DE69633238T2

DE69633238T2 - Methode zur erhöhung der enzymdiversität

Info

Publication number: DE69633238T2
Application number: DE69633238T
Authority: DE
Inventors: Jacob N Wohlstadter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: US5922584A; CA2223716C; AU6167496A; EP1437414A2; US6242236B1; CA2223716A1; JPH11513884A; EP0839208A4; DK0839208T3; DE69633238D1; JP4102435B2; WO1996040960A1; ZA964889B; ES2227594T3; EP0839208B1; EP1437414A3; AU719670B2; ATE274594T1; EP0839208A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im weiteren Sinne auf Verfahren zur Schaffung neuer Katalysatoren, insbesondere Enzyme oder Biokatalysatoren mit hoher Umsatzrate, unter Verwendung von nicht-menschlichen Tieren mit geänderter Keimbahnsequenz. Genauer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren für das Fördern einer schnellen Evolution oder Diversifizierung der Spezifitätsbereiche eines Enzyms. Das Verfahren kann verwendet werden, um Antikörper mit katalytischer Aktivität herzustellen, indem eine funktionelle katalytische Einheit oder ein wesentlicher Teil davon in einen Antikörpergen-Genort einer Keimbahn kodiert wird. Und noch genauer bezieht sich die Erfindung auf die Platzierung und Segmentierung der enzymatischen Sequenzen in den Antikörpergen-Loci.
Hintergrund der Erfindung
Über das letzte Jahrzehnt wurde die Forschung der Produktion nützlicher Antikörper mit katalytischer Aktivität gewidmet. Solche Antikörper sind allgemein bekannter als katalytische Antikörper oder Abzyme. Katalytische Antikörper mit erhöhen Umsatzraten im Vergleich zu nicht katalysierten Reaktionsraten wurden von einer Reihe an Forschergruppen berichtet. (Siehe Suzuki et al., "Recent advances in abzyme studies", 115(4), Journal of Biochemistry, 623–8 (1994); Titmas et al., "Aspects of antibody catalyzed primary amide hydrolysis", 47(2–3), Applied Biochemistry & Biotechnology, 277–90 (1994). Siehe auch US-Patente Nrn. 5,037,750 und 5,156,965 von Schochetman und Massey, welche ein Verfahren für die Erhöhung der Rate chemischer Reaktionen lehren, das die Umwandlung von wenigstens einem Reaktanden zu wenigstens einem Produkt umfasst.
In einigen Fällen wurden bloße Geschwindigkeitssteigerungen gegenüber nicht katalysierten Reaktionsraten erreicht (siehe Thorn et al., "Large rate accelerations in antibody catalysis by strategic use of haptenic charge", 373, Nature, 228–30 (1995). Insoweit wurde jedoch kein generisches Mittel gefunden, um traditionelle Labortechniken zu verwenden, um hocheffiziente, spezifische Katalyse mit katalytischen Antikörpern zu erzeugen.
Die traditionellen Labortechniken für die Erzeugung eines katalytischen Antikörpers geschieht durch die Verwendung von Übergangszustandanaloga (TSA) (siehe US-Patent Nr. 4,792,446 von Kim und Kallenbach). TSA ist ein stabiles Mimetikum der instabilen Zwischenproduktkonformation eines reagierenden Moleküls. Tiere werden mit TSA in der Hoffnung immunisiert, Antikörper zu erzeugen, die wegen ihrer Fähigkeit, die TSA zu binden, die Fähigkeit haben könnten, den Übergangszustand des Reaktionsmittels zu stabilisieren und die Bildung des gewünschten Produktes zu katalysieren. Hybridome werden dann durch Untersuchung der gewünschten katalytischen Aktivität gescreent.
Das überwältigende Problem, das die katalytische Antikörperentwicklung in der großen Mehrheit an Fällen plagte, ist das Fehlen hoher Umsatzraten. Mit der Ausnahme von seltenen Fällen sind katalytische Antikörper um Größenordnungen langsamere Katalysatoren als ähnliche in der Natur gefundene Enzyme.
Kürzlich wurden jedoch Selektionsverfahren verwendet, um katalytische Antikörper zu erzeugen (siehe Smiley et al., "Selection of catalytic antibodies for a biosynthetic reaction from a combinatorial cDNA library by complementation of an auxtrophic Escherichia coli: antibodies for orotate decarboxylation", 91(18), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 8319–23 (1994), Janda et al., "Direct selection for a catalytic mechanism from combinatorial antibody libraries", 91(7), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2532–6). Solche Verfahren verwenden Selektionsdruck, um Antikörper mit gewünschten Eigenschaften zu isolieren, anstelle von mühsameren Screeningtechniken. Zum Beispiel können katalytische Antikörper, die die Bildung eines zellulären Wachstumsfaktors katalysieren, in einer Zelle selektiert werden, die für einen solchen Wachstumsfaktor auxotroph ist.
Fortschritte in der Molekular- und Zellbiologie gaben Forschern die Fähigkeit, die genetische Zusammensetzung der Keimbahn einer Reihe von Tieren zu verändern. Stücke von Genen, ganze Gene und/oder chromosomale Bereiche können selektiv deletiert oder hinzugefügt werden. Kürzlich wurden diese transgenen/Knock-out-Techniken verwendet, um menschliche Proteine in anderen Arten zu produzieren. Insbesondere war es möglich, menschliche Antikörper in Nagern zu produzieren (siehe Green et al., "Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YAC's", 7(1), Nature Genetics, 13–21 (1994); Lonberg et al., "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications", 368 (6474), Nature, 856–9 (1994); Taylor et al., "A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins", 20–23, Nucleic Acids Research, 6287–95 (1992)). Die internationalen Patentanmeldungen WO 91/10741, WO 94/25585 und WO 92/03918 diskutieren ebenfalls die Diversität der menschlichen Sequenz der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen. Die Fähigkeit, menschliche Antikörper in Nagern zu produzieren, erlaubt die kontrollierte Produktion therapeutischer Antikörper mit niedriger Immunogenität.
In einer Extension des traditionellen Verfahrens der katalytischen Antikörpertechnik für die Erhöhung der Antikörperbindungsaffinität an enzymatisch relevante Konformationen und Cofaktoren wurden transgene Tiere verwendet, um die Metallionenbindungsfähigkeiten des Antikörpers an die Keimbahn zu erhöhen. Metallionen werden als Cofaktoren für zahlreiche Enzyme verwendet und es wurden transgene Mäuse erzeugt, um Metallkationen effektiver zu binden (siehe Sarvetnick et al., 1993, "Increasing the chemical potential of the germ-line antibody repertoire", 90(9), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 4008–11; WO 94/25586).
In der vorliegenden Erfindung schlägt der Anmelder, eher als die Förderung der Bindung, wie es in den vergangenen Studien getan worden ist, die Integration funktioneller katalytischer Einheiten in die Keimbahnzusammensetzung eines nicht-menschlichen Tieres vor, so dass die Sequenzen, welche die spezifitätsbestimmenden Bereiche der enzymatischen Aktivität kodieren, in einer analogen Art zu variablen Bereichen von Immunglobulinen diversifiziert werden. Solch ein Ansatz löst das Problem der niedrigen Umsatzrate oder niedrigen katalytischen Aktivität.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Erzeugung katalytischer Antikörper mit einer Enzymaktivität bereit, umfassend:

(a) das Isolieren einer Sequenz einer funktionellen katalytischen Einheit aus einem Enzym;
(b) das Inserieren dieser Sequenz in eine Keimbahn eines nicht-menschlichen Tieres, so dass die Sequenz eine Diversifizierung des variablen Bereiches des Antikörpers durchmacht; und
(c) das Identifizieren der erzeugten Antikörper mit dieser enzymatischen Aktivität.

Die Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Nutzung von transgenen/Knock-out-Keimbahn-Veränderungstechniken dar, um Sequenzen zu implantieren, die für funktionelle katalytische Domänen und/oder Strukturen in der Antikörperkeimbahnsequenz eines nicht-menschlichen Tieres kodieren.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind solche Sequenzen, die für funktionelle katalytische Domänen und/oder Strukturen kodieren, Sequenzen bekannter Enzyme mit der gewünschten katalytischen Funktion (z. B. Hydrolyse einer Peptidbindung), jedoch mit der Spezifität, die von dem gewünschten katalytischen Antikörper verschieden ist.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Sequenzen, die für die Spezifitätsbereiche des implantierten funktionellen Enzyms kodieren, in die Keimbahn des nicht-menschlichen Tieres inseriert, um den CDR-Bereichen des Antikörpers zu entsprechen, um die schnelle Evolution/Diversifikation der Spezifitätsbereiche des Enzyms zu fördern. Die Erfindung liegt auch in der transgenen Implantation funktioneller katalytischer Einheiten oder Enzyme in anderen (nicht antikörper-) chromosomalen Bereichen mit einer hohen Mutationsrate (z. B. T-Zellrezeptor-Gensequenzen).
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sorgt das Verfahren für eine wechselnde Anordnung chimärer Antikörper/Enzymstrukturen. Die Platzierung und Segmentierung der enzymatischen Sequenz ermöglicht die Produktion einer Vielzahl von Antikörper/Enzymstrukturen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt "DNS-Erkennungssequenzen für Rekombinasen, welche die IgG-Genumordnung vermitteln. Konservierte Heptamer-(7bp)- und Nonamer-(9pb)-Sequenzen, getrennt durch 12 oder 13 Basenpaar-Spacersequenzen, werden benachbart zu V- und J-Exons oder V-, D- und J-Exons (in dem H-Ketten-Genort) lokalisiert. Rekombinasen erkennen diese Regionen voraussichtlich und bringen die Exons zusammen, wodurch Schleifen nicht-kodierender, dazwischen liegender DNS gebildet werden, die ausgeschnitten werden, und die Exons werden verbunden. Alternativ können die Exons durch einen Vorgang der Inversion verbunden werden, gefolgt von Exzision und Ligation".
2 erläutert einen Vergleich der Strukturen der konstanten und variablen Domänen von Immunglobulinen, β-Stränge, die als 1–7 bezeichnet worden sind, haben dieselbe Topologie und haben ähnliche Strukturen. Es gibt zwei zusätzliche β-Stränge in der variablen Domäne. Die Schleife zwischen diesen Strängen enthält den hypervariablen Bereich CDR2. Die verbleibenden CDR-Bereiche befinden sich am selben Ende der Tonne in den Schleifen, welche die β-Stränge 2 und 3 und die Stränge 6 und 7 verbinden. Eine Disulfidbindung überbrückt den Strang 2 in einem Faltblatt mit dem Strang 6 in dem anderen Faltblatt, sowohl in den konstanten als auch in den variablen Domänen.
3 ist eine Ansicht der konstanten Domänen von Immunglobulinen, die zu einer komprimierten antiparallelen β-Tonne gefaltet sind, ausgebildet aus einem dreisträngigen β-Faltblatt, das gegen ein viersträngiges β-Faltblatt gepackt wird (a). Die topologischen Diagramme (b) zeigen die verbundenen Greek-Key-Motive dieser Faltung.
4 ist ein topologisches Diagramm der Domänenstruktur von Chymotrypsin. Die Kette wird in ein Greek-Key-Motive gefaltet, gefolgt von einem Haarnadel-Motiv, die als eine sechssträngige antiparallele β-Tonne angeordnet sind.
