ES2386545T3 - Células y mamíferos no humanos modificados genéticamente - Google Patents
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Abstract
Una célula o un mamífero no humano genéticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de ácido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipéptidos del locus de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas endógenos, y porque están presentes las secuencias de ácidos nucleicos de una o más regiones variables de IgH endógenas, de uno o más segmentos D de IgH endógenos, y de uno o más segmentos J de IgH endógenos.
Description
Celulas y mamfferos no humanos modificados geneticamente.
La presente invenci6n se refiere a mamfferos no humanos geneticamente modificados, en particular a roedores geneticamente modificados, tales como ratones, que no codifican ningun polipeptido del locus de la regi6n constante 5 de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6geno. La invenci6n tambien se refiere a celulas no humanas geneticamente modificadas, en particular celulas precursoras embrionarias, en especial celulas de roedor, tales como celulas de rat6n, que no codifican ningun polipeptido del locus de la regi6n constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6geno. La invenci6n tambien se refiere a celulas no humanas geneticamente modificadas, en particular celulas precursoras embrionarias, y a los mamfferos no humanos geneticamente modificados producidos a
10 partir de estas, y a su uso para la producci6n de celulas y mamfferos no humanos en los que todos los genes de la regi6n constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos (de Cμ a Cα) se han delecionado del genoma.
La invenci6n se refiere tambien a mamfferos no humanos geneticamente modificados, en particular a roedores geneticamente modificados, tales como ratones, en los que la deleci6n de los genes de la regi6n constante de la
15 cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos se ha utilizado para permitir la inserci6n de otros genes, tales como genes de inmunoglobulinas ex6genas o sus segmentos, para asegurar y permitir la expresi6n de genes especfficos del locus de la cadena pesada de inmunoglobulinas. Ademas, la invenci6n se refiere a la expresi6n de estos genes producidos por estos mamfferos, y al uso de dichos mamfferos o de sus celulas para la producci6n de sistemas inmunol6gicos modificados con especial enfasis en la producci6n de inmunoglobulinas o anticuerpos.
20 Ademas, la invenci6n se refiere a mamfferos no humanos sin ningun gen de la regi6n constante end6geno cruzados con mamfferos no humanos compatibles capaces de expresar genes de inmunoglobulinas ex6genos como entidades redispuestas introducidas o entidades en la configuraci6n de la lfnea germinal y sobre fragmentos grandes de cromosomas, tales como BAC, YAC y HAC (cromosomas bacterianos, de levadura y humanos artificiales, respectivamente). Los transgenes y los transloci puede ser de AON humano.
25 Antecedentes de la invencian
La estructura basica de un anticuerpo (inmunoglobulina) es una unidad de cuatro polipeptidos, formada por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que estan unidas mediante enlaces disulfuro intercatenarios. Cada cadena esta formada por una regi6n constante y una regi6n variable; VL y CL son los terminos genericos para estas regiones sobre la cadena ligera, y VH y CH especifican las regiones variable y constante de la cadena pesada. En un
30 anticuerpo convencional, cada par de cadenas pesadas es identica, al igual que cada par de cadenas ligeras.
Las inmunoglobulinas (Ig) se agrupan en clases o isotipos (haciendo referencia a la regi6n constante) basandose en la estructura de su regi6n constante de cadena pesada (CH). En seres humanos y ratones existen cinco clases: IgG, IgA, IgM, IgO e IgE. Otras subclases en seres humanos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, y en ratones IgG1, IgG3, IgG2a e IgG2b. El isotipo es definido por los diferentes genes C (μ, δ, γ, ε, α) que son caracterfsticos de cada 35 especie de mamffero concreta y que estan presentes en todos los miembros de esa especie. Sin embargo pueden existir diferencias, habitualmente mutaciones puntuales o pequenos cambios, en los genes de inmunoglobulinas dentro de los miembros de una especie (por ejemplo, ratones BALB/c frente a ratones C57/Bl6). Estas diferencias definen los determinantes alotfpicos. Los determinantes alotfpicos se encuentran en las inmunoglobulinas (Ig) de algunos, pero no todos los miembros de una especie concreta (por ejemplo, Mus musculus). Los determinantes
40 alotfpicos reflejan el polimorfismo genetico de la regi6n constante de cadena pesada de Ig dentro de una especie, y se han utilizado como marcadores geneticos. Se han generado anticuerpos que permiten el reconocimiento de los determinantes isotfpicos inyectando inmunoglobulinas de una especie en otra especie (por ejemplo, IgM humana en un rat6n) o entre miembros de una especie, que permiten producir anticuerpos antialotfpicos (IgMa de BALB/c en C57/Bl6 que forman IgMb).
45 Las regiones constantes de cadena ligera existen en formas isotfpicas conocidas como kappa (κ) y lambda (λ), y estas cadenas ligeras pueden asociarse potencialmente con todos los isotipos de cadena pesada. Las cadenas ligeras en un anticuerpo concreto son identicas, y asf las inmunoglobulinas tienen cadenas ligeras κ o λ, pero no cadenas ligeras mixtas, a menos que el anticuerpo haya sido modificado de modo artificial.
Los determinantes idiotfpicos existen como resultado de estructuras exclusivas generadas por las subregiones 50 hipervariables (o regiones determinantes de la complementariedad, COR) en las regiones variables de cadena ligera
(L) y pesada (H), y se han identificado mediante la variabilidad de secuencia.
Se han desarrollado tecnicas para la producci6n de anticuerpos monoclonales utilizando celulas derivadas de animales de laboratorio pequenos, tales como ratones (Kohler, G. y Milstein, C., "Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256, 495-497 (1975)), que por primera vez describieron la
55 producci6n de anticuerpos monoclonales condensando una celula que forma un anticuerpo individual con una celula tumoral de celula B para producir un clon de celulas en constante divisi6n (lfnea celular de hibridoma) dedicado a fabricar un anticuerpo concreto (anticuerpo monoclonal).
Un anticuerpo monoclonal (mAb) tiene la capacidad de reconocer una estructura o una secuencia definida, o de unirse a un epitopo especffico. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede utilizarse exclusivamente para identificar las moleculas que portan el epitopo especffico, o puede dirigirse, solo o en combinaci6n con otro resto, a un sitio especffico para el diagn6stico o la terapia.
El uso de anticuerpos monoclonales como agentes terapeuticos se ha visto restringido por el desarrollo de una respuesta antiinmunoglobulinas en el sujeto tratado. Oebido a que la secuencia de la regi6n constante es especffica de la especie a partir de la cual se produce el anticuerpo, la introducci6n de un anticuerpo extrano (xenogeneico o ex6geno) en el sistema vascular del hospedante puede producir una respuesta inmunol6gica. Cuando el anticuerpo xenogeneico se introduce varias veces, por ejemplo en el tratamiento de enfermedades cr6nicas, resulta poco factible administrar el anticuerpo, puesto que se provocara una respuesta inmunol6gica y esto dara como resultado la eliminaci6n de la eficacia de diana del anticuerpo administrado generando efectos secundarios extremos, tales como un choque anafilactico. Por esta raz6n se han realizado diversos esfuerzos para "humanizar" anticuerpos de roedores que ya se han utilizado con exito para la intervenci6n terapeutica y, en fechas mas recientes, para establecer ratones transgenicos que produzcan anticuerpos totalmente humanos (BrOggemann, M. y Taussig, M.J. (1997), Production of human antibody repertoires in transgenic mice, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 455-458).
La producci6n de animales transgenicos ha sufrido una revoluci6n debido a las tecnicas que permiten cultivar celulas precursoras embrionarias murinas y a la introducci6n de modificaciones geneticas en estas celuals que pueden ser transmitidas a la lfnea germinal de rat6n. Los genes end6genos pueden modificarse, y pueden introducirse genes extranos (ex6genos), tales como genes humanos, en un hospedante para proporcionar cepas animales capaces de producir nuevos productos, tales como protefnas de uni6n xenogeneicas (extranas), en particular inmunoglobulinas.
Como alternativa al uso de bancos artificiales, es posible crear animales transgenicos que porten loci de inmunoglobulinas humanas, en la configuraci6n de la lfnea germinal, en un entorno genetico en el que los loci de Ig end6genos son defectuosos. Se ha realizado la silenciaci6n de genes de inmunoglobulinas mediante la inserci6n de genes y la eliminaci6n de genes utilizando la introducci6n de construcciones dirigidas a genes en celulas precursoras embrionarias (Bot, A., Immunoglobulin deficient mice generated by gene targeting as models for studying the immune response, Int. Rev. Immunol., 13, 327-340, 1996; Loffert et al., Early B-cell development in the mouse: insights from mutations introduced by gene targeting, Imm. Rev., 137, 135-153, 1994). En estos animales se ha demostrado que los loci introducidos pueden reemplazar la funci6n de los genes silenciados; aquellos son expresados y, para genes de inmunoglobulinas, son redispuestos con una eficacia similar a la de los genes silenciados.
La ontogenia de los linfocitos B es iniciada por una redisposici6n del AON y la expresi6n en la superficie de IgH. En la etapa temprana de la diferenciaci6n, la cadena H μ se asocia como un preBCR (receptor de celulas B) con la cadena L sustituta, que consiste en VpreB y λ5, que es reemplazada por la cadena L convencional para formar un BCR en la etapa inmadura de las celulas B. A esto le sigue la expresi6n de IgM e IgO sobre la superficie celular de una celula B madura con el posterior desarrollo en la periferia de una celula plasmatica que segrega anticuerpos en la que Cμ ha cambiado a otro gen C, γ, ε o α, mientras que mantiene su regi6n V (variable) redispuesta original.
BrOggemann et al. (PNAS, 1989, 86:6709-6723) describe la producci6n de ratones que portan un minilocus de cadena pesada humana con elementos de uni6n (J), de diversidad (O) y variables (V) de Ig no redispuestos, unidos a un gen μ constante de cadena pesada humana, que codifica el isotipo de inmunoglobulina IgM. Los genes de inmunoglobulina extranos (humanos) se insertan en la lfnea germinal de los ratones transgenicos, con el resultado de que la inserci6n extrana esta presente ademas de los genes Ig end6genos. En estos ratones, los genes extranos pueden redisponerse para codificar un repertorio de inmunoglobulinas del isotipo IgM.
El trabajo de BrOggerman et al. (ibid) tambien se describe en la patente de EEUU nO 5.545.807, que se refiere a un metodo para producir una inmunoglobulina obtenida a partir de celulas o fluidos corporales de un animal transgenico que tiene insertado en su lfnea germinal un material genetico que codifica al menos parte de una inmunoglobulina de origen extrano, o que puede redisponerse para codificar un repertorio de inmunoglobulinas. En estos textos, se sugiere que "puede resultar conveniente utilizar un animal hospedante que inicialmente no porte material genetico que codifique regiones constantes de inmunoglobulinas, de modo que el animal trangenico resultante s6lo utilizara el material genetico extrano insertado cuando produzca las inmunoglobulinas. Esto puede lograrse utilizando un mutante natural que carezca del material genetico pertinente, o fabricando mutantes de modo artificial, por ejemplo, en lfneas celulares que en ultimo termino crean un hospedante del que se ha eliminado el material genetico pertinente." Sin embargo, no se sugiere la forma de proporcionar este animal hospedante deficiente en IgC, y las indicaciones se centran s6lo en la inserci6n de material genetico humano; no se ofrecen ejemplos en los que la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6gena se delecione.
Las alteraciones dirigidas se han centrado en genes de la regi6n C individuales, pero la eliminaci6n de Cμ, Cδ p Cε no ha alterado significativamente el avance en el desarrollo de celulas B [1-3]. Parece que la silenciaci6n de genes C individuales o la sustituci6n [4,5] tiene poco efecto sobre el avance del desarrollo, debido a su redundancia funcional. Oe modo similar, aunque la eliminaci6n de la regi6n potenciadora Eμ reduce la redisposici6n del AON [6,7] y la sustituci6n del potenciador α3' afecta a la conmutaci6n [8], estas son s6lo pequenas perturbaciones casi
insignificantes en el desarrollo inmunol6gico.
Se ha logrado evitar el uso de los genes de la regi6n C de la cadena H con un posterior bloqueo en el desarrollo de celulas B mediante dos estrategias opuestas. La eliminaci6n de los segmentos J(uni6n)H elimina la redisposici6n de O(diversidad)-J [9,10] y los ratones no tienen celulas B Ig+, pero siguen desarrollando precursores de celulas B B220+ presentes a niveles algo reducidos.
El documento EP 0 463 151 describe ratones en los que un fragmento de 2,3 kb del locus de cadena pesada de rat6n end6geno, que porta los genes O y J1-4, se ha eliminado y reemplazado (mediante recombinaci6n hom6loga) por un gen de resistencia a la neomicina. Los genes C de IgH de rat6n end6genos estan presentes en el rat6n, pero debido a que los genes O y J estan ausentes, la redisposici6n de los locus no puede realizarse y se bloquea la expresi6n de los genes C de IgH end6genos, evitando la producci6n de un mensaje funcional que codifica una subunidad C de IgH.
Kitamura et al. [11] (Nature, 1991, 350:423-426) describe la producci6n de ratones con una regi6n Cμ alterada (ratones μMT). Esto se logra mediante la localizaci6n genica, en la que un fragmento gen6mico de 9 kb de Cμ y Cδ que porta un cod6n de fin y flanqueado por un gen de resistencia a la neomicina 5' y un gen tk de HSV 3', se inserta en los exones de membrana de Cμ utilizando celulas precursoras embrionarias. Las celulas ES se utilizaron para generar animales quimericos, que se sangraron para obtener ratones heterozig6ticos y despues homocig6ticos para la regi6n Cμ alterada. Los ratones homocig6ticos para el ex6n transmembrana de Cμ alterado eran deficientes en Ig. El desarrollo de celulas B depende de la expresi6n de μ superficial en la etapa de precelulas B, pero debido a que la expresi6n de μ superficial no se produce en ratones con la regi6n Cμ alterada (mutaci6n μMT), el desarrollo de celulas B se detiene en la etapa de la maduraci6n de precelulas B y, por tanto, no se producen celulas B secretoras de anticuerpos o maduras.
En las lfneas con regiones JH eliminadas o con el ex6n Cμ alterado, se produce alguna redisposici6n de la cadena L, y tambien parece que los animales con un ex6n transmembrana Cμ alterado cruzados hasta la homocigosidad en diferentes razas de ratones pueden superar en gran medida el bloqueo en la expresi6n de Ig. Esto resulta particularmente pronunciado en el entorno Balb/c, que revela una expresi6n de IgG, IgA e IgE en animales inactivados homocig6ticos [12,13], mientras que en el entorno original de C57BL/6 s6lo se expresa IgA selectivamente, lo cual se ha interpretado como un resto de un sistema inmunol6gico antiguo quizas mas primitivo [14].
Se desean producir mamfferos no humanos geneticamente modificados, por ejemplo roedores, tales como ratones, en los que los genes de IgH end6genos han sido silenciados, o eliminados, para producir anticuerpos de origen extrano, expresados a partir de los genes introducidos.
