JP2004501601A - 標的化によらない内在性遺伝子の活性化組成物および活性化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
(発明の分野)
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野に含まれる。本発明は、一般には、遺伝子発現の活性化、またはin situでの組換え法によって遺伝子を過剰発現させることに関する。より詳細には、本発明は、本発明によって提供される特殊化された活性化ベクターを宿主細胞のゲノム内に非標的化により組み込ませることによる内在性遺伝子の活性化に関する。本発明はまた、これまで発見できなかった遺伝子を同定、活性化および単離するための方法、ならびにそのような単離された遺伝子を含む宿主細胞およびベクターに関する。本発明はまた、単離された遺伝子、遺伝子産物、核酸分子、そしてそのような遺伝子、遺伝子産物および核酸分子を含む組成物に関し、これらは、様々な治療的適用および診断的適用において使用され得る。従って、本発明により、ヒトの疾患および発達と関連する遺伝子を含む内在性遺伝子を、その遺伝子の配列、構造、機能または発現プロフィルの事前の知識を用いることなく同定し、活性化し、そして単離することができる。
【0002】
(背景技術)
ヒトの疾病に関連する新規遺伝子の同定および過剰発現は、新規な治療薬の開発に向けて重要なステップである。タンパク質を過剰発現する細胞のライブラリーの創製に対する現在のアプローチは、cDNAの産生およびクローニングを基本とする。従って、このアプローチを使用して新規な遺伝子を同定するためには、遺伝子が、ライブラリーの作成に使用した細胞中に発現されていなければならない。遺伝子はまた、ライブラリー中に妥当に示されるに十分なレベルで発現されなければならない。これは、多くの遺伝子が非常に少ない量で、僅かな細胞個体群中に、または短い発達期間中にしか発現されていないため問題である。
【0003】
さらに、いくつかのmRNAはサイズが大きいために、生物学的に活性なタンパク質を発現できる全長cDNA分子を産生することは困難であるか、または不可能である。全長cDNA分子の欠乏はまた、小さなmRNAにおいても観察され、逆転写により産生するのが困難であるか、または細菌における繁殖中に不安定であるメッセージ中の配列と関連があると考えられている。結果として、最も完全なcDNAライブラリーでさえ、あり得る遺伝子の全セットの一部のみしか発現しない。
【0004】
最後に、多くのcDNAライブラリーが細菌ベクターで産生される。生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を発現するためにこれらのベクターを使用することは、ほとんどの哺乳動物タンパク質が正しく折りたたまれず、および/または細菌中で不適切にグリコシル化されるために、極めて限定されている。
【0005】
それ故、生物学的に活性なタンパク質の忠実な発現を容易にし得る、タンパク質発現のより代表的なライブラリーの創製法は、極めて価値がある。
【0006】
現在のタンパク質過剰発現法は、目的の遺伝子をクローニングし、それを適切なプロモーター/エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびスプライス部位の隣の構築物中に配置し、構築物を適当な宿主細胞に導入することを含む。
【0007】
別のアプローチは、強力なプロモーターまたは他の調節配列を、前もって同定した遺伝子に標的化することにより、遺伝子発現を活性化するための相同的組換えの使用を含む。
【0008】
WO90/14092には、哺乳動物細胞において、目的のタンパク質をコードする遺伝子のin situ修飾が記載されている。本出願は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的修飾用の一本鎖オリゴヌクレオチドが記載されている。マーカーも含み得る。しかし、この方法は、実質的に標的部位に相同的なオリゴヌクレオチド配列が提供される場合に限定される。従って、この方法は、部位特異的修飾および相同的組換えによる活性化に必要とされる部位の知識を必要とする。新規な遺伝子は、この方法では発見できない。
【0009】
WO91/06667には、哺乳動物遺伝子のin situ発現法が記載されている。この方法を用いて、増幅遺伝子を、相同的組換えにより標的遺伝子の隣に導入する。次いで、細胞を適当な培地で増殖すると、増幅遺伝子および標的遺伝子の両方が増幅され、標的遺伝子の発現が増強する。上記のように、増幅遺伝子の導入法は、相同的組換えに限定され、配列(または存在)が知られていない新規な遺伝子の活性化には有用ではない。
【0010】
WO91/01140には、相同的組換えによる細胞の修飾による内在性遺伝子の不活性化が記載されている。これらの方法により、相同的組換えを使用して、遺伝子を修飾して不活性化し、遺伝子療法におけるドナーとして利用できる細胞が産生される。
【0011】
WO92/20808には、ゲノム標的部位のin situ修飾法が記載されている。修飾は、小さく、例えば、DNAにおける単一の塩基の変化として記載される。この方法は、標的化のための相同的DNAを使用したゲノム修飾に依拠する。
【0012】
WO92/19255には、相同的組換え(ここでDNA配列はゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込まれる)により達成された、標的遺伝子の発現を増強する方法が記載されている。次いで、この修飾された配列は、発現させるために、二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子は、標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅され得る。相同的組換えは、この標的化アプローチに必要である。
【0013】
WO93/09222には、所望の産物をコードする内在性遺伝子の活性化によりタンパク質を生成する方法が記載されている。調節領域を、相同的組換えにより標的化し、発現が望ましい遺伝子と通常関連する領域を置換または無効化する。この無効化または置換により、正常よりも高いレベルでの遺伝子の発現が引き起こされる。
【0014】
WO94/12650には、細胞においてin situで内在性遺伝子の発現を活性化および内在性遺伝子を増幅する方法を記載し、ここでこの遺伝子は細胞において発現されていないか、または所望のレベルで発現されていない。細胞を、細胞に存在する配列を修復、変化、欠失、または置換する、あるいは細胞の内在性遺伝子と正常に機能的に結合していない調節配列である外来性DNA配列とトランスフェクトさせる。これを行うために、前以って選択した部位でゲノムDNA配列と相同的なDNA配列を使用して、内在性遺伝子を標的化する。さらに、選択マーカーをコードする増幅DNAも含めることができる。相同的に組換えた細胞を、増幅に選択した条件下で培養することにより、内在性遺伝子および増幅マーカーの両方が共増幅され、遺伝子の発現は増加する。
【0015】
WO95/31560には、相同的組換え用のDNA構築物が記載されている。この構築物は、標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含む。標的化は、細胞におけるゲノム配列と構築物の相同的組換えにより達成され、インビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)でのタンパク質の産生が可能となる。
【0016】
WO96/29411には、相同的組換えにより、ゲノムの前以って選択した部位に導入した、外来性調節配列、コードまたは非コード、外来性エキソン、およびスプライスドナー部位を使用する方法が記載されている。本出願において、導入されたDNAは、外来性調節領域の制御下の転写物が、トロンボポエチン、デオキシリボヌクレアーゼI、またはβ−インターフェロン遺伝子のいずれかに存在する、外来性エキソンおよび内在性エキソンの両方を含むように位置し、その結果、外来性および外来性エキソンが機能的に結合した転写物が生成する。新規な転写単位が、相同的組換えにより産生される。
【0017】
米国特許第5,272,071号には、細胞において正常に発現される遺伝子の発現を促進できるDNA調節エレメントを挿入することによる、細胞における転写的にサイレントな遺伝子の転写活性化が記載されている。調節エレメントを、正常なサイレント遺伝子と機能的に結合するように挿入する。挿入は、正常なサイレント遺伝子(標的DNA)のセグメントを有するDNA構築物および所望の転写を誘導するために使用したDNA調節エレメントを創製することにより、相同的組換えを用いて達成される。
【0018】
米国特許第5,578,461号には、相同的組換えによる哺乳動物標的遺伝子発現の活性化を議論する。DNA配列を、ゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込み、標的遺伝子の発現を増強する。次いで、修飾された構築物を二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子を標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅される。
【0019】
上記のアプローチは両方共(クローニングによる、またはインビボでの相同的組換えによる過剰発現構築物の構築)、過剰発現し得る前に、遺伝子をクローン化しおよびシークエンスする必要がある。さらに、相同的組換えを使用すると、ゲノム配列および構造も知らなければならない。
【0020】
残念なことに、多くの遺伝子は未だに同定および/またはシークエンスされていない。従って、以前にクローン化されたかどうか、配列および構造が既知であるかどうかに関わらず、目的の遺伝子を過剰発現する方法が有用である。
【0021】
(発明の要旨)
従って、本発明は、一般には、内在性遺伝子を細胞において過剰発現させるための方法に関する。この方法は、転写調節配列を含有するベクターを細胞内に導入すること、前記ベクターを非相同的組換えによって細胞のゲノム内に組み込ませること、および前記内在性遺伝子を細胞内において過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列に関する事前の知識を必要とせず、あるいは遺伝子の存在に関する知識さえも必要としない。従って、本発明は、標的化によらない遺伝子の活性化に関する。これは、本明細書中で使用されているように、宿主細胞のゲノム内への特殊化された活性化ベクターの(標的化組込みまたは相同的組込みとは対照的に)標的化によらない組込みまたは非相同的組込みによる内在性遺伝子の活性化を意味する。
【0022】
本発明はまた、非相同的組換えにより、遺伝子発現を活性化または遺伝子を過剰発現させる、新規なベクター構築物を包含する。新規な構築物には、相同的な標的配列がない。すなわち、宿主細胞DNAを標的とし、その標的部位において相同的組換えを促進するヌクレオチド配列を含まず、導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を引き起こす。
【0023】
新規なベクター構築物は、不対スプライスドナー配列(unpaired splice donor sequence)に機能的に結合した転写調節配列を含むベクターを含み、さらに、1つ以上の増幅可能なマーカーを含む。
【0024】
新規なベクター構築物は、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列と不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとエピトープタグと不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとシグナル配列とエピトープタグとに機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を含む構築物と、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列とエピトープタグと配列特異的プロテアーゼ部位に機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を有する構築物とを含む。
【0025】
ベクター構築物は、組換え宿主細胞選択のための1つ以上の選択マーカーを含むことができる。あるいは、選択は、活性化内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。
【0026】
これらのベクター、および実際本明細書に開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により容易に認識されるベクターの変形を、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【0027】
本発明のベクター構築物で使用した転写調節配列は、プロモーターを含むがこれに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターはウイルス性プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは、細胞性、非ウイルス性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【0028】
本発明のベクター構築物に使用した転写調節配列は、エンハンサーを含み得るがこれに限定されない。好ましい実施形態において、エンハンサーはウイルス性エンハンサーである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性非ウイルス性エンハンサーである。
【0029】
本明細書に記載した方法の好ましい実施形態において、ベクター構築物は、線状RNAまたはDNAであるか、またはこれを含み得る。
【0030】
ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【0031】
遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物(また、本明細書では互換的に「発現産物」とも呼ぶ)の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【0032】
あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。本発明の、あるかかる態様において、ゲノムに取込まれた本発明のベクター構築物を含む細胞を、真核生物(例えば脊椎動物、特に哺乳動物、より特定するとヒト)に、その真核生物におけるインビボでの細胞による遺伝子の過剰発現または活性化に好ましい条件下で導入し得る。関連した、かかる本発明の態様において、真核生物に導入する前に、細胞を単離およびクローン化し得る。
【0033】
本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および1つ以上の増幅マーカーを含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【0034】
ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【0035】
遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【0036】
あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【0037】
しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、1つ以上の増幅マーカーを含むことができると理解される。そこで、ベクターおよび目的のDNA(すなわち過剰発現した遺伝子を含む)の両方の増幅が細胞で生じ、内在性遺伝子のさらなる発現増強が得られる。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。
【0038】
本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスド供与配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを細胞の非相同的組換えによりゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【0039】
ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【0040】
遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【0041】
あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【0042】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【0043】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および1つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【0044】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【0045】
本発明の任意のベクター構築物はまた、分泌シグナル配列を含むことができる。分泌シグナル配列は、活性化された内在性タンパク質に機能的に結合するように構築物中に配置している。よって、目的のタンパク質の分泌が細胞において生じ、そのタンパク質の精製が容易となる。従って、方法は、タンパク質発現産物が細胞から分泌される段階を含むことができる。
【0046】
本発明はまた、上記の任意の方法により作成した細胞を包含する。本発明は、ベクター構築物を含む細胞、ベクター構築物が細胞ゲノムに組込まれた細胞、および内在性遺伝子から所望の遺伝子産物を過剰発現(この過剰発現は導入された転写調節配列により生じる)している細胞を包含する。
【0047】
細胞を単離およびクローン化できる。
【0048】
方法は、例えば真菌、植物または動物などの、真核起源の任意の細胞において実施することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、脊椎を有する細胞、特に、哺乳動物細胞(ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒト細胞を含むがこれに限定されない)、およびより特定するとヒト細胞において実施し得る。
【0049】
上記の方法により作成した単一の細胞は、単一の遺伝子または1つ以上の遺伝子を過剰発現することができる。細胞における1つ以上の遺伝子を、単一の型の構築物をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。同様に、細胞における1つ以上の遺伝子を、複数の構築物(すなわち1つ以上の型の構築物)をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。それ故、細胞は、唯一の型のベクター構築物または異なる型の構築物を含むことができ、各々、内在性遺伝子を活性化できる。
【0050】
本発明はまた、以下を1つ以上行うことにより、上記した細胞を作成する方法に関する。1つ以上の本発明のベクター構築物の細胞への導入、導入した構築物の非相同的組換えによる細胞のゲノムへの組込み、細胞における1つ以上の内在性遺伝子の過剰発現、および細胞の単離およびクローニング。本発明はまた、かかる方法により産生した細胞(これは単離した細胞であり得る)にも関する。
【0051】
本発明はまた、特徴づけられた(例えばシークエンスされた)、特徴づけられていない(例えば、その機能は既知であるが、クローン化またはシークエンスされていない遺伝子)、または過剰発現前にはその存在が知られていなかった遺伝子である、内在性細胞遺伝子などの遺伝子を過剰発現するための上記した細胞の使用法を包含する。細胞を使用して、インビトロまたはインビボで所望量の発現産物を産生できる。所望であれば、次いで、この発現産物を、例えば細胞溶解により、または増殖培地からの単離により、単離および精製することができる(ベクターが分泌シグナル配列を含む場合)。
【0052】
本発明はまた、上記の方法により作成した細胞のライブラリーを包含する。ライブラリーは、単一のトランスフェクション実験から全クローン、または単一のトランスフェクション実験からの部分集合のクローンを包含できる。部分集合は、同一遺伝子または1つ以上の遺伝子、例えば1集合の遺伝子を過剰発現することができる。トランスフェクションは、単一の構築物を用いて、または1つ以上の構築物を用いて実施することができる。
【0053】
ライブラリーはまた、2つ以上のトランスフェクション実験からの全ての組換え細胞を合わせることにより、単一のトランスフェクション実験からの細胞の1つ以上の部分集合を合わせることにより、または別々のトランスフェクション実験からの細胞の部分集合を合わせることにより形成できる。得られたライブラリーは、同一の遺伝子、または1つ以上の遺伝子、例えば1集合の遺伝子を発現できる。再度、各これらの個々のトランスフェクションにおいて、ユニークな構築物または1つ以上の構築物も使用できる。
【0054】
ライブラリーは、同一の細胞型または異なる細胞型から形成できる。
【0055】
本発明はまた、同一または異なるトランスフェクション実験から、細胞の様々な部分集合を選択することにより、ライブラリーを作成する方法に関する。
【0056】
本発明はまた、内在性遺伝子を過剰発現または活性化するために、またはかかる過剰発現または活性化した遺伝子の遺伝子発現産物を得るために、上記の細胞または細胞のライブラリーを使用する方法に関する。本発明のこの態様により、細胞またはライブラリーは、遺伝子の発現についてスクリーニングし得、所望の遺伝子産物を発現する細胞を選択し得る。次いで、細胞を使用して、その後の使用のために遺伝子産物を単離または精製できる。細胞における発現は、細胞による内在性遺伝子の発現産物の産生に好ましい条件下で、インビトロで細胞を培養することにより、または細胞に遺伝子をインビボで発現させることにより行うことができる。
【0057】
本発明の好ましい実施形態において、方法は、発現産物を単離または精製するプロセスを含む。非常に好ましい実施形態において、内在性遺伝子産物を発現する細胞を、市販、特に診断、治療および薬物探索使用のために、十分量の遺伝子産物の産生に好ましい条件下で培養する。
【0058】
いずれの方法も、さらに、ベクター組込み前または同時に、二本鎖破壊を細胞のゲノムDNAに導入することを含むことができる。
【0059】
本発明はまた、内在性遺伝子の発現を活性化させるために、そして活性化された遺伝子に対応するmRNAおよびcDNAを単離するために有用なベクター構築物に関する。
【0060】
1つのそのような実施形態において、ベクター構築物は、(a)第1の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第1の転写調節配列と、(b)第2の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第2の転写調節配列と、(c)第1の転写調節配列と第2の転写調節配列との間に存在し得る線状化部位を含むことができる。本発明により、このベクター構築物が宿主細胞に形質転換され、次いで宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合、第1の転写調節配列は、好ましくは、第2の転写調節配列の向きに対して逆向きである。いくつかの好ましいそのような実施形態において、ベクターは、線状化部位での切断によって線状化され得る。
【0061】
別の実施形態において、本発明は、対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された転写調節配列を含む、3’末端および5’末端を有する線状ベクター構築物であって、転写が線状ベクター構築物の3’末端または5’末端に向かって導かれる向きで転写調節配列が線状ベクター構築物において配向している線状ベクター構築物を提供する。
【0062】
別の実施形態において、本発明は、(a)転写調節配列と、(b)対形成しないスプライスドナー部位と、(c)希な切断制限部位と、(d)線状化部位をこの順で含むベクター構築物を提供する。
【0063】
別の実施形態において、本発明は、(a)ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第1の転写調節配列と、(b)エキソン−スプライスドナー部位複合体に機能的に連結された第2の転写調節配列とを含むベクター構築物であって、第1の転写調節配列がベクター構築物において第2の転写調節配列と同じ向きであり、かつ第1の転写調節配列がベクター構築物において第2の転写調節配列の上流に存在するベクター構築物を提供する。
【0064】
さらなる実施形態において、本発明は、ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位をさらに含むベクター構築物を提供する。
【0065】
別の実施形態において、本発明は、ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第1の転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第2の転写調節配列をさらに含むベクター構築物を提供する。
【0066】
本発明により、転写調節配列(または、2つ以上の転写調節配列を有するベクター構築物における第1もしくは第2の転写調節配列)は、プロモーター、エンハンサーまたはリプレッサーであり得るが、好ましくは、動物細胞プロモーター、植物細胞プロモーターまたは真菌細胞プロモーターを含むプロモーターであり、最も好ましくは、CMV即時初期遺伝子プロモーター、SV40T抗原プロモーターおよびβアクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである。本発明に従って使用され得る動物細胞起源、植物細胞起源または真菌細胞起源の他のプロモーターはこの分野では公知であり、本明細書中の教示を考慮すれば当業者には熟知のものである。
【0067】
本発明のベクター構築物において使用される選択マーカーは、選択マーカーを含有するベクターが宿主細胞ゲノム内に組み込まれたときに、マーカー遺伝子を含有または発現する細胞の選択を可能にする任意のマーカーまたはマーカー遺伝子であり得る。好適なそのようなマーカーには、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンD遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性1遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
関連する実施形態において、本発明は、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカー、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物を提供する。この場合、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびにスプライスドナー部位は、ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、かつゲノム内の内在性遺伝子を活性化した場合に、ポジティブ選択マーカーの活性な形態での発現を生じさせ、そしてネガティブ選択マーカーの非発現またはネガティブ選択マーカーの不活性な形態での発現のいずれかを生じさせる向きでベクター構築物において配向している。いくつかの好ましいそのような実施形態において、ポジティブ選択マーカーまたはネガティブ選択マーカーまたはその両方のいずれかは、ポリアデニル化シグナルを有していなくてもよい。本発明のこれらの局面において使用されるポジティブ選択マーカーは、発現したときに、マーカーを発現する細胞の単離を容易にし得るタンパク質を産生する任意の選択マーカーであり得る。これには、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンD遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性1遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子またはアデノシンデアミナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明のこれらの局面において使用されるネガティブ選択マーカーは、発現したときに、マーカーを発現する細胞の除去を容易にし得るタンパク質を産生する任意の選択マーカーであり得る。これには、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリアトキシン遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【0069】
本発明はまた、本発明の1つまたは2つ以上のベクター構築物を含む、単離細胞であり得る真核生物宿主細胞に関する。好ましいそのような真核生物宿主細胞には、動物細胞(哺乳動物(特に、ヒト)細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、環形動物細胞、両生類細胞、爬虫類細胞および魚類細胞を含む)、植物細胞、および真菌(特に、酵母)細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかのそのような宿主細胞において、ベクター構築物を宿主細胞のゲノム内に組み込ませることができる。
【0070】
本発明はまた、PCR増幅可能な配列および縮重した3’末端を含むプライマー分子に関する。本発明のこの局面によるプライマー分子は、好ましくは、下記の一般構造を有する。
5’−(dT)a−X−Nb−TTTATT−3’
式中、aは1〜100(好ましくは、10〜30)のすべての数であり、Xは、長さが約10〜20ヌクレオチドの核酸配列からなるPCR増幅可能な配列であり、Nは任意のヌクレオチドであり、bは0〜6のすべての数である。1つの好ましいそのようなプライマーは、5’−TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT−3’(配列番号10)のヌクレオチド配列を有する。関連する実施形態において、本発明のこの局面によるプライマー分子はビオチン化することができる。
【0071】
本発明はまた、第一鎖cDNAを合成するための方法であって、(a)本発明の第1のプライマー(上記に記載されるプライマーなど)をRNAテンプレート分子とアニーリングさせて、第1のプライマー−RNA複合体を形成させることと、(b)この第1のプライマー−RNA複合体の逆転写に好都合な条件のもとでこの第1のプライマー−RNA複合体を逆転写酵素および1つまたは2つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸分子により処理して、第一鎖cDNAを合成することを含む方法に関する。
【0072】
本発明はまた、活性化された遺伝子を、特に宿主細胞のゲノムから単離するための種々の方法に関する。本発明のこれらの方法は、本発明の標的化によらない遺伝子活性化ベクターを使用して産生されるmRNA分子の構造を利用する。本発明の1つのそのような方法は、例えば、(a)転写調節配列および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物を宿主細胞(好ましくは、上記に記載された真核生物宿主細胞の1つ)に導入することと、(b)ゲノム内にエキソンを含む内在性遺伝子がベクターにより活性化されるような条件のもとで、ベクター構築物を宿主細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませることと、(c)宿主細胞からRNAを単離することと、(d)上記に記載された本発明の方法に従って第一鎖cDNAを合成することと、(e)ベクターによりコードされるエキソンに特異的な第2のプライマーを第一鎖cDNAにアニーリングさせて、第2のプライマー−第一鎖cDNA複合体を生成させることと、(f)第一鎖cDNAに対して実質的に相補的である第二鎖cDNAの産生に好都合な条件のもとで、この第2のプライマー−第一鎖cDNA複合体をDNAポリメラーゼと接触させることとを含む。本発明のこの局面による方法は、1つまたは2つ以上のさらなるステップを含むことができ、例えば、対形成しないスプライスドナー部位の下流においてベクター上に存在する制限部位で切断する制限酵素で第二鎖cDNAを処理すること、またはベクターによりコードされるエキソンに特異的な第3のプライマーと、第2のプライマーに特異的な第4のプライマーとを使用して第二鎖cDNAを増幅することなどのステップを含むことができる。本発明はまた、これらの方法に従って産生された単離遺伝子、およびこのような単離遺伝子を含むベクター(発現ベクターであり得る)および宿主細胞に関する。本発明はまた、単離遺伝子(または単離遺伝子を含むベクター、特に発現ベクター)を含む宿主細胞を培養することと、および単離遺伝子によってコードされるポリペプチドの前記宿主細胞による発現に好都合な条件のもとで宿主細胞を培養することとを含むポリペプチドの産生方法に関する。本発明はまた、対形成しないスプライスドナー部位を伴うエキソン領域に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターを宿主細胞に導入することと、およびそのエキソン領域によってコードされるポリペプチドの前記宿主細胞の発現に好都合な条件のもとで宿主細胞を培養することとを含むポリペプチドのさらなる産生方法を提供する。この場合、エキソンは、対形成しないスプライスドナー部位の最も5’末端側の塩基に対して、オープンリーディングフレーム位置のいずれかに位置する翻訳開始部位を含有する(例えば、ATG開始コドンの「A」は、スプライスドナー部位の最も5’末端側の塩基に対して、−3位に存在し得るか、またはその位置から上流に3塩基の間隔(例えば、−6、−9、−12、−15、−18など)で存在し得るか、あるいは−2位に存在し得るか、またはその位置から上流に3塩基の間隔(例えば、−5、−8、−11、−14、−17、−20など)で存在し得るか、あるいは−1位に存在し得るか、またはその位置から上流に3塩基の間隔(例えば、−4、−7、−10、−13、−16、−19など)で存在し得る)。関連する実施形態において、本発明の方法は、得られたポリペプチドを単離することをさらに含むことができる。本発明はまた、これらの方法に従って産生されるポリペプチドに関し、これらは単離ポリペプチドであってもよく、または単離ポリペプチドでなくてもよい。
【0073】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の明細書、および請求の範囲に照らして、その技術分野における通常の当業者には明らかである。
【0074】
(発明の詳細な説明)
非相同性組換による遺伝子活性化は、他の活性化手順よりも優れた利点がある。タンパク質過剰発現の以前の方法とは異なり、本明細書で述べる方法は、興味のある遺伝子をクローン化する(細胞から単離する)必要がない。過剰発現させるDNA配列または構造に関する知識(すなわち、ORFの配列、イントロン、エキソンまたは上流および下流調節要素)も、遺伝子の発現パターン(すなわち組織特異性、発達調節など)の知識も必要ない。さらに、本方法は興味のある遺伝子のゲノム構成(すなわちイントロンおよびエキソン構造)に関する知識も必要ない。
【0075】
したがって、本発明の方法は、相同性組換のための標的ヌクレオチド配列を含まないベクター作成物を含む。標的配列によって、細胞DNAの予定部位におけるベクターDNAと細胞DNAの相同的組換え可能となり、該部位はベクター内の配列に相同性を持ち、予定部位における相同性組換によって、転写調節配列をゲノムへの組込が行われ、次に内在性遺伝子が活性化される。
【0076】
本発明の方法は、予定部位でのベクター組込は含まない。代わりに、本発明は、本発明のベクター作成物を、「非正統的」組換、または「非標的遺伝子活性化」とも呼ばれる非相同性組換によって、細胞DNA(たとえば細胞ゲノム)に組込むことを含む。
【0077】
関連する実施形態において、本発明は非標的遺伝子活性化にも関与する。非標的遺伝子活性化は、多くの重要な応用を含んでいる。最初に、所与の細胞種では通常発現しない遺伝子を活性化することによって、遺伝子のcDNA複製を、その通常発現パターンとは独立に、単離することが可能となる。これにより、短い発達期間の間および/または非常に低い濃度にて、通常、まれな細胞で発現される遺伝子の単離が行いやすくなる。第2に、翻訳によって遺伝子を活性化することにより、全長cDNAをクローニングせずに、タンパク質発現ライブラリーを生成することができる。これらのライブラリーは、新たな酵素およびタンパク質に対して、および/または内在性遺伝子の過剰発現より生じる興味ある表現型に対して、スクリーニングできる。第3に、特定のタンパク質を過剰発現する細胞系を作成し、商業規模のタンパク質を生産することができる。したがって、内在性遺伝子の活性化によって、新たな遺伝子およびタンパク質を発見および単離するための、そして商業化のために特定のタンパク質を大量に生産するための強力な手法が提供される。
【0078】
本明細書に記載のベクターは標的配列を含まない。標的配列は、活性化する遺伝子内または活性化する遺伝子の上流の配列または配列群と相同性を有するベクター上の配列であり(ここで、上流領域は、目的の遺伝子の同一のコード鎖上の最初の機能的スプライス受容部位まで、およびこれを含む)、この相同性を用いて、目的の遺伝子を活性化する転写調節配列を、活性化する遺伝子を含む細胞のゲノムに組込む。内在性遺伝子を活性化するためのエンハンサー組込みベクターの場合、ベクターは、エンハンサー機能が有効な距離範囲において、目的の遺伝子の上流または下流のゲノム内(または目的の遺伝子内)のどの配列も相同性を含まない。
【0079】
それ故、本法は、慣用的および現在利用可能なクローニング技術を使用して見落とした、または見落とし得る、新規な遺伝子を同定できる。本明細書に記載した構築物および方法の使用により、知られていないおよび/または特徴づけられていない遺伝子を、迅速に同定および過剰発現でき、タンパク質を産生できる。タンパク質は、とりわけ、ヒト治療剤および診断剤として、および薬物探索の標的として使用される。
【0080】
この方法はまた、タンパク質をインビトロまたはインビボで産生するための、既知および/または特徴づけられている遺伝子の過剰発現を行うことができる。
【0081】
「既知」遺伝子は、遺伝子の特徴づけのレベルに関する。本発明により、特徴づけられている遺伝子の発現、並びに、特徴づけられていない遺伝子の発現が可能となる。様々なレベルの特徴づけが可能である。これらは、詳細な特徴づけ(例えばクローニング、DNA、RNA、および/またはタンパク質シークエンス)、および遺伝子の調節および機能のクローン化配列への関連を含む(例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列の認識、オープンリーディングフレーム、イントロン等の機能)。特徴づけは、例えば遺伝子のマッピングおよび機能の関連づけ、部分的アミノ酸またはヌクレオチド配列の獲得、または精製タンパク質の獲得および機能の確認などのように詳細度を低くし得る。特徴づけは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が既知であるか、またはタンパク質を単離したが、その機能は知られていない場合には、最小限であってもよい。あるいは、機能は、既知であるが、関連するタンパク質またはヌクレオチド配列は知られていないか、たは既知であるが機能と相関させなくてもよい。最後に、遺伝子の存在およびその機能の両方が知られていないという点で特徴づけが全くないこともあり得る。本発明により、任意の様々な特有の特徴づけ度合いにおける任意の遺伝子の発現が可能となる。
【0082】
多くの異なるタンパク質(また、本明細書では互換的に「遺伝子産物」または「発現産物」とも呼ぶ)を、単一の活性化構築物により、および1セットのトランスフェクションで活性化および過剰発現することができる。従って、1セットのトランスフェクション体(ライブラリー)における単一の細胞または異なる細胞は、同一または異なる構築物でトランスフェクションした後、1つ以上のタンパク質を過剰発現できる。以前の活性化法は、活性化する各遺伝子につき、ユニークな構築物を創製することが必要である。
【0083】
さらに、単一の遺伝子に隣接する多くの異なる組込み部位を、単一の構築物を使用して同時に創製および試験することができる。これにより、タンパク質発現のための、活性化構築物の最適なゲノム位置を迅速に決定できる。
【0084】
以前の方法を使用すると、目的の遺伝子の5’端を、配列および構造に関して広範に特徴づけなければならなかった。産生する各活性化構築物について、適当な標的配列を単離しなければならなかった。通常、これは、活性化する細胞として、同一のヒトまたは動物の実験室株から単離された同質遺伝子的配列でなければならない。ある場合には、このDNAは、目的の遺伝子から50kbまたはそれ以上であり得る。従って、各標的構築物の産生は、至難の量の内在性遺伝子のクローニングおよびシークエンスを必要とする。しかし、配列および構造情報は、本発明の方法では必要ではないので、知られていない配列および特徴づけられていない上流領域を有する遺伝子を活性化できる。
【0085】
これは、細胞性DNAと外来性DNA配列の非相同的組換えを使用したin situ遺伝子活性化を使用すると可能となる。非相同的組換えを使用したin situ遺伝子活性化を達成するために必要な方法および組成物(例えばベクター構築物)は、本発明により提供される。
【0086】
DNA分子は、その遺伝内容をいくつかの異なるおよび別個の機構(相同的組換え、部位特異的組換え、および非相同的/非正統的組換えを含む)により再分配するために再結合できる。相同的組換えは、配列が非常に類似しているDNAの伸展間の組換えを含む。相同的組換えは、遺伝物質の再分配前に、相同的配列間のその長さに沿った対形成を含むことが実証された。クロスオーバーの正確な部位は、相同的セグメントの任意の点であり得る。組換えの効率は、相同的標的配列の長さ(ホープ(Hope)、Development 113:399(1991);レッディー(Reddy)等、J.Virol. 65:1507(1991))、2つの組換え配列の間の配列同一度(フォン・メルフナー(von Melchner)等、Genes Dev. 6:919(1992))、および構築物上に存在する非相同的DNAに対する相同的DNAの比(レトソン(Letson)、Genetics 117:759(1987))に比例する。
【0087】
一方、部位特異的組換えは、特異的DNA配列により示される、前もって決定した部位における遺伝物質の交換を含む。この反応において、タンパク質リコンビナーゼは、組換えシグナル配列に結合し、鎖切断を創製し、DNA鎖交換を容易にする。Cre/Lox組換えは、部位特異的組換えの例である。
【0088】
非相同的/非正統的組換え(例えば本発明の方法により有利に使用したもの)は、有意な配列相同性を共有せず、部位特異的組換え配列において生じない、遺伝物質の連結(交換または再分配)を含む。非相同的組換えの例は、非相同的部位での外来性DNAの染色体への取込み、染色体転座および欠失、DNA末端連結、染色体末端の二本鎖破壊修復、架橋−破壊融合、およびトランスフェクトした配列のコンカテマー化を含む。ほとんどの場合、非相同的組換えは、「自由DNA末端」の連結を通して生じると考えられている。自由末端は、二次DNA末端に直接、または修復またはプロセシング後に、連結できる末端を含むDNA分子である。DNA末端は、5’突出、3’突出、または平滑断端からなり得る。
【0089】
本明細書に使用したように、レトロウイルス挿入および他の転位反応は、厳密ではない形の非相同的組換えと考えられる。これらの反応は、組換え分子間の相同性の使用を含まない。さらに、部位特異的組換えと異なり、これらの型の組換え反応は、個別の部位間で生じない。代わりに、特異的タンパク質/DNA複合体が、唯1つの組換え対(すなわち、レトロウイルスまたはトランスポゾン)上に必要とされ、第二のDNA対(すなわち細胞ゲノム)は通常比較的に非特異的である。結果として、これらの「ベクター」は、標的化様式のように細胞ゲノムに取込まれず、それ故、それらを使用して本発明に記載の活性化構築物を送達することができる。
【0090】
本明細書に記載の方法に有用なベクター構築物は、理想的には、細胞のゲノム配列と非相同的組換えを受けて、その細胞において内在性遺伝子を過剰発現する、転写調節配列を含み得る。本発明のベクター構築物はまた、相同的標的配列を欠失している。すなわち、それらは、宿主細胞DNAを標的化し、その標的部位で相同的組換えを促進する、DNA配列を含まない。従って、本発明のベクター構築物の細胞ゲノムへの取込みは、非相同的組換えにより生じ、組込まれたベクター構築物上に含まれる導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を導くことができる。
【0091】
本発明は、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在の予備知識を必要としない。しかし、活性化する遺伝子の配列が既知である場合、構築物を操作して、適当な配置のベクターエレメント(例えば、開始コドンの位置、内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンの添加、および適当なリーディングフレーム)を含ませ、最大過剰発現および/または適当なタンパク質配列を達成することができる。
【0092】
本発明のある実施形態において、ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【0093】
遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。所望であれば、次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【0094】
あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。
【0095】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【0096】
あるいは、ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および1つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【0097】
本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および増幅マーカーを含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【0098】
ベクターを含む細胞は、遺伝子発現用についてスクリーニングする。
【0099】
遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【0100】
あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【0101】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【0102】
本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【0103】
ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングする。
【0104】
遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【0105】
あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【0106】
ベクター構築物は、本質的に、不対スプライスドナー配列に機能的に結合した転写調節配列から構成でき、また、増幅マーカーも含むことができる。
【0107】
他の活性化ベクターは、転写調節配列、並びに翻訳開始コドンを含むエキソン配列を有する構築物;転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよび分泌シグナル配列を含むエキソン配列;転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物;転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル配列およびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物;転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を有するエキソン配列を含む構築物を含む。各上記の構築物において、構築物上のエキソンは、不対スプライスドナー部位のすぐ上流に位置する。
【0108】
構築物はまた、調節配列、ポリ(A)シグナルを欠失した選択マーカー、内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry site)(ires)、および不対スプライスドナー部位を含むことができる(図4)。開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および/またはプロテアーゼ開裂部位が、任意により、iresと不対スプライスドナー配列の間に含まれ得る。この構築物が遺伝子の上流に組込まれた場合、ポリ(A)部位が内在性遺伝子により供給されるため、選択マーカーは効果的に発現される。加えて、iresによりタンパク質翻訳が下流オープンリーディングフレーム(すなわち内在性遺伝子)で開始可能となるので、下流の遺伝子もまた発現される。従って、この活性化構築物により産生されたメッセージは、ポリシストロン性である。この構築物の利点は、遺伝子の近辺並びに適当な配向で起こらない組込み事象は、薬剤耐性コロニーを産生しないことである。この理由は、(内在性遺伝子により供給された)ポリ(A)テールがないので、ネオマイシン耐性遺伝子が効果的に発現されないからである。非産生的な組込み事象の数を減少させることにより、ライブラリーの複雑性を、その範囲(活性化される遺伝子の数)に影響を及ぼすことなく減らすことができ、これはスクリーニングのプロセスを容易にする。
【0109】
この構築物の別の実施形態において、cre−lox組換え配列を、調節配列とneo開始コドンの間並びにiresと不対スプライスドナー部位の間(iresと開始コドンの間、存在する場合)に含むことができる。目的の遺伝子を活性化した細胞を単離した後、細胞をcreリコンビナーゼをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトすることにより、neo遺伝子およびiresを除去することができる。これにより、ポリシストロン性メッセージの産生が削除され、組込まれた活性化構築物上の調節配列から直接、内在性遺伝子を発現することができる。哺乳動物染色体から遺伝子エレメントを欠失することを容易にするCre組換えの使用が、記載されている(グ(Gu)等、Science 265:103(1994):サウアー(Sauer)、Meth.Enzymology 225:890−900(1993))。
【0110】
従って、本明細書に記載の方法に有用な構築物は、以下を含むがこれに限定されない(また図1から4参照)。
1) 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンを有する構築物。
2) 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンをスプライスドナー部位と共に有する構築物。
3) 調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
4) 調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
5) 調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
6) 調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
7) 調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
8) 調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
9) 調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
10) 調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
11) 調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
12) 調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
13) 調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
14) 調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
15) 調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
16) 調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
17) 調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5’から3’)翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
18) 選択マーカーに結合した調節配列を、内部リボソーム侵入部位、および不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
19) cre/lox組換えシグナルが、a)調節配列と選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間およびb)iresと不対スプライスドナー部位との間に位置する構築物18。
20) 停止コドンを欠失した緑蛍光タンパク質を含むエキソンに機能的に結合した調節配列を不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
【0111】
しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、1つ以上(すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上、最も好ましくは1つまたは2つ)の増幅マーカーを含むことができると理解する。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。活性化構築物上に1つ以上の増幅マーカーを配置することにより、活性化された細胞において目的の遺伝子と1つ以上の増幅マーカーの並置が生じる。一旦活性化された細胞が単離されれば、目的の遺伝子および活性化構築物の両方を含む遺伝子座のコピー数が増加した細胞を選択することにより、さらに発現を増加させることができる。これは、当業者に周知の選択法により、例えば、遺伝子構築物またはベクター上に含まれる1つ以上の増幅マーカーに特異的な1つ以上の選択剤を含む選択培養培地で、細胞を培養することにより達成できる。
【0112】
上記の任意のベクターの非相同的組込みにより内在性遺伝子を活性化した後、組込まれたベクター上に位置する増幅マーカーのコピーが増加したものを選択することにより、内在性遺伝子の発現をさらに増加させ得る。かかるアプローチは、組込まれたベクター上の1つの増幅マーカーを使用して達成し得るが、別の実施形態において、本発明は、2つ以上(すなわち、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上、最も好ましくは2つ)の増幅マーカーを、ベクター上に含ませて、ベクターおよび目的のフランキング遺伝子が増幅した細胞をより効率的に選択し易くし得る方法を提供する。このアプローチは、ベクター上に含まれる1つ以上の機能的内在性増幅マーカーのコピーを有する細胞において特に有用である。なぜなら、この選択法により、ベクターにコードされた増幅マーカーではなく、内在性増幅マーカーを間違えて増幅した細胞を単離できるからである。このアプローチはまた、遺伝子増幅に関与しない機構により、選択剤に対する耐性を発達させた細胞に対して選択するのに有用である。2つ以上の増幅マーカーを使用したアプローチが、これらの状況では有利である。なぜなら、組込まれたベクターおよび目的のフランキング遺伝子を増幅することなく、2つ以上の選択剤に対する耐性(2つ以上の増幅マーカーによりコードされた耐性)を細胞が発達させる可能性は、任意の単一の選択剤に対する耐性を細胞が発達させる可能性よりも有意に低いからである。従って、2つ以上のベクターによりコードされた増幅マーカーを、同時または順次選択することにより、最終的に単離された細胞が、多くの割合で、増幅されたベクターおよび目的の遺伝子を含む。
【0113】
従って、別の実施形態において、本発明のベクターは、2つ以上(すなわち、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上、最も好ましくは2つ)の増幅マーカーを含み得る。このアプローチにより、発現の活性化後にベクター配列および隣接する目的の遺伝子のより効率的な増幅が可能となる。
【0114】
本ベクターの構築に使用し得る増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼを含むがこれに限定されない。
【0115】
また、本明細書に記載した任意の構築物は、増幅マーカーの代わりに、またはそれと共に、真核ウイルス性複製起源を含み得ると理解される。ウイルス性複製起源の存在により、組込みベクターおよび隣接する内在性遺伝子をエピソームとして単離でき、および/または適当なウイルス性複製タンパク質を導入すれば多くのコピー数を増幅できる。有用なウイルス性起源の例は、SV 40 oriおよびEBV ori Pを含むがこれに限定されない。
【0116】
本発明はまた、本明細書で開示した構築物が、本質的に、これらの構築物について特記した成分から構成される実施形態を包含する。また、上記の構築物は、本明細書に記載の方法に有用な構築物の例であるが、本発明はかかる構築物の機能性等価体も含むことを理解する。
【0117】
「ベクター」なる語は、一般的に、ヌクレオチド配列を細胞に導入する媒体を意味すると理解される。任意の特定の配列に限定する意図はない。ベクターはそれ自体、内在性遺伝子を活性化するヌクレオチド配列であり得るか、または内在性遺伝子を活性化する配列を含み得る。従って、ベクターは、本質的に、活性化に必要なこれらの配列のみを含む単純な線形または環形ポリヌクレオチドであり得るか、または大きなポリヌクレオチド、または他の構築物(例えば、DNAまたはRNAウイルスゲノム、全ビリオン、または非常に重要なヌクレオチド配列の細胞への導入に使用する他の生物学的構築物)におけるこれらの配列であり得る。「ベクター構築物」または「構築物」なる語は、本明細書における語「ベクター」と相互に変更可能に使用できるということも理解される。
【0118】
ベクターは、天然に存在するか、または遺伝子工学または合成プロセスにより創製されたDNA配列を含むことができる。
【0119】
構築物は細胞のゲノムへの非相同的組込み時に、内在性遺伝子の発現を活性化できる。内在性遺伝子の発現により、組込み部位(例えば上流領域対イントロン2)に依存して、全長のタンパク質が産生されるか、または端を切り取った生物学的に活性な形の内在性タンパク質が得られる。活性化される遺伝子は、周知の遺伝子(例えば以前にクローン化または特徴づけられた)または知られていない遺伝子(以前にクローン化または特徴づけられていない)であり得る。遺伝子の機能は、既知であるか、または知られていない。
【0120】
周知の活性を有するタンパク質の例は、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、酵素、構造タンパク質、細胞表面レセプター、細胞内レセプター、ホルモン、抗体、および転写因子を含むがこれに限定されない。本法により産生できる既知タンパク質の特殊な例は、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−8、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−14、TGF−β、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、TSH−β、骨成長因子−2、骨成長因子−7、腫瘍壊死因子、α−1アンチトリプシン、抗トロンビンIII、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインC、プロテインキナーゼC、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、肝細胞成長因子、内皮細胞成長因子、ニューロトロピン−3、トロンボポエチン、絨毛ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、αグルコシダーゼ、上皮成長因子、および繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定されない。本発明はまた、トランスメンブランタンパク質を発現する様々な遺伝子の活性化、およびかかるタンパク質[上記したような成長因子、ホルモン、神経伝達物質およびサイトカインの細胞表面レセプター、トランスメンブランイオンチャネル、コレステロールレセプター、リポタンパク質(LDLおよびHDLを含む)および他の脂質部分のレセプター、インテグリンおよび他の細胞外マトリックスレセプター、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリンレセプター、CD抗原(CD2、CD3、CD4、CD8、およびCD34抗原を含む)、および当業者に周知の他の細胞表面トランスメンブラン構造および機能タンパク質を含むがこれに限定されない]の産生および単離を可能とする。通常の当業者には理解されるように、当業者に周知の他の細胞性タンパク質およびレセプターはまた、本発明の方法により産生し得る。
【0121】
本明細書に記載した方法の利点の1つは、事実上任意の遺伝子を活性化できることである。しかし、遺伝子は様々なゲノム構造(様々なイントロン/エキソン境界および開始コドンの位置)を有するので、細胞個体群内の様々な遺伝子を最も多く活性化するために、多様な活性化構築物が提供される。
【0122】
これらの構築物は、別々に細胞にトランスフェクトさせ、ライブラリーを産生できる。各ライブラリーは、独特な1セットの活性化された遺伝子を有する細胞を含む。ある遺伝子は、数個の異なる活性化構築物により活性化される。加えて、遺伝子の一部を活性化することにより、端を切り取った生物学的に活性なタンパク質を産生できる。端を切り取ったタンパク質は、例えば、活性化構築物を、第二エキソンの上流ではなく内在性遺伝子の中間のイントロンまたはエキソンに組込むことにより産生できる。
【0123】
また、異なる構築物の使用により、活性化された遺伝子を新しい配列を含むように修飾することができる。例えば、分泌シグナル配列を、活性化構築物上に含ませて、活性化された遺伝子の分泌を容易にすることができる。ある場合には、イントロン/エキソン構造または目的の遺伝子に依存して、分泌シグナル配列は、内在性遺伝子のシグナル配列の全部または一部を置換できる。他の場合には、シグナル配列により、通常は細胞内に位置するタンパク質の分泌が可能となる。
【0124】
ベクター上の調節配列は、構成プロモーターであり得る。あるいは、プロモーターは誘導性であり得る。誘導プロモーターの使用により、基礎レベルの低い活性化されたタンパク質が、慣用的な培養および増殖の間に、細胞により産生されることが可能となる。よって、細胞を、例えば製造またはスクリーニング中に、大量の所望のタンパク質を産生するために誘導し得る。誘導プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含むがこれに限定されない。
【0125】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のベクター上の調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーでもよく、これらのうちのいずれもが組織特異的であっても良い。
【0126】
ベクター上の調節配列は、細胞性またはウイルス性ゲノムから単離できる。細胞性調節配列の例は、アクチン遺伝子、メタロチオネインI遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、カゼインI遺伝子、血清アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、グロビン遺伝子、ラミニン遺伝子、スペクトリン遺伝子、アンキリン遺伝子、ナトリウム/カリウムATPアーゼ遺伝子およびチューブリン遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。ウイルス性調節配列の例は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子、アデノウイルス後期遺伝子、SV40遺伝子、レトロウイルスLTR、およびヘルペスウイルス遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。典型的には、調節配列は、NF−kB、SP−1、TATA結合タンパク質、AP−1、およびCAAT結合タンパク質などの転写因子の結合部位を含む。機能的には、調節配列は、内在性遺伝子の転写を、促進、増強、または別様に変化させる能力により定義される。
【0127】
ある好ましい実施形態において、調節配列は、ウイルス性プロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、CMV最初期遺伝子プロモーターである。別の実施形態において、調節エレメントは、細胞性、非ウイルス性プロモーターである。
【0128】
別の好ましい実施形態において、調節エレメントは、エンハンサーであってもよいし、または、エンハンサーを含んでもよい。特に好ましいそのような実施形態において、エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性、非ウイルス性エンハンサーである。
【0129】
さらに別の好ましい実施態様では、調節エレメントは、リプレッサーであってもよいし、またはリプレッサーを含んでもよい。特に好ましいこのような実施態様では、リプレッサーはウイルスリプレッサー、細胞性非ウイルス性リプレッサーであってもよい。
【0130】
転写調節配列は、一以上の、骨格付着領域またはマトリックス付着部位、負の調節エレメント、および転写因子結合部位を含んでもよい。調節配列はまた遺伝子座制御領域も含むことができる。
【0131】
本発明は、レトロウイルス転写調節配列、例えば長末端反復配列の使用をも包含する。しかし、これらを使用する場合、それらは活性化する内在性遺伝子(すなわち転写調節配列が再結合して活性化する細胞性遺伝子)の転写のプロモーターまたはエンハンサーとして、転写調節配列の機能に実質的に作用する任意のレトロウイルス配列に必ずしも結合しているわけではない。
【0132】
本発明のベクター構築物は、ベクター上のエキソン配列に機能的に結合していない調節配列をも含み得る。例えば、調節配列がエンハンサーである場合、それを内在性遺伝子の近く(例えば、上流、下流、またはイントロン中)に組込むと、その内在性プロモーターから遺伝子の発現を刺激することができる。この活性化機構により、ベクター由来のエキソン配列は、活性化された遺伝子の転写物には存在していない。
【0133】
あるいは、調節エレメントは、エキソンに機能的に結合し得る。エキソンは、天然の配列であり得るか、または非天然であり得る(例えば合成により製造)。最初のエキソンに開始コドンを欠失した内在性遺伝子を活性化するために(例えば卵胞刺激ホルモン−β)、開始コドンは、好ましくはベクター上のエキソンから削除する。最初のエキソンに開始コドンを含む内在性遺伝子を活性化するために(例えば、エリスロポエチンおよび成長ホルモン)、ベクター上のエキソンは、好ましくは、開始コドン、通常ATG、および好ましくは効率的な翻訳開始部位を含む(コザック(Kozak)、J.Mol Biol.196:947(1987))。エキソンは、開始コドンの後に追加のコドンを含み得る。これらのコドンは、天然遺伝子由来であり得るか、または非天然であり得る(例えば合成)。コドンは、活性化する内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンと同一であり得る。あるいは、コドンは、内在性遺伝子の最初のコドンに存在するコドンとは異なり得る。例えば、コドンは、エピトープタグ、シグナル分泌配列、トランスメンブランドメイン、選択マーカー、またはスクリーニングマーカーであり得る。任意により、不対スプライスドナー部位が、エキソン配列のすぐ3’側に存在し得る。活性化する遺伝子の構造が既知である場合、ベクターのコドンが、スプライシング後に内在性遺伝子の第二エキソンのコドンと共にフレーム内になるように、スプライスドナー部位を位置的にベクターエキソンの隣に配置する。活性化する内在性遺伝子の構造が既知である場合、各々異なるリーディングフレームを含む別々の構築物を使用する。
【0134】
機能的結合は、指定された配列(群)を介した転写を可能とする配置と定義する。例えば、エキソン配列に機能的に結合した調節配列は、エキソン配列が転写されることを示す。開始コドンがベクター上に存在する場合、機能的結合はまた、ベクターエキソン由来のオープンリーディングフレームが、内在性遺伝子のオープンリーディングフレームと共にフレーム内にあることを示す。非相同的組込み後、ベクター上の調節配列(例えばプロモーター)は、内在性遺伝子に機能的に連結し、通常CAP部位と呼ばれる部位で転写開始を容易にする。転写は、ベクター上のエキソンエレメントを介して(存在する場合、開始コドン、オープンリーディングフレーム、および/または不対スプライスドナー部位を介して)、および内在性遺伝子を介して進行する。この機能的結合により産生された初期転写物は、スプライスを受けて、ベクターおよび内在性遺伝子の両方由来のエキソン配列を含むキメラ転写物を創製する。この転写物は、翻訳されて内在性タンパク質を産生できる。
【0135】
エキソンまたは「エキソン配列」は、成熟RNA分子に存在する任意の転写された配列と定義する。ベクター上のエキソンは、例えば5’非翻訳領域などの非翻訳配列を含み得る。あるいは、または非翻訳配列と共に、エキソンは、開始コドンおよびオープンリーディングフレームなどのコード配列を含み得る。オープンリーディングフレームは、天然アミノ酸配列または非天然アミノ酸配列(例えば合成コドン)をコードできる。オープンリーディングフレームはまた、シグナル分泌配列、エピトープタグ、エキソン、選択マーカー、スクリーニングマーカー、または内在性遺伝子にスプライスされた場合にオープンリーディングフレームを保存するように機能するヌクレオチドをコードし得る。
【0136】
初期転写物のスプライシング(このプロセスによりイントロンが除去される)は、それぞれ、イントロンの5’および3’末端に位置する、スプライスドナー部位およびスプライス受容部位により指図される。スプライスドナー部位の共通配列は、(A/C)AG GURAGU(ここでRはプリンヌクレオチドを示す)であり、1−3位のヌクレオチドは、エキソンに位置し、ヌクレオチドGURAGUはイントロンに位置する。
【0137】
不対スプライスドナー部位は、本明細書において、下流スプライス受容部位を含まない、活性化構築物上に存在するスプライスドナー部位として定義する。ベクターを非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組込む場合、不対スプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と対を形成する。次いで、ベクター由来のスプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と共に、ベクタースプライスドナー部位と内在性スプライス受容部位の間の全ての配列の切出しを指図する。これらの介入配列の切出しにより、内在性タンパク質の翻訳を妨害する配列が除去される。
【0138】
本明細書で使用した上流および下流なる語は、それぞれ、コード鎖に関して5’または3’方向にあることを意味する。遺伝子の「上流領域」なる語は、第二エキソンの5’核酸配列(コード鎖に関して)から、同コード鎖を有する最初に隣接する遺伝子の最後のエキソンまでを含むと定義する。機能的に、上流領域は、非相同的組込みベクターを内在性遺伝子に機能的に結合可能な、内在性遺伝子の第二エキソンの5’部位である。
【0139】
ベクター構築物は、非相同的に組込んだ活性化構築物を含む細胞の同定および単離を容易にする選択マーカーを含むことができる。選択マーカーの例は、ネオマイシン耐性(neo)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HRRT)、プロマイシン(pac)、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ(GS)、ヒスチジンD(hisD)、カルバモイルリン酸シンターゼ(CAD)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、多剤耐性1(mdr1)、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、およびアデノシンデアミナーゼ(ada)をコードする遺伝子を含む。
【0140】
あるいは、ベクターは、選択マーカーの代わりに、または加えて、スクリーニングマーカーを含むことができる。スクリーニングマーカーにより、ベクターを含む細胞を、薬物または他の選択的圧力下に配置することなく、単離できる。スクリーニングマーカーの例は、細胞表面タンパク質、蛍光タンパク質、および酵素をコードする遺伝子を含む。ベクター含有細胞を、例えば、ベクターにコードされた酵素により蛍光産物に変換可能な細胞表面タンパク質または基質に、蛍光標識した抗体を使用してFACS(蛍光細胞分析分離装置)により単離し得る。
【0141】
あるいは、選択は、内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。それ故、活性化構築物は、内在性遺伝子自体により付与される「マーカー」以外の選択マーカーを欠損し得る。この実施形態において、活性化された細胞は、活性化された遺伝子により付与される表現型に基づき選択可能である。選択表現型の例は、細胞増殖、成長因子依存性成長、コロニー形成、細胞分化(例えば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞等への分化)、足場非依存性成長、細胞性因子の活性化(例えば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼ等)、細胞表面レセプター/タンパク質の発現、細胞間接着の増加または減少、遊走、細胞活性化(例えば、休止対活性化T細胞)を含む。
【0142】
トランスフェクトした細胞について、安定な組込み体を選択することなく、遺伝子活性化産物のスクリーニングを行う場合、選択マーカーは構築物から削除し得る。これは、安定な組込み体の効率が高い場合に特に有用である。
【0143】
ベクターは、組込みベクターおよび隣接する活性化された内在性遺伝子のコピーの増加した細胞の選択を可能とするために、1つ以上(すなわち、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上、最も好ましくは1つまたは2つ)の増幅マーカーを含み得る。増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、アデノシンデアミナーゼ(ada)、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ(GS)、およびカルバモイルリン酸シンターゼ(CAD)を含むがこれに限定されない。
【0144】
ベクターは、遺伝子増幅に有用な真核ウイルス性複製起源を含み得る。これらの起源は、増幅マーカーの代わりに、または共に存在し得る。
【0145】
ベクターはまた、微生物において構築物の繁殖に有用な遺伝子エレメントを含み得る。有用な遺伝子エレメントの例は、微生物複製起源および抗生物質耐性マーカーを含む。
【0146】
これらのベクター、および本明細書で開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により認識される明らかなベクターを、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【0147】
構築物の細胞ゲノムへの非相同的組込みにより、ベクター由来の調節エレメントと内在性遺伝子由来のエキソンの間に機能的な結合が形成される。好ましい実施形態において、ベクター調節配列の挿入を使用して、内在性遺伝子の発現をアップレギュレートする。遺伝子発現のアップレギュレーションは、転写的にサンレントな遺伝子の転写的に活性な遺伝子への変換を含む。また、転写的にはすでに活性であるが、所望よりも少ないレベルのタンパク質を産生する遺伝子についての遺伝子発現の増強も含む。他の実施形態において、内在性遺伝子の発現は、発現のダウンレギュレーション、誘導性表現型の創製、または発現の組織特異性の変化など別様に影響され得る。
【0148】
本発明によると、遺伝子発現生成物のインビトロでの生成方法は、たとえば、(a)本発明のベクターを細胞へ導入する;(b)非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む;(c)ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる;(d)内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする;(e)細胞による内在性遺伝子の発現生成物の生成に適した条件下で、細胞を培養する;ことで構成される。このような本発明のインビトロ方法はさらに、単離遺伝子発現生成物を生成するために、発現生成物の単離を含む。このような方法では、これに限定されるわけではないが、クロマトグラフィー(HPLC、FPLC、LC、イオン交換、親和性、サイズ排除など)、沈降(硫酸アンモニウム沈降、免疫沈降など)、電気泳動、通常の当業者に周知のタンパク質単離および精製の別の方法を含む、周知のあらゆるタンパク質分離方法を有利に利用できる。
【0149】
同様に、遺伝子発現生成物のインビボ生成方法は、たとえば、(a)本発明のベクターを細胞へ導入する;(b)非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む;(c)ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる;(d)内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする;(e)単離およびクローン化された細胞を、真核生物のインビボ細胞による内在性遺伝子の過剰発現に適した条件下で、真核生物に導入する;ことで構成される。本発明のこの側面により、菌類(特に酵母)、植物、動物、さらに好ましくは動物、またさらに好ましくは脊椎動物、もっとも好ましくは哺乳類、特にヒトを含む、あらゆる真核生物を有利に使用できる。ある関連する例において、本発明は、細胞を真核生物に導入する前に細胞の単離とクローニングを含む方法を提供する。
【0150】
本明細書で使用するように、細胞またはインビトロの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビトロの細胞による、発現生成物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、適切な環境・物理・栄養または生化学に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。このような条件はもちろん、インビトロの細胞による、発現性生物の生成、あるいは遺伝子の過剰発現または活性化に適した、あるいは実現・促進または助長する、培地、インキュベーション、照明、湿度などを含む。同様に、本明細書で使用するように、細胞またはインビボの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビボで真核生物内の細胞による、発現性生物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、細胞を含む動物を維持するための、適切な環境・物理・栄養・生化学・行動・遺伝子および感情に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。所与の条件セットがインビトロまたはインビボで、遺伝子の発現、活性化または過剰発現にとって有利かどうかは、以下で説明および例証するスクリーニング法、あるいは遺伝子の発現、活性化または過剰発現を測定するための当業界において通常の、他の方法を用いて、通常の当業者が決定できる。
【0151】
本明細書で使用するように「内在性遺伝子の活性化」という句は、内在性遺伝子をコードする転写産物の生成を、内在性遺伝子を含む細胞で通常見られるよりも高いレベルで誘発することを意味する。一部の応用例では、「内在性遺伝子の活性化」は、内在性遺伝子を含む細胞で通常見られるよりも高いレベルで、内在性遺伝子によってコードされるタンパク質、またはタンパク質の一部を生成することを意味する場合もある。
【0152】
本発明は、上記の方法のいずれかを用いて作成した細胞も含む。本発明は、ベクター作成物、ベクター生成物が組込まれた細胞、内在性遺伝子による過剰発現する所期の遺伝子生成物である細胞、導入された転写調節配列によって引き起こされる過剰発現を含む。
【0153】
本発明で使用される細胞は、任意の真核種から得ることができ、一次化、二次化、不死化できる。さらに細胞は、インビボのいずれの組織から得てもよい。単離および活性化する細胞を得るための、有用な組織の例として、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、精巣、卵巣、島、腸、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、胎仔、免疫および造血系が挙げられる。細胞の種類としては、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。しかし、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するには、いずれの細胞または細胞の種類でも使用できる。
【0154】
本方法は、菌類、植物または動物などの、真核起源のいずれの細胞内でも実施できる。好ましい例として、脊椎動物、特に哺乳類、そしてさらに好ましくはヒトが挙げられる。
【0155】
作成物は、一次、二次または不死化細胞に組込める。一次細胞とは、脊椎動物から単離されて、継代培養されていない細胞である。二次細胞とは、継代培養されたが、不死化されていない一次細胞である。不死化細胞とは、見かけ上は無期限に継代培養可能な細胞系である。
【0156】
好ましい例では、細胞は不死化細胞系である。不死化細胞系の例として、これに限定されるわけではないが、HT1080、HeLa、Jurkat、293セル、KB癌、T84結腸上皮細胞系、Raji、Hep G2またはHep 3B肝癌細胞系、A2058黒色腫、U937リンパ腫、W138繊維芽細胞細胞系、体細胞雑種、融合細胞が挙げられる。
【0157】
本発明で用いる細胞は、これに限定されるわけではないが、(ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒトなどの)哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、は虫類細胞、植物細胞、酵母細胞を含む、任意の真核種から得られる。特定の種による内在性遺伝子または遺伝子生成物の過剰発現は、その種の細胞内での遺伝子発現を活性化することによって発生することが好ましい。たとえば、内在性ヒトタンパク質を過剰発現させるには、ヒト細胞を用いる。同様に、ウシタンパク質を過剰発現させるには、たとえばウシ成長ホルモン、ウシ細胞を用いる。
【0158】
細胞は真核生物のどの組織から得てもよい。単離・活性化する細胞を得る、有用な脊椎動物の組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、免疫系(リンパ腺を含む)、精巣、卵巣、島、腸、胃、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、接合体、胎仔、造血組織が挙げられる。有用な脊椎動物の細胞の種類としては、これに限定されるわけではないが、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、生殖細胞(すなわち、精母細胞/精子および卵母細胞)、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。単離・活性化する細胞を得る、植物組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、葉組織、子房組織、雄ずい組織、雌ずい組織、根組織、塊茎、配偶子、胚などが挙げられる。しかし、通常の当業者は、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するのに、あらゆる真核細胞または細胞種類を使用できることを認識するであろう。
【0159】
説明したいずれかの方法を用いて生成した細胞はすべて、必要な遺伝子生成物の発現のためのスクリーニングと、細胞内で過剰発現する遺伝子生成物の必要量の供給に有効である。細胞は、単離・クローニングできる。
【0160】
本方法で生成された細胞は、インビトロ(たとえば、タンパク質療法として使用)またはインビボ(たとえば、細胞療法で使用)でタンパク質を生成するのに用いられる。
【0161】
工業用の培養および生成条件は、分析用途(クローニング、タンパク質または核酸シークエンシング、抗体培養、X線結晶分析、酵素学的分析など)に細胞を培養・調整するのに用いる条件によって変化することが多い。ローラーボトルで培養する場合の細胞のスケールアップには、細胞を固定する表面積の増加も含まれる。そのため、工業用の培養では、マイクロキャリアビーズを追加して表面積を増加することが多い。撹拌培養での細胞のスケールアップには、体積を大幅に増加させることが含まれる。マイクロキャリアおよび撹拌培養では、5リットル以上必要になることもある。興味のあるタンパク質の固有効力(比活性)によって、体積は1から10リットルと少なくなることもある。10から15リットルが最も普通である。しかし、50から100リットルまで必要な場合もあり、体積が10,000から15,000リットルにもなることがある。場合によっては、さらに大きな体積が必要なこともある。細胞は、多数、たとえば50から100個のTフラスコでも培養できる。
【0162】
培養条件にもかかわらず、工業規模のタンパク質精製は、分析目的の精製によってもかなり変化する。工業用の実際的な状況でのタンパク質精製は、最初は、約104細胞/mlで、10リットルの細胞の細胞量同等物である。細胞精製を開始する細胞量同等物は、最高106または107細胞/mlで、10リットルの細胞にもなり得る。しかし、通常の当業者は、本方法においては、最初の細胞量同等物が多くても少なくても有利に利用できることを認識するであろう。
【0163】
特に最終生成物を臨床的に使用する際の、別の工業用の培養条件は、意図された培地が血清をまったく、あるいは細胞培養に必要な量含まない、無血清培地で細胞を培養することである。これは明白に、好ましくない毒性汚染物質(ウイルスなど)あるいは、たとえば精製を複雑にするタンパク質などの他の種類の汚染物質の共精製を防ぐ。細胞培養用の無血清培地、このような培地の市販供給元、無血清培地での細胞の培養方法は、通常の当業者には周知である。
【0164】
上記の方法で作成した1個の細胞は、1個あるいは複数の遺伝子を過剰発現できる。複数の遺伝子は、同一の細胞内に作成物を1個組込むか、作成物を複数(すなわち、複数の種類の作成物)組込むことによって活性化できる。そのため、細胞は1種類のベクター作成物のみか、さまざまな種類の作成物を含むことが可能で、それぞれ内在性遺伝子を活性化できる。
【0165】
本発明は、以下の1つまたは複数による、上で説明した細胞作成方法も対象としている:1個以上のベクター作成物を導入する;導入した作成物を、非相同的組換によって細胞のゲノムに組込む;細胞内で1個以上の内在性遺伝子を過剰発現させる;細胞を単離・クローニングする。
【0166】
「トランスフェクション」という語は、本明細書では便宜上、ポリヌクレオチドの細胞への導入を説明する際に用いている。しかし、一般に、ポリヌクレオチドの細胞への導入を指すのに、この語が明確に使用されていることを理解すべきであり、本明細書では、(その明確な意味によるのと同様に)電気穿孔法、リポソーム仲介導入、レトロウイルス仲介導入などの、他の方法による導入を指すことも意図している。
【0167】
ベクターは、当業者に周知の多数の方法によって細胞に導入できる。これには、以下に限定されるわけではないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降、DEAEデキストラン、リポフェクション、レセプタ仲介取込、ポリブレン、粒子照射、マイクロインジェクションが含まれる。あるいは、ベクターは(複製可能または不可能な)ウイルス性粒子として細胞に送達できる。核酸の送達に有用なウイルスとしてはたとえば、これに限定されるわけではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスが挙げられる。核酸分子の細胞への送達に適した、通常の当業者に周知の他のウイルスが、本方法で同様に使用されることがある。
【0168】
トランスフェクションの後、細胞は当業者に周知の、ベクターと宿主細胞のゲノムとの非相同組込に適した条件下で培養される。非相同的に組込まれたベクターを含む細胞は、当業者に周知の、活性化された内在性遺伝子の発現を促す条件下でさらに培養される。
【0169】
ベクター作成物は、単一のDNA作成物、あるいは独立した作成物として細胞に導入され、コンカテマーとなる。
【0170】
好ましい例では、ベクター作成物が二本鎖DNAベクター作成物であるのに対して、ベクター作成物には、一本鎖DNA、一本鎖および二本鎖DNAの組合せ、一本鎖RNA、二本鎖RNA、一本鎖および二本鎖DNAの組合せも含まれる。したがってたとえば、ベクター作成物は、逆転写酵素によってcDNAに転換される一本鎖RNA、2本鎖DNAに転換されるcDNA、最終的に宿主細胞ゲノムと組換を行う二本鎖DNAとなる。
【0171】
好ましい例では、作成物は細胞への導入前に直線化される。活性化作成物の直線化によって、組込過程で染色体末端と反応可能な、DNA遊離末端が作成される。一般に、作成物は調節要素(および、存在する場合は、エクソンおよびスプライスドナー配列)の下流で直線化される。直線化はたとえば、調節配列の下流に独特の制限部位を配置したり、トランスフェクション前に該当する制限酵素で作成物を処理することによって促進できる。要求されない場合は、作成物の直線化部位と、基部の最も機能的な要素(不対スプライスドナー配列)の間に「スペーサ」配列を配置すると都合がよい。スペーサ配列が存在すると、トランスフェクション過程におけるヌクレオチド鎖分解による劣化から、ベクターの重要な機能要素が保護される。このスペーサは、本明細書で説明したベクターの必須機能を変化させないヌクレオチド配列によって構成できる。
【0172】
内在性遺伝子発現を活性化するには、環状作成物も使用できる。環状プラスミドは、細胞へのトランスフェクション時に宿主細胞ゲノムに組込可能なことは、当業者に周知である。トランスフェクション過程で、おそらくDNAの切断が環状プラスミドで発生するため、遊離DNA末端が染色体末端に結合できるようになる。作成物ではこれらの切断の一部は、不可欠なベクター機能を破壊しない位置(たとえば、切断は調節配列の下流で発生する)で発生するため、内在性遺伝子を活性化できる配置で作成物を染色体に組込むことができる。上で述べたように、スペーサ配列が作成物に配置される場合がある(たとえば、調節配列の下流)。宿主細胞ゲノムへの組込後、トランスフェクションの間に、スペーサ領域で発生した切断が、内在性遺伝子の活性化に適した作成物の部位に遊離末端を生成する。
【0173】
本発明は、上で説明した方法で作成した細胞のライブラリも含む。ライブラリは、1回のトランスフェクション実験のクローンすべてか、1回のトランスフェクション実験によるクローンのサブセットを含むことができる。サブセットは、同一の遺伝子あるいは複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを過剰発現できる。トランスフェクションは、1種類の作成物か、複数の種類の作成物によって行うことも可能である。
【0174】
ライブラリは、2回以上のトランスフェクション実験による組換細胞すべてを組合わせるか、1回のトランスフェクション実験による細胞の1個以上のサブセットを組合わせるか、別々のトランスフェクション実験による細胞のサブセットを組合わせて作成することも可能である。得られたライブラリは、同一の遺伝子か、複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを発現できる。これらの各トランスフェクションにおいて再度、独特の作成物あるいは複数の作成物を使用できる。
【0175】
ライブラリは、同一の細胞種類または異なる細胞種類から作成できる。
【0176】
ライブラリは、自然なDNA切断、あるいは、照射、制限酵素および/またはDNA切断剤を、ともに(同じ細胞に)または個あるいは(細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する)に適用して起こった切断で染色体に組込まれた1種類の活性化作成物を含む、1種類のセルから構成できる。このライブラリは、照射、制限酵素および/またはDNA切断剤を、ともに(同じ細胞に)または個あるいは(細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する)適用して処理した細胞のゲノムに組込まれた1個または複数の作成物を含む、複数の種類の細胞で構成できる。
