WO2005121324A1 - Ｅｓ細胞の変異方法およびシステム - Google Patents

Ｅｓ細胞の変異方法およびシステム Download PDF

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WO2005121324A1
WO2005121324A1 PCT/JP2005/010436 JP2005010436W WO2005121324A1 WO 2005121324 A1 WO2005121324 A1 WO 2005121324A1 JP 2005010436 W JP2005010436 W JP 2005010436W WO 2005121324 A1 WO2005121324 A1 WO 2005121324A1
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cells
stem cell
cell
stem cells
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PCT/JP2005/010436
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Junji Takeda
Kosuke Yusa
Kyoji Horie
Original Assignee
Osaka University
Carna Biosciences, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases

Definitions

  • the present invention relates to a technique for modifying a stem cell. More specifically, the present invention relates to a method and system for freely mutagenizing stem cells (for example, embryonic stem cells, and stem cells obtained thereby).
  • stem cells for example, embryonic stem cells, and stem cells obtained thereby.
  • ES cells multipotent embryonic stem cells
  • knock-out mice have been noted for their usefulness because they can be produced from ES cells by gene targeting.
  • Non-patent literature l Kyba, M. and Daley, G. Q., Exp. Hematol. 31: 994-: 1006 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Kim, J.H., et al., Nature 418: 50 ⁇ 56 (2002)
  • Non-Patent Document 3 Parisi, S. et al., J. Cell Biol. 163: 303-314 (2003)
  • Non-Patent Document 4 Reubinoff, BE, Pera, MF, Fong, CY, Trouson, A. and Bongso, A., Nature Biotechnol. 18: 399 ⁇ 404 (2000)
  • Non-Patent Document 5 Thomson, J.A., et al., Science 282: 1145-1147 (1998) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a technique for providing a stem cell having a mutation in both alleles (bialleles).
  • the problem was solved by unexpectedly finding that genome-wide mutagenesis was possible in ES cells such as S cells.
  • the present invention provides the following.
  • the present invention provides a stem cell having mutations inserted in both chains of the allele.
  • the stem cell is an embryonic stem cell.
  • the stem cells have been modified such that the Bloom syndrome (Blm) gene has been lost, lost, or not functioning.
  • Blm Bloom syndrome
  • the Bloom syndrome gene includes the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the present invention provides a library of stem cells in which mutations have been inserted into both chains of an allele, wherein the stem cells contained in the library include the above-described stem cells throughout the genome. Provide a library into which a mutation has been introduced.
  • the stem cells are embryonic stem cells.
  • the stem cells are modified such that the Bloom syndrome gene has been lost, lost, or not functioning.
  • the Bloom syndrome gene comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the present invention relates to a stem cell in which a mutation is introduced into both chains of an allele.
  • a method for producing a cell comprising: A) providing a stem cell; B) disabling a Bloom syndrome gene in the stem cell; and C) inducing a mutation in the stem cell. Provide a way.
  • the Bloom syndrome gene is treated so as not to function temporarily.
  • the Bloom syndrome gene is treated so as not to function temporarily in the presence of a drug.
  • the agent is selected from the group consisting of tetracycline, doxycycline, estrodidin derivatives and prodistrone derivatives.
  • the mutagenesis is selected from the group consisting of exposure to a mutagen, use of a transposon gene, exposure to ultraviolet light, and exposure to radiation.
  • the method further includes a step of inducing homologous recombination.
  • the method further includes a step of inducing homologous recombination in the 4N phase of the cell and causing cell division after the induction.
  • the stem cells are embryonic stem cells.
  • the embryonic stem cells are mammalian embryonic stem cells.
  • the present invention provides a stem cell prepared by the method of the present invention.
  • the stem cells are embryonic stem cells.
  • the present invention provides a tissue obtained from the stem cell of the present invention or the stem cell prepared by the method of the present invention.
  • the present invention provides an organism obtained from the stem cell of the present invention or the stem cell prepared by the method of the present invention.
  • the present invention provides use of a Bloom syndrome gene or a variant thereof for mutation of a stem cell.
  • the Bloom's syndrome gene in the use of the present invention is modified so that the stem cell loses or loses its function or does not function.
  • the Bloom syndrome residue used in the use of the present invention is The gene includes system 1J described in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • the present invention provides use of a Bloom syndrome gene or a variant thereof for producing a composition for mutating stem cells.
  • the Bloom's syndrome gene in the use of the present invention is modified so that it loses power in the stem cell or does not function.
  • the Bloom syndrome gene used in the use of the present invention comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof.
  • Blm tet tetracycline
  • ES mouse embryonic stem
  • N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenesis and transient loss of Blm expression has enabled the generation of ES cell libraries with biallelic mutations throughout the genome.
  • This library is evaluated by screening for mutations in the biosynthesis of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors, which contain at least 23 genes widely distributed throughout the genome. While mutants from 12 separate genes were obtained, two unknown mutants were isolated at the same time.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • the present invention provides efficient phenotype-based genetic screening, and provides efficient techniques in identifying gene function in ES cells.
  • the present invention also allows for phenotype-based analysis of the entire genome in ES cells.
  • FIG. 1 shows conditional production of Blm allele and increase in SCE in ES cells.
  • Figure la shows the targeting strategy and the resulting Blm allele.
  • a tet cassette containing the neo gene or puro gene was inserted upstream of the translation initiation site of Blm to create Blm tetN or Blm tetP , respectively. After the expression of Cre, these choices are lost, resulting in Blm tet .
  • B represents BamHI and S represents Sacl.
  • Abbreviations for the et cassette are described in Bond, CT et al., Science 289: 1942-1946 (2000).
  • Panel lb shows Southern blot analysis of targeted clones.
  • Genomic DNA was digested with BamHI, fractionated by electrophoresis, and hybridized with the radiolabeled probe shown in Figure la.
  • Figure lc shows a long-term Western blot analysis of Blm expression in Blm tet / tet ES cells. The expression level of ⁇ -actin (Actb) was used as a loading control.
  • Figure Id shows a short-term Western blot analysis of Blm expression in Blm tet / tet ES cells. The expression level of ⁇ -actin (Actb) was used as a loading control.
  • Figure l e shows the SCE Blm tet / tet ES cells (lower panel) or untreated Blm tet / tet ES cells dox treated (upper panel).
  • FIG. 2 shows high frequency LOH in Blm-deficient ES cells.
  • FIG. 2a is a schematic diagram of the LOH mechanism. The heterojunction is represented as A / a. If homologous recombination occurs between homologous chromosomes in the 4N phase, cells with LOH (A / A or a / a) appear after cell division.
  • FIG. 2b shows a Luria-Delbruck variation analysis of LOH. The duplication frequency of the Fasl locus having the neo gene was examined.
  • FIG. 2c shows polymorphic S SLP marker analysis of 28 dimorphic variants at the Fasl locus. Open squares and black squares indicate heterozygous and LOH, respectively.
  • FIG. 3 shows the construction of a mutant ES cell library and screening of mutants lacking GPI anchor. Show leaning strategy.
  • FIG. 3a is a schematic diagram of screening of a GPI anchor-deficient mutant derived from an ES library having a dimorphic mutation.
  • Figure 3b is a theoretical prediction of the effectiveness of this screening strategy.
  • # 1 Number of surviving cells after ENU treatment of 2 ⁇ 10 8 ES cells.
  • # 2 Frequency of X-linked Hprt-negative cells, measured as a percentage of 6—TG-resistant colonies.
  • # 3 Mutation ratio of L ⁇ H described in FIG. 2b.
  • # 4 Number of generations (cell cycle) during dox treatment. Numbers in parentheses indicate the total number of cell divisions during dox treatment.
  • # 5 "frequency” represents the frequency of clones with a two polymorphic mutation per locus (2. 3 X 1 0_ 4 X 1/2400 X 7).
  • # 6 Indicates the number of independent clones having dimorphism per locus after dox treatment.
  • FIG. 4 shows an analysis of a GPI anchor deficient mutant.
  • Figure 4a shows the complementation analysis of GPI anchor deficient mutants. GPI-anchored GFP protein was expressed on the cell surface of PigA-deficient ES cells only when PIGA cDNA was supplied (right panel). The left panel shows wild-type ES cells transfected with GFP-GPI as a positive control.
  • FIG. 4b shows the chromosomal location of 23 genes for GPI anchor biosynthesis. The red arrows indicate the 12 genes of the mutants obtained in this screening; the black arrows indicate the 11 genes of the mutants not obtained; * indicates that the cDNA was not obtained. Indicates those that have already been cloned but have not been released.
  • FIG. 4a shows the complementation analysis of GPI anchor deficient mutants. GPI-anchored GFP protein was expressed on the cell surface of PigA-deficient ES cells only when PIGA cDNA was supplied (right panel). The left panel shows wild-type ES cells transfected with
  • FIG. 4c shows the chromosome number of the mutant gene and the number of obtained mutants.
  • the order of the mutant genes on each chromosome is from centromere to telomere. Indicates a mutant containing the same mutation; *** indicates a mutant containing another mutation.
  • the numbers in parentheses indicate the number of mutants having the same mutation.
  • FIG. 4d shows a sequencing analysis of the mutations in PigH. Homozygous mutations have been demonstrated.
  • FIG. 4e shows a sequencing analysis of mutations in GPI8. Homozygous mutations have been demonstrated.
  • FIG. 4f shows a FACS analysis of the two novel mutants.
  • ES cells were stained with a biotinylated anti-HSA antibody (light, line) and anti-Thy_1 antibody (dark, line) and subsequently treated with streptavidin-PE.
  • HSA and Thy-1 are GPI anchor proteins.
  • the dashed line shows the outline of the control staining without the biotinylated antibody (upper panel).
  • the lower panel shows the expression pattern of E-cadherin, a non-GPI anchor protein.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleic acid sequence of the bloom (Blm) gene.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the bloom gene.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleic acid sequence of the tetracycline conditionally regulated B1 m allele cassette used in Example 1.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleic acid sequence of the mutant neo gene.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the mutant neo gene.
  • the term "cell” is defined in the same broad sense as used in the art, and is a constituent unit of a tissue of a multicellular organism, and is wrapped in a membrane structure that isolates the outside world. Rarely, it refers to an organism that has a self-renewal ability inside and has genetic information and its expression mechanism.
  • the cell used in the present specification may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fusion cell, a genetically modified cell).
  • the source of cells can be, for example, a single cell culture, or a cell from embryos, blood, or body tissues of a normally grown transgenic animal, or cells from a normally grown cell line. Such cell mixtures include, but are not limited to.
  • the "4N phase" of a cell refers to the time when the chromosome abundance of the cell is twice (2n) normal. Such periods include, but are not limited to, the G2 phase of the cell cycle. Not. Whether a cell is in the 4N phase can be determined by staining the chromosome with Propidium Iodide (PI).
  • PI Propidium Iodide
  • stem cell has a self-renewal ability, is multipotent (ie, pluripotent).
  • a stem cell can be, but is not limited to, an embryonic stem (ES) cell or a tissue stem cell (also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell).
  • ES embryonic stem
  • tissue stem cell also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell.
  • artificially generated cells eg, the fused cells, reprogrammed cells, etc. described herein
  • Embryonic stem cells are pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to the production of knockout mice since 1989.
  • Tissue stem cells unlike embryonic stem cells, are cells in which the direction of differentiation is limited, exist at specific positions in tissues, and have an undifferentiated intracellular structure. Thus, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have poor intracellular organelles with a high nuclear / cytoplasmic ratio. Tissue stem cells are generally pluripotent and maintain their proliferative potential for more than one lifetime in individuals whose cell cycle is slow. As used herein, the stem cells may preferably be embryonic stem cells, although tissue stem cells may be used where appropriate.
  • tissue stem cells When classified according to the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, skin system, digestive system, bone marrow system, nervous system and the like.
  • Skin tissue tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells.
  • Gastrointestinal tissue stem cells include knee (common) stem cells and hepatic stem cells.
  • myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells.
  • Tissue stem cells of the nervous system include neural stem cells and retinal stem cells.
  • “somatic cells” are cells other than germ cells such as eggs and sperm, and refer to all cells that do not directly transfer their DNA to the next generation. Somatic cells usually have limited pluripotency or disappear.
  • Cells are classified according to their origin into stem cells derived from ectoderm, mesoderm and endoderm. obtain.
  • the cells derived from the ectoderm mainly exist in the brain, and include neural stem cells and the like.
  • Mesodermal-derived cells mainly exist in the bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • Endoderm-derived cells are mainly present in organs and include hepatic stem cells, knee stem cells, and the like. As used herein, somatic cells can be from any germ layer.
  • isolated refers to a substance that naturally accompanies at least a reduced amount in a normal environment, and preferably is substantially free of the substance.
  • an isolated cell refers to a cell that is substantially free from other attendant materials (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) in the natural environment.
  • isolated refers to, for example, when substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology, and when chemically synthesized.
  • the isolated nucleic acid is preferably a sequence that naturally flanks the nucleic acid in the organism from which it is derived (ie, the sequence IJ located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid). Not included.
  • an "established” or “established” cell refers to a cell that maintains a specific property (eg, pluripotency) and that is cultured under culture conditions. A state in which stable growth is maintained. Therefore, the established stem cells maintain pluripotency. In the present invention, it is preferable to use the established stem cells, since the step of newly collecting stem cells from the host can be avoided.
  • a specific property eg, pluripotency
  • non-embryonic refers to not being directly derived from an early embryo. Therefore, cells derived from parts of the body other than the early embryo fall under this category, but cells obtained by modifying embryonic stem cells (eg, genetic modification, fusion, etc.) are also within the range of non-embryonic cells. It is in.
  • the term "differentiated (differentiated) cell” refers to a cell having a specialized function and morphology (eg, a muscle cell, a nerve cell, etc.). No or almost no gender.
  • the differentiated cells include, for example, epidermal cells, parenchymal cells, duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, and pigments Cells, smooth muscle cells, adipocytes, bone cells, chondrocytes, etc.
  • differentiation refers to a morphologically and / or functionally qualitative difference among daughter cell populations resulting from the division of one cell.
  • a phenomenon in which two or more types of cells occur. Therefore, differentiation also includes the process by which a cell population (cell lineage) derived from a cell for which a specific characteristic cannot be detected originally exhibits distinct characteristics such as production of a specific protein.
  • cell differentiation is generally considered to be a state in which a specific gene group in the genome is expressed. By searching for factors or conditions inside or outside the cell that cause such a gene expression state, cell differentiation is performed. Can be identified.
  • the consequences of cell differentiation are in principle stable, especially in animal cells, where differentiation to another type of cell occurs only exceptionally.
  • pluripotency or “pluripotency” is used interchangeably and refers to a property of a cell, which can differentiate into one or more, preferably two or more various tissues or organs. Ability. Therefore, “pluripotency” and “pluripotency” are used interchangeably with “undifferentiated” in this specification unless otherwise specified. Normally, cell pluripotency is limited as development progresses, and in adults, the constituent cells of one tissue or organ rarely change into cells of another. Thus pluripotency is usually lost. In particular, epithelial cells are unlikely to change into other epithelial cells. When this happens, it is usually a pathological condition and is called metaplasia.
  • Embryonic stem cells are pluripotent.
  • Tissue stem cells are pluripotent.
  • the pluripotency the ability to differentiate into all kinds of cells constituting a living body such as a fertilized egg is called totipotency, and the pluripotency can include the concept of totipotency. Whether a certain cell has pluripotency includes, but is not limited to, formation of an embryoid body (Embryoid Body) in an in vitro culture system, culture under conditions for inducing differentiation, and the like.
  • Assay methods for determining the presence of pluripotency using living organisms include the formation of teratomas (teratomas) by transplantation into immunodeficient mice, the formation of chimeric embryos by injection into blastocysts, and the Examples include, but are not limited to, transplantation and proliferation by infusion into ascites.
  • organ or “organ” is used interchangeably and refers to the meaning of an individual organism.
  • an organ is composed of several tissues having a specific spatial arrangement, and a tissue is composed of many cells.
  • Such organs or organs include those associated with the vasculature.
