de fusão de Fc foram produzidos em células de mamífero sob condições estéreis. Os níveis de endotoxina foram medidos conforme descrito acima nas amostras purificadas de células, e apenas amostras com <0,5 EU por 1 μg foram usadas para estudos em animais.
Exemplo 12: transporte do IGF1R-5-GAL com o uso do modelo de Hargreaves
[147] Para avaliar se IGF1R-5-Gal, mFc-IGFI R-5-Gal e IGF1R-5-mFc-Gal (Exemplo 11) transmigram a barreira hematoencefálica, um ensaio in vivo foi utilizado, anteriormente descrito na Publicação de Patente Internacional n° WO 2011/127580.
[148] Um modelo de rato de hiperalgesia inflamatória, similar a este descrito por Hargreaves et al. (1988), foi usado. Os animais foram alojados em grupos de três (modelo de Hargreaves) por gaiola de polipropileno e tiverem acesso livre a alimento e água. Os experimentos foram feitos em um ciclo de luz/escuro de 12 h a uma temperatura de 24 °C e uma umidade relativa de 50 ± 5%. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados de Animais e estavam de acordo com o Conselho canadense de diretrizes para Cuidados de Animais.
[149] Nesse modelo, ratos machos Wistar com 6 a 8 semanas (faixa de peso 230 a 250 g) de idade receberam injeção com volume baixo (100 μl com uma agulha de calibre 30) de adjuvante completo de Freund (CFA; M. tuberculosis exterminada por calor (Sigma) suspensa em uma emulsão de óleo:solução salina a 1:1) na pata posterior direita sob breve anestesia de isoflurano (3%). O CFA induz a liberação de substâncias pró-inflamatórias que ativam nociceptores e criam um estado de dor crônica e hiperalgesia (uma elevada sensibilidade a calor nocivo). A latência de retirada da pata foi medida pela aplicação de um estímulo radiante na superfície plantar em ambas as patas posteriores (pata de controle não inflamada e inflamada) com o uso do equipamento Medidor de Analgesia plantar para estimulação de pata (IITC Modelo n° 336TG Life Science, Inc.). O tempo levado pelo animal para responder lambendo ou tocando sua pata foi interpretado como a resposta positiva (latência de retirada da pata). A lâmpada de intensidade de luz foi ajustada para obter latências de retirada da pata de linha de base entre 17 a 20 s em ambas as patas posteriores antes da administração de CFA. Se uma resposta de retirada não ocorrer dentro de 20 s, o feixe de luz é automaticamente desativado para evitar danos ao tecido, e foi atribuída a pontuação máxima à pata.
[150] Dois dias após a injeção de CFA e antes da administração dos compostos, os animais foram manipulados a aclimatizados no equipamento medidor de analgesia por pelo menos 60 min com o objetivo de reduzir o estresse e impedir respostas falsas positivas. A linha de base foi medida em ambas as patas para verificar a dor desenvolvida (hiperalgesia térmica); a pata não inflamada foi usada como um controle contra a pata que recebeu injeção. Os animais com latência de retirada da pata maior do que 6 s para a “pata inflamada” e menor do que 17s para a “pata normal” foram excluídos do experimento.
[151] Para determinar se IGF1R-5-Gal, mFc-IGF1R-5-Gal e IGF1R-5-mFc-Gal são entregues através da barreira hematoencefálica e podem engatar receptores alvo (GalR1 e 2) no parênquima do cérebro, os ratos receberam uma injeção na veia da cauda de IGF1R-5-Galanina (2,93 mg/kg ou 5,85 mg/kg; endotoxina EU=<1/mg) ou mFc-IGF1R-5-Gal Gal (1,98 mg/kg ou 4,96 mg/kg; <0,5 EU/mg) ou IGF1R-5-mFc- Gal (2,0 mg/kg ou 5,0 mg/kg; <0,5 EU/mg) ou compostos de controle três dias após a injeção por CFA. A latência de retirada da pata (PWL) foi testada para cada pata posterior (inflamada e não inflamada) a cada 15 min por 3 horas. Uma latência aumentada de retirada da pata indica de modo bem-sucedido a indução de analgesia que pode ser apenas obtida através da entrega bem-sucedida da Galanina ao parênquima do cérebro por IGF1R-5. A Galanina pode apenas induzir analgesia quando presente no parênquima do cérebro e, sozinha, não pode atravessar uma BHE intacta (Robertson et al., 2011).
