DE60036297T2 - Bedingtes 'gene trapping'-konstrukt zur unterbrechung von genen - Google Patents

Bedingtes 'gene trapping'-konstrukt zur unterbrechung von genen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Genfallen-Konstrukt, das in Genen konditionale Mutationen verursacht, und die Verwendung dieses Genfallen-Konstrukts zur Inaktivierung aller zellulären Gene durch Mutation. Darüber hinaus betrifft die Erfindung eine Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, die das oben erwähnte Konstrukt enthält. Die Zelle ist zur Identifikation und/oder Isolierung von Genen und zur Bildung von transgenen Organismen zur Untersuchung der Genfunktion in verschiedenen Entwicklungsstufen einschließlich eines Erwachsenen brauchbar.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Seit einigen Jahren wird die gezielte Mutagenese in totipotenten murinen embryonischen Stammzellen (ES) zur Inaktivierung von Genen verwendet, für die geklonte Sequenzen verfügbar waren (Capecchi, The new mouse genetics: altering the genome by gene targeting, Trends in Genetics, 5, 70–76 (1989)). Weil ES-Zellen in vitro eingeführte Mutationen in vivo an transgenen Nachwuchs weitergeben können, ist es möglich, die Folgen einer Genzerstörung im Kontext des gesamten Organismus zu analysieren. So wurden mit dieser Technik zahlreiche Mäusestämme mit funktionell inaktivierten Genen ("Knockout-Mäuse") geschaffen und verwendet, um die biologische Funktion einer Vielzahl von Genen zu untersuchen. Für eine gezielte Mutagenese ist jedoch ein detailliertes Wissen der Genstruktur und -organisation sowie seine physikalische Isolierung in einem Klonierungsvektor erforderlich. Darüber hinaus muss der Zielvektor, der die Gene von Interesse enthält, in ES-Zellen transduziert werden, um mutierte ES-Klone zu isolieren, bei denen ein normales Allel mittels einer homologen Rekombination durch ein mutiertes Allel ersetzt ist (Capecchi 1989). Insgesamt ist die Erzeugung von mutierten Mausstämmen durch dieses Verfahren zeitaufwändig, arbeitsaufwändig, teuer und ineffizient, weil damit jeweils nur ein Gen gehandhabt werden kann (Koller und Smithies, Altering genes in animals by gene targeting. Ann. Rev. Immunol. 10, 705–730 (1992)). Noch wichtiger enthalten Mausmutanten, die mittels dieses Verfahrens erzeugt sind (auch als "herkömmliche, komplette oder klassische Mutanten" bekannt) während ihres gesamten Lebens das inaktivierte Gen in allen Zellen und Geweben.
  • Bei einem verfeinerten Verfahren der gezielten Mutagenese, das als konditionale Mutagenese bezeichnet wird, wird ein ortsspezifisches Rekombinationssystem eingesetzt (z.B. Cre/loxP oder Flp/frt – Sauer und Henderson, Site-specific recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5166–5170 (1988); Senecoff et al., DNA recognition by the FLP recombinase of the yeast 2m plasmid: a mutational analysis of the FLP binding site, J. Mol. Biol., 201, 405–421 (1988)), das eine zeitlich und/oder räumlich begrenzte Inaktivierung von Zielgenen ermöglicht (Rajewsky et al., Conditional gene targeting, J. Clin. Invest., 98, 600–603 (1996)). Die Bildung von konditionalen Mausmutanten ist die Erzeugung von zwei Mausstämmen, d.h. dem Rekombinase-Erkennungsstamm und dem Rekombinase exprimierenden Stamm, erforderlich. Der Rekombinase-Erkennungsstamm wird durch eine oben beschriebene homologe Rekombination in ES-Zellen erzeugt, außer, dass das (die) Ziel-Exon(e) von zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen (hiernach "RRS"), z.B. loxP oder frt, flankiert ist (sind). Weil die RRS in Introns bleiben, stören sie die Genexpression nicht. Der Rekombinase exprimierende Stamm enthält ein Rekombinase-Transgen (z.B. Cre, Flp), dessen Expression entweder auf bestimmte Zellen und Gewebe beschränkt ist oder durch externe Mittel induzierbar ist. Durch eine Kreuzung des Rekombinase-Erkennungsstamms mit dem Rekombinase exprimierenden Stamm werden die RRS-flankierten Exone auf eine vorbeschriebene temporäre und/oder räumlich eingeschränkte Weise vom doppelt transgenen Nachwuchs deletiert. Somit ermöglicht das Verfahren die temporale Analyse der Genfunktion in bestimmten Zellen und Geweben von andernfalls weit exprimierten Genen. Darüber hinaus ermöglicht es die Analyse der Genfunktion im erwachsenen Organismus durch eine Umgehung der embryonalen Letalität, die oft die Folge einer Geninaktivierung ist. Für die pharmazeutische Forschung mit dem Ziel, die Brauchbarkeit von Genen und deren Produkten als Ziele zur Entwicklung von Medikamenten zu validieren, stellen induzierbare Mutationen ein hervorragendes genetisches Werkzeug dar. Wie im Fall von herkömmlichen Mutanten ist die Erzeugung von konditionalen Mutanten ein zeitaufwändiger und arbeitsintensiver Vorgang, der für jedes Gen einzeln durchgeführt werden muss.