5 ist ein Diagramm der Zubereitung von (a) pVHLYSneo und (b) pJHLYShyg.
6 ist ein Diagramm der Zubereitung von (a) pVKLYSneo und (b) pJKLYShyg.
7 ist ein Flussdiagramm, das das Kreuzen von Mäusen zeigt, welche Nachfahren erzeugen, die homozygot bezüglich den inaktiven Genorten der schweren Kette sind, die jedoch die lysozym-modifizierten Mini-Genorte der schweren Kette enthalten.
8 ist ein Flussdiagramm, das das Kreuzen von Mäusen zeigt, welche Nachfahren erzeugen, die homozygot bezüglich den inaktiven Genorten der schweren Kette und der leichten Kette sind, die jedoch die lysozym-modifizierten Mini-Genorte der schweren Kette enthalten.
9 ist ein Flussdiagramm, das das Kreuzen von Mäusen zeigt, welche Nachfahren erzeugen, die homozygot bezüglich den inaktiven Genorten der leichten Kette sind, die jedoch die lysozym-modifizierten Mini-Genorte der leichten Kette Kappa enthalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Definitionen sind notwendig für ein sauberes Verständnis der Erfindung:

• Ein katalytischer Motor ist eine funktionelle katalytische Einheit, die in der Lage ist, die Rate einer Reaktion zu ändern.
• Ein evolutionärer Startpunkt wird definiert als eine Sequenz (oder ein Protein, das durch diese Sequenz kodiert wird), welche für eine gewünschte Eigenschaft kodiert oder eine gewünschte Eigenschaft hat oder eng verwandt ist mit einer Sequenz oder einem Protein mit solch einer Eigenschaft (z. B. katalytische Aktivität).

Wie in der WO 93/19170 von Wohlstadter offenbart, können evolutionäre Startpunkte verwendet werden, um Enzyme und/oder andere Biokatalysatoren (z. B. Ribozyme) mit hohen Umsatzraten zu produzieren. In einem weiten Sinne können Enzyme und/oder andere Biokatalysatoren als zwei Funktionalitäten aufweisend erachtet werden: das katalytische Zentrum, welches die Katalyse antreibt (katalytischer Motor), und die umgebenden Spezifitätsbereiche, die die Substrat- oder Reaktandenselektivität des Enzyms bestimmen. Es wurde empirisch herausgefunden, dass funktionelle katalytische Domänen oder katalytische Motoren gemeinsam sind für Enzyme mit unterschiedlicher Spezifität (siehe Branden et al., "Introduction to protein Structure", Garland Publishing (1991)). Diese empirischen Daten legen nahe, dass es effektiver ist, eine funktionelle katalytische Domäne oder funktionellen katalytischen Motor zu erhalten und die Spezifitätsdomänen zu entwickeln, um Enzyme für neue Substrate zu schaffen, als unterschiedliche katalytische funktionelle Einheiten zu entwickeln. Effiziente Biokatalysatoren benötigen eine präzise strukturelle Orientierung spezifischer chemischer Einheiten und benötigen oftmals eine komplexe serielle zeitliche und räumliche Wechselwirkung mit dem Reaktandensubstrat (siehe Walsh, "Enzymatic Reaction Mechanisms", Freeman and Co. (1979)). Das einfache Binden an eine spezifische Molekülstruktur kann durch eine Reihe unterschiedlicher Moleküle durchgeführt werden. Dies wird am besten veranschaulicht durch Antikörper. Viele im Wesentlichen unterschiedliche Antikörpersequenzen/-strukturen sind der hochaffinen Bindung an dasselbe Antigenepitop fähig. Weitere empirische Nachweise legen nahe, dass die strengen komplexen Anforderungen, die benötigt werden, um eine funktionelle katalytische Einheit zu schaffen, die Zahl klinischer/struktureller Konformationen, die in der Lage sind, Katalyse durchzuführen, dramatisch begrenzt, wohingegen viele unterschiedliche chemische/strukturelle Konformationen eine im Wesentlichen ähnliche Bindungsaffinität verleihen können. Zum Beispiel entwickeln unterschiedliche Proteine im Wesentlichen ähnliche funktionelle katalytische Mechanismen. Obwohl die primären Aminosäuresequenzen solcher Enzyme nicht verwandt sind, entwickeln sie konvergent denselben katalytischen Mechanismus (siehe Brandem). Die Evolutionsdaten zeigen, dass es evolutorisch effizienter ist, um einen Biokatalysator mit einer neuen Spezifität zu schaffen, eine existierende funktionelle katalytische Einheit zu nutzen und die spezifitätsbestimmenden Bereiche zu entwickeln, um die gewünschte Substratselektivität zu erreichen, da nur ein vergleichsweise beschränkterer Satz an chemischen/strukturellen Konformationen in der Lage ist, eine hocheffiziente katalytische Einheit zu bilden. Die gegenwärtige Erfindung liegt in der erhöhten Effizienz der Schaffung von Antikörpern mit katalytischer Aktivität, indem die Antikörperkeimbahnsequenz eines nicht-menschlichen Tieres geändert wird, um für eine funktionelle katalytische Einheit oder im Wesentlichen Alles einer funktionellen katalytischen Einheit oder eines Enzyms zu kodieren.
Eine Reihe unterschiedlicher Übergangszustandsanaloga wurden synthetisiert und verwendet, um Labortiere zu immunisieren. TSAs und andere Immunogene variierender Strukturen und Ladung wurden verwendet, um Antikörper mit katalytischer Aktivität mit variierenden komplementären Formstrukturen und komplementären Ladungsstrukturen zu erzeugen (z. B. siehe Suzuki, Thorn; US-Patente Nrn. 4,792,446, 4,963,355, 5,156,965, 5,401,641, 5,318,897). TSAs können auch mit ausgedehnten Strukturen erzeugt werden, um vollständiger die Struktur des gewünschten Substrats nachzuahmen, um die Selektivität zu erhöhen. Zusätzlich kann Immunisierung durchgeführt werden unter Verwendung von Suizidsubstratinhibitoren (Substrate, die kovalent an funktionelle katalytische Domänen binden). Eine Reihe von Antigenen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In Abhängigkeit von dem gewünschten Grad an Selektivität können Antigene mit genauerer und/oder ausgedehnterer Ähnlichkeit mit dem gewünschten Substrat verwendet werden.
In einigen Fällen kann das gesamte Substrat mit nur geringen Änderungen genutzt werden oder in anderen Fällen kann das Substrat selber genutzt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Enzyminhibitoren und/oder Suizidsubstrate als Antigene oder Bestandteile von Antigenen genutzt. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Enzyminhibitoren und/oder Suizidsubstrate in das Substrat oder ein Analogon davon an der gewünschten Stelle der katalytischen Wirkung auf das Substrat integriert.
In den letzten etlichen Jahren erlaubten Fortschritte in der transgenen/Knock-out-Keimbahnänderung die Produktion nicht-menschlicher Tiere mit variierten Eigenschaften. Eine Reihe unterschiedlicher Gruppen waren in der Lage, die Keimbahn von Antikörpergenen zu ändern, um menschliche Antikörper in anderen Arten zu produzieren. Wie einem Fachmann bekannt ist, können neue Gene und/oder Sequenzen in die Keimbahn eines Tieres eingeführt werden und/oder endogene Gene und/oder Sequenzen können inaktiviert, unterbrochen und/oder deletiert werden. In der vorliegenden Erfindung werden solche Keimbahnänderungstechniken verwendet, um eine funktionelle Enzymsequenz zu inserieren, um ein chimäres Antikörper-Enzym-Molekül zu schaffen, so dass der Enzymanteil des chimären Proteins eine immunologische Evolution und Selektion durchmacht, wodurch Antikörper mit der gewünschten enzymatischen Aktivität erzeugt werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung sind sowohl die Antikörpersequenzen als auch die Enzymsequenzen menschliche Sequenzen, um die mögliche Immunogenität des resultierenden katalytischen Antikörpers zu limitieren. In einem Ausführungsbeispiel kann die Verwendung von künstlichen Hefechromosomen verwendet werden.
Antikörper sind aus etlichen Immunglobulindomänen zusammengesetzt, die kovalent zu der gemeinhin als "Y-förmig" bekannten Struktur der beiden schweren Ketten und der beiden leichten Ketten zusammengeheftet sind. Jede schwere Kette und jede leichte Kette enthält eine variable Immunglobulindomäne und die verbleibenden Immunglobulindomänen sind konstante Domänen. Obwohl sie leicht unterschiedlich in der Struktur sind, haben sowohl die variablen als auch die konstanten Domänen antiparallele β-Tonnen-Tertiärstrukturen (siehe 1). Von den Schleifen, welche die β-Stränge in den variablen Domänen, die als CDR1, CDR2 und CDR3 (komplementaritätsbestimmende Regionen 1, 2 und 3) bezeichnet werden, verbinden, findet man, dass sie weit unter den Antikörpern variieren und Antikörperspezifität verleihen. Antikörperdiversität wird durch eine Reihe an Mittel erzeugt. Zum Beispiel kann die Diversität erzeugt werden durch (1) mehrfache unterschiedliche Keimbahngene, (2) kombinatorische Diversität, (3) Verbindungsdiversität, einschließlich (a) ungenauer DNS-Umordnung und (b) N-Bereichsdiversifikation, (4) variierende Kombinationen von Proteinen der schweren und leichten Kette und (5) somatische Mutation (siehe Abbas et at, "Cellular and Molecular Immunology Second Edition", Saunders Co. (1994); Paul, "Fundamental Immunology Third Edition", Raven Press (1993)). Durch die saubere Einfügung des Enzyms oder der funktionellen katalytischen Einheit in die Keimbahn werden solche Diversifizierungsmechanismen dem enzymatischen Teil des Antikörper-Enzym-Proteins auferlegt. Zum Beispiel können die V-, D- und J-Bereiche eines Antikörpers mit Sequenzen eines bekannten menschlichen Enzyms ersetzt werden. Die Intron-Konfiguration des Antikörper-Genortes wird aufrechterhalten, um eine ausgedehnte Diversifizierung zu begünstigen. Zum Beispiel werden repetitive Sequenzen (Nanomer und Heptamer) ebenso wie Intron-Beabstandung aufrechterhalten (siehe 1).
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Platzierung und Segmentation der enzymatischen Sequenz. Zum Beispiel werden jene Domänen der inserierten Enzymsequenz, die räumlich in dem aktiven Zentrum oder um das aktive Zentrum herum lokalisiert sind, und/oder jene Reste, die eine Rolle bei der ausgedehnten spezifischen Substratbindung spielen können, in jenen Bereiche platziert, die zur höchsten Diversifizierung fähig sind (z. B. die CDR-Regionen). Zum Beispiel faltet Chymotrypsin auch zu einer antiparallelen β-Tonne wie eine Immunglobulindomäne (siehe 2 und 3). Das aktive Zentrum und Substratspezifitätsbereiche sind in der Proteinsequenz lokalisiert, welche die β-Stränge der β-Tonne überbrücken, wie es die CDR-Regionen in einem variablen Bereich eines Immunglobulins sind.
