JP2020508639A - Vhh含有重鎖抗体およびその製造 - Google Patents
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Abstract
Description
a)ラクダ科VHH領域、
b)ラクダ科D領域、
c)ラクダ科J領域、
d)CH1ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
ラクダ科VHH領域、ラクダ科D領域およびラクダ科J領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチドに関する。
a)IgMのCH2、CH3およびCH4ドメイン、ならびに/または
b)IgGのヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメイン
をコードする要素を含む。
a)IgMのCH2、CH3およびCH4ドメイン、ならびに
b)IgGのヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメイン
をコードする要素を含む。
a)IgMのCH2、CH3およびCH4ドメイン、ならびに
b)IgGのヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメイン
をコードする要素を含み、重鎖領域はIgD領域を欠いている。
さらに、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの合成VHH要素を含み得る。
− ラクダ科動物要素の特殊な特性を有するラクダ科動物由来重鎖のみの抗体、例えば、高溶解性、高安定性および機能的タンパク質凹部に近づくことができる広範なCDR領域を生成する、
− 免疫系の天然の再構成系を利用する、
− 特に、IgM選択、体細胞高頻度突然変異および免疫系のIgMからIgGへのクラススイッチ組換えを利用する、
− トランスジェニック哺乳動物、特に内因性標的抗原を欠く哺乳動物におけるVHH含有重鎖抗体を生成する、
− ラマ由来IgH座の部位特異的改善。
a)VHH領域、
b)D領域、
c)J領域、
d)機能的CH1ドメインのない定常重鎖領域、
VHH領域、J領域およびD領域は再配列されない。
a)ラクダ類のVHH領域、
b)D領域、
c)J領域、
d)機能的なCH1ドメインのない定常重鎖領域、
ラクダ類のVHH領域、J領域およびD領域は再配列されない。
a)ラクダ科VHH領域、
b)ラクダ科J領域、
c)ラクダ科D領域、
d)機能的なCH1ドメインのないラクダ科定常重鎖領域、
ラクダ科VHH領域、ラクダ科J領域およびラクダ科D領域は再配列されない。
ラマ・グラマゲノムBACライブラリーのクローニング
ラマ・グラマIgH座をクローニングするために、ラマの肝臓からゲノムDNAを単離し、HindIIIで消化し、平均サイズ150kbのDNA断片を得た。断片をBACベクターpCC1(Epicentre)にクローニングし、大腸菌DH10B細胞にエレクトロポレーションしてゲノムライブラリーを得た。可変ドメインおよび定常ドメインに特異的なプローブを用いて、挿入サイズが90〜220kbの17のBACを単離し、サザンブロット分析により検証した。個々のクローンのサイズを、NotI消化BACのパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて測定した。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変および/または定数セグメントを有する2つの重複BAC(V03およびF07)を、5kb断片に剪断し、Sanger技術により配列決定した。プライマー歩行によって隙間を埋め、Lasergeneソフトウェアを用いて完全な配列を組み立てた。
マウスにおける重鎖のみの抗体の発現を促進するために、BAC V03を、BAC組換えを用いて遺伝子的に改変した。マウス座制御領域(LCR、αエンハンサー)の領域HS3bおよびHS4を、BAC V03の3’末端に挿入した。このために、HS3bおよびHS4を、マウスLCRの必須部分をコードするプラスミド(Michel Cogne,Limoges,Franceにより提供される)(Pinaud et al.,(2001)「Localization of the 3’IgH locus elements that effect long−distance regulation of class switch recombination」Immunity 15:187−199)から、BAC挿入部位に相同な50bpオーバーハングを有するPCRプライマーを使用して増幅した。増幅された構築物のBAC V03への挿入を、Red(登録商標)/ET組換え技術(GeneBridges)を用いて行った。
PhasePrep BAC DNA Kit(Sigma−Aldrich)を用いてラマ・グラマIgH導入遺伝子TE−01を精製した後、フェノール/クロロホルム抽出およびNotIによる線状化を行った。Nagy et al.(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2003)により記載されたように、C57BL/6J x CBAマウスの受精卵母細胞に前核注入により線状構築物を注入した。創始者マウスを、Ig欠損JH T−マウス(Klaus Rajewskyにより供給される)Guら「Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre−loxP−mediated gene targeting」、Cell 73(6):1155−1164(1993)に戻し交配した。
トランスジェニックマウスを、Platinum blue PCR super mix(Invitrogen)を用いて耳クリップDNAからPCRにより同定した。5’および3’導入遺伝子端部に特異的なPCRプライマーの対を用いて、30x(95℃20秒、60℃30秒、72℃60秒)、72℃10分の条件下で生殖細胞系列伝播を確認した(図2)。