  • the organs targeted by the present invention include skin, blood vessels, cornea, kidney, heart, liver, umbilical cord, intestine, nerve, lung, placenta, knee, brain, peripheral extremities, retina and the like. But not limited to them.
  • cells differentiated from the pluripotent cells of the present invention include epidermal cells, ⁇ parenchymal cells, ⁇ duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, and skeletal myoblasts.
  • Examples include, but are not limited to, cells, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells, smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes and the like.
  • tissue refers to a cell population having substantially the same function and / or morphology in a multicellular organism.
  • a “tissue” can be referred to as a tissue, even if it is a population of cells of the same origin but of different origins, if they have the same function and / or morphology. Therefore, when regenerating a tissue using the stem cell of the present invention, a cell population having two or more different origins can constitute one tissue.
  • tissue forms part of an organ. Animal tissues are classified into epithelial tissues, connective tissues, muscle tissues, nervous tissues, etc. based on morphological, functional or developmental grounds. Plants are roughly classified into meristems and permanent tissues according to the stage of development of the constituent cells, and are classified into single tissues and complex tissues according to the type of the constituent cells.
  • protein As used herein, the terms "protein,”"polypeptide,””oligopeptide,” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. .
  • This polymer may be linear or branched or cyclic.
  • the amino acid may be a natural or non-natural amino acid or a modified amino acid.
  • the term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also includes natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, dalycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • poly encompasses polypeptides (eg, including unnatural amino acids and the like), peptidomimetic compounds (eg, peptoids), and other modifications known in the art.
  • Nucleotide “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to a polymer of nucleotides of any length.
  • the term also includes “derivative oligonucleotides” or “derivative polynucleotides.”
  • the term “derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or polynucleotide containing a derivative of a nucleotide or having an unusual linkage between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotide examples include, for example, 2′_ ⁇ _methyl monoribonucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a derivative in an oligonucleotide.
  • oligonucleotides in which the phosphodiester bond has been converted to N3'-P5 'phosphoramidate bonds, derivative oligonucleotides in which ribose and phosphodiester bonds have been converted to peptide nucleic acid bonds, and peracil in the oligonucleotide
  • Derivative oligonucleotide substituted with C5 propynylperacyl derivative oligonucleotide in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C5 thiazole peracyl, induction in which cytosine in oligonucleotide is substituted with C5 propiercytosine Conductive oligonucleotides, derivatives in which cytosine in oligonucleotides is replaced with phenoxazine-modified cytosine Oligonucleotides, derivative oligonucleotides in which ribose in DNA is replaced with 2'-di
  • nucleic acid sequence may also include conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and complements thereof, as well as explicitly stated sequences. It is contemplated to include the sequence. Specifically, degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 26 05-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994).
  • degenerate codon substitutions create a sequence in which the third position of one or more selected (or all) codons has been replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue.
  • nucleic acid molecule is also used interchangeably herein with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like. As used herein, nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the concept of the term “gene”.
  • gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually they are arranged in a certain order on the chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that control its expression are called regulatory genes (eg, promoters). As used herein, a gene includes a structural gene and a regulatory gene unless otherwise specified. Therefore, the Bloom syndrome (Blm) gene usually includes both the structural gene of the Bloom syndrome group (Blm) gene and the promoter of the Bloom syndrome (Blm) gene.
  • gene may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide”.
  • gene product also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “polynucleotide” expressed by a gene. Includes “peptide”. Those skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.
  • homology of a gene (eg, nucleic acid sequence, amino acid sequence, etc.)
  • the degree of identity between two or more gene sequences refers to the degree of identity between two or more gene sequences.
  • the higher the homology between two genes the higher the identity or similarity between their sequences.
  • Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, the hybridization method under stringent conditions.
  • the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical, the genes are homologous.
  • the term “similarity” of a gene eg, a nucleic acid sequence, an amino acid sequence, etc.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as the object of the present invention is satisfied.
  • “Derivative amino acids” or “amino acid analogs” are those that differ from naturally occurring amino acids but have the same function as the original amino acid. Such derived amino acids and amino acid analogs are well-known in the art.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC- IUB Biochemica 1 Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code.
  • the term "corresponding" amino acid or nucleic acid refers to a given polypeptide molecule or polynucleotide molecule, and is the same as a predetermined amino acid in a polypeptide or polynucleotide to be compared with.
  • the ability to exert an action or the ability to have an action S The amino acids or nucleic acids that are predicted are identified. Say. For example, it may be a similar part in a given ortholog.
  • the amino acid responsible for the function of the Bloom's syndrome gene is the mouse Bloom's syndrome gene, and the corresponding amino acid in other animals also functions.
  • the term "corresponding" gene refers to a gene having an effect similar to that of a predetermined gene in a species serving as a reference for comparison, or a gene predicted to have the same. When there are a plurality of genes having such an action, those having the same evolutionary origin are referred to. Thus, the corresponding gene for a gene may be an ortholog or species homolog of that gene. Therefore, the mouse Bloom syndrome gene Corresponding genes can also be found in other animals. Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art.
  • the corresponding gene in an animal can be obtained by using the sequence of the gene (eg, mouse Bloom syndrome gene) that is the reference of the corresponding gene as a query sequence, and using the sequence database of the animal (eg, human or rat) as a query sequence. Can be found by searching for the sequence of the gene (eg, mouse Bloom syndrome gene) that is the reference of the corresponding gene as a query sequence, and using the sequence database of the animal (eg, human or rat) as a query sequence. Can be found by searching for
  • nucleotide may be natural or non-natural.
  • “Derivative nucleotides” or “nucleotide analogs” are those that are different from naturally occurring nucleotides, but that have the same function as the original nucleotides. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphonoreamidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2-dimethyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNA). Not done.
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of l to n-1 relative to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). Polynucleotide.
  • the length of the fragment can be appropriately changed depending on the purpose.For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 for a polypeptide. , 15,20,25,30,40,50 and more amino acids, and specifically listed herein, the length represented by an integer (eg, 11 etc.) is also a lower limit. As appropriate.
  • a length represented by a non-integer integer (eg, 11, etc.) may also be appropriate as a lower limit.
  • the lengths of the polypeptide and the polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above. However, the above-mentioned numbers are not absolute, as long as they have the same function. The above number as an upper limit or adjustment is intended to include a few above and below (or, for example, 10% above and below). In order to express such an intention, in this specification, "about” may be used before a number. It should be understood, however, that the presence or absence of "about” does not affect the interpretation of that number.
  • Bloom syndrome gene As used herein, the terms “Bloom syndrome gene”, “Bloom” gene, and “Bloom” gene
  • the gene and the "Blm” gene are used interchangeably and are a group of diseases caused by a genetic abnormality related to DNA repair, and refer to genes causing a recessive genetic disease accompanied by microcephaly and dwarfism.
  • the Bloom syndrome gene for example,
  • (A) (a) a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof;
  • variant polypeptide having at least one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, A polynucleotide encoding an active variant polypeptide; a polynucleotide;
  • a nucleic acid molecule A nucleic acid molecule
  • one or more amino acids have at least one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion, and have a biological activity;
  • polypeptide having an amino acid sequence having at least 70% identity to the polypeptide of any one of (a) to (d) and having biological activity;
  • the Bloom syndrome (Blm) gene is preferably
  • (A) (a) a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof;
  • variant polypeptide having at least one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, A polynucleotide encoding an active variant polypeptide; a polynucleotide;
  • a nucleic acid molecule A nucleic acid molecule
  • (B) (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof; (b) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, one or more amino acids have at least one mutation selected from the group consisting of substitution, addition and deletion, and have a biological activity; A polypeptide;
  • polypeptide having an amino acid sequence having at least 70% identity to four polypeptides and having biological activity
  • Examples include, but are not limited to, nucleic acid molecules encoding a polypeptide.
  • the term "foreign gene” refers to a gene that does not naturally exist in an organism.
  • a foreign gene may be a modified version of a gene naturally present in the organism or an artificial gene such as a gene naturally present in another organism (eg, a bloom gene). It may be a gene that has been chemically synthesized or a complex thereof (for example, a fusion). An organism containing such a foreign gene can express a gene product that is not naturally expressed.
  • expression of a gene product such as a gene, a polynucleotide, or a polypeptide means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo to take on another form.
  • it means that the gene, polynucleotide, etc., is transcribed and translated into a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be a form of expression. More preferably, such forms of the polypeptide may have undergone post-translational processing.
  • “decrease” in "expression” of a gene, polynucleotide, polypeptide, or the like means that when the factor of the present invention is acted on, the expression is lower than when it is not acted on. Means a significant decrease in the amount of Preferably, the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide.
  • the term “increase” in "expression” of a gene, polynucleotide, polypeptide, or the like means that the amount of expression is significantly increased when the factor of the present invention is acted on as compared to when it is not acted on. Say.
  • the increase in expression increases the expression level of the polypeptide. including.
  • induction of “expression” of a gene refers to causing a certain cell to act on a certain factor to increase the expression level of that gene. Therefore, the induction of expression should be such that the gene is expressed when the expression of the gene is not observed at all, and the expression of the gene when the expression of the gene is already observed. Increasing is included.
  • the term "drug” means that a specific cell survives (or survives more strongly) in the presence thereof, but a weak cell survives without surviving another specific cell. It refers to a compound having such properties and can select cells depending on the existence or non-existence or strength of the cells.
  • agents include, but are not limited to, for example, tetracycline, doxycycline, estrodidin derivatives and prodistrone derivatives.
  • a gene whose expression is induced or stopped by the presence of an external factor eg, an antibiotic
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or protein) may have in a living body, and has various functions (for example, promotion of transcription).
  • a factor for example, a polypeptide or protein
  • its biological activity includes binding to a target nucleic acid molecule, thereby suppressing expression.
  • a factor is an enzyme
  • its biological activity includes the enzymatic activity.
  • an agent is a ligand
  • the ligand involves binding to the corresponding receptor.
  • Such a biological activity can be measured by techniques well known in the art.
  • antisense refers to an activity capable of specifically suppressing or reducing the expression of a target gene. Antisense activity is usually achieved by a nucleic acid sequence of at least 8 contiguous nucleotides that is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest (eg, Blm). A molecule having such antisense activity is called an antisense molecule.
  • nucleic acid sequences are preferably at least 9 contiguous nucleotides in length, more preferably 10 contiguous nucleotides in length, even more preferably 11 contiguous nucleotides in length, 12 contiguous nucleotides in length, 20 contiguous nucleotides, 14 contiguous nucleotides, 15 contiguous nucleotides, 20 contiguous nucleotides It can be a nucleic acid sequence of leotide length, 25 contiguous nucleotides in length, 30 contiguous nucleotides in length, 40 contiguous nucleotides in length, 50 contiguous nucleotides in length.
  • nucleic acid sequences include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, even more preferably 90% homologous, and most preferably 95% homologous to the above sequences. included.
  • antisense activity is preferably complementary to the sequence at the 5 'end of the nucleic acid sequence of the gene of interest.
  • antisense nucleic acid sequences also include those having one or more or one or more nucleotide substitutions, additions and Zs or deletions with respect to the above-described sequences.
  • RNAi is an abbreviation for RNA interference.
  • Homologous mRNA is specifically expressed by introducing a factor that causes RNAi such as double-stranded RNA (also referred to as dsRNA) into cells.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNAi may also be used synonymously with factors that cause RNAi in some cases.
  • factor causing RNAi refers to any factor capable of causing RNAi.
  • a factor that causes RNAi to bow with respect to a “gene” refers to a factor that induces RNAi related to the gene and achieves the effect of RNAi (for example, suppression of expression of the gene).
  • Means Factors that cause such RNAi include, for example, at least a sequence that has at least about 70% homology to a portion of the nucleic acid sequence of the target gene or a sequence that hybridizes under stringent conditions. RNA including a double-stranded portion having a length of 10 nucleotides or a variant thereof, but is not limited thereto.
  • the factor preferably includes a 3′-protruding end, and more preferably, the 3′-protruding end may be DNA having a length of 2 nucleotides or more (eg, DNA having a length of 2 to 4 nucleotides).
  • RNAi when a molecule that causes RNAi, such as dsRNA, is introduced into cells, it is relatively long (eg, 40 base pairs or more).
  • dsRNA an R Naselll-like nuclease called Dicer with a helicase domain cuts out the molecule in the presence of ATP at a 3'-end force of about 20 base pairs each to generate short dsRNA (also called siRNA). .
  • siRN ⁇ A '' is an abbreviation for short interfering RNA, which is artificially synthesized or biochemically synthesized, or synthesized in a living organism, or has a length of about 40 bases or more.
  • a specific protein binds to this siRNA to form a RISC (RNA_induced_silencing-complex).
  • This complex recognizes and binds mRNA having the same sequence as the siRNA, and cleaves the mRNA at the center of the siRNA by an RNaselll-like enzyme activity.
  • 100% is preferable. Mutation of the base at the position deviating from the central force or the deviated position of the siRNA leaves partial activity that does not completely eliminate the cleavage activity by RNAi. On the other hand, the mutation of the base in the center of the siRNA has a great effect, and the mRNA cleavage activity by RNAi is extremely reduced.
  • siRNA itself can be used as a factor that causes RNAi, and a factor that generates siRNA (for example, dsRNA typically having about 40 bases or more) can be used as such a factor. Can be.
  • siRNA acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) by binding the antisense strand of siRNA to mRNA. It is also contemplated that dsRNA is synthesized, and this dsRNA again becomes a substrate for Dicer, generating new siRNA and amplifying the action.
  • RdRP RNA-dependent RNA polymerase
  • the siRNA itself and the factor by which the siRNA occurs are also useful. In fact, in insects and the like, for example, 35 dsRNA molecules almost completely degrade mRNA in a cell having more than 1,000 copies, so it is reasonable to think that siRNA itself and factors that generate siRNA are useful. It is cornered.
  • siRNA double-stranded RNA having a length of about 20 bases (for example, typically about 21 to 23 bases in length) or less, which is called siRNA, can be used.
  • siRNA suppresses gene expression when expressed in cells, and becomes a target of the siRNA. Since it suppresses the expression of pathogenic genes, it can be used for treatment, prevention, prognosis, etc. of diseases.
  • siRNA used in the present invention may take any form as long as it can induce RNAi.
  • the factor that causes RNAi of the present invention may be a short hairpin structure (shRNA; short hairpin RNA) having an overhang at the 3 'end.
  • shRNA refers to a single-stranded RNA containing a partially palindromic base sequence, thereby taking on a double-stranded structure in the molecule to form a hairpin-like structure. For molecules with more than base pairs.
  • shRNAs are artificially chemically synthesized. According to one study, such shRNAs are capable of producing hairpin-structured DNA in which sense and antisense strand DNA sequences are ligated in reverse by synthesizing RNA in vitro with T7 RNA polymerase. .
  • shRNAs can be introduced into cells and then transfected into cells with about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 bases). It is to be understood that they are degraded to length and cause RNAi like siRNA, and have the therapeutic effect of the present invention. It is to be understood that such effects are exerted on a wide variety of organisms, such as insects, plants, animals (including mammals). As described above, shRNA causes RNAi similarly to siRNA, and thus can be used as an active ingredient of the present invention. The shRNA may also preferably have a 3 'overhang.
  • the length of the double-stranded portion is not particularly limited, but may be preferably about 10 nucleotides or more, more preferably about 20 nucleotides or more.
  • the 3 'protruding end may be preferably DNA, more preferably DNA having at least 2 nucleotides or more, and further preferably DNA having 2 to 4 nucleotides in length.
  • RNAi-causing factors used in the present invention may be artificially synthesized (for example, chemically or biochemically) or naturally occurring factors. There is no essential difference in the effect of. For those chemically synthesized, it is preferable to purify them by liquid chromatography or the like.
  • RNAi used in the present invention can also be synthesized in vitro.
  • T7 RNA polymerase and T7 promoter Synthesize antisense and sense RNA from type I DNA.
  • RNAi is induced through the above-described mechanism, and the effects of the present invention are achieved.
  • such RNA can be introduced into cells by the calcium phosphate method.