[152] Os resultados foram analisados como cursos temporários de Latências de Retirada da Pata (PWL, seg) versos tempo (min ou h) (Figura 8A-D).
[153] Os resultados mostram que a galanina administrada por via intravenosa não reduz a dor em comparação à PBS. Em contraste, uma única injeção de FC5- Gal, IGF1R5-Gal, mFc-IGF1R-5-Gal ou IGF1R-5-mFc-Gal produziu uma supressão dependente de dose da hiperalgesia térmica, sugerindo que VHH de IGF1R-5 é a entidade responsável por ‘transportar’ a Galanina através da BHE para produzir um efeito farmacológico ligando-se a GalR1 e/ou 2 no parênquima do cérebro. O efeito de IGF1R-5-Gal é dependente de dose e significativamente mais pronunciado do que este induzido por FC5-Gal, sugerindo que o receptor IGF1R tem uma taxa maior de transporte de BHE do que o receptor de FC5 putativo. Esses resultados demonstram que o VHH de IGF1R-5 pode ‘transportar’ moléculas grandes (3 kDa a 80 kDa) através da BHE com o uso de uma trajetória de transcitose mediada por receptor. O transporte mediado por receptor ativo é exigido já que a BHE é conhecida por impedir a passagem de todas as moléculas hidrofílicas maiores do que 0,5 kDa.
Exemplo 13: imunodetecção de IGF1R-5-MFC
[154] Para garantir que os níveis altos de IGF1R-5mFc detectados no CSF após a administração periférica se originam pelo menos em parte do espaço extracelular do parênquima, em outras palavras, que o construto intacto atravessou a BHE, a imunodetecção de IGF1R-5-mFc em cérebros de rato foi realizada.
[155] Resumidamente, os cérebros dos animais do experimento do Exemplo 11 foram coletados imediatamente após a perfusão de animal com PBS (isto é, 48 h após a injeção na veia da cauda de 5 mg/kg de IGF1R-5-mFc). Os cérebros foram congelados e seccionados em criótomo em seções de 12 μm. As seções foram fixadas por 10 min à TA em Metanol 100%, lavadas 3x em PBS e incubadas por 1 h em soro de cabra normal 10% (NGS) contendo TritonX-100 0,3% em PBS 1x. Fcy- cy3 anti-m-lgG de cabra (n° de catálogo 115-165- 071, Jackson Immuno Reasearch, lote n° 106360) 1:200 em NGS 5% contendo TritonX-100 0,3% em 1xPBS foi aplicado de um dia para o outro a 4 °C. As seções foram lavadas três vezes em 1x PBS e incubadas em anti-GFAP de coelho (n° de catálogo Z0334, Dako) 1:500 em NGS 5%/1XPBS por 1 h à temperatura ambiente. As seções foram lavadas novamente três vezes em 1xPBS e, então, incubadas em Alexa 647 anticamundongo de cabra a 1:300 (A21235, Invitrogen) ou Alexa 647 anticoelho de cabra a 1:500 (A21244, Invitrogen) em 1xPBS. Lectina RCAI de manchamento de vasculatura (n° de catálogo FL-1081, Vector) 1:500 em 1xPBS foi, então, adicionada por 10 min. Após a lavagem três vezes com 1xPBS, as seções foram cobertas com uma lamínula no meio de montagem fluorescente Dako (n° de catálogo S3023, Dako) e elevadas com 2 μg/ml de Hoechst (n° de catálogo H3570, Invitrogen) para manchar os núcleos. As imagens foram capturadas com o Microscópio Fluorescente Olympus 1X81 com o uso de Objetivas de 10X e 60X e canais conforme mostrado na Tabela 4.Tabela 4. Objetivas e canais usados para microscopia fluorescente.