Die Erfindung liegt auch in einer variierenden Anordnung von chimären Antikörper/Enzymstrukturen. In einem Ausführungsbeispiel ersetzen die enzymatischen Sequenzen eine oder vielfache variable Domänen. Weitere vielfach unterschiedliche enzymatische Sequenzen können in die Keimbahn auf eine analoge Weise zu den multiplen variablen V-, D- und J-Regionen integriert werden, um eine extensiv geänderte Keimbahn zu schaffen und um die Diversifizierung weiter zu erhöhen. In einem anderen Ausführungsbeispiel kann die enzymatische Sequenz mit inserierter Intron-Beabstandung und Signalsequenzen der variablen Region in die Keimbahn eingefügt werden, um die enzymatische Domäne als eine aminoterminale Fusion einzubauen. In einem anderen Ausführungsbeispiel können solche aminoterminalen enzymatischen Fusionen variable Regionen von Antikörpern haben, die mit konstanten Immunglobulinbereichen ersetzt worden sind, wodurch die Diversifizierung nur auf die enzymatische Region begrenzt wird. In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung werden Sequenzen, die für enzymatische Funktionalität kodieren, in den Antikörper-Genort der Keimbahn inseriert, so dass die Enzymsequenz Gegenstand der Diversifizierung des variablen Bereichs von Immunglobulin ist, sie jedoch nicht kovalent mit einer Immunglobulindomäne verknüpft ist. Eine weite Reihe solch unterschiedlicher Strukturen kann in der Erfindung von einem Fachmann genutzt und angewandt werden.
Die Erfindung liegt auch in dem Verfahren der und der Sequenz zur Herstellung katalytischer Antikörper unter Verwendung der nicht-menschlichen Tiere der Erfindung mit geänderter Keimbahn. Zum Beispiel kann die Immunisierung mit einer Reihe unterschiedlicher TSA-Typen, Inhibitoren und/oder Suizidsubstraten (siehe Suzuki, Thorn; US-Patente Nrn. 4,792,446, 4,963,355, 5,156,965, 5,401,641) in einer aufeinander folgenden Weise durchgeführt werden, um Antikörper mit steigender Affinität auszulösen. In anderen Ausführungsbeispielen wird nach der Immunisierung der nicht-menschlichen Tiere der Erfindung eine resultierende enzymatische Antikörpersequenz transgen in die Keimbahnsequenz eines anderen nicht-menschlichen Tieres integriert. Zum Beispiel kann diese Technik bei der schrittweisen iterativen Evolution eines katalytischen Antikörpers nützlich sein. Auf diesem Wege kann der evolutionäre Fortschritt auf einem Keimbahnniveau fortgeführt werden.
Das Immunsystem selektiert Antikörper auf der Basis der Bindungsaffinität und/oder Bindungskinetiken. Es wird ein Enzym mit hohen Umsatzraten benötigt, um den Reaktanden zu binden, die Bildung des Produktes zu katalysieren und das Produkt zu entlassen, um einem anderen Reaktanden Zugang zu dem funktionellen aktiven Zentrum des Enzyms zu ermöglichen. Während ein Enzym mit hoher Umsatzrate die Freisetzung des Produktes erfordert, wird ein Antikörper für die hohe Bindungsaffinität selektiert. In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die transgen eingefügte enzymatische oder katalytische funktionelle Einheit selektiv mit einem vergleichsweise kleinen Satz an Mutationen geändert, um die katalytische Aktivität wesentlich zu erniedrigen (z. B. Mutation der katalytischen Triade-Reste einer Serinprotease). Auf diesem Wege kann das Substrat von Interesse als ein Antigen verwendet werden und eine Selektivität für das gewünschte Substrat kann erreicht werden. Nach der Selektion auf Bindung/Selektivität wird der kleine Satz an Mutationen wieder umgekehrt (z. B. durch spezifische Mutation, in-vitro-Screening, Selektion etc.), um die katalytische Umsatzrate zu erhöhen. Der resultierende katalytische Antikörper kann noch weiter selektiert werden unter Verwendung eines enzymatischen Inhibitors, Suizidsubstraten und/oder TSAs.
Die Erfindung liegt in der iterativen Immunisierung nicht-menschlicher Tiere mit geänderter Keimbahn der Erfindung und auch in der simultanen Immunisierung mit multiplen Antigenen. Iterative Immunisierung kann dasselbe Antigen oder unterschiedliche Antigene verwenden, um den Fortschritt der Immunantwort maßzuschneidern. Multiple Antigene können simultan zugeführt werden, um die Immunantwort wie gewünscht zu beeinflussen. Viele Techniken sind für einen Fachmann zugänglich, um die Antikörperproduktion zu optimieren. Zum Beispiel können Hilfsmittel verwendet werden, um eine Immunantwort zu erhöhen.
Die Antikörper mit enzymatischer Aktivität der vorliegenden Erfindung können durch im Stand der Technik bekannte Techniken modifiziert werden. Zum Beispiel kann die dreidimensionale strukturelle Information für gezielte Modifikationen der katalytischen Antikörper verwendet werden. In einem weiteren Beispiel können in-vitro-Mutagenese und Screening und/oder Selektion angewandt werden, um die enzymatischen Antikörper der vorliegenden Erfindung weiter zu entwickeln.
Die Vorbildung eines gewissen Grades an Diversität kann für die Selektion der gewünschten Enzymaktivität unter Verwendung der Verfahren der Erfindung vorteilhaft sein. Beispiele an Mutageneseverfahren, um Enzymgen-Fragmente mit erhöhter Diversität durch Erzeugen einer Anzahl abweichender und mutierter Genfragmente für den Einbau anstelle von multiplen Immunglobulin-Genelementen, das heißt V-, D- und/oder J-Regionen, zu erzeugen, folgen unten. In den Immunglobulin-Genorten wird die existierende Diversität verwendet und an Verfahren für die Schaffung von Diversität angepasst. Folglich wäre es vorteilhaft, vielfache Kopien der Enzymfragmente von Interesse einzuführen, um den Mechanismus der Diversitätsselektion auf eine ähnliche Weise zu erhöhen, wie jene, die bei der Erzeugung der Antikörperdiversität verwendet wird.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Mutageneseverfahren für die Erzeugung von Diversität bekannt. In einem Verfahren wird eine synthetische Genkonstruktion unter Verwendung von "dotierten" Sequenzen gemacht, die die Sequenz des katalytischen Motors von Interesse enthalten, jedoch mit den Basen, die bei der Synthese der Oligonucleotide verwendet worden sind, welche mit den anderen drei Basen zu einem niedrigen Grad, typischerweise von 0,1 bis 10%, dotiert worden sind. Bei dieser Synthese ist das katalytische Zentrum nicht Gegenstand der Mutation oder ist Gegenstand der Mutation nur zu einem geringeren Grad im Vergleich mit den anderen Sequenzen. Dieses Verfahren erzeugt eine Familie an Sequenzen, die an jeder Base nur zu 0,1 bis 10% der Zeit mutiert sind, basierend auf der Ausgangssequenz. Diese synthetischen Oligonucleotide werden dann zu dem endgültigen Gen unter Verwendung von verschiedenen Standardverfahren zusammengebaut.
In einem alternativen Verfahren würde das Gen von Interesse ebenfalls wie oben umrissen unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden konstruiert werden, nun jedoch mit sehr definierten Anteilen der Sequenz, die spezifische Stellen einbaut, welche bezüglich der möglichen Codons vollständig randomisiert sind. Dies kann durch die Verwendung von gemischten Basen erreicht werden, die bei der Synthese des Oligonucleotids verwendet werden, oder durch die Verwendung von zuvor gemachten Codons, die während der Synthese der Oligonucleotide für die Gensynthese verwendet werden. Diese mutierten Genfragmente würden. dann dem Zusammenbau unterzogen werden, wie oben umrissen.
In einem anderen alternativen Verfahren würde das Gen von Interesse auch auf der Basis der Verwendung von PCR mit limitierenden oder nicht natürlichen Basen konstruiert werden, um ein Genfragment mit mutierten Basen zu schaffen. Diese mutierten Genfragmente würden dann dem Zusammenbau unterzogen werden, wie oben umrissen.
In noch einem anderen alternativen Verfahren würde das Gen von Interesse auch basierend auf der Verwendung von chemischen Verfahren konstruiert werden, um die Base zu modifizieren, das heißt Dimethylsulfat, Disulfit, Ameisensäure, Hydrazin etc. Diese mutierten Genfragmente werden dann dem Zusammenbau unterzogen werden, wie oben umrissen.
Das Ergebnis dieser Genkonstruktionstypen ist ein Pool aus vermischten Genen, die dann in die Immunglobulin-Genorte kloniert werden können unter Verwendung von verschiedenen, im Stand der Technik bekannten Verfahren (siehe Beispiele). Zum Beispiel können die Gene mit einem Pool aus nicht kodierenden Klonsequenzen, isoliert aus dem Genort der V-Region von Immunglobulin, co-ligiert werden. Alternativ können andere "Stopf"-Sequenzen verwendet werden, basierend auf dem Verlangen, eine Serie eingestreuter Enzymgensequenzteile zu erzeugen, die analog zu den V-Region-Genfamilien sind. Zusätzlich könnten die Genfragmente spezifisch anstelle der V-, D- oder J-Region-Gensequenzen eingefügt werden. Diese modifizierten und/oder rekonstruierten Pseudo-Genorte würden dann in einen Cosmidvektor kloniert werden und die Klone würden auf die Größe und Anzahl der Enzymgensequenzteile gescreent werden. Der Klon mit der besten Anzahl und Größe der Fragmente würde dann der Rekombination in die Mini-Genloci der Immunglobulin-Genorte in dem YAC-Vektor unterzogen werden (siehe Beispiele). Diese Rekombination würde über die 5'- und 3'-Fragmente (der gewählten Insertionsstelle) der Immunglobulingen-Genorte der Wahl erreicht werden.
Dimere aktive Zentren von Enzymen werden unten diskutiert. Die Diversität von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren liegt auch zum Teil an der kombinatorischen Diversität, die aus zwei getrennten Genen des variablen Bereichs, das heißt variablen Bereichen leichter und schwerer Ketten der Immunglobulin-Genorte, erzeugt sind. Die Verwendung der Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptormechanismen für die Schaffung von Diversität sind einheitlich geeignet für Enzyme, die aus zwei Sequenzen (oder Untereinheiten) bestehen, die gemeinsam das aktive Enzym ausmachen. Die beiden Untereinheiten könnten von demselben Gen als ein Dimer stammen, demselben Gen als ein fragmentiertes Protein oder sie könnten aus zwei unterschiedlichen Genen stammen. Beispiele von Enzymen, die ein aktives Zentrum an der Grenzfläche eines Homodimers bilden, sind Ornithindecarboxylase, Aspartattranscarbamylase, 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-Reduktase, Pyruvatdecarboxylase, Dethiobiotinsynthetase und Glucoseoxidase (D. Alexeev et al., Structure, 1994, 2; 1061. A. Osterman et al., Biochemistry, 1994, 33; 13662. K. Frimpong et al., 1994, 269; 1217. F. Dyda et al., 1993, 32; 6165. H. J. Hecht et al., 1993, 229; 153). Diese Enzyme, die das aktive Zentrum aus zwei Untereinheiten bilden, erzeugen auch zwei aktive Zentren in dem Homodimer oder ein einzelnes aktives Zentrum, wenn eines der Proteine in dem Dimer eine einzelne Mutation in dem aktiven Zentrum hat.
