ES2227594T3 - Metodo para promover la diversidad enzimatica. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA GENERAR CATALIZADORES NUEVOS; ESPECIALMENTE ENZIMAS O BIOCATALIZADORES CON UNA VELOCIDAD DE RECAMBIO ALTA. LAS UNIDADES CATALITICAS FUNCIONALES PUEDEN INTEGRARSE EN LA COMPOSICION DE UNA LINEA GERMINAL DE UN ANIMAL PARA GENERAR ESTOS NUEVOS CATALIZADORES.

Description

Método para promover la diversidad enzimática.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma amplia a métodos para crear nuevos catalizadores, particularmente enzimas o biocatalizadores de elevada velocidad de recambio, usando animales no humanos de secuencia de línea germinal alterada. Más particularmente, la invención se refiere a métodos para promover la rápida evolución o diversificación de las regiones de especificidad de una enzima. El método se puede usar para producir anticuerpos con actividad catalítica codificando una unidad catalítica funcional, o una porción sustancial de la misma, con un locus de gen de anticuerpo de línea germinal. E incluso más particularmente, la invención se refiere a la colocación y segmentación de las secuencias enzimáticas en los locus del gen del anticuerpo.

Antecedentes de la invención

Durante la última década, se han realizado investigaciones dirigidas a la producción de anticuerpos útiles con actividad catalítica. Tales anticuerpos se conocen habitualmente como anticuerpos catalíticos o Abcimas. Un número de grupos de investigación han dado a conocer anticuerpos catalíticos con mejores velocidades de recambio, comparadas con las velocidades de las reacciones sin catalizar (véase Suzuki et al., "Recent advances in abzyme studies". 115(4) Journal of Biochemistry 623-8 (1994), Titmas et al., Aspects of antibody catalyzed primary amide hydrolysis, 47(2-3) Applied Biochemistry & Biotechnology 277-90 (1994). Véanse también las patentes US nº 5.037.750 y nº 5.156.955 de Schochetman y Massey, que enseñan un método para aumentar la velocidad de las reacciones químicas que implican la conversión de al menos un agente reaccionante en al menos un producto.

En algunos casos, se han logrado grandes mejoras de la velocidad con respecto a las velocidades de las reacciones sin catalizar (véase Thorn et al., "Large rate accelerations in antibody catalysis by strategic use of haptenic charge", 373 Nature 228-30 (1995). Sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado un medio genérico para emplear técnicas tradicionales de laboratorio para producir catalizadores específicos altamente eficaces con anticuerpos catalíticos.

Las técnicas tradicionales de laboratorio para producir un anticuerpo catalítico pasan por el uso de análogos del estado de transición (TSA) (véase la patente U.S. nº 4.792.446 de Kim y Kallenbach). El TSA es un imitador estable de la conformación intermedia inestable de una molécula reaccionante. A los animales se les inmuniza con los TSA con la esperanza de producir anticuerpos que, en virtud de su capacidad para unirse a los TSA, pueden tener la capacidad para estabilizar el estado de transición del agente reaccionante y para catalizar la formación del producto deseado. Seguidamente se identifican sistemáticamente los hibridomas al realizar un ensayo para determinar la actividad catalítica deseada.

El problema abrumador que ha plagado el desarrollo de anticuerpos catalíticos, en la mayoría de los casos, es la falta de velocidades de recambio elevadas. Excepto en casos raros, los anticuerpos catalíticos son catalizadores de órdenes de magnitud más lentos que las enzimas similares encontradas en la naturaleza. Recientemente, sin embargo, se han usado métodos de selección para producir anticuerpos catalíticos (véase Smiley et al., "Selection of catalytic antibodies for a biosynthetic reaction from a combinatorial cDNA library by complementation of an auxtrophic Escherichia coli: antibodies for orotate decarboxylation", 91(18) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 8319-23 (1994); Janda et al., "Direct selection for a catalytic mechanism from combinatorial antibody libraries", 91(7) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2532-6). Tales métodos usan una presión de selección para aislar los anticuerpos con las propiedades deseadas, en lugar de las técnicas de identificación sistemática más laboriosas. Por ejemplo, se puede seleccionar un anticuerpo catalítico que cataliza la formación de un factor de crecimiento celular en una célula auxotrófica para tal factor de crecimiento.

Los avances en biología molecular y celular han dado a los investigadores la capacidad para alterar la constitución genética de la línea germinal de una variedad de animales. Se pueden eliminar o añadir selectivamente trozos de genes, genes completos, y/o regiones cromosómicas. Recientemente estas técnicas transgénicas/de silenciamiento se han usado para producir proteínas humanas en otras especies. En particular, ha resultado posible producir anticuerpos humanos en roedores (véase Green et al., "Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YAC's" 7(1) Nature Genetics 13-21 (1994); Lonberg et al., "Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications", 368(6474) Nature 856-9 (1994); Taylor et al., "A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins", 20-23 Nucleic Acids Research 6287-95 (1992). Las solicitudes internacionales WO 91/10741, WO 94/25585 y WO 92/03918 también discuten la diversidad de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de secuencia humana.

La capacidad para producir anticuerpos humanos en roedores permite la producción controlada de anticuerpos terapéuticos de baja inmunogenia.

En una extensión del método tradicional de la técnica del anticuerpo catalítico para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo a conformaciones y cofactores enzimáticamente pertinentes, se han utilizado animales transgénicos para potenciar la capacidad de unión a iones metálicos del anticuerpo de la línea germinal. Los iones metálicos se usan como cofactores para diversas enzimas, y los ratones transgénicos se produjeron para unirse de forma más eficaz a cationes metálicos (véase Sarvetnick et al., 1993, "Increasing the chemical potential of the germ-line antibody repertoire". 90(9) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 4008-11; y el documento WO 94/25586).

En la presente invención, en lugar de promover la unión, como se ha realizado en estudios pasados, se propone integrar las unidades catalíticas funcionales en la composición de la línea germinal de un animal no humano, de forma que las secuencias que codifican las regiones que determinan la especificidad de la actividad enzimática estén diversificadas de una manera análoga a las regiones variables de las inmunoglobulinas. Tal enfoque resuelve el problema de una baja velocidad de recambio o una baja actividad catalítica.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para generar anticuerpos catalíticos que tienen una actividad enzimática, que comprende:

(a)

aislar una secuencia de una unidad catalítica funcional a partir de una enzima;

(b)

insertar dicha secuencia en una línea germinal de un animal no humano, de forma que dicha secuencia sufra una diversificación de la región variable del anticuerpo; e

(c)

identificar los anticuerpos generados que tienen dicha actividad enzimática.

La invención proporciona asimismo un nuevo método para utilizar técnicas transgénicas/de silenciamiento que alteran la línea germinal para implantar secuencias que codifican dominios catalíticos funcionales y/o estructuras en la secuencia del anticuerpo de la línea germinal de un animal no humano.

Según un aspecto de la presente invención, tales secuencias que codifican dominios catalíticos funcionales y/o estructuras son secuencias de enzimas conocidas con la función catalítica deseada (por ejemplo, hidrólisis de un enlace peptídico), pero con una especificidad diferente del anticuerpo catalítico deseado.

Todavía según otro aspecto de la presente invención, las secuencias que codifican las regiones de especificidad de la enzima funcional implantada se insertan en la línea germinal del animal no humano para que correspondan a las regiones CDR del anticuerpo para promover la rápida evolución/diversificación de las regiones de especificidad de la enzima. La invención también se refiere a la implantación transgénica de las unidades catalíticas funcionales o enzimas en otras regiones cromosómicas (no anticuerpos) de velocidad de mutación elevada (por ejemplo, secuencias génicas del receptor de células T).

Según todavía otro aspecto de la presente invención, el método proporciona un conjunto variable de estructuras de anticuerpos/enzimas quiméricas. La colocación y segmentación de la secuencia enzimática permite la producción de multitud de estructuras de anticuerpos/enzimas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra "secuencias de reconocimiento de ADN para recombinasas que median la transposición del gen de Ig. Las secuencias heptámeras (7bp) y nonámeras (9 bp) conservadas, separadas por espaciadores de 12 ó 23 pares de bases, están localizadas contiguas a los exones V y J o a los exones V, D y J (en el locus de la cadena H). Las recombinasas reconocen presumiblemente estas regiones y juntan a los exones, formando bucles de ADN interviniente no codificante que son cortados por escisión, y los exones se unen. Como alternativa, los exones se pueden unir mediante un proceso de inversión, seguido de excisión y ligamiento".

La figura 2 ilustra una comparación de las estructuras de los dominios constante y variable de inmunoglobulinas, las hebras \beta marcadas 1-7 tienen la misma topología y estructuras similares. Hay dos hebras \beta extra, en el dominio variable. El bucle entre estas hebras contiene la región hipervariable CDR2. El resto de las regiones CDR están en el mismo extremo del barril en los bucles que conectan las hebras \beta 2 y 3, y las hebras 6 y 7. Un enlace de disulfuro forma un puente entre la hebra 2 en una lámina con la hebra 6 en la otra lámina, tanto en el dominio constante como en el dominio variable.

La figura 3 es una vista de los dominios constantes de inmunoglobulinas pegadas en un barril \beta antiparalelo comprimido, construido a partir de una lámina \beta de tres hebras empaquetada frente a una lámina de cuatro hebras (a). El diagrama topológico (b) muestra los motivos claves de Greek conectados de este plegamiento.