Se han utilizado una serie de estrategias para silenciar (es decir, alterar) o eliminar un unico gen de Ig end6geno, combinadas con la introducci6n simultanea de un gen humano ex6geno.
Pluschke et al. (J. Immunol. Methods, 1998, 215(1-2):27-37) utilizan una estrategia de localizaci6n genetica (Stief et al., J. Immunol., 1994, 152:3378) en celulas precursoras embrionarias para sustituir el segmento genico gamma 2a constante de IgH de rat6n (Cγ2a) por el segmento genico gamma 1 constante de IgH humano (Cγ1); ademas de esto, se generaron celulas ES en las que el segmento genico kappa de IgL de rat6n se reemplaz6 por su hom6logo humano. Las celulas ES se utilizaron para generar ratones quimericos.
Zou et al. (Science, 1993, 262, 1271-1274) describen un sistema de recombinaci6n Cre-llxP que funciona en celulas de mamffero y que se ha utilizado para la experimentos de localizaci6n genica en el rat6n para generar deleciones "limpias" de genes diana en la lfnea germinal, asf como para inactivar genes de una manera condicional (basandose en la expresi6n regulada de la recombinasa Cre).
Cre es una protefna recombinasa de 38 kOa del bacteri6fago P1 que media en la recombinaci6n especffica de sitio intramolecular (excisiva o inversional) e intermolecular (integrativa) entre los sitios llxP; para un analisis del sistema, vease Sauer, en Methods of Enzymology, 1993, vol. 2215, 890-900. Un sitio llxP (el locus del entrecruzamiento) consiste en dos repeticiones invertidas de 13 pb separadas por una regi6n espaciadora asimetrica de 8 pb. Una molecula de Cre se une por repetici6n invertida, o dos moleculas de Cre se alinean en un sitio llxP. La recombinaci6n se produce en la regi6n espaciadora asimetrica. Estas 8 bases tambien son responsable de la direccionalidad del sitio. Oos secuencias llxP en la orientaci6n opuesta entre sf invierten el trozo de AON intermedio, y dos sitios en orientaci6n directa dictan la excisi6n del AON intermedio entre los sitios, dejando un sitio llxP detras. Esta eliminaci6n precisa de AON puede utilizarse para eliminar genes (deleci6n de genes) o para activar genes. El sistema Cre-llxP tambien puede utilizarse para introducir genes (introducci6n de genes). Un gen flanqueado por dos sitios llxP en una orientaci6n directa se denomina un "gen floxeado".
Zou et al. (Current Biology, 1994, 4(12):1099-2003) describen el uso del sistema Cre-llxP en celulas precursoras embrionarias de rat6n para sustituir el gen Cγ1 de rat6n, que codifica la regi6n constante de la cadena pesada de anticuerpos IgG1, por el correspondiente gen Cγ1 humano. Se gener6 una construcci6n de transporte dirigido en la que el sitio llxP se clon6 en el extremo 3' de la secuencia genica diana (en este caso el Cγ1 de rat6n) y, en la 4 10
posici6n 5' del gen diana, se realiz6 una inserci6n (de 5' a 3') de un gen mutante de interes (en este caso Cγ1 humano), un sitio llxP, un marcador de selecci6n negativo (tk de HSV) y un marcador de selecci6n positivo (neor). En esta construcci6n, los sitios llxP estan en la orientaci6n directa. La construcci6n de transporte dirigido se introdujo mediante transfecci6n en celulas ES, y los transformantes se seleccionaron en G418 mediante la resistencia a la neomicina. Se introdujo una construcci6n Cre en las celulas transformadas para lograr la expresi6n transitoria de Cre. La recombinaci6n, es decir, la excisi6n de la secuencia entre los dos sitios llxP (que codifican tk de HSV, neor y el gen diana Cγ11 de rat6n end6geno), s6lo se produce en las celulas que expresan la recombinasa Cre. La secuencia Cγ1 humana se situa fuera de los sitios llxP, y asf permanece insertada dentro del genoma de rat6n. Se emple6 una selecci6n negativa con aciclovir o ganciclovir para identificar las celulas en las que se ha producido la deleci6n, puesto que s6lo las celulas que no expresan tk de HSV, es decir, aquellas en las que el gen Cγ1 de rat6n end6geno tambien ha sido delecionado, son capaces de sobrevivir en estos medios.
Por tanto, Zou et al. (1994) emplean el sistema Cre-llxP para introducir un gen Cγ1 humano y despues delecionar un solo gen de la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6geno, Cγ1. Los exones que codifican las porciones transmembrana y citoplasmica del Cγ1 de rat6n de IgH no fueron sustituidos por secuencias humanas, y se mantuvieron para minimizar el riesgo de alterar la expresi6n en la membrana y la senalizaci6n de la IgG1 humanizada en el rat6n. El gen Cγ1 humano introducido se transmiti6 a traves de la lfnea germinal de rat6n, y los ratones mutantes resultantes se cruzaron con ratones que expresan cadenas ligeras kappa con una regi6n constante humana, en lugar de ser de rat6n. Los ratones homocig6ticos para ambas inserciones producen anticuerpos IgG1 que portan cadenas kappa humanizadas.
Nicholson et al. (J. Immunol., 1999, 6888-6906) produjeron ratones que portan transloci de cadena ligera κ y λ y pesada de Ig humana basados en YAC en un entorno en el que los loci de Igκ e IgH end6genos han sido inactivados. La inactivaci6n del locus IgH se logr6 utilizando los ratones Cμ (mutante μMT) descritos por Kitamura (1991), supra. La expresi6n de Igκ fue alterada por la inserci6n de un m6dulo Neo en el gen Cκ (Zou et al., Eur. J. Immunol., 1995, 25, 2154).
Un problema tecnico tratado por esta invenci6n es la producci6n de un mamffero no humano que es incapaz de expresar ninguno de sus genes C de IgH end6genos, y por tanto es inmunodeficiente. Un problema particular tratado por la presente invenci6n es la producci6n de un roedor, en particular un rat6n, que es incapaz de expresar ninguno de sus 8 genes C de IgH end6genos. Para lograr esto, es necesario generar un mamffero no humano mutante, en particular un roedor, tal como un rat6n, en el que los genes de la regi6n constante de cadena pesada end6genos ya no estan presentes o no son funcionalmente activos.
Por consiguiente, la presente invenci6n proporciona un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos.
La presente invenci6n tambien proporciona un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes todas las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable y los segmentos O y J de IgH end6genas.
Los inventores tambien describen un rat6n transgenico o geneticamente modificado, en el que las celulas germinales no tienen el locus del gen C de inmunoglobulinas end6geno. Tambien describen un rat6n transgenico geneticamente modificado o su progenie, en el que las celulas somaticas y germinales no tienen el locus del gen C de inmunoglobulinas end6geno.
En un aspecto de la invenci6n, la celula o el mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas. En las celulas y los mamfferos no humanos geneticamente modificados de la invenci6n, todas las secuencias de genes de regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina (C de IgH) estan ausentes o parcialmente ausentes del genoma. Preferiblemente, cada uno de los genes de la regi6n C de IgH end6genos estan ausentes; mas preferiblemente, la regi6n C end6gena completa (de Cμ a Cα) esta ausente.
En la presente, end6geno se define como autentico, nativo, no extrano y no modificado por ingenierfa genetica, tal como localizaci6n genica o introducci6n de genes.
Las celulas o los mamfferos no humanos geneticamente modificados pueden obtenerse mediante la deleci6n dirigida de todas o fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas. La deleci6n puede ser de todos los genes de la regi6n C de IgH end6genos y las secuencias intermedias (deleci6n limpia o eliminaci6n completa de
exones/intrones) o de fundamentalmenmte todas las secuencias de C de IgH end6genas mediante la deleci6n de un parte extensa de la secuencia del gen de la regi6n C de IgH end6gena, de modo que se evita la expresi6n de cualquier gen C de IgH. La deleci6n dirigida puede realizarse mediante un proceso de recombinaci6n-excisi6n, por ejemplo mediante recombinaci6n Cre-llxP. Por tanto, la invenci6n tambien proporciona un mamffero no humano transgenico o geneticamente modificado, segun se describe en la presente, o una celula de mamffero no humano transgenica o geneticamente modificada, preferiblemente una celula precursora embrionaria, segun se describe en la presente, que puede obtenerse mediante un metodo de recombinaci6n especffica de sitio, preferiblemente mediante un metodo de recombinaci6n Cre-llxP.
En los metodos de recombinaci6n especffica de sitio para la deleci6n dirigida, se escinde una regi6n de secuencia de acido nucleico flanqueada por dos secuencias de recombinaci6n especffica de sitio; tras la excisi6n, una unica secuencia de recombinaci6n especffica de sitio permanece en el genoma. Se prefiere que la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio sea un sitio de recombinaci6n especffica de sitio no end6geno (NESSR). Pueden utilizarse varios metodos para producir una celula de mamffero no humano en el que la secuencia diana para la deleci6n, es decir, el locus C de IgH end6geno, esta flanqueada por sitios NESSR. En uno de estos metodos, los sitios NESSR estan secuencialmente integrados en el genoma de una celula de mamffero no humano, preferiblemente una celula precursora embrionaria, de forma que un sitio NESSR primero se introduce en una celula y se integra en un extremo de la secuencia diana, y despues un sitio NESSR se introduce y se integra en el otro extremo de la secuencia diana. En un metodo alternativo, los sitios NESSR se introducen simultaneamente en la celula para su integraci6n en cada extremo de la secuencia diana. Las celulas con un sitio NESSR en uno u otro extremo de la secuencia diana pueden utilizarse para producir mamfferos no humanos geneticamente modificados con secuencias NESSR presentes dentro del genoma en uno u otro extremo de la secuencia diana. Un mamffero no humano que tenga un unico sitio NESSR en un extremo de la secuencia diana del locus C de IgH puede cruzarse con un mamffero no humano que tenga un sitio NESSR en el otro extremo de la secuencia diana del locus C de IgH, para producir una progenie con sitios NESSR que flanquean la secuencia diana. Las celulas con sitios NESSR flanqueando la secuencia diana del locus C de IgH pueden utilizarse para producir mamfferos no humanos geneticamente modificados con secuencias NESSR presentes dentro del genoma que flanquean el locus C de IgH end6geno.
La presente invenci6n proporciona una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado que tiene al menos una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena presente dentro del genoma cadena abajo
o dentro del ultimo gen del locus C de IgH y/o cadena arriba o dentro del primer gen del locus C de IgH. En una realizaci6n preferida, dos sitios NESSR, preferiblemente sitios llxP, se integran dentro del genoma cadena abajo o dentro del ultimo gen del locus C de IgH, y cadena arriba o dentro del primer gen del locus C de IgH.
Un sitio NESSR puede estar presente cadena arriba en una posici6n adyacente al primer gen del locus C de IgH y/o cadena abajo en una posici6n adyacente al ultimo gen del locus IgH. "Adyacente" significa que el sitio NESSR esta colocado 5' o 3' del inicio del primer gen, o al final del ultimo gen del locus C de IgH. Esto implica que el primer o el ultimo gen del locus C de IgH es la regi6n codificadora mas cercana al NESSR.
La invenci6n proporciona un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, segun se describe en la presente, que tiene sitios NESSR, que son preferiblemente sitios llxP, que flanquean los genes de la regi6n C de IgH, o insertados en los genes a cada extremo de los genes de la regi6n C de IgH.
La invenci6n proporciona un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, en el que los genes C de IgH end6genos estan ausentes, segun se describe en la presente, y un sitio de recombinaci6n especffica de sitio no end6geno (NESSR) esta presente dentro del genoma, preferiblemente el sitio de recombinaci6n especffica de sitio no end6geno es un sitio de recombinaci6n llxP.
Se prefiere que los genes C de IgH end6genos esten delecionados, pero al menos parte de al menos una secuencia potenciadora de C de IgH end6gena se mantenga. Esto tiene la ventaja de mejorar la expresi6n de genes extranos cuando se insertan en el locus y permite la regulaci6n especffica de locus de los genes introducidos de manera especffica de sitio (por ejemplo, utilizando una inserci6n Cre-llxP que emplea el sitio llxP remanente en la agrupaci6n de genes C de IgH delecionados). La retenci6n de al menos parte de la secuencia potenciadora J-Cintr6nica end6gena y/o al menos parte de la secuencia potenciadora α3' se prefiere particularmente.
En una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n, estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables y de los segmentos O y/o J de IgH end6genas. En una realizaci6n se prefiere particularmente que esten presentes las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable y de los segmentos O y J de IgH end6genas.
En una realizaci6n alternativa, una regi6n variable ex6gena, preferiblemente una regi6n variable de mamffero, mas preferiblemente una regi6n variable humana, esta presente.
Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n puede comprender uno o mas marcadores seleccionables integrados dentro del genoma.
Un marcador seleccionable puede estar colocado cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena. Al menos un marcador seleccionable puede estar integrado dentro del genoma cadena arriba y/o cadena abajo de al menos una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena.
En una realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, que tiene un marcador seleccionable integrado cadena arriba o cadena abajo del primer y/o del ultimo gen C de IgH end6geno y/o cadena arriba o cadena abajo de una secuencia llxP.
El marcador seleccionable es preferiblemente uno o mas de un gen de resistencia a la neomicina; un gen de resistencia a la puromicina; un gen de higromicina. El marcador seleccionable puede ser un gen de timidina quinasa del virus del herpes simplex.
Un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, segun se describe en la presente, puede tener un marcador seleccionable diferente integrado en cada extremo de la regi6n C de IgH.
Por tanto, un mamffero no humano o una celula de mamffero no humano, tal como una celula de roedor, por ejemplo una celula de rat6n, en particular una celula precursora embrionaria de rat6n, puede no tener el locus de cadena pesada de inmunoglobulinas end6geno, y puede comprender uno o mas genes que codifican un marcador seleccionable.
Un mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n puede ser un mamffero roedor, murino, ovino, porcino, equino, canino, felino o similares, pero preferiblemente es roedor, mas preferiblemente murino, lo mas preferiblemente un rat6n. Una celula de mamffero no humano geneticamente modificada de la invenci6n puede ser una celula precursora embrionaria o un oocito; y preferiblemente es una celula de roedor, murina, ovina, porcina, equina, canina, felina o similares, preferiblemente una celula de roedor, mas preferiblemente una celula murina, lo mas preferiblemente un celula de rat6n. Los ratones son particularmente preferidos porque su repertorio inmunol6gico es extenso y son faciles de manipular y criar.
La presente invenci6n proporciona un rat6n o una celula de rat6n geneticamente modificado en el que los 8 genes de inmunoglobulina de la regi6n constante de cadena pesada end6genos (μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α) estan ausentes o parcialmente ausentes hasta el punto de no ser funcionales, o en el que los genes δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b y ε estan ausentes y los genes flanqueantes μ y α estan parcialmente ausentes hasta el punto de no ser funcionales, o en el que los genes μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b y ε estan ausentes y α esta parcialmente ausente hasta el punto de no ser funcional, o en el que δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α estan ausentes y μ esta parcialmente ausente hasta el punto de no ser funcional.