  • RNAi of the present invention also include factors such as single strands that can hybridize with mRNA, or all similar nucleic acid analogs thereof. Such factors are also useful in the treatment methods and compositions of the present invention.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art. Using a polynucleotide selected from the polynucleotides of the present invention as a probe, a colony'no, hybridization method, a plaque'hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like is used. Thus, such a polynucleotide can be obtained. Specifically, using a filter on which DNA derived from colonies or plaques has been immobilized, 0.7 to: 1. After performing hybridization at 65 ° C. in the presence of 1.0 M NaCl, the mixture was subjected to hybridization.
  • SSC saliva e-sodium citrate
  • the composition of the 1-fold concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate).
  • Filter at 65 ° C. Means a polynucleotide that can be identified by washing.
  • Hybridization was performed using experiments such as Molecular Cloning 2 ⁇ ed., Current Protocols m Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approch, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. It can be carried out according to the method described in the book.
  • sequences containing only the A sequence or only the T sequence are preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions.
  • polynucleotide that can be hybridized refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions.
  • the hybridizable polynucleotide is a polynucleotide having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention, preferably 80% Polynucleotides having the above homology, more preferably polynucleotides having a homology of 95% or more can be mentioned.
  • probe refers to a substance to be searched for, which is used in biological experiments such as screening in vitro and / or in vivo. , but not limited thereto, nucleic acid molecules comprising a base sequence of, or peptides comprising a particular amino acid sequence.
  • nucleic acid molecule usually used as a probe examples include a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence of at least 8 contiguous nucleotides, which is homologous or complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest.
  • nucleic acid sequence is preferably at least 9 contiguous nucleotides in length, more preferably 10 contiguous nucleotides in length, even more preferably 11 contiguous nucleotides in length, 12 contiguous nucleotides in length, 13 contiguous nucleotides, 14 contiguous nucleotides, 15 contiguous nucleotides, 20 contiguous nucleotides, 25 contiguous nucleotides, 30 contiguous nucleotides, 4
  • the nucleic acid sequence can be 0 contiguous nucleotides in length, 50 contiguous nucleotides in length.
  • Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous, more preferably at least 80% homologous, even more preferably 90% homologous, and 95% homologous to the above sequences. included.
  • search refers to another nucleus having a specific function and / or property utilizing a certain nucleobase sequence electronically or biologically or by another method. This refers to finding an acid base sequence.
  • Electronic searches include BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) and FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444). — 2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195—197 (1981)), and Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.
  • Bio searches include stringent hybridization, macroarrays in which genomic DNA is occupied by a nylon membrane or shellfish, microarrays attached to glass plates (microarray assays), PCR and in situ Examples include, but are not limited to, hybridization.
  • the term "primer” is synthesized in a polymer synthase reaction. Refers to a substance necessary for initiating the reaction of a polymer compound.
  • a nucleic acid molecule eg, DNA or RNA
  • a nucleic acid molecule complementary to a partial sequence of the polymer compound to be synthesized can be used.
  • nucleic acid molecule usually used as a primer examples include a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence having a length of at least 8 continuous nucleotides, which is complementary to the nucleic acid sequence of the gene of interest.
  • Such a nucleic acid sequence preferably has at least 9 contiguous nucleotides in length, more preferably 10 contiguous nucleotides in length, even more preferably 11 contiguous nucleotides in length, 12 contiguous nucleotides in length, 13 consecutive nucleotides in length, 14 consecutive nucleotides in length, 15 consecutive nucleotides in length, 16 consecutive nucleotides in length, 17 consecutive nucleotides in length, 18 consecutive nucleotides in length, 19 A contiguous nucleotide length, 20 contiguous nucleotides of length, 25 contiguous nucleotides of length, 30 contiguous nucleotides of length, 40 contiguous nucleotides of length, 50 contiguous nucleotides of length, a nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequences used as probes include nucleic acid sequences that are at least 70% homologous to the above sequences, more preferably at least 80% homologous, even more preferably 90% homologous, and 95% homologous. It is.
  • a suitable sequence as a primer can vary depending on the nature of the sequence to be synthesized (amplified), but those skilled in the art can appropriately design a primer according to the intended sequence. The design of such primers is well known in the art, and may be performed manually or using a computer program (eg, LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar).
  • the term "factor that specifically binds to a nucleic acid molecule or polypeptide” refers to the binding level of the factor to the nucleic acid molecule or polypeptide.
  • a factor that is at or above the level of binding of that factor to the peptide include, for example, when the target is a nucleic acid molecule, a nucleic acid molecule having a sequence complementary to the target nucleic acid molecule, a polypeptide that binds to the target nucleic acid sequence (for example, a transcription factor
  • examples include, but are not limited to, antibodies, single-chain antibodies, receptor-one ligand pairs, and enzyme-substrates. Not.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • Hydrophobic amino acids of amino acids f, tanno II produced. Contributes to the secondary structure of proteins, and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge properties.
  • One amino acid is replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index, and a protein still having a similar biological function (eg, a protein equivalent to an enzyme activity) is obtained. It is well known in the art that it can occur.
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. It is understood in the art that such substitution of amino acids based on hydrophobicity is efficient.
  • the hydrophilicity index can also be considered in designing a polypeptide. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid Glutamic acid (+ 3.0 ⁇ 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (+ 3.0 ⁇ 1); 0.4); proline (0.5 ⁇ 1); alanine (0.5); histidine (0.5); cysteine (1.1.0); methionine (1.1.3); valine ( I-1.5); Leucine (1-1.8); Isoloisin (1-1.8); Tyrosine (1-2.3); Phenylalanine (1-2.5); and Tryptophan ( 3.4).
  • an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity index and still provide a bioisostere.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the term "conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid are similar to those described above.
  • conservative substitution include, for example, those having a hydrophilicity index or a hydrophobicity index of two or less within soil 2, preferably within ⁇ 1 and more preferably within ⁇ 0.5. But not limited to them.
  • conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; daltamic and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; Leucine, isoleucine, and the like, but are not limited thereto.
  • the "variant" refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or polynucleotide is partially changed. Such variants include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles refer to genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have the same or a very similar distribution of their corresponding alleles, and usually have nearly the same biological activity, but rarely have different biological activities. It may have active activity.
  • “Species homolog or homolog” refers to homology (preferably 60% or more homology, more preferably, homology at the amino acid level or nucleotide level) of a certain gene within a certain species. 80./o above, 85./ 0 or more, 90% or more, instances that have a homology) of 95% or more. Methods for obtaining such species homologs will be apparent from the description herein.
  • the term "ortholog” refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes, both orthologous genes.
  • the hemoglobin gene family with a multigene structure for example, human and mouse spider hemoglobin
  • the bin gene is an ortholog of force S
  • the human spleen hemoglobin gene and ⁇ -hemoglobin gene are paralogs (genes generated by gene duplication).
  • Onoresologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees.
  • Orthologs of the present invention may also be useful in the present invention, since orthologs can usually perform the same function in another species as the original species.
  • disabling the Blm gene means modifying the Blm gene so as to destroy (or reduce) its normal function or manipulating the cell such that the Blm gene is deleted. Or by using a technique such as antisense or RNAi to treat the Blm gene with a force that renders it inoperable or with a drug or the like so that it does not function temporarily.
  • mutagenesis refers to causing a mutation in a certain gene.
  • a mutagenesis factor include mutagens (for example, N-ethyl-N _ Nitrosoureas (ENU), nitrosamine derivatives, etc.), use of transposon genes, exposure to ultraviolet light and radiation, but are not limited thereto. It is understood that mutagenesis using a transposon can be performed by those skilled in the art in consideration of the technique of the present inventors (International Publication WO02 / 13602).
  • a conservatively modified variant is essentially a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence. Due to the degeneracy of the genetic code, many functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine.
  • nucleic acid variation is a "silent modification (mutation)," which is one type of conservatively modified mutation.
  • Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid.
  • each codon in the nucleic acid (AUG, which is usually the only codon for methionine, and It is understood that (except for TGG, which is the only codon for Tofan), can be modified to produce functionally identical molecules.
  • each silent variation of a nucleic acid which encodes a polypeptide is implicit in each described sequence.
  • modifications may be made to avoid substitution of the amino acid cysteine, which greatly affects the conformation of the polypeptide.
  • base sequence modification methods include cleavage with a restriction enzyme or the like, ligation treatment with a DNA polymerase, Klenow fragment, DNA ligase, or the like, site-specific base substitution using a synthetic oligonucleotide, or the like. (Site-directed mutagenesis; Mark Zoller and Michael Smith, Methods in Enzymology, 100, 468-500 (1983)) Force S, power S, and other methods commonly used in the field of molecular biology Can also be modified.
  • amino acid addition, deletion, or modification can also be performed to produce a functionally equivalent polypeptide.
  • Amino acid substitution refers to the replacement of the original peptide with one or more, for example:! -10, preferably 1-5, and more preferably 1-3 amino acids.
  • the addition of amino acids refers to the addition of one or more amino acids to the original peptide chain, for example, 1 to 10, preferably:! To 5, and more preferably 1 to 3 amino acids.
  • Amino acid deletion refers to the deletion of one or more, for example:! -10, preferably 1-5, more preferably 1-3 amino acids from the original peptide.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, forces S including amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), etc. .
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid or an unnatural amino acid or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • peptide analog or "peptide derivative” is a compound that is different from a peptide, but is equivalent to the peptide in at least one chemical or biological function.
  • peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs or amino acid derivatives have been added or replaced with the original peptide.
  • Peptide analogs function similarly to those of the original peptide (e.g., have similar pKa values, similar functional groups, and similar binding modes to other molecules). , The water solubility is similar, etc.) As described above, such addition or substitution is performed.
  • Such peptide analogs can be made using techniques well known in the field.
  • a peptide analog can be a polymer comprising an amino acid analog.
  • polynucleotide analogs and “nucleic acid analogs” are compounds that are different from polynucleotides or nucleic acids.
  • a polynucleotide or nucleic acid is equivalent to at least one chemical or biological function. A thing.
  • polynucleotide or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives have been added or substituted with respect to the original peptide.
  • the nucleic acid molecule used in the present specification has a part of the nucleic acid sequence deleted as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the naturally-occurring polypeptide. Alternatively, it may be replaced by another base or another nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 ′ end and the Z or 3 ′ end. Further, a nucleic acid molecule which hybridizes a gene encoding a polypeptide under stringent conditions and encodes a polypeptide having substantially the same function as the polypeptide may be used. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
  • Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, or the like.
  • substitution, addition or deletion of a polypeptide or polynucleotide means an amino acid or its substitute for the original polypeptide or polynucleotide, respectively. Or the substitution of nucleotides or their substitutes, additions or removals. Techniques for such substitution, addition or deletion are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions or deletions may be any number as long as the number is one or more. As long as the information transfer function is maintained. For example, such a number may be one or several, and preferably is less than 20 of the total length. % Or less, 10% or less, or 100 or less, 50 or less, 25 or less.
  • the term "specifically expresses" a gene means that the gene is at a different (preferably higher) level at a particular site or stage in a plant than at other sites or stages. It is expressed. To be specifically expressed may be expressed only at a certain site (specific site) or may be expressed at other sites. Preferably, specific expression means expression at a certain site only.
  • homologous recombination refers to an exchange phenomenon of a corresponding DNA portion between chromosomes, and can be achieved, for example, by exposing to a condition of deletion of Blm gene and Cre / loxP system.
  • homologous recombination when it is desired to induce homologous recombination in the 4N phase of the cell, it can be achieved by exposing the Blm gene to deficiency and Cre / loxP system.
  • vector refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • vectors are capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of integration into chromosomes, Those containing a promoter at a position suitable for nucleotide transcription are exemplified. Of the vectors, those suitable for clawing are called “cloning vectors”. Such cloning vectors usually contain a multiple cloning site which contains multiple restriction enzyme sites.
  • expression vector refers to an expression vector in which, in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression, various regulatory elements are operably linked in a host cell. Nucleic acid sequence.
  • the regulatory elements may preferably include a terminator, a selectable marker such as a drug resistance gene, and a heterogeneous gene. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, an animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • a lambda FIX vector (phage vector) is used for genomic library screening, and a lambda ZAP vector (phage vector) is used for cDNA screening. be able to.
  • pBluescript II SK +/-, pGEM, pCR2.1 vector (plasmid vector) can be mainly used.
  • a pSV2neo vector (plasmid vector) can be used as an expression vector.
  • Such a vector can be appropriately implemented by referring to Molecular Cloning A3.2 described above.
  • terminal 1 is located downstream of a gene coding region of a gene, and is involved in the termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA and the force of the poly A sequence. Array. It is known that the terminator is involved in mRNA stability and affects the expression level of a gene.
  • promoter refers to a region on DNA that determines the start site of transcription of a gene, and that directly regulates the frequency of transcription, and that transcription is usually performed by binding of RNA polymerase. The starting base sequence. Therefore, in the present specification, a portion of a gene having a promoter function is referred to as a “promoter portion”. Since the promoter region is usually a region within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region, if the protein coding region in the genomic nucleotide sequence is predicted using DNA analysis software, the promoter region may be The area can be estimated.
  • Putative promoter region Varies depending on the structural gene, but is usually upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is within about 2 kbp upstream of the first exon translation start site.
  • the term “enhancer” refers to a sequence used to enhance the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of forces that can be used may be used or one may not be used.
  • operably linked refers to a transcriptional / translational regulatory system (eg, promoter, enhancer, etc.) or a translational regulatory sequence that is capable of expressing (operating) a desired sequence. Is placed under the control of.
  • the promoter is usually located immediately upstream of the gene, but need not necessarily be located adjacent to the gene.
  • treatment so as not to function temporarily refers to processing that is temporarily performed so that the function of a certain gene is not exhibited.
  • the gene functions when the factor (eg, metal, antibiotic, drug, etc.) responsible for switching the factor on or off is present or absent. Shine, so that they are arranged, what they do.
  • any technique for introducing a nucleic acid molecule into a cell may be used. Examples include transformation, transduction, and transfection. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausubel FA et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York; NY; Sambrook J et al., "987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Separate volume experimental medicine” Gene transfer & expression analysis experiment method ". Co., 1997. Gene transfer can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known techniques.
  • any of the methods described above for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transduction, and transformation.
  • the calcium phosphate method, the ribosome method, the DEAE dextran method, the electroporation method, and the method using a particle gun (gene gun) examples thereof include transfection, transduction, and transformation.
  • transformant refers to all or a part of an organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, and the like.
  • a transformant is also called a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like, depending on the target.
  • the cells used in the present invention may be transformants.
  • prokaryotic itoda spores include Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacteriumfe, Microbacteriiim, Pseudomonas, and the like.
  • Prokaryotic cells for example, Escherichia coli XL1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DHl are exemplified, such cells are described in In "Molecular CI oning edition) by Sambrook, J and Russell, DW, Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA 2001).
  • animal cells include CHO cells and BHK cells, which are mouse 'myeloma cells, rat myeloma cells, mouse ⁇ /, ibridoma cells, Chinese' no, and Muster's cells. And African green monkey kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • Mouse 'myeloma cells include ps20 and NSO; rat' myeloma cells include YB2 / 0; human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC: CRL-1573); human leukemia cells include BALL-1; COS-1 and COS-7 are exemplified as African Midori's kidney cells, and HCT-15 is exemplified as a human colon cancer cell line.
  • Cosl, NIH3T3, ES (Rl, TMA, NR2) cells are exemplified. But not limited to them.
  • any method for introducing a recombinant vector can be used, as long as it is a method for introducing DNA.
  • a calcium chloride method an etatroporation method [Methods] Enzymol., 194, 182 (1990)] Lipofuxion method, Spheroplast method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], acetic acid Lithium method. Bacteriol., 153, 163 (1983)] and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • “detection” or “quantification” of gene expression is achieved by using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement methods.
  • an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement methods.
  • the molecular biological measurement method include a Northern blot method, a dot plot method, and a PCR method.
  • the immunological measurement method include, for example, an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a Western blot method, and an immunohistochemical staining method.
  • the quantification method include an ELISA method and an RIA method.
  • DNA arrays are widely outlined in Shujunsha, edited by Cell Engineering, “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”. Protein arrays are described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32.
  • Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT-PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid systems, in vitro translation, and the like, in addition to the above.
  • screening refers to selecting a target such as an organism or a substance (e.g., a gene) having a specific property of interest from a population including a large number by a specific operation Z evaluation method. To do.
  • a target such as an organism or a substance (e.g., a gene) having a specific property of interest from a population including a large number by a specific operation Z evaluation method.
  • the cells of the present invention can be used.
  • immunophoreotype performing screening using an immune reaction
  • immunoophenotyping Various techniques can be employed with monoclonal antibodies to screen for cell populations that express the marker, including magnetic separation using antibody-coated magnetic beads, solid matrices (i.e., “Panning” using antibodies attached to plates), and flow cytometry (eg, US Pat. No. 5,985,660; and Morrison et al., Cell, 96: 737-49). (1999)).
  • Screening may be performed using a system using real substances such as in vitro or in vivo, or using a library generated using an in silico (computer-based) system.
  • compounds obtained by screening having a desired activity are also included in the scope of the present invention.
  • drugs, diagnostic agents, therapeutic agents, and the like by computer modeling are provided based on the disclosure of the present invention.
  • the term "library” refers to a certain set of genes, compounds, cells, and the like for screening.
  • the library 1 may be a set of genes, compounds, cells, and the like having similar properties, or may be a set of random genes, compounds, cells, and the like.
  • a set of genes, compounds, cells, etc. predicted to have similar properties is used, but is not limited thereto.
  • the modification is randomly introduced into the whole genome, so that the collection is a library useful for the analysis of various genes. It is understood that it can be used as
  • Genomic DNA containing the mouse Blm gene was isolated from the Rl-ES genomic library.
  • the targeting vector was introduced into R1-ES cells, followed by G418 selection and / or puromycin selection (Sigma).
  • Targeted clones were screened by PCR (Expand High Fidelity PCR System (Roche)) and confirmed by Southern blot analysis (Rapid-hyb buffer (Amersham Pharmacia)). All targeted clones used in this study retained the normal karyotype.
  • Blmtet / tet ES cells were cultured in medium containing 1 ⁇ Og / ml doxycycline (dox) (Sigma) and harvested at appropriate time points.
  • dox ml doxycycline
  • To examine Blm expression after dox withdrawal cells cultured in medium containing dox were washed once with PBS and cultured further in the absence of dox until harvest.
  • Blm protein was detected with anti-BLM antibody (ab476, abeam). ⁇ ⁇ ⁇ The stunt blot used ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Almasia).
  • Blm tet / tet ES cells cultured in the presence or absence of dox for an appropriate period of time are labeled for 20 hours with 3 zg / ml 5-bromodoxydiridine (BrdU) (Sigma), and 0.1 Treatment with ⁇ g / ml conoresemide (KaryoMax—Colcemid (Invitrogen)) was performed for 45 minutes.
  • the spread chromosomes were stained with 0.1 mgZml of Atalizin Orange (Sigma).
  • a targeting vector for the Fasl locus containing the mutated neo gene (see Koike et al., EMBO Rep. 3, 433-437 (2002)) (SEQ ID NOS: 4 and 5) was introduced into Blm et / tet ES cells. did.
  • the mutation induction rate of the dimorphism was determined by using the function analysis of! ⁇ 11 ⁇ 06 1: 1 ⁇ as described above (see Koike, H. et al., EMBO Rep. 3: 433-437 (2002)). Measurement Specified.
  • Blm tet / tet ES cells are cultured for 24 hours in the presence or absence of 1.O g / ml dox, and with or without dox, 100 mm culture under pure culture conditions.
  • Single-cell clones were obtained by plating.
  • Spread single cell clones were then selected with the aid of high-dose G418 (l. OmgZml) without dox.
  • High-dose G418-resistant clones was counted.
  • ENU mutagenesis and calculation of the mutation frequency of the Hprt locus were performed by the method described in Chen, Y. et al., Nature Genet. 24, 314-317 (2000).
  • Mutagenized ES cells were cultured for 4 days in the presence or absence of dox to create a mutant ES cell library.
  • the mutant and control libraries were treated with 10 nM proaerolysin (Protox Biotech) in a suspension of 1.0 x 10 6 cells / ml, gelatin-coated 100 mm culture dishes, and one culture dish. The cells were seeded at 5-8 ⁇ 10 6 cells per cell.
  • FIG. la is a schematic diagram of the Blm allele (Blm tet ) conditionally regulated by tetracycline (SEQ ID NO: 3). Insert a tetracycline-based regulatory cassette (tet cassette) (see Bond, C. T. et al., Science 289: 1942-1946 (2000)) immediately upstream of the translation initiation codon of both Blm alleles. These were exchanged for Blm tet . Targeting was confirmed by Southern blot analysis ( Figure lb). We hypothesized that persistent deficiency of Blm would result in persistent accumulation of biallelic mutations on the genome, resulting in a phenotypic change during long-term culture.
  • tet cassette tetracycline-based regulatory cassette
  • GPI anchor deficient cells can be positively selected by aerolysin (see Hong, Y. et al., EMBO J. 21: 5047-5056 (2002)), which can kill GPI anchor positive cells. .
  • the ES cell line used in this study is of male origin, and the PigA gene involved in the first stage of GPI anchor biosynthesis maps to the X chromosome. Therefore, this functional disruption does not require biallelic mutations, and the majority of GPI-deficient mutations are derived from PigA mutations (Kawagoe, K., Takeda, J., ⁇ , ⁇ .
  • FIG. 3a shows a protocol for ENU mutagenesis of ES cells, generation of an ES cell library, and screening for GPI anchor deficient mutants.
  • 2 ⁇ 10 8 ES cells were treated for 2 hours at 37 ° C. using ENU in an amount of 0.2 mgZml. Cell viability was about 3%, and 6 ⁇ 10 6 cells survived ENU treatment. The frequency of mutations in surviving cells was determined by selection with 6-thioguanine and was 2,400 times lower at the X-linked allelic hypoxanthine phosphoribosyltransferase (Hprt) locus. Chen et al. Have previously shown higher concentrations of ENU (0.35 mg / ml). Treated ES cell power.
  • Hprt allelic hypoxanthine phosphoribosyltransferase
  • mutants were widely distributed throughout the genome, and mutants were identified in more than half (1/23 out of 23) of known genes in one round of screening (Figure 4b).
  • FIG. 4c one mutant was obtained in four genes, while one or more mutants were obtained in other autosomal genes. Since the hits in this gene frequently have the same mutation, these variants are probably from a single clone. Therefore, the difference in the number of mutants can be explained by when the mutation occurs after dox addition. Sequencing analysis of these mutants revealed that they did not contain the sequence of the wild-type allele (FIGS. 4d and 4e), suggesting that biallelic mutations occur in ES cells treated with dox. Without dox treatment, only one mutant was isolated (data not shown).
  • Expression cloning can be expected to be a straightforward approach to identifying genes that cause a particular phenotype.
  • Recent developments in highly efficient systems for transduction of cDNA libraries see, for example, episomal vectors that are stably maintained in ES cells (see Chambers, I. et al., Cell 113: 643-655 (2003)).
  • High-titer retrovirus vector resistant to promoter silencing in ES Itoda vesicle see Kitamura, T. et al., Exp. Hematol. 31: 1007-1014 (2003))
  • Is mutated Very useful for gene identification Inspection of homology regions using polymorphic markers often narrows down the positions of mutations, as exemplified in FIG. 2c.
  • phenotype-based genetic screening With respect to phenotype-based genetic screening, a definitive decision to determine whether the observed phenotype was caused by a genetic variation or simply a change in the characteristics of a wild-type cell It is important to establish standards. This is particularly important in the analysis of ES cells, even if the culture conditions are carefully controlled, since a small fraction of the ES cell population can spontaneously differentiate. Transient regulation of Blm expression is useful for assessing specific phenotypes. If clones with the desired phenotype can be obtained more efficiently under dox-treated culture conditions than under non-selective culture conditions, these clones isolated by dox-derivatized LOH will It often covers alleles.
  • a mutation can be freely induced in stem cells such as ES cells, and the mutation can be introduced throughout the genome, a library of stem cells that can be used for analysis of various genes is provided. It can be used for drug development, disease analysis, disease diagnosis, treatment, gene therapy, etc., and has high industrial value.

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Abstract

　両方の対立遺伝子（二対立遺伝子）に変異を有する幹細胞を提供するための技術を提供すること。 　本発明は、対立遺伝子の両方の鎖に変異が導入された幹細胞を生産する方法であって、Ａ）幹細胞を提供する工程；Ｂ）該幹細胞におけるＢｌｍ対立遺伝子が機能しないようにする工程；およびＣ）該幹細胞における変異を誘発する工程、を包含する、方法を提供する。本発明はまた、対立遺伝子の両方の鎖に変異が挿入された、幹細胞のライブラリーであって、該ライブラリーに含まれる幹細胞は、ゲノム全体にわたって該変異が導入されている、ライブラリーを提供する。

Description

明 細 書
ES細胞の変異方法およびシステム
技術分野
[0001] 本発明は、幹細胞の改変技術に関する。より詳細には、幹細胞（例えば、胚性幹細 胞の自在な変異誘発方法およびシステム、ならびにそれによつて得られた幹細胞に 関する。
背景技術
[0002] 多分化能を有する胚性幹細胞（本明細書において以下、 ES細胞ともいう）をはじめ とする幹細胞は、種々の臓器または組織に分化し得ることから、注目されている。例 えば、「ノックアウト」マウスは、遺伝子ターゲテイングによって ES細胞から作製され得 ることからその有用性が注目されてレ、る。
[0003] 特に、 ES細胞のインビト口での、多くの異なる細胞型（例えば、造血細胞、ニューロ ンおよび心筋細胞（Kyba, M.および Daley, G. Q.、 Exp. Hematol. 31 : 994〜 1006 (2003) =非特許文献 1、 Kim, J. H.ら、 Nature 418 : 50^56 (2002) = 非特許文献 2および Parisi, S.ら、 J. Cell Biol. 163： 303〜314 (2003) =非特 許文献 3を参照のこと））への分化が報告されており、治療適用の可能性を示唆して レヽる（Reubinoff, B. E.， Pera, M. F. , Fong, C. Y.， Trouson, A.および Bo ngso, A.、 Nature Biotechnol. 18 : 399〜404 (2000) =非特許文献 4および T homson, J. A.ら、 Science 282 : 1145〜： 1147 (1998) =非特許文献 5を参照の こと)。
[0004] 両方の対立遺伝子（二対立遺伝子）に変異を有する幹細胞ライブラリーの作製は、 分化の分子機構ならびに ES細胞の多分化能の分析に有用であり、そのような技術 の登場が待ち望まれている。
非特許文献 l : Kyba, M.および Daley, G. Q.、 Exp. Hematol. 31 : 994〜： 100 6 (2003)
非特許文献 2 : Kim, J. H.ら、 Nature 418 : 50^56 (2002)
非特許文献 3： Parisi, S.ら、 J. Cell Biol. 163 : 303—314 (2003) 非特許文献 4 : Reubinoff, B. E. , Pera, M. F. , Fong, C. Y. , Trouson, A. および Bongso, A.、 Nature Biotechnol. 18 : 399^404 (2000)
非特許文献 5 : Thomson, J. A.ら、 Science 282 : 1145〜1 147 (1998) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、両方の対立遺伝子（二対立遺伝子）に変異を有する幹細胞を提供する ための技術を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、上記課題を検討した結果、ブルーム症候群遺伝子の条件的破壊が、 E
S細胞などの ES細胞におけるゲノム全体にわたる変異導入を可能にすることを予想 外に見いだしたことによって解決された。
[0007] 従って、本発明は以下を提供する。
[0008] 一つの局面において、本発明は、対立遺伝子の両方の鎖に変異が挿入された幹 細胞を提供する。
[0009] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、胚性幹細胞である。
[0010] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、ブルーム症候群（Blm)遺伝子が喪失 されてレ、る力または機能しなレ、ように改変されてレ、る。
[0011] 一つの実施形態において、上記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載され る配列またはその改変体を含む。
[0012] 別の局面において、本発明は、対立遺伝子の両方の鎖に変異が挿入された、幹細 胞のライブラリーであって、上記ライブラリーに含まれる幹細胞は、ゲノム全体にわた つて上記変異が導入されているライブラリーを提供する。
一つの実施形態において、上記幹細胞は、胚性幹細胞である。
[0013] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、ブルーム症候群遺伝子が喪失されて レ、る力、または機能しなレ、ように改変されてレ、る。
[0014] 一つの実施形態において、上記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載され る配列またはその改変体を含む。
[0015] 別の局面において、本発明は、対立遺伝子の両方の鎖に変異が導入された幹細 胞を生産する方法であって: A)幹細胞を提供する工程; B)上記幹細胞におけるブ ルーム症候群遺伝子が機能しないようにする工程；および C)上記幹細胞における変 異を誘発する工程、を包含する方法を提供する。
[0016] 一つの実施形態において、上記ブルーム症候群遺伝子は、一過的に機能しないよ うに処理される。
[0017] 一つの実施形態において、上記ブルーム症候群遺伝子は、薬剤の存在下で、一 過的に機能しないように処理されている。
[0018] 一つの実施形態において、上記薬剤は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エストロ ジヱン誘導体およびプロジヱストロン誘導体からなる群より選択される。
[0019] 一つの実施形態において、上記変異の誘発は、変異原への暴露、トランスポゾン遺 伝子の利用、紫外線への暴露および放射線への曝露からなる群より選択される。
[0020] 一つの実施形態において、相同組換えを誘発する工程をさらに包含する。
[0021] 一つの実施形態において、相同組換えを前記細胞の 4N期に誘発させ、上記誘発 後に細胞分裂をさせる工程をさらに包含する。
[0022] 一つの実施形態において、上記幹細胞は、胚性幹細胞である。
[0023] 一つの実施形態において、上記胚性幹細胞は、哺乳動物の胚性幹細胞である。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製される、幹細胞を提供す る。
[0024] 一つの実施形態において、上記幹細胞が胚性幹細胞である。
[0025] 別の局面において、本発明は、本発明の幹細胞または本発明の方法によって調製 される幹細胞から得られる、組織を提供する。
[0026] 別の局面において、本発明は、本発明の幹細胞または本発明の方法によって調製 される幹細胞から得られる、生物体を提供する。
[0027] 別の局面において、本発明は、ブルーム症候群遺伝子またはその改変体の、幹細 胞の変異のための使用を提供する。
[0028] 本発明の使用の 1つの実施形態において、本発明の使用における前記ブルーム 症候群遺伝子は、前記幹細胞にぉレ、て喪失される力、または機能しなレ、ように改変さ れる。具体的な実施形態では、本発明の使用において用いられるブルーム症候群遺 伝子は、配列番号 1に記載される配歹 1Jまたはその改変体を含む。
[0029] 別の局面において、本発明は、ブルーム症候群遺伝子またはその改変体の、幹細 胞を変異させるための組成物を製造するための使用を提供する。
[0030] 本発明の組成物を製造するための使用の 1つの実施形態において、本発明の使 用における前記ブルーム症候群遺伝子は、前記幹細胞において喪失される力、また は機能しないように改変される。具体的な実施形態では、本発明の使用において用 レ、られるブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載される配列またはその改変体 を含む。
[0031] (本発明のさらなる説明）
哺乳動物系における表現型ベースの遺伝スクリーニングの主要な制限は、ゲノムの 二倍体性質である。ブルーム症候群遺伝子（Bml)の喪失は、ヘテロ接合の喪失 (L OH)の増大した割合を示す（German, J.、 Dermatol. Clin. 13： 7〜： 18 (1995)、 Groden, J. , Nakamura, Υ.および German, J.、 Proc. Natl. Acad. Sci. US A 87 : 4315〜4319 (1990)および Luo, G.ら、 Nature Genet. 26 : 424^429 (2000)を参照のこと）。
[0032] 本発明の 1つの特定の実施形態において、本発明者らは、テトラサイクリン制御下 の Blm対立遺伝子（Blmtet)を用いて、マウス胚性幹（ES)細胞でのゲノム全体にわ たる二対立遺伝子変異の導入を示した。 Blm発現の一過性の喪失は、姉妹染色分 体間だけでなぐ相同染色体間の相同組換えも誘導した。二対立遺伝子変異を有す る ES細胞の表現型力 S、テトラサイクリンアナログであるドキシサクリンの中止後も維持 されることが示された。 N—ェチルー N—二トロソ尿素（ENU)変異誘発および Blm発 現の一過性の喪失の組み合わせは、ゲノム全体にわたって二対立遺伝子変異を有 する ES細胞ライブラリーの作製を可能にした。このライブラリ一は、グリコシルホスファ チジルイノシトール (GPI)アンカーの生合成の変異に関するスクリーニングによって 評価され、この GPIアンカーは、ゲノム全体にわたって広く分布する、少なくとも 23個 の遺伝子を含む。 12個の別々の遺伝子由来の変異体を得た一方で、同時に 2個の 未知の変異体を単離した。
[0033] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な 説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
発明の効果
[0034] 本発明は、効率のよい表現型ベースの遺伝スクリーニングを提供し、そして ES細胞 における遺伝子機能の同定における効率のよい技術を提供する。本発明はまた、 E S細胞におけるゲノム全体にわたる表現型ベースの解析を可能にする。
図面の簡単な説明
[0035] [図 1]図 1は、 ES細胞における条件的な Blm対立遺伝子の産生および SCEの増大 を示す。図 laは、ターゲティング戦略および結果として生じた Blm対立遺伝子を示す 。 neo遺伝子または puro遺伝子を含む tetカセットを Blmの翻訳開始部位の上流に 揷入し、 BlmtetNまたは BlmtetPをそれぞれ作製した。 Creの発現後、これらの選択マ 一力一が欠落し、結果として Blmtetを生じる。 Bは BamHIを表し、 Sは Saclを表す。 t etカセットにつレヽての略語は、 Bond, C. T.ら、 Science 289： 1942〜1946 (200 0)に記載される。図 lbは、標的化クローンのサザンブロット解析を示す。ゲノム DNA を BamHIで消化して電気泳動により分画し、図 laに示す放射標識したプローブで ハイブリダィズした。図 lcは、 Blmtet/tetES細胞における Blm発現の、ウェスタンブロ ットによる長期の解析を示す。 β—ァクチン (Actb)の発現レベルをローデイングコン トロールとして使用した。図 Idは、 Blmtet/tetES細胞における Blm発現の、ウェスタン ブロットによる短期の解析を示す。 β—ァクチン（Actb)の発現レベルをローデイング コントロールとして使用した。図 leは、 dox処理した Blmtet/tetES細胞（下のパネル） または未処理の Blmtet/tetES細胞（上のパネル）の SCEを示す。