In der vorliegenden Erfindung würden die Enzym-Genfragmente sowohl in die Genorte der schweren als auch der leichten Kette eingebaut werden und es würden Mäuse aus den ES-Zelllinien erzeugt werden, die diese modifizierten Genloci enthalten. Die modifizierten Genorte der leichten und schweren Kette würden dann durch Kreuzungen zwischen den transgenen Mäusen kombiniert werden. Die Mäuse mit beiden modifizierten Genorten würden dann in der Lage sein, den Grad an Diversität, der durch die mögliche kombinatorische Diversität möglich ist, auszudehnen.
Ein Fachmann würde realisieren, dass eine breite Reihe nicht-menschlicher Tiere genutzt werden kann, um katalytischen Antikörper zu erzeugen. Zum Beispiel können Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Kühe etc., ebenso wie Nicht-Säugerarten verwendet werden. Weiterhin würde ein Fachmann erkennen, dass eine breite Reihe enzymatischer Funktionalitäten und Enzymfamilien ebenso wie spezifische Enzyme in der Erfindung genutzt werden können (US-Patente Nrn. 4,792,446, 4,963,355, 5,156,965, 5,401,641, 5,229,272, 5,194,585, 5,236,836).
Die folgenden Beispiele, die die Verfahren der vorliegenden Erfindung erläutern, nutzen die folgenden Verfahren und Materialien.
Die transgenen Mäuse werden gemäß Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, erhalten.
Embryonale Stammzellen werden gemäß den publizierten Vorgehensweisen manipuliert (Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E. J. Robertson, Hrsg., IRL Press, Washington, D. C., 1987; Zjilstra et al., Nature, 342: 435–438 (1989), und Schwartzberg et al., Science, 246: 799–803 (1989)).
DNS-Klonierungsverfahren werden durchgeführt nach J. Sambrook, et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
Hybridomzellen und Antikörper werden manipuliert nach "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
Beispiel I
Einbau des 5'- oder aminoterminalen Teils des Enzyms Lysozym in den Bereich der schweren Kette der Mauskeimbahn durch Rekombination, um die Rekonstruktion und Selektion aktiver Enzyme unter Verwendung von Immunglobulin-Rekombination und somatischen Mutationsmechanismen zu ermöglichen.
Anfänglich wird die schwere Kette des variablen Bereichs VH81X (Maus-VH-Äquivalent; am nächsten zu der D-Region, Nature, 311, 727–753, 1984) aus einer Phagenbibliothek unter Verwendung einer synthetisch hergestellten Oligonucleotidsonde isoliert, um eine genomische Bibliothek des Phagen Lambda, erhalten aus fötaler Mausleber-DNS (Stratagene), zu screenen. Dieses V-Region-Genfragment wird dann in einen Plasmidvektor subkloniert, der das Thymidinkinase-(tk-)Gen aus Herpes simplex enthält, angetrieben von dem Phosphoglyceratkinasegen-(PGK-)Promotor der Maus (WO 94/02602), um den Vektor pVH81X zu ergeben. Das Plasmid pVH81X wird verwendet, um das Subklonieren des 5'-Teiles des Lysozymgens anstelle der kodierenden VH81X-Sequenz zu ermöglichen, jedoch mit dem Präpeptid und den intakten Rekombinationssignalen. In diesem Beispiel erstreckt sich der 5'-Teil des Lysozyms von der Aminosäure Lys 1 bis zu Gly 71 (Lysozym EC3.2.1.17, Jung et al., "Exons encode functional and structural units of chicken lysozyme", Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 77 (10), 5759–5763, 1980). Es wird verstanden werden, dass zahlreiche Bereiche des Enzyms in dieses Konstrukt gegeben werden können, basierend auf dem gewünschten Rekombinationsweg.
Das Konstrukt wird unter Verwendung von PCR gemacht, um drei Fragmente mit identischen Sequenzüberlappungen zu schaffen, um die aufeinander folgende Konstruktion des chimären genomischen Gens zu erlauben.
Diese drei Fragmente sind: 1) der 5'-Teil des VH81X-Gens, einschließlich dem nicht kodierenden Bereich; 2) der 5'-Teil des Lysozymgens mit Sequenzen der VH-Region an den 5'- und 3'-Enden der Fragmente nach der PCR, und 3) das 3'-Ende des VH-Gens. Die Konstruktion würde bestehen aus dem Kombinieren von 1) und 2) in PCR mit dem 5'-Primer aus der PCR 1) und dem 3'-Primer aus der PCR 2), um ein Fragment zu erzeugen, das die Sequenzen von 1) und 2) enthält. Das Produkt der PCR-Reaktion, das die Fragmente 1) und 2) kombiniert, wird zu den Produkten der PCR 3) hinzugefügt und der 5'-Primer aus der PCR 1) wird mit dem 3'-Primer aus der PCR 3) kombiniert und wiederum PCR ausgesetzt, dies würde in dem endgültigen PCR-Fragment resultieren, welches die Fragmente 1), 2) und 3) in einem einzelnen Fragment eingebaut haben würde. Dieses endgültige Fragment, das 1), 2) und 3) kombiniert und das den 5'-Teil von Lysozym innerhalb der genomischen Sequenzen des V-Region-Gens von VH81X enthält, wird dann in pVH81X kloniert, wobei die natürliche Sequenz ersetzt wird und der Vektor pVHLYS5 für die Rekombination in die Keimbahn der Maus geschaffen wird. Das Plasmid pVHLYS5 wird für die Rekombination nach der Einfügung des neo-Gens in diese neue genomische Sequenz in einer Position 3' zum Fragment 3) fertig gemacht, wodurch pVHLYS5neo erzeugt wird (siehe 5a).
Dieser Rekombinationsvektor ist so gestaltet, dass wenigstens 1 kb native genomische Sequenz das modifizierte VH81X-Genelement mit dem 5'-Teil der Lysozymsequenz flankiert.
Der Vektor pVHLYS5neo wird linearisiert und für die Elektroporation der embryonalen Stammzelllinie unter Verwendung von Standardverfahren verwendet. Die aus der Transfektion resultierenden Zellen werden dann auf Medien selektiert, die G418 enthalten, um nach dem neo-Gen zu selektieren, und auf Medien, die Gancyclovir (Syntex) enthalten, um nach dem Verlust des Thymidinkinasegens zu selektieren. Dieses doppelte Selektionsprotokoll verbessert die Wiedergewinnung der homologen Rekombinationsereignisse, die in dem Ersetzen des VH81X-Gens resultieren. Die resultierenden Kolonien werden dann in der Anwesenheit von Gancyclovir expandiert und für die spezifische Insertion durch Southern-Blot-Analyse untersucht, welche ein Genfragment neuer Größe erzeugt, das mit dem 5'-Genfragment von Lysozym, das bei der Konstruktion des Rekombinationsvektors verwendet worden ist, hybridisiert.
Aus einem Screening aus 300 Zelllinien werden jene mit den gewünschten Fragmenten expandiert und der weiteren Analyse ausgesetzt.
Die Zelllinie mit seinem inserierten 5'-Teil des Lysozymgens, LYS5, wird leicht für eine zweite Runde der Elektroporation expandiert, um die endgültige Zelllinie zu schaffen, die beide Teile des Lysozymgens innerhalb der Rekombinationseinheiten der schweren Kette enthält.
Beispiel II
Einbau des 3'- oder carboxyterminalen Teils des Enzyms Lysozym in den Bereich der schweren Kette der Mauskeimbahn durch Rekombination, um die Rekonstruktion und Selektion aktiver Enzyme unter Verwendung der Immunglobulin-Rekombination und somatischer Mutationsmechanismen zu ermöglichen.
Anfänglich werden die J-Regionen der schweren Kette JH aus einer Phagenbibliothek unter Verwendung einer synthetisch hergestellten Oligonucleotidsonde isoliert, um eine genomische Bibliothek des Phagen Lambda, abgeleitet aus fötaler Mausleber-DNS (Stratagene), zu screenen. Dieses JH-Region-Genfragment wird dann in einem Plasmidvektor subkloniert, der das Thymidinkinase-(tk-)Gen aus Herpes simplex enthält, angetrieben von dem Phosphoglyceratkinasegen-(PGK-)Promotor der Maus (WO 94/02602), um den Vektor pJH zu ergeben. Das Plasmid pJH wird verwendet, um das Subklonieren des 3'-Teils des Lysozymgens anstelle der vier kodierenden Sequenzen von JH zu ermöglichen, wobei jedoch beide Rekombinationssignale intakt sind. In diesem Beispiel erstreckt sich der 3'-Teil des Lysozyms von der Aminosäure Leu 75 bis zu Leu 129. Es wird verstanden werden, dass zahlreiche Teile des Enzyms in dieses Konstrukt gegeben werden können, basierend auf dem gewünschten Rekombinationspfad.
Das Konstrukt wird unter Verwendung von PCR gemacht, um drei Fragmente mit identischen Sequenzüberlappungen zu erzeugen, um die sequenzielle Konstruktion des chimären genomischen Gens zu erlauben.
Diese drei Fragmente sind: 1) der 5'-Teil des JH-Gen-Clusters (der nicht kodierende Bereich, einschließlich der meisten 5'-Rekombinationssignale); 2) der 3'-Teil des Lysozymgens, nun mit JH-Region-Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden des Fragments, und 3) das 3'-Ende des JH-Gen-Clusters, der das meiste des 3'-Rekombinationssignals enthält. Die Konstruktion würde bestehen aus dem Kombinieren von 1) und 2) in PCR mit dem 5'-Primer aus der PCR 1) und dem 3'-Primer aus der PCR 2), um ein Fragment zu schaffen, das die Sequenzen von 1) und 2) enthält. Das Produkt der PCR-Reaktion, die die Fragmente 1) und 2) kombiniert, wird zu den Produkten der PCR 3) hinzugefügt und der 5'-Primer aus der PCR 1) wird mit dem 3'-Primer aus der PCR 3) kombiniert und wieder PCR unterzogen, dies würde in dem endgültigen PCR-Fragment resultieren, welches die Fragmente 1), 2) und 3) in einem einzelnen Fragment eingebaut haben würde. Dieses endgültige Fragment, das 1), 2) und 3) kombiniert und das den 3'-Teil von Lysozym innerhalb der genomischen Sequenzen des JH-Region-Gens enthält, wird dann in pJH kloniert, wodurch die natürliche Sequenz ersetzt wird und der Vektor pJHLYS3 für die Rekombination in die Keimbahn der Maus erzeugt wird. Das Plasmid pJHLYS3 wird fertig gemacht für die Rekombination nach der Insertion des Hydromycingens in diese neue genomische Sequenz in einer Position 3' von dem Fragment 3), wodurch pJHLYS3hyg erzeugt wird (siehe 5b).
Dieser Rekombinationsvektor wird so konstruiert, dass wenigstens 1 kb nativer genomischer Sequenz das modifizierte JH-Gen-Element 3'-Teil der Lysozymsequenz flankiert.