Parcialmente ausente significa que la secuencia del gen de la regi6n constante de IgH end6gena ha sido delecionada o alterada hasta el punto de que ningun producto genico de C de IgH end6geno funcional es codificado en el locus C de IgH, es decir, ningun producto genico de C de IgH end6geno funcional puede expresarse desde el locus.
La presente invenci6n proporciona tambien una celula precursora embrionaria (ES) de mamffero no humano que se caracteriza porque los genes de la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6genos estan ausentes o parcialmente ausentes. Preferiblemente, todos los genes de la regi6n C de IgH end6genos estan ausentes; mas preferiblemente todos los genes C de IgH end6genos conocidos estan ausentes.
En una realizaci6n preferida, la celula ES es un mutante de deleci6n de una celula precursora embrionaria de rat6n en el que los 8 genes de inmunoglobulina de la regi6n constante de cadena pesada end6genos μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α estan ausentes o parcialmente ausentes hasta el punto de no ser funcionales, o en el que los genes δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b y ε estan ausentes y los genes flanqueantes μ y α estan parcialmente ausentes hasta el punto de no ser funcionales, o en el que los genes μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b y ε estan ausentes y α esta parcialmente ausente hasta el punto de no ser funcional, o en el que δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α estan ausentes y μ esta parcialmente ausente hasta el punto de no ser funcional.
El mutante de deleci6n de un mamffero no humano, preferiblemente un roedor, mas preferiblemente un rat6n, puede cruzarse con un mamffero no humano compatible que sea capaz de expresar uno o mas genes C de IgH funcionalmente activos, preferiblemente uno o mas genes C de IgH humanos funcionalmente activos, por ejemplo, un mutante de deleci6n de un rat6n puede cruzarse con un rat6n capaz de expresar uno o mas genes C de IgH humanos funcionalmente activos. La progenie heterocig6tica (F1) de este cruzamiento puede cruzarse entre sf para producir una progenie heterocig6tica y homocig6tica (F2) de un mamffero no humano, preferiblemente un rat6n, que no sea capaz de expresar los genes C de IgH end6geno pero que sf sea capaz de expresar s6lo un gen o genes C de IgH extranos, preferiblemente humanos.
Tal como se observa en otras razas de ratones con inactivaci6n de Ig que expresan transgenes de Ig, la presencia de genes C de rat6n puede dar como resultado la producci6n de cadenas de Ig quimericas de humano (es decir,
extrano)-rat6n mediante mecanismos de transconmutaci6n o transcorte y empalme que juntan segmentos genicos que estan sobre diferentes localizaciones cromos6micas (analizado en BrOggemann y Taussig, Curr. Opin. Biotechn., 8, 455-458, 1997). Por tanto, una ventaja de delecionar completamente o casi completamente la regi6n del gen C de IgH end6gena completa es que, en la progenie F2, que porta y expresa un locus o gen introducido, por ejemplo de IgH ex6geno, el locus del gen C de IgH end6geno no puede activarse para producir productos de conmutaci6n o de corte y empalme poco convencionales. Por consiguiente, una ventaja de producir un animal no humano con genes de Ig end6genos silenciados y genes de Ig humanos introducidos es que no pueden producirse moleculas mixtas (por ejemplo, IgH de rat6n e IgL humana) y, por tanto, la inmunizaci6n de este animal permite la producci6n de anticuerpos totalmente humanos especfficos.
La invenci6n proporciona un metodo para producir una celula no humana geneticamente modificada que comprende:
- (a)
- (i) transfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba
- o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n, y
- (ii)
- transfectar una celula producida en (a) (i) con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido un marcador seleccionable y una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; o
- (b)
- (i) transfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo
- o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n, y
- (ii)
- transfectar una celula producida en (b) (i) con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; o
- (c)
- cotransfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba
- o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo cada una de dichas construcciones de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y teniendo cada una un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador o marcadores seleccionables estan presentes, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; y opcionalmente,
- (d)
- proporcionar a una celula obtenida en (a) (ii), (b) (ii) o (c) una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, y evaluar para acontecimientos de deleci6n.
La recombinasa en la etapa opcional (d) puede ser proporcionada por un vector de expresi6n, es decir, por la introduci6n de un vector de expresi6n en la celula. En un metodo preferido, la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena es un sitio llxP, y en la etapa opcional (d), la recombinasa es una recombinasa Cre.
Se prefiere que la celula no humana geneticamente modificada sea una celula precursora embrionaria o un oocito. La celula no humana geneticamente modificada puede ser una celula de roedor, mas preferiblemente una celula de rat6n.
Puede utilizarse cualquier vector de clonaci6n adecuado para generar la construcci6n de transporte dirigido, y las estrategias de clonaci6n se describen en Sambrook, Fritsch y Maniatis en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Oe manera deseable, la construcci6n de transporte dirigido puede portar uno o mas genes de marcadores; los marcadores adecuados son conocidos, y los que resultan especialmente adecuados son los que permiten una selecci6n positiva. Oe particular interes es el uso del gen para la neomicina fosfotransferasa ("neo"), que confiere resistencia a G418, y tambien es adecuado el gen de resistencia a la puromicina ("puro") o el gen de resistencia a la higromicina; se prefieren los genes de resistencia a la neomicina y/o puromicina.
En la construcci6n de transporte dirigido, cadena arriba y/o cadena abajo del gen diana puede haber un gen que proporciona la identificaci6n de si ha ocurrido un doble entrecruzamiento hom6logo (selecci6n negativa). Puede emplearse el gen de la timidina quinasa del virus de herpes simplex (HSV-tk o tk de HSV) como marcador de selecci6n negativa, puesto que las celulas que producen timidina quinasa pueden ser destruidas por aciclovir o ganciclovir.
Tras haber preparado una construcci6n de transporte dirigido y haber eliminado cualquier secuencia no deseada, la construcci6n puede introducirse en la celula diana, por ejemplo una celula ES o un oocito. Puede emplearse cualquier tecnica conveniente para introducir el AON en la celula diana. Para la localizaci6n genetica convencional (habitualmente con construcciones de hasta 20 kb), el AON se introduce mas habitualmente mediante electroporaci6n (vease Zou et al., Eur. J. Immunol., 25, 2154-2162, 1995), mientras que para modificaciones secundarias, tales como la integraci6n mediada por Cre-llxP, la electroporaci6n puede utilizarse para la integraci6n de construcciones mas pequenas y otros metodos, tales como la lipofecci6n y la fusi6n de celulas/esferoplastos de levadura para YAC (cromosomas artificiales de levadura) y la transferencia de AON mediada por fosfato de calcio para fragmentos de cromosomas o cromosomas artificiales de mamffero que permiten la integraci6n de una gama desde varios 100 kb hasta Mb. Por tanto, la electroporaci6n es la tecnica preferida para la introducci6n de pequenos fragmentos de AON (hasta 50 kb) en la celula diana, y los otros metodos listados son adecuados y quizas ventajosos para la introducci6n de secuencias de AON mas grandes (>50 kb).
Oespues de la transformaci6n o la transfecci6n de las celulas diana, estas pueden seleccionarse mediante marcadores positivos y/o negativos. Tal como se indic6 previamente, pueden utilizarse marcadores positivos, tales como genes de resistencia a neomicina y/o puromicina. Las celulas con el fenotipo deseado despues pueden analizarse mediante un analisis de restricci6n, electroforesis, analisis de la transferencia Southern, PCR o similares.
La PCR tambien puede utilizarse para detectar la presencia de recombinaci6n hom6loga. Pueden emplearse cebadores de PCR que sean complementarios con una secuencia dentro de la construcci6n de transporte dirigido, y que sean complementarios con una secuencia fuera de la construcci6n y en el locus diana. Se obtienen moleculas de AON en la reacci6n de PCR s6lo cuando ambos cebadores son capaces de unirse a la secuencia complementaria, es decir, s6lo si se ha producido una recombinaci6n hom6loga. La demostraci6n de los fragmentos con el tamano esperado, verificada mediante secuenciaci6n, apoya la conclusi6n de que se ha producido la recombinaci6n hom6loga.
Aunque la presencia del gen del marcador en el genoma indica que se ha producido la integraci6n, es necesario determinar si se ha producido la integraci6n hom6loga. Los metodos para lograrlo son conocidos en la tecnica, tales como la utilizaci6n de un analisis del AON mediante una hibridaci6n de transferencia Southern para establecer la localizaci6n de la integraci6n. Empleando sondas para el inserto y las secuencias en las regiones 5' y 3' distantes a la regi6n flanqueante en la que se producirfa la integraci6n hom6loga, puede demostrarse que se ha logrado el transporte dirigido hom6logo. Una ventaja es que las sondas externa adyacentes al AON de localizaci6n dirigida y los sitios de restricci6n recien introducidos, por ejemplo mediante un gen de un marcador seleccionable, pueden utilizarse para la identificaci6n de la alteraci6n introducida por transporte dirigido.
Por tanto, puede utilizarse una selecci6n, preferiblemente mediante PCR, para confirmar la integraci6n de sitios NESSR, tales como sitios llxP, en la posici6n correcta, sobre el mismo alelo y en la orientaci6n correcta (directa) para permitir la eliminaci6n de genes mediante deleci6n. La selecci6n con metodos tales como la PCR tambien puede utilizarse para detectar acontecimientos de deleci6n.
Una celula precursora embrionaria tal como se describe en la presente, por ejemplo que puede obtenerse mediante el anterior metodo, puede utilizarse para la producci6n de un mamffero no humano geneticamente modificado.
Los procesos descritos anteriormente pueden realizarse primero para inactivar los loci de cadena pesada constante en una celula precursora embrionaria, las celulas despues pueden inyectarse en blastocitos del hospedante y desarrollarse para producir un animal quimerico. Los metodos adecuados se describen, por ejemplo, en Hogan et al. (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., y Lacy, E. (1994), Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY). Los animales quimericos se cruzan para obtener hospedantes heterocig6ticos. Oespues, mediante el cruzamiento de los hospedantes heterocig6ticos, puede obtenerse un hospedante homocig6tico.
Por consiguiente, la invenci6n proporciona un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza porque una celula precursora embrionaria, tal como se describe en la presente, se introduce en un blastocito hospedante y se desarrolla para producir un animal quimerico.
Esto puede lograrse mediante un metodo que se caracteriza por:
- (a)
- introducir una celula precursora embrionaria de mamffero no humano, tal como se describe en la presente, en un blastocito de mamffero no humano compatible; y
- (b)
- transplantar el blastocito obtenido en (a) a una madre de acogida que es un mamffero no humano compatible para obtener un mamffero no humano quimerico, y opcionalmente seleccionar el marcador o marcadores seleccionables y/o la secuencia o secuencias de recombinaci6n especffica de sitio no end6genas y/o la deleci6n de todas o fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas.
Un mamffero no humano quimerico producido mediante estos metodos puede cruzarse para obtener una progenia heterocig6tica. La progenie heterocig6tica puede cruzarse entre sf para obtener una progenie homocig6tica. Por tanto, la invenci6n proporciona un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado. que se 9 10
caracteriza por realizar un metodo de la invenci6n para obtener un mamffero no humano quimerico y cruzar dicho mamffero no humano quimerico para obtener una progenie heterocig6tica. Tambien se proporciona un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza por realizar un metodo de la invenci6n para obtener una progenie heterocig6tica y cruzar entre sf dicha progenie heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica.
Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado segun la invenci6n puede comprender:
- (a)
- inyectar un clon de una celula ES de mamffero no humano que tiene dos sitios llxP integrados, tal como se describe en la presente, en un blastocito de mamffero no humano;
- (b)
- transplantar el blastocito en una madre de acogida que es un mamffero no humano compatible para obtener una progenie quimerica de mamfferos no humanos;
- (c)
- opcionalmente seleccionar para llxP;
- (d)
- cruzar la progenie para obtener un mamffero no humano que tiene dos sitios llxP integrados en el mismo alelo;
- (e)
- cruzar un mamffero no humano que tiene dos sitios llxP integrados con un mamffero no humano que expresa Cre compatible;
- (f)
- seleccionar la progenie para mutantes de deleci6n, preferiblemente mediante PCR; o
- (g)
- generar mamfferos no humanos geneticamente modificados, por ejemplo ratones, con dos sitios llxP integrados en un alelo, o en un locus o en dos alelos o loci distintos, cruzando entre sf los ratones derivados producidos mediante transgenesis o la vfa de celulas ES;
- (h)
- realizar una deleci6n inter-o intraalelica tras la expresi6n de Cre.
La invenci6n tambien proporciona un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la invenci6n para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, con un mamffero no humano geneticamente modificado compatible homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, para obtener una progenie heterocig6tica, y opcionalmente cruzar entre sf la progenie heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica para ambas integraciones.
La progenie homocig6tica para ambas integraciones puede cruzarse con un mamffero no humano compatible capaz de expresar una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena para obtener una progenie con la deleci6n del gen C de IgH, que opcionalmente puede seleccionarse utilizando metodos adecuados para detectar la deleci6n del gen C de IgH.
La secuencia o secuencias de recombinaci6n especffica de sitio no end6genas pueden ser sitios llxP, y la recombinasa una recombinasa Cre.
La progenie heterocig6tica u homocig6tica para llxP en ambos loci puede cruzarse con un mamffero no humano compatible capaz de expresar la recombinasa Cre para obtener una progenie de mamfferos no humanos que no comprenden una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6genos en uno o ambos alelos.
Puede obtenerse un mamffero no humano transgenico capaz de expresar la recombinasa Cre mediante la microinyecci6n de un plasmido Cre linealizado en el pronucleo masculino de embriones de mamfferos no humanos F1 para producir una raza de mamfferos no humanos que expresan Cre.
Utilizando los metodos de la invenci6n descritos en la presente puede obtenerse un mamffero no humano geneticamente modificado que no comprenda una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6genos. Las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos estaran presentes en la progenie, en algunos aspectos todas las secuencias de acidos nucleicos end6genas de la regi6n variable y del segmento O y J de IgH estaran presentes en la progenie.
La invenci6n proporciona un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo de la invenci6n para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n que no 10 10
comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina end6genos, con un mamffero no humano compatible que codifica y es capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, para obtener una progenie heterocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos, y opcionalmente cruzar entre sf la progenie heterocig6tica para producir una progenie homocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos.
Un gen ex6geno es un gen que es extrano, es decir, no nativo, a la celula o al mamffero no humano hospedante.
Por tanto, la invenci6n puede emplearse para producir un mamffero no humano, que preferiblemente es un roedor, mas preferiblemente un rat6n, que es capaz de expresar un gen o genes de inmunoglobulina extranos, preferiblemente humanos, cruzando el mamffero no humano geneticamente modificado, segun se define en la presente, que no es capaz de expresar genes C de IgH funcionalmente activos (end6genos), con un mamffero no humano compatible, preferiblemente un roedor, mas preferiblemente un rat6n, que es capaz de expresar uno o mas genes C de IgH funcionalmente activos extranos, preferiblemente humanos. Esto permite el intercambio interespecffico de genes/loci para producir una progenie seleccionada (heterocig6tica u homocig6tica) con uno o mas genes funcionalmente activos ex6genos, preferiblemente humanos, de los rasgos deseados, en un entorno en que los correspondientes genes del mamffero no humano estan silenciados o eliminados.