[図 2]図 2は、 Blm欠損 ES細胞における高頻度な LOHを示す。図 2aは、 LOH機構 の概略図である。ヘテロ接合を A/aとして表す。 4N期に相同染色体間で相同組換 えが起こる場合、細胞分裂の後に LOH (A/Aまたは a/a)を有する細胞が現れる。 図 2bは、 LOHの Luria— Delbruck変動解析を示す。 neo遺伝子を有する Fasl遺伝 子座の重複頻度を調べた。図 2cは、 Fasl遺伝子座の 28個の二多型性変異の多型 S SLPマーカー解析を示す。 白抜きの四角、および黒い四角は、それぞれヘテロ接合 および LOHを示す。
[図 3]図 3は、変異 ES細胞ライブラリーの構築および GPIアンカー欠損変異体のスク リーニング戦略を示す。図 3aは、二多型性変異を有する ESライブラリー由来の、 GPI アンカー欠損変異体のスクリーニングの概略図である。図 3bは、このスクリーニング 戦略の有効性の理論的な予測である。 # 1： 2 X 108個の ES細胞の、 ENU処理後の 生存細胞数。 # 2 : 6—TG耐性コロニーの割合として測定する、 X連鎖性 Hprt陰性 細胞の頻度。 # 3 :図 2bに記載された L〇Hの変異比率。 # 4 : dox処理の間の世代（ 細胞周期）の数。括弧内の数字は、 dox処理の間の細胞分裂の総数を示す。 # 5 :「 頻度」は、遺伝子座あたりの二多型性変異を有するクローンの頻度を表す（2. 3 X 1 0_4 X 1/2400 X 7)。 # 6： dox処理後の遺伝子座あたり二多型変異を有する独立 したクローンの数を示す。
[図 4]図 4は、 GPIアンカー欠損変異体の解析を示す。図 4aは、 GPIアンカー欠損変 異体の相補性解析を示す。 GPIアンカー GFPタンパク質は、 PIGA cDNAを供給 したときのみ、 PigA欠損 ES細胞の細胞表面に発現した（右パネル）。左のパネルは 、ポジティブコントロールとして GFP— GPIをトランスフエタトし野生型の ES細胞を示 す。図 4bは、 GPIアンカーの生合成に関する 23個の遺伝子の染色体位置を示す。 赤レ、矢印は、このスクリーニングにおレ、て得られた変異体の 12個の遺伝子を示し；黒 い矢印は、得られなかった変異体の 11個の遺伝子を示し； *は、 cDNAがすでにクロ ーン化されているが未公開なものを示す。図 4cは、変異遺伝子の染色体番号および 得られた変異体の数を示す。各染色体における変異遺伝子の順序は、動原体から 末端小粒に向ってである。 は、同一の変異を含む変異体を示し； * * *は、別の変 異を含む変異体を示す。括弧内の数字は、同一の変異を有する変異体の数を示す 。図 4dは、 PigHにおける変異の配列決定解析を示す。ホモ接合の変異が立証され た。図 4eは、 GPI8における変異の配列決定解析を示す。ホモ接合の変異が立証さ れた。図 4fは、 2つの新規変異体の FACS解析を示す。 ES細胞を、ピオチン化抗 H SA抗体 (薄レ、線）および抗 Thy _ 1抗体 (濃レ、線）で染色し、続けて、ストレプトアビ ジン一 PEで処理した。 HSAおよび Thy— 1は GPIアンカータンパク質である。破線 は、ピオチン化抗体を伴わなレ、、コントロール染色の輪郭を示す（上のパネル）。下の パネルは、非 GPIアンカータンパク質である E—カドヘリンの発現パターンを示す。 配列表の説明 [0036] 配列番号 1は、ブルーム（Blm)遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号 2は、ブルーム遺伝子のアミノ酸配列を示す。
配列番号 3は、実施例 1において使用されるテトラサイクリンで条件的に調節される B1 m対立遺伝子のカセットの核酸配列を示す。
配列番号 4は、変異 neo遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号 5は、変異 neo遺伝子のアミノ酸配列を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0037] 以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形 の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、そ の複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用 される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられるこ とが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用さ れる全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によつ て一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書 (定義を含め て）が優先する。
[0038] (用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
[0039] 本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であって も、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい 。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成 長したトランスジエニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞 株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
[0040] 細胞の「4N期」とは、細胞の染色体数力 通常（2n)の 2倍になってレ、る時期をレ、う 。そのような時期としては、例えば、細胞周期の G2期が挙げられるがそれらに限定さ れない。また、ある細胞が 4N期かどうかは、 Propidium Iodide (PI)で染色体を染 めて判定することができる。
[0041] 本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能 (すなわち多能性）
(「pluripotency」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときに その組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹 (ES)細胞または 組織幹細胞 (組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得 るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した 細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞 など)もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞を いう。胚性幹細胞は、 1981年に初めて樹立され、 1989年以降ノックアウトマウス作 製にも応用されている。 1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学に も利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定さ れている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしてい る。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核/細胞質比が 高ぐ細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が 遅ぐ個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、 幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され 得る。
[0042] 由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄 系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹 細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膝 (共通）幹細胞、肝幹細 胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞な どが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙 げられる。
[0043] 本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、 その DNAを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性 が限定されてレ、るかまたは消失してレ、る。
[0044] 細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され 得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉 由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞 などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膝幹細胞など が含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。
[0045] 本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が 少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離され た細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク 質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう 場合、「単離された」とは、たとえば、組換え DNA技術により作製された場合には細 胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物 質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。 単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に 隣接している（flanking)配列（即ち、該核酸の 5 '末端および 3'末端に位置する配 歹 IJ)を含まない。
[0046] 本明細書にぉレ、て、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質 (例え ば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになつ た状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では 、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程 を回避することができるので好ましレ、。
[0047] 本明細書において、「非胚性」とは、初期胚に直接由来しないことをいう。従って、 初期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変（ 例えば、遺伝的改変、融合など）を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内 にある。
[0048] 本明細書にぉレ、て「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例 えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほ とんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、陴実質細胞、陴管細胞、肝 細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血 管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられ る。
[0049] 本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、 1個の細胞の分裂によって由 来した娘細胞集団の中で形態的および/または機能的に質的な差をもった二つ以 上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない 細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした 特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定 の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態 をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を 同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞で は，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
[0050] 本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の 性質をいい、 1以上、好ましくは 2以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力を いう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない 限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて 制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化す ることは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮 性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生 (metaplasia )と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり 化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組 織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生 体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性 の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系 における、胚様体 (Embryoid Body)の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げ られるがそれらに限定されなレ、。また、生体を用いた多能性の有無についてのアツセ ィ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫 (テラトーマ）の形成、胚盤胞へ の注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙 げられるがそれらに限定されない。
[0051] 本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のあ る機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性 をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特 定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのよ うな臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。 1つ の実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓 、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膝臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに 限定されない。本明細書において、本発明の多能性細胞から分化した細胞としては 、表皮細胞、陴実質細胞、陴管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、 骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂 肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
[0052] 本明細書において「組織」（tissue)とは、多細胞生物において、実質的に同一の 機能および/または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有する 力 異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および /_または形態を有す るのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生す る場合、 2以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、 組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠 に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、 構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種 類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、レ、ろいろな分類が行われている。
[0053] 本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸 のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよぐ環状であって もよレ、。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよぐ改変されたァ ミノ酸であってもよレ、。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとァセンブ ルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたァミノ 酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、ダリ コシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例え ば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上 のアナログを含むポリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様 化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される 本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「 核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリ マーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオ チド」を含む。 「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌク レオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドをレ、い、互換的に使用される。そのようなオリゴヌタレ ォチドとして具体的には、例えば、 2 ' _〇_メチル一リボヌクレオチド、オリゴヌクレオ チド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体オリゴ ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3 '—P5 'ホスホロアミ デート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースと リン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体オリ ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C 5チアゾールゥラシルで置換さ れた誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C 5プロピエルシト シンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノ キサジン修飾シトシン（phenoxazine— modified cytosine)で置換された誘導体 オリゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2 '—〇一プロピルリボースで置換された誘 導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシェトキシリ ボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと 示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保 存的に改変された改変体 (例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含するこ とが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された（ または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および/またはデォキシイノシ ン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer et al. , Nucl eic Acid Res. 19 : 5081 (1991) ; Ohtsuka et al. , J. Biol. Chem. 260 : 26 05- 2608 (1985)； Rossolini et al. , Mol. Cell. Probes 8 : 91 - 98 (1994)
) 0
[0055] 用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリ ヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、ゲノム DNAなどを含む。本明 細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
[0056] 本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体 上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝 子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本 明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含 する。したがって、ブルーム症候群（Blm)遺伝子というときは、通常、ブルーム症候 群（Blm)遺伝子の構造遺伝子およびブルーム症候群（Blm)遺伝子のプロモーター の両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオ チド」および「核酸」ならびに/または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」 および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺 伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」なら びに/または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包 含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解すること ができる。
[0057] 本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、
2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝 子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝 子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジ工ン トな条件下でのハイブリダィゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を 直接比較する場合、その遺伝子配列間で DNA配列が、代表的には少なくとも 50% 同一である場合、好ましくは少なくとも 70%同一である場合、より好ましくは少なくとも 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99%同一である場合、それらの遺伝 子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子 (例えば、核酸配列、アミノ酸配列 など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみな した場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保 存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる 。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
[0058] 本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比 較は、配列分析用ツールである BLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出 される。
[0059] 本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非 天然のものでもよレ、。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在す るアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをレ、う。そのような誘 導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
[0060] アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— IUB Biochemica 1 Nomenclature Commissionにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本 明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された 1文字コードによ り言及され得る。
[0061] 本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド 分子またはポリヌクレオチド分子にぉレ、て、比較の基準となるポリペプチドまたはポリ ヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有する力、あるいは有すること力 S 予測されるアミノ酸または核酸をレ、い、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同 様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるポリヌク するオルソログにおける同様の部分であり得る。本明細書では、ブルーム症候群遺 伝子の機能を担うアミノ酸は、マウスのブルーム症候群遺伝子が他の動物の対応す るアミノ酸が同様に機能を担うことが理解される。
[0062] 本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種 における所定の遺伝子と同様の作用を有する力、、または有することが予測される遺伝 子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起 源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオル ソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウスブルーム症候群遺伝子に対 応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝 子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例 えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例 えば、マウスブルーム症候群遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例 えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
[0063] 本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよレ、。 「誘導 体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは 異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレ ォチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導 体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォエート、ホスホ ノレアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、 2_〇一メチルリボヌク レオチド、ペプチド—核酸 (PNA)が含まれるが、これらに限定されない。