La figura 4 es un diagrama topológico de la estructura del dominio de quimiotripsina. La cadena está plegada en un motivo clave de Greek, seguido de un motivo de horquilla que están dispuestos como un barril \beta antiparalelo de seis hebras.

La figura 5 es un diagrama de preparación de (a) pVHLYSneo y (b) pJHLYShyg.

La figura 6 es un diagrama de preparación de (a) pVKLYSneo y (b) pJKLYShyg.

La figura 7 es un diagrama de flujo que muestra el cruzamiento de ratones que producen progenia que son homocigotos con respecto a los locus de cadena pesada inactivos, pero que contienen los minilocus de cadena pesada modificados con lisozima.

La figura 8 es un diagrama de flujo que muestra el pinzamiento de ratones que producen progenie que son homocigotos con respecto a los locus de cadena pesada y de cadena ligera inactivos, pero que contienen los minilocus de cadena pesada modificados con lisozimas.

La figura 9 es un diagrama de flujo que muestra el cruzamiento de ratones que producen progenie que son homocigotos con respecto a los locus de cadena ligera inactivos pero que contienen los minilocus de cadena ligera capa modificados con lisozima.

Descripción detallada de la invención

Las siguientes definiciones son necesarias para una comprensión apropiada de la invención:

\bullet

Un motor catalítico es una unidad catalítica funcional capaz de alterar la velocidad de una reacción.

\bullet

Un punto de partida evolutivo se define como una secuencia (o proteína codificada por dicha secuencia) que codifica o tiene una propiedad deseada o está muy relacionada con una secuencia o proteína con tal propiedad (por ejemplo, actividad catalítica).

Como se describe en el documento WO 93/19170 de Wohlstadter, se pueden utilizar puntos de partida evolutivos para producir enzimas con una elevada velocidad de recambio y/u otros biocatalizadores (por ejemplo, ribozimas). En un sentido amplio, se puede considerar que las enzimas y/u otros biocatalizadores tienen dos funcionalidades: el centro catalítico que activa la catálisis (motor catalítico), y las regiones de especificidad vecinas que determinan la selectividad por el sustrato o el agente reaccionante de la enzima. Empíricamente, se ha encontrado que los dominios catalíticos funcionales o motores catalíticos son comunes para enzimas de especificidad diferente (véase Branden et al., "Introduction to protein Structure", Garland Publishing (1991). Estos datos empíricos sugieren que es más eficaz mantener un dominio catalítico funcional o un motor catalítico y desarrollar los dominios de especificidad para crear enzimas para nuevos sustratos, en vez de desarrollar diferentes unidades funcionales catalíticas. Los biocatalizadores eficaces requieren una orientación estructural precisa de los restos químicos específicos, y a menudo requieren una interacción temporal y espacial en serie compleja con el sustrato reaccionante [véase Walsh, "Enzymatic Reaction Mechanisms", Freeman and Co., (1979)]. De forma simple, la unión a una estructura molecular específica se puede llevar a cabo con una variedad de diferentes moléculas. Esto se ejemplifica mejor por los anticuerpos. Muchas estructuras/secuencias de anticuerpos sustancialmente diferentes son capaces de una unión de elevada afinidad al mismo epítopo antigénico. Otra evidencia empírica sugiere que los requisitos complejos restrictivos necesarios para crear una unidad catalítica funcional restringen drásticamente el número de conformaciones químicas/estructurales que son capaces de llevar a cabo la catálisis, mientras que muchas conformaciones químicas/estructurales diferentes pueden conferir una afinidad de unión sustancialmente similar. Por ejemplo, diferentes proteínas desarrollan mecanismos catalíticos funcionales sustancialmente similares. Incluso aunque tales secuencias de aminoácidos primarias de las enzimas no están relacionados, evolucionan de manera convergente hacia el mismo mecanismo catalítico (véase Brandem). Los datos evolutivos indican que para crear un biocatalizador de nueva especificidad es evolutivamente más eficaz utilizar una unidad catalítica funcional existente y desarrollar las regiones que determinan la especificidad, para lograr la selectividad deseada por el sustrato, puesto que sólo un conjunto relativamente más restringido de conformaciones químicas/estructurales son capaces de formar una unidad catalítica altamente eficaz. La actual invención se refiere al aumento de eficacia en la creación de anticuerpos con actividad catalítica mediante la alteración de la secuencia del anticuerpo de línea germinal de un animal no humano para codificar una unidad catalítica funcional o sustancialmente toda una unidad catalítica funcional o enzima.

Se ha sintetizado una variedad de diferentes análogos del estado de transición, y se ha usado para inmunizar animales de laboratorio. Se han utilizado los TSA y otros inmunógenos de estructuras y cargas variables para provocar anticuerpos con actividad catalítica que tienen estructuras complementarias de forma variable y estructuras complementarias de carga variable (por ejemplo, véase Suzuki; Thorn; patentes U.S. nº 4.792.446, nº 4.963.355, nº 5.156.965, nº 5.401.641 y nº 5.318.897). Los TSA también se pueden producir con estructuras extendidas para imitar de forma más completa la estructura del sustrato deseado para aumentar la selectividad. Adicionalmente, se puede llevar a cabo una inmunización usando inhibidores de sustrato suicida (sustratos que se unen covalentemente a dominios catalíticos funcionales). En la presente invención se puede utilizar una variedad de antígenos. Dependiendo del grado deseado de selectividad, se pueden usar antígenos de una similitud más exacta y/o más extensa con el sustrato deseado.

En algunos casos, se puede utilizar sustancialmente todo un sustrato con solamente pequeñas alteraciones, o en otros casos se puede utilizar el propio sustrato. En una realización preferida de la invención, los inhibidores de enzimas y/o sustratos suicidas se usan como antígenos o componentes de antígenos. En una realización particularmente preferida de la invención, los inhibidores de enzimas y/o sustratos suicidas se integran en el sustrato o en un análogo del mismo en el sitio deseado de acción catalítica en el sustrato.

En los últimos años, los avances en la alteración transgénica/de silenciamiento de líneas germinales ha permitido la producción de animales no humanos con diversas propiedades. Una variedad de diferentes grupos ha sido capaz de alterar la línea germinal de genes de anticuerpos para producir anticuerpos humanos en otras especies. Como es conocido por los expertos en la materia, se pueden introducir nuevos genes y/o secuencias en una línea germinal del animal, y/o se pueden inactivar, interrumpir y/o eliminar genes y/o secuencias endógenas. En la actual invención, tales técnicas de alteración de la línea germinal se utilizan para insertar una secuencia enzimática funcional para crear una molécula enzimática de anticuerpo quimérico de forma que la porción enzimática de la proteína quimérica sufre una evolución y selección inmunológica generando anticuerpos con la actividad enzimática deseada. En una realización preferida de la invención, tanto las secuencias del anticuerpo como las secuencias de la enzima son secuencias humanas, para limitar la inmunogenia potencial del anticuerpo catalítico resultante. En una realización, se puede hacer uso de cromosomas artificiales de levadura.

Los anticuerpos están compuestos de varios dominios inmunoglobulínicos que están unidos covalentemente en la estructura habitualmente conocida con "forma de Y" de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera contiene un dominio variable inmunoglobulínico, y los dominios inmunoglobulínicos restantes son dominios constantes. Aunque son ligeramente diferentes en estructura, tanto el dominio variable como el dominio constante tienen estructuras terciarias en barril de tipo \beta antiparalelas (véase la Fig. 1). Se encuentra que los bucles que conectan a las hebras \beta en los dominios variables denominados CDR1, CDR2 y CDR3 (regiones 1, 2 y 3 que determinan la complementariedad) varían ampliamente entre anticuerpos y confieren especificidad del anticuerpo. La diversidad de anticuerpos se genera a través de una variedad de medios. Por ejemplo, la diversidad se puede generar mediante (1) múltiples genes de líneas germinales diferentes, (2) diversidad combinatoria, (3) diversidad de empalme que incluye (a) transposición imprecisa de ADN y (b) diversificación de la región N, (4) mediante combinaciones variables de proteínas de cadena pesada y de cadena ligera, y (5) mediante mutación somática (véase Abbas et al., "Cellular and Molecular Immunology Second Edition", Saunders Co., (1994); Paul, "Fundamental Immunology Third Edition", Raven press (1993). Mediante la inserción apropiada de la enzima o de la unidad catalítica funcional en la línea germinal, tales mecanismos de diversificación se imponen sobre la porción enzimática de la proteína enzimática del anticuerpo. Por ejemplo, las regiones V, D y J de un anticuerpo se pueden sustituir con secuencias de una enzima humana conocida. La configuración intrónica del locus del gen del anticuerpo se mantiene para fomentar la diversificación extensa. Por ejemplo, se mantienen las secuencias repetitivas (nanómera y heptámera) así como el espaciamiento intrónico (véase la Fig. 1).

La invención se refiere asimismo a la colocación y segmentación de la secuencia enzimática. Por ejemplo, aquellos dominios de la secuencia enzimática insertada que está localizada espacialmente en o alrededor del sitio activo, y/o aquellos residuos que pueden desempeñar un papel en la unión específica extensa al sustrato, se sitúan en aquellas regiones que son capaces de la mayor diversificación (por ejemplo, las regiones CDR). Por ejemplo, la quimiotripsina también se pliega en un barril beta antiparalelo igual que un dominio inmunoglobulínico (veánse las Figuras 2 y 3). El sitio activo y las regiones de especificidad por el sustrato están localizados en la secuencia proteínica que forman un puente en las hebras betas del barril beta, como lo están las regiones CDR en una región variable inmunoglobulínica.