【0177】
本発明は、同一または別個のトランスフェクション実験による細胞の各種サブセットを選択してライブラリを作成する方法も対象とする。たとえば、(作成物20をトランスフェクションした細胞において、緑蛍光タンパク質の存在によって判定した)核核因子を発現する細胞はすべて、活性化核因子を用いて細胞のライブラリを作成するためにプールできる。同様に、膜や分泌タンパク質を発現する細胞もプールできる。細胞は、たとえば成長因子独立成長、成長因子独立増殖、コロニー形成、細胞分化(たとえば神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞などへの分化)、足場独立成長、細胞因子(たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど)の活性化、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化(たとえば、静止対活性化T細胞)などの表現型によってもグループ化できる。
【0178】
本発明は、内在性細胞を過剰発現するために細胞のライブラリを用いる方法も対象としている。このライブラリは遺伝子の発現についてスクリーニングされ、必要な遺伝子生成物を発現する細胞が選択される。その後、この細胞を用いて、遺伝子生成物を後で使用するために精製する。細胞をインビトロで培養するか、インビボで細胞に遺伝子を発現させることによって、細胞を発現できる。
【0179】
本発明はまた、新規遺伝子および遺伝子生成物を識別するためにライブラリを用いる方法も対象としている。
【0180】
本発明はさらに、非相同組込のパターンを刺激またはこれに作用する作用薬を用いて細胞を処理することによって、遺伝子活性化の効率を高める方法も対象としている。細胞発現パターン、クロマチン構造、メチル化パターンは、細胞の種類によって劇的に異なることが実証されている。同じ細胞種類の異なる細胞系でも、大きく異なる場合がある。これらの違いは、DNA切断パターンと修復過程の両方に影響を与え、非相同組込に大きく影響する。たとえば、DNAのクロマチン化された範囲(不活性遺伝子と結合しやすい特性)は、制限酵素と化学薬品による切断に対する耐性が大きい一方、照射による切断を受けやすい。
【0181】
さらに、不活性遺伝子はメチル化できる。この場合、CpGメチル化によってブロックされる制限酵素は、不活性遺伝子付近のメチル化部位を開裂できず、メチル化感受性酵素を用いて遺伝子を活性化するのがさらに困難になる。これらの問題は、さまざまなDNA切断剤を用いて複数の細胞系の活性化ライブラリを作成すれば回避できる。ライブラリを作成すると、より完全な組込パターンを作成でき、与えられた遺伝子が活性化される可能性は最大となる。
【0182】
本発明の方法には、2本鎖切断を、過剰発現される内在性遺伝子を含む細胞のDNAに導入することが含まれる。これらの方法は、ベクター組込の前か同時に、2本鎖切断を細胞内のゲノムDNAを導入する。DNA切断の機構は、ゲノム内のDNA切断パターンに著しく影響を及ぼす。結果として、自然に、または照射、制限酵素、ブレオマイシン、または他の切断剤によって人為的に引き起こされたDNA切断は、異なる位置に発生可能である。
【0183】
組込効率を向上させ、組込部位のランダムな分布を改善するために、トランスフェクションの前か後に、少量、普通、大量の照射で細胞を処理できる。トランスフェクションされたDNAは、人為的に2本鎖切断させることによって、宿主細胞の染色体にDNA修復過程の一部として組込可能である。通常、組込部位として作用する2本鎖切断を作成することは、律速段階である。そのため、照射(または他のDNA破壊剤)を用いた染色体切断を増やすことによって、所与のトランスフェクションで多数の構成要素が得られる。さらに、照射によるDNA切断の機構は、自然切断とは異なる。
【0184】
照射は、高エネルギーの光子がDNA分子にぶつかったときに、DNA切断を直接引き起こす。照射はその代わりに、細胞内の化合物を活性化し、この化合物がDNA鎖と反応し、DNA鎖を切断させる。一方、自然切断は、細胞内に生成された反応性化合物(スーパーオキシドおよび過酸化物など)とDNA分子の相互作用によって発生すると考えられる。しかし、細胞内のDNAは、むき出しの除タンパクポリマーとして存在しているのではなく、代わりにクロマチンに結合し、凝集状態で存在している。結果として、一部の領域が、2本鎖を切断させる、細胞内の作用薬に接触できくなる。照射によって生じた光子の波長は、DNAの凝集領域にぶつかるほど短いため、自然切断で示したよりも下のDNA領域に切断を引き起こす。したがって、照射はDNAの異なる切断パターンを作成可能で、次に、異なる組込パターンが生成される。
【0185】
結果として、細胞内の同一の活性化作成物を用いて作成したライブラリは、照射処理を行っても、行わなくても、活性化遺伝子の異なるセットを潜在的に含む。最終的に、照射処理によって、非相同組込の効率は最大5から10倍上昇し、少ない細胞を用いて完全なライブラリを作成できる。したがって、照射処理は遺伝子活性化効率を高め、トランスフェクションされた細胞において新たな組込と活性化パターンを生成する。有用な照射の種類としては、α、β、γ、x線、紫外線照射がある。有用な照射量は細胞の種類によって異なるが、一般に、細胞生存度が0.1から99%となる照射量範囲が有用である。HT1080細胞の場合、これは137Cs源による約0.1から1000radの照射量に相当する。他の照射量も、組込頻度が増加したり、組込部位のパターンが変化する限りは有用である。
【0186】
トランスフェクションされた細胞で染色体切断を人為的に引き起こすには、照射以外にも、制限酵素を用いることができる。照射と同様に、DNA制限酵素は染色体を切断させ、次にこれがトランスフェクションされたDNAの組込部位として作用する。DNA切断がこのように増えると、活性化作成物の組込全体の効率が上昇する。さらに、制限酵素による切断の機構は照射の場合とは異なり、染色体切断のパターンも異なると考えられる。
【0187】
制限酵素は、光子と比べると比較的大きな分子で、DNAを破壊する能力を持つ小型の代謝物質である。結果として、制限酵素は、ゲノム全体としてよりも、あまり凝集していない領域を切断しやすくする。興味のある遺伝子がゲノム内の接触可能な領域内にある場合は、細胞を制限酵素で処理すれば、興味のある遺伝子の上流に活性化作成物が組込まれる可能性を高めることができる。制限酵素は具体的な配列を認識するため、そして、所与の制限部位が興味のある遺伝子の上流にない場合があるため、さまざまな制限酵素を使用できる。各酵素は宿主染色体の開裂部位に影響を及ぼす、各種特性(たとえば、大きさ、安定性、メチル化部位の開裂能力、最適反応条件)を備えているため、いろいろな制限酵素を使用することも重要である。各酵素は、開裂可能な制限部位の分布が異なるため、さまざまな組込パターンを作成する。
【0188】
したがって、活性化作成物導入の前、導入中、導入後に制限酵素(または制限酵素を発現可能なプラスミド)を導入すると、異なるセットの遺伝子が活性化される。最終的に、制限酵素が引き起こした会列によって、組み込み効率が最大5から10倍に上昇し(Yorifujiら、Mut. Res. 243:121(1990))、より少ない細胞をトランスフェクションして、完全なライブラリを作成できる。このため、制限酵素を用いて新しい組込パターンを作成し、自然切断あるいは他の人為的に引き起こされた切断での非相同組換によって作成されたライブラリで活性化できなかった遺伝子を活性化できる。
【0189】
制限酵素を用いて、活性化作成物をゲノム内の必要な場所にバイアス組込できる。たとえば、平均で50から1000キロベースごとに真核DNAを開裂する複数の希少制限酵素について記述されている。希少制限認識配列が偶然、興味のある遺伝子の上流に位置する場合、活性化作成物とのトランスフェクションの際に制限酵素を導入することによって、DNA切断は、優先的に興味のある遺伝子の上流で起こる。そして、この切断裂は、活性化作成物の組込部位として作用することがある。興味のある遺伝子内あるいは付近の適当な位置で開裂させる酵素ならどれでもよく、部位はゲノムの残りの部分に過少表現されるか、ゲノム付近に過剰表現される(たとえば、CpGを含む制限部位)。以前認識されていない遺伝子の場合、8bpの認識部位(たとえば、NotI、SftI、PmeI、SwaI、SseI、SrfI、SgrAI、PacI、AscI、SgfI、Sse8387I)を備えた制限酵素、CpGを含む部位(たとえば、EagI、Bsi−WI、MluI、BssHII)を認識する酵素、他の希少な切断酵素を使用できる。
【0190】
このようにして、ある種の活性化遺伝子について強化した、「バイアス」ライブラリを作成できる。この点について、CpGジヌクレオチドを含む制限酵素部位は、一般にゲノムでは過少表現されるが、遺伝子活性化にまさに有用な場所の、多くの遺伝子の5’末端ではCpG島の形で過剰表現されるため、特に有用である。したがって、これらの部位を認識する酵素は、遺伝子配列の5’末端で優先的に開裂する。
【0191】
制限酵素は複数の方法によって、宿主細胞に導入できる。制限酵素はまず、電気穿孔法によって細胞に導入できる(Yorifujiら、Mut. Res. 243:121(1990);Winegarら、Mut. Res. 225:49(1989))。一般に、細胞に導入される制限酵素の量は、電気穿孔媒体の濃度に比例する。電圧、静電容量、抵抗を調節して、各細胞系に対するパルス条件を最適化する必要がある。次に、制限酵素は、真核調節要素の制御下で酵素をコード化するプラスミドから、一時的に発現できる。生成される酵素のレベルは、誘導プロモーターを用いたり、誘導強度を変化させて制御できる。場合によっては、(酵素の毒性によって)生成される制限酵素の量を制限することが望ましいこともある。このような場合、弱い、または突然変異のプロモーター、スプライス部位、翻訳開始コドン、ポリA尾部を用いて、生成される制限酵素の量を低下させることができる。3番目に、制限酵素は、細胞膜に融着するか、細胞膜を透過する作用薬を導入できる。リポソームおよびストレプトリジン(Pimplikarら、J. Cell. Biol. 125:1025(1994))は、この種の作用薬の例である。最後に機械的穿孔(Beckerら、Cell 50:523−534(1987))とマイクロインジェクションを用いて、ヌクレアーゼと他のタンパク質を細胞に導入することも可能である。しかし、活性酵素を生体細胞に導入可能な方法ならすべて適切である。
【0192】
ブレオマイシンと他のDNA破壊作用薬が誘発したDNA切断によっても、異なるDNA切断パターンが生成できる。そのため、細胞内で2本鎖切断を生成可能な作用薬およびインキュベーション条件は、効率の上昇および/または非相同組換部位の変更に役立つ。DNA切断化学薬品の種類の例として、これに限定されるわけではないが、過酸化物、他のフリーラジカル生成化合物、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬、酸、置換ヌクレオチド、エネジエン(enediyne)抗体が挙げられる。
【0193】
具体的なDNA切断化学薬品の例としては、これに限定されるわけではないが、ブレオマイシン、過酸化水素、クメンヒドロペルオキシド、t−ブチルヒドロペルオキシド、(アニリン、1−ナフチルアミンまたは1−ナフトールと反応させた)次亜塩素酸、硝酸、リン酸、ドキソルビシン、9−デオキシドキソルビシン、ジメチル−6−ドキソルビシン、5−イミノダウノルビシン、アドリアマイシン、4’−(9−アクリジニルアミノ)メタンスルフォン−m−アニシジン、ネオカルチノスタチン、8−メトキシカフェイン、エトポシド、エリプチシン、イドクスウリジン、ブロモデオキシウリジンが挙げられる。
【0194】
照射あるいはブレオマイシンなどの、少量のDNA切断作用剤に細胞を事前に露出させておくと、細胞内のDNA修復機構を引き起こすことが可能である。トランスフェクションの約24時間前にこれらの作用剤で細胞を事前処理すると、細胞は、DNA切断の修復とトランスフェクション後のDNA組込がさらに効率よく行える。さらに、LD50(露出された細胞の致死率が50%となる量)が事前処理後は高くなるため、照射や他のDNA切断剤の量を多く使用することもできる。これにより、複数の投与量でランダムな活性化ライブラリが作成され、宿主細胞の染色体内の組込部位の種々の分布が生じる。
【0195】
(スクリーニング)
いったん活性化ライブラリ(または複数のライブラリ)が作成されると、多くのアッセイを用いてスクリーニングが可能である。興味のあるタンパク質(たとえば、分泌されたウイルス細胞内タンパク質)の特性とライブラリを作成するのに用いる活性化作成物の性質によって、以下で説明するアッセイのいずれか、あるいはすべてを利用できる。他のアッセイ形式も使用できる。
【0196】
(ELISA)
酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)を用いて、活性化タンパク質を検出できる。活性化遺伝子生成物が分泌されると、活性化ライブラリ細胞のプールによる培養上清が、興味のあるタンパク質に固有の結合抗体を含むウェルでインキュベートされる。細胞または細胞のグループが興味のある遺伝子を活性化すると、タンパク質が培地に分泌される。ライブラリクローンのプール(プールは、1から100,000を超えるライブラリメンバの範囲でよい)をスクリーニングすると、興味のある遺伝子を活性化した細胞を含むプールが識別できる。それから、同朋選択、限界希釈、または当業者に周知の他の技術によって、興味のある細胞を他のライブラリ メンバから精製できる。分泌されたタンパク質に加えて、ELISAは、細胞間および膜結合タンパク質を発現する細胞のスクリーニングに用いることができる。このような場合、培養上清をスクーリンニングする代わりに、少数の細胞をライブラリプール(各細胞は、プールごとに少なくとも100から1,000回表現される)から除去し、溶解・清澄させ、抗体で被覆したウェルに加える。
【0197】
(ELISA スポット アッセイ)
ELISAスポットは、興味のあるタンパク質に固有の抗体で被覆される。被覆後、ウェルを1% BSA/PBSで1時間、37℃でブロックする。ブロック後、ランダム活性化ライブラリから100,000から500,000の細胞を各ウェルに加える(プール全体の最高10%を表現)。一般に、各ウェルにプール1個を宛てる。興味のあるタンパク質を発現する細胞の頻度が1/10000の場合(すなわち、プールが10,000個のクローンで構成されている場合、その中の1個が興味のあるタンパク質を発現する)、ウェル当たり500,000個の細胞で被覆すると、50個の特異性の細胞が得られる。細胞は、動かしたり、分散させたりせずに、37℃で24から48時間、ウェルでインキュベートする。インキュベーション後、細胞を除去し、プレートをPBS/0.05% Tween 20で3回、PBS/1%BSAで3回洗浄する。第2の抗体を適当な濃度でウェルに加え、室温で2時間か、4℃で16時間インキュベートする。これらの抗体はビオチン化するか、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で直接標識できる。第2の抗体を除去し、プレートをPBS/1%BSAで洗浄する。HRPで標識した、第3の抗体またはストレプトアビジンを加え、室温で1時間インキュベートする。
【0198】
(FACSアッセイ)
蛍光細胞分析分離装置(FACS)を用いて、ランダム活性化ライブラリを多くの方法でスクリーニングできる。興味のある遺伝子が細胞表面タンパク質をコード化する場合、蛍光標識された抗体を活性化ライブラリによる細胞と共にインキュベートする。興味のある遺伝子が分泌タンパク質をコード化する場合、細胞をビオチン化して、興味のあるタンパク質に固有の抗体に結合したストレプトアビジンとインキュベートできる(Manzら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)92:1921(1995))。インキュベーション後、細胞を高濃度のゼラチン(またはアガロースやメチルセルロースなど、他のポリマー)に入れて、分泌タンパク質の拡散を抑える。タンパク質が細胞から分泌されると、細胞表面に結合している抗体によって捕捉される。そして、興味のあるタンパク質の存在は、蛍光標識された第2の抗体によって検出される。細胞は、分泌タンパク質と膜結合タンパク質の両方について、蛍光シグナルに従って分類される。その後、蛍光細胞は単離、伸張され、さらにFACS、限界希釈、または、当業者に周知の他の細胞精製技術によって濃縮される。
【0199】
(磁気ビーズ分離)
この技術の原理は、FACと類似している。(上で説明した)膜結合タンパク質や捕捉された分泌タンパク質は、活性化ライブラリを、興味のあるタンパク質固有の抗体結合磁気ビーズでインキュベートすることで検出される。タンパク質が細胞表面にある場合、磁気ビーズはその細胞に結びつく。磁石を用いると、興味のあるタンパク質を発現する細胞を、ライブラリ中の他の細胞から精製できる。これらの細胞をビーズから除去し、伸張、分析し、必要ならばさらに精製する。
【0200】
(RT−PCR)
(少なくともプール中の各クローン数と等しい)少数の細胞を収集・溶解して、RNAを精製する。単離後、逆転写酵素を用いて、RNAが逆転写される。このとき、興味のあるcDNAに固有のプライマーを用いて、PCRが行われる。
【0201】
あるいは、活性化作成物内の合成エクソンと内在性遺伝子のエクソンに渡るプライマーを使用できる。このプライマーは、興味のある、内在的に発現された遺伝子をハイブリダイズおよび増幅しない。逆に、活性化作成物が興味のある遺伝子と活性化された遺伝子の発現の上流で組込まれた場合、このプライマーは、遺伝子に固有の第2プライマーとともに、内在性遺伝子によるエクソンにスプライスされた合成エクソンの存在によって、活性化遺伝子を増幅する。したがって、この方法は、通常、興味のある遺伝子を必要なレベルよりも低レベルで発現させる細胞内で、活性化された遺伝子を検出するのに使用できる。
【0202】
(表現型選択)
本例では、活性化遺伝子に付与された表現型に基づいて細胞を選択できる。選択可能な表現型の例としては、増殖、成長因子独立成長、コロニー形成、細胞分化(たとえば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞など)、足場独立成長、細胞因子の活性化(たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど)、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化(たとえば、静止対活性化T細胞)が挙げられる。上で説明したような表現型を示す活性化細胞を単離することが重要なのは、組込作成物による内在性遺伝子の活性化がおそらく、認められた細胞表現型の原因であるためである。したがって、活性化遺伝子は、認められた表現型を処理したり、誘起するために重要な治療薬または薬ターゲットとなる。
【0203】
上記の各アッセイの感受性は、ライブラリ細胞の遺伝子発現を一時的にアップレギュレートすることで、効果的に高めることができる。これは、たとえばライブラリにPMAおよび腫瘍壊死因子αを加えることによって、NF−κB部位を含むプロモーターに対して実施できる。別個に、あるいはPMAおよびTNF−αとともに、酪酸ナトリウムを加えると、さらに遺伝子発現を高めることができる。これらの試薬を加えると、興味のあるタンパク質の発現が増加するため、興味のある遺伝子活性化細胞を識別するために、より感受性の低いアッセイを使用できるようになる。
【0204】
多くの遺伝子の活性化を最大にする目的で活性化ライブラリが作成されるため、ライブラリクローンをプールに構成することは有用である。各プールは、100,000を超える各クローンで構成できる。したがって、あるプールでは、多くの活性化タンパク質が、多くの場合、希薄濃度で生成される(プール全体の大きさと、特定の活性化タンパク質を生成する、プール内の細胞数が限られていることによる)。したがって、スクリーニング前のタンパク質濃縮は、スクリーニングアッセイにおいて活性化タンパク質を検出する機能を効果的に高める。濃縮について特に有用な方法は、限外濾過である;しかし、他の方法も使用できる。たとえば、タンパク質は、存在する大半またはすべてのタンパク質を結合する条件で、イオン交換、疎水性、色素、ヒドロキシアパタイト、レクチンおよび他の適当な樹脂に吸着させて、非特異的に、または半特異的に濃縮できる。その後、結合タンパク質はスクリーニング前に、少量で除去できる。この方法は、タンパク質の濃縮を促進するために、無血清培地で細胞を培養する場合に有利である。
【0205】
別の例では、活性化作成物に含められる有用な配列は、エピトープタグである。エピトープタグは、活性化タンパク質の親和性精製(たとえば、免疫親和性またはキレート基質)を可能にするアミノ酸配列で構成できる。そのため、活性化作成物にエピトープタグを含ませると、活性化ライブラリによる活性化タンパク質すべてが精製できる。活性化タンパク質を他の細胞や培地タンパク質から精製することによって、新規タンパク質と酵素の活性のスクリーニングが行いやすくなる。ある例では、活性化タンパク質の精製後、エピトープタグを除去することが好ましい場合もある。これは、プロテアーゼ認識配列(たとえば、因子IIaまたはエンテロキナーゼ開裂部位)を、活性化作成物のエピトープタグより下流に組込むことで実施できる。精製された活性化タンパク質を適当なプロテアーゼとインキュベートすると、タンパク質からエピトープタグが放出される。
【0206】
エピトープタグ配列が活性化作成物上に位置するライブラリでは、活性化タンパク質はすべて、親和性精製を用いて、他の細胞タンパク質および培地タンパク質から精製できる。親和性精製は活性化タンパク質を濃縮するだけでなく、これらのタンパク質を、ライブラリをスクリーニングするのに用いられるアッセイを妨害する可能性のある他の作業から精製する。
【0207】
興味のある遺伝子を過剰発現する細胞を含むクローンのプールが確認されると、活性化細胞を単離する手段を行える。活性化細胞の単離は、当業者に周知のさまざまな方法で実施できる。細胞精製方法の例としては、限界希釈、蛍光細胞分析分離、磁気ビーズ分離、同胞選択、クローニングリングを用いた単一コロニー精製が挙げられる。
【0208】
本発明の好ましい例では、発現生成物を精製する過程が含まれる。非常に好ましい例では、内在性遺伝子生成物を発現する細胞は、工業用途、特に診断・治療・薬剤発見用途に利用できる量の遺伝子生成物が生成されるように培養される。
【0209】
本明細書に記載する方法で使用するベクターはすべて、増幅可能なマーカーを含むことができる。その結果、ベクターと(たとえば、過剰発現遺伝子を含む)興味のあるDNAの両方の増幅が細胞内で起こり、内在性遺伝子の発現がさらに高められる。したがって、内在性遺伝子を増幅する手段を方法に含めてもよい。
【0210】
活性化細胞が単離されると、興味のある遺伝子と活性化作成物の両方を含む座位を増幅して、発現をさらに強化することができる。これは、以下に示す方法を単独で、あるいは組合わせることによって、実施できる。
【0211】
増幅可能マーカーは、さらに多いコピー数の場合に選択可能な遺伝子である。増幅可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、カルバミルリン酸シンターゼが挙げられる。これらの例の場合、増幅マーカーとフランキング配列(興味のある遺伝子を含む)の多いコピー数は、増幅マーカーによって作用を受ける薬剤や毒代謝物を使用するために選択できる。一般に、薬剤や毒代謝物濃度が上昇すると、増幅可能マーカーの少数のコピーを含む細胞が死に、これに対して、マーカーのコピーを多数含む細胞は生存し、コロニーを形成する。これらのコロニーは、単離、伸張され、興味のある遺伝子の生成の上昇をレベルについて分析できる。
【0212】
活性化作成物の増幅可能マーカーの配置は、活性化細胞内の興味のある細胞と増幅可能マーカーと並列になる。コピー数を増やした増幅可能マーカーと興味のある遺伝子を含む活性化細胞は、増量した選択性薬剤(通常は薬剤または代謝物)の存在下で、細胞を培養することによって選択できる。たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の増幅は、メトトレキサートを用いて選択できる。
【0213】
薬剤耐性コロニーは、増加させた各薬剤濃度において発生するため、各コロニーは、増幅可能なマーカーおよび興味のある遺伝子のコピー数に関して選択・特徴付けが可能で、興味のある遺伝子の発現について分析できる。活性化遺伝子発現が最高レベルのコロニーはそれぞれ、より高い薬剤濃度でさらに増幅するために選択できる。最高の薬剤濃度では、クローンが発現する、興味のあるタンパク質の量は著しく増加する。
【0214】
DHFRを増幅する場合、複数の異なる濃度のメトトレキセートで約1x107の細胞をプレートさせると都合がよい。メトトレキセートの有効所期濃度は、約5から100nMの範囲である。しかし、メトトレキセートの最適濃度は、各細胞系と組込部位について経験的に決定する必要がある。メトトレキセート含有培地での培養後、メトトレキセートの最高濃度によるコロニーを選んで、興味のある遺伝子発現の増加について分析する。その後、最高濃度のメトトレキセートによるクローンは、DHFRと興味のある遺伝子をさらに増幅するために選択する、さらに高濃度のメトトレキセート中で培養する。遺伝子増幅の程度が最高のクローンには、マイクロモルおよびミリモル範囲のメトトレキセート濃度を使用できる。
【0215】
複製のウイルス起点(たとえば、ori Pまたはヒト細胞のSV40、マウス細胞のpolyoma ori)を活性化作成物に配置すると、活性化細胞内の興味ある遺伝子と複製のウイルス起点が並列になる。そして、起点とフランキング配列は、ウイルス複製タンパク質をトランスに導入することで増幅できる。たとえば、ori P(Epstein−Barrウイルスの複製起点)を用いると、EBNA−Iが一時的、または安定して発現できる。EBNA−Iは、組込まれたori P座位から複製を開始する。複製は、起点から双方向に広がる。各複製生成物が作成されると、これも複製を開始できる。結果として、ウイルス起点と、興味のある遺伝子を含むフランキングゲノム配列のコピーが多数作成される。コピー数が多くなると、細胞が興味のある遺伝子をより多く生成できる。
【0216】
複製生成物はある頻度で組換を行って、興味のある遺伝子を含む、フランキングゲノム配列を含む環状分子を生成する。興味のある遺伝子を持つ環状分子を含む細胞は、Hirt抽出とサザンブロッティングによる1回の細胞クローニングと分析で単離できる。精製を行うと、コピー数を増やした(通常10から50コピー)エピソームゲノム座位を含む細胞を、培養により繁殖できる。より多く増殖するためには、元の作成物の第1の起点に隣接する第2の起点を含めることにより、エピソームをさらに増加できる。たとえば、T抗原を用いて、ori P/SV40エピソームのコピー数を最大1,000まで増加できる(Heinzelら、J. Virol. 62:3738(1988))。このようにコピー数を実質的に増加させると、タンパク質の発現を劇的に高めることができる。
【0217】
本発明は、インビボとインビトロの両方での、内在的遺伝子の過剰発現を含む。そのため、細胞は、遺伝子生成物の必要量を精製するためにインビトロで使用するか、その遺伝子生成物を無傷の動物に提供するためにインビボで使用することが可能である。
【0218】
本発明は、本明細書に記載した方法によって生成されたタンパク質も含む。タンパク質は、既知、あるいは以前未知であった遺伝子のいずれかから生成できる。本方法で作成可能な周知のタンパク質の例としては、これに限定されるわけではないが、エリスロポイエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージ刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−2、インターロイキン−6、インターロイキン−11、インターロイキン−12、TGFβ、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、TSH−β、骨成長因子−2、骨成長因子−7、腫瘍壊死因子、アルファ−1 抗トリプシン、抗トロンビンIII、白血病抑制因子、グルカゴン、プロテインC、プロテインキナーゼC、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、ニューロトロピンー3、トロンボポイエチン、絨毛膜ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、アルファグルコシダーゼ、上皮成長因子、FGF、マクロファージコロニー刺激因子、上記の各タンパク質のための細胞表面レセプタが挙げられる。
【0219】
活性化細胞によるタンパク質生成物を生成する場合、当業者に周知の、いずれのタンパク質生成方法を用いてもよい。
【0220】
(活性化された膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞の単離)
膜関連タンパク質をコードする遺伝子は、医薬品開発の観点から特に興味深い。これらの遺伝子およびこれら遺伝子のコードするタンパク質は、例えば、コンビナトリアルケミストリーライブラリーやハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、低分子の医薬品を開発するのに利用可能である。また、これらのタンパク質やその可溶型タンパク質(例えば、膜貫通領域を欠いた切断型)は、ヒトや動物において治療的に活性のある医薬品として利用可能である。膜タンパク質の同定は、ツーハイブリッド研究法やアフィニティーキャプチャー技術を用いて、新規リガンド(例えば、サイトカイン、成長因子、および他のエフェクター分子)を同定するのにも利用可能である。他にも多くの膜タンパク質利用法が考えられる。
【0221】
内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するための現在の研究法は、cDNAライブラリーからの遺伝子の単離とシークエンシングを含む。次に、タンパク質の膜貫通領域を同定できる疎水性プロットを用いて、ORF解析により内在性膜タンパク質を同定する。残念ながら、cDNAライブラリーを作製した細胞内で内在性膜タンパク質をコードする遺伝子が発現されていなければ、この方法を用いてその遺伝子は同定できない。さらに、多くの遺伝子は、発生段階の短い時期に、およびまたは非常に低レベルで、非常に限られた細胞でのみ発現する。その結果、現在利用できる研究法では、これらの遺伝子を効率的に同定することができない。
【0222】
本発明により、遺伝子の配列、構造、機能、あるいは発現の性質の知識なしに、内在性遺伝子を活性化することができる。この開示した方法を用いて、遺伝子は転写レベルでのみ、あるいは転写と翻訳の両レベルで活性化される。その結果、組み込みベクターを含む細胞内で、活性化内在性遺伝子にコードされるタンパク質が産生される。さらに、ここで開示した特異的ベクターを用いることにより、活性化内在性遺伝子から産生されるタンパク質に、例えばエピトープタグを含むなどの修飾ができる。他のベクター(例えば、上記したベクター12から17)は、エピトープタグの上流にシグナルペプチドをコードする。このベクターは、内在性膜タンパク質の発現を活性化した細胞を単離するのに利用できる(以下の例5を参照)。このベクターは、通常では分泌されないタンパク質を分泌させるのにも利用できる。
【0223】
このように、本発明は、細胞の内在性膜タンパク質や膜貫通タンパク質をコードする内在性遺伝子を同定する方法にも関連する。本発明のこのような方法は、一つあるいはそれ以上のステップからなる。例えば、本発明のこのような一方法は、(a)本発明の一つあるいはそれ以上のベクターを細胞に導入し; (b)非相同的組換えにより、ベクターを細胞のゲノムに組み込み;(c)組み込まれたベクターコンストラクト内に含まれる転写制御配列によって遺伝子をアップレギュレートションし、内在性遺伝子を過剰発現させ;(d)内在性遺伝子を過剰発現する細胞をスクリーニングし;(e)活性化遺伝子をキャラクタライズし、細胞の内在性膜タンパク質をコードする遺伝子として同定する。というステップからなる。関連実施態様として、本発明は、活性化遺伝子のキャラクタライズ以前にさらに細胞からの活性化遺伝子の単離を含む方法を提供する。
【0224】
内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するため、細胞のゲノムに組み込むベクターは、開始コドン、シグナル配列、およびエピトープタグを含むエキソン配列に連結した制御配列を含み、その下流には不対スプライスドナー部位がくる。組み込みと内在性遺伝子の活性化により、ベクター由来のシグナルペプチドとエピトープタグが下流の内在性遺伝子のエキソンにコードされるタンパク質に融合したキメラタンパク質が産生される。このキメラタンパク質は、ベクターのコードするシグナルペプチドが存在するため分泌経路へと向けられ、タンパク質の翻訳終了後はそのタンパク質が分泌される。しかしながら、活性化内在性遺伝子が内在性膜タンパク質をコードし、その遺伝子の膜貫通領域がベクターの組み込み部位の3’側に位置するエキソンにコードされる場合には、このキメラタンパク質は細胞表面へ行き、エピトープタグが細胞表面上に提示される。周知の細胞単離法(例えば、フローサイトメトリーによるソーティング、マグネチックビーズによる細胞ソーティング、免疫吸着、あるいは当業者に周知の他の方法)により、エピトープタグに対する抗体を用いて、エピトープタグを提示し内在性膜タンパク質コード遺伝子を活性化した細胞を全体の中から単離することができる。これらの細胞は、次に膜タンパク質の機能の研究に利用できる。また、例えば、ベクターのコードするエキソンに特異的なDNAプローブでハイブリダイゼーションし、これらの細胞から作製したcDNAライブラリーをスクリーニングするなどの周知方法を利用して、あるいはここで示した遺伝子コンストラクトを用いて、さらに細胞から活性化遺伝子を単離できる。
【0225】
ベクターのエキソンにコードされるエピトープタグは、抗体に結合可能な短いペプチド、物質に結合可能な短いペプチド(例えば、ポリヒスチジン/二価金属イオン担体、マルトース結合タンパク質/マルトース担体、グルタチオンS−トランスフェラーゼ/グルタチオン担体)、あるいは内在性膜タンパク質由来の細胞外ドメイン(膜貫通ドメインを欠く)で抗体やリガンドの存在するものである。しかしながら、当業者に周知の他のタイプのエピトープタグも、本発明に準じて同等に利用できると考えられる。
【0226】
内在性遺伝子の非標的活性化のためのベクター
上述したように非標的遺伝子活性化は、新たな遺伝子およびタンパク質を発見および単離するための、そして商業化のために特定のタンパク質を大量に生産するための強力な手法が提供を提供する、宿主細胞における内在性遺伝子の活性化を含め、多くの重要な用途がある。非標的遺伝子活性化の一部の用途では、細胞のライブラリーを作成することが望ましい。このライブラリーでは、各メンバが宿主細胞ゲノムの独自の位置に組込まれた活性化ベクターを含み、ライブラリーの各メンバが各種内在性遺伝子を活性化している。さらに、組込ベクターを含むが、内在性遺伝子を活性化できないライブラリーから細胞を除去することが望ましい。真核細胞は遺伝子を欠失した大規模領域を含むことが多く、遺伝子のない領域への活性化ベクター組込は頻繁に行われる。しかし、これらの組込ベクターは、内在性遺伝子を活性化できないが、(適切なプロモーターによって駆動され、ポリアデニル化シグナルが続く)選択マーカーを活性化ベクターに包含させると、宿主細胞に薬剤耐性を付与することができる。遺伝子発見用途ではさらに不確実であるが、ベクター配列を含む転写産物は、遺伝子が活性されているかどうかにかかわらず、これらの細胞内で生成される。遺伝子が活性化されていない場合、これらのベクター配列含有転写産物は、非遺伝子ゲノムDNA配列を含む。結果として、活性化遺伝子を単離する場合、単離されたベクター由来のRNA(またはcDNA)分子すべて(すなわちベクター配列を含む転写産物)を単離することはできない。なぜなら、これらの転写産物の多くは内在性遺伝子をコードしないためである。これらの問題を克服するために、本発明は、高特異性ベクターおよびベクター活性化遺伝子の単離を促進する方法を提供する。
【0227】
本発明のこれらのベクターは、内在性遺伝子発現の活性化と、活性化遺伝子に対応するmRNAおよびcDNAの単離に有用である。このようなベクターの1つは、ベクターをゲノム内に組込む細胞の数を減少させるが、内在性遺伝子から発現を活性化(あるいは内在性遺伝子によって転写)することができなかった。これらの細胞を除去することによって、さらに少ないライブラリーメンバを作成およびスクリーニングし、所与の数の活性化遺伝子を単離できる。さらに、活性化遺伝子を発現できなかったベクター含有細胞は、真の活性化細胞の単離を妨害可能なRNA分子を生成する。したがって、本明細書で開示するベクターは、タンパク質過剰発現および/または活性化遺伝子に対応するcDNA分子の単離に適した細胞を生成するのに特に有用である。本発明の第2の種類のベクターは、活性化内在性遺伝子からエキソンIを単離するのに有用である。結果として、これらのベクターは活性化RNA転写産物から全長遺伝子を得るのに使用できる。本明細書で述べる機能性ベクター成分はそれぞれ独立して、あるいは相互に組み合わせて使用できる。
【0228】
ポリ(A)トラップ活性化ベクター
活性化遺伝子の単離を促進するために、本発明は、内在性遺伝子の活性化時に優先的に薬剤耐性コロニーを生成できる、新規の遺伝子活性化ベクターを提供する。このようなベクターは、本明細書では「ポリ(A)トラップベクター」と呼ぶ。ポリ(A)トラップベクターは、図8A−8Fに示す。pRIG21bと呼ばれる、このような二重ポリ(A)トラップベクターの1つのヌクレオチド配列は、図15A−15B(配列番号19)に示す。これらのベクターは、ポリ(A)シグナルを欠失した選択マーカー遺伝子に動作可能に結合された(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはCMV即時型遺伝子プロモーター、SV40 T抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーターまたはβ−アクチンプロモーターなどのプロモーターである)転写調節配列を含む。選択マーカー遺伝子がポリアデニル化シグナルを欠失しているため、そのメッセージは安定ではなく、マーカー遺伝子生成物は十分に生成されない。しかし、活性化ベクターは内在性遺伝子の上流に組込まれる場合、選択マーカーは内在性遺伝子のポリアデニル化シグナルを利用して、それにより薬剤耐性を付与するのに十分な量の選択マーカータンパク質を生成することができる。したがって、この活性化ベクターを組込む細胞は一般に、内在性遺伝子が活性化された場合のみ、薬剤耐性コロニーを形成する。
【0229】
ポリ(A)トラップ活性化ベクターは、任意の選択可能またはスクリーニング可能マーカーを含むことができる。さらに、選択マーカーは、組込ライブラリー作成に使用される細胞内で機能性であるどのプロモーターからも発現できる。したがって、選択マーカーはウイルス性または非ウイルス性プロモーターによって発現できる。随意に、不対スプライス供与体部位は作成物、好ましくは選択マーカーの3’に包含させて、選択マーカーをコードするエキソンを、内在性遺伝
子のエキソンに直接スプライスすることができる。下流の転写調節配列およびスプライス供与体部位がベクターに含まれている場合、選択マーカーに隣接してスプライス供与体部位が含まれていると、これらの下流要素がメッセンジャーRNAから除去される。
【0230】
関連する実施形態において、(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである)第2の転写調節配列は、選択マーカーの下流および選択マーカーと同じ方向に配置してもよい。随意に、不対スプライス供与体部位は下流の転写調節配列に結合してもよい。このような配置では、ポリ(A)トラップ活性化ベクターは、内在性エキソンにスプライスされた下流ベクターコードエキソンを含むメッセージを生成できる。上述したように、これらのキメラ転写産物は、ベクターコードエキソンの性質によって、未変性または修飾タンパク質に翻訳可能である。
【0231】
本明細書で使用するように、「ベクターコードエキソン」は、転写調節配列下流と、ベクター上に見られる転写開始部位および不対スプライス供与体部位の間にあるベクターの領域を意味する。ベクターコードエキソンは、十分に処理されたメッセージ内に内在性遺伝子を含む転写産物の5’末端に存在する。同様に、本明細書で使用するように、「ベクターコードイントロン」は
、不対スプライス供与体部位の下流に位置するベクターの領域である。ベクターに線形化部位が存在する場合、ベクターコードイントロンは、不対スプライス供与体部位および直線化部位の間のベクターコードエキソンの下流であるベクターの領域である。ベクターコードイントロンは、RNA処理中に活性化遺伝子転写産物から除去される。
【0232】
スプライス受容体トラップ(SAT)ベクター
内在性遺伝子を活性化できない細胞を除去する別の方法として、本発明は、本明細書で「スプライス受容体トラップ(SAT)」ベクターと呼ぶ別のベクターを提供する。これらのベクターは、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性スプライス受容体までスプライスするように設計されている。さらに、該ベクターは、スプライシングが行われない場合には、宿主細胞にとって毒性である生成物(または対抗して選択可能な生成物)を生成するよう設計されている。したがって、これらのベクターは、ベクターコードエキソンが内在性エキソンをスプライスできない細胞の消滅を促進する。
【0233】
スプライス受容体トラップベクターは、ベクター上で同じ方向に向いたポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカー遺伝子の両方を含むことができる。本明細書で使用されるように、ポジティブ選択マーカーは発現時に、マーカーを発現する細胞の単離を促進可能なタンパク質を生成する遺伝子である。同様に、本明細書で使用されるように、ネガティブ選択マーカーは発現時に、マーカーを発現する細胞の除去を促進可能なタンパク質を生成する遺伝子である。
ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは、不対スプライス供与体部位によってベクター作成物内で分離されることが好ましい。しかし、他の実施形態において、ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカー遺伝子内に融合させてもよい。この配置では、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーのリーディングフレームが保存されるように、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーの間に配置される。不対スプライス供与体部位は、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーの接合部に配置されることが好ましい。しかし、不対スプライス供与体部位は、内在性スプライス受容体部位へのスプライシング時に、ポジティブ選択マーカーが活性形で発現され、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように、融合遺伝子のどこに配置してもよい。この配置では、ポジティブ選択マーカーは、ネガティブ選択マーカーの上流に配置される。
【0234】
本明細書に含まれる説明を考慮すれば、SATベクター上のポジティブおよびネガティブ選択マーカーが融合タンパク質として発現される必要がないことも、当業者には明白である。ある実施形態において、内部リボゾームエントリー部位(ires)は、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの間に挿入される。この配置において、不対スプライス供与体部位は2つのマーカーの間か、どちらかのマーカー遺伝子のリーディングフレーム内に、スプライシング時に、ポジティブ選択マーカーが活性形で発現され、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように配置できる。別の実施形態において、ポジティブ選択マーカーを、ネガティブ選択マーカー以外の各種の転写調節配列から駆動することができる。この配置において、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーの5’未翻訳領
域、またはネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内のどこかに、スプライシング時に、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように配置される。さらに、ポジティブおよびネガティブマーカーが各種の転写調節配列から駆動される場合、ポジティブ選択マーカーはネガティブ選択マーカーの上流または下流に配置され、ポジティブ選択マーカーはその3’末端にスプライス供与体部位を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【0235】
本明細書で述べるベクターは、どのポジティブ選択マーカーを含んでいてもよい。本明細書において有用なポジティブ選択マーカーの例としては、ネオマイシン(neo)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ピューロマイシン(pac)、デヒドロオラターゼ、グルタミンシンセターゼ(GS)、ヒスチジンD(hisD)、カルバミルホスフェートシンターゼ(CAD)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、マルチドラッグ耐性(mdr1)、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(gpt)、アデノシンデアミナーゼ(ada)をコードする遺伝子が挙げられる。あるいは、ベクターはポジティブ選択マーカーの代わりに、スクリーニング可能マーカーを含んでいていもよい。スクリーニング可能マーカーとしては、宿主細胞内で識別可能な表現形を生成可能な任意のタンパク質を含む。スクリーニング可能マーカーの例としては、細胞表面エピトープ(CD2など)および酵素(β−ガラクトシダーゼなど)が挙げられる。
【0236】
本明細書で述べるベクターも、あるいは、対抗して選択される任意のネガティブ選択マーカーを含んでいてもよい。ネガティブ選択マーカーの例としては、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、チミジンキナーゼ(TK)およびジフテリア毒素が上げられる。ネガティブ選択マーカーは、細胞表面タンパク質または酵素などの、スクリーニング可能マーカーでもよい。ネガティブ選択マーカーを発現する細胞はたとえば、蛍光発色セルソーティング(FACS)または磁気ビードセルソーティングによって除去できる。
【0237】