[0064] 本明細書にぉレ、て、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（ 長さが n)に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオ チドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例え ば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 2 0、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙して レ、ない整数で表される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。また 、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15, 20、 25、 30、 40、 50、 75、 100 およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表 される長さ（例えば、 11など)もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核 酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなぐ同じ機能を有 する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例え ば上下 10%)のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本 明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「 約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えなレ、ことが理解されるべきである。
[0065] 本明細書において、「ブルーム症候群遺伝子」、「Bloom」遺伝子、「ブルーム」遺 伝子、および「Blm」遺伝子は、交換可能に用いられ、 DNA修復に関連する遺伝子 異常による疾患群であって、小頭症，小人症を伴う劣性遺伝病の原因遺伝子をいう。 ブルーム症候群遺伝子としては、例えば、
(A) (a)配列番号 1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌク レオチド；
(b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加お よび欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチド であって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体で ある、ポリヌクレオチド；
(e)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする 、ポリヌクレオチド；
(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジヱント条件下でハイブリ ダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；また は
(g) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一 性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
(B) (a)配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリぺプ チド；
(b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加およ び欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を 有する、ポリペプチド；
(c)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体に よってコードされる、ポリペプチド；
(d)配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
(e) (a)〜（d)のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であ るアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるがそれらに限定されなレ、。ブルーム 症候群（Blm)遺伝子は好ましくは、
(A) (a)配列番号 1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌ クレ才チド；
(b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントを コードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加お よび欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチド であって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド;
(d)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体で ある、ポリヌクレオチド；
(e)配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体をコードする 、ポリヌクレオチド；
(f) (a)〜（e)のいずれ力 1つのポリヌクレオチドにストリンジヱント条件下でハイブリ ダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；また は
(g) (a)〜（e)のいずれ力、 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一 性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、
核酸分子；あるいは
(B) (a)配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリぺプ チド； (b)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加およ び欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を 有する、ポリペプチド；
(c)配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体に よってコードされる、ポリペプチド；
(d)配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
(e) (a)〜（d)のいずれ力 4つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であ るアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
を含む、
ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられるがそれらに限定されない。
[0066] 本明細書において「外来遺伝子」とは、ある生物において、その生物には天然には 存在しない遺伝子をいう。そのような外来遺伝子は、その生物に天然に存在する遺 伝子を改変したものであってもよぐ天然において他の生物に存在する遺伝子 (例え ば、ブルーム遺伝子）であってもよぐ人工的に合成した遺伝子であってもよぐそれ らの複合体 (例えば、融合体）であってもよい。そのような外来遺伝子を含む生物は、 天然では発現しなレ、遺伝子産物を発現し得る。
[0067] 本明細書にぉレ、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現 」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう 。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなど力 転写および翻訳されて、ポリペプチド の形態になることをいうが、転写されて mRNAが作製されることもまた発現の一形態 であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを 受けたものであり得る。
[0068] 従って、本明細書にぉレ、て遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の 「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が 有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少 を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「 増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が 有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加 を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作 用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、ま つたくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにする こと、およびすでにその遺伝子の発現が見られてレ、た場合にその遺伝子の発現が増 大することを包含する。
[0069] 本明細書において「薬剤」とは、その存在下において、特定の細胞が生存する（ま たはより強く生存する）が、別の特定の細胞が生存しないほたは弱く生存する）ような 性質を有する化合物をいい、細胞の生存の有無または強弱によって、細胞を選択す ること力 Sできる。そのような薬剤としては、例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、 エストロジヱン誘導体およびプロジヱストロン誘導体などを挙げることができるがそれら に限定されない。本明細書では、外的因子（例えば、抗生物質）の存在によって、発 現が誘導されるか、または誘導がとまるような遺伝子であることが好ましレ、。
[0070] 本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタ ンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写 促進活性)を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がアンチセンス分子であ る場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制 などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵 素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応 するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野におい て周知の技術によって測定することができる。
[0071] 本明細書にぉレ、て「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制 または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、 目的とする遺伝 子（例えば、 Blm)の核酸配列と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の 核酸配列によって達成される。このようなアンチセンス活性を有する分子をアンチセ ンス分子という。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチ ド長の、より好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 11の連続する ヌクレオチド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌクレオチド長の、 14の連続するヌクレオチド長の、 15の連続するヌクレオチド長の、 20の連続するヌク レオチド長の、 25の連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40 の連続するヌクレオチド長の、 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。 そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましく は、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、 90%相同な、もっとも好ましくは 95% 相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、 目的とする遺伝子の核 酸配列の 5 '末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセン スの核酸配列には、上述の配列に対して、 1つまたは数個あるいは 1つ以上のヌクレ ォチドの置換、付加および Zまたは欠失を有するものもまた含まれる。
[0072] 本明細書において「RNAi」とは、 RNA interferenceの略称で、二本鎖 RNA (ds RNAともいう）のような RNAiを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同な mRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用 レ、られる技術をいう。本明細書において RNAiはまた、場合によっては、 RNAiを引き 起こす因子と同義に用いられ得る。
[0073] 本明細書において「RNAiを引き起こす因子」とは、 RNAiを引き起こすことができる ような任意の因子をレ、う。本明細書にぉレ、て「遺伝子」に対して「RNAiを弓 [き起こす 因子」とは、その遺伝子に関する RNAiを引き起こし、 RNAiがもたらす効果 (例えば 、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのような RNAiを引き起こ す因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 70% の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列を含 む、少なくとも 10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む RNAまたはその改変体が挙げ られるがそれに限定されなレ、。ここで、この因子は、好ましくは、 3'突出末端を含み、 より好ましくは、 3'突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の DNA (例えば、 2〜4ヌクレオ チド長の DNAであり得る。
[0074] 理論に束縛されないが、 RNAiが働く機構として考えられるものの一つとして、 dsR NAのような RNAiを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、 4 0塩基対以上） RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer)と呼ばれる R Naselll様のヌクレアーゼが ATP存在下で、その分子を 3'末端力 約 20塩基対ず つ切り出し、短鎖 dsRNA (siRNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「siRN A」とは、 short interfering RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまた は生化学的に合成されたもの力、あるいは生物体内で合成されたもの力、あるいは 約 40塩基以上の二本鎖 RNAが体内で分解されてできた 10塩基対以上の短鎖二本 鎖 RNAをレ、い、通常、 5 '—リン酸、 3 ' _〇Hの構造を有しており、 3 '末端は約 2塩 基突出している。この siRNAに特異的なタンパク質が結合して、 RISC (RNA_indu ced_ silencing— complex)が形成される。この複合体は、 siRNAと同じ配列を有 する mRNAを認識して結合し、 RNaselll様の酵素活性によって siRNAの中央部で mRNAを切断する。 siRNAの配列と標的として切断する mRNAの配列の関係につ いては、 100%—致することが好ましレ、。し力、し、 siRNAの中央力、ら外れた位置につ いての塩基の変異については、完全に RNAiによる切断活性がなくなるのではなぐ 部分的な活性が残存する。他方、 siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きぐ R NAiによる mRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異 をもつ mRNAについては、その変異を中央に配した siRNAを合成し、細胞内に導 入することで特異的に変異を含む mRNAだけを分解することができる。従って、本発 明では、 siRNAそのものを RNAiを引き起こす因子として用いることができるし、 siR NAを生成するような因子（例えば、代表的に約 40塩基以上の dsRNA)をそのような 因子として用いることができる。
[0075] また、理論に束縛されることを希望しないが、 siRNAは、上記経路とは別に、 siRN Aのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメラーゼ（RdRP)の プライマーとして作用し、 dsRNAが合成され、この dsRNAが再びダイサ一の基質と なり、新たな siRNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫など では、例えば 35分子の dsRNA分子が、 1 , 000コピー以上ある細胞内の mRNAを ほぼ完全に分解することから、 siRNA自体および siRNAが生じるような因子が有用 であることが理角军される。
[0076] 本発明において siRNAと呼ばれる、約 20塩基前後（例えば、代表的には約 21〜2 3塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RNAを用いることができる。このような siR NAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、その siRNAの標的となる 病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することが できる。
[0077] 本発明において用いられる siRNAは、 RNAiを引き起こすことができる限り、どのよ うな形態を採っていてもよい。
[0078] 別の実施形態において、本発明の RNAiを引き起こす因子は、 3'末端に突出部を 有する短いヘアピン構造（shRNA; short hairpin RNA)であり得る。本明細書に おいて「shRNA」とは、一本鎖 RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより 、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約 20塩基対以上の分子を レ、う。そのような shRNAは、人工的に化学合成される。あるレ、は、そのような shRNA は、センス鎖およびアンチセンス鎖の DNA配列を逆向きに連結したヘアピン構造の DNAを T7 RNAポリメラーゼによりインビトロで RNAを合成することによって生成す ること力 Sできる。理論に束縛されることは希望しなレ、が、そのような shRNAは、細胞内 に導入された後、細胞内で約 20塩基（代表的には例えば、 21塩基、 22塩基、 23塩 基）の長さに分解され、 siRNAと同様に RNAiを引き起こし、本発明の処置効果があ ることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含 む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、 sh RNAは、 siRNAと同様に RNAiを引き起こすことから、本発明の有効成分として用い ること力 Sできる。 shRNAはまた、好ましくは、 3 '突出末端を有し得る。二本鎖部分の 長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20 ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3'突出末端は、好ましくは DNAであり得、よ り好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の DNAであり得、さらに好ましくは 2〜4ヌ クレオチド長の DNAであり得る。
[0079] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、人工的に合成した (例えば 、化学的または生化学的)ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この 両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、 液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
[0080] 本発明において用いられる RNAiを引き起こす因子は、インビトロで合成することも できる。この合成系において、 T7 RNAポリメラーゼおよび T7プロモーターを用いて 、铸型 DNAからアンチセンスおよびセンスの RNAを合成する。これらをインビトロで アニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じて RNAiが引き起こ され、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのよう な RNAを細胞内に導入することができる。
[0081] 本発明の RNAiを引き起こす因子としてはまた、 mRNAとハイブリダィズし得る一本 鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。その ような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
[0082] 本明細書において、「ストリンジヱントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」と は、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択 されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー'ノ、イブリダィゼーシヨン法、プラー ク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用 レ、ることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニー あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜： 1. 0Mの Na C1存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC (salin e- sodium citrate)溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウ ム、 15mM クェン酸ナトリウムである）を用レ、、 65°C条件下でフィルターを洗浄する ことにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecu lar Cloning 2ηα ed. , current Protocols m Molecular Biology, Suppl ement 1〜38、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approa ch, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載さ れている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジヱントな条件下でハイブリダ ィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外さ れる。 「ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダィズ条件下で別の ポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドをレ、う。ハイブリダィ ズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性 を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さ らに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。 [0083] 本明細書にぉレ、て「プローブ」とは、インビトロおよび/またはインビボなどのスクリ 一二ングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、 例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド などが挙げられるがそれに限定されなレ、。
[0084] 通常プローブとして用いられる核酸分子としては、 目的とする遺伝子の核酸配列と 相同なまたは相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するも のが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオ チド長の、より好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 11の連続す るヌクレオチド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌクレオチド長の 、 14の連続するヌクレオチド長の、 15の連続するヌクレオチド長の、 20の連続するヌ クレオチド長の、 25の連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 4 0の連続するヌクレオチド長の、 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る 。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相 同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、 90%相同な、 95% 相同な核酸配列が含まれる。
[0085] 本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法によ り、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核 酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al . , J. Mol. Biol. 215 : 403— 410 (1990) )、 FASTA (Pearson & Lipman, Pr oc. Natl. Acad. Sci. , USA 85 : 2444— 2448 (1988) )、 Smith and Water man法（Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147 : 195— 197 (1981) )、およ び Needleman and Wunsch法 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443— 453 (1970) )などが挙げられるがそれらに限定されなレ、。生物学的な検索と しては、ストリンジェントハイブリダィゼーシヨン、ゲノム DNAをナイロンメンブレン等に 貝占り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアツ セィ）、 PCRおよび in situハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定 されない。
[0086] 本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される 高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成 されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、 DNAまたは RNAなど）が用いられ得る。
[0087] 通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、 目的とする遺伝子の核酸配列 と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げら れる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、よ り好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 11の連続するヌクレオチ ド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌクレオチド長の、 14の連続 するヌクレオチド長の、 15の連続するヌクレオチド長の、 16の連続するヌクレオチド 長の、 17の連続するヌクレオチド長の、 18の連続するヌクレオチド長の、 19の連続 するヌクレオチド長の、 20の連続するヌクレオチド長の、 25の連続するヌクレオチド 長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40の連続するヌクレオチド長の、 50の連続 するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には 、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同 な、さらに好ましくは、 90%相同な、 95%相同な核酸配列が含まれる。プライマーと して適切な配列は、合成 (増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当 業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのような プライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンビュ ータプログラム（例えば、 LASERGENE, PrimerSelect, DNAStar)を用いて行つ てもよい。
[0088] 本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」と は、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベル力 その核酸 分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結 合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、 対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸 分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド (例えば、転写因子など)な どが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプタ一一リガンドの 対のいずれか一方、酵素一基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定さ れない。