La invención se refiere asimismo a un conjunto variable de estructuras de anticuerpos/enzimas quiméricas. En una realización, las secuencias enzimáticas sustituyen uno o múltiples dominios variables. Otras secuencias enzimáticas diferentes múltiples se pueden integrar en la línea germinal de manera análoga a las múltiples regiones variables V, D y J, para crear una línea germinal extensamente alterada y para aumentar la diversificación. En otra realización, la secuencia enzimática, que tiene secuencias espaciadoras y de señal intrónicas de región variable insertadas, se puede insertar en la línea germinal para incorporar el dominio enzimático como una fusión aminoterminal. En otra realización, tales fusiones enzimáticas aminoterminales pueden tener regiones variables de anticuerpos sustituidas con regiones inmunoglobulínicas constantes, limitando de ese modo la diversificación solamente a la región enzimática. En otra realización de la invención, las secuencias que codifican la funcionalidad enzimática se insertan en el locus del anticuerpo de la línea germinal de forma que la secuencia de la enzima se somete a diversificación de región variable de inmunoglobulina, pero no está enlazada covalentemente a un dominio de inmunoglobulina. Se puede utilizar y emplear en la invención, por el experto en la materia, una amplia variedad de estructuras diferentes.

La invención también se refiere a un método y secuencia de producción de anticuerpos catalíticos que usa los animales no humanos de línea germinal alterada de la invención. Por ejemplo, la inmunización con una variedad de diferentes tipos de TSA, inhibidores, y/o sustratos suicidas (véase Suzuki; Thorn; patentes U.S. nº 4.792.446, nº 4.963.355, nº 5.156.965 y nº 5.401.641) se puede llevar a cabo de manera secuencial para producir anticuerpos con afinidad creciente. En otra realización, después de la inmunización de los animales no humanos de la invención, se integra entonces transgénicamente una secuencia de anticuerpo enzimática resultante en la secuencia de línea germinal de otro animal no humano. Por ejemplo, esta técnica puede ser útil en la evolución iterativa por pasos de un anticuerpo catalítico. De este modo, se puede continuar el progreso evolutivo a un nivel de línea germinal.

El sistema inmunitario selecciona anticuerpos basándose en la afinidad de unión y/o en la cinética de unión. Se requiere una enzima con velocidades de recambio elevadas para unirse al agente reaccionante, para catalizar la formación del producto y liberar el producto para permitir el acceso de otro agente reaccionante al sitio activo funcional de la enzima. Mientras que una enzima con velocidad de recambio elevada requiere la liberación del producto, un anticuerpo se selecciona por la elevada afinidad de unión. En otra realización de la invención, la unidad funcional enzimática o catalítica, insertada transgénicamente, es alterada selectivamente con un conjunto relativamente pequeño de mutaciones para reducir sustancialmente la actividad catalítica (por ejemplo, la mutación de los restos de la triada catalítica de una serina proteasa). De esta manera, el sustrato de interés se puede usar como un antígeno, y se puede lograr la selectividad por el sustrato deseado. Después de la selección de la unión/selectividad, se invierte el pequeño conjunto de mutaciones (por ejemplo, mediante mutación específica, detección sistemática in vitro, selección, etc.), a fin de aumentar el recambio catalítico. El anticuerpo catalítico resultante se puede seleccionar adicionalmente usando un inhibidor enzimático, sustratos suicidas y/o TSA.

La invención se refiere a la inmunización iterativa de los animales no humanos de la invención con línea germinal alterada, y también a la inmunización simultánea con múltiples antígenos. La inmunización iterativa puede usar el mismo antígeno o antígenos diferentes para adaptar la progresión de la respuesta inmunitaria. Se pueden suministrar simultáneamente múltiples antígenos para inclinar a la respuesta inmunitaria según se desee. Existen muchas técnicas para el experto en la materia a fin de optimizar la producción de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden emplear adyuvantes para elevar la respuesta inmunitaria.

Los anticuerpos con actividad enzimática de la actual invención se pueden modificar con técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la información estructural tridimensional para diseñar racionalmente modificaciones de los anticuerpos catalíticos. En un ejemplo adicional, se pueden emplear la mutagénesis in vitro y la detección sistemática o selección para desarrollar adicionalmente los anticuerpos enzimáticos de la actual invención.

La pregeneración de un cierto nivel de diversidad puede ser ventajosa para la selección de la actividad enzimática deseada usando los métodos de la invención. A continuación siguen los ejemplos de métodos de mutagénesis para generar fragmentos génicos enzimáticos con mayor diversidad, generando un número de diferentes fragmentos génicos mutados para la incorporación en el sitio de múltiples elementos génicos inmunoglobulínicos, es decir, regiones V, D y/o J. En los locus de genes de inmunoglobulina, se usa la diversidad existente y se empareja con los métodos para la generación de la diversidad. De este modo, sería ventajoso introducir múltiples copias de los fragmentos enzimáticos de interés para potenciar el mecanismo de selección de diversidad de manera similar a como se usa en la generación de la diversidad de anticuerpos.

En la técnica se conocen diversos métodos de mutagénesis para la generación de diversidad. En un método, se obtiene una construcción génica sintética usando secuencias "dopadas" que contienen la secuencia del motor catalítico de interés, pero con las bases usadas en la síntesis de los oligonucleótidos "dopados" con las otras 3 bases a un nivel bajo, típicamente de 0,1-10%. En esta síntesis el sitio catalítico no está sometido a mutación, o está sometido a mutación solamente a un nivel más bajo con relación a las otras secuencias. Este método genera una familia de secuencias que están mutadas en cada base solamente 0,1-10% del tiempo, basándose en la secuencia original. Estos oligonucleótidos sintéticos se ensamblan entonces en el gen final usando diversos métodos estándares.

En un método alternativo, el gen de interés se construiría también como se esquematiza anteriormente usando oligonucleótidos sintéticos, pero ahora con porciones muy definidas de los sitios específicos que incorporan las secuencias que están totalmente al azar con respecto a los codones potenciales. Esto se puede lograr mediante el uso de bases mixtas usadas en la síntesis del oligonucleótido, o mediante el uso de codones prefabricados usados durante la síntesis de los oligonucleótidos para la síntesis génica. Estos fragmentos génicos mutados se someterían entonces a ensamblaje como se esquematiza anteriormente.

En otro método alternativo, el gen de interés también se construiría basándose en el uso de PCR, con bases limitantes o no naturales, para generar un fragmento génico con bases mutadas. Estos fragmentos génicos mutados se someterían entonces a ensamblaje como se esquematiza anteriormente.

En aún otro método alternativo, el gen de interés se construiría también basándose en el uso de métodos químicos para modificar las bases, es decir, sulfato de dimetilo, bisulfito, ácido fórmico, hidrazina, etc. Estos fragmentos génicos mutados se someterían entonces a ensamblaje como se esquematiza anteriormente.

El resultado de estos tipos de construcción génica es un conjunto de genes mixtos que entonces se pueden clonar en los locus inmunoglobulínicos usando diversos métodos conocidos en la técnica (véanse los ejemplos). Por ejemplo, los genes se pueden coligar con un conjunto de secuencias no codificantes de clones aisladas de los locus de la región V de inmunoglobulina. Como alternativa, se podrían usar otras secuencias "de relleno" basándose en el deseo de generar una serie de porciones de secuencias de genes de enzimas entremezcladas análogas a las familias de genes de la región V. Además, los fragmentos génicos se podrían insertar específicamente en lugar de las secuencias génicas de las regiones V, D ó J. Estos pseudolocus modificados y/o reconstruidos se clonarían entonces en un vector cósmido, y los clones se identificarían sistemáticamente por el tamaño y número de las porciones de secuencias de genes enzimáticos. El clon con el mejor número y tamaño de fragmento se sometería entonces a recombinación en los minilocus de genes de inmunoglobulinas en el vector YAC (véanse los ejemplos). Esta recombinación se lograría vía los fragmentos 5' y 3' (del sitio de inserción seleccionado) de los locus del gen de inmunoglobulina de elección.

Más adelante se tratará sobre sitios activos enzimáticos diméricos. La diversidad inmunoglobulínica y de los receptores de células T también es debida en parte a la diversidad combinatoria generada a partir de dos genes de región variable separados, es decir, regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de los locus de inmunoglobulina. El uso de los mecanismos de receptores de células T y de inmunoglobulinas para la generación de la diversidad está únicamente indicado para enzimas compuestas de dos secuencias (o subunidades) que juntas forman la enzima activa. Las dos subunidades podrían ser del mismo gen como un dímero, del mismo gen como una proteína fragmentada, o de dos genes diferentes. Los ejemplos de enzimas que forman un sitio activo en la interfaz de un homodímero son ornitina descarboxilasa, aspartato transcarbamilasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa, piruvato descarboxilasa, destiobiotina sintetasa y glucosa oxidasa (Alexeev D et al Structure 1994, 2; 1061. Ostetman A et al Biochemistry 1994, 33; 13662. Frimpong K et al 1994, 269; 1217. Dyda F et al 1993 32; 6165. Hecht HJ et al 1993; 229; 153). Estas enzimas que forman el sitio activo a partir de dos subunidades también generan dos sitios activos en el homodímero, o un sitio activo único cuando una de las proteínas en el dímero tiene una única mutación en el sitio activo.