Se proporciona un metodo para producir una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que comprende la introducci6n de uno o mas genes ex6genos en una celula de mamffero no humano de la invenci6n que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina end6genos. Se prefiere que la celula de mamffero no humano sea una celula precursora embrionaria o un oocito. Cuando la celula de mamffero no humano es una celula ES, se prefiere que dicho uno o mas genes ex6genos se introduzcan mediante transfecci6n. Cuando la celula de mamffero no humano es un oocito (celula huevo), se prefiere que dicho uno o mas genes ex6genos se introduzcan mediante microinyecci6n de AON. Preferiblemente, dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en el genoma de la celula o el mamffero no humano, mas preferiblemente dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena.
Se proporciona un metodo alternativo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que comprende realizar un metodo de la invenci6n para obtener un mamffero no humano de la invenci6n que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina end6genos, y en el que estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano obtenido de esta manera con un mamffero transgenico compatible que tenga uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinaci6n especffida de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserci6n de uno o mas genes ex6genos.
Se proporciona otro metodo alternativo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que comprende realizar un metodo de la invenci6n para obtener un mamffero no humano de la invenci6n que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulina end6genos, y en el que todas las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable y del segmento O y J de IgH end6genas estan presentes, y cruzar dicho mamfferon no humano obtenido de esta manera con un mamffero transgenico compatible que tiene uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserci6n de uno o mas genes ex6genos.
En los anteriores metodos para producir un mamffero no humano geneticamente modificado, o una celula de mamffero no humano geneticamente modificada, capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, se prefiere que la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena sea una secuencia llxP, y la inserci6n sea mediante integraci6n Cre-llxP. El mamffero no humano geneticamente modificado es preferiblemente un roedor, mas preferiblemente un rat6n.
Para proporcionar la producci6n de protefnas de uni6n xenogeneicas (ex6genas) (por ejemplo, protefnas de anticuerpo extranas) en un hospedante, es necesario que el hospedante sea competente para proporcionar las enzimas necesarias y otros factores implicados en la producci6n de anticuerpos (por ejemplo, la maquinaria de recombinaci6n celular), mientras que debe carecer de los genes end6genos para la expresi6n de las subunidades de IgC pesadas de inmunoglobulinas y, por tanto, no puede expresar los segmentos V, O y J remanentes despues de la redisposici6n del AON. Por tanto, estas enzimas y otros factores asociados con la redisposici6n de la lfnea germinal, el corte y empalme, la mutaci6n somatica y similares son preferiblemente funcionales en el hospedante. Sin embargo, una regi6n natural funcional que comprende los diversos exones asociados con la producci6n de regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genas estara ausente/delecionada en ciertas realizaciones de la invenci6n.
En una estrategia de deleci6n y reemplazo, el material genetico ex6geno para la inserci6n puede producirse a partir de una fuente de mamffero, preferiblemente una fuente humana, o puede producirse de modo sintetico. El material puede codificar al menos parte de una inmunoglobulina conocida, o puede modificarse para que codifique al menos parte de una inmunoglobulina alterada. Las tecnicas adecuadas para estos procesos son muy conocidas.
En el caso de la estrategia de deleci6n y reemplazo, cuando la inserci6n de AON xenogeneico es grande, pueden insertarse loci de Ig completos (1-3 Mb). El uso de la estrategia de reemplazo de Cre-llxP entonces permitirfa la eliminaci6n del locus y la inserci6n de un locus distinto.
El gen o genes ex6genos son preferiblemente un gen de IgH o genes de IgH, mas preferiblemente un gen C de IgH o genes C de IgH. El gen o genes ex6genos pueden ser un gen humano o genes humanos, preferiblemente el gen o genes ex6genos son genes de la regi6n constante de cadena pesada de Ig humanos, mas preferiblemente un locus de la regi6n constante de cadena pesada de Ig humano, o un locus de cadena pesada de Ig humano, que tenga las regiones V, O, J y/o C.
En el ser humano, el locus de cadena pesada de las inmunoglobulinas esta localizado en el cromosoma 14. En la direcci6n 5'-3' de la transcripci6n, el locus comprende una gran agrupaci6n de genes de la regi6n variable (VH), los genes de la regi6n de diversidad (O), seguido de los genes de la regi6n de uni6n (JH) y la agrupaci6n de genes constantes (CH). Se calcula que el tamano del locus es de aproximadamente 2.500 kilobases (kb). Ourante el desarrollo de las celulas B, segmentos genicos discontinuos del locus de IgH de la lfnea germinal se juxtaponen mediante una redisposici6n ffsica del AON. Para que pueda producirse un polipeptido de Ig de cadena pesada funcional, deben unirse tres segmentos de AON discontinuos, de las regiones VH, O y JH, de una manera secuencial especffica, VH a OJH, generando la unidad funcional VHOJH. Cuando VHOJH se ha formado se producen cadenas pesadas especfficas tras la transcripci6n del locus de Ig, utilizando como molde la unidad VHOJHCH especffica que comprende exones e intrones. Existen dos loci para las cadenas ligeras de Ig, el locus κ sobre el cromosoma 2 humano, y el locus λ sobre el cromosoma 22 humano. La estructura de los loci IgL es similar a la del locus IgH, excepto que la regi6n O no esta presente. Tras la redisposici6n de IgH, se logra la redisposici6n de un locus de cadena ligera de una manera similar mediante la uni6n de VL y JL a la cadena κ o λ. Los tamanos de los loci λ y κ son cada uno de 1-3 Mb. La expresi6n de la IgH redispuesta y de una cadena ligera Igκ o Igλ en una celula B particular permite la generaci6n de moleculas de anticuerpos.
Las regiones V, O, J y/o C del locus de la cadena pesada de Ig humanas pueden estar en la configuraci6n de la lfnea germinal, o pueden disponerse productivamente. En la configuraci6n de la lfnea germinal, los exones estan separados por secuencias intermedias, y asf la secuencia genica debe redisponerse para la expresi6n del gen o genes. Cuando estan dispuestas productivamente, las secuencias intermedias se han eliminado de la secuencia genica, y asf no es necesaria la redisposici6n de la secuencia genica para la expresi6n del gen o genes.
Una celula o un mamffero no humano capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, obtenidos mediante un metodo descrito en la presente, pueden utilizarse para la producci6n de inmunoglobulinas ex6genas, preferiblemente de inmunoglobulinas humanas.
Una inmunoglobulina ex6gena es una inmunoglobulina que no es nativa al mamffero o celula hospedante en el cual se produce; en algunas realizaciones de la invenci6n se prefiere que la inmunoglobulina ex6gena comprenda una regi6n variable de mamffero que no sea nativa al mamffero o celula hospedante en el cual se produce, y mas preferiblemente la regi6n variable de mamffero es una regi6n variable humana.
Se ha descubierto que un mamffero no humano transgenico puede producir una inmunoglobulina quimerica o extrana (derivada de material genetico ex6geno insertado) en respuesta a un inmun6geno posteriormente introducido en el mamffero no humano transgenico. Por consiguiente, mediante la introducci6n de material genetico extrano, por ejemplo humano, que codifica sustancialmente todas las regiones especfficas de especie de una inmunoglobulina, es posible estimular al mamffero no humano transgenico para que produzca una inmunoglobulina extrana contra cualquier antfgeno introducido en el animal. El animal transgenico por tanto puede proporcionar una fuente muy util, conveniente y valiosa de inmunoglobulinas humanas contra una amplia gama de antfgenos. Ademas, no existirfan interferencias debidas a la expresi6n simultanea del polipeptido C de IgH end6geno.
Por consiguiente, la presente invenci6n proporciona un metodo para la producci6n de una inmunoglobulina ex6gena, que comprende un metodo para producir una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado de la invenci6n, que es capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, siendo la inmunoglobulina una inmunoglobulina ex6gena con respecto al mamffero o la celula hospedante en el cual se produce. En un aspecto preferido, la inmunoglobulina ex6gena comprende una regi6n variable de mamffero que no es nativa al mamffero o la celula hospedante en el cual se produce, mas preferiblemente la regi6n variable de mamffero es una regi6n variable humana. En otro aspecto preferido, la inmunoglobulina ex6gena es una inmunoglobulina humana.
Cuando se emplea un mamffero no humano en un uso o un metodo para la producci6n de una inmunoglobulina ex6gena, el mamffero no humano es preferiblemente un roedor, mas preferiblemente un rat6n. Cuando se emplea una celula de mamffero no humano en un uso o un metodo para la producci6n de una inmunoglobulina ex6gena, la celula de mamffero no humano es preferiblemente una celula de roedor, mas preferiblemente una celula de rat6n.
Tambien se proporciona un metodo para la producci6n de un medicamento que comprende un metodo de la invenci6n para la producci6n de una inmunoglobulina ex6gena.
Descripcian de las figuras
La figura 1 ilustra la estrategia para la eliminaci6n del gen de la regi6n constante de inmunoglobulinas de cadena pesada. Se insert6 una secuencia loxP cadena arriba de un gen de un marcador seleccionable (puromicina) en el gen C mas 5', y otro gen de un marcador seleccionable (neomicina) cadena arriba de una secuencia loxP se insert6 cadena abajo del gen C final y mas 3' en el potenciador 3'. Tras la expresi6n de Cre, esta estrategia dio como resultado la eliminaci6n de una regi6n de aproximadamente 200 kb con todos los genes C.
La figura 2 ilustra la construcci6n de transporte dirigido para la regi6n 3', proporcionandose a la izquierda los digeridos de restricci6n que confirman el ensamblaje correcto.
La figura 3 ilustra un ensayo de la transferencia Southern que muestra los fragmentos de la lfnea germinal (GL) cuando se hibridan con la sonda 3'ext (externa) indicada. Las muestras con inactivaci6n (KO, "knock-out") o integraci6n hom6loga producen otra banda Sad de aproximadamente 10 kb y BamHI de 4 kb, ademas de una banda de la lfnea germinal mas debil para el alelo modificado.
Las figuras 4 y 5 indican que, tras la transfecci6n de ZX3 (ZX3 es una denominaci6n interna de las celulas precursoras embrionarias murinas producidas utilizando los metodos descritos por Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, y E. Lacy, 1994, en Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press), se seleccionaron celulas precursoras embrionarias y se evaluaron, y a partir de 601 clones de celulas ES se identific6 un acontecimiento de transporte dirigido, el clon nO 355. A la izquierda de la figura 5 se muestran posteriores analisis de la transferencia Southern del clon 355.
La figura 6 ilustra la construcci6n de transporte dirigido de Cμ y el analisis de la secuencia de llxP en las dos construcciones de transporte dirigido, que verifican su orientaci6n correcta para permitir la eliminaci6n por deleci6n mediada por Cre de todos los genes C.
La figura 7 ilustra el esquema para la integraci6n dirigida y la deleci6n de la agrupaci6n de los genes C.
La figura 8 muestra el analisis de la transferencia Southern de 355 homocigotos potenciales (3'E) derivados del clon de ES 355 y su cruzamiento hasta la homocigosidad. La banda de aproximadamente 4 kb indica el acontecimiento de transporte dirigido, la banda de aproximadamente 6,5 kb es la banda de la lfnea germinal, y ++ indica la integraci6n dirigida en ambos alelos.
La figura 9 muestra el clon de celulas ES 355 que se utiliz6 para el transporte dirigido posterior con el vector de transporte dirigido de Cμ. Las sondas externa se indican como A y B. Esto produce un acontecimento de transporte dirigido dual, el clon 212.
La figura 10 muestra c6mo se verific6 la integraci6n. El clon 212 porta dos integraciones dirigidas, cadena arriba y cadena abajo de la agrupaci6n de genes C. La transfecci6n de las celulas ES con un vector Cre permite el analisis de la deleci6n y sugiere que ambos acontecimientos de transporte dirigido se produjeron sobre un alelo.
La figura 11 demuestra que los clones, despues de la transfecci6n de Cre, parecen producir una banda de PCR utilizando los cebadores 1 y 4 ilustrados en la figura 7. Sin embargo, permanece una banda que indica la integraci6n dirigida, los cebadores 1 y 2. Esto puede indicar clones mixtos o que no se logra la eliminaci6n mediada por CrellxP en todas las celulas de los clones.
La figura 12 muestra el analisis de PCR de ratones de transmisi6n de la lfnea germinal potenciales (seleccionados por el color del pelo) para ambas integraciones dirigidas 3'E y μ. Oe forma inesperada, aproximadamente la mitad del numero de ratones de transmisi6n de la lfnea germinal tenfan un alelo que porta el acontecimiento de transporte dirigido 5' o 3', pero no ambos acontecimientos. Oe los 19 ratones, 6 fueron negativos, 7 positivos para la integraci6n dirigida en 3'E, 5 positivos para la integraci6n dirigida en μ, y uno fue positivo para ambos acontecimientos de transporte dirigido. Puesto que la transmisi6n de la lfnea germinal fue de aproximadamente 50% (la mitad de los ratones con el color de pelo correcto no tenfan la modificaci6n diana), parece que las dos integraciones dirigidas estan sobre un alelo, pero el estrecruzamiento con frecuencia separa las dos regiones.
La figura 13 muestra los resultados del analisis de PCR de un gran numero de ratones de transmisi6n de la lfnea germinal (seleccionados basandose en el color del pelo) que resulta en la identificaci6n de 7 ratones que portan ambos acontecimientos de transporte dirigido 3'E y μ. Oe 51 ratones, 22 fueron negativos, 14 positivos para la integraci6n dirigida en 3'E, 7 positivos para la integraci6n dirigida en μ, y 7 fueron positivos para ambos acontecimientos de transporte positivo 3'E y μ.
La figura 14 muestra el esquema para el analisis de PCR de ratones IgHC-inactivados (deleci6n).
La figura 15 muestra los analisis de PCR de las crfas de la primera y segunda generaci6n obtenidas tras cruzar los
dos ratones de transmisi6n de la lfnea germinal que portan ambos acontecimientos de transmisi6n dirigida, μlox y 3'Elox, con animales Cre+.
La figura 16 muestra los resultados del analisis de citometrfa de flujo de celulas de medula 6sea y de bazo procedente de ratones homocig6ticos CΔ (deleci6n de IgHC).
La figura 17 muestra (A) los resultados del analisis de la redisposici6n de O-J y V-O-J mediante PCR, que se realiz6 para ensayar la implicaci6n del locus IgH en la redisposici6n del AON procedente de celulas de la medula 6sea, y (B) analisis transcripcionales de RT-PCR de una sola etapa de ARN preparado a partir de celulas de medula 6sea y RT-PCR de una sola etapa.
La figura 18 muestra los resultados de un ELISA realizado en suero de ratones F1, CΔ y μMT; en el suero de ratones CΔ no se detect6 la presencia de ninguna Ig ni de fracciones individuales de IgM, IgG o IgA.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparacian de la construccian de transporte dirigido para la regian Cμ 5'
Un banco de fago λ, obtenido de AON de celulas ES (precursoras embrionarias) E14 (Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) se hibrid6 con un fragmento BamHI de 4,5 kb que comprende Cμ (Zou et al., Int. Immunol., 13, 1489-1499, 2001). Se identificaron y cartografiaron varios clones positivos. Los metodos de hibridaci6n estan bien documentados en la bibliograffa y son conocidos por los expertos en la tecnica.