[0089] (遺伝子の改変）
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク 質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性 は、一般に当該分野で認められている（Kyte. Jおよび Doolittle, R. F. J. Mol. Bi ol. 157 (1) : 105 - 132, 1982)。アミノ酸の疎水白勺十生質 fま、生成したタンノヽ。ク質の 二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプ ター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水 性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは:イソロイシン（ + 4. 5)；バリン（ + 4. 2)；ロイシン（ + 3. 8)；フヱ二ルァラニン（ + 2. 8)；システィン /シスチン（ + 2. 5)；メチォニン（+ 1. 9)；ァラニン（ + 1. 8)；グリシン（一0. 4)；スレ ォニン（一0. 7) ;セリン（一0. 8)；トリプトファン（一0. 9) ;チロシン（一1. 3) ;プロリン (- 1. 6)；ヒスチジン（一3· 2)；グルタミン酸（一3· 5)；グノレタミン（一3· 5)；ァスパラ ギン酸（一3. 5)；ァスパラギン（一3· 5) ;リジン（一3. 9)；およびアルギニン（一4. 5) )である。
[0090] あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依 然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 (例えば、酵素活性にぉレ、て等価 なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換に おいて、疎水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好まし ぐおよび ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなァミノ 酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
[0091] 親水性指数もまた、ポリペプチドの設計において考慮され得る。米国特許第 4, 55 4, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられてい る：アルギニン（ + 3. 0)；リジン（ + 3. 0)；ァスパラギン酸（ + 3. 0 ± 1)；グルタミン酸（ + 3. 0 ± 1)；セリン（ + 0. 3)；ァスパラギン（ + 0. 2)；グルタミン（ + 0. 2)；グリシン（0 )；スレオニン（一0. 4)；プロリン（一0. 5 ± 1)；ァラニン（一0. 5)；ヒスチジン（一0. 5) ；システィン（一1. 0)；メチォニン（一1. 3)；バリン（一 1. 5)；ロイシン（一1. 8)；ィソロ イシン（一 1. 8) ;チロシン（一2. 3)；フエ二ルァラニン（一2. 5)；およびトリプトファン（ 3. 4)。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え 得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親 水性指数が ± 2以内であることが好ましぐ ± 1以内であることがより好ましぐおよび ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。
[0092] 本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換さ れるアミノ酸との親水性指数または/および疎水性指数が上記のように類似してレ、る 置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、土 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ± 0. 5以内のもの 同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業 者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；ダル タミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン ；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定され ない。
[0093] 本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの 物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改 変体、付加改変体、欠失改変体、短縮 (truncated)改変体、対立遺伝子変異体な どが挙げられる。対立遺伝子（allele)とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される 遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して 、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常そ の対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配歹 1Jを有し、通常はほぼ 同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「 種相同体またはホモログ（homolog)」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レべ ルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60%以上の相同性、より好まし くは、 80。/o以上、 85。/0以上、 90%以上、 95%以上の相同性）を有するものをいう。 そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。 「オルソ ログ (ortholog)」とは、ォノレソロガス遺伝子 (orthologous gene)ともレヽレ、、二つの 遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子 構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのひへモグロ ビン遺伝子はオルソログである力 S,ヒトのひヘモグロビン遺伝子および βヘモグロビン 遺伝子はパラログ (遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オノレソログは、分子系統樹 の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果 たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用 であり得る。
[0094] 本明細書において、 Blm遺伝子を機能しないようにすることは、 Blm遺伝子の正常 な機能を破壊 (または低下）するように改変するか、 Blm遺伝子が欠失するように細 胞を操作するか、アンチセンスまたは RNAiのような技術によって、 Blm遺伝子を機 能させなくする力 \あるいは一過的に機能しないように薬剤などにより処理することに よって達成され得る。
[0095] 本明細書において「変異誘発」とは、ある遺伝子に対して変異を生じさせることをい レ、、そのような変異誘発の因子としては、例えば、変異原（例えば、 N—ェチル _N _ ニトロソ尿素 (ENU)、ニトロソァミン誘導体など）、トランスポゾン遺伝子の利用、紫外 線への暴露および放射線へのなどを挙げることができるがそれらに限定されなレ、。ト ランスポゾンを利用した変異誘発は、本発明者らの技術（国際公開 WO02/13602 )を参酌して、当業者が実施することができることが理解される。
[0096] 本明細書にぉレ、て「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配 列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは 、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をレ、い、核酸がァミノ 酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のた め、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コ ドン GCA、 GCC、 GCG、および GCUはすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。した がって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた ポリペプチドを変更することなぐ記載された対応するコドンの任意のものに変更され 得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレン ト改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は また、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核 酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、および通常トリプ トフアンのための唯一のコドンである TGGを除く） 、機能的に同一な分子を産生す るために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸 の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そ のような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステ インの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限 酵素などによる切断、 DNAポリメラーゼ、 Klenowフラグメント、 DNAリガーゼなどに よる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩 基置換法（特定部位指向突然変異法； Mark Zoller and Michael Smith, Me thods in Enzymology, 100, 468— 500 (1983) )力 S挙げ、られる力 S、この他にも 通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
[0097] 本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の 置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の 置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、：!〜 10個、好ましくは 1〜5個、より好ま しくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖 に 1つ以上、例えば、 1〜： 10個、好ましくは:!〜 5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸 を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、：!〜 10個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。ァ ミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシ ノレ化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化）などを含む力 S、これらに限 定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよぐ非天 然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよレ、。天然のアミノ酸が好ましい。
[0098] 本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」と は、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能また は生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとの ペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付カ卩または置 換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機 能 (例えば、 pKa値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結 合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるよ うに、このような付カ卩または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分 野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナ口 グは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
[0099] 同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核 酸とは異なる化合物である力 ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも 1つの化学的 機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナ ログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のヌクレオチドアナ ログまたはヌクレオチド誘導体が付カ卩または置換されているものが含まれる。
[0100] 本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリ ペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部 が欠失または他の塩基により置換されていてもよぐあるいは他の核酸配列が一部揷 入されていてもよい。あるいは、 5 '末端および Zまたは 3 '末端に他の核酸が結合し ていてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハ イブリダィズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコー ドする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発 明において利用することができる。
[0101] このような核酸は、周知の PCR法により得ることができ、化学的に合成することもで きる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダィゼーシヨン法な どを組み合わせてもよい。
[0102] 本明細書にぉレ、て、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付カ卩または欠失」 とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはそ の代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物力 置き換わること、付け加わること または取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野 において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが 挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよぐそのような 数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、 ホルモン、サイト力インの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる 。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 20 %以内、 10%以内、または 100個以下、 50個以下、 25個以下などであり得る。
[0103] 本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特 定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レべ ルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発 現してもよぐそれ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発 現するとは、ある部位にぉレ、てのみ発現することをレ、う。
[0104] 本明細書において「相同組換え」は、染色体間の対応する DNA部分の交換現象 をいい、例えば、 Blm遺伝子の欠損および Cre/loxPシステムという条件に曝すこと によって達成することができる。特に、相同組換えを前記細胞の 4N期に誘発させるこ とが所望される場合は、 Blm遺伝子の欠損および Cre/loxPシステムとレ、う条件に 曝すことによって達成することができる。
[0105] 本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手 法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. e t al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001)； Ausubei, F. M. (1987) . Current Pro tocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand Wiley— Inte rscience ; Ausubei, F. M. " 989) . Short Protocols in Molecular Biolog y : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecul ar Biology, Greene Pub. Associat ESand Wiley— Interscience； Sambro ok, J. et al. (1989) . Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその 3rd Ed. (2001) ; Innis, M. A. (1990) . PCR Pro tocols： A Liuide to Methods and Applications, Academic Press ;Aus ubel, F. M. (1992) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compe ndium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, G reene Pub. Associates ; Ausubei, F. M. (1995) . Short Protocols in Mo iecular Biology : A compendium of Methods from Current Protocol s in Molecular Biology, Greene Pub. Associates； Innis, M. A. et al. ( 1995) . PCR Strategies, Academic Press ; Ausubei, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates ； Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications： Protocols for Functi onal Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実 験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部 分 (全部であり得る）が参考として援用される。
[0106] 人工的に合成した遺伝子を作製するための DNA合成技術および核酸化学にっレ、 ては、例えば、 Gait, M. J. (1985) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRLPress ; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis : A Practical Approach, IRL Press ; Eckstein, F. (1991) . Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approac, IRL Press ; Adams, R. L. etal. ( 1992) . The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hall ; Sha barova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic A cids, Weinheim； Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Che mistry and Biology, Oxford University Press； Hermanson, G. T. (1996 ) . Bioconjugate Techniques, Academic Pressなどに記載されており、これら は本明細書において関連する部分が参考として援用される。
[0107] 本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組換えべクタ 一」とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクタ 一をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫 細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または 染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプ 口モーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローユングに適した ベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制 限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクロー ユングに使用可能なベクターは、当該分野において多数存在し、販売元により、微妙 な違レ、（例えばマルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配歹' J)から名前を変え て販売されている。例えば、 In Molecular Cloning (3rd edition) Sambrook , J and Russell, D. W. , Appendix 3 (Volume 3) , Vectors and Bacter ial strains. A3. 2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)に代表的なものが記 載 (発売元も記載)されており、そのようなものを当業者は適宜目的に応じて使用する こと力 Sできる。
[0108] 本明細書にぉレ、て「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプ 口モーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結 されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネータ一、薬剤耐性 遺伝子のような選択マーカーおよび、ェンノヽンサ一を含み得る。生物（例えば、動物 )の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じ て変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
[0109] 本明細書において使用される組換えベクターとしては、例えば、ゲノムライブラリー のスクリーニングにはラムダ FIXベクター（ファージベクター）を、 cDNAのスクリー二 ングではラムダ ZAPベクター（ファージベクター）を利用することができる。ゲノム DN Aのクローニングには pBluescript II SK + /— , pGEM, pCR2. 1 ベクター（プ ラスミドベクター）を主に使用することができる。発現ベクターとして pSV2neoベクター (プラスミドベクター）を利用することができる。このようなベクターは、前出の Molecul ar Cloning A3. 2を参考にして適宜実施することができる。
[0110] 本明細書において「ターミネータ一」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下 流に位置し、 DNAが mRNAに転写される際の転写の終結、ポリ A配列の付力卩に関 与する配列である。ターミネータ一は、 mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量 に影響を及ぼすことが知られている。
[0111] 本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また その頻度を直接的に調節する DNA上の領域をレ、い、通常 RNAポリメラーゼが結合 して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロ モーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、 通常、推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上流約 2kbp以内の領域であること が多いので、 DNA解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード 領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域 は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定さ れず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一 ェキソン翻訳開始点から上流約 2kbp以内に存在する。
[0112] 本明細書において「ェンハンサー」とは、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用 レ、られる配列をいう。そのようなェンハンサ一は当該分野において周知である。ェン ハンサ一は複数個用いられ得る力 S1個用いられてもよいし、用いなくともよい。
[0113] 本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現 (作動） 力 Sある転写翻訳調節配歹 IK例えば、プロモーター、ェンハンサーなど）または翻訳調 節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結 されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ず しも隣接して配置される必要はなレ、。
[0114] 本明細書において、「一過的に機能しないように処理」とは、一過的に、ある遺伝子 の機能が発揮されないように処理されていることをいい、例えば、ある遺伝子がある 因子をコードする遺伝子に作動可能に連結されることによって、その因子のスィッチ のオンオフを担う因子（例えば、金属、抗生物質、薬剤など）が存在または不存在とな つたときに、その遺伝子が機能しなレ、ように配置されてレ、ることをレ、う。
[0115] 本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよぐ 例えば、形質転換、形質導入、トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核 酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、 例えば、 Ausubel F. A.ら編 (1988)、 Current Protocols in Molecular Bi ology、 Wiley、 New York；、 NY; Sambrook Jら "987) Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.およびその第三版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブ ロット、ウェスタンプロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣 用技術を用いて確認することができる。
[0116] また、ベクターの導入方法としては、細胞に DNAを導入する上述のような方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、トランスフエクシヨン、形質導入、形質転換な ど（例えば、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、エレクトロボレ ーシヨン法、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
[0117] 本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生 命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植 物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転 換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられ る細胞は、形質転換体であってもよい。