En la presente invención los fragmentos de genes de enzimas se incorporarían tanto en los locus de cadena pesada y de cadena ligera como en los ratones generados a partir de las estirpes celulares de ES que contienen estos locus génicos modificados. Los locus modificados de cadena pesada y de cadena ligera se combinarían entonces mediante entrecruzamientos entre los ratones transgénicos. Los ratones transgénicos con ambos locus modificados serían capaces de este modo de expandir el nivel de diversidad posible a través de la diversidad combinatoria posible.

El experto en la materia apreciará que se puede utilizar una amplia variedad de animales no humanos para generar anticuerpos catalíticos. Por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cabras, oveja, vacas, etc., así como se pueden usar especies no mamíferas. Adicionalmente, el experto en la materia apreciará que se puede utilizar en la invención una amplia variedad de funcionalidades enzimáticas y familias de enzimas así como también enzimas específicas (patentes U.S. nº 4.792.446, nº 4.963.355, nº 5.156.965, nº 5.401.641, nº 5.229.272, nº 5.194.585 y nº 5.236.836).

Los siguientes ejemplos, que ilustran los métodos de la presente invención, utilizan los siguientes métodos y materiales.

Los ratones transgénicos derivan según Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory.

Los embriocitos indiferenciados se manipulan según los procedimientos publicados (Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E.J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987; Zjilstra et al., Nature 342:435-438 (1989); y Schwartzberg et al., Science 246:799-803 (1989).

Los procedimientos de clonación de ADN se llevan a cabo según J. Sambroak, et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2ª ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Las células de hibridomas y los anticuerpos se manipulan según "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Ejemplo I Incorporación de la porción 5' o aminoterminal de la enzima lisozima en la región de cadena pesada de la línea germinal de ratón, mediante recombinación, para permitir la reconstrucción y selección de enzimas activos usando los mecanismos de mutación somática y recombinación de inmunoglobulinas

Inicialmente, la región variable de cadena pesada de VH81X (ratón equivalente VH más próximo a la región D, Nature 311, 727-753, 1984) se aísla de una librería de fagos usando una sonda oligonucleotídica obtenida sintéticamente para identificar sistemáticamente un fago de librería lambda genómico derivado de ADN de hígado fetal de ratón (Stratagene). Este fragmento génico de región V se subclona entonces en un vector plásmido que contiene el gen de timidina quinasa (tk) del herpes simple accionado por el promotor del gen de fosfogliceratoquinasa (PGK) de ratón (documento WO 94/02602) para dar el vector pVH81X. El plásmido pVH81X se usa para permitir la subclonación de la porción 5' del gen de lisozima en lugar de la secuencia codificante de VH81X, pero manteniendo intactas las señales prepeptídicas y de recombinación. En este ejemplo, la porción 5' de la lisozima se extiende desde el aminoácido Lys 1 hasta Gly 71 (Lisozima EC3.2.1.17, Jung et al, "Exons Encode functional and structural units of chicken lysozyme", Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 77 (10), 5759-5763, 1980). Se comprenderá que se podrían situar diversas porciones de la enzima en este constructo, basándose en la ruta de recombinación deseada.

El constructo se obtiene usando PCR para generar tres fragmentos con solapamientos idénticos de secuencia para permitir la construcción secuencial del gen genómico quimérico.

Estos tres fragmentos son 1) la porción 5' del gen VH81X que incluye la región no codificante; 2) la porción 5' del gen de lisozima con secuencias de la región VH en los extremos 5' y 3' de los fragmentos después de la PCR; y 3) el extremo 3' del gen VH. La construcción consistiría en combinar 1) y 2) en la PCR con el cebador 5' procedente de la PCR 1) y el cebador 3' procedente de la PCR 2) para generar un fragmento que contiene las secuencias de 1) y 2). El producto de los fragmentos 1) y 2) de combinación a partir de la reacción de PCR se añaden a los productos de PCR 3), y el cebador 5' de la PCR 1) se combina con el cebador 3' de la PCR 3), y nuevamente se somete a PCR, dando esto como resultado el fragmento final de PCR que habría incorporado los fragmentos 1), 2) y 3) en un único fragmento. Este fragmento final que combina 1), 2) y 3), y que contiene la porción 5' de la lisozima en las secuencias genómicas del gen de región V de VH81X se clona entonces en pVH81X sustituyendo a la secuencia natural y generando el vector pVHLYS5 para la recombinación en la línea germinal del ratón. El plásmido pVHLYS5 está listo para la recombinación después de la inserción del gen neo en esta nueva secuencia genómica 3' al fragmento 3) generando pVHLYS5neo (véase la Fig. 5a).

Este vector de recombinación se construye de forma que al menos 1 kb de la secuencia genómica nativa flanquee el elemento génico VH81X modificado con la porción 5' de la secuencia de lisozima.

El vector pVHLYS5neo se linealiza y se usa para electroporación de la estirpe celular de embriocitos indiferenciados, usando métodos estándares. Las células procedentes de la transfección se seleccionan entonces en medios que contienen G418 para seleccionar el gen neo, y que contienen ganciclovir (Syntex) para seleccionar la pérdida del gen de timidina quinasa. Este protocolo de doble selección mejora la recuperación de los sucesos de recombinación homóloga dando como resultado la sustitución del gen VH81X. Las colonias resultantes se expanden entonces en ausencia del ganciclovir y se ensayan para determinar la inserción específica mediante análisis de transferencia Southern que genera un fragmento génico de nuevo tamaño que se hibrida con el fragmento génico 5' de la lisozima usado en la construcción del vector de recombinación.

Para una identificación sistemática de 300 estirpes celulares, aquellas con los fragmentos deseados se expanden y se someten a análisis posterior.

La extirpe celular con su porción 5' insertada del gen de lisozima, LYS5, se expande y está lista para una segunda ronda de electroporación para generar la estirpe celular final que contiene ambas porciones del gen de lisozima con las unidades de recombinación de cadena pesada.

Ejemplo II Incorporación de la porción 3' o carboxiterminal de la enzima lisozima en la región de cadena pesada de la línea germinal de ratón, mediante recombinación, para permitir la reconstrucción y selección de enzimas activos usando los mecanismos de mutación somática y de recombinación inmunoglobulínica

Inicialmente, las regiones J de cadena pesada de JH se aíslan de una librería de fagos usando una sonda oligonucleotídica obtenida sintéticamente para identificar sistemáticamente un fago de librería lambda genómico derivado de ADN de hígado fetal de ratón (Stratagene). Este fragmento génico de región JH se subclona entonces en un vector plásmido que contiene el gen de timidina quinasa (tk) del herpes simple mediante el promotor del gen de fosfogliceratoquinasa (PGK) de ratón (documento WO 94/02602) para dar el vector pJH. El plásmido pJH se usa para permitir la subclonación de la porción 3' del gen de lisozima en lugar de las cuatro secuencias codificantes de JH, pero manteniendo intactas ambas señales de recombinación. En este ejemplo, la porción 3' de la lisozima se expande desde el aminoácido Leu 75 hasta Leu 129. Se comprenderá que se podrían situar diversas porciones de la enzima en este constructo, basándose en la ruta de recombinación deseada.

El constructo se obtiene usando PCR para generar tres fragmentos con solapamientos idénticos de secuencia para permitir la construcción secuencial del gen genómico quimérico.

Estos tres fragmentos son 1) la porción 5' del racimo génico de JH (incluyendo la región no codificante a la mayoría de las señales de recombinación de 5'); 2) la porción 3' del gen de lisozima ahora con las secuencias de la región JH en los extremos 5' y 3' de los fragmentos; y 3) el extremo 3' del racimo del gen de JH que contiene la mayoría de la señal de recombinación en 3'. La construcción consistiría en combinar 1) y 2) en una PCR con el cebador 5' de la PCR 1) y el cebador 3' de la PCR 2) para generar un fragmento que contiene las secuencias de 1) y 2). El producto de los fragmentos 1) y 2) de combinación de la reacción de PCR se añaden a los productos de PCR 3), y el cebador 5' de la PCR 1) se combina con el cebador 3' de la PCR 3), y nuevamente se somete a PCR, dando esto como resultado el fragmento de PCR final que habría incorporado los fragmentos 1), 2) y 3) en un único fragmento. Este fragmento final, que combina 1), 2) y 3), y que contiene la porción 3' de la lisozima en las secuencias genómicas del gen de región de JH, se clona entonces en pJH sustituyendo a la secuencia natural y generando el vector pJHLYS3 para la recombinación en la línea germinal del ratón. El plásmido pJHLYS3 ya está listo para la recombinación después de la inserción del gen de higromicina en esta nueva secuencia genómica 3' al fragmento 3) generando pJHLYS3hyg (véase la Fig. 5b).

Este vector de recombinación se construye de forma que al menos 1 kb de la secuencia genómica nativa esté flanqueando el elemento del gen JH modificado con la porción 3' de la secuencia de lisozima.