Se anadi6 un sitio llxP al gen de puromicina (Tucker et al., Genes Oev., 10, 1008-1020, 1996) mediante PCR (cebador oligonucleotfdico directo BamHI-llxP-puro: 5' TTTGGATCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGACCTCGAAATTCTACCGGG 3' (SEQ IO NO:1) y el cebador oligonucleotfdico inverso BcII-puro: 5' TTTGATCAGCTGATCTCGTTCTTCAGGC 3' (SEQ IO NO:2) que permiten la recuperaci6n de llxP-puro sobre un fragmento BamHI-BcII).
Se uni6 el fragmento de aproximadamente 6,5 kb de JH3/4 a Cμ1 y se uni6n el fragmento de aproximadamente 5,5 kb de Cμ2 a Cδ con un gen de resistencia a puromicina-llxP sobre un fragmento BamHI-BcII de aproximadamente 2 kb (vease la figura 6).
Se ensambl6 la construcci6n de transporte dirigido para Cμ (μlox) mediante la subclonaci6n de fragmentos BamHI-BgIII en pUC19 (Invitrogen). El sitio EcoRI 3' se sustituy6 por NotI utilizando una digesti6n parcial y una inserci6n de conector de extremo romo. En la construcci6n de transporte dirigido 5' resultante para Cμ, se insert6 una secuencia llxP cadena arriba de un gen de un marcador seleccionable (puromicina) que estaba insertado en el gen Cμ.
Ejemplo 2: Preparacian de la construccian de transporte dirigido para la regian α3'
El banco de fago λ (vease anteriormente), obtenido de AON de celulas ES (precursoras embrionarias) E14, se hibrid6 con un fragmento BgIII de 3,5 kb que comprende el potenciador α3' de rata (Petterson et al., Nature, 344, 165-168, 1990) y se identificaron y cartografiaron varios clones positivos.
La regi6n potenciadora α3' sobre un fragmento SacI de aproximadamente 9 kb se clon6 en pUC19 y el sitio EcoRV interno se cambi6 a SpcI mediante una digesti6n parcial y una inserci6n de conector de extremo romo. Este sitio exclusivo permite la integraci6n de un gen de neomicina-llxP de aproximadamente 1,3 kb sobre un fragmento NheI compatible (vease la figura 2). Se anadi6 un sitio llxP al gen de resistencia a la neomicina (Stratagene, La Jolla, CA) mediante inserci6n de extremo romo de llxP procedente de pGEM-30 (Gu, H., Y.-R. Zou, y K. Rajewsky, Cell, 73, 1155-1164, 1993) y mediante inserci6n de oligonucle6tidos (Sauer, Mol. Cell. Biol., 7, 2087-2096, 1987) en la construcci6n de transporte dirigido α3' (3'Elox) cadena abajo del gen de neomicina.
Ejemplo 3: Confirmacian de la orientacian de los sitios 10xP
La orientaci6n correcta del sitio llxP en cada construcci6n de transporte dirigido se verific6 mediante secuenciaci6n de AON (vease la figura 6). Los sitios llxP deben estar en la misma orientaci6n lineal entre sf de forma que pueda obtenerse, tras la inserci6n dirigida de ambos sitios llxP, la eliminaci6n por deleci6n mediada por Cre. En este caso, esto permite la eliminaci6n de ambos genes de marcadores seleccionables insertados y la regi6n entre Cμ y el potenciador 3'α al final de la agrupaci6n de genes C.
Ejemplo 4: Preparacian de celulas ES
Se produjeron celulas ES ZX3, obtenidas a partir de la raza de rat6n 129 sv, utilizando los metodos descritos en Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, y E. Lacy, 1994, en Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. ZX3 es una denominaci6n interna de estas celulas precursoras embrionarias murinas obtenidas por Zou-Xiangang tras el 3er intento.
Ejemplo 5: Transfeccian de celulas ES e hibridacian Southern
La construcci6n de transporte dirigido de Cμ se linealiz6 utilizando BamHI y NotI, y la construcci6n de transporte dirigido del potenciador α3' se linealiz6 con BgIII y EcoRV (vease la figura 3). Para cada construcci6n por separado, aproximadamente 10 μgdel fragmento purificado (kit de purificaci6n nO 28304, Qiagen, Crawley, West Sussex, Reino Unido) se mezclaron con aproximadamente 107 celulas ES ZX3, obtenidas a partir de la raza de rat6n 129 sv, y se sometieron a una electroporaci6n y a una selecci6n segun se ha descrito (Zou et al., Eur. J. Immunol., 25, 21542162, 1995; Zou et al., Int. Immunol., 13, 1489-1499, 2001). Se prepar6 AON procedente de clones resistentes a G418 (Neor) para la construcci6n de potenciador α3' y se analiz6 en analisis de la transferencia Southern segun se ha descrito (Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Esto permiti6 la identificaci6n de un clon en el que el transporte dirigido fue correcto (355) que se utiliz6 para la introducci6n de la construcci6n de Cμ y la selecci6n con puromicina, que produjo un clon en el que el transporte dirigido fue correcto (212) identificado con la inserci6n correcta en Cμ y el potenciador 3'α.
Las sondas de hibridaci6n fueron un fragmento EcoRV-SacI externo 3' de aproximadamente 0,4 kb para el potenciador α3' (vease la figura 5), y sondas externas 5' y 3' para Cμ descritas en Zou et al., Int. Immunol., 13, 14891499, 2001 (veanse las figuras 9 y 10). Estas fueron una sonda externa 5', un fragmento BamHI-BgIII de aproximadamente 0,5 kb, y una sonda externa 3' de 335 pb, obtenidas mediante PCR utilizando AON plasmfdico con los siguientes oligonucle6tidos: cebador directo 5' AACCTGACATGTTCCTCC 3' (SEQ IO NO:3) y cebador inverso (5' GGGATTAGCTGAGTGTGG 3' (SEQ IO NO:4). Las condiciones de PCR fueron de 95 OC durante 1 min, 58 OC durante 1 min, y 72 OC durante 30 seg con 30 ciclos.
Se realizaron analisis de la transferencia Southern como se indic6 anteriormente, ofreciendose los resultados en las figuras 3, 4 y 5 que muestran los fragmentos de la lfnea germinal (GL) cuando se hibridan con la sonda 3'ext (externa) indicada. Las muestras con integraci6n hom6loga o inactivadas (KO) producen otras bandas SacI de aproximadamente 10 kb y BamHI de aproximadamente 4 kb (3,8 kb), ademas de una banda de la lfnea germinal mas debil para el alelo no modificado.
La figura 9 muestra los resultados del clon de celulas ES 355 que se utiliz6 para la posterior integraci6n del vector de transporte dirigido de Cμ. Se realiz6 un analisis de la transferencia Southern utilizando la sonda B y la sonda A (no se muestra) que identific6 un acontecimiento de transporte dirigido doble, el clon 212.
Para la deleci6n mediada por Cre en la transfecci6n transitoria, se mezclaron 10 μg del plasmido superenrollado pBS185 (Gibco, nO de catalogo 10347-011) con 107 celulas ES en 0,8 ml de medio de celulas ES y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min. Oespues de la transferencia a una cubeta de separaci6n de electrodos de 0,4 cm (Bio-Rad, 65-2088) se aplicaron pulsos electricos dos veces a 230 V y 500 μF. Las celulas se cultivaron a 37 OC durante 30 min y despues se trasladaron en baja densidad a placas de 6 pocillos que contenfan celulas alimentadoras. Oespues de 8 a 10 dfas en cultivo se recogieron los clones y se dividieron en partes iguales para ensayar su supervivencia en un medio de selecci6n. Aproximadamente 10% de los clones murieron y en sus fracciones separadas se identific6 la deleci6n mediante PCR y analisis de la transferencia Southern.
La figura 10 muestra c6mo se verific6 la integraci6n mediante analisis de la transferencia Southern tal como se describi6 anteriormente. El clon 212 porta dos integraciones dirigidas, cadena arriba y cadena abajo de la agrupaci6n de genes C. La transfecci6n de las celulas ES con el vector Cre permite la delecci6n, que aument6 la banda de hibridaci6n resultante tal como se esperaba.
La eliminaci6n de los 8 genes de la regi6n C en una regi6n de aproximadamente 200 kb implic6 la integraci6n dirigida de construcciones de homologfa flanqueadas por llxP (μlox y 3'Elox) en los exones 1 y 2 de Cμ, con la eliminaci6n de un fragmento BgIII-BamHI de 330 pb, y en el potenciador 3', localizado aproximadamente 15 kb cadena abajo de Cα (figura 7). La integraci6n hom6loga se identific6 mediante una hibridaci6n Southern utilizando sondas externas (figura 10). Esto produjo, en una digesti6n BgIII y una hibridaci6n con la sonda 5'JH, una banda de la lfnea germinal de 8,3 kb y de transporte dirigido de 7,8 kb, mientras que la sonda 3'E identific6 una banda de la lfnea germinal de 11,2 kb y de transporte dirigido de 12,5 kb. Utilizando la sonda 3'E en una digesti6n BamHI se identific6 una banda de la lfnea germinal de 6,5 kb y de transporte dirigido de 4 kb. Para evaluar la eficacia de la eliminaci6n del gen C mediada por Cre-llxP, se transfect6 el plasmido de Cre pBS185 y se expres6 de forma transitoria en celulas ES con transporte dirigido doble. Tras la deleci6n del gen C se obtuvo un fragmento BgIII de 15 kb cuando se hibrida con la sonda 5'JH y, por separado, con la sonda 3'E, y en una digesti6n BamHI se obtuvo un fragmento de 11,5 kb con la sonda '3E. Estos descubrimientos estan de acuerdo con el mapa del locus. El analisis de las colonias individuales mediante transferencia Southern y PCR, ofreciendose ejemplos en la figura 10, demuestra la deleci6n del locus en aproximadamente 10% de los clones. Est6 esta de acuerdo con la evaluaci6n inicial de la captaci6n celular y la expresi6n del gen Cre que se verific6 transfiriendo parte de cada colonia a un medio selectivo en el que aproximadamente 1 de cada 10 clones muri6. El clon de celulas ES con transporte dirigido doble 212 se emple6 para obtener ratones, puesto que una deleci6n in vitrl puede obtenerse con facilidad, lo cual sugiere que ambas modificaciones se integraron en el mismo alelo y que la deleci6n in vitrl probablemente puede lograrse cruzando los ratones de transmisi6n de la lfnea germinal con los que expresan Cre [15].
La verificaci6n de los dos acontecimientos de integraci6n dirigida cadena arriba (5' Cμ) y cadena abajo (α3') de la agrupaci6n de genes C se confirm6 en el clon 212 mediante una transfecci6n transitoria de las celulas ES con el vector Cre y un analisis de la deleci6n mediante PCR utilizando la pareja de cebadores 1-4 (veanse las figuras 7 y 14, para P1 y P4 veanse los ejemplos) que demuestra la deleci6n de la agrupaci6n de genes C y sugiere que la integraci6n dirigida de las dos contrucciones se produjo sobre un alelo (vease la figura 11).
La figura 11 demuestra que los clones despues de la transfecci6n de Cre parecen producir una banda de PCR utilizando los cebadores 1 y 4 ilustrados en las figuras 7 y 14, y en el ejemplo 8. Sin embargo, permaneci6 una banda que indica la integraci6n dirigida, los cebadores 1 y 2. Esto puede indicar clones mixtos o que no se logra la eliminaci6n mediada por Cre-llxP en todos las celulas del clon. N6tese que, puesto que esto no se observa en las hibridaciones de transferencia Southern, figura 10, es probable que represente un nivel bajo de contaminaci6n detectado por una amplificaci6n con PCR muy eficaz.
Ejemplo 6: Generacian de ratones y cruzamientos
Se inyectaron clones de celulas ES con acontecimientos de transporte dirigido (355 para el unico acontecimiento de transporte dirigido del potenciador α3', integraci6n de 3'Elox en el potenciador α3', y 212 para los acontecimientos de transporte dirigido del potenciador α3' (3'Elox) y de 5' Cμ (μlox)) en blastocistos de BALB/c, se transplantaron en madres de acogida (C57BL/6 x CBA)F1 y se obtuvieron ratones quimericos y de transmisi6n de la lfnea germinal segun se ha descrito (Hogan, B., R. Beddington, F. Costantini, y E. Lacy, 1994, Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los ratones despues se analizaron mediante PCR como se describe a continuaci6n y se obtuvieron, cruzaron e investigaron segun las normas de licencias de proyectos de UK Home Office.
El cruzamiento de animales que portan ambos acontecimientos de transporte dirigido con ratones Cre (para los metodos, vease la referencia 15, Zou et al. (2003)) produjo la deleci6n del locus.
Ejemplo 7: Anllisis de la transferencia Southern de ratones de transmisian de la linea germinal producidos a partir del clon de ES 355
Se realiz6 un analisis de la transferencia Southern de ratones de transmisi6n de la lfnea germinal producidos a partir del clon de ES 355, con los ratones producidos a partir de estos cruzados hasta la homocigosidad, utilizando la sonda E externa 3' (C en la figura 7). La banda de aproximadamente 4 kb indica el acontecimiento de transporte dirigido, la banda de aproximadamente 6,5 kb es la banda de la lfnea germinal, y ++ indica la integraci6n dirigida en ambos alelos. Los resultados de la transferencia Southern se proporcionan en la figura 8.
Para la obtenci6n de ratones transgenicos que expresan la protefna Cre de forma ubicua se linealiz6 el plasmido de Cre pBS185 (GibcoBRL, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) con ScaI y se purific6 utilizando un kit de purificaci6n de AON (nO 28304, Qiagen, Crawley, West Sussex, Reino Unido). El AON se microinyect6 en el pronucleo masculino de embriones F1 (CBA x B57Bl/6) segun metodos convencionales (Hogan, vease anteriormente) y se produjeron varios fundadores, dos de los cuales mostraron una alta tasa de deleci6n de genes/loci cuando se cruzan con ratones llxP.
La figura 12 muestra que, de forma inesperada, aproximadamente la mitad de los ratones de transmisi6n de la lfnea germinal obtenidos a partir del clon 212 tenfan un alelo que porta el acontecimiento de transporte dirigido 5' o 3', pero no ambos acontecimientos. Puesto que la transmisi6n de la lfnea germinal fue de aproximadamente 50% (la mitad de los ratones con el color de pelo correcto no tenfan la modificaci6n especffica de sitio), parece que las dos integraciones dirigidas estan sobre un alelo, pero el estrecruzamiento con frecuencia separa las dos regiones.
El analisis de un gran numero de ratones mediante PCR identific6 7 ratones que portaban ambos acontecimientos de transporte dirigido (figura 13). El cruzamiento de estos ratones con ratones que expresan Cre mostr6 la deleci6n del locus, dando como resultado la producci6n de un rat6n con la deleci6n del agrupamiento de genes C de IgH en un alelo.