内在性遺伝子を活性化発現した細胞を単離するために、組込ベクターを含む細胞は、適切な薬剤選択によって識別できる。ポジティブ選択マーカー向けであり、ネガティブ選択マーカーに対抗する選択は同時に行える。他の実施形態では、選択は連続して行える。選択を連続して行う場合、ポジティブ選択マーカー向けの選択を最初に行い、次にネガティブ選択マーカーに対抗する選択を行う。あるいは、ネガティブ選択マーカーに対抗する選択を最初に行い、次にポジティブ選択マーカー向けの選択を行う。
【0238】
ポジティブおよびネガティブマーカーは、各遺伝子の翻訳開始部位の上流に位置する転写調節要素によって発現される。ポジティブ/ネガティブマーカー融合タンパク質またはires配列を使用する場合、1個の転写調節要素が両方のマーカーを発現させる。ポリ(A)シグナルは各選択マーカーの3’に置かれる。ポジティブ/ネガティブ融合遺伝子を使用する場合、1個のポ
リ(A)シグナルはマーカーの3’に配置される。あるいは、遺伝子活性化イベント(以下の二
重ポリ(A)/スプライス受容体トラップを参照)のための追加特異性を与えるために、ポリ(A)シグナルはベクターから排除してもよい。
【0239】
二重ポリ(A)/スプライス受容体トラップベクター
遺伝子活性化イベントを欠失した細胞の数をさらに減少させるために、本発明は、ベクターコードエキソンを内在性遺伝子によるエキソンにスプライスし、ポリ(A)シグナルを獲得しさえすれば、宿主細胞を生存させられるベクターも提供する。これらのベクターは本明細書では、「二重ポリ(A)/スプライス受容体トラップベクター」または「二重ポリ(A)/SATベクター」と呼ぶ。細胞生存のためにスプライシングおよびポリアデニル化の両方の発生を必要とすることにより、内在性遺伝子を活性化できなかった細胞は、活性化ライブラリーからさらに効率よく除去される。
【0240】
二重ポリ(A)/スプライス受容体トラップベクターは、SATベクターで述べたように構成されたポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む;しかし、どちらの遺伝子も機能性ポリ(A)シグナルを含んでいない。したがって、ポジティブ選択マーカーは、スプライシングが発生して内在性ポリ(A)シグナルを捕捉しなければ、高レベルで発現されない。ポリ(A)シグナルがないことは別として、この種のベクターの他のすべての機能および実施形態は、本明細書で述べるSATベクターと同様である。二重ポリ(A)/SATベクターの例は図9A−9Fおよび10A−10Fに示す。pRIG22bと呼ぶ、このような二重ポリ(A)/SATベクターの1つを16A−16Bに示す(配列番号20)。
【0241】
内在性遺伝子からタンパク質発現を活性化するのためのベクター
非標的遺伝子活性化の多くの用途では、活性化内在性遺伝子からタンパク質を生成することが望ましい。これを実現するには、(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである)第2の転写調節配列を、本明細書で述べる任意のベクター上の選択マーカーの下流に配置できる。ポリ(A)トラップベクター、SATベクターまたは二重ポリ(A)トラップ/SATベクターを使用すると、下流転写調節配列は、上流の選択マーカーと同じ方向に発現させるように配置される。しかし、この種のベクターによって全長タンパク質の発現を活性化させるには、エキソンIの潜在性開始ATGコドンを避けるために、ベクターを内在性遺伝子の5’UTR内に組込む必要がある。
【0242】
あるいは、非標的遺伝子活性化を用いてタンパク質発現の頻度を増加させるために、ベクター上の下流転写調節配列を、スプライス供与体部位が続くエキソン配列に動作可能に結合してもよい。好ましい実施形態において、ベクターエキソンは開始コドンを欠失している。このベクターは、エキソンIで翻訳開始コドンをコードしない遺伝子からタンパク質発現を活性化させるために特に有用である。別の好ましい実施形態において、ベクターエキソンは開始コドンを含んでいる。付加コドンは、翻訳開始コドンおよびスプライス供与体部位の間に配置でいる。たとえば、部分シグナル分泌配列はベクターエキソン上でコードできる。部分シグナル配列は、機能性シグナル配列を生成する内在性遺伝子による部分シグナル配列を補完可能な、どのアミノ酸配列でもよい。部分配列は、1および100番目のアミノ酸をコードし、既存遺伝子から由来するか、新規配列より成る。したがってこのベクターは、エキソンIの内在性シグナル配列の一部を、そしてそれ以降のエキソンから残りのシグナル配列の一部をコードする遺伝子からタンパク質を生成および分泌するのに有用である。特殊な種類の内在性遺伝子を活性化するのに有用なベクターの別の例では、機能性シグナル配列をベクターエキソン上にコードできる。このベクターによって、エキソンIのシグナル配列をコードする遺伝子からタンパク質を生成および分泌することができる。通常は分泌されないタンパク質の分泌形を生成するために使用することもできる。
【0243】
開始コドンがベクターエキソンに含まれている場合、各リーディングフレーム内にベクターを生成することは有利である。これは、開始コドンおよびスプライス供与体結合部位の間のヌクレオチド数を変えて実施できる。同時に、好ましいベクター配置は、エキソン/イントロン構造、翻訳開始コドンの位置またはリーディングフレームとは無関係に、内在性遺伝子からタンパク質を生成することができる。
【0244】
活性化内在性遺伝子からエキソンIを単離するためのベクター
上述した非標的遺伝子活性化ベクターは、内在性遺伝子の活性化および単離、内在性遺伝子からのタンパク質の生成に有用である。しかし、内在性遺伝子上流での組込時に、これらのベクターはそれぞれ、内在性遺伝子によるエキソンIを欠失した転写産物を生成する。ベクターは、ベクター組込部位の下流の第1スプライス受容体部位にスプライスされたベクターコードエキソンを含む転写産物を生成するように設計されており、真核遺伝子の第1エキソンはスプライス受容体部位を含まないため、通常、内在性遺伝子の第1エキソンは非標的遺伝子活性化に由来するmRNA分子上では回収されない。第1エキソン内にコード情報を含む遺伝子などの一部の遺伝子では、活性化内在性遺伝子の第1エキソンを効率よく回収する必要がある。
【0245】
活性化内在性遺伝子の第1エキソンを回収するために、転写調節配列(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである)は、ベクターコードエキソンを発現させる第2の転写調節配列(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである)下流の活性化ベクターに含まれている。したがって、上流の転写調節配列が不対スプライス供与体部位に結合され、下流転写調節配列はスプライス供与体部位に結合されない。両方の転写調節配列が同一方向に発現するように方向付けられている。このようなエキソンI回収ベクターの例を図12A−12Gに示す。この種のベクターの組み込みは、少なくとも2つの異なるRNA転写産物を作成する(図13)。第1の転写産物は上流転写調節配列から由来し、内在性遺伝子のエキソンIIに酢プライスされたベクターエキソンを含む。第2の転写産物は、下流転写調節酵素から由来し、5’から3’まで、ベクターと遺伝子、エキソンI、エキソンIIおよ
びすべての下流エキソンの転写開始部位の間の領域を含む。本明細書で述べる方法を用いて、両方の転写産物を回収および分析して、非標的遺伝子活性化によって単離された遺伝子によるエキソンIのキャラクタリゼーションができる。
【0246】
活性化ベクターに位置するエキソンは、選択マーカー、タンパク質、タンパク質の一部、分泌シグナル配列、シグナル配列の一部、エピトープを発現可能であり、あるいは何も発現しないことも可能である。エキソンによってタンパク質が発現される場合、ポリ(A)シグナルをベクターコード遺伝子の下流に包含させることもできる。あるいはポリ(A)シグナルを省略してもよい。別の実施形態において、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを上流転写調節配列に、動作可能に結合することもできる。本実施形態では、選択マーカーに対応する不対スプライス供与体部位の位置は、SATベクターおよび二重ポリ(A)/SATベクターについて上で述べられている。
【0247】
シングルエキソンおよびマルチエキソン遺伝子とラッピングのための遺伝子活性化ベクター
上述したように、ある実施形態において、本発明のポリ(A)トラップベクターは、選択マーカーに動作可能に結合され、その後に不対スプライスドナー部位が続く。このようなベクターは、遺伝子内または付近に組込まれると、内在性遺伝子上にスプライスされる選択マーカーを含む転写産物を生成する。内在性遺伝子がポリ(A)シグナルをコードすると、生じたmRNAはポリアデニル化され、それによって転写産物が、組込ベクターを含む細胞に対して薬剤耐性を付与するのに十分なレベルで翻訳される。
【0248】
上記のベクターは内在性遺伝子を「トラップ」できるが、選択マーカー下流のスプライス供与体部位は、このようなベクターの有力な用途のいくつかでは使用できず、場合によっては妨害をする。第1にこのようなベクターは、単一エキソン遺伝子がスプライス受容体部位を含んでいないため、それらを選択的にトラップするのに使用できない。第2にこれらのベクターは、薬剤耐性がポリ(A)シグナルの上流のベクター組込のみに依存するため、潜在性遺伝子を「トラップ」することが多い。あいにく、潜在性ポリ(A)シグナルがゲノム内に位置することは、薬剤耐性細胞の形成と、選択マーカーを含む非遺伝子転写産物の作成につながる。これらの細胞および転写産物は、これらのベクターを用いた遺伝子発見用途を妨害する。第3に、本明細書で述べるような新たな修飾を用いないと(上を参照)、これらのベクターは活性化内在性遺伝子からタンパク質を効率よく生成できない。さらに、内在性遺伝子によるタンパク質は、内部リボソームエントリー部位(ires)が選択マーカーおよびスプライス供与体部位の間に含まれている場合でさえ、わずかしか発現しない。なぜならiresによる翻訳は一般に、転写産物の5’末端の
第1開始コドンからの翻訳よりも効率が低いからである。したがって、単一エキソン遺伝子を含む内在性遺伝子をさらに特異的にトラップ可能であり、活性化内在性遺伝子からタンパク質を効率的に発現できるベクターが必要である。
【0249】
それゆえ、別の実施形態において、本発明はそのようなベクターを提供する。そのような実施形態の1つでは、ベクターは、1個以上の(すなわち1、2、3、4、5またはそれ以上)の選択マーカーに動作可能に結合されたプロモーターを含み、そこでは選択マーカーの後にスプライスド供与体部位またはポリ(A)シグナルは続いていない(図17A−17Gを参照)。マーカー転写産物はポリアデニル化されないため、一般に、宿主細胞ゲノムへの組込時にこのベクターは十分な量の選択マーカーを生成できない。しかし、ベクターが単一エキソン遺伝子を含む遺伝子付近、あるいは遺伝子内に組込まれると、選択マーカーは内在性遺伝子からポリ(A)シグナルを捕捉し、それによってマーカー転写産物が安定し、細胞に薬剤耐性表現型が付与される。ベクター組込を遺伝子内か、遺伝子付近のどちらにするか選択することに加えて、本発明の本態様によるベクターも、本明細書の「活性化内在性遺伝子からエキソンIを単離するためのベクター」という節で述べたように、活性化遺伝子からエキソンIを回収するのに使用できる。
【0250】
好ましい実施形態では、ベクターは第1の選択マーカーの上流に第2の選択マーカーを含むことができる(図18を参照)。上流の選択マーカーは、好ましくは転写調節配列に、最も好ましくはプロモーターに動作可能に結合される。随意に、不対スプライス供与体部位は、上流選択マーカーの転写開始部位および翻訳開始部位の間に配置できる。あるいは、スプライス供与体部位は、宿主細胞ゲノムへのベクター組込の後、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性エキソンへのスプライス時に、上流選択マーカーが不活性化形で生成されるように、あるいは全く生成されないように、上流選択マーカーのリーディングフレーム内のどこに配置してもよい。下流ポジティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞のために選択することによって、遺伝子内または遺伝子付近に組込まれたベクターを含む細胞を単離できる。さらに、上流選択マーカーを活性化形で生成する細胞に対抗して選択することによって、ベクター転写産物がマルチエキソン内在性遺伝子によるエキソンにスプライスされた細胞を除去することができる。言い換えれば、これらの例では、ベクターコードスプライス供与体部位および内在性ポリ(A)シグナルの間にスプライス受容体部位がないため、これらのベクターは、単一エキソン遺伝子またはマルチエキソン遺伝子の3’が最も多いエキソンに組込まれたベクターを含む細胞を使用できる。したがっ
て、活性化マルチエキソンを含む細胞の多くは選択後も生存せず、結果として、活性化シングルエキソンを含む細胞はライブラリー内で著しく濃縮される。
【0251】
別の好ましい実施形態において、本発明の本態様によるベクターは、第1の選択マーカーの上流に1個以上(すなわち1、2、3、4、5個以上、好ましくは1個の)ネガティブ選択マーカーを含む(図19Aおよび19Bを参照)。ネガティブ選択マーカーはプロモーターに動作可能に結合されることが好ましい。随意に、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーの転写開始部位および翻訳開始部位の間に配置してもよい。あるいは、スプライス供与体部位は、宿主細胞ゲノムへのベクター組込後、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性エキソンへのスプライスの間にネガティブ選択マーカーが不活性化形で生成されるように、あるいは全く生成されないように、ネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内のどこに配置してもよい。ポジティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞のために選択し、ネガティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞に対抗して選択することによって、これらのベクターは内在性遺伝子の内部または上流に組込まれたベクターを含む細胞を同定するのに使用できる。(1)内在性エキソンへのスプライシングおよび(2)ポリ(A)シグナルの捕捉はどちらも細胞生存に必要であり、潜在性遺伝子トラップイベントを含む細胞はライブラリー内で減少する。この理由は、潜在性スプライス受容体部位および潜在性ポリ(A)シグナルの両者に隣接して組込まれるベクターの確率が、単一の潜在性部位に隣接して組込まれるベクターの確率よりも実質的に低いからである。したがって、これらのベクターは以前のベクターよりも、遺伝子を捕捉するための特異性が高い。
【0252】
本明細書の内容を考慮すると、当業者は、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含むベクターを用いて活性化内在性遺伝子からタンパク質を生成できることも認識するであろう。タンパク質生成を指示できるあるベクター構成は、ネガティブ選択マーカーの5’UTRに配置され
たスプライス供与体部位より構成される。スプライシング時に、内在性遺伝子の第2エキソンに結合されたネガティブ選択マーカーによる5’UTRを含むキメラ転写産物が生成される。この
ベクターは、第2または次のエキソン内で翻訳開始コドンをコードする遺伝子よりタンパク質生成を活性化できる。同様に、スプライス供与体部位はネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内の、スプライスが生じなければマーカーの機能が妨害されない位置に配置できる。翻訳開始コドンに対応する別のリーディングフレーム内に配置されたスプライスドナー部位を含む同様のベクターも使用できる。内在性遺伝子にスプライスする場合に、これらのベクターは、活性化内在性遺伝子のエキソンIIに融合されたネガティブ選択マーカーによる開始コドンを含む、キメラ転写産物を生成する。したがって、これらのベクターは、エキソンIで翻訳開始コドンをコードする遺伝子によるタンパク質発現を活性化できる。活性化内在性細胞からタンパク質を十分に生成できる、他のポジティブ/ネガティブ選択ベクターについて以下で述べる。
【0253】
本発明のベクターはどれも、選択マーカー下流の内部リボソームエントリー部位(ires)3’を含むことができる。iresによって、内在性遺伝子にベクターを組込む際に、内在性遺
伝子を翻訳できる。随意に、翻訳開始コドンを、選択マーカーとires配列の間に包含させてもよい。開始コドンが存在する場合、付加コドンがエキソン上に存在することがある。開始コドンは、そして付加コドンが存在する場合は、スプライス供与体部位に対応する任意の、そして一括してすべてのリーディングフレーム内に存在してもよい。さらに翻訳開始コドン下流のコドンは、存在する場合、たとえば単一分泌シグナル、部分シグナル配列、タンパク質(全長タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフ、エピトープ標識など)またはスペーサ領域をコードする。
【0254】
別の好ましい実施形態において、本明細書で述べたどのベクターも選択可能なマーカーの上流に、エキソン領域に動作可能に結合した第2の転写調節配列(最も好ましくはプロモーター)を含み、後に不対スプライス供与体部位が続く。この上流エキソンは、活性化内在性遺伝子からタンパク質を発現する場合に特に有用である。エキソンが翻訳開始コドンを欠失していることがある。あるいはエキソンが翻訳開始コドンを含むことがある。開始コドンが存在する場合、付加コドンがエキソン上に存在することがある。開始コドンは、そして付加コドンが存在する場合は、スプライス供与体部位に対応する任意の、そして一括してすべてのリーディングフレーム内に存在してもよい。さらに翻訳開始コドン下流のコドンは、存在する場合、たとえば単一分泌シグナル、部分シグナル配列、タンパク質(全長タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフ、エピトープ標識など)またはスペーサ領域をコードする。
【0255】
タンパク質−タンパク質相互作用に有用な活性化ベクター
近年、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する一般的手法が述べられている(たとえば米国特許第5,283,173;5,468,614および5,667,973、その開示は引用することによって本明細書に全体が含まれている)。この手法は、DNA結合ドメインをコードする遺伝子フラグメントに隣接し、それを含む枠内の第1cDNA分子のクローニング;および転写トランス活性化ドメインをコードする遺伝子フラグメントに隣接し、それを含む枠内の第2cDNA分子のクローニングに依存する。各キメラ遺伝子は、キメラ遺伝子の上流に配置されたプロモーター領域から発現される。発現を検出するために、両方のキメラ遺伝子をレポーター細胞にトランスフェクションする。(DNA結合および転写活性化ドメインに融合されたクローン化cDNAによってコードされたタンパク質によって)第1のキメラタンパク質が第2のキメラタンパク質と相互作用すると、次にDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインはシングルタンパク質錯体内に結合される。結果として、タンパク質−タンパク質相互作用錯体は、レポーター遺伝子の調節領域に結合し、その発現を活性化できる。
【0256】
この以前の手法の限界は、cDNAとしてクローン化された遺伝子間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出できるのみであることである。本明細書で述べるように、多くの遺伝子はまれな細胞種内で非常に低いレベルにて、あるいは短い発達ウィンドウ中に発現される;したがって、これらの遺伝子は通常、cDNAライブラリーにはない。さらに、多くの遺伝子は大きすぎて全長クローンとして効率よく単離できず、これらの以前の手法を使用するのが困難になる。
【0257】
本発明は、内在性遺伝子またはトランスフェクションされたゲノムDNAからタンパク質発現を活性化できる。以前の手法とは異なり、実質的にどの遺伝子も、その通常の発現パターンとは関係なく、効率よく発現できる。さらに、本発明は内在性遺伝子から(あるいはトランスフェクションされたゲノムDNAから)発現されるタンパク質を修飾することも可能なため、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイで使用するキメラタンパク質を生成することもできる。
【0258】
本発明によってタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、2つのベクターを使用する。第1のベクターは一般にBD/SD(結合ドメイン/スプライス供与体)と呼ばれ、DNA結合領域および不対スプライス供与体部位をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合されるプロモーターを含む。第2のベクターは一般にAD/SD(活性化ドメイン/スプライス供与体)と呼ばれ、転写活性化領域および不対スプライス供与体部位をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合されるプロモーターを含む。異なるリーディングフレームを持つ遺伝子を調整するために、結合ドメインおよび活性化ドメインを、不対スプライス供与体部位に対応する3つの考えられるリーディングフレームのそれぞれでコードできる。さらに、他のベクターについて本明細書で述べるように、BD/SDおよびAD/SDベクターは、選択マーカーおよび増幅可能マーカーを含む、他の機能性要素を持つことも可能である。ベクターは、ベクターが遺伝子を活性化した細胞を選択可能な配置に向けた選択マーカーを含んでいてもよい。マルチプロモーター/活性化エキソンベクターも有用である。BD/SDおよびAD/SDベクターのいくつかの例を図25に示す。これらのベクターを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の検出を示す例は図26に表示した。
【0259】
BD/SDベクターのDNA結合ドメインは、特異性ヌクレオチド配列に結合可能な任意のタンパク質ドメインをコードする。転写活性化タンパク質を用いてDNA結合ドメインを供給すると、転写活性化ドメインはBD/SDベクターから省略される。DNA結合ドメインを用いてタンパク質をコードする遺伝子の例としては、これに限定されるわけではないが、酵母GAL4遺伝子、酵母GCN4遺伝子および酵母ADR1遺伝子が挙げられる。原核および原核供給源による他の遺伝子も、DNA結合ドメインの供給に使用できる。
【0260】
AD/SDベクターの転写活性化ドメインは、リポーター遺伝子のプロモーター領域付近に配置された場合、リポーター遺伝子の転写を向上可能なタンパク質ドメインをコードする。転写活性化タンパク質を用いて転写活性化ドメインを供給すると、DNA結合ドメインはAD/SDベクターから省略される。転写活性化ドメインを用いてタンパク質をコードする遺伝子の例としては、これに限定されるわけではないが、酵母GAL4遺伝子、酵母GCN4遺伝子および酵母ADR1遺伝子が挙げられる。原核および原核供給源による他の遺伝子も、転写活性化ドメインの供給に使用できる。
【0261】
本発明において、タンパク質−タンパク質相互作用は、ゲノムDNAストレッチに配置された遺伝子の発現を活性化するために、上述したように、BD/SDおよびAD/SDベクターを用いて検出される。
【0262】
ある実施形態において、BD/SDベクターはレポーター細胞系のゲノム内にランダムに組込まれる。本発明で述べる他のベクターと同様に、BD/SDベクターは、ベクター組込部位下流に配置された遺伝子からのタンパク質発現を活性化できる。BD/SDベクター上の活性化エキソンはDNA結合ドメインを活性化するため、活性化内在性タンパク質は、N−末端にDNA結合ドメインを含む融合タンパク質として生成される。それゆえ、BD/SDベクターを宿主細胞のゲノムに組込むことにより、融合タンパク質のライブラリーが作成可能となり、このライブラリーでは、各タンパク質はN−末端にDNA結合ドメインを含む。
【0263】
AD/SDベクターをリポーター細胞系のゲノムに組込んで、細胞のライブライリを作成することが可能となり、このライブラリーでは、ライブラリーの各メンバが転写活性化ドメインに融合した異なる内在性遺伝子として発現されることも認識される。
【0264】
BD/SDライブラリーはいったん作成すると、転写活性化ドメインに融合した(以下で遺伝子Xと呼ばれる)特異性遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフェクションできる。これにより、ゲノム内でコードされる細胞は実質的に、遺伝子Xに対する相互作用について試験することができる。同様に、AD/SDライブラリーは、DNA結合ドメインに融合した(以下で遺伝子Xと呼ばれる)特異性遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフェクションできる。これにより、ゲノム内でコードされる細胞は実質的に、遺伝子Xに対する相互作用について試験することができる。BD/SDまたはAD/SDライブラリーの構成前に、特異性遺伝子が宿主細胞内で安定して発現することも認識される。
【0265】
別の実施形態では、ゲノムDNAを、DNA結合ドメインおよび活性化ドメインそれぞれの下流のBD/SDベクターおよび/またはAD/SDベクター内にクローニングする。遺伝子が存在し、ゲノムDNA内で正しく向けられている場合、BD/SDベクター(またはAD/SDベクター)は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに有用な融合タンパク質として遺伝子を発現することができる。in situでのBD/SD(またはAD/SD)ベクターの組込と同様に、以前にcDNA分子として単離されているかどうかにかかわらず、どの遺伝子でも試験できる。
【0266】
別の実施形態では、第1のライブラリーの細胞内で第2のライブラリーを作成する。たとえば、AD/SDベクターは、BD/SDライブライを含む細胞内に組込める。逆に、BD/SDベクターは、AD/SDライブラリーを含む細胞内に組込める。これによって、結合ドメイン融合タンパク質として発現されるすべての活性化ドメインは、すべての活性化ドメイン融合タンパク質に対して試験できる。本発明は原核生物内で実質的にすべてのタンパク質を(結合および活性化ドメインを持つ融合タンパク質として)発現できるが、この手法は、初めての場合は、単一のライブラリーでタンパク質−タンパク質相互作用のすべての組合わせを試験できる。ある生物ですべてのンパク質−タンパク質相互作用を調査するには、ライブラリー内のライブラリーが実質的に包括的でなければならない。たとえば、10,000個の遺伝子を含む生物で50%までのタンパク質−タンパク質相互作用を検出するには、第1のライブラリーは、それぞれ活性化遺伝子を発現する、少なくとも細胞100,000個を含んでいる必要がある。第1のライブラリーの各クローン内で、次に第2のベクターを用いて、それぞれ活性化遺伝子を含む、少なくとも100,000クローンのライブラリーを作成する。したがって、全ライブラリーは100,000クローンx100,000クローン、すなわち全部で1010クローンを含む。このことは、すべての遺伝子が同じ頻度で活性化され、各遺伝子活性化イベントによって、活性化内在性遺伝子を含むフレーム内で融合タンパク質が生成することを前提としている。タンパク質−タンパク質相互作用が50%範囲を超えるライブラリーを作成するため、および/または、より低い頻度で活性化されるタンパク質を示すために、より大きなライブラリーを作成できる。
【0267】
ライブラリー対ライブラリーのスクリーンは複数の方法で作成できることも認識される。第1に、BD/SDおよびAD/SDベクターを同一のレポーター細胞のゲノム内に組込むことによって、両方のライブラリーを同時にまたは連続して作成できる。第2に、第1のライブラリーは、レポーター細胞のゲノム内にBD/SDベクターを組込むことによって作成され、第2のライブラリーは、クローン化ゲノムDNAを含むAD/SDベクターをトランスフェクションすることによって作成される。この手法では、AD/SDライブラリーが最初に作成され、続いて、クローン化ゲノムDNAを含むBD/SDベクターが導入されることが認識される。第1のライブラリーはクローン化ゲノムDNAを含むBD/SDベクター(またはAD/SDベクター)をトランスフェクションし、続いて第2のベクターをレポーター細胞ゲノムに組込むことに作成可能であることも認識される。第3に、それぞれクローン化ゲノムフラグメントを含むBD/SDおよびAD/SDベクターを用いて細胞をトランスフェクションすることによって、両方のライブラリーを同時にまたは連続して作成できる。第4に、クローン化ゲノムフラグメントをBD/SDベクターまたはAD/SDベクターのどちらかで使用する場合、cDNAライブラリーがもう一方のベクター内に作成され、細胞内に導入されることが認識される。これにより、cDNAライブラリーに存在するすべての遺伝子を、ゲノム内の他のすべての遺伝子との相互作用について検査することができる。
【0268】
ライブラリー/ライブラリースクリーンには、細胞の大規模なライブラリーの作成を含むため、遺伝子の活性化およびライブラリーのメンバ間の枠内融合タンパク質生成の頻度を最大限にすることが重要である。これは、少なくとも2つの方法で実現できる。第1にBD/SDおよびAD/SDベクターは、遺伝子を「トラップ」する配置内に選択トラップベクターを含むことができる。選択トラップベクターの例は、図8、9、10、17、19、21および25に示す。これらのベクターは、活性化ベクターが転写により活性化した細胞のために選択する。第2に、複数のプロモーター/活性化エキソンユニットをBD/SDおよびAD/SDベクターに包含させることができる。各プロモーター/活性化エキソンユニットは、不対スプライス供与対部位に対応する異なるリーディングフレーム内の結合ドメイン(または活性化ドメイン)をコードする。マルチプロモーター/エキソンベクターの例は図23に示す。この種のベクターによって、転写レベルで活性化される遺伝子はどれでも、ベクター上のプロモーター/活性化エキソンの1つから枠内融合タンパク質として生成されるようになる。第3に、ベクターは、効率のよいトランスフェクション手順を用いて、レポーター細胞内に導入できる。この点では、レトロウイルス組込によるBD/SDおよびAD/SDベクターの挿入が有利である。
【0269】
本発明で有用なレポーター細胞は、BD/SDおよびAD/SDベクターによって生成された転写産物を正しくスプライスできる細胞すべてを含む。該レポーター細胞は、BD/SDおよびAD/SDベクターによって発現されたタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用の存在下で、より高いレベルにて発現するレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、本明細書で述べる任意のマーカーのような、選択可能なマーカーでもよい。あるいは、レポーター遺伝子はスクリーニング可能なマーカーでもよい。有用な選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカーの例は、本明細書で述べる。
【0270】
レポーター細胞において、最小プロモーターはレポーター遺伝子に動作可能に結合される。タンパク質−タンパク質相互作用の存在下でレポーター遺伝子の発現を向上させるために、DNA結合部位がBD/SDベクターのDNA結合ドメイン領域によってコードされるタンパク質に認識されるように、DNA結合部位を最小プロモーターの中または付近に配置する。タンパク質−タンパク質相互作用がない場合、BD/SDより生成されたDNA結合ドメイン融合タンパク質は転写活性化ドメインを欠失しているため、レポーター遺伝子の最小プロモーターから転写を活性化することができない。しかし、BD/SDより生成されたDNA結合ドメイン融合タンパク質がAD/SDベクターから生成された活性化ドメイン融合タンパク質と相互作用すると、タンパク質錯体がレポーター遺伝子の発現を活性化できる。レポーター遺伝子の発現の向上は、スクリーニング可能マーカーに関するアッセイを用いて、あるいは選択マーカーの薬剤選択を用いて検出できる。
他のレポーター系を本発明と併せて用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を検出可能なことも認識されている。特に、2つの分離可能なドメインを含んでおり、各ドメインが相互に近接して生化学または構造活性を生じるタンパク質を、本発明と併せて用いることができる。
【0271】
マルチプロモーター/活性化エキソンベクター
未知の遺伝子からタンパク質発現を活性化するを目標とする、非標的遺伝子活性化の用途では、通常、ベクターの集合を使用しなければならない。したがって、別の実施形態において、本発明は1つ以上のプロモーター/活性化エキソンユニットを含むベクターを提供する(図20A−20E)。
【0272】
真核細胞のゲノムに存在する各種遺伝子構造を調整するために、本発明の本態様によるベクターは、異なる構造を持つ活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列(たとえばプロモーター)を含むことが望ましい。これらの活性化エキソンは全体として、実質的にすべて内在性遺伝子からタンパク質発現を活性化することができる。たとえば、エキソンII(あるいはエキソンIIの下流のエキソン)の翻訳開始コドンをコードする遺伝子からタンパク質発現を活性化するために、あるベクターは、翻訳開始コドンを欠失した活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列(たとえばプロモーター)を含むことができる。エキソンIの翻訳開始コドンをコードするあらゆる種類の遺伝子からタンパク質発現を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列(たとえばプロモーター)をそれぞれ含む、3つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内で開始コドンをコードする。別の活性化エキソン配置も有用である。たとえば、エキソンIのシグナル分泌配列の一部をコードする遺伝子からタンパク質発現および分泌を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列(たとえばプロモーター)をそれぞれ含む、3つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内で部分シグナル配列をコードする。エキソンIのシグナル配列全体をコードする遺伝子からタンパク質発現および分泌を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列(たとえばプロモーター)をそれぞれ含む、3つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内にシグナル分泌配列全体を含む。分泌タンパク質をコードする遺伝子発現を活性化することに加えて、シグナル配列全体をコードするプロモーター/活性化エキソンは、通常は分泌されないタンパク質の発現および分泌も活性化する。これはたとえば、通常細胞内に局在化されているタンパク質のタンパク質精製を促進できる。
【0273】
他の有用なコード配列は、これに限定されるわけではないが、配列コードタンパク質(全長タンパク質、タンパク質の一部、タンパク質モチーフおよび/またはエピトープ標識を含む)を含めて、本発明の本態様によるベクターのエキソン活性化に包含させることができる。本明細書で述べるように、本発明の本態様にベクターは個別または一括して、宿主細胞ゲノムに組込んで、細胞のライブラリーを作成することができる。ライブラリーの各メンバは、異なる内在性タンパク質を潜在的に過剰発現する。それゆえ、ベクターのこれらの集合によって、真核宿主細胞内の内在性遺伝子すべて、あるいは実質的にすべてを活性化することが可能となる。
【0274】
上述したように、ベクターの集合を宿主細胞内に組込む場合、タンパク質発現の活性化は実質的にどの細胞からでも行える。あいにく、すべての内在性遺伝子からタンパク質を生成するために、非常に多数のライブラリーメンバを生成しなければならない。これはひとつには、宿主細胞によってコードされる遺伝子の数が多いことである。さらに、これらの手法を用いると、多くの細胞は内在性遺伝子の中または付近に組込まれたベクターを含む;しかし組込まれたベクターは、内在性遺伝子からの活性化タンパク質発現とは適合しない構造を持つ活性化エキソンを含む。たとえば、ベクターエキソンは(スプライス結合に対応する)リーディングフレーム1内で開始コドンをコードできるが、組込ベクター下流の第1エキソンによってコードされたタンパク質は(スプライス結合に対応する)リーディングフレーム2内にある。したがって、多くのライブラリーメンバは、内在性遺伝子の転写を活性化したが、内在性遺伝子によってコードされたタンパク質を生成できなかった組込ベクターを含む。
【0275】
内在性遺伝子内または付近へのベクター組込の後、タンパク質発現を活性化できない細胞の数を減少させるために、複数のプロモーター/活性化エキソンを含むベクターを使用できる。このベクターでは、各プロモーター/活性化エキソンユニットは、異なる構造の内在性遺伝子からの発現を活性化できる。複数の活性化エキソンを含む単一のベクターは、それぞれ異なる活性化エキソンを含む複数の転写産物を生成できるため、遺伝子内または付近に組込まれた単一のベクターは内在性遺伝子の構造とは関係なく、タンパク質発現を活性化できる(図21)。
【0276】
マルチプロモーター/活性化エキソンベクターは、2個以上のプロモーター/活性化エキソンを含むことができる。各プロモーター/活性化エキソンユニットには、不対スプライス供与対部位が続くことがある。そのような1つの実施形態において、2個のプロモーター/活性化エキソンがベクターに含まれ、各プロモーター/活性化エキソンは、異なる種類の内在性遺伝子からのタンパク質発現を活性化することができる。好ましい実施形態において、ベクターは3個のプロモーター/活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内で翻訳開始コドンをコードする。他の好ましい実施形態において、ベクターは3個のプロモーター/活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内で部分のシグナル分泌配列をコードする。さらに他の好ましい実施形態において、ベクターは3個のプロモーター/活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内でシグナル分泌配列全体をコードする。別の実施形態は、第4のプロモーター/活性化エキソンを含む上の各ベクターを含み、第4の活性化エキソンは、翻訳開始コドンをコードしない。
【0277】
ベクターは、任意の数(たとえば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上など)のプロモーター/活性化エキソンユニットを含んでいてもよい。複数のプロモーター/活性化エキソンが単一のベクターに存在する場合、それらは相互に対応する同一の方向に向けられていることが好ましい(すなわち、プロモーターは同一奉公に発現を引き起こす)。
【0278】
異なる活性化エキソンの転写を起こすプロモーターは、相互に同一であるか、1個以上のプロモーターが異なる場合がある。プロモーターはウイルス性、細胞性または合成でもよい。プロモーターは構造的でも、誘導性でもよい。当業者に認識可能であるか、本明細書で述べられているように、他の種類のプロモーターおよび調節配列も本発明の本態様に従って、ベクターの調製に使用してもよい。
【0279】
複数のプロモーター/活性化エキソンユニットを含むベクターはどれも、随意に1個以上の選択マーカーおよび/または増幅可能マーカーを含んでもよい。選択可能および/または増幅可能マーカーは、ポリ(A)シグナルを含んでもよい。あるいは、マーカーがポリ(A)シグナルを欠失していてもよい。選択マーカーは、ポジティブまたはネガティブ選択マーカーでもよい。選択マーカーはマーカーの上流、内部または下流に、不対スプライス供与対部位を含んでいてもよい。または、選択マーカー不対スプライス供与対部位を欠失していてもよい。選択マーカーおよび/または増幅可能マーカーは、存在している場合、プロモーター/活性化エキソンユニットの上流、内部または下流に配置できる。選択可能および/または増幅可能マーカーはベクトル上に、プロモーター/活性化エキソンユニットに対応する任意の方向に配置できる。選択マーカーの目的が内在性遺伝子を捕捉することである場合、選択マーカーがプロモーター/活性化エキソンと同一方向に向いていることが好ましい。
【0280】
増幅可能マーカー
本明細書で述べるどのマーカーも随意に、1個以上(たとえば、2、3、4、5またはそれ以上)の増幅可能マーカーを含んでいてもよい。増幅可能マーカーの例は、上で詳細に述べたものを含む。増幅可能マーカーは、ポジティブ/ネガティブ選択マーカーの上流に配置することが好ましい。ポリアデニル化トラップベクターを使用する場合、組込前のベクターコンカテマー化に由来するベクターコードポリ(A)シグナルを捕捉する可能性を除去するために、増幅可能マーカーにポリアデニル化シグナルを省略することが有利である。
【0281】
増幅可能マーカーは存在する場合、活性化転写調節配列(すなわち内在性遺伝子によるベクターからの転写を指示するプロモーター)の上流に配置される。増幅可能マーカーは、ベクター上にどの方向で存在してもよい(すなわちリーディングフレームがどちらのDNA鎖上にあってもよい)。
【0282】
増幅可能マーカーも、ポジティブ選択マーカーと同じ遺伝子である。ポジティブ選択マーカーおよび増幅可能マーカーの両方として使用可能な遺伝子の例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナーゼ(ada)、ジヒドロオトターゼ、グルタミンシンターゼ(GS)、カルバミルホスフェートシンターゼ(CAD)が挙げられる。
【0283】
一部の実施形態において、そしてある用途では、ベクターに複数の増幅可能マーカーを配置することが望ましい。1個以上の増幅可能マーカーを使用すると、各増幅可能マーカーの二重選択、あるいは連続選択が可能となる。これによって、興味のある遺伝子を含め、ベクターおよびフランキングゲノム座位を増幅した細胞の単離が促進される。
【0284】
プロモーター
選択マーカー、増幅可能マーカー(存在する場合)および/または内在性遺伝子を発現させるために、任意のプロモーターおよび調節要素がこれらの活性化ベクター上で使用できることは理解される。別の好ましい実施形態において、内在性遺伝子を発現させるプロモーターは強いプロモーターである。CMV即時型遺伝子プロモーター、SV40 T抗原プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターは、この種のプロモーターの例である。別の好ましい実施形態において、誘導性プロモーターを用いて内在性遺伝子を発現させる。これによって内在性タンパク質を、さらに制御された方法で発現させることができる。テトラサイクリン誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、ectdysoneプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターは、この種のプロモーターの例である。さらに別の実施形態において組織特異性プロモーターを用いて内在性遺伝子を発現させる。組織特異性プロモーターの例としては、これに限定されるわけではないが、免疫グロブリンプロモーター、カゼインプロモーター、および成長ホルモンプロモーターである。
【0285】
制限部位
本発明のベクターは、ベクター内の不対スプライス供与対部位の下流に位置する1個以上の制限部位を含むことができる。これらの制限部位を用いて、トランスフェクションの前にプラスミドベクターを直線化することができる。直線配置では、活性化ベクターは転写鎖に対応する5’
から3’に、プロモーター、スプライス供与対部位および直線化部位を含む。
【0286】
制限部位も、ベクターイントロン含有cDNA分子の除去を促進するために、ベクターイントロンに含まれる。本態様において、ベクターは転写鎖に対応する5’から3’に、プロモーター
、スプライス供与対部位、制限部位および直線化部位を含む。不対スプライス供与対部位および直線化部位の間に制限部位を包含させることによって、スプライスされていない転写産物は、cDNAを適切な制限酵素で消化することによって除去できる。遺伝子活性化に由来するcDNA分子は、制限部位を含むベクターイントロンを除去したため、消化されない。これにより、増幅/クローニングの間に遺伝子活性化転写産物を優先的に濃縮し、内在性遺伝子の同定および分析を著しく促進することができる。
【0287】
制限部位は、活性化遺伝子のクローニングを促進するために、ベクターエキソンにも包含されることがある。遺伝子活性化に続いて、mRNAは細胞から回収され、cDNAへ合成される。cDNAをベクターエキソンに切り込む制限酵素によって消化すると、遺伝子活性化cDNA分子は、次に適切なベクターにクローニングを行うために、5’末端に適切なオーバーハングを含
む。これによりcDNA分子を活性化した遺伝子の単離が促進される。
【0288】
1つの実施形態において、ベクターエキソンに配置された制限部位は、ベクターイントロンに配置された制限部位とは異なる。これにより、転写産物を含むベクターイントロンによる消化されたcDNAフラグメントは消化されて、クローニングベクターと適合しないオーバーハングを持つため(以下参照)、ベクターイントロンを含むcDNA分子の除去が促進される。あるいは、同じ酵素によって認識された変性制限部位は、ベクターエキソンおよびイントロン内に配置される。これらの部位を開裂する酵素は、複数の部位、認識配列内に奇数の塩基を持つ部位、中断されたパリンドロームを持つ部位、非パリンドローム配列、または1個以上の変性塩基を持つ部位を開裂することができる。言い換えれば、酵素が、ベクターイントロン内で生成されたオーバーハングとは異なる、ベクターエキソン内のオーバーハングを生成する場合、同一の制限エンドヌクレアーゼ制限部位によって認識される制限部位を使用してもよい。異なるオーバーハングが生成されるため、ベクターエキソンオーバーハングに適合する、およびベクターイントロンオーバーハングに適合しない部位を含むクローニングベクターを用いて、cDNA分子を含むベクターエキソンおよびcDNA分子を欠失したベクターイントロンを優先的にクローニングすることができる。有用な変性制限部位の例としては、Sfi I、Acci、Afl III、SapI、Ple I、Tsp45 I、ScrF I、Tse I、PpuM I、Rsr II、SgrA Iによって認識されたDNA配列を含む。
【0289】