El vector pJHLYS3hyg se linealiza y se usa para electroporación de la estirpe celular con su porción 5' insertada del gen de lisozima, LYS5, usando métodos estándares. Las células procedentes de la transfección se seleccionan entonces en medios que contienen higromicina, para seleccionar el gen hyg, y que contienen ganciclovir (Syntex) para seleccionar la pérdida del gen de timidina quinasa. Este protocolo de doble selección mejora la recuperación de los sucesos de recombinación homóloga dando como resultado la sustitución de la agrupación del gen JH. Las colonias resultantes se expanden entonces en ausencia de ganciclovir, y se ensayan para determinar la inserción específica mediante análisis de transferencia Southern que genera un fragmento génico de nuevo tamaño que se hibrida con el fragmento génico 3' de la lisozima usado en la construcción del vector de recombinación.

Para una identificación sistemática de 300 estirpes celulares, aquellas con los fragmentos deseados se expanden y se someten a análisis posterior.

La estirpe celular LYS53 se construye con los tres aminoácidos perdidos de la combinación de los fragmentos génicos 5' y 3' (Ser 72, Lys 73 y Asn 74), para permitir la incorporación de las regiones D en la ruta de recombinación. Esto crea un punto caliente para la mutagénesis en la estructura de la lisozima para esta combinación de fragmentos génicos 5' y 3'.

La estirpe celular con sus porciones 5' y 3' insertadas del gen de lisozima, LYS53, se expande lista para su uso. Esta célula podría formar la base de un nuevo ratón vía la generación de ratones y crías quiméricos. Como alternativa, esta estirpe celular se podría usar para el aislamiento de un fragmento génico que contiene los genes 5' y 3' de lisozima flanqueados por las secuencias nativas del ratón. Estos fragmentos génicos, cuando se colocan directamente en el núcleo de embriones de ratón de célula única, darían lugar a ratones que contienen los genes de inmunoglobulina mutados.

Ejemplo III Incorporación de la porción 5' o amino terminal de la enzima lisozima en la región de cadena ligera kappa de la línea germinal de ratón, mediante recombinación, para permitir la reconstrucción y selección de enzimas activos usando los mecanismos de mutación somática y de recombinación inmunoglobulínica

Inicialmente, la región variable de cadena ligera de VK se aísla de una librería de fagos usando una sonda oligonucleotídica obtenida sintéticamente para identificar sistemáticamente un fago de librería lambda genómico derivado de ADN de hígado fetal de ratón (Stratagene). Este fragmento génico de región V se subclona entonces en un vector plásmido que contiene el gen de timidina quinasa (tk) del herpes simple mediante el promotor del gen de fosfogliceratoquinasa (PGK) de ratón (documento WO 94/02602) para dar el vector pVK. El plásmido pVK se usa para permitir la subclonación de la porción 5' del gen de lisozima en lugar de la secuencia codificante de VK, pero manteniendo intactas las señales de recombinación y prepeptídica. En este ejemplo, la porción 5' de la lisozima se expande desde el aminoácido Lys 1 hasta Asn 74. Se entenderá que se podrían situar diversas porciones de la enzima en este constructo, basándose en la ruta de recombinación deseada.

El constructo se obtiene usando PCR para generar tres fragmentos con solapamientos idénticos de secuencia para permitir la construcción secuencial del gen genómico quimérico.

Estos tres fragmentos son 1) la porción 5' del gen de VL que incluye la región no codificante; 2) la porción 5' del gen de lisozima ahora con las secuencias de la región VL en los extremos 5' y 3' de los fragmentos; y 3) el extremo 3' del gen de VL. La construcción consistiría en combinar 1) y 2) en una PCR con el cebador 5' de la PCR 1) y el cebador 3' de la PCR 2) para generar un fragmento que contiene las secuencias de 1) y 2). El producto de la reacción de PCR que combina los fragmentos 1) y 2) se añade a los productos de PCR 3), y el cebador 5' de la PCR 1) se combina con el cebador 3' de la PCR 3), y nuevamente se somete a PCR, dando esto como resultado el fragmento de PCR final que habría incorporado los fragmentos 1), 2) y 3) en un único fragmento. Este fragmento final, que combina 1), 2) y 3), y que contiene la porción 5' de la lisozima en las secuencias genómicas del gen de región V de VL, se clona entonces en pVL sustituyendo a la secuencia natural y generando el vector pVKLYS5 para la recombinación en la línea germinal del ratón. El plásmido pVKLYS5 ya está listo para la recombinación después de la inserción del gen de neo en esta nueva secuencia genómica 3' al fragmento 3) generando pVKLYS5neo (véase la Fig. 6a).

Este vector de recombinación se construye de forma que al menos 1 kb de la secuencia genómica nativa esté flanqueando el elemento del gen VL modificado, con la porción 5' de la secuencia de lisozima.

El vector pVKLYS5neo se linealiza y se usa para electroporación de la estirpe celular embriónica, usando métodos estándares. Las células procedentes de la transfección se seleccionan entonces en medios que contienen G418, para seleccionar el gen neo, y que contienen ganciclovir (Syntex) para seleccionar la pérdida del gen de timidina quinasa. Este protocolo de doble selección mejora la recuperación de los sucesos de recombinación homóloga dando como resultado la sustitución del gen VL. Las colonias resultantes se expanden entonces en ausencia del ganciclovir, y se ensayan para determinar la inserción específica mediante análisis de transferencia Southern que genera un fragmento génico de nuevo tamaño que se hibrida con el fragmento génico 5' de la lisozima usado en la construcción del vector de recombinación.

Para una identificación sistemática de 300 estirpes celulares, aquellas con los fragmentos deseados se expanden y se someten a análisis posterior.

La estirpe celular con su porción 5' insertada del gen de lisozima, LYS5K, se expande lista para una segunda ronda de electroporación para generar la estirpe celular final que contiene ambas porciones del gen de lisozima dentro de las unidades de recombinación de cadena pesada.

Ejemplo IV Incorporación de la porción 3' o carboxi terminal de la enzima lisozima en la región de cadena ligera de la línea germinal de ratón, mediante recombinación, para permitir la reconstrucción y selección de enzimas activos usando los mecanismos de mutación somática y de recombinación inmunoglobulínica

Inicialmente, la región J de cadena pesada de JK se aísla de una librería de fagos usando una sonda oligonucleotídica obtenida sintéticamente para identificar sistemáticamente un fago de librería lambda genómico derivado de ADN de hígado fetal de ratón (Stratagene). Este fragmento génico de región JK se subclona entonces en un vector plásmido que contiene el gen de timidina quinasa (tk) del herpes simple mediante el promotor del gen de fosfogliceratoquinasa (PGK) de ratón (documento WO 94/02602) para dar el vector pJK. El plásmido pJK se usa para permitir la subclonación de la porción 3' del gen de lisozima en lugar de las cuatro secuencias codificantes de JK, pero manteniendo intactas ambas señales de recombinación. En este ejemplo, la porción 3' de la lisozima se expande desde el aminoácido Leu 75 hasta Leu 129. Se comprenderá que se podrían situar diversas porciones de la enzima en este constructo, basándose en la ruta de recombinación deseada.

El constructo se obtiene usando PCR para generar tres fragmentos con solapamientos idénticos de secuencia para permitir la construcción secuencial del gen genómico quimérico.

Estos tres fragmentos son 1) la porción 5' del racimo génico de JK (incluyendo la región no codificante a la mayoría de las señales de recombinación de 5'); 2) la porción 3' del gen de lisozima ahora con las secuencias de la región JK en los extremos 5' y 3' de los fragmentos; y 3) el extremo 3' del racimo del gen de JK que contiene la mayoría de la señal de recombinación de 3'. La construcción consistiría en combinar 1) y 2) en una PCR con el cebador 5' de la PCR 1) y el cebador 3' de la PCR 2) para generar un fragmento que contiene las secuencias de 1) y 2). El producto de la reacción de PCR que combina los fragmentos 1) y 2) se añade a los productos de PCR 3), y el cebador 5' de la PCR 1) se combina con el cebador 3' de la PCR 3), y nuevamente se somete a PCR, dando esto como resultado el fragmento de PCR final que habría incorporado los fragmentos 1), 2) y 3) en un único fragmento. Este fragmento final, que combina 1), 2) y 3), y que contiene la porción 3' de la lisozima en las secuencias genómicas del gen de región de JH, se clona entonces en pJK sustituyendo a la secuencia natural y generando el vector pJKLYS3 para la recombinación en la línea germinal del ratón. El plásmido pJKLYS3 ya está listo para la recombinación después de la inserción del gen de higromicina en esta nueva secuencia genómica 3' al fragmento 3) generando pJKLYS3hyg (véase la Fig. 6b).

Este vector de recombinación se construye de forma que al menos 1 kb de la secuencia genómica nativa esté flanqueando el elemento del gen de JK modificado, con la porción 3' de la secuencia de lisozima.

El vector pJKLYS3hyg se linealiza y se usa para electroporación de la estirpe celular con su porción 5' insertada del gen de lisozima, LYS5, usando métodos estándares. Las células procedentes de la transfección se seleccionan entonces en medios que contienen higromicina, para seleccionar el gen hyg, y que contienen ganciclovir (Syntex) para seleccionar la pérdida del gen de timidina quinasa. Este protocolo de doble selección mejora la recuperación de los sucesos de recombinación homóloga dando como resultado la sustitución de la agrupación del gen JH. Las colonias resultantes se expanden entonces en ausencia de ganciclovir, y se ensayan para determinar la inserción específica mediante análisis de transferencia Southern que genera un fragmento génico de nuevo tamaño que se hibrida con el fragmento génico 3' de la lisozima usado en la construcción del vector de recombina-
ción.