Ejemplo 8: Seleccian de PCR de ratones con inactivacian de C de IgH (delecian) Cebadores
- NOMBRE (J. Coadwell)
- NOMBRE (L. Ren) LONGITUO SECUENCIA (5' a 3')
- P1 V00818f.pri
- MIgHKO1F 27 pb AGAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGG
- P1 corresponde a SEQ IO NO:5, este es un cebador directo que se une a la regi6n μ.
- P2 puromycinr.pri
- MIgHKO2R 23 pb TGGATGTGGAATGTGTGCGAGGC
- P2 corresponde a SEQ IO NO:6, este es un cebador inverso que se une a la regi6n μ.
- P3 neomycinf.pri
- MIgHKO3F 23 pb TGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC
- P3 corresponde a SEQ IO NO:7, este es un cebador directo que se une a la regi6n potenciadora 3'.
- P4 X96607r.pri
- MIgHKO4R 22 pb GAGTCCCCATCCCCAAGGCTGG
- P4 corresponde a SEQ IO NO:8, este es un cebador inverso que se une a la regi6n potenciadora 3'.
Metodos de PCR
Para cada una de las PCR utilizadas para la selecci6n de ratones de inactivaci6n de IgH, las reacciones se establecieron del siguiente modo:
- Por cada 20 μl de reacci6n:
- 10 x tamp6n
- 2,0 μl
- dNTP 2 mM
- 2,0 μl
- cebador directo 20 mM
- 0,8 μl
- cebador inverso 20 mM
- 0,8 μl
- Taq preparada en el laboratorio
- 0,1 μl
- cola de AON diluida
- 1,0 μl
- agua
- 13,3 μl
Las parejas de cebadores directo e inverso utilizadas para cada tipo de PCR fueron:
i. PCR 212: MIgHKO1F (SEQ IO NO:5) y MIgHKO2R (SEQ IO NO:6) 10 ii. PCR 355: MIgHKO3F (SEQ IO NO:7) y MIgHKO4R (SEQ IO NO:8)
iii. PCR de deleci6n: MIgHKO1F (SEQ IO NO:5) y MIgHKO4R (SEQ IO NO:8)
El 10 x tamp6n utilizado fue KCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%, Tris-Cl 100 mM, pH 9,0, MgCl21,5 mM.
Las reacciones se realizar6n como sigue: 5 minutos a 95 OC durante 1 ciclo, 30 segundos a 94 OC, despues 45
segundos a la temperatura de hibridaci6n apropiada, seguido de 1 minuto a 72 OC para 30 ciclos, despues 10 15 minutos a 72 OC para 1 ciclo. Tras lo cual las reacciones se mantuvieron a 6 OC hasta que se analizaron. Las temperaturas de hibridaci6n utilizadas para cada tipo de reacci6n fueron:
i. PCR 212: 62 OC
ii. PCR 355: 62 OC
iii. PCR de deleci6n: 66 OC
Ejemplo 9: El mosaicismo alelico se transmite a traves de la linea germinal
Los resultados de cruzamiento para los dos primeros ratones de transmisi6n de la lfnea germinal que portan ambos acontecimientos de uni6n, μlox y 3'Elox, con animales Cre+ (1a generaci6n), y el posterior cruzamiento de ratones de deleci6n de C (CΔ) para obtener animales homocig6ticos sin genes C de IgH remanantes (2a generaci6n) se ilustra en la tabla 1.
Tabla 1: Tasa de transmisi6n de la integraci6n hom6loga y la deleci6n del locus
- Genotipo: 1a generaci6na
- Genotipo: 2a generaci6nb
- integraci6n hom6loga
- deleci6n nO (%) integraci6n hom6loga deleci6n nO (%)
- -
- + 0 (0) - + 4 (11)
- +
- +
- 2 (5)* + + 0 (0)
- +
- - 24 (60) + - 10 (26)
- tipo salvaje
- 14 (35) tipo salvaje 24 (63)
- (a)
- Los ratones de transmisi6n de la lfnea germinal que portan ambos acontecimientos de uni6n (μlox y 3'Elox) se cruzaron con ratones Cre heterocig6ticos. Oe los 71 ratones de la primera generaci6n analizados mediante PCR, 40 fueron Cre+ y para estos animales se muestra la presencia de la integraci6n dirigida y la deleci6n del locus.
- (b)
- Los ratones de deleci6n de la 1a generaci6n (*) se cruzaron despues con ratones F1 normales, lo cual produjo 38 animales analizados mediante PCR con una deleci6n de locus o, por separado, los acontecimientos de transporte dirigido o sin ninguna modificaci6n.
En los ratones de 1a generaci6n producidos, la transmisi6n de Cre fue algo mejor que el 50% esperado, portando un gran numero de ratones los acontecimientos de transporte dirigido. Esto implica que ambas integraciones dirigidas se produjeron en un alelo, aunque el tamano y la complejidad del locus de IgH impidi6 la determinaci6n de la uni6n cromos6mica por medios moleculares. Sin embargo, en estos animales de la 1a generaci6n, CΔ s6lo pudo lograrse en dos ratones, que tambien mantuvieron las bandas de PCR para los acontecimientos de transporte dirigido (figura 15). Este nivel bajo de deleci6n mediada por Cre-loxP, acompanado de un mosaicismo del locus, no fue evidente en los cruzamientos previos utilizando los ratones Cre pBS185 [15]. Esto puede ser debido a una menor eficacia de deleci6n en ratones heterocig6ticos debido a unos niveles reducidos de Cre o, como alternativa, a la inaccesibilidad del locus de IgH. Las combinaciones de cruzamiento de animales macho o hembra Cre+ con ratones μlox y 3'Elox no cambiaron este resultado. No obstante, los descubrimientos sugieren que la deleci6n del locus puede lograrse pero no con una alta eficacia en todas las celulas. Trabajando sobre la suposici6n de que la deleci6n mediada por CreloxP puede producirse operativamente temprano en el desarrollo fetal, esta result6 ser correcta, puesto que el posterior cruzamiento de ratones que portan la deleci6n dirigida y los dos acontecimientos de integraci6n hom6loga produjo unas crfas con la deleci6n transmitida y sin integraci6n dirigida remanente (figura 15, carril 4 y 5). La frecuencia con que se obtuvieron ratones CΔ heterocig6ticos a partir del cruzamiento de los fundadores mosaico fue considerablemente menor que la transmisi6n de las integraciones dirigidas e incluso el numero de ratones de tipo salvaje, lo cual sugiere los siguientes acontecimientos. Un huevo fertilizado porta un alelo de tipo salvaje de IgH, un alelo de IgH con transporte dirigido doble, y Cre integrado aleatoriamente en el genoma. La deleci6n mediada por Cre funciona de manera desproporcionada, y en la etapa de 4 celulas s6lo uno de los blast6meros porta el alelo delecionado y un alelo de tipo salvaje, mientras que los otros tres blast6meros portan cada uno un alelo de transporte dirigido doble y un alelo de tipo salvaje. Este patr6n de distribuci6n se mantiene durante el desarrollo, y tras la meiosis, 4 de 8 celulas germinales (50%) tienen el alelo de tipo salvaje, 3 de 8 (37,5%) el alelo de transporte dirigido, y 1 de 8 (12,5%) la deleci6n. Aunque los numeros en la tabla 1 son demasiado pequenos para corresponder exactamente a este calculo, demuestran que la mayorfa de los ratones de la 2a generaci6n son de tipo salvaje, que el numero intermedio de ratones portan las integraciones dirigidas y que, a 11%, se encuentra una correspondencia cercana para el numero de ratones CΔ, lo cual apoya en gran medida la prediccion de que la recombinaci6n mediada por Cre puede ser desproporcionada en etapas tempranas del desarrollo.
Ejemplo 10: Anllisis de PCR de la delecian y la redisposician
La integraci6n hom6loga en Cμ y el potenciador α3' se identific6 utilizando 2 conjuntos de oligonucle6tidos (vease la figura 1): (1) Cμ directo (5' AGAGCCCCCTGTCTGATAAGAATCTGG 3', SEQ IO NO:5), y (2) puro (5' TGGATGTGGAATGTGTGCGAGGC 3', SEQ IO NO:6), produjeron un fragmento de aproximadamente 485 pb; mientras que (3) neo (5' TGCTTTACGGTATCGCCGCTCCC 3', SEQ IO NO:7), y (4) 3'E (5' GAGTCCCCATCCCCAAGGCTGG 3', SEQ IO NO:8) produjeron un fragmento de aproximadamente 500 pb. Tras la eliminaci6n del gen C, los oligonucle6tidos (1) y (4) produjeron una banda de deleci6n de aproximadamente 613 pb. La presencia del transgen Cre y del gen γ2a en el locus de IgH end6geno se identific6 utilizando los siguientes oligonucle6tidos: Cre directo 5' GGACATGTTCAGGGATCGCCAGG 3', SEQ IO NO:9, y Cre inverso 5'
GATAGCTGGCTGGTGGCAGATGG 3', SEQ IO NO:10, y γ2a directo 5' GGCTGGGATGGGCATAAGGATAAAGGTC 3', SEQ IO NO:11, y una mezcla 1:1 de γ2aa inverso 5' GTAGCTATTTCTTTCCACCCAGTTCTTC 3', SEQ IO NO:12, y γ2ab inverso 5' GAAAAGACTTCCTCTTTCCCAAGTGCTC 3', SEQ IO NO:13, que fueron especffico de alotipo. Las condiciones de PCR 6ptimas fueron de 94 OC durante 45 sg, 60 OC (Cre, γ2a) o 62 OC (Cμ-puro, neo-3'E) o 66 OC (Cμ-3'E) durante 1 min o 45 sg (Cre), y 72 OC durante 45 sg con 30 ciclos, seguido de 10 min a 72 OC para completar la reacci6n.
Para el analisis de la redisposici6n de O-J y V-O-J se prepar6 AON y ARN a partir de celulas de la medula 6sea utilizando el reactivo Tri (Sigma) y el sistema de RT-PCR One-Step (Invitrogen, Life Technologies). Se emplearon combinaciones de los siguientes oligonucle6tidos: una mezcla 1:1 de OF (5' GCATGTCTCAAAGCACAATG 3', SEQ IO NO:14) y OQ52 (5' ACCCTGGACACAGGAAACAC 3', SEQ IO NO:15) cebadores directos; una mezcla 1:1 de VJ558L (5' ATGGGATGGAGCTGGATCTT 3', SEQ IO NO:16) y VJ558CL (5' ATGGAATGGAGCTGGGTCTT 3', SEQ IO NO:17) cebadores directos; cebador inverso JH1-4 (5' GAGACOGTGASHRORGTBCCTKSRCC 3', SEQ IO NO:18 con R = A + G, K = G + T, H = A + T + C, B = G + T + C, y O = G + A + T); y lamina B1, un gen expresado de forma ubicua como control, lamina para 5' GTATGAGGCGGCACTAAACTCTAA 3', SEQ IO NO:19, y una mezcla 1:1 de AON gen6mico de lamina inverso 5' GAAGCCACTGAAGAACACAAATAG 3', SEQ IO NO:20, y AONc de lamina inverso 5' TACGAAACTCCAAGTCCTCAGTAA 3', SEQ IO NO:21. Las condiciones de la PCR fueron de 35 ciclos de 92 OC durante 15 sg, 60 OC durante 30 sg, y 72 OC durante 40 sg, y las condiciones de la RT-PCR fueron 30 min a 50 OC, y 2 min a 94 OC, seguido de 35 ciclos de 92 OC durante 15 sg, 50 OC durante 30 sg, y 72 OC durante 40 sg, seguido de 10 min a 72 OC para completar la reacci6n.
Ejemplo 11: Bloqueo en el desarrollo en la etapa preB-I
Para investigar la capacidad en el desarrollo de la poblaci6n de linfocitos en ratones CΔ homocig6ticos se analizaron celulas de la medula 6sea y de bazo mediante citometrfa de flujo (figura 16).
Analisis de citometrfa de flujo
Se prepararon suspensiones de celulas de medula 6sea y de bazo a partir de ratones normales F1 (C57/BL6 x CBA), ratones μMT (ratones mutantes homocig6ticos μMT-/-(Cμ) [11]) y ratones de deleci6n de CΔ. Se tineron celulas de medula 6sea con cuatro combinaciones de colores (vease la figura 4) con el c-kit anti-rat6n conjugado con PE (CO117, 09995B, BO PharMingen, San Oiego, CA), CO45R anti-rat6n conjugado con APC (B220, 01129A, BO PharMingen), CO25 anti-rat6n conjugado con biotina (01092A, BO PharMingen), IgM anti-rat6n de rata monoclonal conjugado con FITC (especffico de la cadena μ, 04-6811, Zymed, San Francisco, CA), CO43 anti-rat6n conjugado con biotina (01602O, BO PharMingen), IgO anti-rat6n conjugado con FITC (02214O, BO PharMingen), y/o cadena L de Igκ anti-rat6n conjugado con PE (559940, BO PharMingen). Las celulas de bazo se tineron con CO45R anti-rat6n conjugado con APC, IgM anti-rat6n conjugado con biotina (especffico de la cadena μ, 02082O, BO PharMingen), Igκ anti-rat6n conjugado con PE y CO21/CO35 anti-rat6n conjugado con FITC (CR2/CR1, 553818, BO PharMingen). Las reacciones con anticuerpos conjugados con biotina posteriormente se incubaron con estreptavidina conjugada con Tri-color (SA10006, Caltag). Las celulas se analizaron en un FACSVantage y se utiliz6 CELLQuest para el analisis de los datos.
Para la tinci6n de la superficie celular, se emplearon anticuerpos marcados contra el marcador B220 de pancelulas B (CO45R) en combinaci6n con anticuerpos que permiten la identificaci6n de las diversas etapas de diferenciaci6n sucesivas en el desarrollo de las celulas B. En la medula 6sea (figura 16A), esto demostr6 que las poblaciones en la etapa progenitora y precursora, pro-y precelulas B c-kit+ B220+ y precelulas B CO43+ B220+, se mantienen, pero desaparecen los linfocitos B220+ mas maduros. La ausencia de una gran poblaci6n de celulas B B220+ es similarmente pronunciada en ratones CΔ y μMT con exones de membrana alterados [16] y se establece en la etapa preB-II con la ausencia de celulas B CO25+ que normalmente expresan un preBCR con una cadena H μ y una cadena L sustituta. La eliminaci6n de la agrupaci6n de genes C conduce a la desaparici6n completa de celulas B inmaduras y maduras que expresan la cadena H y L de Ig, y la tinci6n de la cadena L de IgM, IgO, Igκ de superficie y celulas B maduras CO21/35 positivas (figura 16B) revela su total ausencia.