Figure img0005
[156] Os resultados são mostrados na Figura 10. A imunodetecção de Fc de camundongo mostrou forte manchamento dos vasos cerebrais por todas as diferentes regiões do cérebro, assim como o manchamento do parênquima cerebral perivascular, indicando que o IGF1R-5Fc é acumulado nos vasos cerebrais e também transmigrou a BHE no parênquima cerebral circundante. Os resultados suportam a asserção de que os níveis aumentados de CSF do IGF1R-Fc são indicativos da transmigração de construto através da BHE. Isso é adicional e fortemente suportado pela observação de que a galanina ligada ao IGF1R-5 induziu uma resposta farmacológica (analgesia) em receptores GalR1 e GalR2 do parênquima. Coletivamente, os resultados da transmigração de BHE in vitro e os resultados farmacocinéticos (níveis de soro/CSF) e farmacodinâmicos (modelo de Hargreaves) in vivo demonstram que o VHH de IGF1R-5 transmigra a BHE intacta a taxas significativamente mais altas do que outros VHHs por meio da transcitose mediada por receptor ativo ativada por sua ligação a epítopos de IGF1R e que o mesmo pode ‘transportar’ uma faixa (1 a 80 kD) de moléculas não permeáveis de outro modo através da barreira hematoencefálica.
Exemplo 14: efeito de IGF1R-5 na função ‘fisiológica’ de IGF1R
[157] A partir de uma perspectiva de segurança, é importante mostrar que o anticorpo da invenção não interfere com a função fisiológica do receptor - isto é, a sinalização induzida por seu ligante natural, IGF-1 - ao engatar seu receptor para a entrega por meio da transcitose mediada por receptor. Em vista disso, é importante demonstrar que VHH de IGF1R-5 ou IGF1R-5-mFc não interferem com a sinalização fisiológica através do IGF1R ou do receptor de insulina relacionado (IR) induzida por seus ligantes naturais.
[158] Para determinar se IGF1R-5 induz a sinalização através de IGF1R ou IR sozinho ou interfere com a sinalização conforme estimulada pelos ligantes naturais do receptor, IGF-1 ou insulina, seu efeito na fosforilação dos próprios receptores ou quinase a jusante estimulada por receptor, Akt, foi determinado nas células SV- ARBEC.
[159] As SV-ARBEC foram cultivadas para a confluência no meio de base M199 suplementado com peptona, D-glicose, aminoácidos BME, vitaminas BME, solução antibiótica/antimicótica e soro fetal bovino, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. As células foram comutadas no meio sem soro 18 h antes do tratamento.A fusão de VHH de IGF1R-5 ou IGF1R-5-Fc (100 nM ou 500 nM) foi adicionada às células 1 h antes da adição de 200 μg/ml de IGF-1, 10μg/ml de insulina ou veículo. As células foram incubadas com ligantes ou veículo por 20 minutos e, então, lavadas duas vezes na solução salina equilibrada de Hank. As células foram subsequentemente lisadas com o uso de tampão RIPA 1x (Cell Signaling Technology) suplementado com coquetel de inibidor de protease e Triton-x 100 1% (Sigma). As células receberam rajadas de 2 x 20 segundos em um sonicador de banho de água, e os lisados foram clarificados por centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos. A concentração de proteína foi determinada com o uso do sistema de ensaio de proteína DC (BIO-RAD laboratories). Os μg iguais de amostras de proteína foram separados em um gel de poliacrilamida SDS de gradiente de 4 a 20% a 125 V e transferidos para a membrana PVDF. Fosfo-Akt (Ser 473) foi detectado pela incubação de um dia para outro em uma diluição de 1:1.000 do anticorpo primário contra esse alvo (Cell Signaling Technology) seguida por uma incubação de 1 h com anticorpo secundário de IgG-HRP anticoelho de cabra, então, reagido com o reagente ECL Plus e visualizado no filme de autorradiografia. Os valores de densitometria foram determinados com o uso do software Un-Scan-lt (Silk Scientific Inc.).