Para una identificación sistemática de 300 estirpes celulares, aquellas con los fragmentos deseados se expanden y se someten a análisis posterior.

La estirpe celular con sus porciones 5' y 3' insertadas del gen de lisozima, LYS53K, se expande lista para su uso. Esta célula podría formar la base de un nuevo ratón vía la generación de ratones y crías quiméricos. Como alternativa, esta estirpe celular se podría usar para el aislamiento de un fragmento génico que contiene los genes 5' y 3' de lisozima flanqueados por las secuencias nativas del ratón. Estos fragmentos génicos, cuando se colocan directamente en el núcleo de embriones de ratón de célula única, darían lugar a ratones que contienen los genes de inmunoglobulina mutados.

Ejemplo V Generación de quimeras de línea germinal.

Las estirpes celulares LYS53 y LYS53K de ES transfectadas se cultivaron siguiendo métodos estándares, se sometieron a tripsina y se resuspendieron en medio de inyección (DMEM 15% de suero fetal de ternera, 20 mM de HEPES, pH 7,3, antibióticos y 2-mercaptoetanol). Se obtuvieron blastocistos C57BL/6L (Jackson Labs, Bar, Harbor, ME) de tres días y medio a partir de hembras sobreovuladas de 4-5 semanas, siguiendo métodos estándares.

Se inyectan alrededor de 10 a 15 células en el blastocelo de cada blastocisto. Estas células de ES que contienen los blastocistos se transfieren quirúrgicamente entonces a una trompa de falopio de hembras pseudopreñadas de C57BL/6L X DBA/2 o C57BL/6L X CAB F1.

La contribución de las células ES a las crías se determina mediante el examen del color del pelo. Las crías quiméricas, en las que las células ES participan en la formación de los animales, tienen pelos que contienen pelambre de tipo agutí y cremoso.

La contribución de la línea germinal de los ratones quiméricos seleccionados se determinan apareándolos con ratones C57BL/6J y contando las crías F1 esperadas para el color agutí. Es de esperar que alrededor del 50% de los ratones agutíes hereden los locus génicos de cadena kappa o de cadena pesada mutados. La transmisión de la línea germinal se caracteriza adicionalmente por un análisis de transferencia Southern del ADN aislado de las colas de la progenie F1.

Estos ratones F1 se someten entonces a un entrecruzamiento para aislar los ratones homocigotos con respecto a los locus génicos de cadena kappa o de cadena pesada mutados. Estos ratones formarían ahora la base de una colonia de ratones para aislar la actividad de lisozima recombinada para determinar la especificidad alterada del sustrato, pero que aún retienen los restos Glu 35 y Asp 52 de sitio catalítico activos.

Ejemplo VI Método alternativo para generar los ratones transgénicos que contienen el sistema de recombinación enzimático

La generación de ratones transgénicos que contienen los locus génicos de cadena pesada modificada la enzima aislados de la estirpe celular LYS53 de ES.

La estirpe celular LYS53 se cultiva, y el minilocus de cadena pesada modificada se aísla como un fragmento que contiene el gen VH291 modificado, ahora con las secuencias 5' de lisozima, las secuencias genómicas de la región D, la región JH que ahora contiene la porción 3' de lisozima en lugar de los seis genes de JH, y la secuencia de cadena pesada mu. Este fragmento génico se aísla clonando en una librería de YAC y determinando sistemáticamente usando una sonda del gen de lisozima. Se hace crecer el clon de YAC con el menor número de genes 5' de VH extra al VH291 modificado (el gen VH más próximo 5' a la región JH), y el ADN se usa para transfectar una estirpe celular de ES. Los agentes transfectantes se seleccionan usando G418 para el gen neo presente en el gen modificado. Las estirpes celulares de ES resistentes resultantes se caracterizan entonces con respecto a la inserción génica deseada. El clon con los locus de cadena pesada modificada intactos se cultivan entonces y se usan para la generación de ratones quiméricos como se describe en el Ejemplo V. Los ratones resultantes contendrían el sistema de anticuerpos totalmente nativo en combinación con los minilocus de cadena pesada modificada.

Estos ratones de primera generación se cruzan entonces con ratones que son heterocigotos con respecto a un locus de cadena pesada de inmunoglobulina defectuosa (producida según los métodos estándares de WO 94/02602). Esto da como resultado una progenie que contiene la combinación de i) heterocigotos con respecto a una cadena pesada de inmunoglobulina defectuosa, y ii) los minilocus de cadena pesada modificada. Estas progenies con las dobles modificaciones se someten entonces a un entrecruzamiento que da como resultado la producción de un homocigoto con respecto a los locus de cadena pesada inactiva, pero que contiene los minilocus de cadena pesada modificada de lisozima (véase la Fig. 7).

En una alternativa a la ruta de crianza anterior, estos ratones de primera generación se cruzan entonces con ratones que son heterocigotos con respecto a un locus de cadena pesada de inmunoglobulina defectuoso y a un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (producidos según los métodos estándares de WO 94/02602). Esto da como resultado una progenie que contiene la combinación de i) heterocigotos con respecto a una cadena pesada de inmunoglobulina defectuosa y una cadena ligera kappa, y ii) los minilocus de cadena pesada modificada. Estas progenies con las dobles modificaciones se someten entonces a un entrecruzamiento que da como resultado la producción de un homocigoto con respecto a la cadena pesada inactiva y a los locus de cadena ligera pero que contienen los minilocus de cadena pesada modificada de lisozima (véase la Fig. 8).

Estos ratones con los genes de anticuerpos modificados dobles y triples están ahora listos para la selección de nuevas actividades catalíticas para lisozima basándose en la inmunización para conducir la recombinación y mutación somática de los nuevos minilocus de cadena pesada que contiene los fragmentos génicos de lisozima.

Ejemplo VII Método alternativo para generar los ratones transgénicos que contienen el sistema de recombinación enzimático

La generación de ratones transgénicos que contienen los locus génicos de cadena pesada modificada de la enzima aislados de la estirpe celular LYS53K de ES.

La estirpe celular LYS53K se cultiva, y el minilocus de cadena ligera modificada se aísla como un fragmento que contiene el gen VK modificado, ahora con 5' de lisozima, la región JK que ahora contiene la porción 3' de lisozima en lugar de los genes de JK, y la secuencia de cadena ligera kappa. Este fragmento génico se aísla clonando en una librería de YAC y determinando sistemáticamente usando una sonda del gen de lisozima. Se hace crecer el clon de YAC con el menor número de genes 5' de VK extra al VK modificado (el gen VK más próximo 5' a la región JK), y el ADN se usa para transfectar una estirpe celular de ES. Los agentes transfectantes se seleccionan usando G418 para el gen neo presente en el gen modificado. Las estirpes celulares de ES resistentes resultantes se caracterizan entonces con respecto a la inserción génica deseada. El clon con los locus de cadena pesada modificada intactos se cultivan entonces y se usan para la generación de ratones quiméricos como se describe en el Ejemplo V. Los ratones resultantes contendrían el sistema de anticuerpos totalmente nativo en combinación con los minilocus de cadena kappa modificada.

Estos ratones de primera generación se cruzan entonces con ratones que son heterocigotos con respecto a un locus de cadena ligera de inmunoglobulina defectuosa (producida según los métodos estándares de WO 94/02602). Esto da como resultado una progenie que contiene la combinación de i) heterocigotos con respecto a una cadena ligera de inmunoglobulina defectuosa, y ii) los minilocus de cadena ligera kappa modificada. Estas progenies con las dobles modificaciones se someten entonces a un entrecruzamiento que da como resultado la producción de un homocigoto con respecto a los locus de cadena ligera inactiva, pero que contiene los minilocus kappa de cadena ligera modificada de lisozima (véase la Fig. 9).

Estos ratones con la doble modificación están ahora listos para la selección de nuevas actividades catalíticas para lisozima basándose en la inmunización para conducir la recombinación y mutación somática de los nuevos minilocus de cadena pesada que contienen los fragmentos génicos de lisozima.

Ejemplo VIII Incorporación de la ribonucleasa A enzimática en la región de cadena pesada de los locus génicos de inmunoglobulina de ratón mediante recombinación en levadura para generar un minilocus para generación de ratones quiméricos que producen nuevas actividades de ribonucleasa

Fragmento 5' de ribonucleasa A procedente del aminoácido 1 a 68 (Ribonucleasa A EC 3.1.27.5, véase Borkakoti et al "The Refined Structure Of Ribonuclease-A at 1.45 Angstroms Resolution", J. Crystallographic Spectroscopy Res. 14, 467 1984).