Ejemplo 12: Inactividad transcripcional a pesar de la redisposician del ADN
La conservaci6n de unos niveles normales de procelulas B en ratones CΔ sugiere que pueden mantenerse acontecimientos de diferenciaci6n tempranos. Para ensayar la implicaci6n del locus de IgH en la redisposici6n del AON, se prepar6 AON de celulas de la medula 6sea y se analiz6 la redisposici6n de O-J y V-O-J mediante PCR. Para la regi6n entre OQ52 y JH, un fragmento de aproximadamente 1200 pb indica la configuraci6n de la lfnea germinal, mientras que las bandas de amplificaci6n de tamano menor son el producto de una recombinaci6n O-JH y VH-O-JH exitosa. En ratones CΔ se identific6 una extensa redisposici6n del AON para la uniones O-J mas tempranas en el desarrollo, asf como para la recombinaci6n de V-O-J (figura 17A). Se predicen unos fragmentos de PCR de aproximadamente 500 pb para la redisposici6n O-J y >300 pb para V-O-J, representando las bandas mas grandes amplificaciones aun presentes de JH distales remanentes despues de la recombinaci6n. Los ratones CΔ producen bandas del intervalo de tamano esperado, que tenfan un patr6n e intensidad similares a los encontrados en ratones normales y ratones μMT analizados en paralelo. Para los analisis transcripcionales se prepar6 ARN a partir de
celulas de la medula 6sea, y una RT-PCR de una sola etapa que emplea ARN procedente de aproximadamente 106 celulas por reacci6n revel6 que se produjeron pocas o ninguna transcripciones de cadena H redispuesta en ratones CΔ (figura 17B). El bajo nivel de transcripci6n remanente puede venir indicado por las bandas debiles en algunas de las reacciones o, como alternativa, esto puede representar el fondo debido a la baja rigurosidad de las reacciones o los oligonucle6tidos utilizados para la amplificaci6n. Sin embargo, la utilizaci6n de ARN de ratones normales, asf como de ratones μMT, produjo bandas de RT-PCR discernibles del intervalo de tamano esperado que establecen una marcada diferencia despues de la redisposici6n de AON de cadena H entre ratones μMT que muestran una transcripci6n de la cadena H totalmente funcional y ratones CΔ con una cadena H transcripcionalmente silenciosa. Los inventores repitieron los analisis de PCR y RT-PCR con aproximadamente 105 y aproximadamente 5 x 105 celulas de medula 6sea CO43+ B220+, respectivamente, clasificadas mediante citometrfa de flujo. Se obtuvieron bandas diferenciadas pero patrones menos diversos en ratones normales y μMT, pero de nuevo los ratones CΔ no produjeron productos de RT-PCR (los datos no se muestran). Una amplificaci6n mediante PCR de lamina B1, un gen expresado de forma ubicua utilizado como control, produjo un fragmento gen6mico de aproximadamente 433 pb y un producto de AONc de aproximadamente 215 pb, identificados en todos los ratones.
El descubrimiento de que los ratones CΔ son transcripcionalmente inactivos concuerda con su falta de anticuerpos sericos.
ELISA
Fueron capturados anticuerpos sericos mediante ELISA [33] sobre placas Falcon (353911, Becton Oickinson) revestidas con 50 μl de anti-IgM 10 μg/ml (especffico de la cadena μ) (Sigma M-8644), anti-IgG (especffico de la cadena γ) (Binding Site AU272), anti-IgA (especffico de la cadena α) (Sigman M-8769) o cadena L κ anti-rat6n (Sigma K-2132). El anticuerpo unido se identific6 utilizando anti-Ig biotinilado (diluci6n 1/500, Amersham RPN 1001)
o anti-κ (diluci6n 1/200, Zymed 04-6640), seguido de una diluci6n 1/200 de peroxidasa de rabano conjugada con estreptavidina (Amersham 1052). Se midi6 la A492 en un Titertek Multiskan MCC/340.
En el ELISA no se encontr6 la presencia de ninguna Ig ni de fracciones individuales de IgM, IgG o IgA en el suero de ratones CΔ (figura 18), mientras que la expresi6n de Ig en ratones μMT parece ser similar a los niveles de expresi6n previamente indicados [12-14]. El defecto en la producci6n de Ig, reenfatizado por la falta de Igκ, demuestra que ningun fragmento de cadena H de anticuerpo ni cadenas L por sf solas estan siendo expresados en ratones CΔ.
La inserci6n dirigida de sitios llxP, 5' y 3' de la agrupaci6n de genes CH, permite la eliminaci6n mediada por Cre de una regi6n de aproximadamente 200 kb que produce una lfnea de rat6n deficiente en Ig. Aunque se logr6 la deleci6n in vitrl con la eficacia esperada mediante la expresi6n transitoria de Cre, la eliminaci6n de genes C in vivl mediante el cruzamiento con ratones que expresan Cre de forma ubicua result6 diffcil. Como resultado, y a pesar de la transmisi6n normal del transgen Cre, pocos animales portan la deleci6n del gen C (vease la tabla 1). Esta falta de eficacia no se observa cuando se eliminan aproximadamente 400 kb del locus de la cadena L de Igλ mediante un cruzamiento con la lfnea de rat6n Cre [15,17 y ENSEMBL Mouse Release 17.30.1 (ensamblaje NCBI 30)] y no esta claro por que se producen diferentes niveles de eficacia en los dos loci de Ig diana. En la primera generaci6n de ratones que portan la deleci6n del gen C (camadas de ratones Cre+ cruzados con ratones μlox 3'Elox), analizados mediante PCR de la cola de AON, a la banda de deleci6n siempre le acompana la presencia de bandas para los acontecimientos de transporte dirigido. Un problema con la eficacia de la recombinaci6n mediada por Cre se ha relacionado con su promotor y se ha demostrado que el promotor inmediato temprano principal del citomegalovirus (CMV) humano, utilizado en los ratones Cre de la invenci6n, es menos eficaz que el promotor de CMV murino equivalente [18]. Tanto la expresi6n ubicua como la expresi6n condicional del gen Cre muestra una variaci6n en la eficacia [19,20] y esto puede explicar por que la deleci6n mediada por Cre del locus del gen C s6lo pudo lograrse con exito en una proporci6n variada de celulas y tejidos que producen un patr6n de mosaico. No obstante, la deleci6n del gen C puede lograrse de forma temprana para asegurar un desarrollo modificado de la lfnea germinal que permita la producci6n mediante cruzamiento de ratones homocig6ticos sin genes C remanentes.
Los experimentos demuestran que la eliminaci6n de todos los genes C silencia el locus de IgH a nivel transcripcional, pero no en la etapa de redisposici6n del AON. Esto impica que la activaci6n del locus se mantiene totalmente y, en efecto, los niveles de celulas B tempranas en la etapa de diferenciaci6n de pro-a precelulas B, ckit+ B220+ y CO43+ B220+, son comparables a los de los ratones normales. No obstante, con la falta de celulas CO43+ B220+ (vease la figura 16), se logra un bloqueo completo en el desarrollo en la etapa de preB-II cuando las cadenas H de Ig redispuestas deben transcribirse y expresarse. La tinci6n de poblaciones de celulas B de medula 6sea y bazo con anticuerpos especfficos para marcadores de diferenciaci6n revela un patr6n de desarrollo muy similar para ratones μMT y CΔ que tambien se confirma a nivel de AON, en el que ambas razas muestran una extensa redisposici6n (referencia 14 y figura 17). Sin embargo, con respecto a la expresi6n de Ig existen diferencias fundamentales entre las razas CΔ y μMT que no son evidentes utilizando un analisis de citometrfa de flujo del desarrollo de celulas B, en el que las poblaciones pequenas de celulas B madura pueden escapar a la detecci6n. El hecho de que estas celulas B maduras esten presentes en la medula 6sea de ratones μMT, pero no en ratones CΔ, se hace evidente en reacciones de RT-PCR. En este caso, los ratones CΔ parecen no producir transcripciones de IgH, que estan presentes en abundancia en celulas de la medula 6sea de ratones μMT. Para excluir cualquier
accidente, se produjo AONc para la identificaci6n de las transcripciones de Ig con cebadores JH internos. Esto evit6 la amplificaci6n selectiva del ARN poliadenilado, un producto de cadena H poco probable en ratones CΔ que carecen de la regi6n 3' no traducida fundamental para el procesamiento y la expresi6n de ARN. La expresi6n de Ig puede identificarse en el suero de ratones μMT, pero no en ratones CΔ, que muestran una falta completa de Ig en ELISA. Esto estableci6 que, con la eliminaci6n de todos los genes C, el locus de IgH se hace completamente inoperativo a nivel transcripcional despues de completar la redisposici6n del AON. Oe manera inesperada, los inventores han identificado una cantidad significativa de IgG en el suero de los animales μMT a niveles que no se habfan observado en ratones μMT del entorno C57BL/6 [14]. Una raz6n puede ser que los ratones μMT mantenidos como una colonia de crfa durante mucho tiempo han perdido el entorno B57BL/6, y asf permiten la expresi6n de IgG [12,13]. Sin embargo, los niveles intermedios de IgA de los ratones μMT son bastante similares a los niveles indicados para μMT en el entorno C57BL/6, y el analisis de los ratones individuales mostr6 que no pueden alcanzarse los niveles de tipo salvaje del entorno BALB/c, al igual que en μMT [12,13] (los datos no se muestran).
Con respecto a otras estrategias de silenciamiento de la cadena H, la eliminaci6n de agrupaciones de segmentos de genes, tales como todos los genes V, O, J o C, parece garantizar la insuficiendia del locus. Esto se ha demostrado en ratones con deleci6n de JH, en los que tambien se ha indicado un bloqueo en el desarrollo de celulas B en la etapa de precursores de CO43+ [9,21], y se descubri6 la falta de transcripciones de μ desde el alelo que porta la deleci6n [10]. Un locus de la cadena H disfuncional silencia la expresi6n de la cadena L, y aunque el locus de Igκ puede redisponerse al mismo tiempo, o incluso antes que el locus de IgH, s6lo se expresa una cadena L productivamente redispuesta tras la producci6n de la cadena H ([22] y [9] y las referencias citadas allf). En ratones con deleci6n de JH, la redisposici6n de Cκ en poblaciones de celulas clasificadas B220+ CO43+ es bastante similar a los niveles del tipo salvaje, mientras que s6lo puede detectarse un nivel bajo de transcripciones de la lfnea germinal en un analisis de la transferencia Northern [9]. Por el contrario, la eliminaci6n de Cμ, el primer gen C expresado y considerado fundamental para dirigir el desarrollo de celulas B, no produce ratones silenciosos en cadena H [1]. Una probable raz6n para ello es que la funci6n de un gen C puede ser reemplazada por otro. En ratones con delecci6n de Cμ, esto se logra con Cδ, y en la sustituci6n de Cγ2a, un gen C quizas menos importante mas cadena abajo, otros Cγ asumen la responsabilidad [4]. Oe manera similar, la eliminaci6n de Cδ fue bien tolerada y quizas compensada por un aumento en la expresi6n de Igμ [2]. La suposici6n de que la maduraci6n de celulas B despues de la redisposici6n del AON puede depender de manera crucial de la expresi6n de Igμ surgi6 de modelos de ratones transgenicos, en los que en las estrategias iniciales, Cμ era el unico gen C en un locus de IgH introducido en la configuraci6n de la lfnea germinal ([23] y las referencias citadas allf). Sin embargo, esto no implica que otros genes C, por ejemplo Cγ, no puedan iniciar procesos del desarrollo similares, que podrfan ser desentranados cuando se produzcan ratones con deleciones de Cμ y Cδ. La sugerencia de que quizas un sistema inmunologico mas primitivo
o evolutivamente antiguo pueda estar funcionando surge de la observaci6n de que la IgA se expresa en ratones μMT silenciados [14], y de que los anticuerpos con s6lo cadenas H de camelidos no parece que sobrepasen la etapa de celulas precursoras de Igμ [24,25]. Esto puede ensayarse en ratones CΔ mediante la inserci6n de genes dirigida mediada por Cre-llxP.
Referencias bibliogrlficas
[1] C. Lutz, et al., IgO can largely substitute for loss of IgM function in B cells, Nature, 393 (1998), 797-801.
[2] L. Nitschke, M.H. Kosco, G. Kohler, M.C. Lamers, Immunoglobulin O-deficient mice can mount normal immune responses to thymus-independent and-dependent antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 1887-1891.
[3] G. Achatz, L. Nitschke, M.C. Lamers, Effect of transmembrane and cytoplasmic domains of IgE on the IgE response, Science, 276 (1997), 409-411.
[4] G. Pluschke et al., Generation of chimeric monoclonal antibodies from mice that carry human immunoglobulin Cγ1 heavy or Cκ light chain gene segments, Immunol. Methods, 215 (1998), 27-37.
[5] Y.R. Zou, W. MOller, H. Gu, K. Rajewsky, Cre-loxP-mediated gene replacement: a mouse strain producing humanized antibodies, Current Biology, 4 (1994), 1099-1103.
[6] M. Serwe, F. Sablitzky, V(O)J recombination in B cells is impaired but not blocked by targeted deletion of the immunoglobulin heavy chain intron enhancer, EMBO J., 12 (1993), 2321-2227.
[7] J. Chen, F. Young, A. Bottaro, V. Stewart, R.K. Smith, F.W. Alt, Mutations of the intronic IgH enhancer and its flanking sequences differentially affect accessibility of the JH locus, EMBO J., 12 (1993), 4635-4645.
[8] M. Cogne et al., A class switch control region at the 3' end of the immunoglobulin heavy chain locus, Cell, 77 (1994), 737-747.
[9] J. Chen et al., Immunoglobulin gene rearrangement in B cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus, Int. Immunol., 5 (1993), 647-656.
[10] H. Gu, Y.R. Zou, K. Rajewsky, Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting, Cell, 73 (1993), 1155-1164.
[11] O. Kitamura, J. Roes, R. Kuhn, K. Rajewsky, A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin μ chain gene, Nature, 350 (1991), 423-426.
[12] Z. Orinska et al., Novel B cell population producing functional IgG in the absence of membrane IgM expression, Eur. J. Immunol., 32 (2002), 3472-3480.
[13] M. Hasan, B. Polic, M. Bralic, S. Jonjic, K. Rajewsky, Incomplete block of B cell development and immunoglobulin production in mice carrying the μMT mutation on the BALB/c background, Eur. J. Immunol., 32 (2002), 3463-3471.
[14] A.J. Macpherson et al., IgA production without μ or δ chain expression in developing B cells, Nat. Immunol., 2 (2001), 625-631.
[15] X. Zou, T.A. Piper, J.A. Smith, N.O. Allen, J. Xian, M. BrOggemann, Block in development at the pre-B-II to immature B cell stage in mice without Igκ and Igλ light chain, J. Immunol., 170 (2003), 1354-1361.
[16] T. Nikolic, G.M. Oingjan, P.J. Leenen, R.W. Hendriks, A subfraction of B220+ cells in murine bone marrow and spleen does not belong to the B cell lineage but has dendritic cell characteristics, Eur. J. Immunol., 32 (2002), 686
692.
[17] M. Clamp et al., Ensembl 2002: accommodating comparative genomics, Nucleic Acids Res., 31 (2003), 38-42.
[18] C.E. Appleby et al., A novel combination of promoter and enhancers increases transgene expression in vascular smooth muscle cells in vitro and coronary arteries in vivo after adenovirus-mediated gene transfer, Gene Ther., 10 (2003), 1616-1622.