[160] Os resultados são mostrados na Figura 11. As análises por Western blot da fosforilação de Akt mostraram que o IGF1-5 não inibiu a fosforilação de Akt induzida por 10 μg/ml de insulina ou por 200 μg/ml de IGF-1 quando coaplicado com IGF1R-5 ou IGF1-5-mFc a 100 nM ou IGF1R-5-mFc a 500 nM. Nem o VHH ou as fusões Fc induziram a sinalização de Akt por si (Figura 11 A, 11 B e 11 C, identificado com “5”). Os resultados demonstraram que, mesmo na exibição bivalente no formato de fusão Fc, o IGF1R-5 não aciona a dimerização do receptor e a sinalização a jusante e, portanto, não interfere com a função do receptor na presença do ligante natural. Essa característica do IGF1R-5 (‘ligante silencioso’) é importante para sua aplica como o carreador de BHE para produtos terapêuticos, já que a mesma confere um perfil de segurança favorável.
[161] As modalidades e os exemplos descritos no presente documento são ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção conforme reivindicado. Variações das modalidades anteriores, incluindo alternativas, modificações e equivalentes são pretendidas pelos inventores. Ademais, a combinação discutida dos recursos pode não ser necessária para a solução inventiva. REFERÊNCIAS Abbott NJ (2013) Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36(3):437 a 449. Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology, Neurochem. Int. 2004, 45, 545 a 552. Abulrob A, Sprong H, Van Bergen en Henegouwen P, Stanimirovic D (2005) The blood-brain barrier transmigrating single domain antibody: mechanisms of transport and antigenic epitopes in human brain endothelial cells. J Neurochem. 95(4): 1.201 a 1.214. Arbabi-Ghahroudi, M. 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Claims (13)

1. Fragmento de anticorpo de camelídeo do tipo anticorpo de domínio único, de ligação de antígeno isolado ou purificado caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência de região determinante de complementaridade (CDR) 1 de GRTIDNYA (SEQ ID NO:1); uma sequência de CDR2 de IDWGDGGX (SEQ ID NO:2); e uma sequência de CDR3 de AMARQSRVNLDVARYDY (SEQ ID NO:3), em que o fragmento de anticorpo se liga especificamente ao Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R).
2. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência: X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6 X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14LX15X16E DTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS (SEQ ID NO:4), em que XI é E ou Q; X2 é K ou Q; X3 é V ou E; X4 é A ou P; X5 é V ou S; X6 é D ou G; X7 é L ou R; X8 é F ou W; X9 é A ou S; X10 é A ou T; X11 é A ou S; X12 é G ou N; X13 é M ou L; X14 é N ou R; X15 é E ou R; X16 é P ou A; X17 é S ou Y; e X18 é Q ou L, ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma.
3. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREF VATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQ SRVNLDVARYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:5); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLE WVSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMAR QSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6); QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLE WVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMAR QSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKGLEF VATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQ SRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8); QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDRE FVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKGTMYLQMNSLRAEDTAVYSCAMAR QSRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9); e EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREF VSTIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQ SRVNLDVARYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10).
4. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo de domínio único (sdAb).
5. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo se liga a um epítopo que compreende a sequência FENFLHNSIFVPR (SEQ ID NO:11).
6. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo de ligação de antígeno está em um formato de exibição multivalente.
7. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo de ligação de antígeno é ligado a um fragmento Fc.
8. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado transmigra a barreira hematoencefálica.
9. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo de ligação de antígeno é ligado a uma molécula de carga.
10. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga tem um peso molecular na faixa de 1 kD a 200 kDa e/ou é selecionada do grupo consistindo de um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, um fator de crescimento, uma citocina, um coletor de receptor, um composto químico, uma porção química de carboidrato, uma enzima, um anticorpo ou fragmento do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral ou um agente citotóxico; um ou mais lipossomas ou nanocarreadores carregados com um agente detectável, um terapêutico, um fármaco, um peptídeo, uma enzima, um anticorpo ou fragmento do mesmo, uma molécula com base em DNA, um vetor viral ou um agente citotóxico; ou uma ou mais nanopartículas, nanofios, nanotubos ou pontos quânticos.
11. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais fragmentos de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
12. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser para uso em terapia.
13. Fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para uso em um modelo de barreira hematoencefálica pela detecção de um Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina tipo 1 (IGF1R) ou expressão IGF1R, compreendendo: a) colocar uma amostra de tecido em contato com um ou mais do que um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno isolado ou purificado, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ligado a um agente detectável; e b) detectar o agente detectável ligado ao fragmento de anticorpo de ligação de antígeno ligado ao IGF1R na amostra de tecido.
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