Ig欠損JH Tマウスの内因性IgH座のノックアウト(J要素およびμエンハンサーの欠失)を、同じPCR条件を用いて検証した。IgH座の変異領域に特異的なプライマー対は、Stock No:002438(The Jackson Laboratory)のテクニカルサポートプロトコルに記載されている。
導入遺伝子TE−01によるB細胞発生の救済を確認するために、CD3(Biolegend、Cat#100312)およびCD19(eBioscience、Cat#110193−85)(図3)に特異的な蛍光色素結合抗体を用いて、TE−01トランスジェニック、JHTおよびC57BL/6Jマウスの血中からのリンパ球染色を実施した。FACS CantoIIフローサイトメーターおよびFlowJoソフトウェア(Becton Dickinson、Pont de Claix、フランス)を、分析に使用した。
機能性IgMおよびIgG重鎖抗体を産生するTE−01トランスジェニックマウスの能力を検証するために、TE−01トランスジェニックマウスを、精製タンパク質抗原で免疫化した。マウスは、3週間間隔で5回の免疫化を受けた。最終追加免疫の3日後、マウスを絶命させ、脾臓、リンパ節および骨髄から細胞を単離した。innuPREP RNA Mini Kit(analytik Jena)を用いてRNAを精製し、逆転写酵素(Gibco)およびランダムヘキサマープライマー(GE Healthcare)を用いてcDNAに転写した。
抗原特異的重鎖IgMおよびIgG応答の誘導を確認するために、VHHコード領域をPCR増幅し、ウサギIgGのヒンジ、CH2およびCH3ドメインをコードするカセットの上流のpCSE2.5発現ベクターにクローン化した(Schirrmannら、「Transient Production of scFv−Fc Fusion Proteins in Mammalian Cells」、Antibody Engineering Vol.2中(編、R.Kontermann & S.Duebe)387−398(Springer−Verlag、Berlin Heidelberg;2010))。個々のクローンを配列決定し、HEK−6E細胞に一時的にトランスフェクトした(Zhangら、「Production of chimeric heavy−chain antibodies」、Methods Mol Biol 525,323−336(2009))。トランスフェクションの6日後に細胞上清を回収した。細胞上清中のタンパク質をSDS−PAGEおよびクーマシー染色により分析した(図8)。その結果、大部分のIgMクローニングからの重鎖抗体の効率的な製造が明らかになった。一般に、VHH含有クローンは、VH含有クローンよりも高い発現収率を示した。大部分のIgGクローニングについても効率的な製造が観察された。細胞上清を、ELISAにより抗原特異的重鎖抗体について分析した。ウェルを、免疫化に用いた抗原または無関係な対照タンパク質で被覆した。ウェルをアルブミンで遮断し、次いで、Nb−ウサギIgG重鎖抗体(PBSで1:20に希釈)を含有する個々のHEK−6E細胞上清とインキュベートした。ウェルを洗浄し、結合したNb−ウサギIgG重鎖抗体を、ペルオキシダーゼ結合二次抗体(ロバ抗ウサギIgG、Dianova)およびTMBを基質として検出した(図9)。CD38特定Nb−ウサギIgG重鎖抗体およびARTC2特定Nb−ウサギIgG重鎖抗体を、対照として用いた。結果は、TE−01トランスジェニックマウスの免疫化が、広範な体細胞高頻度突然変異を有するB細胞クローン由来の別個の抗原特異的VHH含有重鎖抗体を誘導することを明らかにする(図10、配列10−01〜10−22;配列番号59〜80)。
図11に模式的に示すように、BAC TE−01でBAC組換えを行って、TE−02およびTE−03ラマIgHトランスジェニックマウスを作製した。マウス座制御領域の要素HS3aおよびHS1,2(パート1;P1)を、BAC構築物TE−01中のHS3b−HS4−カセット(パート2;P2)の上流に挿入した。このために、アンピシリン選択カセット、次いで要素HS3aおよびHS1,2を含むDNAカセットを使用した。HS3aおよびHS1,2の配列を、マウスLCRの必須部分をコードするプラスミドから得た(Pinaudら、(2001)「Localization of the 3’ IgH locus elements that effect long−distance regulation of class switch recombination」、Immunity 15:187−199)。選択カセットは、2つのloxP突然変異体lox71およびlox66に隣接した。構築物全体に、BAC TE−01で修飾される領域に相同な、90bpの5’相同性アームおよび86bpの3’相同性アームを装備した。平滑末端SnaBI制限切断部位を、両方の相同性アームの外側末端に置いた。構築物を合成し、ベクターpUC57にクローン化した。DNAカセットを、SnaBI制限消化により単離した。組換えを、大腸菌株SW106を用いて行った。相同組換えに続いて、HS3a−HS1,2カセットの上流のアンピシリン選択カセットを欠失させるためのCre/lox組換えを行った。
導入遺伝子TE02のラマ・グラマIgM座のCH3−CH4−TM1−TM2領域を、マウス配列によって置き換えた。このために、CH3ドメインから膜貫通ドメイン2(TM2)までのマウスIgM座のゲノム配列に、Lama IgM座上の対応する配列と一致する45bpの相同領域を隣接させた。2つのloxP変異体(lox71およびlox66)が隣接するアンピシリン選択カセットを、エクソンCH4とTM1との間のイントロン配列に挿入した。各45bp相同領域の外端は、SnaBI制限切断部位をコードした。構築物を合成し、ベクターpUC57にクローン化した。DNAカセットを、SnaBI制限消化により平滑末端で単離した。組換えを、大腸菌株SW106を用いて行った。相同組換えに続いて、CH4エクソンとTM1エクソンの間のイントロン配列中のアンピシリン選択カセットを欠失させるためのCre/lox組換えを行った。