El gen de ribonucleasa A se construye a partir de oligonucleótidos sintéticos de entre 50 y 70 bases de longitud. Todo el gen, incluyendo los sitios de restricción seleccionados, está codificado en 8 oligonucleótidos. El gen se ensambla y se liga seguido de PCR con los oligonucleótidos 5' y 3' para amplificar el fragmento génico ligado. El gen se clona entonces en un vector plásmido p5R. Se usa la PCR para generar dos fragmentos que corresponden a i) la porción 5' de la región variable de cadena pesada más próxima, que contiene el prepéptido y 800 bases 5', y ii) la porción 5' de la región variable de cadena pesada más próxima, que contiene las señales de recombinación y 800 bases 3' usando el clon YAC descrito en el Ejemplo 9 que contiene el fragmento génico de cadena pesada VH, D, JH y Mu. El fragmento 5' de PCR se clona en el sitio de restricción seleccionado, en el extremo 5' de la porción 5' del fragmento génico de Rnasa. El fragmento 3' de PCR se clona en el sitio de restricción seleccionado, en el extremo 3' de la porción 5' del fragmento génico de Rnasa. Este vector p5RREC se usa como la fuente del fragmento génico que contiene la porción 5' del gen rnasa flanqueado por el gen de inmunoglobulina. Este fragmento génico se clona entonces en medio vector YAC que incluye un marcador HIS3 seleccionable de levadura, no presente en el vector YAC original, un centrómero (CEN) y un telómero individual (TEL), para generar p5RRECY.

Fragmento 3' de ribonucleasa A procedente de aminoácidos 72 a 124 (véase Borkakoti).

El gen de ribonucleasa A se construye a partir de oligonucleótidos sintéticos de entre 50 y 70 bases de longitud. Todo el gen, incluyendo los sitios de restricción seleccionados, está codificado en 8 oligonucleótidos. El gen se ensambla y se liga seguido de PCR con los oligonucleótidos 5' y 3' para amplificar el fragmento génico ligado. El gen se clona entonces en un vector plásmido p3R. Se usa la PCR para generar dos fragmentos que corresponden a i) la porción 5' de la región de JH más próxima de 5', que contiene las señales de recombinación y 800 bases 5', y ii) la porción 3' de la región de JH más próxima de 3', que contiene las señales de recombinación y 800 bases 3' usando el clon YAC descrito en el Ejemplo 9 que contiene el fragmento génico de cadena pesada VH, D, JH y Mu. El fragmento 5' de PCR se clona en el sitio de restricción seleccionado, en el extremo 5' de la porción 5' del fragmento génico de Rnasa. El fragmento 3' de PCR se clona en el sitio de restricción seleccionado, en el extremo 3' de la porción 5' del fragmento génico de Rnasa. Este vector p3RREC se usa como la fuente del fragmento génico que contiene la porción 3' del gen rnasa flanqueado por el gen de inmunoglobulina.

El subclón de la región JH modificada, que contiene la porción 3' de la enzima de interés procedente de p3RREC, también se subclona en medio vector YAC que incluye un marcador LEU2 seleccionable de levadura, no presente en el vector YAC original, y un único TEL, dando lugar a p3RRECY.

Después de la construcción de estos vectores, el medio vector YAC, con el gen de VH modificado (p5RRECY), se linealiza y se usa para transformar una cepa de levadura que tiene las secuencias de cadena pesada de ratón deseadas de la cadena pesada de VH, D, JH y Mu. La selección en busca de prototropía de histidina da lugar a colonias de levadura que han sufrido una recombinación homóloga. El medio vector YAC que contiene la región JH modificada de la enzima, que contiene la porción 3' de la enzima de interés (p3RRECY), se linealiza entonces y se usa para transformar la cepa de levadura generada en la etapa previa. La selección en busca de prototropía de leucina da como resultado una cepa de levadura que contiene todo el locus de enzima/inmunoglobulina. Preferiblemente, ambas etapas de selección se pueden llevar a cabo juntas. Este YAC se aísla y se microinyecta en una célula ES, y la célula se somete a selección neo usando G418. La estirpe celular RNA35YAC resultante se usa entonces para generar un ratón quimérico como se describe anteriormente en el Ejemplo V. El ratón quimérico resultante se somete entonces a crianza a fin de generar ratones que produzcan la molécula quimérica de anticuerpo de enzima sin la producción de anticuerpos nativos. Los Ejemplos 6 y 7 describen protocolos de crianza para eliminar la expresión de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera endógena.

Ejemplo IX Este ejemplo describe un método alternativo para la clonación y la microinyección de un transgén de inmunoglobulina de cadena pesada/enzima en un cigoto murino

Los núcleos se aíslan de hígado de ratón, y se embeben en agarosa de bajo punto de fusión, y se destruyen por lisis con EDTA y proteinasa K que libera el ADN de peso molecular elevado. Este ADN de peso molecular elevado se somete entonces a digestión con enzimas de restricción que cortan para producir fragmentos grandes, es decir, Not1, etc.

Este ADN fragmentado de peso molecular elevado se somete entonces a electroforesis en gel de campo pulsado, y los fragmentos se analizan en busca de la combinación de la cadena pesada de VH, D, JH y Mu de ratón. Estos fragmentos se reúnen y se clonan en un vector YAC que contiene el marcador de resistencia a neo. Los clones de YAC se analizan, y aquellos con las secuencias de cadena pesada de ratón deseadas, de la cadena VH, D, JH y Mu, se usan en la serie de clonación posterior.

Los genes VH procedentes del clon de YAC seleccionado se subclonan en un vector plásmido, y se someten a reclonación dando como resultado la sustitución del gen VH con la porción enzimática de interés como se describe en el ejemplo 1 para producir el vector pVH5E. La región JH también se subclona en un vector plásmido y se somete a la inserción de la porción 3' de la enzima como se describe en el ejemplo 2, para producir el vector pJH3E.

El vector pVH5E se subclona entonces con el gen de VH modificado que contiene la porción 5' de la enzima de interés en un medio vector de YAC que incluye un marcador HIS3 seleccionable de levadura, no presente en el vector de YAC original, un centrómero (CEN) y un único telómero (TEL). El subclón de la región JH modificada, que contiene la porción 3' de la enzima de interés procedente de pJH3E, también se subclona en medio vector de YAC, que incluye un marcador LEU2 seleccionable de levadura, no presente en el vector de YAC original, y un único TEL. El medio vector de YAC, con el gen de VH modificado, se linealiza y se usa para transformar una cepa de levadura que tiene las secuencias de cadena pesada de ratón deseadas de la cadena pesada de VH, D, JH y Mu. La selección en busca de prototropía de histidina da lugar a colonias de levadura que han sufrido una recombinación homóloga. El medio vector YAC que contiene la región JH modificada de la enzima, que contiene la porción 3' de la enzima de interés, se linealiza entonces y se usa para transformar la cepa de levadura generada en la etapa previa. La selección en busca de prototropía de leucina da como resultado una cepa de levadura que contiene todo el locus de enzima/inmunoglobulina. Preferiblemente, ambas etapas de selección se pueden llevar a cabo juntas. Este YAC se aísla y se microinyecta en una célula ES, y la célula se somete a selección neo usando G418. La estirpe celular LYS53YAC resultante se usa entonces para generar un ratón quimérico como se describe anteriormente en el Ejemplo V. El ratón quimérico resultante se somete entonces a crianza a fin de generar ratones que produzcan la molécula quimérica de anticuerpo de enzima sin la producción de anticuerpos nativos. Los Ejemplos VI y VII describen protocolos de crianza para eliminar la expresión de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera endógena.

Ejemplo X Producción de diversidad enzimática usando los ratones transgénicos producidos en los ejemplos 5, 6, 7, 8 y 9. En los ejemplos 11, 12 y 13 a continuación se dan ejemplos específicos de inmunización para generar nuevas actividades

La inmunización de los ratones que tienen el ADN de enzima/inmunoglobulina integrado se realiza con inyecciones de un antígeno en adyuvante. Estos antígenos pueden ser análogos del estado de transición, o sustratos o productos o combinaciones en un único inmunógeno. Estos diversos inmunógenos se pueden usar solos o en combinaciones secuenciales que están destinadas a enfocar el desarrollo de la diversidad enzimática estimulada por el protocolo de inmunización. Los ratones se revacunan con antígeno 14 días después de la inmunización primaria. Típicamente, esto también es seguido de inmunizaciones en los días 34 y 50. La respuesta de los ratones es seguida con sangrías realizadas sobre los animales inmunizados, para ensayar la actividad específica de las respuestas enzimáticas frente al sustrato de interés. La sangre del ratón se somete a una etapa de purificación basada en la secuencia de cadena pesada Mu en el COOH terminal de las enzimas recombinadas o de la cadena ligera Kappa dependiendo del ratón transgénico específico usado en la inmunización. Típicamente, esta purificación haría uso de anticuerpos específicos antiinmunoglobulina de ratón sobre perlas u otra fase sólida para llevar a cabo una purificación rápida y eficaz.

Los ratones con la actividad enzimática deseada más elevada se sacrifican, y se retiran los bazos para la generación de los hibridomas que segregan la actividad enzimática deseada.

Las células de los mielomas se usan como el compañero de fusión para generar los hibridomas, siguiendo los métodos estándares. Un día antes de la fusión, las células se dividen en medio reciente que contiene 10% de suero fetal de ternera, a una concentración de 5 x 10^{5} células/ml. En la mañana de la fusión, las células se diluyen con un volumen igual de medio suplementado con 20% de suero fetal de ternera y 2X disolución de OPI (3 mg/ml de oxaloacetato, 0,1 mg/ml de piruvato sódico y 0,4 IU/ml de insulina).