ベクターイントロンおよび/またはエキソンに配置された制限部位は、まれな制限部位(たとえば8bpの制限部位)または非常にまれな部位(たとえばヌクレアーゼをコードしたイントロンに認識された部位)でもよい。8bp認識部位を持つ制限酵素の例としては、NotI、SfiI、PacI、AscI、FseI、PmeI、SgfI、SrfI、SbfI、Sse、8387 I、SwaIが挙げられる。制限酵素をコードするイントロンの例としては、I−PpoI、I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−TliIが挙げられる。あるいは、8bp未満の制限部位をベクター上に配置することもできる。たとえば、7bp、6bp、5bp、4bpより成る制限部位を使用できる。一般にさらに小さい制限認識部位を使用すると、全長遺伝子より短いクローニングが行われる。ハイブリタイゼーションプローブの作成などの場合では、小さいcDNAクローンの単離のほうが有利なことがある。
【0290】
双方向活性化ベクター
本明細書で述べる活性化ベクターは双方向でもよい。ベクター上に活性化転写調節配列が1個存在する場合、ベクターが適切な位置(たとえば遺伝子の上流)に、正しい方向で組込まれた場合のみに、遺伝子活性化が生じる。すなわち、内在性遺伝子を活性化するために、活性化作成物上のプロモーターは、コード鎖の転写を可能にする内在性遺伝子に面している必要がある。この方向性の要求事項の結果として、座位への組込イベントの半分のみによって、内在性遺伝子の転写活性化が生じる。組込イベントの残りの半分によって、興味のある遺伝子から離れてベクター転写が生じる。したがって、遺伝子活性化頻度を2倍にするために、本発明は、ベクターが宿主細胞ゲノムに組込まれる方向とは無関係に、内在性遺伝子の活性化に使用できる双方向ベクターを提供する。
【0291】
本発明の本態様による双方向ベクターは、(これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサ、リプロセッサを含む、任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである)2個の転写調節配列、2個のスプライス供与体部位、1個の直線化部位を含むことが望ましい。スプライス供与対部位が有用な場合、各転写調節配列は独立したスプライス供与体部位に動作可能に結合され、転写調節配列/スプライス供与体対は、相互に逆向きであってもよい(すなわち、第1の転写調節配列は、第2の転写調節配列が宿主ゲノム細胞に組込まれた方向に対して反対の方向で宿主細胞ゲノムに組込んでもよい)。2個の対立する転写調節配列/スプライス供与体対は、直線化部位によって分離することができる。直線化部位の機能は、転写調節配列/スプライス供与体部位の間に(すなわち、内在性遺伝子の活性化に適した位置に)遊離DNA末端を生成することである。本発明の双方向ベクターの例を、図11A−11Cに示す。
【0292】
2個の対立する転写調節配列は、同一の転写調節配列でも、異なる転写調節配列でもよい。随意に、転写開始コドン(たとえばATG)および1個以上の付加コドンを、片方または両方のベクターコードエキソンに包含させてもよい。翻訳開始コドンが存在する場合、片方または両方のベクターコードエキソンは、タンパク質、タンパク質の部分、シグナル分泌配列、シグナル分泌配列の部分、タンパク質モチーフまたはエピトープ標識をコードできる。あるいは、片方または両方のベクターコードエキソンが翻訳開始コドンを欠失していることがある。
本発明の本態様による双方向ベクターは随意に、本明細書で詳細に述べる選択マーカーおよび増幅可能マーカーを含む、1個以上の選択マーカーまたは1個以上の増幅可能マーカーを含んでいてもよい。双方向ベクターは上述したように、ポリ(A)トラップ、スプライス受容体トラップ、二重ポリ(A)/スプライス受容体トラップとして構成してもよい。単方向ベクターについて述べた他のベクター配置も、双方向ベクターに包含させてもよい。
【0293】
非標的活性化ベクターを用いたゲノムDNAの共トランスフェクション
本明細書で述べるどのベクターも、真核宿主細胞内へのトランスフェクション前に、ゲノムDNA内に組込まれるか、そうでなければ結合されることが可能であることが認識されている。これにより、遺伝子の通常の発現特性とは無関係に、ゲノム内の実質的にどのゲノムからも高レベルの発現が可能となる。したがって、本発明のベクターは、単離ゲノムDNAフラグメントによりコードされた遺伝子からの発現を活性化するのに使用できる。これを実施するために、ベクターを、少なくとも1個の遺伝子、または遺伝子の部分を含むゲノムDNA内に組込むか、結合させる。一般に活性化ベクターは、遺伝子発現を活性化させるために、遺伝子内か、遺伝子の上流に配置しなければならない。いったん挿入すると(または結合させると)、ベクター/ゲノムDNAを適切な真核宿主細胞に導入することによって、下流の遺伝子が(転写産物またはタンパク質として)発現される。宿主細胞への導入の後、ベクターコードプロモーターは単離DNA内でコードした遺伝子によって発言を行い、スプライシングの後に成熟したmRNA分子を生成する。このプロセスは適切な活性化ベクターを用いて、トランスフェクションされたゲノムDNAによってコードされたどの遺伝子からでもタンパク質を発現させることができる。さらに、本明細書で述べる方法を用いて、トランスフェクションされたゲノムDNAによってコードされた遺伝子に対応するcDNA分子が生成および単離される。
【0294】
活性化遺伝子を安定に発現されるために、トランスフェクション活性化ベクター/ゲノムDNAを宿主細胞ゲノムに組込むことができる。あるいは、トランスフェクション活性化ベクター/ゲノムDNAを安定したエピソームとして維持することができる(たとえば、ウイルス由来の複製および/または核維持機能を用いて−下を参照)。また別の実施形態において、活性化遺伝子はたとえばプラスミドから、過渡的に発現される。
【0295】
本明細書で使用するように、「ゲノムDNA」という用語は、細胞によるスプライスされていない遺伝子物質を指す。スプライシングとは、転写後に遺伝子からイントロンを除去するプロセスを指す。それゆえゲノムDNAは、mRNAおよびcDNAとは対照的に、エキソンとイントロンをスプライスされていない形で含む。本発明では、大半の真核細胞がエキソンおよびイントロンを含んでおり、本発明の多くのベクターが、第1の下流エキソンへのスプライシングと、介在性イントロンの除去によって、ゲノムDNA内でコードされた遺伝子を活性化するように設計されているため、真核細胞由来のゲノムDNAは特に有用である。
【0296】
本発明で有用なゲノムDNAは、当分野で周知のどの方法によっても単離できる。高分子量ゲノムDNAおよび超高分子量ゲノムDNA(非損傷およびアガロースプラグ内に収納)を単離する方法の多くが述べられている(Sambrookら、「分子クローニング(Molecular Cloning)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。加えて、各種サイズのゲノムDNAを単離するための市販キットも入手できる(Gibco/BRL,Stratagene,Clontechなど)。
本発明で使用するゲノムDNAは、生物のゲノム全体を含んでもよい。または、ゲノムDNAは、生物によるゲノム全体の一部のみを含んでいてもよい。たとえば、ゲノムDNAは複数の染色体、1個の染色体、染色体の一部、遺伝子座、1個の遺伝子、遺伝子の部分を含んでもよい。
【0297】
本発明で有用なゲノムDNAは、宿主細胞への導入前には実質的に非損傷(すなわち断片化されていない)である。または、ゲノムDNAは、宿主細胞への導入前に断片化されてもよい。これは、たとえば、機械的剪断、ヌクレアーゼ処理、化学処理、照射、または当分野で周知の他の方法によって実施できる。ゲノムDNAが断片化されると、望ましいサイズのDNAフラグメントを生成するために断片化条件を調整できる。通常は、DNAフラグメントは、少なくとも1個の遺伝子、または遺伝子の部分(たとえば少なくとも1個のエキソン)を包含できるのに十分な大きさである必要がある。ゲノムDNAは、事前クローニングを行わずに、適切な真核宿主細胞に直接導入してもよい。または、ゲノムDNA(またはゲノムDNAフラグメント)は、トランスフェクションの前にベクター内にクローニングしてもよい。有用なベクターとしては、これに限定されるわけではないが、高および中間複写数のプラスミド(たとえばpUC、pBluescript、pACYC184、pBR322など)、コスミド、細菌性人工染色体(BACs)、酵母人工染色体(YACs)、P1人工染色体(PACs)、およびファージ(たとえばラムダ、M13など)が含まれる。当分野で周知の他のクローニングベクターも使用できる。ゲノムDNAをクローニングベクター内にクローニングした場合、特異性クローン化DNA断片を単離し、本発明で使用してもよい。たとえば、YAC、BAC、PACまたはコスミドライブラリーは、特異性染色体領域にマップするクローンを同定するために、ハイブリダイゼーションによってスクリーニングできる。随意に、いったん単離すれば、これらクローンは配列され、興味のある染色体領域を通じてコンティグを生成できる。このコンティグ内に存在する遺伝子のcDNAコピーを迅速に単離するために、これらのゲノムクローンは、宿主細胞内への活性化ベクターによって、別個に、または一括してトランスフェクションしてもよい。次に、ベクターコードエキソンを含み、ベクターコードイントロンを欠失しているcDNAを単離し、分析できる。したがって、コンティグ内に存在するすべての遺伝子はcDNAクローンとして迅速に単離可能であるため、この手法は位置的なクローニング手法の速度を著しく向上させる。
【0298】
当業者が認識した誘導体を含め、本明細書で述べる活性化ベクターは、ゲノムDNAとともに共トランスフェクションしてもよく、そのため本発明で有用である。ベクターはその最も簡単な形で、不対スプライス供与体部位を従えたエキソンに、動作可能に結合したプロモーターを含むことができる。他の有能なベクターの例としては、これに限定されるわけではないが、ポリAトラップベクター(たとえば図8、9、11C、12Fおよび17に示したベクター)、二重ポリ(A)トラップ/スプライス受容体トラップベクター(たとえば図9、10、12G、19および21に示したベクター)、双方向ベクター(たとえば図11に示したベクター)、シングルエキソントラップベクター(たとえば図19に示したベクター)、マルチプロモーター/活性化エキソンベクター(たとえば図23に示したベクター)、活性化遺伝子に対応するcDNAを単離するためのベクター、および活性化遺伝子からタンパク質発現を活性化するためのベクター(たとえば図2、3、4、8B−F、9B−C、9E−F、10B−C、10E−F、11、12、17B−G、23)が挙げられる。
【0299】
活性化ベクターは、ウイルス起源の複製を含んでいてもよい。ウイルス起源の複製が存在すると、ゲノムフラグメントを含むベクターが宿主細胞内でエピソームとして伝播される。有用なウイルス起源の複製の例には、oriP(EBウイルス)、SV40 ori、BPV oriおよびワクチンoriが含まれる。これらの起源による複製を促進するために、適切なウイルス複製タンパク質をベクターから発現させる。たとえば、ベクターを含むEBV ori PおよびSVo40riもEBNA−1またはT抗原をそれぞれコードおよび発現させることができる。あるいは、ベクターを、すでにウイルス複製タンパク質(たとえばEBNA−1またはT抗原)を発現している細胞内に導入してもよい。EBNA−1またはT抗原を発現する細胞の例としてはそれぞれ、EBNA−1発現ユニットによってトランスフェクションされたヒト293細胞(Clontech)およびCOS−7細胞(American Type Culture Collection;ATTC No.CRL−1651)が挙げられる。
【0300】
活性化ベクターは増幅可能マーカーを含んでいてもよい。このことにより、エピソームか、宿主細胞ゲノム内に組込まれている、ベクターおよびフランキングゲノムDNAの増加性複製を含む細胞を単離することができる。ベクターおよびフランキングゲノムDNAの増加性複製を含む細胞は、より高いレベルで活性化遺伝子を発現し、遺伝子単離およびタンパク質生成を促進する。
【0301】
活性化ベクターおよびゲノムDNAを、ベクターコードスプライス供与体部位からゲノムDNAによってコードされたスプライス受容体部位へのスプライシングが可能な任意の宿主細胞に導入してもよい。好ましい実施形態において、ゲノムDNA/活性化ベクターは、ゲノムDNAが単離された細胞と同一の種による宿主細胞内にトランスフェクションされる。しかしある例では、ゲノムDNAが単離された細胞とは異なる種による宿主細胞に、ゲノムDNAをトランスフェクションすることは有利である。たとえば、ある種によるゲノムDNAを第2の種の宿主細胞にトランスフェクションすると、ハイブリダイゼーション技術を用いた、トランスフェクションされたゲノムDNA中で活性化する遺伝子の分析が行いやすくなる。トランスフェクションされたDNAによってコードされた活性化遺伝子は、高度な厳密性ハイブリダイゼーションに基づいて、宿主細胞に由来する遺伝子から区別することができる。ある種のゲノムDNAを別の種による宿主細胞にトランスフェクションすることを用いると、非相同性細胞内でタンパク質を生成することも可能である。これにより、成長、タンパク質修飾または製造上の利点をもたらす非相同性タンパク質内で、タンパク質を生成することができる。
【0302】
活性化ベクターは、ゲノムDNAとともに宿主細胞内に共トランスフェクションしてもよく、その場合、ベクターは細胞への導入前にゲノムDNAに結合しない。本実施形態において、ゲノムDNAはトランスフェクションプロセス間に断片化されるため、遊離DNA末端が生成される。これらのDNA末端は、細胞のDNA修復機構によって、共形質導入された活性化ベクターに結合されるようになる。活性化ベクターへの結合の後、ゲノムDNAおよび活性化ベクターは、非相同性組換プロセスによって宿主細胞ゲノムに組込むことができる。このプロセスの間にベクターが、トランスフェクションされたゲノムDNAによってコードされた遺伝子に結合されるようになると、ベクターはその発現を活性化する。
【0303】
または、非標的活性化ベクターは、トランスフェクションの前にゲノムDNAに物理的に結合されることもある。好ましい実施形態において、ゲノムDNAフラグメントはトランスフェクションの前にベクターに結合される。これによって、ゲノムDNAによってコードされる遺伝子にベクターが動作可能に結合される確率が最大となり、相同性ゲノムDNAを含まない宿主細胞ゲノム内にベクターが組込まれる確率が最小となるため、有利である。
【0304】
関連する実施形態において、ゲノムDNAは活性化エキソン下流の活性化ベクター内にクローン化される。この実施形態において、大規模なゲノムフラグメントのクローニングは、大規模なゲノムフラグメントを調整することのできるベクター内で促進することができる。したがって、活性化ベクターはBACs、YACs、PACs、コスミドまたはゲノムDNAの大規模なフラグメントを伝播できる同様のベクター内に構成される。
【0305】
活性化ベクターをゲノムDNAに結合する別の方法に、転位がある。本実施形態において、活性化ベクターは、細胞へのトランスフェクション前の転位またはレトロウイルス組込反応によって、ゲノムDNA内に生みこまれる。したがって、活性化ベクターは、転位および/またはレトロウイルス組込を促進するのに必要なcis配列を含むことができる。トランスポンシグナルを含むベクターの例は図27に示す;しかし、本明細書で述べるベクターがトランスポンシグナルを含んでもよいことは認識されている。
【0306】
ゲノムDNAに異質配列を挿入できる転位系はどれでも、本発明で使用できる。さらに、反転および欠失を促進できるトランスポンも、本発明を実施するのに使用できる。欠失および反転系は活性化ベクターをゲノムDNAに組込まないが、ゲノムDNAが活性化ベクター内にクローン化される場合に、活性化ベクターによって、クローン化ゲノムDNAに対応する位置を変化できるようにする。そのため、活性化ベクターを(組込、反転または欠失によって)ゲノムフラグメントの内部、または外部の複数の位置にシャッフリングすることによって、所与のゲノムフラグメント内の複数の遺伝子を活性化することができる。本発明に有用な転位系の例は、これに限定されるわけではないが、δγ、Tn3、Tn5、Tn7、Tn9、Tn10、Ty、レトロウイルス組込およびレトロトランスポン(Bergら、「移動性DNA(Mobile DNA)」,ASM Press,Washington DC,pp.879−925(1989);Strathmanら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 88:1247(1991);Bergら、Gene 113:9(1992);Liuら、Nucl.Acids Res.15:9461(1987);Martinら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:8398(1995);Phadinsら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 86:5908(1989);Tomcsanyiら、J.Bacteriol.172:6348(1990);Wayら、Gene 32:369(1984);Baintonら、Cell 65:805(1991);Ahmedら、J.Mol.Biol.178:941(1984);Benjaminら、Cell 59:373(1991);Brownら、Cell 49:347(1987);Eichingerら、Cell 54:955(1988);Eichingerら、Genes Dev.4:324(1990);Braitermanら、Mol Cell Biol.14:5719(1994);Braitermanら、Mol Cell Biol.14:5731(1994);Yorkら、Nucl.Acids Res.26:1927(1998);Devineら、Nucl.Acids Res.18:3765(1994);Goryshinら、J.Biol.Chem.273:7367(1998))が挙げられる。
【0307】
活性化ベクターは、転位を使用して、どの形のゲノムDNAにも組込める。たとえば、活性化ベクターは、非損傷または断片化ゲノムDNAのどちらにも組込める。または、活性化ベクターはゲノムDNAのクローン化フラグメントに組込める(図28)。本実施形態において、ゲノムDNAは、高および中間複製数プラスミド(たとえば、pUC、pBluescript、pACYC184、pBR322など)、コスミド、細菌性人工染色体(BACs)、酵母人工染色体(YACs)、P1人工染色体(PACs)およびファージ(たとえばラムダ、M13など)を含め、どのクローニングベクターにも存在する。当分野で周知の他のクローニングベクターも使用できる。上述したように、特異性遺伝子座によるゲノムフラグメントを単離して、活性化ベクター組込の基質として使用してもよい。
【0308】
活性化ベクターの組込後、ゲノムDNAは活性化遺伝子発現に適した宿主細胞に直接導入してもよい。あるいは、ゲノムDNAを中間宿主細胞内に導入し、伝播させてもよい。たとえば、活性化ベクターをBACゲノムライブラリー内に組込んだ後、BACライブラリーはE.コリに形質転換できる。これによって、活性化ベクター内に存在する抗体耐性マーカーを選択することによって、トランスポンを含むプラスミドを濃縮することができる。結果として、組込活性化ベクターを欠失したBACプラスミドは、抗体選択によって除去される。
【0309】
転位仲介活性化ベクター統合は、精製した酵素を用いてインビトロで起こる。あるいは、転位反応はインビボで起こる。たとえば転位は、ベクター内にトランスポンを含むか、ゲノム内に組込複製としてトランスポンを含む供与体菌株を用いて、細菌内で実施してもよい。興味のある標的は、組込を受容するトランスポーザ宿主内に導入される。次に、挿入を保持する標的を遺伝子選択によって宿主から回収する。同様に、酵母、食物、昆虫または哺乳類細胞などの真核宿主細胞を用いて、活性化ベクターをゲノムDNAのフラグメント内にトランスポン仲介によって組込むことができる。
【0310】
活性化内在性遺伝子からのmRNAおよびcDNAの単離
他の実施形態において、本発明は、本発明のベクターを用いて活性化された遺伝子、特に真核細胞のゲノム内に含まれた遺伝子を単離する方法を目的としている。これらの方法は、本発明の非標的遺伝子活性化ベクターを用いて精製されたmRNA分子の構造を利用する。本明細書で述べる本発明の方法によって、実質的にどの活性化遺伝子でも、以前単離およびキャラクタリゼーションされたかどうかにかかわらず、および生理活性が基地であるかどうかにかかわらず、単離することができる。このことは、本発明の組込ベクターより生成されるキメラ転写産物の特性により可能である。本明細書で述べる方法を用いて、活性化ベクターを細胞のゲノム内に組込むことができる。しかし一般に、活性化ベクターは多くの細胞のゲノムに組込まれて、独自の組込イベントのライブラリーを生成する。ライブラリーの各メンバは、独自の組込部位に配置されたベクターを含む、活性化された内在性遺伝子を潜在的に含む。遺伝子活性化は、活性化ベクターが内在性遺伝子の3’−最大エキソンの上流に、ベクターからの転写によって内在性遺伝子によっ
て進行させることが可能な方向で組込まれた場合に行われる。組込部位は、内在性遺伝子のイントロンまたはエキソン内であるか、遺伝子の転写開始部位の上流であってもよい。組込の後、活性化作成物は、活性化ベクターによってコードされるエキソンから内在性遺伝子によってコードされるエキソンまでのすプライシングが可能な転写産物を生成するように設計される。結果として、内在性遺伝子によるエキソンに結合されたベクターエキソンを含むキメラメッセージが生成され、そこではベクター組込部位の下流に位置する領域から内在性エキソンが得られる。このキメラ転写三部tの構造は、遺伝子発見目的には利用できない。たとえば、キメラ転写産物は、(遺伝子の全長cDNAまたはゲノム複写を単離するために、または遺伝子をキャラクタリゼーションするために)プローブとして使用するために、または直接配列決定および/またはキャラクタリゼーションのために迅速に単離できる。
【0311】
ベクター挿入によって活性化されたキメラ転写産物を単離するために、cDNAは活性化イベントを含むライブラリーメンバから生成される。手順のスループットを向上させるために、キメラ転写産物をライブラリーメンバのプールから単離することも可能である。次に、cDNAを、活性化細胞から収穫したmRNAから生成できる。あるいは、RNA全体を用いて、cDNAを生成する。どちらの場合でも、第1の鎖合成はオリゴdTプライマー、オリゴdT/ポリ(A)シグナルプライマー、またはランダムプライマーを用いて実施できる。cDNA生成物のクローニングを促進するために、ポリdTベースの5’−プライマーX(dT)1−100−3’という構
造のプライマーを使用できる。オリゴdT/ポリ(A)シグナルプライマーは、5’−(dT)
10−30−プライマーX−N0−6−TTTATT−3’という構造を取りうる。ランダムプライマ
ーは、5’−(プライマーX)NNNNNN−3’という構造を取りうる。各プライマーにおい
て、プライマーXは標的核酸分子を引き続きPCR増幅するために使用可能なすべての配列である。活性化遺伝子増幅生成物をクローン化する場合、プライマーX配列内に1個以上の制限部位を包含させて、次のクローニングを促進することが有用である。プライマーX領域を欠失するプライマーを含め、当業者が認識する他のプライマーを用いて、第1の鎖cDNA生成物を作成することができる。
【0312】
本発明により、プライマーは1個以上のハプテン分子と結合して、その後の、そのようなプライマーを含む核酸分子(たとえば第1および/または第2鎖cDNA生成物)の単離を促進する。プライマーが(cDNA合成中の包含によって)核酸分子と結合した後、ハプテニル化プライマーを含む分子の選択的単離は、リガンド−ハプテン相互作用によって、特異的にハプテンと相互作用し、ハプテンに結合する、該当するリガンドを使用して実施される。好ましいそのような態様において、リガンドはたとえば、担体に結合することがある。興味のある固体(ハプテニル化プライマー含有核酸分子)は、いったん担体に結合すると、担体マトリクスを溶液、好ましくは緩衝液または水で洗浄することによって、汚染核酸および他の物質から分離できる。次に、プライマー内の1個以上の開裂部位の開裂、または核酸分子を含む単体の高イオン強度溶出緩衝液よる処理によって、担体から興味のある核酸分子を除去することができる。
【0313】
本発明の本態様でに使用に好ましい担体としては、これに限定されるわけではないが、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ラテックスビード、磁気ビード、常磁性ビード、超常磁性ビードまたはマイクロタイタープレートおよび最も好ましくは、プライマー上のハプテン分子に特異的に認識、およびそれらに結合する1個以上のリガンド分子を含む磁気ビード、常磁性ビードまたは超常磁性ビードが挙げられる。
【0314】
本発明のプライマー分子で使用するのに特に好ましいハプテン分子としては例外なく:(i)ビオチン;(ii)抗体;(iii)酵素;(iv)リポ多糖類;(v)アポトランスフェリン;(vi)フェロトランスフェリン;(vii)インシュリン;(viii)サイトカイン(成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子);(ix)gp120;(x)β−アクチン;(xi)LFA−1;(xii)Mac−1;(xiii)グリコフォリン;(xiv)ラミニン;(xv)コラーゲン;(xvi)フィブロネクチン;(xvii)ビトロネクチン;(xviii)インテグリンαvβ1およびαvβ3;(xix)インテグリンα3β1、α4β1、α4β7、α5β1、αvβ1、αITbβ3、αvβ3、αvβ6;(xx)インテグリンα1β1、α2β1、α3β1、αvβ3;(xxi)インテグリンα1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α7β1、α6β5;(xxii)アンキリン;(xxiii)C3bi、フィブリノーゲンまたはX因子;(xxiv)ICAM−1またはICAM−2;(xxv)スペクトリンまたはフォドリン;(xxvi)CD4;(xxvii)サイトカイン(成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子)受容体;(xxviii)インシュリン受容体;(xxix)トランスフェリン受容体;(xxx)Fe+++;(xxxi)ポリミキシンBまたはエンドトキシン中和タンパク質(ENP);(xxxii)酵素特異性基質;(xxxiii)タンパク質A、タンパク質G、細胞表面Fc受容体または抗体特異性抗原;(xxxiv)アビジンおよびストレプトアビジンが含まれる。特に好ましいのはビオチンである。
【0315】
本発明の本態様による、上述のハプテン分子に順に一致する、特に好ましいリガンド分子としては例外なく;(i)アビジンおよびストレプトアビジン;(ii)タンパク質A、タンパク質G、細胞表面Fc受容体または抗体特異性抗原;(iii)酵素特異性基質;(iv)ポリミキシンBまたはエンドトキシン中和タンパク質(ENP);(v)Fe+++;(vi)トランスフェリン受容体;(vii)インシュリン受容体;(viii)サイトカイン(成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子)受容体;(ix)CD4;(x)スペクトリンまたはフォドリン;(xi)ICAM−1またはICAM−2;(xii)C3bi、フィブリノーゲンまたはX因子;(xiii)アンキリン;(xiv)インテグリンα1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α7β1、α6β5;(xv)インテグリンα1β1、α2β1、α3β1、αvβ3;(xvi)インテグリンα3β1、α4β1、α4β7、α5β1、αvβ1、αITbβ3、αvβ3、αvβ6;(xvii)インテグリンαvβ1およびαvβ3;(xviii)ビトロネクチン;(xix)フィブロネクチン;(xx)コラーゲン;(xxi)ラミニン;(xxii)グリコフォリン;(xxiii)Mac−1;(xxiv)LFA−1;(xxv)β−アクチン;(xxvi)gp120;(xxvii)サイトカイン(成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子);(xxviii)インシュリン;(xxix)フェロトランスフェリン;(xxx)アポトランスフェリン;(xxxi)リポ多糖類;(xxxii)酵素;(xxxiii)抗体;および(xxxiv)ビオチンが挙げられる。本発明のビオチン化プライマーとともに使用するのに特に適しているのは、アビジンおよびストレプトアビジンである。
【0316】
第1鎖合成の後、第2鎖cDNA合成は、ベクターコードエキソンに対して特異性のプライマーを用いて行う。これにより、ベクターコードプロモーターに由来したすべての転写産物から二重鎖cDNAを作成する。内在性プロモーターから生成されたすべての細胞mRNA(およびcDNA)は、転写産物が5’末端にベクターエキソンを欠失しているため、一本鎖のままである
。第2鎖合成を実施すると、cDNAは制限酵素によって消化され、ベクター内にクローン化され、伝播される。
【0317】
クローニングを促進するために、ベクターエキソンを含むcDNA分子は、ベクターエキソンに対して特異性のプライマーおよび第1鎖cDNAプライマー(たとえばプライマーX)に対して特異性のPCRによって増幅される。異なる遺伝子による複数のキメラ転写産物の第1鎖合成および/または増幅の間に、PCR増幅によって、異なる位置のプライミングを表す可変長DNAフラグメントが生成される。これらの増幅生成物は、キャラクタリゼーションのためにプラスミド内にクローン化されるか、標識して、プローブとして使用することができる。
【0318】
RNAポリメラーゼを用いた直線増幅などの(Van Gelder,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1663−1667(1990);Eberwine,Methods 10:283−288(1996))、他の増幅技法を使用できる。たとえば、RNAポリメラーゼによる直線増幅を使用する場合、ベクターエキソン上にプロモーター(たとえばT7プロモーター)を配置できる。結果として、遺伝子活性化転写産物は、転写産物の5’末
端にプロモーター配列を含む。あるいは、第1鎖および第2鎖合成の後に、プロモーターをcDNA分子に結合することができる。どちらかの戦略を使用して次に、リボヌクレオチドトリホスフェートの存在下でRNAポリメラーゼをcDNAによってインキュベートし、cDNAからRNA転写産物を作成する。これらの転写産物はそれからcDNAを生み出すために逆転写される。RNAポリメラーゼは1個のcDNA分子から数千個の転写産物を作成でき、これらの転写産物がそれぞれcDNA内へ逆転写できるため、大規模な増幅が行える。PCRと同様に、RNAポリメラーゼを用いた増幅によって、活性化遺伝子のクローニングを促進することができる。他の種類の増幅戦略も可能である。
【0319】
別の実施形態において、cDNA分子を含むベクターエキソンは増幅せずに単離できる。これはたとえば、増幅中にバイアスが発生した場合(たとえば、1個のDNAフラグメントが他のDNAフラグメントよりも効果的に増幅する場合)に有用である。標識メッセージ陽に濃縮されたcDNAを生成するために、活性化ライブラリーからRNAを単離する。プライマー(たとえばランダム六量体、オリゴ(dT)、またはポリ(dT)またはランダムヌクレオチドに結合されたプライマーを含むハイブリッドプライマー)をアニーリングしてRNAとし、第1鎖合成の指示に用いる)。次に第1鎖cDNA分子をハイブリダイズして、ベクターコードエキソンに対して特異性のプライマーとする。このプライマーは第2鎖合成を指示する。第2鎖合成の後、cDNAは、ベクターエキソンをおよび第1鎖プライマー(たとえばプライマーXに−上を参照)を切断する制限酵素によって消化する。次に第2鎖生成物を有用なベクター内にクローン化し、それらを伝播できるようにする。
【0320】
本明細書に含まれる説明を考慮すると、本発明の方法によって作成したcDNA生成物も、各種の原核(細菌)または真核(酵母、植物あるいは、ヒトまたは他の哺乳類を含む動物)細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適したクローニングベクター内へクローン化されることは、当業者には明らかである。このようなクローニングベクターは、発現ベクターでもよく、これらに限定されるわけではないが、染色体−、エピソーム−および、ウイルス由来ベクター、たとえば、コスミドおよびファージミド、BACs、MACs、YACsなどの、細菌性プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、その組み合わせによって由来するベクターが含まれる。本発明の本態様に従って使用するのに適した他のベクター、および、そこでのDNA断片の挿入方法、そのようなクローニングベクターをを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者には周知であろう。
【0321】
スプライスされていない転写生成物の除去
ある例において、活性化ベクターは遺伝子を欠失した領域内のゲノムに組込まれる。あるいは、遺伝子を含む領域に組込まれるが、非コード鎖の転写が起こる方法で配向されている。これらの各例において、通常、ベクターコードエキソンに隣接した未転写DNA配列を含む、遺伝子活性化転写産物が生成される。これらの配列によって、新規遺伝子の同定および分析が複雑になる。したがって、これらのゲノム分子を選択的に除去すると有利である。
【0322】
ベクターコードイントロンを含むcDNA分子を除去するために、二重鎖cDNAを、ベクターコードイントロンに配置された配列を識別する制限酵素によって処理する。制限酵素は、ベクターエキソンの開裂によって生成されるオーバーハングとは異なるオーバーハングを作成することが好ましい。これにより、開裂生成物のクローニングベクター内への結合を防止することによってのみ活性化される細胞がクローニングされる。
【0323】
活性化内在性遺伝子からのエキソンIの回収
活性化遺伝子からエキソンIを回収するために、特殊ベクターを用いて非標的遺伝子活性化ライブラリーを作成できる。このベクターは、その最も簡単な形で5’から3’に、プロモーター
、不対スプライス供与対部位および第2プロモーターを含む。下流プロモーターは、上流プロモーターと同一の方向に向けられる。内在性遺伝子の上流への組込時に、この種のベクターは2種類の転写産物を生成する。第1の転写産物は、内在性遺伝子のエキソンIIに結合されるベクターエキソンを含む。この転写産物を単離する方法は上で述べている。第2の転写産物は、内在性遺伝子の上流領域と、それに続くエキソンIIに結合したエキソンIおよび内在性遺伝子による下流エキソンを含む(図6)。
【0324】
エキソンIは2段階のステップを用いて、組込ベクターを含む細胞から回収できる。第1に、転写産物(すなわち転写産物#1、図13)を含むベクターエキソンは、上述した方法を用いて単離する。エキソンIIを含む転写産物の5’末端はいったん単離すると、配列決定され、フラ
ンキング内在性エキソンの配列を決定できる。第2に、フランキング内在性エキソンの配列がわかれば、活性化細胞のエキソンII(または下流エキソン)にアニーリング可能なPCRプライマーを発生させることができる。これらのプライマーは、反転PCRの修飾形を用いて、転写産物#2(図13)からエキソンIを増幅するために使用できる(Zeiner,M.Biotechniques 17(6):1051−1053(1994))。簡潔に言えば、内在性遺伝子からのエキソンIは、上で決定した配列情報に基づき、遺伝子特異性プライマーを用いて第1鎖cDNA合成を実施することによって増幅される。第2鎖合成は、E.コリ DNAポリメラーゼIを用いて、当業者に周知の方法で実施できる。次に二重鎖cDNAを、第1鎖cDNAプライマー上流の内在性遺伝子で少なくとも1回開裂し、ベクターエキソン内で開裂しない、制限酵素によって消化する。消化の後、cDNAは自己結合して、環状分子を生成する。制限/環状化部位の上流の内在性細胞内でアニーリングする反転PCRプライマーを用いると、PCR増幅によって、内在性遺伝子からエキソンI配列を含むDNA生成物が生成される。
【0325】
より高レベルの遺伝子活性化転写産物/タンパク質を含む細胞の選択方法
開示した発明の複数の実施形態において、活性化ベクターは増幅可能マーカー(たとえばDHFR)およびウイルス起源の複製(たとえばEBV ori P)を含む。別の実施形態において、増幅可能マーカーおよびウイルス起源の複製は、ゲノムDNAのクローン化フラグメントを含むクローニングベクター上に存在する。また別の実施形態では、活性化ベクターは片方の要素(たとえばDHFR)を含み、ゲノムインサートを保持するクローニングベクターはもう片方の要素(たとえばOri P)を含む。増幅可能マーカーおよびウイルス起源の初期位置とは無関係に、要素は、宿主細胞への導入前か、導入中に同一のDNA分子上で結合される。
【0326】
シス作用要素に加えて、トランス作用ウイルス性タンパク質は一般に、エピソームを十分に発現させるために必要である。トランス作用ウイルス性タンパク質の例は、FBNA−1とSV40T抗原を含む。エピソームの十分な複製を促進するために、トランス作用ウイルス性タンパク質はエピソームから発現させることができる。したがって、トランス作用ウイルス性タンパク質は、転位活性化ベクターから発現させるか、クローニングベクターの主鎖に配置してもよい。あるいは、トランス作用ウイルス性タンパク質は、エピソームを導入する真核宿主細胞によって発現させてもよい。
【0327】
増幅可能マーカーおよびウイルス起源の複製が同一分子上にあり、適切なウイルス複製タンパク質を発現する宿主細胞中に存在すると、エピソームの複製数を増加させることができる。エピソームの複製数を増加させるために、細胞を適切な選択下に配置することができる。たとえばDHFRがエピソーム上に存在する場合、メトトレキサートを培養物に添加してもよい。該選択的薬剤は、すでにエピソームの複製数が高まっている個体群において細胞を単離するために、比較的高濃度で使用してもよい。あるいは、該選択的薬剤は比較的低い濃度で使用し、濃度を周期的に上昇させてもよい。薬剤濃度を2倍に上昇させると、複製数が段階的に増加する。
【0328】
非特異性薬剤耐性(すなわちエピソームの複製数増加と関連しない薬剤耐性)の頻度を低下させるために、1個以上の増幅可能マーカーをベクター中に配置できる。複数の増幅可能マーカーをエピソームに包含させると、細胞を複数の薬剤を用いて選択することができる(同時にまたは連続的に)。非特異性薬剤耐性が比較的まれなイベントであるため、複数の薬剤に対する非特異性薬剤耐性を生じさせる細胞の確率は非常に低い。したがって、複数の増幅可能マーカーがエピソーム上に存在すると、エピソームの複製数が大きい細胞の単離が促進される。
【0329】
エピソームの複製数の増幅によって、ベクター活性化遺伝子に由来する転写産物の数が増加する。次に、これによって、活性化遺伝子に由来するcDNA分子の単離が促進される。さらに、エピソーム複製数の増幅が、活性化遺伝子からのタンパク質発現を劇的に上昇させる。より高いレベルのタンパク質産出によって、バイオアッセイスクリーニング、細胞アッセイスクリーニングおよび製造目的のためのタンパク質生成が促進される。
【0330】
上述した非常に望ましい特性の結果として、ウイルス由来の複製および増幅可能マーカーを含むベクターおよびこれらのベクターを用いてエピソームベクターの複製数を迅速に増幅することは、ゲノムDNAに存在する遺伝子の活性化発現の範囲を超えて膨張するブレークスルーとなっている。たとえば、これらのベクターを用いてcDNAコード遺伝子を過剰発現させると、増幅可能マーカーを持つ宿主細胞ゲノムに遺伝子を組込まなくても、高レベルのタンパク質発現を行うことができる。さらに、染色体配列の増幅と同様に、数百から数千個のベクターのエピソーム複製を持つ細胞を単離し、培養物内で維持することができる。そのため、本明細書で述べるベクターおよびその使用によって、高レベルのクローン化ゲノムDNAを哺乳類細胞中で伝播させ、ベクター上に存在する遺伝子のcDNA複製のゲノムインサートとしての単離を促進し、クローン化cDNAによるタンパク質生成および真核遺伝子のゲノム複製をを最大限にすることができる。
【0331】
ここで示した方法や応用に対して他にも適当な修飾と適応があることは当業者には容易に明白なことであり、本発明あるいはその実施態様の範囲を逸脱することなく行える。本発明をここに詳細に記述したが、以下の例を参照することによってより明確に理解されよう。これは実例の目的でのみここに包含したものであり、本発明を限定するものではない。
【0332】
例1:内在性遺伝子発現を活性化するための細胞のトランスフェクション
方法 :pRIG−1 の構築
ヒトDHFRは、PCRにて作製したHT1080細胞由来cDNAから、プライマーDHFR−F1(5’TCCTTCGAAGCTTGTCATGGTTGGTTCGCTAAACTGCAT 3’)(配列番号1)およびDHFR−R1(5’ AAACTTAAGATCGATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAA 3’)(配列番号2)を用いてPCRにより増幅し、pTARGETTM(Promega)のT部位にクローニングしてpTARGET:DHFRを作製したPREP9をNheIとXbaIで切断してRSVプロモーターを単離し、pTARGET:DHFRのNheI切断部位に挿入してpTgT:RSV+DHFRを作製した。オリゴヌクレオチドJH169(5’ ATCCACCATGGCTACAGGTGAGTACTCG 3’)(配列番号3)とJH170(5’ GATCCGAGTACTCACCTGTAGCCATGGTGGATTTAA 3’)(配列番号4)をアニーリングしてpTgT: RSV+DHFRのI−Ppo−IとNheI切断部位に挿入し、pTgT: RSV+DHFR+Exlを作製した。プライマーTet F1(5’ GGCGAGATCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAAT 3’)(配列番号5)およびTet F2(5’ GGCCAGATCTGCTACCTTAAGAGAGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA 3’)(配列番号6)を用いて、PBR322のヌクレオチド230から508番に相当する279bpの領域をPCRにより増幅した。増幅した産物をBglIIで切断し、pTgT: RSV+ RSV+DHFR+ExlのBamHI切断部位に挿入してpRIG−1を作製した。
【0333】
トランスフェクション:HT1080細胞でのpRIG−1遺伝子活性化
ライブラリーの作製
遺伝子発現を活性化するため、上記したコンストラクトのグループ内から適した活性化コンストラクトを選択する。次に、当業者に周知のいずれかのトランスフェクション法により、選択した活性化コンストラクトを細胞に導入する。トランスフェクション法の例として、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAEデキストラン法、および受容体依存性エンドサイトーシス法が挙げられる。細胞への導入に続き、DNAは非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、自然に生じた染色体の切れ目、あるいは人為的に誘発した染色体の切れ目で起こる。
【0334】
方法
pRIG1によるヒト細胞のトランスフェクション。HT1080細胞のHPRT−サブクローンであるHH1細胞2x109コを、150mm組織培養プレートで90%コンフルエントになるまで培養した。細胞から培地を除去し、培養上清として保存した(以下を参照)。トリプシンで短時間インキュベーションすることによりプレートから細胞を剥がし、培地/10%ウシ胎児血清を添加してトリプシンを中和し、Jouan遠心機で5分間、1,000Rpmで遠心分離して沈殿させた。1xPBSで細胞を洗浄し、カウントし、上記のように再度沈殿させた。最終的に2.5x107コ細胞/mlになるように、1xPBS(Gibco BRL, Cat #14200−075)で細胞の沈殿を再懸濁した。次に、細胞を137Cs由来の50ラドのγ照射に曝露した。pRIG1は(図14A〜14B:配列番号18)、BamHIにより直鎖状にし、フェノール/クロロホルムで精製し、エタノールにより沈殿させ、PBSに再懸濁した。精製し直鎖状にした活性化コンストラクトを、最終濃度40μg/mlになるように細胞懸濁液に添加した。次にDNA/照射細胞混合液を混合し、0.4cmのエレクトロポレーションキュベット(Biorad)に400μlずつ分注した。エレクトロポレーション装置(Biorad)を用いて、キュベットを250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルスの後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco/BRL)を含むαMEM/10%FBSに加えた。続いて、約7x106コ細胞/35mlのαMEM/10%FBS/ペニシリンストレプトマイシン(33%培養上清/67%新鮮培地)を含むプレートの割合で、細胞をプレーティングした。37℃で24時間インキュベーションした後、60mg/mlストックから最終濃度が500μg/mlになるように、それぞれのプレートにG418(Gibco/BRL)を添加した。4日間の選択後、培地を新鮮なαMEM/10% FBS/ペニシリンストレプトマイシン/500μg/ml G418で置換した。さらに7から10日間細胞をインキュベーションし、新規タンパク質因子の存在について培養上清をアッセイした、あるいは後に解析するため−80℃にて保存した。薬剤耐性のクローンは、後に解析するため液体窒素で保存した。
【0335】
例2:DNA組み込みの頻度とランダム性を増加させるための電離放射線の利用
方法:90%コンフルエントの段階でHH1細胞を回収し、1xPBSで洗浄し、7.5x106コ細胞/mlになるように1xPBSで再懸濁した。細胞に、15μgの直鎖状化DNA(pRIG−1)を添加し混合した。それぞれのキュベットに400μlずつ分注し、エレクトロポレーション装置(Biorad)を用いて、250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、2.5mlのαMEM/10% FBS/1xペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけたうち300μlの細胞を、直ちに、あるいはトランスフェクション後1時間または4時間の時点で0,50,500,5000ラドで照射した。照射後直ちに、細胞を完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから24時間後、G418を最終濃度500μg/mlになるよう培養細胞に添加した。選択から7日後、培養液を500μg/mlのG418を含む新鮮完全培地に置換した。選択から10日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー/90%メタノール/10%酢酸で染色し、50細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【0336】
例3:ゲノムにランダムの、半ランダムの、あるいはターゲットした)切れ目を生じるための制限酵素の利用