Der Vektor pJHLYS3hyg wird linearisiert und für die Elektroporation der Zelllinie mit ihrem eingefügten 5'-Teil des Lysozymgens, LYS5, unter Verwendung von Standardverfahren verwendet. Die Zellen aus der Transfektion werden dann auf Medien selektiert, die Hygromycin enthalten, um für das hyg-Gen zu selektieren, und die Gancyclovir (Syntex) enthalten, um nach dem Verlust des Thymidinkinasegens zu selektieren. Dieses doppelte Selektionsprotokoll verbessert die Wiedergewinnung der homologen Rekombinationsereignisse, die in dem Ersetzen des JH-Gen-Clusters resultieren. Die resultierenden Kolonien werden dann in der Abwesenheit von Gancyclovir expandiert und auf die spezifische Insertion durch Southern-Blot-Analyse untersucht, welche ein Genfragment neuer Größe schafft, das mit dem 3'-Fragment von Lysozym hybridisiert, das bei der Konstruktion des Rekombinationsvektors verwendet worden ist.
Aus einem Screening mit 300 Zelllinien werden jene mit den gewünschten Fragmenten expandiert und der weiteren Analyse unterzogen.
Die Zelllinie LYS53 wird mit drei Aminosäuren konstruiert, die von der Kombination der 5'- und 3'-Genfragmente fehlen (Ser 72, Lys 73 und Asn 74), dies wird getan, um den Einbau der D-Regionen in dem Rekombinationspfad zu erlauben. Dies schafft einen Herd für die Mutagenese in der Lysozymstruktur dieser 5'- und 3'-Genfragment-Kombination.
Die Zelllinie mit ihrem inserierten 5'- und 3'-Teil des Lysozymgens, LYS53, wird zur Verwendung fertig expandiert. Diese Zelle könnte über die Schaffung von chimären Mäusen und Züchtung die Basis einer neuen Maus bilden. Alternativ könnte diese Zelllinie für die Isolierung eines Genfragmentes verwendet werden, das die 5'- und 3'-Lysozymgene enthält, flankiert von den nativen Maussequenzen. Diese Genfragmente würden, wenn sie direkt in die Kerne von einzelligen Mausembryonen gegeben würden, Mäuse schaffen, die die mutierten Immunglobulingene enthalten.
Beispiel III
Einbau des 5'- oder aminoterminalen Teils des Enzyms Lysozym in den Bereich der leichten Kette Kappa der Mauskeimbahn durch Rekombination, um die Rekonstruktion und Selektion aktiver Enzyme zu ermöglichen, unter Verwendung der Immunglobulin-Rekombination und somatischen Mutationsmechanismen.
Anfänglich wird die variable Region der leichten Kette VK aus einer Phagenbibliothek isoliert unter Verwendung einer synthetisch hergestellten Oligonucleotidsonde, um eine genomische Bibliothek des Phagen Lambda, abgeleitet aus fötaler Mausleber-DNS (Stratagene), zu screenen. Dieses V-Region-Genfragment wird dann in einen Plasmidvektor subkloniert, der das Thymidinkinase-(tk-)Gen von Herpes simplex enthält, angetrieben von dem Phosphoglyceratkinasegen-(PGK-)Promotor der Maus (WO 94/02602), um den Vektor pVK zu ergeben. Das Plasmid pVK wird verwendet, um das Subklonieren des 5'-Teils des Lysozymgens anstelle der kodierenden Sequenz von VK zu erlauben, jedoch mit dem intakten Präpeptid und den intakten Rekombinationssignalen. In diesem Beispiel erstreckt sich der 5'-Teil des Lysozyms von der Aminosäure Lys 1 bis Asn 74. Es wird verstanden werden, dass zahlreiche Teile des Enzyms in dieses Konstrukt gegeben werden können, basierend auf dem gewünschten Rekombinationspfad.
Das Konstrukt wird unter Verwendung von PCR gemacht, um drei Fragmente mit identischen Sequenzüberlappungen zu erzeugen, um die nachfolgende Konstruktion des chimären genomischen Gens zu ermöglichen.
Diese drei Fragmente sind: 1) der 5'-Teil des VL-Gens, einschließlich des nicht kodierenden Bereichs; 2) der 5'-Teil des Lysozymgens, nun mit VL-Regionssequenzen an den 5'- und 3'-Enden der Fragmente, und 3) das 3'-Ende des VL-Gens. Die Konstruktion wurde bestehend aus dem Kombinieren von 1) und 2) in PCR mit dem 5'-Primer aus der PCR 1) und dem 3'-Primer aus der PCR 2), um ein Fragment zu erzeugen, das die Sequenzen von 1) und 2) enthält. Das Produkt der PCR-Reaktion, wodurch die Fragmente 1) und 2) kombiniert werden, wird zu den Produkten der PCR 3) hinzugefügt und der 5'-Primer aus der PCR 1) wird mit dem 3'-Primer aus der PCR 3) kombiniert und wiederum PCR ausgesetzt, dieses würde in dem endgültigen PCR-Fragment resultieren, welches die Fragmente 1), 2) und 3) in einem einzelnen Fragment eingebaut haben würde. Dieses Endfragment, das 1), 2) und 3) kombiniert und den 5'-Teil von Lysozym in den genomischen Sequenzen der V-Region des VL-Gens enthält, wird dann in pVL kloniert, wodurch die natürliche Sequenz ersetzt wird und der Vektor pVKLYS5 für die Rekombination in die Keimbahn der Maus erzeugt wird. Das Plasmid pVKLYS5 wird fertig gemacht für die Rekombination nach der Insertion des neo-Gens in diese neue genomische Sequenz in einer Position 3' zu dem Fragment 3), wodurch pVKLYS5neo erzeugt wird (siehe 6a).
Dieser Rekombinationsvektor wird so konstruiert, dass wenigstens 1 kb nativer genomischer Sequenz das modifizierte VL-Genelement in dem 5'-Teil der Lysozymsequenz flankiert.
Der Vektor pVKLYS5neo wird linearisiert und für die Elektroporation der embryonalen Stammzelllinie unter Verwendung von Standardverfahren verwendet. Die Zellen von der Transfektion werden dann auf Medien selektiert, die G418 enthalten, um nach dem neo-Gen zu selektieren, und Gancyclovir (Syntex), um nach dem Verlust des Thymidinkinasegens zu selektieren. Dieses doppelte Selektionsprotokoll verbessert die Wiedergewinnung der homologen Rekombinationsereignisse, was in dem Ersetzen des VL-Gens resultiert. Die resultierenden Kolonien werden dann in der Abwesenheit von Gancyclovir expandiert und für die spezifische Insertion durch Southern-Blot-Analyse untersucht, welche ein Genfragment neuer Größe schafft, das mit dem 5'-Fragment von Lysozym, das bei der Konstruktion des Rekombinationsvektors verwendet wurde, hybridisiert.
Aus einem Screening von 300 Zelllinien werden jene mit den gewünschten Fragmenten expandiert und weiterer Analyse unterzogen.
Die Zelllinie mit seinem inserierten 5'-Teil des Lysozymgens, LYS5K, wird leicht für eine zweite Runde der Elektroporation expandiert, um die endgültige Zelllinie zu erzeugen, die beide Teile des Lysozymgens in den Rekombinationseinheiten der schweren Kette enthält.
Beispiel IV
Einbau des 3'- oder carboxyterminalen Teils des Enzyms Lysozym in die Region der leichten Kette der Mauskeimbahn durch Rekombination, um die Rekonstruktion und Selektion von aktiven Enzymen zu ermöglichen, unter Verwendung der Immunglobulin-Rekombination und von somatischen Mutationsmechanismen.
Anfänglich wird die J-Region der schweren Kette JK aus einer Phagenbibliothek unter Verwendung einer synthetisch hergestellten Oligonucleotidsonde isoliert, um eine genomische Bibliothek des Phagen Lambda, abgeleitet aus fötaler Mausleber-DNS (Stratagene), zu screenen. Dieses JK-Region-Genfragment wird dann in einem Plasmidvektor subkloniert, der das Thyminidinkinase-(tk-)Gen aus Herpes simplex enthält, angetrieben von dem Phosphoglyceratkinasegen-(PGK-)Promotor der Maus (WO 94/02602), um den Vektor pJK zu ergeben. Das Plasmid pJK wird verwendet, um das Subklonieren des 3'-Teils des Lysozymgens anstelle der vier kodierenden Sequenzen von JK zu erlauben, jedoch mit beiden Rekombinationssignalen intakt. In diesem Beispiel erstreckt sich der 3'-Teil von Lysozym von der Aminosäure Leu 75 bis zu Leu 129. Es wird verstanden werden, dass zahlreiche Teile des Enzyms in dieses Konstrukt gegeben werden können, basierend auf dem gewünschten Rekombinationspfad.
Die Konstruktion wird unter Verwendung von PCR hergestellt, um drei Fragment mit identischen Sequenzüberlappungen zu erzeugen, um die nachfolgende Konstruktion des chimären genomischen Gens zu erlauben.
Diese drei Fragmente sind: 1) der 5'-Teil des JK-Gen-Clusters (der nicht kodierende Bereich, einschließlich der meisten 5'-Rekombinationssignale); 2) der 3'-Teil des Lysozymgens, nun mit JK-Region-Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden der Fragmente und 3) das 3'-Ende des JK-Gen-Clusters, das das meiste des 3'-Rekombinationssignals enthält. Die Konstruktion würde bestehen aus dem Kombinieren von 1) und 2) in PCR mit dem 5'-Primer aus der PCR 1) und dem 3'-Primer aus der PCR 2), um ein Fragment zu erzeugen, das die Sequenzen von 1) und 2) enthält. Das Produkt der PCR-Reaktion, das die Fragmente 1) und 2) kombiniert, wird zu den Produkten der PCR 3) hinzugefügt und der 5'-Primer aus der PCR 1) wird mit dem 3'-Primer aus der PCR 3) kombiniert und wiederum PCR ausgesetzt, dieses würde in dem endgültigen PCR-Fragment resultieren, welches die Fragmente 1), 2) und 3) in einem einzelnen Fragment eingebaut haben würde. Dieses endgültige Fragment, das 1), 2) und 3) kombiniert und das den 3'-Teil von Lysozym in den genomischen Sequenzen des JH-Region-Gens enthält, wird dann in pJK kloniert, wodurch die natürliche Sequenz ersetzt wird und der Vektor pJKLYS3 für die Rekombination in die Keimbahn der Maus erzeugt wird. Das Plasmid pJKLYS3 wird fertig gemacht für die Rekombination nach der Insertion des Hygromycin-Gens in diese neue genomische Sequenz in einer Position 3' von dem Fragment 3), wodurch pJKLYS3hyg erzeugt wird (siehe 6b).
Dieser Rekombinationsvektor wird so konstruiert, dass wenigstens 1 kb nativer genomischer Sequenz das modifizierte JK-Genelement in dem 3'-Teil der Lysozymsequenz flankiert.
Der Vektor pJKLYS3hyg wird linearisiert und für die Elektroporation der Zelllinie mit seinem inserierten 5'-Teil des Lysozymgens, LYSS, verwendet, unter Verwendung von Standardverfahren. Die Zellen aus der Transfektion werden dann auf Medien selektiert, die Hygromycin enthalten, um nach dem hyg-Gen zu selektieren, und Gancyclovir (Syntex), um nach dem Verlust des Thymidinkinasegens zu selektieren. Dieses doppelte Selektionsprotokoll verbessert die Wiedergewinnung der homologen Rekombinationsereignisse, die in der Ersetzung des JH-Gen-Clusters resultieren. Die resultierenden Kolonien werden dann in der Abwesenheit von Gancyclovir expandiert und für die spezifische Insertion durch Southern-Blot-Analyse untersucht, welche ein Genfragment neuer Größe erzeugt, das mit dem 3'-Genfragment von Lysozym hybridisiert, das bei der Konstruktion des Rekombinationsvektors verwendet worden ist.