[0118] 本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核 生物糸田胞としては、 Escherichia属、 Serratia属、 Bacillus属、 Brevibacterium属 、 Corynebacteriumfe、 Microbacteriiim属、 Pseudomonas属などに,禺 "5— 原核 生物細胞、例えば、 Escherichia coli XLl -Blue, Escherichia coli XL2 - B lue、 Escherichia coli DHlが例示され、そのような細胞は、 In "Molecular CI oning edition) by Sambrook, J and Russell, D. W. , Appendix 3 (Volume 3) , Vectors and Bacterial strains. A3. 2 (Cold Spring H arbor USA 2001) に記載されている。
[0119] 本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラ ット.ミエローマ細胞、マウス ·/、イブリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞で ある CHO細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT563 7 (特開昭 63— 299)、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ 細胞としては、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2/0など、ヒト胎 児腎臓細胞としては HEK293 (ATCC： CRL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL— 1など、アフリカミドリザノレ腎臓細胞としては COS— 1、 COS— 7、 ヒト結腸癌 細胞株としては HCT— 15が例示され、好ましくは、例えば、 Cosl , NIH3T3, ES (Rl , TMA, NR2)細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
[0120] 本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、 DNAを 導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレ タトロポレーシヨン法 [Methods. Enzymol. ， 194， 182 (1990) ]、リポフエクシヨン 法、スフエロプラスト法 [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84， 1929 (1978) ]、酢酸 リチウム法 . Bacteriol. , 153, 163 (1983) ]、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978)記載の方法などが例示される。
[0121] 本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において 用いられる、 Cre酵素の一過的発現、染色体上での DNAマッピングなどは、細胞ェ 学別冊実験プロトコールシリーズ「FISH実験プロトコール ヒト'ゲノム解析から染色 体 ·遺伝子診断まで」松原謙一、吉川 寛 監修 秀潤社 (東京)などに記載されるよ うに、当該分野において周知である。
[0122] 本明細書において遺伝子発現 (たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現）の「検 出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切 な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブ ロット法、ドットプロット法または PCR法などが例示される。免疫学的測定方法としては 、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる ELISA法、 RIA法、蛍光 抗体法、ウェスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法と しては、 ELISA法または RIA法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プロ ティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイについて は、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」）に広く概説され ている。プロテインアレイについては、 Nat Genet. 2002 Dec ; 32 Suppl : 526 —32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT-PCR, RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hybridシステム、インビトロ翻訳などが挙 げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解 析実験法 ·中村祐輔ラボ，マニュアル、編集 ·中村祐輔 羊土社 (2002)などに記載さ れており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
[0123] (スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、 目的とするある特定の性質をもつ生物ま たは物質 (例えば、遺伝子)などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集 団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の細胞を使用するこ とができる。
[0124] 本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型 分類（immunophenotyping)」ともいう。種々の技術が、マーカーを発現する細胞 集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてそ の技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス (すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「バニング (panning)」、ならびにフロ 一サイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第 5, 985, 660号；および Morriso n et al.， Cell, 96： 737— 49 (1999)を参照）。
[0125] スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよぐィ ンシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよ レ、。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、 本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をも とに、コンピュータモデリングによる薬物、診断剤、治療薬などが提供されることも企 図される。
[0126] 本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための遺伝子、化合物 、細胞などの一定の集合をいう。ライブラリ一は、同様の性質を有する遺伝子、化合 物、細胞などの集合であっても、ランダムな遺伝子、化合物、細胞などの集合であつ てもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予測される遺伝子、化合物、細胞などの 集合が使用されるが、それに限定されない。
[0127] 本発明において作製される幹細胞（例えば、 ES細胞）の改変体は、ランダムにゲノ ム全体に改変が導入されていることから、その集合は、種々の遺伝子の解析に有用 なライブラリ一として用いられ得ることが理解される。
[0128] 本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、そ の全体力 S、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援 用される。
[0129] 以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以 下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は 、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従つ て、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限 定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 実施例
[0130] 以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵 守した。
[0131] (実施例 1 :条件的な Blm ES細胞の作製）
(条件的な Blm ES細胞の作製方法）
マウス Blm遺伝子（配列番号 1および 2)を含むゲノム DNAを Rl—ESゲノムライブ ラリーから単離した。ターゲテイングベクターを R1—ES細胞に導入し、続けて G418 選択および/またはピューロマイシン選択 (シグマ）を行った。標的化したクローンを PCRによってスクリーニング（Expand High Fidelity PCR System (Roche) ) し、そしてサザンブロット解析（Rapid— hyb buffer (アマシャムフアルマシア））で確 認した。本研究で使用した標的化したクローンは全て、正常な核型を保有した。
[0132] (ウェスタンブロット解析）
Blmtet/tetES細胞を 1 · O g/mlのドキシサイクリン（dox) (シグマ）を含む培地中 で培養し、適切な時点で収集した。 dox中止後の Blm発現を調べるために、 doxを含 む培地中で培養した細胞を PBSで 1回洗浄し、収集するまで、さらに doxの不在下で 細胞を培養した。 Blmタンパク質を抗 BLM抗体（ab476、 abeam)で検出した。ゥヱ スタンブロットは、 ECL Western Blotting Detection Reagents (アマシャムフ アルマシア）を用いた。
[0133] (SCE解析）
適切な期間、 doxの存在下または不在下で培養した Blmtet/tetES細胞を、 3 z g/ mlの 5 -ブロモデォキシゥリジン（BrdU) (シグマ）で 20時間標識し、 0. 1 μ g/mlのコ ノレセミド（KaryoMax— Colcemid (インビトロジェン））で 45分間処理した。広がった 染色体を 0. lmgZmlのアタリジンオレンジ（シグマ）で染色した。
[0134] (機能解析）
変異 neo遺伝子（Koikeら、 EMBO Rep. 3、 433〜437 (2002)を参照のこと）（ 配列番号 4および 5)を有する Fasl遺伝子座に対するターゲテイングベクターを、 Blm tet/tetES細胞に導入した。二多型の変異誘発率を、前述 (Koike, H.ら、 EMBO R ep. 3 : 433〜437 (2002)を参照のこと）の!^11^ 06 1：1^ 機能解析を用ぃて測 定した。詳細には、 Blmtet/tetES細胞を 1. O g/mlの doxの存在下または不在下 で 24時間培養し、 doxを伴って力または伴わなレ、純系濃度の培養条件で 100mm培 養皿に撒いて、単一細胞クローンを得た。次いで、 doxを伴わない高用量 G418 (l . OmgZml)の補助により、広がった単一細胞クローンを選択した。選択の 10日後に、 高用量 G418耐性クローンの数を数えた。
[0135] (ENU変異誘発および GPIアンカー変異体のためのスクリーニング）
ENU変異誘発および Hprt遺伝子座の変異頻度の算出は、 Chen, Y.ら、 Natur e Genet. 24, 314〜317(2000)に記載された方法で行った。変異誘発された ES 細胞を、 doxの存在下または不在下で 4日間培養し、変異 ES細胞ライブラリーを作 製した。この変異ライブラリーおよびコントロールライブラリーを、 1mlあたり 1. 0 X 106 細胞の懸濁液中、 10nMのプロアエロリジン（Protox Biotech)で処理し、ゼラチン コーティングした 100mm培養皿に、培養皿 1枚あたり 5〜8 X 106細胞で撒いた。次 の日、死細胞を洗い出し、生細胞をさらに 5nMのプロアエロリジンで 8時間処理し、 マイトマイシン C (協和発酵 (株） )で処理したフィーダ一細胞を添加し、 GPIアンカー 欠損変異体コロニーを作製した。結果として得られたコロニーを収集して拡大させ、 相補性アツセィのために、 GFP— GPI発現ベクターおよび GPIアンカーの生合成に 関する cDNAを用いてトランスフエタトした（TransFast transfection reagent (プ 口メガ）、 DNA 2mg、 TransFast 12 /i 1を 1 · 0 X 105個の ES細胞に加える）。
[0136] (結果）
図 laは、テトラサイクリンで条件的に調節される Blm対立遺伝子（Blmtet)の概略図 (配列番号 3)である。テトラサイクリン系ベースの調節カセット（tetカセット）（Bond, C . T.ら、 Science 289： 1942〜1946 (2000)を参照のこと）を、 Blmの両対立遺伝 子の翻訳開始コドンの直上流に挿入し、これらを Blmtetと交換した。ターグティングは 、サザンプロット解析で確認した（図 lb)。本発明者らは、 Blmの持続的な欠損は、ゲ ノム上での二対立遺伝子変異の持続的な集積を引き起こし、結果として長期の培養 の間に表現型を変化させると仮定した。その一方、 Blmtetによってもたらされる Blmの 一過性の喪失は、表現型における変化を最小限にする。 Blm発現の調節は、テトラ サイクリンアナログであるドキシサイクリン（dox)を使用することによって調べた。 dox の添加は、結果として Blmタンパク質の急速な減少をもたらした（図 lcおよび Id)。よ り重要には、 Blmタンパク質は、 doxの中止後にその本来のレベルを回復した（図 lc )。ブルーム症候群細胞（German, J.、 Dermatol. Clin. 13： 7〜： 18 (1995)を参 照のこと）の代表的な細胞遺伝現象である、姉妹染色分体交換 (SCE)の高いレベル が観察された一方で（図 le)、 Blmタンパク質は検出されなかった（図 lc)。 SCEは、 脊椎動物細胞において相同組換えと密接に関連する（Sonoda, E.ら、 Mol. Cell. Biol. 19 ; 5166〜5169 (1999)を参照、のこと）。それゆえ、 dox処理は、ネ目同染色体 間の組換えを誘導すると予想され得、組換えが 4N期に起こる場合、一対立遺伝子 変異が細胞分裂の後に二対立遺伝子変異となる（図 2a)。二対立遺伝子変異の割 合における一過性の Blm欠損の影響を調べるために、「一対立遺伝子変異」モデル としての遺伝子ターゲテイングによって、変異 neo遺伝子を Fasリガンド（Fasl)遺伝子 座に導入した。本発明者らは以前に、「二対立遺伝子変異」を意味する、この遺伝子 座における変異 neo遺伝子の重複が、高用量 G418を使用して選択され得ることを 証明した（Koike, H.ら、 EMBO Rep. 3 : 433〜437 (2002)を参照のこと）。 Luri & 06 1"1^1^周期的変動解析（し111^, S. E.および Delbmck, M.、 Genetics 2 8 : 491〜510 (1943)を参照のこと）によって決定された重複率は、 doxの不在下で 1世代あたりの 1細胞あたり 8. 5 X 10—6事象であるのに対し、この比率は、 doxの存 在下で 1世代あたりの 1細胞あたり 2. 3 X 10—4事象に増加した（図 2b)。それゆえ、 B lmの一過性の喪失は、二対立遺伝子変異の比率に 27倍の増加をもたらした（図 2b) 。本研究で得られたこの比率は、野生型 ES細胞（2. 3 X 10_5)および Blm欠損 ES 細胞（4. 2 X 10— 4)における LOHについて以前に報告されたもの（Luo, G.ら、 Nat ure Genet. 26 : 424〜429 (2000)を参照、のこと）と類似する。
乗換えの染色体上の位置を決定するために、 2つの別々の近交系 129亜系（129 Xl/SvJ X 129S l/SvImJ) (Lefebvre, L.， Dionne, N. , Karaskova, J. , Sq uire, J. A.および Nagy, A.、 Nature Genet. 27 : 257〜258 (2001)を参照の こと）の育種から得た Fl胚から樹立した、 Rl _ES細胞株の第 1染色体における多型 マーカーを使用した（図 2c)。 DlMitlOOlマーカーおよび DlMit292マーカーの それぞれの位置は、 Fasl遺伝子座力も約 30Mb近位および遠位に位置付けられる。 28倍高用量の G418耐性クローンを選択し、乗換えの染色体上の位置を決定し、 10 の乗換え（約 35%)力 SFasl遺伝子座から 30Mb近位の範囲で起こったことを見出した (図 2c)。
[0138] Blm改変 ES細胞における増大した有糸分裂組換えの観察に促され、ゲノム全体に わたって二対立遺伝子変異を含む ES細胞ライブラリー樹立の可能性を調べた。 ES 細胞において非常に高い変異原性を有するため（Chen, Y.ら、 Nature Genet. 24 : 314〜317 (2000)を参照のこと）、 ENUを変異原として使用した。二対立遺伝 子変異の分布および複雑性がゲノム全体を網羅するのに十分高いか否かを決定す るために、 GPIアンカーの生合成において不完全な変異 ES細胞についてスクリー二 ングを行うことにした。少なくとも 23個の遺伝子が GPIアンカーの生合成に関与して おり、これらはマウスのゲノムにおいて広く分布する（図 4b)。 GPI経路内の任意の遺 伝子の変異は、細胞表面上の GPIアンカータンパク質の欠損を生じる。それゆえ、 G PIアンカー欠損細胞は、 GPIアンカー陽性細胞を殺し得るァエロリジン（aerolysin) (Hong, Y.ら、 EMBO J. 21： 5047〜5056 (2002)を参照のこと）によって正に 選択され得る。本研究で使用した ES細胞株は、雄由来であり、 GPIアンカー生合成 の第 1段階に関与する PigA遺伝子は X染色体に位置付けられる。それゆえ、この機 能的破壊は二対立遺伝子変異を必要とせず、 GPI欠損変異の大半が PigA変異に 由来する (Kawagoe, K. , Takeda, J. , Εηαο, Υ.および Kmoshita, Τ. 、 Geno mics 23 : 566〜574 (1994)を参照のこと）。このようなバイアスを回避するために、 PIGA cDNAの余分なコピーを Blmtet/tetES細胞に導入し、続けて ENU変異誘発 を行った。
[0139] 図 3aは、 ES細胞の ENU変異誘発、 ES細胞ライブラリーの作製、および GPIアン カー欠損変異体についてのスクリーニングのプロトコルを示す。 0. 2mgZmlの量の ENUを使用して、 37°Cで 2時間、 2 X 108個の ES細胞を処理した。細胞の生存度は 約 3%であり、 6 X 106個の細胞が ENU処理後に生き残った。生存細胞における変 異の頻度は、 6—チォグァニンを用いる選択によって決定したところ、 X連鎖の一対 立遺伝子ヒポキサンチンホスフオリボシルトランスフェラーゼ（Hprt)遺伝子座にぉレヽ て 2, 400分の 1だった。 Chenらは以前に、より高い濃度の ENU (0. 35mg/ml)で 処理した ES細胞力 生殖細胞系列の能力を保持することを報告し（Chen, Y.ら、 N ature Genet. 24： 314〜317 (2000)を参照のこと）、処理した細胞の長期の生存 度力 野生型の ES細胞に類似することを示唆した。細胞周期の 3世代にわたる dox 処理によって誘導した二対立遺伝子変異の頻度は、遺伝子座あたり 0. 7 X 10_6で あると算出され、二対立遺伝子変異を有する独立したクローンの数は、遺伝子座あた り 4. 2個と評価された（図 3b)。これらの結果は、本発明者らの ES細胞ライブラリーが ほとんどの遺伝子座において二対立遺伝子変異を含むことを示唆する。
この原理の実用的な有用性を証明するために、 ES細胞ライブラリーをァエロリジン（ aerolysin)を用いてスクリーニングし、 35個の GPIアンカー欠損変異体を単離した（ 図 3a)。 GPIアンカー GFP構築物（GFP— GPI) (Kondoh, G.ら、 FEBS Lett. 4 58： 299〜303 (1999)を参照のこと）を野生型 ES細胞にトランスフエタトした場合、 GFP— GPIタンパク質が細胞表面上に発現する（図 4a)。その一方、相補的 cDNA を供給した場合、 GFP— GPIタンパク質は変異体上のみで発現した（図 4a)。それゆ え、 GPIアンカーの生合成に関する遺伝子の cDNAのトランスフエクシヨンを伴う相補 性解析によって、これらの変異体を分類した。変異遺伝子は、ゲノム全体にわたって 広く分布し、変異体を一回りのスクリーニングで公知の遺伝子の半分以上（23分の 1 2)において同定した（図 4b)。図 4cでは、 4つの遺伝子において 1つの変異体が得ら れたのに対し、他の常染色体遺伝子において 1つ以上の変異体が得られた。この遺 伝子のヒットは頻繁に同じ変異を有するので、これらの変異体はおそらく単一クロー ン由来である。それゆえ、変異体の数における差異は、 doxの添カ卩後、いつ変異が 生じるのかによって説明され得る。これらの変異体の配列決定解析は、これらが野生 型対立遺伝子の配列を含まないことを明らかにし（図 4dおよび 4e)、二対立遺伝子 変異は doxで処理した ES細胞において生じることを示唆した。 dox処理をしない場合 、 1つの変異体のみが単離された（データは示さず)。さらに、 GPIアンカー生合成は 、 2つの変異体における cDNAトランスフエクシヨンによって補完されず、これらが新 規遺伝子に変異を有することを示唆する（図 4f)。 GPIアンカーの生合成における欠 損は、細胞融合によって補完されるので、これらの変異体では別々の遺伝子が変異 していなければならなレ、（データは示さず)。 [0141] 本発明者らは、劣性変異体の単離が、哺乳動物細胞においてゲノム全体にわたる 様式で可能であることを証明した。本発明者ら（Koike, H.ら、 EMBO Rep. 3 : 43 3〜437 (2002)を参照のこと）および他の研究者（Liu, P. , Jenkins, N. A.およ び Copeland, N. G. 、 Nature Genet. 30 : 66〜72 (2002)を参照のこと）力 こ れまでに、 Cre/loxPが媒介する相同染色体間の組換えによって二対立遺伝子を 導入する方法を報告したが、これは、両方の対立遺伝子に ΙοχΡ部位を有する、前も つて選択された染色体にしか適用され得なレ、。多くの、し力、し全てではない遺伝子座 は、チャイニーズノヽムスター卵巣（CH〇）細胞株（Gupta, R. S. ， Chan, D. Y.お よび Siminovitch, L. 、 Cell 14 : 1007〜1013 (1978)を参照、のこと）におレヽて機 能的に一倍体であり、劣性表現型を有する変異細胞の単離が報告された (Hanada , K.ら、 Nature 426： 803〜809 (2003)を参照のこと）。し力し、変異体の単離の 確率は、標的遺伝子が CHO細胞において機能的に一倍体または二倍体であるかど うかに大きく依存するので、変異体の非ランダムな単離が予想され得る（Nakamura , N.ら、 J. Biol. Chem. 272 : 15834〜： 15840 (1997)を参照のこと）。ここに幸艮告 した研究において、 GPIアンカー生合成に関する公知の遺伝子の半分以上力 正常 な核型を有する ES細胞における一回りの選択で同定され得、従って、本発明者らの 選択概要のランダムな性質を証明した。理論上、二対立遺伝子変異はたいていの遺 伝子座で生じるが（図 3b)、ほぼ半分の GPIアンカー欠損変異体は取得し得なレ、。こ の不完全な適用範囲は、 ES細胞における ENUでの AT塩基対の優性変異によって 説明され得る（Munroe, R. J.ら、 Nature Genet. 24： 318〜321 (2000)を参照 のこと）。この可能性は、異なる型の変異に対する優先傾向を有する、 EMSおよび IC R191のような他の化学変異誘発物質によって調べられる。
[0142] 特定の表現型を引き起こす遺伝子を同定するためには、発現クローニングが率直 なアプローチであると予想され得る。 cDNAライブラリーの形質導入のための高効率 なシステムの最近の発展（例えば、 ES細胞で安定に維持されるェピソームベクター（ Chambers, I.ら、 Cell 113 : 643〜655 (2003)を参照のこと）および ES糸田胞にお けるプロモーターのサイレンシングに耐性な、高力価レトロウイルスベクター（Kitamu ra, T.ら、 Exp. Hematol. 31： 1007〜1014 (2003)を参照のこと））は、変異した 遺伝子の同定に大いに役立つ。多型マーカーによる相同性領域の調査は、図 2cで 例示したように、変異の位置を絞り込むことが多い。変異体の細密な遺伝地図を完成 するために、多数の多型マーカーが利用可能な C57BL/6 X 129S4/SvJae F1 ハイブリッド ES糸田胞（Eggan, K.ら、 Pro Natl. Acad. Sci. USA 98 : 6209〜6 214 (2001)を参照のこと）に、 Blmtet対立遺伝子を導入した。原因遺伝子の同定を 容易にするために、ジーントラップ（Friedrich, G.および Soriano, P. 、 Genes D ev. 5 : 1513〜1523 (1991)を参照のこと）のような標識変異誘発が ENUの代わり に使用され得る。実際、 Geoらはレトロウイルスジーントラップベクターを使用してゲノ ム全体にわたる劣性スクリーニングに成功した。
[0143] 表現型ベースの遺伝スクリーニングに関して、観察された表現型が遺伝的変異によ つて引き起こされたものなのか、または単に野生型細胞の特性の変化なのかを判断 するための決定的な判断基準を確立することが重要である。培養条件が注意深く制 御されている場合でさえ、 ES細胞集団の小画分が自発的に分化し得るため、このこ とは、 ES細胞の解析において特に重要である。 Blm発現の一過性の調節は、特定 の表現型の評価に有用である。所望の表現型を有するクローンが、非選択的な培養 条件よりも、 dox処理の培養条件下でより効率的に取得され得る場合、 dox誘導化 L OHによって単離されたこれらのクローンは、二対立遺伝子をかくまうことが多い。本 発明者らのケースでは、非選択的培養条件では 1個のクローンが得られたのみであ つたのに対し、 dox処理の培養条件で 35個のァエロリジン抵抗性クローンが得られた という事実は、さらにこれらのクローンを特徴付けることを促した。多分化能の ES細胞 はレ、かなる種類の組織にも分化し得るため、二対立遺伝子変異の包括的な単離の ための新しい方法は、インビト口ならびにインビボでの分化の分子機構の解析に重大 な影響を有するはずである。
[0144] (参考文献）
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産業上の利用可能性
ES細胞などの幹細胞に自在に変異を誘発することができ、かつ、その変異がゲノ ム全体にわたって導入され得ることから、種々の遺伝子の解析に使用できる幹細胞ラ イブラリーが提供され、このライブラリ一は医薬開発、疾患の解析、疾患の診断、処置 、遺伝子治療などにもちいることができ、産業上における利用価値は高い。

Claims

請求の範囲
[I] 対立遺伝子の両方の鎖に変異が揷入された、幹細胞。
[2] 前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項 1に記載の幹細胞。
[3] 前記幹細胞は、ブルーム症候群（Blm)遺伝子が喪失されてレ、るかまたは機能しなレ、 ように改変されてレ、る、請求項 1に記載の幹細胞。
[4] 前記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載される配列またはその改変体を含 む、請求項 3に記載の幹細胞。
[5] 対立遺伝子の両方の鎖に変異が挿入された、幹細胞のライブラリーであって、該ライ ブラリーに含まれる幹細胞は、ゲノム全体にわたって該変異が導入されている、ライ ブラリー。
[6] 前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項 5に記載のライブラリー。
[7] 前記幹細胞は、ブルーム症候群遺伝子が喪失されている力または機能しないように 改変されている、請求項 5に記載のライブラリー。
[8] 前記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載される配列またはその改変体を含 む、請求項 7に記載のライブラリー。
[9] 対立遺伝子の両方の鎖に変異が導入された幹細胞を生産する方法であって、
A)幹細胞を提供する工程；
B)該幹細胞におけるブルーム症候群遺伝子が機能しないようにする工程；および
C)該幹細胞における変異を誘発する工程、
を包含する、方法。
[10] 前記ブルーム症候群遺伝子は、一過的に機能しないように処理される、請求項 9に 記載の方法。
[II] 前記ブルーム症候群遺伝子は、薬剤の存在下で、一過的に機能しないように処理さ れている、請求項 10に記載の方法。
[12] 前記薬剤は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、エストロジェン誘導体およびプロジェ ストロン誘導体からなる群より選択される、請求項 11に記載の方法。
[13] 前記変異の誘発は、変異原への暴露、トランスポゾン遺伝子の利用、紫外線への暴 露および放射線への曝露からなる群より選択される、請求項 9に記載の方法。
[14] 相同組換えを誘発する工程をさらに包含する、請求項 9に記載の方法。
[15] 相同組換えを前記細胞の 4N期に誘発させ、該誘発後に細胞分裂をさせる工程をさ らに包含する、請求項 14に記載の方法。
[16] 前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項 9に記載の方法。
[17] 前記胚性幹細胞は、哺乳動物の胚性幹細胞である、請求項 9に記載の方法。
[18] 請求項 9に記載の方法によって得られる幹細胞。
[19] 胚性幹細胞である、請求項 18に記載の幹細胞。
[20] 請求項 9に記載の方法によって得られる幹細胞から得られる、組織。
[21] 請求項 9に記載の方法によって得られる幹細胞から得られる、生物体。
[22] 請求項 1に記載の幹細胞から得られる、組織。
[23] 請求項 1に記載の幹細胞から得られる、生物体。
[24] ブルーム症候群遺伝子またはその改変体の、幹細胞の変異のための使用。
[25] 前記ブルーム症候群遺伝子は、前記幹細胞において喪失されるかまたは機能しな レ、ように改変される、請求項 24に記載の使用。
[26] 前記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載される配列またはその改変体を含 む、請求項 24に記載の使用。
[27] ブルーム症候群遺伝子またはその改変体の、幹細胞を変異させるための組成物を 製造するための使用。
[28] 前記 Blm遺伝子は、前記幹細胞にぉレ、て喪失される力または機能しなレ、ように改変 される、請求項 27に記載の使用。
[29] 前記ブルーム症候群遺伝子は、配列番号 1に記載される配列またはその改変体を含 む、請求項 27に記載の使用。
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