方法:90%コンフルエントの段階でHH1細胞を回収し、1xPBSで洗浄し、7.5x106コ細胞/mlになるように1xPBSで再懸濁した。組み込み効率をテストするため、15μgの直鎖状化DNA(PGK−βgeo)をそれぞれ400μlずつ分注した細胞に添加し、混合した。いくつかの分注細胞については、続いて制限酵素、XbaI,NotI,HindIII,IppoI(10から500units)を別々の細胞/DNA混合液に添加した。それぞれのキュベットに400μlずつ分注し、エレクトロポレーション装置(BioRad)を用いて、250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、2.5mlのαMEM/10%FBS/1xペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけた全量2.5mlの細胞のうち、300μlを完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから24時間後、G418を最終濃度600μg/mlになるよう培養細胞に添加した。選択から7日後、培養液を600μg/mlのG418を含む新鮮完全培地に置換した。選択から10日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー/90%メタノール/10%酢酸で染色し、50細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【0337】
例4:組み込みベクター上に位置する二つの増幅可能マーカーを選択することによる増幅
ベクターを宿主細胞のゲノムへ組み込んだ後、組み込みベクター上に位置する一つあるいはそれ以上の増幅可能マーカーを同時にあるいは連続して選択することにより、遺伝子座のコピー数が増幅される。例えば、二つの増幅可能マーカーを含むベクターがゲノムに組み込まれると、ベクター上に位置する両増幅可能マーカーを選択することにより、規定の遺伝子(すなわち、ベクター組み込み部位に位置する遺伝子)の発現は増加し得る。この研究法により、適当な遺伝子座(すなわち、組み込みベクターを含む遺伝子座)を増幅する細胞のクローンを非常に容易に単離できる。
【0338】
非相同的組換えによりベクターがゲノムに組み込まれると、独自の位置に組み込みベクターを含む個々の細胞クローンを、ゲノムの他の位置に組み込みベクターを含む他細胞から単離することができる。あるいは、混合した細胞集団でも増幅の選択が可能である。
【0339】
組み込みベクターを含む細胞は、次に一次増幅可能マーカーに特異的な一次選択薬剤の存在下で培養する。この薬剤により、ベクターあるいは内在性染色体上の増幅可能マーカーを増幅した細胞が選択される。次に、これらの細胞を二次増幅可能マーカーに特異的な二次選択薬剤の存在下で培養することにより、二次選択マーカーの増幅について選択する。ベクターと隣接するゲノムDNAを増幅した細胞はこの二次選択ステップにおいて生存するが、内在性一次増幅可能マーカーを増幅した細胞、あるいは非特異的耐性を獲得した細胞は生存できない。2つ以上(例えば、3つ、4つ、5つ、あるいはそれ以上)の増幅可能マーカーを含むベクターが細胞ゲノムに組み込まれた場合には、同様の方法でさらなる選択を行うこともあり、その場合、組み込みベクター上に含まれるさらなる増幅マーカーに特異的な選択薬剤の存在下で連続して培養する。選択後、生存細胞で目的遺伝子の発現レベルについてアッセイし、最も高いレベルで発現している細胞を選んでさらに増幅させる。代わりに、両方(2つの増幅可能マーカーを用いた場合)あるいはすべて(2つ以上の増幅可能マーカーを用いた場合)の選択薬剤に耐性の細胞プールを、個々のクローンを単離しないでさらに培養することもできる。その後、これらの細胞を拡大培養し、より高い濃度(通常、2倍高)の一次選択薬剤存在下で培養する。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を続ける。
【0340】
あるいは、組み込みベクターを含む細胞を両方(2つを用いた場合)またはすべて(2つ以上を用いた場合)の増幅可能マーカーで同時に選択することもできる。同時選択は、両方(2つのマーカーを用いた場合)またはすべて(2つ以上のマーカーを用いた場合)の選択薬剤をトランスフェクションした細胞を培養する選択培地に添加して行う。生存細胞の大多数が、増幅した組み込みベクターを有する。次にこれらのクローンを個々にスクリーニングし、最も発現レベルの高い細胞を同定するか、またはプールして用いることもできる。さらに、それぞれの選択薬剤をより高い濃度(通常、2倍高)で細胞にかける。続いて、生存細胞で発現レベルについてアッセイする。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を繰り返す。
【0341】
どちらの選択ストラテジー(つまり、同時あるいは連続選択)においても、細胞毒性のない低濃度から細胞の大多数が死滅する高濃度まで薬剤の力価測定を行い、選択薬剤の初期濃度を個々に決定する。一般的には、はっきりと区別のできるコロニー(例えば、プレーティングした100,000コの細胞当たり数百コのコロニー)を生じる濃度を初期濃度として選ぶ。
【0342】
例5:膜貫通タンパク質をコードするcDNAの単離
pRIG8R1−CD2(図5A〜5D; 配列番号7), pRIG8R2−CD2(図6A〜6C; 配列番号8), およびpRIG8R3−CD2(図7A〜7C; 配列番号9)ベクターは、不対スプライスドナー部位の上流にあるエキソンに連結して働くCMV前初期遺伝子プロモーターを含む。ベクター上のエキソンはCD2の細胞外ドメイン(フレームの合う終止コドンを欠く)に連結したシグナルペプチドをコードする。それぞれのベクターは、スプライスドナー部位について異なるリーディングフレームにあるCD2をコードする。
【0343】
活性化遺伝子のライブラリーを作製するため、2x107コの細胞を137Cs源にて50ラドで照射し、15μgの直鎖状化pRIG8R1−CD2(配列番号7)をエレクトロポレーションした。pRIG8R2−CD2(配列番号8)、さらにpRIG8R3−CD2(配列番号9)を用いて、別々に同様の操作を行った。トランスフェクション後、3つの細胞グループを混合し、ディッシュ当たり5x106コのトランスフェクションされた細胞となるように150mmディッシュにプレーティングして、ライブラリー#1を作製した。トランスフェクションから24時間後、ライブラリー#1を500μg/mlのG418で14日間選択した。ホスト細胞のゲノムにベクターを組み込んだ薬剤耐性クローンを混合し、分注し、解析のため凍結した。3x107コの細胞,3x107コの細胞,および1x107コの細胞をそれぞれpRIG8R1−CD2,pRIG8R2−CD2,およびpRIG8R3−CD2でトランスフェクションし、あとは上記と同様の操作を行い、ライブラリー#2を作製した。
【0344】
活性化した内在性膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞を単離するため、それぞれのライブラリーから3x106コの細胞を培養し、以下のように処理した。
・4mlのトリプシンEDTAで細胞をトリプシン処理した。
・細胞が遊離した後、8mlのアルファMEM/10%FBSを添加してトリプシンを中和した。
・無菌のPBSで細胞を1回洗浄し、800xgで7分間、遠心分離して回収した。
・細胞ペレットを2mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。1mlをソーティングに用い、もう1mlを500μg/mlG418を含むアルファMEM/10%FBSで再度プレーティングして拡大培養し、保存した。
・ソーティングに用いる細胞を無菌のアルファMEM/10%FBSで1回洗浄し、800xgで7分間、遠心分離して回収した。
・上清を除去し、ペレットを1mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。アイソタイプコントロールでの染色用に、100μlの細胞を除去した。
・900μlの細胞に200μlの抗CD2 FITC(Pharmingen カタログ#30054X)を添加し、もう一方で100μlの細胞に20μlのマウスIgG1アイソタイプコントロール(Pharmingen カタログ#33814X)を添加した。細胞を氷上で20分間インキュベーションした。
・抗ヒトCD2 FITCで染色した細胞を含むチューブに、5mlのPBS/10%FBSを添加した。アイソタイプコントロールには、900μlのPBS/10%FBSを添加した。600xgで6分間遠心分離することにより、細胞を回収した。
・チューブから上清を除去した。アイソタイプコントロールで染色した細胞を500μlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁し、抗CD2 FITCで染色した細胞を1.5mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。
【0345】
FACS Vantageフローサイトメーター(Becton Dickinson Immunocytometry Systems; Moutain View,CA)により、連続して5回、細胞をソーティングした。それぞれのソーティングにおいて、全細胞中最も強い蛍光性を示す表示したパーセンテージの細胞(以下を参照)を回収し、拡大培養して、再度ソーティングした。ネガティブコントロールとして、HT 1080細胞をソーティングした。それぞれのソーティング段階において、以下の細胞集団をソーティングして回収した。
【0346】
【表1】
それぞれのライブラリーについて各最終ソーティングした細胞を拡大培養し、液体窒素で保存した。
【0347】
FACSソーティングした細胞からの活性化遺伝子の単離
上記のように細胞をソーティングした後、ソーティングした細胞からPCRベースのクローニング法により活性化遺伝子を単離した。しかし、FACSソーティングした細胞から活性化遺伝子を単離するためには、遺伝子クローニングのいずれの周知方法も同様に用いることができる。
【0348】
以下のプロトコールにより遺伝子を単離した。
(1) PolyATract System 1000 mRNA 単離キット(Promega)を使用し、ライブラリー#1および#2由来の3x107コのCD2+細胞(上記のように、FACSにより5回ソーティングした)からmRNAを単離した。
(2) mRNAを単離した後、0.5μlの単離mRNAを99.5μlの水に希釈し、OD260測定によりmRNA濃度を定量した。CD2+細胞から21μgのmRNAを回収した。
(3) 以下のようにして第一鎖cDNA合成を行った。
(a) PCR機を4℃に保温している間に、以下の成分を順に添加して第一鎖反応混合液を準備した。
41μl DEPC処理ddH20
4μl 10mM各dNTP
8μl 0.1M DTT
16μl 5xMMLV第一鎖バッファー(Gibco−BRL)
5μl (10pmol/μl) コンセンサスポリアデニル化部位プライマー
GD.R1(配列番号10)*
1μl RNAsin(Promega)
3μl (1.25μg/μl) mRNA
*注釈:GD.R1, 5’ TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT 3’(配列番号10)は、mRNAの第一鎖cDNA合成用(遺伝子発見「Gene Discovery」)プライマーである。このプライマーはポリアデニル化シグナルAATAAAおよび下流のポリA領域にアニールするように設計してある。このプライマーにより、第一鎖にNotI切断部位が導入される。
サンプル調製後、以下のようにインキュベーションした。
(b) 70℃、1分
(c) 42℃、保温
【0349】
次にそれぞれのサンプルに2μlの400 U/μl SuperScriptII(Gibco−BRL; Rockville, MD)を添加し、最終全量を82μlとした。約3分後、サンプルを以下のようにインキュベーションした。
(d) 37℃、30分
(e) 94℃、2分
(f) 4℃、5分
続いてそれぞれのサンプルに2μlの20 U/μl RNace−IT(Stratagene)を添加し、サンプルを37℃で10分間インキュベーションした。
【0350】
(4) 第一鎖合成に続き、PCR cleanupキット(Qiagen)を用いて以下のようにcDNAを精製した。
(a) 1.7mlのシリコン処理したエッペンドルフチューブに80μlの第一鎖反応液を移し、400μlのPBを添加した。
(b) サンプルをPCR cleanupカラムに移し、14,000Rpmで2分間、遠心分離した。
(c) カラムを分解して流出液をデカントし、ペレットに750μlのPEを添加して、チューブを14,000Rpmで2分間遠心分離した。
(d) カラムを分解して流出液をデカントし、チューブを14,000Rpmで2分間遠心分離して樹脂を乾燥させた。
(e) 50μlのEBを用いて、14,000Rpmで2分間遠心分離することにより、カラムから新しくシリコン処理したエッペンドルフチューブに溶出した。
【0351】
(5) 次に以下のようにして第二鎖cDNAを合成した。
(a) 以下の成分を順に添加して、第二鎖反応混合液を室温で準備した。
ddH2O 55μl
10 x PCRバッファー 10μl
50 mM MgCl2 5μl
10 mM dNTPs 2μl
25 pmol/μl RIG.751−Bio* 4μl
25 pmol/μlGD.R2** 4μl
第一鎖産物 20μl
*注釈:RIG.F751−Bio, 5’ Biotin−CAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGG 3’(配列番号11)は、
pRIGベクターから発現される転写物のキャップ部位にアニールする。**注釈:GD.R2, 5’ TTTTCGTCAGCGGCCGCATC 3’(配列番号12)は、GD.R1プライマー(配列番号10)を用いて作製したcDNAをPCR増幅するのに用いるプライマーである。GD.R2はGD.R1のサブ配列であり、ポリAシグナル配列に先行する縮重塩基まで一致する。
(b) 第二鎖合成の開始:
94℃、1分
1μlのTaq(5 U/μl, Gibco−BRL)を添加;
1μlのVent DNA pol(0.1 U/μl, New England Biolabs)を添加
(c) 63℃で2分間インキュベーション
(d) 72℃で3分間インキュベーション
(e) (b)のステップを4回繰り返す
(f) 72℃で6分間インキュベーション
(g) 4℃でインキュベーション(保温)
(h) 終了
【0352】
(6) STEで3回洗浄することにより、200μlの1mg/mlストレプトアビジン常磁性粒子(SA−PMP)を調製した。
(7) 第二鎖反応の産物をSA−PMPに直接添加し、室温で30分間インキュベーションした。
(8) 結合後、マグネットでSA−PMPを捕集し、上清を除去した。
(9) 500μlのSTEでビーズを3回洗浄した。
(10) ビーズを50μlのSTEに再懸濁し、マグネットを用いてチューブの底に捕集した。次に、ピペットでSTE上清を注意深く除去した。
(11) 50μlのddH20でビーズを再懸濁し、100℃のウォーターバスに2分間入れてPMPから精製cDNAを遊離させた。
(12) マグネットにPMPを捕集し、cDNAを含む上清を注意深く除去し、精製cDNAを回収した。
(13) 精製産物をきれいなチューブに移し、14,000Rpmで2分間遠心分離して残りのPMPをすべて除去した。
【0353】
(14) 次に、以下のようにPCR反応を行い、RIG活性化cDNAを特異的に増幅した。
(a) 以下の成分を順に添加して、PCR反応混合液を室温で準備した。
H2O 59μl
10 x PCRバッファー 10μl
50 mM MgCl2 5μl
10 mM dNTPs 2μl
25 pmol/μl RIG.F781* 2μl
25 pmol/μl GD.R2 2μl
第二鎖産物 20μl
*注釈:RIG.F781, 5’ ACTCATAGGCCATAGAGGCCTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAG 3’(配列番号13)は、GD.F1, GD.F3, GD.F5−Bio, およびRIG.F751−Bioの下流にアニールし、cDNAの5’クローニング用にSfiI切断部位を付加する。このプライマーは、RIG エキソン1特異的第二鎖cDNAのnested PCR増幅に用いる。
(b) サーマルサイクラーの開始:
94℃、3分
1μlのTaq(5 U/μl, Gibco−BRL)を添加;
1μlのVent DNA pol(0.1 U/μl, New England Biolabs)を添加
次に(c)〜(e)のステップを10サイクル繰り返し、PCRを行った。
(c) 94℃、30秒
(d) 60℃、40秒
(e) 72℃、3分
続いて次のステップを行い、PCRを完了した。
(f) 94℃、30秒
(g) 60℃、40秒
(h) 72℃、3分
(i) 72℃ + 各サイクル20秒として10サイクル分
(j) 72℃、5分
(k) 4℃、保温
【0354】
(15) 50μlのEBでライブラリー物質を溶出した後、10μlのNEBバッファー2,40μlのdH2O,および2μlのSfiIを加えて50℃で1時間インキュベーションし、forwardプライマー(RIG.F781; 配列番号13)でコードされるSfiI切断部位でcDNAの5’末を切断した。
(16) SfiI切断後、5μlの1 M NaClと2μlのNotIをそれぞれのサンプルに加えて37℃で1時間インキュベーションし、第一鎖プライマー(GD.R1; 配列番号10)でコードされるNotI切断部位でcDNAの3’末を切断した。
(17) 続いて切断したDNAを1%低融点アガロースゲルで分画した。1.2 kb〜8 kbの範囲にあるcDNAをゲルから切り出した。
(18) QiaexII Gel Extraction(Qiagen)を用いて切り出したアガロースゲルからcDNAを回収した。400単位のT4DNAリガーゼ(NEB)を用いて、全量10μlの1xT4リガーゼバッファー(NEB)中で、2μlのcDNA(約30mg)を7μl(35ng)のpBS−HSP(SfiI/NotIで直鎖状化)にライゲーションした。
【0355】
(19) ステップ(18)のライゲーション反応混合液0.5μlをE.coli DH10Bに形質転換した。
(20) 103コロニー/0.5μlライゲーションDNAを回収した。
(21) 以下のように、12.5μl容量のPCRでプライマーM13F20およびJH182(RIGエキソン1特異的)を用いて、これらのコロニーをエキソンについてスクリーニングした。
(a) 適当数の96ウェルプレートに100μlのLB(選択抗生物質を含む)を分注した。
(b) 単一コロニーを拾って96ウェルプレートの個々のウェルに播種し、プレートを37℃のインキュベーターに振盪せずに2〜3時間置いた。
(c) 以下のように、PCR反応「マスターミックス」を氷上で調製した。
【0356】
【表2】
【0357】
(d) PCR反応プレートのそれぞれのウェルに10μlのマスターミックスを分注した。
(e) 100μlのE.coli培養液から2.5μlを、PCR反応プレートの対応するウェルに移した。
(f) 典型的なPCRサイクル条件でPCRを行った。
(i) 94℃/2分(細菌の溶解とプラスミドの変性)
(ii) 92℃変性で15分間;60℃プライマーアニーリングを20秒;72℃プライマー伸張を40秒を30サイクル
(iii) 72℃の最終伸張を5分
(iv) 4℃で保温
(g) 次にPCR反応液にブロモフェノールブルーを添加した;サンプルを混合し、遠心分離した後、全反応混合液をアガロースゲルにのせた。
【0358】
(23) 200クローンをスクリーニングしたうち、78%がベクターのエキソンに関して陽性であった。これらのうち96クローンをミニプレップ用に培養し、Qiagen 96−well turbo−prepを用いてQiagen Miniprep Handbook(1997年4月)にしたがい精製した。
(24) NEBバッファー3中、全量22μlで2μlのDNAをNotI, BamHI,XhoI,XbaI,HindIII,EcoRIで同時に切断し、1%アガロースゲルで電気泳動することにより多くの重複クローンを除去した。
【0359】
結果
このプロトコールにより、2つの異なるcDNAライブラリーをスクリーニングした。1つめのライブラリー(TMT#1)では、単離した活性化遺伝子8つをシークエンシングした。これら8つの遺伝子のうち、4つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、6つは新規遺伝子であった。2つめのライブラリー(TMT#2)では、単離した活性化遺伝子11個をシークエンシングした。これら11個の遺伝子のうち、1つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、1つの遺伝子は内在性膜タンパク質に相同な部分的にシークエンシングされた遺伝子をコードし、9つは新規遺伝子であった。単離した遺伝子がキャラクタライズされた既知遺伝子に相当する場合はすべて、その遺伝子は内在性膜タンパク質であった。
【0360】
それぞれのライブラリーから単離した遺伝子の典型的で顕著なアラインメント(GenBankから得た)を以下に示す。
【0361】
TMT#1の顕著なアラインメント:
TMT#2の顕著なアラインメント:
【0362】
例6:ポリ(A)トラップベクターを用いた内在性遺伝子の活性化
HT1080細胞(1x10 7細胞)に、137Cs光源を用いて50radsを照射し、15μgの直線化pRIG14を用いて電気穿孔を行った(図29A−29B)。トランスフェクションの後、細胞を150mmシャーレに5x106細胞/シャーレでプレーティングした。24時間後にピューロマイシンを3μg/mlとなるよう添加した。細胞は3μg/mlピューロマイシンの存在下で12日間37℃でインキュベートした。培地は5日ごとに交換した。12日後にコロニー数を数え、細胞をトリプシン処理し、新しいシャーレに再度プレーティングした。細胞は90%集密まで増殖させ、凍結保管および遺伝子単離のために収集した。通常、トランスフェクションされた細胞1x107個当たり1000−3000コロニーが生成された。
【0363】
例7:二重ポリ(A)トラップ/SATベクターを用いた内在性遺伝子の活性化
1x107個のHH1細胞(HPRT−マイナスHT1080細胞)137Cs光源を用いて50radsを照射し、15μgの直線化pRIG−22を用いて電気穿孔を行った。トランスフェクションの後、細胞を150mmシャーレに5x106細胞/シャーレでプレーティングした。24時間後、500μg/ml G481にネオマイシンを加えた。細胞は500μg/ml G481の存在下で、37℃で4日間インキュベートした。培地は、500μg/ml G481およびAgThgを含む新しい培地と交換し、両方の薬剤の存在下でさらに7日間増殖させた。または、HPRT活性の対照として、培地を、500μg/ml G481およびHAT(Life Technologies,Inc.,メリーランド州ロックビルより入手可能、製造者の推奨濃度で使用)む新しい培地と交換し、両方の薬剤の存在下でさらに7日間増殖させた。トランスフェクションの12日後、コロニー数を数え、細胞をトリプシン処理し、新しいシャーレに再度プレーティングした。細胞は90%集密まで増殖させ、凍結保管および遺伝子単離のために収集した。通常、G418/AgThg選択を行った細胞は、トランスフェクションされた細胞1x101個当たり1000−3000コロニーを生成した。これに対して、通常、G418/HAT選択を行った細胞は、トランスフェクションされた細胞1x107個当たり100コロニーを生成した。
【0364】
例8:活性化遺伝子の単離
本発明の方法を用いて、非標的遺伝子活性化ベクターを真核細胞のゲノム内に組込む。ベクターを複数の細胞に組込むことによって、細胞が異なるベクター活性化遺伝子を発現するライブラリーが生成される。市販のRNA単離キットを用いて、RNAをこれらの細胞から単離する。本例では、Poly(A)Tract 1000(Promega)を用いて細胞からRNAを単離する。RNAは分析および配列決定のために、cDNAに転換され、増幅、サイズ分画され、プラスミド内にクローン化される。本プロセスの簡単な説明を示す。
【0365】
(1) 4mlのGTC抽出緩衝液(Poly(A)Tract 1000Kit−(Promega)を15mlのポリカーボネート製スクリューキャップ付き試験管に入れ、168μlの2−メルカプトエタノールを加えて、70℃の温浴に入れた。
(2) 処理した各ペレットのために8mlの希釈緩衝液を15mlのポリカーボネート製スクリューキャップ付き試験管に入れ、168μlの2−メルカプトエタノールを加えて、70℃の温浴に入れた。
(3) ゲノムに組込んだ非標的遺伝子活性化ベクターを含む−80℃保管細胞ペレット(1x107−1x108細胞)から除去する。4mlのGTC抽出緩衝液を細胞ペレット上にただちにピペットで加える。ペレットが再懸諾されるまでピペットで出し入れしてから、15mlのスナップキャップ付きポリプロピレン製試験管に移す。
(4) 8mlの希釈緩衝液を加え、倒置して混合する。
(5) 10μl(500pmol)のビオチン化オリゴdTプライマーを加え、混合する。
(6) 70℃で5分間倒置させて放置する。2〜3分ごとに均等に加温されるように確認する。
(7) Sorvall HB−6ロータを用いて7800rpm(10kxg)、25℃で10分間遠心分離を行う。この間、6mlのストレプトアビジン−常磁性粒子(SA−PMPs)をPoly(A)Tractシステム1000マグネットによって、6mlの0.5xSSCで3回洗浄する。
(8) 3回洗浄後、6ml 0.5xSSC中にSA−PMPsを再懸濁させる。
(9) RNA調製物から上澄液をピペットで除去し、再懸濁させたSA−PMPsに加える(除去する際に上澄をペレットをかき混ぜないように注意すること)。
(10) SA−PMP/RNAを混合させ、室温で2分間インキュベートする。
【0366】
(11) Poly(A)Tractシステム1000マグネットを用いて磁気ビードを捕捉する。液体の粘度が高いため、すべてのビードがペレット化するまでしばらく時間がかかることに注意する。
(12) 上澄を流し、2mlピペットを用いて1.7ml 0.5xSSC中でビードを再懸濁させ、2mlのスクリューキャップ付き試験管に移す。
(13) マグネットを用いてSA−PMPsを捕捉し、P1000を用いて上澄をピペットで除去する。
(14) 1.7ml 0.5xSSCを加え、試験管を数回倒置させて混合する。
(15) ステップ14および15をさらに2回繰り返す。
(16) ヌクレアーゼを含まない水1ml中にSA−PMPsを再懸濁させ、数回倒置させて混合する。
(17) SA−PMPsを捕捉し、mRNAをピペットで採取する。
(18) 0.5mlのmRNAを2個のシリコン処理エッペンドルフ試験管に入れ、50μlのDEPC処理3MNaOAc溶液および0.55mlのイソプロパノールを加える。数回倒置させて混合し、−20℃で少なくとも4時間置く。
(19) mRNAを10分間、最大RPM(14k)で遠心分離にかける。
(20) 注意して上澄をピペットで採取し、2分間、14k RPMで再度遠心分離にかけて、200μlの80%エタノールでペレットを洗浄する。ペレットの色がしばしば茶色または黄褐色であることに注意する。この色は残留SA−PMPsより生じる。
【0367】
(21) 洗浄液を除去し、ペレットを室温で10分を超えないように風乾させる。
(22) ペレットをそれぞれ5μlずつ再懸濁させ、1個の試験管で一緒にする。
(23) 14k RPMで2分間遠心分離にかけて、残留SA−PMPを除去し、注意深くmRNAを除去する。
(24) 0.5μlを99.5μlの水で希釈し、OD260を測定して、mRNAの濃度を決定する。1OD260=40μgRNAであることに注意する。
(25) 試験サンプルおよび負の対照(HT1080)の両方のために、PCR装置を4℃に維持しながら以下成分を連続して加えて、第1鎖反応を開始するステップ1。
42μl DEPC−処理ddH2O
4μl 10mM各dNTP
8μl 0.1MDTT
16μl 5xMMLV第1鎖緩衝液
5μl (10pmol/μl)GDR1
1μl RNAsin(Promega)
4μl (1.25μg/μl)mRNA
ステップ2:70℃/1分
ステップ3:42℃/維持
ステップ4:1分後、2μlのSuperScript II(R)(Life Technologies,Inc.;メリーランド州ロックビル)を加え、37℃で30分間インキュベートする。
ステップ5:94℃/2分
ステップ6:4℃/∞
ステップ7:2μlのRNaseを加え、37℃で10分間インキュベートする。
ステップ8:4℃/∞
(26) 1%アガロースゲル上で8μlのDNAを分析して、cDNA合成を確認し、70μlの第1鎖反応液を1.5ml シリコン処理エッペンドルフ試験管に移し、400μlのPBを加えて、QiagenのPCRクリーンアップキットを用いた残りのcDNAを生成する。
(27) PCRクリーンアップカラムに移し、最大RPMで2分間遠心分離する。
(28) カラムを分解し、流出物を完全に排出する。750μlのPEを加え、最大RPMで2分間遠心分離する。
(29) カラムを分解し、流出物を完全に排出し、最大RPMで2分間遠心分離し、乾燥樹脂を得る。
(30) 50μlのEBを用いて完全に溶出し、カラムを新しいシリコン処理エッペンドルフ試験管に移し、最大RPMで2分間遠心分離する。
【0368】
(31) 第2鎖cDNA合成をRTで開始する。
H2O 8.5μl
10xPCR緩衝液 5μl
50mM MgCl2 2.5μl
10mM dNTPs 1μl
25pmol/μl GDF5Bio 10μl
25pmol/μl GDR2 10μl
第1鎖生成物 15μl
ステップ9:94℃/1分
ステップ10:60℃/10分
0.25μl Taqポリメラーゼを加える。
ステップ11:60℃/2分
ステップ12:72℃/10分
ステップ13:94℃/1分
ステップ14:分「ステップ11」へ戻りさらに4回
ステップ15:60℃/2分
ステップ16:72℃/10分
ステップ17:終了
【0369】
(32) STEで3回洗浄し、マグネットで収集して、100μlのSA−PMPsを調製する。最終洗浄の後、ビードを150μl STE中に再懸濁する。
(33) QiagenのPCRクリーンアップキットを用いて第2鎖反応の生成物を精製する。50μlのEBを用いて溶出し、第2鎖反応の生成物を150μlのPMPsに加える。
(34) RTにて静かに30分間撹拌する。
(35) 結合後、マグネットを使用してSA−PMPsを収集し、物質によって流出物を回収する(この物質を取っておくこと!)。
(36) ビードを500μl STEで3回、NEB 2(1x)で1回洗浄する。
(37) ビードを100μl NEB 2(1x)中に再懸濁する。
(38) 2μl Sfilを加え、10分ごとに静かに混合して50℃で30分間消化する。
(39) マグネットを用いて精製cDNAを回収し、上澄を注意深く除去する。
(40) 生成物を新しい試験管に移し、最大RPMで2分間遠心分離にかけ、すべてのビードを除去する。
【0370】
(41) 特にRAGE活性化cDNAを増幅するために、PCR反応を開始する。
H2O 37μl
10xPCR緩衝液 10μl
10mM dNTPs 2μl
25pmol/μl GDF781 10μl
25pmol/μl GDR2 10μl
第2鎖生成物 25μl
ステップ1:94℃/2分
ステップ2:94℃/45秒
ステップ3:60℃/10分
0.5μl Taqポリメラーゼを加える。
ステップ4:72℃/10分
ステップ5:94℃/45秒
ステップ6:60℃/2分
ステップ7:72℃/10分
ステップ8:さらに8回ステップ5まで繰り返す
ステップ9:94℃/45秒
ステップ10:60℃/2分
ステップ11:72℃/10分+各サイクルごとに20秒
ステップ12:さらに14回、ステップ9まで繰り返す
ステップ13:72℃/5分
ステップ14:4℃保持
【0371】
(42) ライブラリー物質に対するHT1080のPCR増幅の特異性を、1%アガロースゲル上での分析によって確認する。cDNA増幅に高い特異性がある場合は、Qiagen PCRクリーンアップキットを用いてPCR生成物を精製する。
(43) 50μlのEBでライブラリー物質を溶出させた後、10μl NEB2、40μl dH2Oおよび2μl SfiIを加え、50℃で1時間消化する。
(44) 5μlの1M NaClおよび2μlのNotIを加え、37℃で1時間消化する。
(45) 1%L.M.アガロースゲルを調製し、ゲル上でライブラリー物質を移動させる。物質を描出した後、500bp〜10kbの大きさでフラグメントを切り出す。
(46) QiaexIIゲル抽出プロトコル(Qiagen)を用いてライブラリーDNAを回収し、10μl EB中にDNAを溶出させる。この物質5μlを4μlのpBS−HBS(SfiI/NotI)またはpBS−SNSに連結させ、総体積を10μlとする。
(47) E.コリを、40μl細胞当たり0.5μl連結DNAを用いて転換する。
(48) コロニーを選び、一晩LB中で増殖させ、プラスミドを単離する。
(49) 制限消化およびDNA配列決定によって、遺伝子活性化cDNAインサートを分析する。
【0372】
例9:減算cDNAプールからの活性化遺伝子の単離
例8、ステップ1−24で述べたように、Poly−A Tract 1000システム(Promega)を用いて、トランスフェクションされていないHT1080細胞から精製mRNAを調製し、EZ−LinkTM Biotin LC−ASA試薬(Pierce)を用いて以下のようにビオチン化した。
1) 25μl DEPC処理dH2Oおよび10μgのHT1080を含む15μlのmRNAをシリコン処理微量遠心管に入れ、氷上で維持する。
2) 抑制光のもとで作業し、反応管に40μlの調製LC−ASAストック試薬(100%エタノール中に1mg/ml)を加えた。
3) 紫外線光(365nm波長)を微量遠心管の5cm上に配置し、反応混合物に15分間照射するのに用いた。
4) 未結合ビオチン試薬を標識HT1080mRNAから除去し、反応混合物をRNaseフリーMicroSpin P−30カラム(BioRad)に、製造者の指示どおり通過させた。
【0373】
HT1080細胞は、ポリ(A)トラップpRIG活性化ベクターを用いてトランスフェクションし、例1で述べたように、薬剤耐性コロニーの個体群を生成するために、選択性培地で増殖させた。プールしたコロニーから、例8で述べたようにPromega Poly−A Tract 1000システムを用いて、精製したmRNAを調製した。第1鎖cDNAは、オリゴGD.R1(TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT)(配列番号10)を用いて、例8、ステップ25で述べたように、5μgのこのmRNAから調製した。反応混合物はQiagen PCR Quick Clean−upカラムを通過させ、精製した第1鎖cDNAを100μl EB中で回収した。
ビオチン化HT1080mRNAs(サブストラクター個体群)およびpRIG−トランスフェクションされたコロニーのスーパープール(標的個体群)から調製した第1鎖cDNA減算ハイブリダイゼーションは以下のように行った。
【0374】
1) 9μgのビオチン化mRNAを、0.5μgの第1鎖cDNAを含む0.5ml微量遠心管に加えた。
2) 1/100x体積の10mg/mlグリコーゲン、pH5.5の1/10x体積の3M酢酸ナトリウム、2.6体積の100%エタノールを管に加え、混合した。
3) 管を−80℃に1時間おき、次に冷蔵微量遠心管で20分間回転させた。
4) 沈殿核酸のペレットを排水し、70%エタノールで1回洗浄してから、風乾させた。
5) ペレットを5μlのHBS(50mM HEPES、pH 7.6;2mM EDTA;0.2%SDS;500mM NaCl)中で溶媒和させ、5μlの軽油を上に重ね、次に2分間95℃まで加熱した後に、68℃で24時間置く。
6) 反応混合物を100μl HB(SDSを含まないHBS)で希釈し、100μlのクロロホルムで軽油を除去する。
7) 300μl HB中で3回予備洗浄した300μlのストレプトアビジン被覆常磁性粒子(Promega)に、希釈したハイブリダイゼーション混合物を加えた。
8) 混合物を室温で10分間インキュベートし、磁気捕獲によって、SA−PMPおよび結合ビオチン−mRNA:DNAハイブリッドを溶液から除去する。
9) ステップ7および8を1回繰り返す。
10) 透明溶液に対して減算ハイブリダイゼーションおよび捕獲ハイブリッドの磁気による除去(ステップ1−9)を、以下の例外を用いて1回行った:
ステップ6:ハイブリダイゼーション反応物を2x PCR緩衝液(40mM Tris−HCl、pH8.4;100mM KCl)によって希釈した。
ステップ7:PMPsを1X PCR緩衝液で予備洗浄した。
【0375】
2回減算した第1鎖cDNAを用い、45μlの第1鎖cDNAに7μl dH2O、5μl 50mM MgCl2、2μlの10mM各dNTPの予備混合物、1μl 10x PCR緩衝液、20μlの12.5pmol/μl GD19F1−Bio(5’ビオチン−CTCG
TTTAGTGCGGCCGCTCAGATCACTGAATTCTGACGACCT)(配列番号14)、20μlの12.5pmol/μl GD.R2(TTTTCGTCAGCGGCCGCATC)(配列番号12)、および0.5μl のTaqポリメラーゼを、例8、ステップ31で述べた熱サイクルを用いて結合させ、第2鎖cDNAを生成した。第2鎖cDNA生成物は、例8、ステップ32−49で述べたように、増幅し、E.コリベースのcDNAライブラリーを生成するためにさらに処理した。
【0376】
例10:RIG活性化転写産物の選択的捕捉
HT1080細胞は、例6で述べたように、pRIG19活性化ベクターを用いてトランスフェクションし(図30A−30C)、選択的培地で2週間培養した。すべてのRNAは、TRIzol(R)試薬(Life Technologies,Inc.,メリーランド州ロックビル)を製造者のプロトコルに従って用いて、108個の細胞より成るペレットから調製し、720μlのDEPC処理dH2O(dH2O DEPC)に溶解させた。混在ゲノムDNAは、80μlのNEB 10x緩衝液2、8μlのPromega RNasin、20μlのRQ1 Promega RNaseフリーDNaseを混合し、37℃で30分間インキュベートし、同体積のフェノール:クロロホルム(1:1)およびクロロホルムで連続して抽出し、1/10x体積の酢酸ナトリウム(pH5.5)と混合し、2x体積の100%エタノールを用いてRNAを沈殿させ、乾燥RNAペレットをdH2O DEPC中で溶媒和させることによってRNA調製物より除去し、最終濃度を4.8μg/μlとした。
【0377】
pRIG19活性化遺伝子に由来するmRNA転写産物は、2mlのRNaseフリー微量遠心管内で150μlのすべてのRNA、150μlのHBDEPC(50mM HEPES、pH7.6;2mM EDTA;500mM NaCl)、3μlのPromega RNasin、2.5μl(25pmol/μl)オリゴGD19.R1−Bio(表1を参照)を混合し、次に70℃で5分間、次で50℃で15分間インキュベートして、細胞RNA全体のプールから選択的に捕捉した。1mlのPromegaストレプトアビジン被覆常磁性粒子(SA−PMPs)を磁気的に捕捉し、1.5mlの0.5x SSCでそれぞれ3回洗浄し、SA−PMPsは再懸濁せずに放置した。温かいオリゴ:RNAハイブリダイゼーション反応物を、半乾燥SA−PMPsを含む管に直接加えた。室温で10分間インキュベートした後、SA−PMPを1mlの0.5xSSCで3回洗浄した。
【0378】
【表3】
【0379】
最後の磁気捕捉の後、SA−PMPsは190μlのdH2ODEPCandで懸濁し、68℃で15分間インキュベートした。PMPは、磁気への曝露によって固定化され、RIG活性化転写産物を含む澄んだ溶液を微量遠心管に移した。63μlの捕捉RIG活性化転写産物をPCR管に移し、ここで第1鎖および第2鎖cDNA合成を、PCRプログラム「1+2CDNA」を用いて以下のように行った。
【0380】
ステップ1:
4℃/∞:RIG活性化転写産物を含むPCR管に、20μl 5x GibcoBRL RT緩衝液、1μl Promega RNasin、10μl 100mM DTT、それぞれ10mMの5μl dNTP予備混合物、1μl オリゴGD.R1(表1を参照)を25pmol/μlの濃度で加えた。
ステップ2:70℃/3分
ステップ3:42℃/10分
ステップ4:2.5μlのSuperScript II(R)(Life Technologies,Inc.)を加え、次に37℃で1時間インキュベートした。
ステップ5:94℃/2分
ステップ6:4℃/∞
【0381】
第1鎖cDNA混合物に、2μlのStratagene RNase−Itを加え、混合物を37℃で15分間インキュベートした。600μlのQiagen PB試薬を反応物に加えた後、Qiagen PCRクリーンアップカラムに移し、製造者の指示に従って処理した。cDNAを50μlのEB中でカラムから溶出させ、PCR管に移した。第2鎖cDNA反応は、例9で述べたように、オリゴGD19.F2−Bio(表1)およびGD.R2(表1)を用いて実施した。第2鎖生成物は、SA−PMPsの最終懸濁液は1xNEB 4緩衝液中にあり、捕捉cDNAは制限エンドヌクレアーゼAscIを用いて粒子から開裂させたことを除き、オリゴGD19.F2およびGD.R2を用いた第2鎖cDNA生成物の増幅、エンドヌクレアーゼSfiIおよびNotIを用いた増幅cDNAの消化、クローニング前のcDNAのサイズ選択はすべて、例9で述べたように実施した。最終cDNAクリーンアップは、cDNAプールをQiagen PCR Cleanupカラムから30μlのEB中で溶出さえることによって実施した。11μlのcDNAを4μlの5x GibcoBRLリガーゼ緩衝液、SfiI、NotIおよびCIPによる消化によって以前に調製した4μl pGD5ベクターDNAと混合した。1μlのT4 DNAリガーゼを加え、反応混合物を16℃で一晩インキュベートした。1μlの連結反応物を用いて、電気能力のあるE.コリ DH10B細胞を変換し、次に12.5μg/mlクロラムフェニコールのLB寒天プレート上にプレーティングした。通常、変換された連結混合物μl当たり60〜80個の細菌コロニーが回収された。
【0382】
例11:RIG活性化転写産物の選択的捕捉
HT1080細胞はpRIG19活性化ベクターによってトランスフェクションし、例6で述べたように選択的培地で2週間培養した。すべてのRNAはT、RIzol(R)試薬(Life Technologies,Inc.,メリーランド州ロックビル)を製造者のプロトコルに従って用いて、108個の細胞より成るペレットから調製し、720μlのDEPC処理dH2O(dH2O DEPC)に溶解させた。混在ゲノムDNAは、80μlのNEB 10x緩衝液2、8μlのPromega RNasin、20μlのRQ1 Promega RNaseフリーDNaseを混合し、37℃で30分間インキュベートし、同体積のフェノール:クロロホルム(1:1)およびクロロホルムで連続して抽出し、1/10x体積の酢酸ナトリウム(pH5.5)と混合し、2x体積の100%エタノールを用いてRNAを沈殿させ、乾燥RNAペレットをdH2O DEPC中で溶媒和させることによってRNA調製物より除去し、最終濃度を4.8μg/μlとした。
【0383】
pRIG19活性化遺伝子に由来するmRNA転写産物は、2mlのRNaseフリー微量遠心管内で150μlのすべてのRNA、150μlのHBDEPC(50mM HEPES、pH7.6;2mM EDTA;500mM NaCl)、3μlのPromega RNasin、2.5μl(25pmol/μl)オリゴGD19.R1−Bio(表1を参照)を混合し、次に70℃で5分間、次で50℃で15分間インキュベートして、細胞RNA全体のプールから選択的に捕捉した。1mlのPromegaストレプトアビジン被覆常磁性粒子(SA−PMPs)を磁気的に捕捉し、1.5mlの0.5x SSCでそれぞれ3回洗浄し、SA−PMPsは再懸濁せずに放置した。温かいオリゴ:RNAハイブリダイゼーション反応はセミ−ドライSA−PMPsを含む間の中へ直接加えられる。室温で10分間インキュベートした後、SA−PMPsは1ml 0.5xSSCで3回洗浄した。最後の磁気捕捉の後、SA−PMPsは190μlのdH2ODEPCで懸濁し、68℃で15分間インキュベートした。PMPは、磁気への曝露によって固定化され、RIG活性化転写産物を含む澄んだ溶液を微量遠心管に移した。63μlの捕捉RIG活性化転写産物をPCR管に移し、ここで第1鎖および第2鎖cDNA合成を、PCRプログラム「1+2CDNA」を用いて以下のように行った。
【0384】
ステップ1:
4℃/∞:RIG活性化転写産物を含むPCR管に、20μl5xGibcoBRL RT緩衝液、1μl Promega RNasin、10μl 100mM DTT、それぞれ10mMの5μl dNTP予備混合物、1μl オリゴGD.R1(表1を参照)を25pmol/μlの濃度で加えた。
ステップ2:70℃/3分
ステップ3:42℃/10分
ステップ4:2.5μlのSuperScript II(R)(Life Technologies,Inc.)を加え、次に37℃で1時間インキュベートした。
ステップ5:94℃/2分
ステップ6:60℃/∞;温度を維持しながら、以下を加えた。20μlの50mM MgCl2、1μlの25pmol/μlオリゴGD19.F1−Bio(表1)、2μlのStratagene RNace−It。10分後、0.5μlのTaq DNAポリメラーゼ(Life Technologies,Inc.)を加え、サイクルを続けた。
ステップ7:72℃/10分
ステップ8:4℃/∞
【0385】
100μl の体積のcDNA反応混合物を1.5mlのシリコン処理微量遠心管に移し、同体積のフェノール:クロロホルム(1:1)およびクロロホルムによって連続的に抽出し、水相を新たな管に移して、37℃で5分間、スピードバック内に置いた。cDNAの制限消化は、74μl dH2O、20μl NEB 10x緩衝液2、2μl 1mg/ml BSA、4μl SfiIを加え、50℃で1時間インキュベートした後、10μl 1M NaCl、4μl NotIを加え、37℃で1時間インキュベートして行った。反応混合物は同体積のフェノール:クロロホルム(1:1)およびクロロホルムを用いて連続的に抽出し、次に1/100x体積の10mg/mlグリコーゲン、1/30x体積の3M酢酸ナトリウム(pH7.5)、2x体積の100%無水エタノールを用いてcDNAを沈殿させ、−80℃で1時間凍結させた。cDNAペレットを70%エタノールで1回戦上司、15分間風乾させた後、5μlのdH2O、1μlの10X NEBリガーゼ緩衝液、SfiI、NotIおよびCIPによる消化により以前調製した4μlのpGD5ベクターDNA中で溶媒和させた。0.5μlのT4 DNAリガーゼを加え、反応混合物を16℃で一晩インキュベートした。10μl dH2Oを連結反応物に加え、0.5μlを用いて電気能力E.コリ DH10B細胞を変換した。一般に、変換連結混合物1μl当たり6〜10個のコロニーが見られた。
【0386】
例12:活性化ベクターのゲノムDNAへの連結とヒト細胞へのトランスフェクション