Aus einem Screening aus 300 Zelllinien wurden jene mit den gewünschten Fragmenten expandiert und weiterer Analyse ausgesetzt.
Die Zelllinie mit ihren inserierten 5'- und 3'-Teilen des Lysozymgens, LYS53K, wird fertig für die Verwendung expandiert. Diese Zelle könnte die Basis einer neuen Maus über die Bildung von chimären Mäusen und Zucht bilden. Alternativ könnte diese Zelllinie für die Isolierung eines Genfragmentes verwendet werden, das die 5'- und 3'-Lysozymgene enthält, flankiert von den nativen Maussequenzen. Diese Genfragmente würden, wenn sie direkt in die Kerne von einzelligen Mausembryonen gegeben würden, Mäuse hervorrufen, die die mutierten Immunglobulingene enthalten.
Beispiel V
Erzeugung der Keimbahnchimären
Die transfizierten ES-Zelllinien LYS53 und LYS53K werden unter Befolgung von Standardverfahren kultiviert, trypsiniert und in Injektionsmedium (DMEM 15% fötales Kälberserum, 20 mM HEPES, pH 7,3, Antibiotika und 2-Mercaptoethanol) resuspendiert. Dreieinhalb Tage alte C57BL/6L-Blastocysten (Jackson Labs Bar Harbor, ME) werden aus 4–5 Wochen alten superovulierenden weiblichen Tieren unter Befolgung von Standardverfahren gewonnen.
Ungefähr 10–15 Zellen werden in das Blastocoel jeder Blastocyste injiziert. Diese ES-Zellen, die Blastocysten enthalten, werden dann chirurgisch auf ein Uterushorn pseudoschwangerer weiblicher C57BL/6L-X-DBA/2- oder C57BL/6J-X-CAB-F1-Tiere übertragen.
Die Beteiligung der ES-Zellen an den Nachfahren wird durch Untersuchung der Fellfarbe bestimmt. Die chimären Nachfahren, in welchen die ES-Zellen an der Bildung der Tiere beteiligt sind, haben aguti- und cremefarbene Haare.
Die Keimbahnbeteilung der ausgewählten chimären Mäuse wird bestimmt durch Paaren mit C57BL/6J-Mäusen und Zählen der erwarteten F1-Nachfahren mit der Aguti-Farbe. Von ungefähr 50% der Aguti-Mäuse würde erwartet werden, dass sie die mutierten Schwere-Ketten- oder Kappa-Ketten-Genloci vererben würden. Die Keimbahnübertragung wird weiter charakterisiert durch die Southern-Blot-Analyse der aus den Schwänzen der F1-Nachfahren isolierten DNS.
Diese F1-Mäuse werden dann einer Artenkreuzung unterzogen werden, um die homozygoten Mäuse bezüglich der mutierten Schwere-Ketten- oder Kappa-Ketten-Genloci zu isolieren. Diese Mäuse werden nun die Basis einer Mauskolonie bilden, um eine rekombinierte Lysozymaktivität für eine geänderte Substratspezifität zu isolieren, jedoch immer noch unter Beibehaltung der Reste Glu 35 und Asp 52 des aktiven katalytischen Zentrums.
Beispiel VI
Ein alternatives Verfahren, um transgene Mäuse zu erzeugen, die das Enzym-Rekombinationssystem enthalten.
Die Erzeugung von transgenen Mäusen, die die modifizierten Genloci der schweren Kette des Enzyms enthalten, isoliert aus der ES-Zelllinie LYS53.
Die LYS53-Zelllinie wird hochkultiviert und der modifizierte Schwere-Ketten-Mini-Genort wird als ein Fragment isoliert, das das modifizierte VH291-Gen, nun mit Lysozym in 5'-Position, die genomischen Sequenzen der D-Region, die JH-Region, nun enthaltend den 3'-Teil von Lysozym anstelle von sechs JH-Genen, und die Sequenz der schweren Kette Mu enthält. Dieses Genfragment wird isoliert durch Klonieren in eine YAC-Bibliothek und durch Screening unter Verwendung einer Sonde des Lysozymgens. Der YAC-Klon mit den wenigsten zusätzlichen VH-Genen in einer Position 5' zu dem modifizierten VH291 (das am nächsten in 5'-Richtung zu der JH-Region gelegene VH-Gen) wird aufgezogen und die DNS wird verwendet, um eine ES-Zelllinie zu transfizieren. Die Transfektanten werden unter Verwendung von G418 nach dem neo-Gen, das in dem modifizierten Gen vorhanden ist, selektiert. Die resultierenden resistenten ES-Zelllinien werden dann bezüglich der gewünschten Geninsertion charakterisiert. Der Klon mit den intakten modifizierten Schwere-Ketten-Genorten werden dann kultiviert und für die Erzeugung chimärer Mäuse verwendet, wie in Beispiel V beschrieben. Die resultierenden Mäuse würden das vollständige native Antikörpersystem in Kombination mit den modifizierten Mini-Loci der schweren Kette enthalten.
Diese erste Generation an Mäusen werden dann mit Mäusen gekreuzt, die heterozygot bezüglich defekter Genorte der schweren Kette von Immunglobulin (hergestellt nach den Standardverfahren der WO 94/02602) sind. Dies resultiert in Nachfahren, die die Kombination aus i) Heterozygoten bezüglich einer defekten schweren Kette aus Immunglobulin und ii) den modifizierten Mini-Genorten der schweren Kette enthalten. Diese Nachfahren mit den doppelten Modifikationen werden dann einer Artenkreuzung unterzogen, welche in der Produktion einer Homozygoten bezüglich den inaktiven Genorten der schweren Kette resultiert, die jedoch die modifizierten Mini-Genorte der schweren Kette von Lysozym enthält (siehe 7).
In einer Alternative zu dem obigen Züchtungsweg wird diese erste Generation an Mäusen dann mit Mäusen gekreuzt, die heterozygot bezüglich defekten Immunglobulin-Genorten der schweren Kette und Genorten der leichten Kette Kappa von Immunglobulin (hergestellt nach den Standardverfahren der WO 94/02602) sind. Dies resultiert in Nachfahren, die die Kombination aus i) Heterozygoten bezüglich einer defekten schweren Kette und leichten Kette Kappa von Immunglobulin und ii) den modifizierten Genorten der schweren Kette sind. Diese Nachfahren mit den doppelten Modifikationen werden dann einer Artenkreuzung ausgesetzt, welche in der Produktion einer Homozygote bezüglich der Genorte der inaktiven schweren Kette und der leichten Kette resultiert, die jedoch die modifizierten Mini-Genorte der schweren Kette von Lysozym enthalten (siehe 8).
Diese Mäuse mit den doppelt und dreifach modifizierten Antikörpergenen sind nun fertig für die Selektion neuer katalytischer Aktivitäten für Lysozym, basierend auf der Immunisierung, um die Rekombination und somatische Mutation der neuen Mini-Genorte der schweren Kette anzutreiben, die die Lysozym-Genfragmente enthalten.
Beispiel VII
Ein alternatives Verfahren, um die transgenen Mäuse zu erzeugen, die das Enzym-Rekombinationssystem enthalten.
Die Erzeugung von transgenen Mäusen, die die modifizierten Genloci der schweren Kette des Enzyms enthalten, isoliert aus der ES-Zelllinie LYS53K.
Die LYS53K-Zelllinie wird hochgezogen und die modifizierten Mini-Genorte der leichten Kette werden als ein Fragment isoliert, das das modifizierte VK-Gen, nun mit Lysozym in 5'-Position, die JK-Region, nun enthaltend den 3'-Teil von Lysozym anstelle der JK-Gene, die Sequenz der leichten Kette Kappa enthält. Dieses Genfragment wird durch Klonieren in eine YAC-Bibliothek und durch Screening unter Verwendung einer Sonde des Lysozymgens isoliert. Der YAC-Klon mit den wenigsten zusätzlichen VK-Genen in einer Position 5' des modifizierten VK (das am nächsten in 5'-Richtung zu der JK-Region gelegene VK-Gen) wird wachsen gelassen und die DNS wird verwendet, um eine ES-Zelllinie zu transfizieren. Die Transfektanten werden unter Verwendung von G418 nach dem in dem modifizierten Gen vorhandene neo-Gen selektiert. Die resultierenden resistenten ES-Zelllinien werden dann bezüglich der gewünschten Geninsertion charakterisiert. Der Klon mit den intakten modifizierten Schwere-Ketten-Genorten wird dann kultiviert und für die Erzeugung chimärer Mäuse verwendet, wie im Beispiel V beschrieben. Die resultierenden Mäuse würden das vollständige native Antikörpersystem in Kombination mit den modifizierten Mini-Genorten der Kappa-Kette enthalten.
Diese erste Generation an Mäusen wird dann mit Mäusen gekreuzt, die heterozygot sind bezüglich defekter Genorte der leichten Kette von Immunglobulin (hergestellt gemäß den Standardverfahren der WO 94/02602). Dies resultiert in Nachfahren, die die Kombination aus i) Heterozygoten bezüglich einer defekten leichten Kette von Immunglobulin und ii) den modifizierten Mini-Genorten der leichten Kette Kappa enthalten. Diese Nachfahren mit den doppelten Modifikationen werden dann einer Artenkreuzung ausgesetzt, welche in der Produktion einer Homozygote bezüglich den inaktiven Leichte-Ketten-Genorten resultiert, die jedoch die modifizierten Mini-Genorte der leichten Kette Kappa aus Lysozym enthalten (siehe 9).
Diese Mäuse mit der doppelten Modifikation sind nun fertig für die Selektion neuer katalytischer Aktivitäten für Lysozym, basierend auf Immunisierung, um die Rekombination und somatische Mutation der neuen Schwere-Ketten-Mini-Genorte, die die Lysozym-Genfragmente enthalten, anzutreiben.
Beispiel VIII
Einbau des Enzyms Ribonuclease A in den Bereich der schweren Kette der Maus- Immunglobulin-Genloci durch Rekombination in Hefe, um Mini-Genorte für die Erzeugung chimärer Mäuse, die neue Ribonuclease-Aktivitäten herstellen, zu erzeugen.
5'-Fragment von Ribonuclease A von der Aminosäure 1 bis 68 (Ribonuclease A EC 3.1.27.5, siehe Borkakoti et al. "The Refined Structure Of Ribonuclease-A at 1.45 Angstroms Resolution", J. Crystallographic Spectroscopy Res. 14, 467, 1984.