Después de sacrificar al ratón, se retira asépticamente el bazo y se coloca en una placa con medio de cultivo. Las células se separan hasta que el bazo está en piezas finas y la mayoría de las células han sido eliminadas.

Las células se lavan en medio estéril reciente, y se deja que sedimenten los grumos. Los esplenocitos se lavan adicionalmente dos veces mediante centrifugación en un medio sin suero. Durante el segundo lavado, las células de mielomas también se lavan en un tubo separado. Después del lavado final, los dos peletes celulares se combinan y se centrifugan una vez juntos. A cada pelete celular se le añade una disolución de 50% de polietilenglicol (PEG), mientras que las células se resuspenden, durante un total de dos minutos. Se añaden 10 ml de medio precalentado a la disolución celular, mezclando lentamente durante 3 minutos. Las células se centrifugan y se elimina el sobrenadante. Las células se resuspenden en 10 ml de medio suplementado con 20% de suero fetal de ternera, 1X de disolución OPI y 1X de disolución AH (58 \muM de azaserina, 0,1 mM de hipoxantina). Las células fundidas se reparten en partes alícuotas en placas de 96 pocillos, y se cultivan a 37ºC durante una semana. El sobrenadante se recoge asépticamente de cada pocillo y se reúne en grupos. Estos grupos se ensayan en busca de actividad enzimática frente al sustrato. Los conjuntos positivos se ensayan adicionalmente para pocillos individuales. Cuando se ha identificado un pocillo positivo, las células se transfieren desde la placa de 96 pocillos a 0,5 ml de medio suplementado con 20% de suero fetal de ternera, 1X de OPI, y 1X de AH, en una placa de 24 pocillos. Cuando ese cultivo se pone denso, las células se expanden en 5 ml, y después en 10 ml. En esta etapa, las células se subclonan de forma que sólo exista en el cultivo una única célula productora de enzima/anticuerpo. Estos cultivos pueden formar la base de la producción de la nueva actividad enzimática, o la fuente de información genética para el desarrollo de sistemas de expresión y producción alternativos para la actividad enzimática, usando métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo XI Generación de aumento de actividad de lisozima y aumento de diversidad de secuencias

En este ejemplo, los ratones transgénicos para la fusión de lisozima/anticuerpo son estimulados con el sustrato natural "NAG NAM NAG NAM NAG NAM" para la enzima acoplada a KLH. También se usa como inmunógeno el inhibidor natural NAG-lactona acoplado a KLH. Esto formó la base del sistema de ensayo para ver la estimulación de la recombinación génica de lisozima y la recuperación de la lisozima activa.

Los ratones transgénicos se inmunizan con inmunógenos descritos anteriormente según el Ejemplo 10. Los hibridomas activos se someten entonces a amplificación mediante PCR del gen de lisozima, seguido de la secuenciación mediante métodos estándares (Clontech, Palo Alto, CA). Se encuentra que los genes de lisozima procedentes de los ratones estimulados muestran un nivel significativo de variabilidad de secuencias, demostrando la capacidad del sistema para generar diversidad enzimática mediante estimulación directa.

Ejemplo XII Generación de diversidad en los ratones transgénicos productores de inmunoglobulina de ribonucleasa

En este ejemplo, se estimulan a los ratones transgénicos de ribonucleasa/inmunoglobulina tanto con el ARN sustrato natural como con el sustrato de transición de uridina-vanadato acoplado a KLH después de la oxidación con peryodato de los cis-dioles en el anillo de ribosa seguido de la formación de una base de Schiff con los grupos amino de KLH y reducción con borohidruro de sodio. Los ratones quiméricos se inmunizan siguiendo los protocolos generales esquematizados anteriormente.

Los ratones se identifican sistemáticamente en busca de niveles crecientes de la actividad de anticuerpo de ribonucleasa quimérico después del aislamiento selectivo del anticuerpo usando reactivos anti-anticuerpo sobre perlas. Se encuentra que esto es importante debido a los niveles endógenos de ribonucleasa encontrados en el suero.

Los hibridomas aislados de estas inmunizaciones se estudian en busca tanto de la actividad enzimática como de las secuencias de la ribonucleasa. Se encuentran diferencias significativas en las secuencias y actividades específicas de los clones de las moléculas quiméricas de ribonucleasa/anticuerpo.

Ejemplo XIII Generación de una nueva actividad de lisozima basada en la inmunización del estado de transición

En este ejemplo, el inmunógeno usado para estimular la generación de la diversidad enzimática se basa en el análogo del estado de transición de amidina, previamente descrito (documento WO 93/02703). Se conocen otras alternativas para este estado de transición, por ejemplo, NAG-lactona, 1-aminogalactósido y galactal. El hapteno de amidina imita el estado de transición para la hidrólisis de enlaces glicosídicos, y representa una buena estructura central de un inmunógeno para estimular el desarrollo del repertorio de lisozima. La amidina específica se prepara para que concuerde con el sustrato de galactosa para permitir la generación y selección de una actividad de galactosidasa a partir de ratones productores de lisozima/anticuerpo. Estos inmunógenos se generan típicamente como una serie, siendo el grupo R un número de diversas elecciones. En este caso, se centró en el uso de ribosa y desoxirribosa acoplada al soporte de proteína. Este inmunógeno de amidina se acopla al soporte de proteína típicamente hemocianina de lapa, para mejores resultados. El programa de inmunización se lleva a cabo como se ilustra en el protocolo general del Ejemplo 10 anterior. El suero -procedente de los animales inmunizados se ensaya durante la inmunización usando un sustrato quimioluminiscente de galactosidasa (Tropix, Cambridge, MA). Los animales que muestran la mayor actividad se usan para la fusión con la estirpe de hibridoma como se describe anteriormente.

El experto en la materia apreciará que se pueden emplear diversas combinaciones de las técnicas identificadas anteriormente, para poner en la práctica la invención reivindicada.

Claims (22)

1. Método para generar anticuerpos catalíticos que tienen una actividad enzimática, que comprende:

(a)

aislar una secuencia de una unidad catalítica funcional a partir de una enzima;

(b)

insertar dicha secuencia en una línea germinal de un animal no humano, de forma que tal secuencia sufra una diversificación de la región variable de anticuerpo; e

(c)

identificar los anticuerpos generados con dicha actividad enzimática.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además, después de la etapa (b) pero antes de la etapa (c), una etapa adicional de inmunización de dicho animal no humano con un inmunógeno.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho inmunógeno se selecciona de entre el grupo que consta de un análogo del estado de transición unido a un sustrato de interés en el sitio de acción catalítica, y un análogo del estado de transición unido a un análogo del sustrato de interés.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho inmunógeno se selecciona de entre el grupo que consta de un inhibidor enzimático, un inhibidor enzimático unido a un sustrato de interés en el sitio de acción catalítica y un inhibidor enzimático unido a un análogo del sustrato de interés.

5. Método según la reivindicación 2, en el que dicho inmunógeno se selecciona de entre el grupo que consta de un inhibidor de sustrato suicida, un inhibidor de sustrato suicida unido a un sustrato de interés en el sitio de acción catalítica y un inhibidor de sustrato suicida unido a un análogo del sustrato de interés.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dichos anticuerpos catalíticos son anticuerpos quiméricos, y en el que dicha etapa de inserción de dicha secuencia comprende sustituir una secuencia que codifica un dominio de anticuerpo.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende además, después de la etapa (b) pero antes de la etapa (c), una etapa adicional de inmunización de dicho animal no humano con un inmunógeno.

8. Método según la reivindicación 7, en el que se integran múltiples unidades catalíticas funcionales diferentes, o componentes de las mismas, en la línea germinal de un animal no humano.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dichas unidades catalíticas funcionales, o componentes de las mismas, se separan mediante secuencias intrónicas de región variable de inmunoglobulina.

10. Método según la reivindicación 7, que comprende además un procedimiento repetido iterativamente, en el que una secuencia que codifica el producto de una iteración es la secuencia integrada en una línea germinal de un animal no humano en la siguiente iteración.

11. Método según la reivindicación 7, en el que dicha secuencia, cuando se expresa, está fusionada al término amino de una cadena de inmunoglobulina.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha cadena de inmunoglobulina carece de una región variable.

13. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha secuencia se inserta en un cromosoma artificial de levadura.

14. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha unidad catalítica funcional es una enzima completa o una porción de una enzima completa.

15. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha unidad catalítica funcional es una enzima inactivada.

16. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha secuencia está insertada transgénicamente en una línea germinal de un animal no humano, y la secuencia de línea germinal de anticuerpo endógeno está silenciada o eliminada.

17. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha identificación de los anticuerpos generados es un procedimiento seleccionado de entre el grupo que consta de identificación sistemática, selección y aislamiento.

18. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha secuencia es de origen humano.

19. Método según la reivindicación 1, 2, 6 ó 7, en el que dicha secuencia es de origen humano, y dichos anticuerpos generados son anticuerpos de tipo humano.

20. Método según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia se inserta en un locus de gen de anticuerpo de un animal no humano.

21. Método según la reivindicación 20, que comprende además, después de la etapa (b) pero antes de la etapa (c), una etapa adicional de inmunización de dicho animal no humano con un inmunógeno.

22. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho anticuerpo catalítico es un anticuerpo quimérico, y en el que dicha etapa de inserción de dicha secuencia comprende sustituir una secuencia que codifica un dominio de anticuerpo.