ゲノムDNAは、発表された手順(Sambrookら、「分子クローニング(Molecular Cloning)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))に従って、ヒト細胞系、HT1080(108細胞)から収集した。単離ゲノムDNAは、不完全消化が行われる条件下でBamHIによって消化した。これは、反応物中にBamHIの量を滴定することによって行える。各反応物は、10μgのゲノムDNAと濃度が0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.62または11.24ユニットのいずれかであるBamHIを含んでいた。37℃で1時間インキュベートした後、反応をフェノール抽出によって停止させ、次いでエタノール沈殿させた。各反応物による消化DNAは、アガロールゲル電気泳動によって分離した。主として10kb〜400kbの範囲のDNAを含む反応物は、活性化ベクターに連結させるために一緒にした。プールされた消化ゲノムDNAは次に、連結緩衝液中のBamHI直線化活性化ベクターに加えた。リガーゼ(Life Technologies,Inc.,40ユニット)を加え、連結反応物を16℃で24時間インキュベートした。連結の後、LIPOFECTIN(R)(Life Technologies,Inc.)を用いて製造者の手順に従って、ゲノムDNA/活性化ベクターをHT1080細胞内にトランスフェクションした。随意に、トランスフェクション前後にHT1080細胞に照射した。細胞に照射する場合、0.1〜200radsの線量範囲が特に有用であることがわかった。トランスフェクションの後、細胞は完全培地で増殖させた。トランスフェクションの36時間後、G418(300μg/ml)を培地に加えた。選択の10〜14日後、薬剤耐性クローンをプールし、膨張させ、収集した。すべてのRNAまたはmRNAは収集細胞から採取した。次に、本明細書で述べた方法を用いて、ベクター活性化遺伝子由来のcDNAを合成および単離した(たとえば上の例8を参照)。
【0387】
例13:BACコンティグクローンの活性化ベクターによる共トランスフェクション
ゲノムライブラリーは、発表された手順(Shizuyaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8794(1992))に従って、pUniBAC(図34A−34B)内に生成した。通常、ゲノムフラグメントのサイズは1kb〜500kbであり、50kb〜500kbであることが好ましい。BACライブラリーは、E.コリ内で伝播させた。トランスフェクション用のプラスミドを調製するために、ライブラリーを12.5μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上にプレーティングした。各150mmプレート上に約1000個のクローンが存在した。増殖および選択の後、LBを加えて各プレートからのコロニーを溶出させ、プールした。各プール(〜10,000クローン)は、1リットルのLB/12.5μg/mlのクロラムフェニコール中で一晩増殖させた。次に、市販キット(Qiagen)を用いて、BACプラスミドを各プールから単離した。
【0388】
精製BACクローンは、クローニング部位の側面にあるBACベクター内の独自の部位を開裂するI−Ppo−Iを用いて消化した。I−Ppo−Iは非常に珍しいカッターであるため、ゲノムDNAインサートの大部分を消化しない。消化の後、直線化ゲノムライブラリークローンは、製造者の指示に従ってLIPOFECTIN(R)(Life Technologies,Inc.)を用いてHT1080細胞に共トランスフェクションされた。簡単には、10μgのBACゲノムDNAをαーMEM(血清なし)中で1μgの直線化pRIG20(図31A−31C)と結合させた。5μgのLIPOFECTIN(R)をDNAに加え、混合物を室温で15分間インキュベートした。次にDNA/LIPOFECTIN(R)混合物を、6ウェルシャーレ内の105HT1080細胞に加えた。細胞はDNA/LIPOFECTIN(R)を用いて血清を含まないαーMEM中で12時間インキュベートし、洗浄し、MEM/10%FBS中に36時間置いた。ベクターおよびゲノムDNAを組込んだ細胞を選択するために、トランスフェクションされた細胞を10cmシャーレに再度プレーティングし、300μg/ml G418の存在下で10日間インキュベートした。薬剤耐性クローンを膨張および収集し、本明細書の例8で述べたように活性化cDNA分子を単離した。
【0389】
例14:活性化ベクターの精製ゲノムDNAへのインビトロ組込および組込生成物の宿主細胞へのトランスフェクション
ゲノムDNAは単離し、発表された手順(Sambrookら、「分子クローニング(Molecular Cloning)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989);Shizuyaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8794(1992))を用いて、細菌性人工染色体、pUniBAC(図34A−34B)内へクローン化した。ゲノムインサートをpUniBAC内に連結した後、プラスミドをE.コリ菌株DH10B(Life Technologies,Inc.)内にトランスフェクションし、テトラサイクリン上で選択した。個々の細菌性クローンを合わせて、約1000のメンバを含むプールに入れた。各プールを1リットルのLB/テトラサイクリン中で飽和するまで増殖させた。ゲノムDNAインサートを含むpUniBACプラスミドは、市販キット(Qiagen)を用いて細菌から単離した。
【0390】
UniBACクローンの各プールでは、2μgのライブラリーを、50ngの活性化ベクターpRIG−Tおよび1ユニットの突然変異Tn5トランスポザーゼ(トランスポザーゼはEpicentre Technologiesから入手可能)によって、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、pUniBACクローンをDH10B細胞内に形質転換し、クロラムフェニコール上で選択した。各プールのすべてのコロニーを合わせ、1リットルのLB/クロラムフェニコール中で増殖させた。プラスミドは、製造者の指示に従ってQiagen Tip−500を用いて収集した。
【0391】
各プールでは、20μgのライブラリーを、製造者の指示に従って30μgのEx−gen500(MBI Fermentas)を用いて、2x106HT1080細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、3μg/mlピューロマイシンを含む培地内に細胞を入れた。ピューロマイシンの存在下で10日間増殖させた後、薬剤耐性クローンをプールし、膨張し、遺伝子発見のために収集した。ベクター活性化遺伝子を単離するために、例8で述べたように、細胞の各プールによるmRNAを単離して、cDNAに変換し、プラスミド内へクローン化した。個々のcDNAクローンは、制限消化および配列決定によって分析した。
【0392】
例15:クローン化ゲノムDNAによるタンパク質発現ライブラリーの作成
ゲノムDNAインサートを含むゲノムライブラリー(平均サイズ100kb)は、例13および14で述べたように、pUniBAC内で作成した(注記:本発明の一部の実施形態において、ゲノムフラグメントは活性化ベクターの直線化部位にクローン化される。その場合、活性化ベクターはYAC、BAC、PACまたはコスミドベースベクターであることが好ましい)。本例では、活性化ベクターpRIG−TPは、例14で述べたように、インビトロ転位を用いたBACゲノムライブラリー中に組込んだ。pRIG−TPを図36に示す。組込の後、ライブラリープラスミドは、E.コリに形質転換され、組込pRIG−TPベクターを含むBACベクターをクロラムフェニコールプレート上で選択した。コロニーをプールし、LB/テトラサイクリン中で飽和するまで増殖させた。BACプラスミドは市販キット(Qiagen)を用いて収集した。
【0393】
各トランスフェクションでは、20ugのBACライブラリーを、製造者の指示に従って30ug Ex−gen 500(MBI Fermentas)を用いて、2x106HT1080細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、3μg/mlピューロマイシンを含む培地内に細胞を入れた。選択の10日後、薬剤耐性をクローンをプールおよび膨張させた。膨張させた薬剤耐性クローンのプールは、凍結、タンパク質生成およびエピソーム増幅のために別個のグループに分割した。
活性化分泌タンパク質を単離および試験するために、培養上澄を収集し、特異性アッセイで使用するまで−80℃で保存した。活性化細胞内タンパク質は(当分野で周知の任意の方法によって調製した)細胞溶解物から収集し、インビトロアッセイで使用した。
【0394】
BACエピソームの複製数を増幅するために、メトトレキサートの濃度を上昇させて細胞を選択した。これらの実験では、メトトレキサートの初期濃度は20nMであった。メトトレキサート濃度は、5μMに耐性の細胞が得られるまで、7日ごとに倍にした。メトトレキサートの各濃度において、細胞の一部を保存およびタンパク質生成のために除去した。非メトトレキサート選択細胞について述べたように、活性化分泌および細胞内タンパク質をこれらの細胞から収集した。
【0395】
理解を確実にする目的で本発明を説明と例によりある程度詳細に十分に記述したが、本発明あるいはその特異的実施態様の範囲に影響を及ぼすことなく、広範で同等の条件、組成、および他のパラメータ範囲内で本発明を修飾あるいは変更して同様のことが実施実施可能であること、そうした修飾あるいは変更が添付のクレーム内に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【0396】
この明細書で述べた刊行物、特許、および特許出願はすべて本発明に関連する当業者の熟練レベルを示しており、これらは、各刊行物、特許、あるいは特許出願が明示的に個々にあるいは個別に引用して本明細書の一部をなすものとされるように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【図1】本明細書に記載した遺伝子活性化事象の概略図。活性化構築物を細胞にトランスフェクトし、宿主細胞染色体のDNA破壊位置に組込ませる。破壊が目的の遺伝子の上流で生じ(例えば、Epo)、適当な活性化構築物が破壊位置に取込まれ、よって、その調節配列が目的の遺伝子に機能的に結合するようになる場合、遺伝子の活性化が生じる。転写およびスプライシングにより、活性化構築物由来および内在性遺伝子由来のエキソン配列を含むキメラRNA分子が産生される。続く翻訳により、目的のタンパク質が産生される。組換え細胞を単離した後、遺伝子発現はさらに遺伝子増幅により増強することができる。
【図2】翻訳されていない活性化構築物の概略図。矢印は、プロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はS/Dにより示される。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図3】翻訳された活性化構築物の概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はS/Dにより示される。翻訳された、シグナルペプチド、エピトープタグ、およびプロテアーゼ開裂配列は、構築物の下の説明に示す。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図4】内在性遺伝子を活性化できる活性化構築物の概略図。
【図5A−5D】pRIG8R1−CD2のヌクレオチド配列(配列番号7)。
【図6A−6C】pRIG8R2−CD2のヌクレオチド配列(配列番号8)。
【図7A−7C】pRIG8R3−CD2のヌクレオチド配列(配列番号9)。
【図8A−8F】ポリ(A)トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示され、リーディングフレームは白色ボックスで表示されている。以下の呼称を使用した。スプライスドナー部位(S/D)、シグナル分泌配列(SP)、エピトープ標識(ET)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)。図8B−8Fに示したベクターでは、Neo遺伝子のすぐ下流のスプライス供与体部位を省略することができる。Neo遺伝子および下流プロモーターの間のスプライス供与体部位を欠失したベクターの場合、Neo転写産物は下流プロモーターの3’
に位置するスプライス供与体部位を利用する。さらに、図8B−8Eに示したベクターのように、下流プロモーターはエキソンを発現させることができる。このエキソンは、存在する場合、任意のリーディングフレーム内のコドンをコードする。複数のベクターを使用して、3つの予想リーディングフレーム内それぞれのコドンを作成できる。
【図9A−9F】単一のプロモーターによって駆動されるポジティブネガティブ選択マーカーを含む、スプライス受容体トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ(A)シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、明細書で述べるように、ポリ(A)シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター3’に配置されることが
ある。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、シグナル分泌配列(SP)、エピトープ標識(ET)、内部リボソームエントリー部位(ires)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)。これらの例において、Neoはポジティブ選択マーカーを表し、HPRTはネガティブ選択マーカーを表す。図9Cおよび9Fに示したベクトルにおいて、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを含む。詳細な説明に記載するように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図10A−10F】各種プロモーターによって駆動されるポジティブネガティブ選択マーカーを含む、スプライス受容体トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ(A)シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、明細書で述べるように、ポリ(A)シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター3’に配置されることがあ
る。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位(S/D)、内部リボソームエントリー部位(ires)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)。図10A−10Fに示すベクターでは、Neoはポジティブ選択マーカーを表し、HPRTはネガティブ選択マーカーを表す。示されているように、図10A−10Fに示したベクターは、Neo遺伝子のスプライス供与体部位3’を含まない;しかし、表示して
いない他のベクターでは、スプライス供与体はNeo遺伝子の3’に位置し、ポジティブ選択マ
ーカーの内在性エキソンへのスプライスを促進する。図10Cおよび10Fに示したベクターでは、エキソンを示す領域が翻訳開始コドンを含む。詳細な説明に記載するように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図11A−10C】双方向活性化ベクターの概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソンは格子ボックスとして示し、スプライス供与体部位はS/Dによって示す。斜線ボックスは、上流プロモーターに動作可能に結合したエキソン配列を示す。これらのベクターのエキソンは未翻訳であるか、本明細書で述べるように開始コドンおよび付加コドンを含むことが理解される。図11B−11Cに記載されたベクターに示されているように、ベクターは選択マーカーを含んでいてもよい。これらのベクターでは、ネオマイシン耐性(Neo)遺伝子が示されている。図11Bでは、ポリアデニル化シグナル(pA)が選択マーカーの下流に位置する。図11Cでは、ポリアデニル化シグナルはベクトルから省略されている。
【図12A−12G】活性化内在性遺伝子からエキソンIを回収するのに有用なベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ(A)シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、詳細な説明で述べるように、ポリ(A)シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター3’に配置されることがある。以下の呼称を使用した。スプライス供与体
部位(S/D)、内部リボソームエントリー部位(ires)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)。これらの例において、Neoはポジティブ選択マーカーを表し、HPRTはネガティブ選択マーカーを表すこれらの例において、エキソンを示す領域は、存在する場合に、翻訳開始コドンを欠失していることも認識される。表示していない他の例では、エキソンを示す領域は翻訳開始コードを含む。さらに、エキソンが翻訳開始コドンを含む場合、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。
【図13】図12A−12Gに示した組込ベクターから生成された2つの転写産物を描いた図。DNA鎖は水平線として描かれている。ベクターDNAは黒線として示されている。内在性ゲノムDNAは灰色の線として示されている。長方形はエキソンを描いている。ベクターコードエキソンは、白色長方形として示されている。S/Dはスプライス供与体部位を示す。組込の後、ベクターコードプロモーターは内在性遺伝子の転写を活性化する。上流プロモーターから生じる転写は、内在性遺伝子による2番目以降のエキソンに結合したベクターコードエキソンを含む、スプライスされたRNA分子を生成する。これに対して、下流プロモーターによる転写によって、エキソンIおよび内在性遺伝子によるそれ以降のエキソンに結合された組込ベクターの下流の配列を含む、転写産物が生成される。
【図14A−14B】pRIG1のヌクレオチド配列(配列番号18)
【図15A−15B】pRIG21bのヌクレオチド配列(配列番号19)
【図16A−16B】pRIG22bのヌクレオチド配列(配列番号20)
【図17A−17G】ポリ(A)トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、シグナル分泌配列(SP)、エピトープ標識(ET)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)ベクタープロモーター#1(VP#1)およびベクタープロモーター#2(VP#2)。図17C−17Gに描いたベクターに示すように、エキソンおよび不対スプライス供与体部位に動作可能に結合したプロモーターは、選択マーカーの上流に配置できる。このエキソンは、存在する場合に、スプライス供与体部位に対応する任意のリーディングフレーム内の開始コドンをコードすることができる。異なるリーディングフレームを持つ遺伝子によるタンパク質発現を活性化するために、スプライス供与体部位に対応した異なるリーディングフレーム内にそれぞれ開始コドンを持つ、3つの独立したベクターを使用できる。
【図18】マルチエキソン内在性遺伝子上流の宿主細胞ゲノムへの組込時の、図17Cによるベクターによって生成された転写産物の説明。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。DNA鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター/細胞ゲノム境界を示している。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)、内在性プロモーター(EP)およびポリアデニル化シグナル(pA)組込の後、ベクタープロモーター#1は、内在性遺伝子による処理(スプライス)済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したNeo遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物#1は内在性遺伝子におるポリ(A)シグナルを含むため、Neo遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物#1に加えて、組込ベクター、転写産物#2と呼ばれる、ベクタープロモーター#2に由来する第2の転写産物を生成する。転写産物#2の構造は、内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の効率よい翻訳を促進する。図17に示すように、ベクターコードエキソン内に代わりのコード情報を含むベクターは、たとえばシグナル配列および/またはエピトープ標識を含む各種キメラタンパク質を生成するのに使用できる。
【図19】二重ポジティブ選択マーカーベクターの例。ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。ポリ(A)シグナルはこれらの例には存在しない。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位(S/D)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、ベクタープロモーター#1、およびベクタープロモーター#2(VP#2)。
【図20A−20B】内在性遺伝子に隣接する宿主細胞ゲノム内に組込みされる、二重ポジティブ選択マーカーベクターによって生成された転写産物の例。図20Aは、マルチエキソン遺伝子付近のベクター組込時に生成された転写産物を示す。図20Bは、単一エキソン遺伝子付近のベクター組込時に転写産物を示す。各水平線はDNA分子を表す。DNA鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター/細胞ゲノム境界を示している。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転子領域は各プロモーターの下流に位置する全ての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)、内在性プロモーター(EP)およびポリアデニル化シグナル(pA)。組込の後、ベクタープロモーター#1は、内在性遺伝子による処理(スプライス)済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したHyg遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物#1は内在性遺伝子におるポリ(A)シグナルを含むため、Hyg遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物#1に加えて、組込ベクター、転写産物#2と呼ばれる、ベクタープロモーター#2に由来する第2の転写産物を生成する。図20Aでは、Neo遺伝子はベクターコードスプライス供与体部位からスプライスされる時に、転写産物#2から除去され、第1の内在性スプライス受容体がベクター組込部位の下流に位置した(すなわちこの例ではエキソンII)。マルチエキソン遺伝子は各エキソン(エキソンIを除く)の5’末端にスプライス受容体部位を含むため、Neo遺伝
子はベクターが付近の、転写的に活性化されたマルチエキソン遺伝子を組込みした細胞中の転写産物#2から除去される。結果として、マルチエキソン遺伝子を活性化した細胞は、G418およびハイグロマイシンによって選択すると消滅することがある。図20Bでは、単一エキソン遺伝子はスプライス受容配列を含んでいないため、Neo遺伝子はスプライシングによって転写産物#2から除去されない。したがって、単一エキソン遺伝子付近に組込みされたベクターを含む細胞は、G418およびハイグロマイシンによる二重選択後も残存する。これらの細胞は、本明細書で述べる方法を使用して、活性化単一エキソン遺伝子を効率よく単離するのに使用できる。
【図21A−21B】ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含む二重トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位(S/D)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)およびベクタープロモーター#3(VP#3)。図21A−21Bに示すベクターでは、Neoはポジティブ選択マーカーを表し、HPRTはネガティブ選択マーカーをあらわす。re21Bでは、第3のプロモーターが選択マーカーの上流に配置されている。この上流プロモーターはエキソンと不対スプライス供与対部位に動作可能に結合されている。本例では、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを含む。本明細書で述べるように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図22】マルチエキソン内在性遺伝子の上流の宿主細胞ゲノムに組込みされた、二重ポジティブ/ネガティブ選択マーカーベクターによって生成された転写産物の例。各水平線はDNA分子を表す。DNA鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター/細胞ゲノム境界を示している。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位(S/D)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)、ベクタープロモーター#3(VP#3)、ポリアデニル化シグナル(pA)および内在性プロモーター(EP)。組込の後、ベクタープロモーター#1は、内在性遺伝子による処理(スプライス)済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したNeo遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物#1は内在性遺伝子におるポリ(A)シグナルを含むため、Neo遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物#1に加えて、組込ベクター、転写産物#2と呼ばれる、ベクタープロモーター#2に由来する第2の転写産物を生成する。本例では、ベクターがマルチエキソン遺伝子の上流に組込した。マルチエキソン遺伝子は各エキソンの5’末端
にスプライス受容体部位を含んでいるため、HPRT遺伝子はベクターが付近の、転写的に活性化されたマルチエキソン遺伝子を組込した細胞中の転写産物#2から除去される。結果として、活性化マルチエキソン遺伝子を含む細胞は、G418および8−アザグアニン6−チオグアニン(AgThg)を用いて選択すると単離できる。したがって、単一エキソン遺伝子付近に組込みされたベクターを含む細胞は、G418およびAgThgによる二重選択後に残存する。これらの細胞は、本明細書に述べる方法を用いて活性化マルチエキソン遺伝子を効率的に単離するために使われる。転写産物#1および#2に加えて、転写産物#3と呼ばれる第3の転写産物が組込ベクターから生成される。ベクタープロモーター#3に由来する転写産物#3は、内在性遺伝子によるタンパク質発現を指示するのに適したエキソン配列を含む。これは、プロモーター#3下流の第1スプライス供与体部位から内在性遺伝子による第1下流スプライス受容体部位までのスプライシングの後に発生する。タンパク質発現の指示に加えて、転写産物#3、および/または転写産物#1および/または#2は、本明細書に述べる方法を用いて遺伝子発見のために単離することができる。
【図23A−23D】マルチプロモーター/活性化エキソンベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印は、プロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。これらのベクター上のエキソンは未翻訳であるか、本明細書で述べる開始コドンおよび付加コドンをふくむことが理解される。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)、ベクタープロモーター#3(VP#3)およびベクタープロモーター#4(VP#4)。それぞれのベクター活性化エキソンは、A、B、CおよびDと呼ぶ。各エキソンは異なる構造を含む場合がある。各活性化エキソンおよびフランキングイントロンを下に示す。しかし、シグナル配列、部分シグナル配列、エピトープ標識、タンパク質、タンパク質の部分およびタンパク質モチーフをコードするエキソンを含め、本明細書で述べる活性化エキソンは、任意の組み合わせおよび/または順序でこれらのベクターで使用されることが理解される。いずれかのエキソンが開始コドンを欠失していることがある。さらにこれらの例には表示していないが、これらのベクターは選択マーカーおよび/または増幅可能マーカーを含むことがある。選択マーカーはポリ(A)シグナルまたはスプライス供与体部位を含むことがある。スプライス供与体部位は、存在する場合、選択マーカーの上流または下流に配置できる。あるいは、選択マーカーは、ポリ(A)シグナルおよび/またはスプライス供与体部位に動作可能に結合されないことがある。
【図24】内在性遺伝子の上流にある宿主細胞ゲノムへの組込時の、マルチプロモーター/活性化エキソンベクターより生成する代謝産物の例。各水平線はDNA分子を表す。DNA鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター/細胞ゲノム境界を示している。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域は各プロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ベクタープロモーター#1(VP#1)、ベクタープロモーター#2(VP#2)、ベクタープロモーター#3(VP#3)、ベクタープロモーター#4(VP#4)、内在性プロモーター(EP)およびポリアデニル化シグナル(pA)。それぞれのベクター活性化エキソンは、A、B、CおよびDと呼ぶ。組込の後、各ベクターコードプロモーターは異なる転写産物を生成することができる。各転写産物は、内在性遺伝子による第1下流スプライス受容体部位に結合された異なる活性化エキソンを含む(この例ではエキソンII)。それぞれの活性化エキソンは、(A)、(B)、(C)または(D)と呼ぶ。内在性エキソンは、(I)、(II)、(III)または(VI)と呼ぶ。一般にコード配列および/またはリーディングフレームは、存在する場合、活性化エキソン間で異なる。本例では4つの活性化エキソンを示すが、活性化エキソンは組込ベクター上に何個存在してもよい。
【図25A−25D】タンパク質−タンパク質相互作用の検出に有用な活性化ベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位(S/D)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)。DNA結合ドメインおよび活性化ドメインは、(スプライス供与体部位に対応する)任意のリーディングフレーム内でコードされ、異なるリーディングフレームを用いて内在性遺伝子を活性化することができる。
【図26】図25に示すベクターを用いたタンパク質−タンパク質相互作用を検出する手法の1つを示す概略図。各水平線はDNA分子を表す。DNA鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター/細胞ゲノム境界を示している。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、結合ドメイン(BD)、活性化ドメイン(AD)、認識配列(RS)およびポリアデニル化シグナル(pA)。結合ドメインベクターは、遺伝子Aと呼ばれる内在性遺伝子の上流で、宿主細胞のゲノム内に組込まれることが示されている。活性化ドメインベクターは、遺伝子Bと呼ばれる内在性遺伝子の上流で、同じ宿主細胞のゲノム内に組込まれることが示されている。どちらのベクターも同じホスト細胞のゲノム内に組込まれる。組込後、各ベクターは結合ドメイン(または場合に応じて、活性化ドメイン)を含む融合タンパク質を生成し、このタンパク質は下流の内在性遺伝子のによってコードされる。結合ドメイン融合タンパク質が活性化ドメイン融合タンパク質と相互作用すると、タンパク質錯体が形成される。この錯体は、細胞に存在するレポーター遺伝子の発現を増加させることができる。
【図27】インビトロおよびインビボ転位に有用な活性化ベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。黒いボックスはトランスポンシグナルを示す。トランスポンシグナルに対する方向性があり、シグナルは転位反応(組込、逆位または欠失)の種類に適した配置に合わせられていることが認識される。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、ピューロマイシン耐性遺伝子(Puro)、ポリ(A)シグナル(pA)、複製由来のEBウイルス(ori.P)。活性化エキソンは、(スプライス供与体部位に対応する)任意のリーディングフレームにおいてアミノ酸をコードし、異なるリーディングフレームを用いて内在性遺伝子を活性化することができる。
【図28】インビトロ転位によるクローン化ゲノムDNAフラグメント内への活性化ベクターの組込を示す概略図。各水平線はDNA分子を表す。クローン化ゲノムDNAは、BACベクター内にある。1本線はゲノムDNAを表し、長方形はBACベクター配列を示す。矢印は、DNA分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ベクター活性化エキソンは白いボックスとして表示されている。クローン化ゲノムフラグメント内でコードされた遺伝子によるエキソンは斜線ボックスとして示される。黒いボックスはトランスポンシグナルを示す。トランスポンシグナルに対する方向性があり、シグナルは転位反応(組込、逆位または欠失)の種類に適した配置に合わせられていることが認識される。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ポリアデニル化シグナル(pA)。ベクターをゲノムフラグメントに組込むために、活性化ベクターをトランスポサーゼの存在下でクローン化ゲノムDNAによって培養した。活性化ベクターをゲノムフラグメントに組込んだ後、プラスミドを適切な真核宿主細胞に直接トランスフェクションして、ベクター組込部位の下流に位置する遺伝子を発現させることができる。あるいは、適切な真核宿主細胞にトランスフェクションするために、BACプラスミドをE.コリに形質転換して大量のプラスミドを生成することができる。
【図29A−29B】pRIG14のヌクレオチド配列。
【図30A−30B】図30A−30B。pRIG19のヌクレオチド配列。
【図31A−31B】図31A−31B。pRIG20のヌクレオチド配列。
【図32A−32B】pRIGad1のヌクレオチド配列。
【図33A−33B】pRIGbd1のヌクレオチド配列。
【図34A−34B】pUniBACのヌクレオチド配列。
【図35A−35B】pRIG221のヌクレオチド配列。
【図36】pRIG−TPの概略図。ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はDNA分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。白いボックスはエキソンを示す。黒いボックスは、トランスポン組換シグナル(Tn5による−Epicentre Technologiesから市販されているインビトロ転位キットと互換性)を表す。以下の呼称を使用した:スプライス供与体部位(S/D)、ピューロマイシン耐性遺伝子(Puro)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、EB核抗原−1複製タンパク質(EBNA−1)、複製由来のEBウイルス(ori.P)、ポリ(A)シグナル(pA)および活性化エキソン(AE)。活性化エキソンは、タンパク質合成を指示可能な、任意のリーディングフレーム内の翻訳開始コドン、部分分泌シグナル配列、全体分泌シグナル配列、エピトープ標識、タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフを含めて、任意の配列を含むことができることが理解される。活性化エキソンは翻訳開始コドンも欠失していることがある。
【図37A−37C】図37A−37C。pRIG−Tのヌクレオチド配列。
Claims (204)
- (a)第1の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第1の転写調節配列と、
(b)第2の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第2の転写調節配列と
を含むベクター構築物。 - 前記第1の転写調節配は前記第2の転写調節配列と同じ向きである請求項1に記載のベクター構築物。
- 前記第1の転写調節配は前記第2の転写調節配列の向きに対して逆向きである請求項1に記載のベクター構築物。
- 前記ベクターは線状である請求項2または請求項3に記載のベクター。
- (a)転写調節配列と
(b)対形成しないスプライスドナー部位と
(c)希な切断制限部位と、
(d)線状化部位と
をこの順で含むベクター構築物。 - (a)転写調節配列と、
(b)希な切断制限部位を含むエキソンと、
(c)対形成しないスプライスドナー部位と、
(d)線状化部位と
をこの順で含むベクター構築物。 - 前記対形成しないスプライスドナー部位と前記線状化部位との間に位置する第2の希な切断制限部位をさらに含む、請求項6に記載のベクター。
- ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第1の転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第2の転写調節配列をさらに含むベクター構築物。
- 前記第1の転写調節配列または前記第2の転写調節配列はプロモーターである、請求項1または請求項8に記載のベクター構築物。
- 前記プロモーターは、CMV即時初期遺伝子プロモーター、SV40T抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項9に記載のベクター構築物。
- 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項5〜7のいずれかに記載のベクター構築物。
- 前記プロモーターは、CMV即時初期遺伝子プロモーター、SV40T抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項11に記載のベクター構築物。
- 前記選択マーカーは、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンD遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性1遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項8に記載のベクター構築物。
- 請求項1、5、6、7および8のいずれかに記載されるベクター構築物を含む真核生物宿主細胞。
- 前記細胞は動物細胞である、請求項14に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記動物細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、環形動物細胞、両生類細胞、爬虫類細胞および魚類細胞からなる群から選択される、請求項15に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記動物細胞は哺乳動物細胞である、請求項15に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項17に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記細胞は植物細胞である、請求項14に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記細胞は真菌細胞である、請求項14に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記真菌細胞は酵母細胞である、請求項20に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記細胞は単離細胞である、請求項15に記載の真核生物宿主細胞。
- 前記ベクター構築物は前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項15に記載の真核生物宿主細胞。
- PCR増幅可能な配列および縮重した3’末端を含むプライマー分子であって、下記の構造、
5’−(dT)a−X−Nb−TTTATT−3’
(式中、aは1〜100のすべての数であり、Xは、長さが約10〜20ヌクレオチドの核酸配列からなるPCR増幅可能な配列であり、Nは任意のヌクレオチドであり、bは0〜6のすべての数である)
を有するプライマー分子。 - 前記PCR増幅可能な配列は1つまたは2つ以上の制限部位を含む、請求項24に記載のプライマー分子。
- aが10〜30のすべての数である、請求項24に記載のプライマー分子。
- 前記プライマー分子の1つまたは2つ以上の塩基に結合した1つまたは2つ以上のハプテン分子を含む、請求項24に記載のプライマー分子。
- 前記ハプテン分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、酵素、リポ多糖、アポトランスフェリン、フェロトランスフェリン、インスリン、サイトカイン、細胞外マトリックスタンパク質、インテグリン、アンキリン、C3bi、フィブリノーゲン、スペクトリン、サイトカイン受容体、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ポリミキシンB、エンドトキシン中和タンパク質(ENP)、酵素特異的基質、プロテインA、プロテインG、細胞表面Fc受容体、抗体特異的抗原、抗体特異的ペプチド、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項27に記載のプライマー分子。
- 前記ハプテン分子はビオチンである、請求項27に記載のプライマー分子。
- 第一鎖cDNAを合成するための方法であって、
(a)請求項24に記載されるプライマーをRNAテンプレート分子とアニーリングして、プライマー−RNA複合体を形成させるステップと、
(b)前記プライマー−RNA複合体の逆転写に好都合な条件のもとで前記プライマー−RNA複合体を逆転写酵素および1つまたは2つ以上のデオキシヌクレオシド分子で処理して、第一鎖cDNAを合成するステップと
を含む方法。 - 対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列と、1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーとを含み、かつ相同な標的化配列を含まないベクター構築物。
- 転写調節配列、増幅可能なマーカーおよびウイルス複製起点を含むベクター構築物。
- 選択マーカー、翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列、分泌シグナル配列、エピトープ標識、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物。
- 翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列、分泌シグナル配列、エピトープ標識、配列特異的プロテアーゼ部位、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物。
- (a)翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列と、
(b)4つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、前記アミノ酸配列は、単独ではシグナルペプチド活性を構成するには不十分であるが、前記核酸配列が内在性遺伝子のエキソンと一緒にされた場合、または前記核酸配列が内在性遺伝子の上流に存在する場合にはシグナルペプチド活性を構成するには十分である核酸配列と、
(c)対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター。 - 前記構築物は1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項33〜35のいずれかに記載にベクター構築物。
- 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項31および33〜35のいずれかに記載のベクター構築物。
- 前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項37に記載のベクター構築物。
- 前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターである、請求項38に記載のベクター構築物。
- 前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求項38に記載のベクター構築物。
- 前記プロモーターは誘導性プロモーターである、請求項38に記載のベクター構築物。
- 請求項31〜35のいずれかに記載されるベクター構築物を含有する細胞。
- 請求項36に記載されるベクター構築物を含有する細胞。
- 前記部ベクター構築物は細胞ゲノムに組み込まれている、請求項42に記
載の細胞。 - 前記部ベクター構築物は細胞ゲノムに組み込まれている、請求項43に記載の細胞。
- 内在性遺伝子が、前記ベクター構築物の前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって前記細胞において過剰発現される、請求項44または45に記載の細胞。
- 前記細胞は単離細胞である、請求項42に記載の細胞。
- 前記細胞は単離細胞である、請求項43に記載の細胞。
- 請求項31〜35のいずれかに記載されるベクター構築物を細胞に導入することを含む宿主細胞の作製方法。
- 内在性の細胞遺伝子またはその一部の発現産物を産生させるための方法であって、
(a)請求項31〜35のいずれかに記載される構築物をゲノム含有細胞に導入するステップと、
(b)前記構築物を前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記内在性遺伝子を前記細胞内で過剰発現させるステップと