Das Ribonuclease-A-Gen wird aus synthetischen Oligonucleotiden, die zwischen 50 und 70 Basen lang sind, konstruiert. Das gesamte Gen, einschließlich ausgewählter Restriktionsstellen, ist in acht Oligonucleotiden kodiert. Das Gen wird zusammengebaut und ligiert, gefolgt von PCR mit den 5'- und 3'-Oligonucleotiden, um das ligierte Genfragment zu amplifizieren. Das Gen wird dann in einen Plasmidvektor p5R kloniert. PCR wird verwendet, um zwei Fragmente, die i) dem 5'-Teil des sich am meisten proximal befindlichen variablen Bereichs der schweren Kette, enthaltend das Präpeptid und 800 Basen in 5'-Position, und ii) dem 3'-Teil des sich am meisten proximal befindlichen variablen Bereichs der schweren Kette, enthaltend die Rekombinationssignale und 800 Basen in 3'-Position, entsprechen, unter Verwendung des in Beispiel 9 beschriebenen YAC-Klons, der das VH-, D-, JH- und Mu-Schwere-Ketten-Genfragment enthält, zu erzeugen. Das 5'-PCR-Fragment wird in die gewünschte Restriktionsstelle am 5'-Ende des 5'-Teils des RNase-Genfragmentes kloniert. Das 3'-PCR-Fragment wird in die gewünschte Restriktionsstelle an dem 3'-Ende des 5'-Teils des RNase-Genfragments kloniert. Dieser Vektor p5RREC wird als die Quelle für das Genfragment verwendet, das den 5'-Teil des RNase-Gens enthält, flankiert von den Immunglobulinen. Dieses Genfragment wird dann in die Hälfte eines YAC-Vektors kloniert, der einen selektierbaren Hefemarker HIS3, der in dem Ausgangs-YAC-Vektor nicht vorhanden war, ein Centromer (CEN) und ein einzelnes Telomer (TEL) einschließt, um p5RRECY zu erzeugen.
3'-Fragment von Ribonuclease A von der Aminosäure 72 bis 124 (siehe Borkakoti).
Das Ribonuclease-A-Gen wird aus synthetischen Oligonucleotiden konstruiert, die zwischen 15 und 70 Basen lang sind. Das gesamte Gen einschließlich der ausgewählten Restriktionsstellen ist in acht Oligonucleotiden kodiert. Das Gen wird zusammengebaut und ligiert, gefolgt von PCR mit den 5'- und 3'-Oligonucleotiden, um das ligierte Genfragment zu amplifizieren. Das Gen wird dann in einem Plasmidvektor p3R kloniert. PCR wird dann verwendet, um zwei Fragmente, die i) dem 5'-Teil der sich am meisten in 5'-Richtung befindenden JH-Region, enthaltend die Rekombinationssignale und 800 Basen in 5'-Position, und ii) dem 3'-Teil der sich am meisten in 3'-Richtung befindlichen JH-Region, enthaltend die Rekombinationssignale und 800 Basen in 3'-Position, entsprechen, unter Verwendung des in Beispiel 9 beschrieben YAC-Klons, enthaltend das VH-, D-, JH- und Mu-Schwere-Ketten-Genfragment, zu erzeugen. Das 5'-PCR-Fragment wird in die gewählte Restriktionsstelle auf dem 5'-Ende des 5'-Teils des RNase-Genfragmentes kloniert. Das 3'-PCR-Fragment wird in die gewählte Restriktionsstelle auf dem 3'-Ende des 5'-Teils des RNase-Genfragmentes kloniert. Dieser Vektor p3RREC wird als die Quelle für das Genfragment verwendet, das den 3'-Teil des RNase-Gens enthält, flankiert von den genomischen Immunglobulinsequenzen.
Der modifizierte Subklon der JH-Region, der den 3'-Teil des Enzyms von Interesse aus p3RREC enthält, wird auch in die Hälfte eines YAC-Vektors subkloniert, der einen selektierbaren Hefemarker Leu 2, der nicht in dem Ausgangs-YAC-Vektor vorhanden war, und ein einzelnes TEL, das p3RRECY hervorruft, enthält.
Nach der Konstruktion dieser Vektoren wird die Hälfte des YAC-Vektors mit dem modifizierten VH-Gen (p5RRECY) linearisiert und verwendet, um einen Hefestamm zu transformieren, der die gewünschten Sequenzen der schweren Ketten der Maus der VH-, D-, JH- und Mu-Schwere-Ketten enthält. Die Selektion auf die Histidinprototrophie bewirkt Hefekolonien, die homologe Rekombination durchmachten. Der halbe YAC-Vektor, der die modifizierte JH-Region des Enzyms enthält, enthaltend den 3'-Teil des Enzyms von Interesse (p3RRECY), wird dann linearisiert und verwendet, um den Hefestamm, der in dem vorangegangenen Schritt erzeugt worden war, zu transformieren. Die Selektion nach der Leucin-Prototrophie resultiert in einem Hefestamm, der die gesamten Enzym-/Immunglobulin-Genorte enthält. Vorzugsweise können beide Selektionsschritte gemeinsam durchgeführt werden. Dieser YAC wird isoliert und in eine ES-Zelle mikroinjiziert und die Zelle wird der neo-Selektion unter Verwendung von G418 ausgesetzt. Die resultierende Zelllinie RNA35YAC wird dann verwendet, um eine chimäre Maus zu erzeugen, wie oben in Beispiel V beschrieben. Die resultierende chimäre Maus wird dann der Zucht ausgesetzt, um Mäuse zu erzeugen, die das chimäre Enzym-Antikörper-Molekül produzieren, ohne die Produktion nativer Antikörper. Die Beispiele G und 7 beschreiben Zuchtprotokolle, um die endogene Expression der schweren Kette und der leichten Kette von Immunglobulin zu entfernen.
Beispiel IX
Dieses Beispiel beschreibt ein alternatives Verfahren für das Klonieren und die Mikroinjektion eines Transgens aus Enzym und Schwerer-Kette-Immunglobulin in eine Mauszygote.
Aus der Mausleber werden Kerne isoliert und in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und mit EDTA und Proteinase K lysiert, wodurch die DNS mit hohem Molekulargewicht freigesetzt wird. Diese DNS mit hohem Molekulargewicht wird dann der Restriktionsenzymverdauung mit Restriktionsenzymen, die schneiden, um große Fragmente zu ergeben, das heißt Not1 etc. unterzogen.
Diese fragmentierte DNS mit hohem Molekulargewicht wird dann der Pulsfeld-Gelelektrophorese unterzogen und die Fragmente werden hinsichtlich der Kombination der VH-, D-, JH- und Mu-Schweren-Kette der Maus analysiert. Diese Fragmente werden vereinigt und in einen YAC-Vektor kloniert, der einen neo-Resistenzmarker enthält.
YAC-Klone werden analysiert und jene mit den gewünschten Sequenzen der schweren Kette der Maus der VH-, D-, JH- und Mu-Schweren-Ketten werden in den weiteren Klonierungsserien verwendet.
Die VH-Gene des ausgewählten YAC-Klons werden in einen Plasmidvektor subkloniert und dem erneuten Klonieren ausgesetzt, was in dem Ersetzen des VH-Gens durch den Enzymteil von Interesse resultiert, wie beschrieben in Beispiel 1, um den Vektor pVH5E zu ergeben. Diese JH-Region wird auch in einen Plasmidvektor subkloniert und der Insertion des 3'-Teils des Enzyms unterzogen, wie beschrieben in Beispiel 2, um den Vektor pJH3E zu ergeben.
Der Vektor pVH5E wird dann mit dem modifizieren VH-Gen, das den 5'-Teil des Enzyms von Interesse enthält, in einem halben YAC-Vektor subkloniert, der einen selektierbaren Hefemarker HIS3, der nicht in dem Ausgangs-YAC-Vektor anwesend war, ein Centromer (CEN) und ein einzelnes Telomer (TEL) enthält. Der modifizierte JH-Region-Unterklon, der den 3'-Teil des Enzyms von Interesse aus pJH3E enthält, wird auch in die Hälfte eines YAC-Vektors kloniert, der einen selektierbaren Hefemarker LEU2 enthält, der nicht in dem Ausgangs-YAC-Vektor vorhanden war, und ein einzelnes TEL. Der halbe YAC-Vektor mit dem modifizierten VH-Gen wird linearisiert und verwendet, um einen Hefestamm zu transformieren, der die gewünschten Sequenzen der schweren Kette der Maus der VH-, D-, JH- und Mu-Schweren-Ketten enthält. Die Selektion hinsichtlich der Histidinprototrophie bewirkt Hefekolonien, die eine homologe Rekombination durchmachten. Der halbe YAC-Vektor, der die modifizierte JH-Region des Enzyms enthält, die den 3'-Teil des Enzyms von Interesse enthält, wird dann linearisiert und verwendet, um den in dem vorangegangenen Schritt erzeugten Hefestamm zu transformieren. Die Selektion hinsichtlich Leucinprototrophie resultiert in einem Hefestamm, der die gesamten Enzym-/Immunglobulin-Genorte enthält. Vorzugsweise können beide Selektionsschritte gemeinsam durchgeführt werden. Dieser YAC wird isoliert und in ES-Zellen mikroinjiziert und die Zelle wird dann der neo-Selektion unter Verwendung von G418 ausgesetzt. Die resultierende Zelllinie LYS35YAC wird dann verwendet, um eine chimäre Maus zu erzeugen, wie oben in Beispiel 5 beschrieben. Die resultierende chimäre Maus wird dann der Zucht ausgesetzt, um Mäuse zu erzeugen, die das chimäre Enzym-Antikörper-Molekül produzieren, ohne die Produktion nativer Antikörper. Die Beispiele 6 und 7 beschreiben Zuchtprotokolle, um die endogene Expression der schweren Kette und der leichten Kette von Immunglobulin zu entfernen.
Beispiel X
Produktion von Enzymdiversität unter Verwendung der in den Beispielen, 5, 6, 7, 8 und 9 hergestellten transgenen Mäuse. Spezifische Beispiele der Immunisierung, um neue Aktivitäten zu erzeugen, werden später in den folgenden Beispielen 11, 12 und 13 wiedergegeben.
Immunisierung der Mäuse, welche die integrierte Enzym-/Immunglobulin-DNS tragen, werden mit Injektionen eines Antigens in Adjuvans immunisiert. Diese Antigene können Übergangszustandsanaloga oder Substrate oder Produkte oder Kombinationen eines einzelnen Immunogens sein. Diese verschiedenen Immunogene können alleine oder in aufeinander folgenden Kombinationen verwendet werden, welche auf die Fokussierung der Entwicklung der Enzymdiversität, stimuliert durch das Immunisierungsprotokoll, abzielen. Die Mäuse werden mit Antigen 14 Tage nach der primären Immunisierung geboostert. Typischerweise folgen auf dieses auch Immunisierungen an den Tagen 34 und 50. Der Antwort der Mäuse wird gefolgt mit Blutabnahmen, die an den immunisierten Tieren vorgenommen werden, um die spezifische Aktivität der Enzymantwort gegen das Substrat von Interesse zu untersuchen. Das Mäuseblut wird einem Reinigungsschritt ausgesetzt, basierend auf der Sequenz der schweren Kette Mu an dem COOH-Ende der rekombinierten Enzyme oder der leichten Kette Kappa, in Abhängigkeit von der bei der Immunisierung verwendeten spezifischen transgenen Maus. Typischerweise würde diese Reinigung Verwendung von für Anti-Maus-Immunglobulin spezifischen Antikörpern auf Perlen oder auf anderer fester Phase machen, um eine schnelle und wirksame Reinigung durchzuführen.
Die Mäuse mit der höchsten gewünschten Enzymaktivität werden geschlachtet und die Milzen werden für die Erzeugung von Hybridomen, welche die gewünschte Enzymaktivität sezernieren, entfernt.