実施形態1:哺乳動物におけるVHH含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
a)ラクダ科VHH領域、
b)ラクダ科D領域、
c)ラクダ科J領域、
d)CH1ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
ラクダ科VHH領域、ラクダ科D領域およびラクダ科J領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチド。
a)IgGのヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメイン、ならびに/または
b)IgMのCH2、CH3およびCH4ドメイン
をコードする要素を含む、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
Claims (15)
- 哺乳動物におけるVHH含有重鎖抗体の産生のための単離されたポリヌクレオチドであって、以下:
a)ラクダ科VHH領域、
b)ラクダ科D領域、
c)ラクダ科J領域、
d)機能的なCH4ドメインをもつIgM定常重鎖領域、
e)CH1ドメインのないラクダ科定常重鎖領域
を含み、
前記ラクダ科VHH領域、前記ラクダ科D領域および前記ラクダ科J領域は再配列されない、
前記単離されたポリヌクレオチド。 - 前記ラクダ科D領域が少なくとも2つのラクダ科D要素を含み、前記ラクダ科D要素が、好ましくは配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ラクダ科J領域が少なくとも2つのラクダ科J要素を含み、前記ラクダ科J要素が、好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号7からなる群から選択される、請求項1または2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記定常重鎖領域が、
a)IgMのCH2、CH3およびCH4ドメイン、ならびに
b)IgGのヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメイン、
をコードする要素を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 前記定常重鎖領域が、δ領域および関連するスイッチ領域を含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、前記VHH含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物に特異的な少なくとも1つのエンハンサーを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ラクダ科VHH領域が、少なくとも1つのラクダ科VHH要素を含み、前記ラクダ科VHH要素が、好ましくは、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号19および配列番号20からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 膜近位のCHドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンが、VHH含有重鎖抗体が発現される哺乳動物または関連する哺乳動物の対応するドメインをコードするエクソンによって交換される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ラクダ科動物がLama種、好ましくはラマ・グラマである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号30の配列またはそのフラグメントによってコードされる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ベクターが好ましくは細菌人工染色体である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項11に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記ポリヌクレオチドが異種であり、好ましくは前記哺乳動物がマウスまたはラットである、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記哺乳動物が、膜結合および/または可溶性バージョンとしてVHH含有重鎖抗体を発現する、請求項12に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物におけるVHH含有重鎖抗体の製造のための方法であって、該哺乳動物において異種VHH含有重鎖抗体を発現する工程を含み、前記異種VHH含有重鎖抗体を、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの再配列によって形成されるVHH−D−J配列によってコードする、前記方法。
- 哺乳動物由来のVHH含有重鎖抗体をクローニングする方法であって、前記異種VHH含有重鎖抗体を、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの再配列によって形成されるVHH−D−J配列によってコードする、前記方法。
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