を含む方法。 - 前記過剰発現はインビトロで達成される、請求項50に記載の方法。
- 前記過剰発現はインビボで達成される、請求項50に記載の方法。
- 前記発現産物を前記細胞から単離することをさらに含む、請求項50に記載の方法。
- 請求項31〜35のいずれかに記載される構築物で形質転換された細胞の集団を含む細胞ライブラリーであって、前記構築物が前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込まれている細胞ライブラリー。
- 細胞のライブラリーから遺伝子産物を得るための方法であって、請求項54に記載されるライブラリーを前記遺伝子産物の発現についてスクリーニングすること、前記遺伝子産物を過剰発現する細胞を前記ライブラリーから選択すること、および前記選択された細胞から前記遺伝子産物を得ることを含む方法。
- 内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
(a)分泌シグナル配列に機能的に連結された転写調節配列と、対形成しないスプライスドナー配列とを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性の細胞遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性の細胞遺伝子またはその一部の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)前記内在性の細胞遺伝子またはその一部の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項56に記載の方法。
- インビボでの細胞において内在性遺伝子を過剰発現させるための方法であって、
(a)転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。 - 内在性の細胞遺伝子の発現産物をインビボで産生させるための方法であって、
(a)対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクター組み込み物を前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。 - 内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
(a)転写調節配列および1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同組合せによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)前記ベクターおよび前記内在性遺伝子が前記細胞において増幅される条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(f)前記内在性遺伝子の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記ベクターは、前記転写調節配列に機能的に連結されたスプライスドナー部位をさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子またはその一部は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−8、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−14、TGF−β、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、TSH−β、骨増殖因子−2、骨増殖因子−7、腫瘍壊死因子、α−1アンチトリプシン、抗トロンビンIII、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインC、プロテインキナーゼC、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−3、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびCD抗原からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項60または請求項62に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子またはその一部はエリスロポイエチンタンパク質をコードする、請求項60または請求項62に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子またはその一部は成長ホルモンタンパク質をコードする、請求項60または請求項62に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子またはその一部はG−CSFタンパク質をコードする、請求項60または請求項62に記載の方法。
- 前記遺伝子発現産物は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−8、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−14、TGF−β、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、TSH−β、骨増殖因子−2、骨増殖因子−7、腫瘍壊死因子、α−1アンチトリプシン、抗トロンビンIII、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインC、プロテインキナーゼC、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−3、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびCD抗原からなる群から選択されるタンパク質である、請求項60または請求項62に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
- 前記遺伝子発現産物はエリスロポイエチンタンパク質である、請求項60または請求項62に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
- 前記遺伝子発現産物は成長ホルモンタンパク質である、請求項60または請求項62に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
- 前記遺伝子発現産物がG−CSFタンパク質である、請求項60または請求項62に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
- インビボでの細胞において内在性遺伝子を過剰発現させるための方法であって、
(a)転写調節配列および1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。 - 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項56、58〜60、62および71のいずれかに記載の方法。
- 前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項72に記載の方法。
- 前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス即時初期プロモーターである、請求項73に記載の方法。
- 前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求項72に記載の方法。
- 前記プロモーターは誘導性である、請求項72に記載の方法。
- 前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムDNA内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項56、58〜60、62および71のいずれかに記載の方法。
- 前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムDNA内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムDNA内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項50に記載の方法。
- 請求項56、58〜60、62および71のいずれかに記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
- 前記ベクター構築物は線状である、請求項56、58〜60、62および71のいずれかに記載の方法。
- 内在性遺伝子の発現産物を細胞内において産生させるための方法であって、
(a)転写調節配列を含むベクターを少なくとも1つの単離されたゲノム含有細胞に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)前記細胞を血清低下培地で培養するステップと
を含む方法。 - タンパク質の発見方法であって、
(a)転写調節配列を含むベクターを少なくとも1つの単離されたゲノム含有細胞に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させることを可能にする条件のもとにおいて前記細胞を血清低下培地で培養し、それにより細胞馴化培地を作製するステップと、
(d)前記遺伝子またはその一部の発現産物の存在について前記細胞馴化培地をスクリーニングするステップと
を含む方法。 - 前記細胞馴化培地を(d)におけるスクリーニングの前に濃縮することをさらに含む、請求項83に記載の方法。
- 高処理能力アッセイを含む、請求項82〜84のいずれかに記載の方法。
- 内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
(a)転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(e)前記内在性遺伝子の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(f)104細胞/mlである少なくとも10リットルの細胞に等しい細胞塊から前記発現産物を単離するステップと
を含む方法。 - 前記ベクターは1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項82〜84および86のいずれかに記載の方法。
- 前記ベクターは対形成しないスプライスドナー部位をさらに含む、請求項82〜84および86のいずれかに記載の方法。
- in situでの細胞において、その表現型が知られている内在性遺伝子の発現を、前記遺伝子の何らかの配列情報を使用することなく増大させるための方法であって、
(a)増幅可能なマーカー、転写調節配列、および対形成しないスプライスドナー配列を含むベクターを構築するステップと、
(b)複数コピーの前記ベクターを多数の細胞に送達するステップと、
(c)挿入されたベクターと細胞のゲノムとの間の非相同的組換え事象を可能にする条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(d)前記遺伝子の発現が高められている細胞を同定するために、前記内在性遺伝子の表現型に関するアッセイによって前記組換え細胞をスクリーニングするステップと、
(e)前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。 - 前記表現型は特定のタンパク質の産生であり、かつ前記アッセイは前記タンパク質の増大した産生について試験することによって行われる、請求項89に記載の方法。
- 挿入された遺伝子構築物をそのゲノム内に含む単離された細胞であって、前記遺伝子構築物は増幅可能なマーカーおよび転写調節配列を含み、そして前記構築物は遺伝子内または遺伝子の上流領域内に挿入され、かつ前記遺伝子の発現を活性化し、そして前記遺伝子および前記遺伝子の上流領域は前記遺伝子構築物に対するヌクレオチド配列相同性を有しない単離された細胞。
- 前記遺伝子構築物は、エキソンと対形成しないスプライスドナー配列をさらに含む、請求項91に記載の単離された細胞。
- 前記遺伝子は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−8、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン−12、インターロイキン−13、インターロイキン−14、TGF−β、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、TSH−β、骨増殖因子−2、骨増殖因子−7、腫瘍壊死因子、α−1アンチトリプシン、抗トロンビンIII、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインC、プロテインキナーゼC、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−3、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびCD抗原からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項91または請求項92に記載の単離された細胞。
- 前記遺伝子はエリスロポイエチンタンパク質をコードする、請求項91または請求項92に記載の単離された細胞。
- 前記遺伝子は成長ホルモンタンパク質をコードする、請求項91または請求項92に記載の単離された細胞。
- 前記遺伝子はG−CSFタンパク質をコードする、請求項91または請求項92に記載の単離された細胞。
- 遺伝子の発現を高めるための方法であって、
(a)エンハンサー配列および1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーを含有し、かつ遺伝子に特異的な標的化配列を含有しないベクターを細胞のゲノム内に導入するステップと、
(b)内在性遺伝子の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
(c)前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。 - 前記内在性遺伝子の発現が増大している細胞を単離することをさらに含む、請求項97に記載の方法。
- 細胞における内在性遺伝子の発現を高めるための方法であって、
(a)エンハンサー配列および1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(b)前記内在性遺伝子を発現する非相同的組換え細胞をスクリーニングするステップと、ただし、前記遺伝子、ならびに前記エンハンサー配列が活性である前記遺伝子の上流領域および下流領域は前記ベクターに対して相同的ではなく、
(c)前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。 - 挿入された人工遺伝子構築物をそのゲノム内に含む単離された細胞であって、前記遺伝子構築物は、1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーと、前記細胞における遺伝子の発現を高めるのに効果的なエンハンサーとを含み、そして前記遺伝子構築物は遺伝子内あるいは遺伝子の上流領域内または下流領域内に挿入され、かつ前記エンハンサーが活性である前記遺伝子および前記領域は前記遺伝子構築物に対して相同的でない単離された細胞。
- 前記内在性遺伝子は膜貫通タンパク質をコードする、請求項53、56、58〜60、62、71、82〜84および86のいずれかに記載の方法。
- 前記遺伝子は細胞膜貫通タンパク質をコードする、請求項89、97および99のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞を動物に導入する前に前記細胞の単離およびクローニングを行うことをさらに含む、請求項58、59、62および71のいずれかに記載の方法。
- 前記動物は哺乳動物である、請求項58、59、62および71のいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物はヒトである、請求項104に記載の方法。
- 内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
(a)(i)開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と
(ii)シグナル配列と
(iii)対形成しないスプライスドナー部位を伴うエピトープ標識と
を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
(b)前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
(c)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(d)前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。 - 内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
(a)真核生物宿主細胞からゲノムDNAを単離するステップと、
(b)(i)開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と、
(ii)シグナル配列と、
(iii)エピトープ標識と
を含むベクターと、前記単離されたゲノムDNAを一緒にして、ゲノムDNA−ベクター複合体を形成させるステップと、
(c)前記ゲノムDNA−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
(d)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(e)前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。 - 内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
(a)原核生物宿主細胞からcDNAを調製するステップと、
(b)(i)開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列、
(ii)シグナル配列、および
(iii)対形成しないスプライスドナー部位を伴うエピトープ標識
を含むベクターと、前記単離されたcDNAを一緒にして、cDNA−ベクター複合体を形成させるステップと、
(c)前記cDNA−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
(d)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子を前記細胞において過剰発現させるステップと、
(e)前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。 - 前記エピトープ標識を発現する前記細胞を単離することをさらに含む、請求項106〜108のいずれかに記載の方法。
- 前記単離細胞から前記の過剰発現した内在性遺伝子を単離することをさらに含む、請求項109に記載の方法。
- (a)エキソンおよび対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第1のプロモーターと、
(b)ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第2のプロモーターと
を含むベクター。 - 前記の第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは同じ向きで前記ベクター内において存在する、請求項111に記載のベクター。
- 前記ベクターは線状であり、かつ前記選択マーカーは前記第1のプロモーターの3’に位置する、請求項112に記載のベクター。
- 前記ベクターは線状であり、かつ前記選択マーカーは前記対形成しないスプライスドナー部位の5’に位置する、請求項112に記載のベクター。
- 前記エキソンは翻訳開始コドンを有しない、請求項111に記載のベクター。
- 前記エキソンは翻訳開始コドンを含む、請求項111に記載のベクター。
- 前記エキソンは翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含む、請求項111に記載のベクター。
- (a)第1のプロモーターと、
(b)ポジティブ選択マーカーと、
(c)ネガティブ選択マーカーと、
(d)対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター構築物であって、
前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびに前記スプライスドナー部位は、前記ベクターによりコードされるスプライスドナー部位とゲノムによりコードされるスプライスアクセプター部位との間でスプライシングが生じるような方法で前記ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれたとき、前記ポジティブ選択マーカーは活性な形態で発現し、かつ前記ネガティブ選択マーカーは発現しないか、または不活性な形態で発現するかのいずれかである向きで前記ベクター構築物において配向しているベクター構築物。 - 前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは融合遺伝子として存在する、請求項118に記載のベクター。
- 前記ポジティブ選択マーカー、前記ネガティブ選択マーカー、または前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの両方はポリアデニル化部位を有しない、請求項118に記載のベクター。
- 第2の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第2のプロモーターをさらに含む、請求項118に記載のベクター。
- 第1のプロモーターおよび第2のプロモーターを含み、前記の第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは同じ向きで配向しているベクターであって、
(a)前記第2のプロモーターではなく、前記第1のプロモーターが、対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結され、
(b)前記第1のプロモーターまたは前記第2のプロモーターのいずれの下流にもポリアデニル化シグナルを含まない
ことを特徴とするベクター。 - 前記ベクターは線状であり、かつ前記第2のプロモーターは前記第1のプロモーターの3’に位置する、請求項112に記載のベクター。
- (a)対形成しないスプライスドナー部位を含有する第1の選択マーカーに機能的に連結された第1のプロモーターと、
(b)第2の選択マーカーに機能的に連結された第2のプロモーターと
を含むベクターであって、
前記の第1の選択マーカーまたは第2の選択マーカーはいずれもポリアデニル化シグナルを含有しないベクター。 - 前記の第1の選択マーカーおよび第2の選択マーカーはポジティブ選択マーカーである、請求項124に記載のベクター。
- 前記第1の選択マーカーは前記第2の選択マーカーの上流に位置する、請求項124に記載のベクター。
- (a)第1のエキソンおよび第1の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第1のプロモーターと、
(b)第2のエキソンおよび第2の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第2のプロモーターと
を含むベクターであって、
前記第1のエキソンのヌクレオチド配列は前記第2のエキソンのヌクレオチド配列と異なるベクター。 - 前記の第1のエキソンおよび第2のエキソンはそれぞれ、翻訳開始コドンと、停止コドンで終了しないオープンリーディングフレームとを含む、請求項127に記載のベクター。
- 前記第1のエキソン、前記第2のエキソン、または前記の第1のエキソンおよび第2のエキソンの両方は翻訳開始コドンを有しない、請求項127に記載のベクター。
- (a)ポジティブ選択マーカーに機能的に連結された第1のプロモーターと、
(b)ネガティブ選択マーカーに機能的に連結された第2のプロモーターと、
(c)対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター構築物であって、
前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびに前記スプライスドナー部位は、ゲノム内の内在性遺伝子が転写的に活性化される方法で前記ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれたとき、前記ポジティブ選択マーカーは活性な形態で発現し、かつ前記ネガティブ選択マーカーは発現しないか、または不活性な形態で発現するかのいずれかである向きで前記ベクター構築物において配向しているベクター構築物。 - 第2の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第3のプロモーターをさらに含む、請求項130に記載のベクター構築物。
- 1つまたは2つ以上の転位シグナルをさらに含む、請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載のベクター。
- 1つまたは2つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載のベクター。
- 1つまたは2つ以上のウイルス複製起点をさらに含む、請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載のベクター。
- 1つまたは2つ以上のウイルス複製因子遺伝子をさらに含む、請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載のベクター。
- 前記増幅可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ、およびカルバミルリン酸シンターゼからなる群から選択される、請求項133に記載のベクター。
- 前記ウイルス複製起点は、エプスタインバールウイルスのoriPおよびSV40のoriからなる群から選択される、請求項134に記載のベクター。
- ゲノムDNAをさらに含む、請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載のベクター。
- 請求項31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項132に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項133に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項134に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項135に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 請求項138に記載されるベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞は単離細胞である、請求項139に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は単離細胞である、請求項140〜144のいずれかに記載の宿主細胞。
- 請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 請求項132に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 請求項133に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 請求項134に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 請求項135に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 請求項138に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
- 細胞内における内在性遺伝子を活性化させるための方法であって、
(a)請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載されるベクターでゲノム含有細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含み、
前記組込みにより、前記細胞のゲノム内の内在性遺伝子の活性化がもたらされる方法。 - 遺伝子を同定するための方法であって、
(a)請求項1、5〜7、8、31、32、35、111、118、122、124、127、130および131のいずれかに記載されるベクターで多数のゲノム含有細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記宿主細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組み込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(c)前記ベクターが前記細胞のゲノム内に組み込まれた細胞を選択するステップと、
(d)前記細胞からRNAを単離するステップと、
(e)前記単離されたRNAからcDNAを作製するステップと、
(f)1つまたは2つ以上のヌクレオチド配列を含有する1つまたは2つ以上のcDNA分子を前記ベクターから単離することによって前記cDNA内の遺伝子を同定するステップと
を含む方法。 - (f)における前記同定は、前記cDNAを前記ベクターにハイブリダイゼーションすることによって達成される、請求項154に記載の方法。
- (f)における前記同定は、前記cDNAを配列決定し、そして前記cDNAのヌクレオチド配列を前記ベクターのヌクレオチド配列と比較することによって達成させる、請求項154に記載の方法。
- 前記対形成しないスプライスドナー部位は、前記第1の選択マーカーの上流または前記第1の選択マーカーの内部に位置し、その結果、前記ベクターが真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、前記対形成しないスプライスドナー部位からゲノムコードのスプライスアクセプター部位へのスプライシングが生じたとき、前記第1の選択マーカーは不活性な形態で発現するか、またか全く発現しない、請求項124に記載のベクター。
- 単一エキソン遺伝子が活性化された細胞を単離するための方法であって、
(a)請求項157に記載されるベクターで多数のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(c)前記の第1の選択マーカーおよび第2の選択マーカーがその活性な形態で発現する細胞を選択するステップと
を含む方法。 - (a)前記細胞からRNAを単離するステップと、
(b)前記単離されたRNAからcDNAを作製するステップと、
(c)前記cDNAから単一エキソン遺伝子を単離するステップと
をさらに含む、請求項158に記載の方法。 - 遺伝子のエキソンIを単離するための方法であって、
(a)請求項111、112、114、122、124および127のいずれかに記載されるベクターで1つまたは2つ以上のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(c)前記ベクターによって、1つまたは2つ以上のエキソンを含有する内在性遺伝子が転写的に活性化された細胞を選択するステップと、
(d)前記選択された細胞からRNAを単離するステップと、
(e)前記単離されたRNAからcDNAを作製するステップと、
(f)前記内在性遺伝子に由来する第2のエキソンにスプラシングされた前記ベクターに由来する第1のエキソンを含有するcDNA分子を回収し、それによって1つまたは2つ以上のベクターエキソン標識cDNA分子を得るステップと、
(g)前記ベクターエキソン標識cDNA分子を使用して、エキソンIを含有する活性化された内在性遺伝子を回収するステップと
を含む方法。 - 遺伝子のエキソンIを含有する転写物を発現させるための方法であって、
(a)請求項111、112、114、122、124および127のいずれかに記載されるベクターで1つまたは2つ以上のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
(c)内在性遺伝子に由来するエキソンIを含有する転写物の発現に好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 遺伝子産物を産生させるための方法であって、
(a)少なくとも1つの遺伝子を含有するゲノムDNAを真核生物細胞から単離するステップと、
(b)1つまたは2つ以上の転位シグナル、1つまたは2つ以上のプロモーター、1つまたは2つ以上のエキソン、および1つまたは2つ以上の対形成しないスプライスドナー部位を含むベクターを、前記単離されたゲノムDNAにインビトロ転位によって挿入し、それによってゲノムDNA−ベクター複合体を形成させるステップと、
(c)前記ゲノムDNA−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
(d)前記遺伝子の発現に好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 前記遺伝子の発現産物を単離することをさらに含む、請求項162に記載の方法。
- 内在性の細胞ゲノム遺伝子によってコードされる遺伝子産物を産生させるための方法であって、
(a)少なくとも1つの遺伝子を含有するゲノムDNAを真核生物細胞から単離するステップと、
(b)請求項111、112、114、122、124および127のいずれかに記載されるベクターを、前記単離されたゲノムDNA内に挿入するか、そうでなければ前記単離されたゲノムDNAと一緒にし、それによってベクター−ゲノムDNA複合体を作製するステップと、
(c)前記ベクター−ゲノムDNA複合体を好適な真核生物宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
(d)前記ベクター−ゲノムDNA複合体に含有される前記ベクターによってコードされる1つまたは2つ以上の遺伝子の転写を生じさせるのに好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。 - (e)前記転写によって産生されるRNAを前記宿主細胞から単離するステップと、
(f)前記単離されたRNAから1つまたは2つ以上のcDNA分子を作製するステップと、
(g)前記cDNAの5’末端にベクター配列を含有する1つまたは2つ以上のcDNA分子を回収し、それによって前記遺伝子を単離するステップと、
をさらに含む、請求項164に記載の方法。 - 前記ベクターは1つまたは2つ以上の転位シグナルをさらに含み、そして前記ベクターは前記単離されたゲノムDNAにインビトロ転位によって組み込まれる、請求項164に記載の方法。
- 前記単離されたゲノムDNAはクローニングベクターに存在する、請求項164に記載の方法。
- タンパク質を産生させるための方法であって、
(a)ゲノムDNAを1つまたは2つ以上の細胞から単離するステップと、
(b)請求項111、112、114、122、124および127のいずれかに記載されるベクターを、前記単離されたゲノムDNA内に挿入するか、そうでなければ前記単離されたゲノムDNAと一緒にし、それによってベクター−ゲノムDNA複合体を作製するステップと、
(c)前記ベクター−ゲノムDNA複合体を好適な宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
(d)前記ベクター−ゲノムDNA複合体に含有される前記ゲノムDNAからのタンパク質発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - タンパク質を産生させるための方法であって、
(a)ゲノムDNAを1つまたは2つ以上の細胞から単離するステップと、
(b)1つまたは2以上の転位シグナルと、エキソン−対形成しないスプライスドナー複合体に機能的に連結された転写調節配列とを含むベクターを、前記単離されたゲノムDNA内に転位によって組み込ませ、それによってベクター−ゲノムDNA複合体を形成させるステップと、
(c)前記ベクター−ゲノムDNA複合体を好適な宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
(d)前記ベクター−ゲノムDNA複合体に含有される前記ゲノムDNAからのタンパク質発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 遺伝子を発現させるための方法であって、
(a)1つまたは2つ以上の遺伝子を含有するゲノムDNAを1つまたは2つ以上の真核生物細胞から単離するステップと、
(b)(i)選択マーカーと
(ii)翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列と、
(iii)分泌シグナル配列と、
(iv)エピトープ標識と、
(v)対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクターと、前記単離されたゲノムDNAとを一緒にし、それによってベクター−ゲノムDNA複合体を作製するステップと、
(c)前記ベクター−ゲノムDNA複合体を細胞に導入するステップと、
(d)前記ベクター−ゲノムDNA複合体を含有する細胞を選択するステップと、
(e)前記ベクター−ゲノムDNA複合体に含有される遺伝子の発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 前記宿主細胞は、タンパク質発現を生じさせるのに好適な条件で培養される前に、その途中で、またはその後で、前記トランスフェクションされたベクター−ゲノムDNA複合体を含有する細胞について選択される、請求項168に記載の方法。
- 前記ベクターは選択マーカーをさらに含み、そして前記宿主細胞は、タンパク質または遺伝子の発現を生じさせるのに好適な条件で培養される前に、前記トランスフェクションされたベクター−ゲノムDNA複合体を含有する細胞について選択される、請求項169に記載の方法。
- 前記クローニングベクターは、BAC、YAC、PAC、コスミド、ファージおよびプラスミドからなる群から選択される、請求項167に記載の方法。
- 前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項164に記載の方法。
- 請求項168に記載される方法により産生されるタンパク質。
- 請求項170〜172のいずれかに記載される方法により産生されるタンパク質。
- 請求項174に記載される方法により産生されるタンパク質。
- タンパク質を発現させるための方法であって、
(a)(i)翻訳開始コドンを有しないか、あるいは翻訳開始コドンと、停止コドンによって終了していないオープンリーディングフレームとをコードするかのいずれかである異種のエキソンと、
(ii)異種のスプライスドナー部位と、
(iii)遺伝子またはその一部をコードするゲノムDNAフラグメントと
(iv)1つまたは2つ以上の選択マーカーと
に機能的に連結された異種のプロモーターを含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションするステップと、
(b)前記トランスフェクションされたベクターを含有する細胞を選択するステップと、
(c)前記ベクターからのタンパク質発現に好適な条件のもとで、前記トランスフェクションされた宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。 - 前記ベクターはウイルス複製起点をさらに含む、請求項178に記載の方法。
- 前記ウイルス複製起点はエプスタインバールウイルスのoriPである、請求項179に記載の方法。
- (a)異種のプロモーターと、
(b)異種のエキソンと、
(c)異種のスプライスドナー部位と、
(d)遺伝子またはその一部をコードするゲノムフラグメントと、
(e)1つまたは2つ以上の選択マーカーと、
(f)1つまたは2つ以上のウイルス複製起点と
を含むベクターであって、
前記異種のエキソンは翻訳開始コドンを有しないか、あるいは翻訳開始コドンと、停止コドンによって終了していないオープンリーディングフレームとをコードしているかのいずれかであり、そして前記ベクターが宿主細胞に導入されたときに前記ゲノムフラグメントによりコードされる前記遺伝子またはその一部からタンパク質が発現するように、前記ゲノムフラグメントが、前記異種のプロモーター、前記エキソンおよびスプライスドナー部位の下流に配向しているベクター。 - 前記選択マーカーはポリアデニル化シグナルを有しない、請求項181に記載のベクター。
- 1つまたは2つ以上のウイルス複製タンパク質をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子をさらに含む、請求項181に記載のベクター。
- 増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項181に記載のベクター。
- 請求項181〜184のいずれかに記載されるベクターを含む細胞。
- 前記細胞は単離細胞である、請求項185に記載の細胞。
- 前記第1の転写調節配列は、前記ベクター構築物において、前記第2の転写調節配列と同じ向きである、請求項8に記載のベクター構築物。
- 前記ポジティブ選択マーカーは、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンD遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性1遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子およびアデノシンデアミナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項118または130に記載のベクター構築物。
- 前記ネガティブ選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子およびジフテリアトキシン遺伝子からなる群から選択される、請求項118または130に記載のベクター構築物。
- 前記ネガティブ選択マーカーは前記ポジティブ選択マーカーの上流に位置する、請求項130に記載のベクター。
- タンパク質を安定的に発現する宿主細胞であって、プロモーター、エキソン/スプライスドナー複合体、および前記タンパク質またはその一部をコードするゲノムフラグメントを含むベクターを含み、前記プロモーターおよびエキソン/スプライスドナー複合体は前記ゲノムフラグメントに対して異種である宿主細胞。
- 前記ベクターは前記細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項191に記載の宿主細胞。
- 前記ベクターはウイルス複製起点をさらに含み、エピソームとして前記宿主細胞内に維持される、請求項191に記載の宿主細胞。
- 前記ベクターは1つまたは2つ以上の選択マーカーをさらに含む、請求項190または請求項192に記載の細胞。
- 前記ウイルス複製起点はエプスタインバールウイルスのoriPである、請求項192に記載の細胞。
- 内在性遺伝子からの発現を活性化するための方法であって、
(a)内在性遺伝子を活性化するのに好適なベクターを染色体含有宿主細胞に導入するステップと、
(b)前記ベクターの導入前または前記ベクターの導入後において前記宿主細胞の染色体に複数のDNA切断を導入し得る薬剤で前記細胞を処理するステップと、
(c)前記ベクターと前記内在性遺伝子との間において機能的な連結が形成されるように前記ベクターを前記DNA切断部に組み込ませ、それにより、前記内在性遺伝子が1つまたは2つ以上のベクターコードのヌクレオチド配列によって活性化されるステップと
を含む方法。 - (d)における前記活性化が、前記宿主細胞を単離して、前記内在性遺伝子の活性化に好都合な条件のもとで前記宿主細胞を培養することによって達成される、請求項196に記載の方法。
- (a)遺伝子に機能的に連結された転写調節配列と、
(b)ウイルス複製起点と、
(c)増幅可能なマーカーと
を含むベクター。 - 遺伝子の発現を増大させるための方法であって、
(a)エピソームとして宿主細胞内に維持される請求項198に記載のベクターを宿主細胞内に導入するステップと、
(b)前記増幅可能なマーカーおよび前記遺伝子の増大した発現について選択するステップと
を含む方法。 - 対形成しない細胞転写物分子に由来するcDNA分子を切断するための方法であって、
(a)請求項5または請求項7に記載されるベクターを、1つまたは2つ以上の真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、
(b)前記転写調節配列からの発現に好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと、
(c)前記宿主細胞からRNAを単離するステップと、
(d)前記単離されたRNAからcDNAを作製するステップと、
(e)前記希な切断制限部位で切断する酵素により前記cDNAを消化するステップと
を含む方法。 - 薬物を発見するための方法であって、
(a)ベクターを真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、ここで、前記ベクターの組込みにより、前記宿主細胞における内在性遺伝子の発現が活性化され、
(b)前記活性化された遺伝子の発現に好都合な条件のもとで前記細胞を培養し、それにより、前記活性化された遺伝子の遺伝子産物を産生させるステップと、
(c)薬物の活性についてスクリーニングされる1つまたは2つ以上の試験化合物により前記細胞を処理するステップと、
(d)前記遺伝子産物と反応するか、または前記遺伝子産物によって誘導される細胞表現型に影響を及ぼす前記1つまたは2つ以上の試験化合物の能力を決定するステップと
を含む方法。 - 薬物を発見するための方法であって、
(a)ベクターを真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、ここで、前記ベクターの組込みにより、前記宿主細胞における内在性遺伝子の発現が活性化され、
(b)前記活性化された遺伝子の遺伝子産物の生成に好都合な条件のもとで、血清低下培地で前記細胞を培養し、それによって、前記遺伝子産物を含有する細胞馴化培地を作製するステップと、
(c)1つまたは2つ以上の試験化合物を、前記細胞馴化培地における前記遺伝子産物と相互作用する前記試験化合物の能力を決定することによって薬物の活性についてスクリーニングするステップと
を含む方法。 - (c)における前記スクリーニングの前に前記細胞馴化培地を濃縮することをさらに含む、請求項202に記載の方法。
- (c)における前記スクリーニングの前に前記細胞馴化培地を濃縮することをさらに含む、請求項202に記載の方法。
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