[19] K. Sakai et al., Stage-and tissue-specific expression of a Col2a1-Cre fusion gene in transgenic mice, Matrix Biol, 19 (2001), 761-767.
[20] H. Guo et al., Specificity and efficiency of Cre-mediated recombination in Emx1-Cre knock-in mice, Biochem. Biophys. Res. Commun., 273 (2000), 661-665.
[21] A. Jakobovits et al., Analysis of homozygous mutant chimeric mice: deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks B-cell development and antibody production, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 2551-2555.
- [22]
- T.I. Novobrantseva, V.M. Martin, R. Pelanda, W. MOller, K. Rajewsky, A. Ehlich, Rearrangement and expression of immunoglobulin light chain genes can precede heavy chain expression during normal B cell development in mice,
- J.
- Exp. Med., 189 (1999), 75-88.
[23] M. BrOggemann, Human monoclonal antibodies from translocus mice, en Mllecular Billlgy lf B-cells (2004),
F.W. Alt, T. Honjo, M.S. Neuerger (eds.), pp. 547-561.
[24] V.K. Nguyen, A. Oesmyter, S. Muyldermans, Functional Heavy-chain Antibodies in Camelidae, Adv. Immunol., 79 (2001), 261-269.
[25] V.K. Nguyen, X. Zou, M. Lauwereyes, L. Brys, M. BrOggemann, S. Muyldermans, Heavy-chain only antibodies derived from dromedary are secreted and displayed by mouse B-cells, Immunology, 109 (2003), 93-101.
[26] B. Sauer, N. Henderson, Targeted insertion of exogenous ONA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase, New Biol., 2 (1990), 441-449.
[27] X. Zou, C. Ayling, J. Xian, T.A. Piper, P.J. Barker, M. BrOggermann, Truncation of the μ heavy chain alters BCR signalling and allows recruitment of CO5+ B cells, Int. Immunol., 13 (2001), 1489-1499.
[28] S. Pettersson, G.P. Cook, M. BrOggemann, G.T. Williams, M.S. Neuberger, A second B cell-specific enhancer 3' of the immunoglobulin heavy-chain locus, Nature, 344 (1990), 165-168.
[29] K.L. Tucker et al., Germ-line passage is required for establishment of methylation and expression patterns of imprinted but not of nonimprinted genes, Genes Oev., 10 (1996), 1008-1020.
[30] X. Zou, J. Xian, A.V. Popov, I.R. Rosewell, M. MOller, M. BrOggemann, Subtle differences in antibody responses and hypermutation of λ light chains in mice with a disrupted κ constant region, Eur. J. Immunol., 25 (1995), 21542162.
[31] J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[32] B. Hogan, R. Beddington, F. Constatini, E. Lacy, Manipulating the mouse embryo, A Laboratory Manual (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[33] A.V. Popov, X. Zou, J. Xian, I.C. Nicholson, M. BrOggemann, A human immunoglobulin λ locus is similarly well expressed in mice and humans, J. Exp. Med., 189 (1999), 1611-1619.
LISTAOO OE SECUENCIAS
<110> Babraham Institute
<120> Celulas y mamfferos no humanos modificados geneticamente
<130> WPP286912
<150> documento GB 0304374.2
<151>
<160> 21
<170> PatentIn versi6n 3.1
<210> 1
<211> 64
<212> AON
<213> Artificial
<400> 1
<210> 2
<211> 28
<212> AON
<213> Artificial
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> AON
<213> Artificial
<400> 3 <210> 4
<211> 18
<212> AON
<213> Artificial
<400> 4
<210>5
<211> 27
<212> AON
<213> Artificial
<400> 5
<210> 6
<211> 23
<212> AON
<213> Artificial
<400> 6
<210> 7
<211> 23
<212> AON
<213> Artificial
<400> 7
<210> 8
<211> 22
<212> AON
<213> Artificial <400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> AON
<213> Artificial
<400> 9
<211> 23
<212> AON
<213> Artificial
<210> 11
<211> 28
<212> AON 20 <213> Artificial
<400> 11
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<210> 14
<211> 20
<212> AON
<213> Artificial
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Claims (60)
- REIvINDICACIoNES1.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos.
- 2.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes todas las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable y del segmento O y J de IgH end6genas.
- 3.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas (C de IgH).
- 4.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque todas las secuencias de genes de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas estan ausentes o parcialmente ausentes del genoma.
- 5.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque puede obtenerse o se obtiene mediante la deleci6n dirigida de todas o fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas.
- 6.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque puede obtenerse o se obtiene mediante una recombinaci6n Cre-llxP.
- 7.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque al menos parte de al menos una secuencia potenciadora del gen C de IgH esta presente.
- 8.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena esta presente dentro del genoma.
- 9.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque tiene una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena abajo o dentro del ultimo gen del locus C de IgH.
- 10.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicaci6n 9, que se caracteriza porque tiene otra secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen del locus C de IgH.
- 11.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque uno o mas marcadores seleccionables estan presentes dentro del genoma.
- 12.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicaci6n 9, que se caracteriza porque al menos un marcador seleccionable esta presente cadena arriba o cadena abajo de la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena.
- 13.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicaci6n 10, que se caracteriza porque al menos un marcador seleccionable esta integrado dentro del genoma cadena arriba y/o cadena abajo de al menos una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena.
- 14.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que se caracteriza porque el marcador o marcadores seleccionables son uno o mas de los marcadores seleccionables seleccionados del grupo que comprende un gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la puromicina, y un gen de resistencia a la higromicina.
- 15.-Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que se caracteriza porque la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena es un sitio llxP.
- 16.-Un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque es un rat6n.
- 17.-Una celula no humana geneticamente modificada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que se caracteriza porque es una celula de rat6n.
- 18.-Un rat6n geneticamente modificado segun la reivindicaci6n 16, o una celula de rat6n geneticamente modificadasegun la reivindicaci6n 17, que se caracteriza porque los ocho genes C de IgH end6genos, μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α estan ausentes o parcialmente ausentes.
- 19.-Una celula no humana geneticamente modificada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o las reivindicaciones 17 o 18, que se caracteriza porque es una celula precursora embrionaria.
- 20.-Un metodo para producir una celula no humana geneticamente modificada, que comprende:
- (a)
- (i) transfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba
- o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n, y
- (ii)
- transfectar una celula producida en (a) (i) con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido un marcador seleccionable y una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; o
- (b)
- (i) transfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo
- o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n, y
- (ii)
- transfectar una celula producida en (b) (i) con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcci6n de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; o
- (c)
- cotransfectar una celula no humana con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena arriba
- o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y con una construcci6n de transporte dirigido para la integraci6n cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo cada una de dichas construcciones de transporte dirigido una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y teniendo cada una un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador o marcadores seleccionables estan presentes, y evaluar dicha celula para la integraci6n de la secuencia de recombinaci6n; y opcionalmente,
- (d)
- proporcionar a una celula obtenida en (a) (ii), (b) (ii) o (c) una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, y opcionalmente evaluar para acontecimientos de deleci6n.
- 21.-Un metodo segun la reivindicaci6n 20, que se caracteriza porque la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena es un sitio llxP.
- 22.-Un metodo segun la reivindicaci6n 21, que se caracteriza porque, en la etapa opcional (d), la recombinasa es una recombinasa Cre.
- 23.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que se caracteriza porque la recombinasa se proporciona mediante un vector de expresi6n.
- 24.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, que se caracteriza porque la celula no humana geneticamente modificada es una celula de rat6n.
- 25.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que se caracteriza porque la celula no humana geneticamente modificada es una celula precursora embrionaria.
- 26.-El uso de una celula precursora embrionaria de la reivindicaci6n 19 para la producci6n de un mamffero no humano geneticamente modificado.
- 27.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque una celula precursora embrionaria de la reivindicaci6n 19 se introduce en un blastocito hospedante y se desarrolla en un animal quimerico.
- 28.-Un metodo segun la reivindicaci6n 27, que se caracteriza por:(a) introducir una celula precursora embrionaria de mamffero no humano segun la reivindicaci6n 19 en un blastocito de mamffero no humano compatible; y(b) transplantar el blastocito obtenido en (a) a una madre de acogida que es un mamffero no humano compatible para obtener un mamffero no humano quimerico, y opcionalmente seleccionar el marcador o marcadores seleccionables y/o la secuencia o secuencias de recombinaci6n especffica de sitio no end6genas y/o la deleci6n de fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas.
- 29.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicaci6n 27 o 28 para obtener un mamffero no humano quimerico, y cruzar dicho mamffero no humano quimerico para obtener una progenie heterocig6tica.
- 30.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicaci6n 29 para obtener una progenie heterocig6tica, y cruzar entre sf dicha progenia heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica.
- 31.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicaci6n 30 para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, con un mamffero no humano geneticamente modificado compatible homocig6tico para la integraci6n de una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, para obtener una progenie heterocig6tica, y opcionalmente cruzar entre sf la progenie heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica para ambas integraciones.
- 32.-Un metodo segun la reivindicaci6n 31, que se caracteriza porque comprende ademas cruzar la progenie homocig6tica para ambas integraciones con un mamffero no humano compatible capaz de expresar una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena para obtener una progenie; y opcionalmente seleccionar la progenie obtenida para la deleci6n del gen C de IgH.
- 33.-Un metodo segun la reivindicaci6n 31 o la reivindicaci6n 32, que se caracteriza porque la secuencia o secuencias de recombinaci6n especffica de sitio no end6genas son sitios llxP.
- 34.-Un metodo segun la reivindicaci6n 33, que se caracteriza porque la recombinasa es una recombinasa Cre.
- 35.-Un metodo segun la reivindicaci6n 33, que se caracteriza porque comprende ademas cruzar la progenie heterocig6tica u homocig6tica para llxP en ambos loci con un mamffero no humano compatible capaz de expresar la recombinasa Cre para obtener una progenie de mamfferos no humanos que no comprenda una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de Ig end6genos en uno o ambos alelos.
- 36.-Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, que se caracteriza porque las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos estan presentes en la progenie.
- 37.-Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, que se caracteriza porque todas las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable y del segmento O y J de IgH end6genas estan presentes en la progenie.
- 38.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 16, o la reivindicaci6n 18, que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 16, o la reivindicaci6n 18, con un mamffero no humano compatible que codifica y es capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, para obtener una progenie heterocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos, y opcionalmente cruzar entre sf la progenie heterocig6tica para producir una progenie homocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos.
- 39.-Un metodo para producir una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza porque comprende la introducci6n de uno o mas genes ex6genos en una celula de mamffero no humano segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 15, o las reivindicaciones 17 o 18, que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos.
- 40.-Un metodo segun la reivindicaci6n 39, que se caracteriza porque la celula de mamffero no humana es una celula precursora embrionaria.
- 41.-Un metodo segun la reivindicaci6n 40, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos seintroducen mediante transfecci6n.
- 42.-Un metodo segun la reivindicaci6n 39, que se caracteriza porque la celula de mamffero no humana es un oocito (celula huevo).
- 43.-Un metodo segun la reivindicaci6n 42, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se introducen mediante microinyecci6n de AON.
- 44.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en el genoma de la celula o del mamffero no humano.
- 45.-Un metodo segun la reivindicaci6n 44, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena.
- 46.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano obtenido de este modo con un mamffero transgenico no humano que tiene uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserci6n de dicho uno o mas genes ex6genos.
- 47.-Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sf misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la regi6n constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes todas las secuencias de acidos nucleicos de la regi6n variable, los segmentos O y J de IgH end6genas, y cruzar dicho mamffero no humano obtenido de este modo con un mamffero transgenico no humano que tiene uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena, para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserci6n de dicho uno o mas genes ex6genos.
- 48.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, que se caracteriza porque la secuencia de recombinaci6n especffica de sitio no end6gena es una secuencia llxP, y la inserci6n es mediante integraci6n de Cre-llxP.
- 49.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48, que se caracteriza porque el mamffero no humano geneticamente modificado es un rat6n.
- 50.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49, que se caracteriza porque el gen o genes ex6genos son un gen de IgH o genes de IgH.
- 51.-Un metodo segun la reivindicaci6n 50, que se caracteriza porque el gen o genes de IgH son un gen C de IgH o genes C de IgH.
- 52.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 51, que se caracteriza porque el gen o genes ex6genos son un gen humano o genes humanos.
- 53.-Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 52, que se caracteriza porque los genes ex6genos son un locus de cadena pesada de Ig humano que tiene regiones V, O, J y/o C.
- 54.-Un metodo segun la reivindicaci6n 53, en el que las regiones V, O, J y/o C del locus de cadena pesada de Ig humano estan en la configuraci6n de la lfnea germinal.
- 55.-Un metodo segun la reivindicaci6n 53, en el que las regiones V, O, J y/o C del locus de cadena pesada de Ig humano estan productivamente dispuestas.
- 56.-Un metodo para la producci6n de inmunoglobulinas ex6genas que comprende un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 55.
- 57.-Un metodo para la producci6n de inmunoglobulinas humanas que comprende un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 55.
- 58.-Un metodo segun la reivindicaci6n 56 o 57, en el que el mamffero no humano es un roedor.
- 59.-Un metodo segun la reivindicaci6n 56 o 57, en el que el mamffero no humano es un rat6n.
- 60.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 56 o 57, en el que la celula no humana es una celula de roedor. 61.-Un metodo segun la reivindicaci6n 56 o 57, en el que la celula no humana es una celula de rat6n. 62.-Un metodo para la producci6n de un medicamento que comprende un metodo segun una cualquiera de lasreivindicaciones 56 a 61.
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| US20100138946A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-06-03 | Origen Therapeutics | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus |
| EP2187732A4 (en) * | 2007-08-14 | 2012-11-07 | Origen Therapeutics Inc | TRANSGENIC CHICKEN WITH INACTIVED ENDOGENIC GENLOCUS |
| AU2009298458B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-10-08 | Ablexis, Llc | Non-human mammals for the production of chimeric antibodies |
| RU2011129459A (ru) * | 2008-12-18 | 2013-01-27 | Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам | Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение |
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| IL251010B2 (en) * | 2014-10-22 | 2024-01-01 | Crescendo Biologics Ltd | transgenic mice |
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| US10813346B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-10-27 | Trianni, Inc. | Enhanced immunoglobulin diversity |
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Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| SG48759A1 (en) | 1990-01-12 | 2002-07-23 | Abgenix Inc | Generation of xenogenic antibodies |
| US5625126A (en) * | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| DE4228162C1 (de) | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
| US6130364A (en) * | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
| JPH1023677A (ja) * | 1996-07-03 | 1998-01-23 | Uniden Corp | 無接点充電装置、充電器、コードレス機器および無接点充電器 |
| GB9711167D0 (en) * | 1997-05-31 | 1997-07-23 | Babraham The Inst | Telomere-associated chromosome fragmentation |
| GB2398784B (en) * | 2003-02-26 | 2005-07-27 | Babraham Inst | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
-
2003
- 2003-02-26 GB GB0304374A patent/GB2398784B/en not_active Expired - Lifetime
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2004
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