Myelomzellen werden als Diffusionspartner verwendet, um die Hybridome zu erzeugen, unter Befolgung von Standardverfahren. Einen Tag nach der Fusion werden die Zellen in frischem Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, mit einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml aufgeteilt. Am Morgen der Fusion werden die Zellen mit einem gleichen Volumen Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum und 2 × OPI-Lösung (3 mg/ml Oxalacetat, 0,1 mg/ml Natriumpyruvat und 0,4 IU/ml Insulin), verdünnt.
Nach dem Schlachten der Maus wird die Milz aseptisch entfernt und in eine Petrischale mit Kulturmedium gegeben. Die Zellen werden auseinandergezogen bis die Milz in feine Stücke gezogen wurde und die meisten Zellen entfernt worden sind.
Die Zellen werden in frischem sterilem Medium gewaschen und den Klumpen wird ermöglicht, sich abzusetzen. Die Splenocyten werden weiter zweimal durch Zentrifugation in Medium ohne Serum gewaschen. Während dem zweiten Waschschritt werden die Myelomzellen auch in einem gesonderten Röhrchen gewaschen. Nach dem endgültigen Waschschritt werden die beiden Zellpellets kombiniert und einmal gemeinsam zentrifugiert. Eine Lösung aus 50% Polyethylenglykol (PEG) wird langsam zu dem Zellpellet hinzugefügt, während die Zellen resuspendiert werden, für insgesamt 2 Minuten. 10 ml vorgewärmtes Medium werden zu der Zelllösung hinzugefügt, wobei langsam für 3 Minuten gemischt wird. Die Zellen werden zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Die Zellen werden in 10 ml Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 1 × OPI-Lösung und 1 × AH-Lösung (58 μM Azaserin, 0,1 mM Hypoxanthin), resuspendiert. Die fusionierten Zellen werden in 96-Well-Platten in Aliquoten aufgeteilt und bei 37°C für eine Woche kultiviert. Der Überstand wird aus jeder Vertiefung aseptisch entnommen und in Pools gegeben. Diese Pools werden auf Enzymaktivität gegen das Substrat untersucht. Positive Pools werden weiter für individuelle Vertiefungen untersucht. Wenn eine positive Vertiefung identifiziert worden ist, werden die Zellen von der 96-Well-Platte in 0,5 ml Medium, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, 1 × OPI und 1 × AH, in eine 24-Well-Platte übertragen. Wenn jene Kultur dicht wird, werden die Zellen in 5 ml expandiert und dann in 10 ml. In diesem Zustand werden die Zellen subkloniert, so dass sich eine einzelne Enzym/Antikörper produzierende Zelle in der Kultur befindet. Diese Kulturen können die Basis für die Produktion der neuen Enzymaktivität bilden oder können die Quelle genetischer Information für die Entwicklung alternativer Expressions- und Produktionssysteme für die Enzymaktivität unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren bilden.
Beispiel XI
Die Schaffung gesteigerter Lysozymaktivität und die Zunahme der Sequenzdiversität.
In diesem Beispiel werden die Mäuse, die transgen für die Lysozym-/Antikörperfusion sind, mit dem natürlichen Substrat "NAG NAM NAG NAM NAG NAM" für das Enzym, gekoppelt an KLH, stimuliert. Der natürliche Inhibitor NAG-Lacton, gekoppelt an KLH, wird ebenfalls als ein Immunogen verwendet. Dies bildete die Basis des Testsystems, um die Stimulation der Lysozymgen-Rekombination und die Wiedergewinnung aktiven Lysozyms zu betrachten.
Die transgenen Mäuse werden mit Immunogenen, beschrieben wie oben in Beispiel 10, immunisiert. Die aktiven Hybridome werden dann der PCR-Amplifikation des Lysozymgens ausgesetzt, gefolgt von der Sequenzierung gemäß Standardverfahren (Clontech Palo Alto CA). Von den Lysozymgenen aus den stimulierenden Mäusen wird gefunden, dass sie einen signifikanten Grad an Sequenzvariabilität zeigen, was die Fähigkeit des Systems, Enzymdiversität durch gerichtete Stimulation zu erzeugen, belegt.
Beispiel XII
Erzeugung von Diversität in den Ribonuclease-Immunglobulin produzierenden transgenen Mäusen.
In diesem Beispiel werden die für Ribonuclease/Immunglobulin transgenen Mäuse sowohl mit dem natürlichen Substrat RNS als auch dem Übergangssubstrat Uridin-Vanadat, gekoppelt an KLH nach der Periodat-Oxidation der cis-Diole in dem Ribosering, gefolgt von der Bildung einer Schiff'schen Base mit den Aminogruppen von KLH und der Reduktion mit Natriumborhydrid, stimuliert. Die chimären Mäuse werden unter Befolgung des oben umrissenen allgemeinen Protokolls immunisiert.
Die Mäuse werden auf erhöhte Level der chimären Ribonuclease-Antikörperaktivität nach der selektiven Isolierung des Antikörpers unter Verwendung von Anti-Antikörper-Reagenzien auf Perlen gescreent. Dies wird als wichtig befunden wegen den endogenen Spiegeln an Ribonuclease, die in Serum gefunden werden.
Die aus diesen Immunisierungen isolierten Hybridome werden sowohl hinsichtlich der Enzymaktivität als auch hinsichtlich Sequenzen der Ribonuclease untersucht. Signifikante Unterschiede werden in den Sequenzen und spezifischen Aktivitäten der Klone der chimären Ribonuclease-Antikörpermoleküle gefunden.
Beispiel XIII
Erzeugung einer neuen Lysozymaktivität, basierend auf Übergangszustandimmunisierung.
In diesem Beispiel wird das Immunogen, das verwendet wird, um die Bildung der Enzymdiversität zu stimulieren, auf dem Amidinübergangszustandsanalogon, das kürzlich beschrieben wurde (WO 93/02703), basiert. Andere Alternativen zu diesem Übergangszustand sind bekannt, z. B. NAG-Lacton, 1-Aminogalactosid und Galactal. Das Amidinhapten ahmt den Übergangszustand für die Hydrolyse der glycosidischen Bindungen nach und repräsentiert eine gute Kernstruktur eines Immunogens, um die Entwicklung des Lysozymrepertoirs zu stimulieren. Das spezifische Amidin wird zubereitet, um zu dem Substrat Galactose zu passen, um die Bildung und Selektion einer Galactosidaseaktivität der Lysozym/Antikörper produzierenden Mäusen zu ermöglichen. Diese Immunogene werden typischerweise als Serien erzeugt, wobei die R-Gruppe eine Zahl zahlreicher Auswahlen ist. In diesem Fall konzentrierten wir uns auf die Verwendung von Ribose und Desoxyribose, gekoppelt an den Proteinträger. Dieses Amidinimmunogen wird an das Trägerprotein, typischerweise das Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, für die besten Ergebnisse gekoppelt. Der Immunisierungsplan wird durchgeführt, wie durch das allgemeine Protokoll des Beispiels 10 oben erläutert. Das Serum aus den immunisierten Tieren wird während der Immunisierung unter Verwendung eines chemolumineszenten Galactosidasesubstrates (Tropix Cambridge MA) untersucht. Die Tiere, die die höchste Aktivität zeigen, werden für die Fusion mit der Hybridomlinie verwendet, wie oben beschrieben.
Ein Fachmann würde erkennen, dass verschiedene Kombinationen der oben identifizierten Techniken angewendet werden können, um die beanspruchte Erfindung zu praktizieren.

Claims

Verfahren zur Erzeugung katalytischer Antikörper mit einer Enzymaktivität, umfassend: (a) das Isolieren einer Sequenz einer funktionalen katalytischen Einheit aus einem Enzym; (b) das Insertieren der Sequenz in eine Keimbahn eines nicht menschlichen Tieres, so dass die Sequenz diese Diversifizierung des variablen Bereichs eines Antikörpers durchläuft und (c) das Identifizieren der erzeugten Antikörper mit der Enzymaktivität.
Verfahren nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend nach Schritt (b), jedoch vor Schritt (c) einen weiteren Schritt des Immunisierens des nicht menschlichen Tieres mit einem Immunogen.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Immunogen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Übergangszustandsanalogon, angeheftet an ein interessierendes Substrat am Ort der katalytischen Wirkung, und einem Übergangszustandsanalogon, angeheftet an ein Analogon des interessierenden Substrats.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Immunogen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzyminhibitor, einem Enzyminhibitor, angeheftet an ein interessierendes Substrat am Ort der katalytischen Wirkung, und einem Enzyminhibitor, angeheftet an ein Analogon des interessierenden Substrats.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Immunogen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Suizidsubstratinhibitor, einem Suizidsubstratinhibitor, angeheftet an ein interessierendes Substrat am Ort der katalytischen Wirkung, und einem Suizidsubstratinhibitor, angeheftet an ein Analogon des interessierenden Substrats.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die katalytischen Antikörper chimere Antikörper sind und worin der Schritt des Insertierens der Sequenz das Ersetzen einer für eine Antikörperdomäne kodierenden Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, zusätzlich umfassend nach Schritt (b), jedoch vor Schritt (c) einen weiteren Schritt des Immunisierens des nicht menschlichen Tieres mit einem Immunogen.
Verfahren nach Anspruch 7, worin multiple, unterschiedlich funktionale katalytische Einheiten oder Komponenten derselben in die Keimbahn eines nicht menschlichen Tieres integriert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die funktionalen katalytischen Einheiten oder Komponenten derselben durch Intronsequenzen eines variablen Bereichs eines Immunglobulins voneinander getrennt sind.
Verfahren nach Anspruch 7, zusätzlich umfassend einen iterativ wiederholten Prozess, worin eine Sequenz, kodierend das Produkt einer Iteration, die Sequenz darstellt, die in die Keimbahn eines nicht menschlichen Tieres in der nächsten Iteration integriert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Sequenz, wenn sie exprimiert wird, an den Aminoterminus einer Immunglobulinkette fusioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Immunglobulinkette ein variabler Bereich fehlt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin die Sequenz in ein künstliches Hefechromosom insertiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin die funktionale katalytische Einheit ein vollständiges Enzym oder ein Teil eines vollständigen Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin die funktionale katalytische Einheit ein inaktiviertes Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin die Sequenz transgen in eine Keimbahn eines nicht menschlichen Tieres transgen insertiert wird und worin die endogene Antikörpersequenz der Keimbahn inaktiviert (knocked-out) oder entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin das Identifizieren der erzeugten Antikörper ein Prozess ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Screenen bzw. Sichten, Selektieren und Isolieren.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 6 oder 7, worin die Sequenz menschlichen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, G oder 7, worin die Sequenz menschlichen Ursprungs ist und die erzeugten Antikörper humanisierte Antikörper sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sequenz in einen Antikörper-Genlokus eines nicht menschlichen Tieres insertiert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, zusätzlich umfassend nach Schritt (b), jedoch vor Schritt (c) einen weiteren Schritt des Immunisierens des nicht menschlichen Tieres mit einem Immunogen.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin der katalytische Antikörper ein chimerer Antikörper ist und worin der Schritt des Insertierens der Sequenz das Ersetzen einer für eine Antikörperdomäne kodierenden Sequenz umfasst.