  • Um einige der Probleme anzugehen, die bei der gezielten Mutagenese auftreten, sind mehrere Typen von Vektoren entwickelt worden, die als "Genfallen" bezeichnet werden, die ein promotorfreies Reportergen in hauptsächlich zufällige Chromosomenorte einschließlich transkriptionsaktiver Regionen insertieren (rezensiert in Hill und Wurst, Mutagenic strategies to dissect mammalian development Curr. Topics. Dev. Biol. 28, 181–206 (1993); Gossler und Zachgo, Gene and enhancer trap screens in ES cell chimaeras, in: Gene targeting – a practical approach (A. L. Joyner, Ed.), Oxford University Press, Oxford (1993)). Integrationen in die Exone (Exonfallen) oder Introne (Intronfallen) eines zellulären Gens zerstören das Gen und führen im Allgemeinen zu seiner funktionellen Inaktivierung. Darüber hinaus erzeugt die Genfalle eine molekulare Markierung, wodurch ein Gen, das mit einer speziellen Funktion verbunden ist, geklont wird. Somit ist das Gen-Trapping anders als die homologe Rekombination nicht auf Gene beschränkt, für die geklonte Sequenzen erhältlich sind, und es kann verwendet werden, um Gene zu zerstören, die sich im Genom befinden. In den meisten Fällen werden Genfallen als Retroviren transduziert, obwohl elektroporierte DNA auch verwendet wird. Retroviren haben den Vorteil, dass sie mittels eines präzisen Mechanismus in das Genom integriert werden und keine Beschädigung der benachbarten DNA verursachen. Darüber hinaus integrieren Retroviren anders als elektroporierte DNA fast nie hintereinander. Weil Genfallen-Integrationen im Genom statistisch verteilt sind, ist es möglich, mit einer begrenzten Anzahl von Experimenten Mutationen in einer großen Anzahl von Genen zu erzeugen (Zambrowicz et al., Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embryonic stem cells, Nature 392, 608–611 (1998)). Im Prinzip ermöglicht dies die Mutationsanalyse aller Gene innerhalb eines Genoms einfach durch die Erzeugung einer Integrationsbibliothek, bei der jedes einzelne Gen durch eine Genfalle zerstört wird. In den meisten Fällen werden murine embryonische Stammzellen (ES) als Ziele für Genfallen-Integrationen verwendet, weil Mutantenklone leicht in vitro erhalten und auf transgenen Nachwuchs in vivo übertragen werden können (Gossler et al., Mouse embryonic stem cells and reporter constructs to detect developmentally regulated genes, Science, 244, 463–465 (1989); Friedrich und Soriano, Promoter traps in embryonic stem cells: a genetic screen to identify and mutate developmentally genes in mice, Genes & Developmen, 5, 1513–1523 (1991); Skarnes et al., A gene trag approach in mouse embryonic stem cells: the lacZ reporter is activated by splicing, reflects endogenous gene expression, and is mutagenic in mice, Genes Dev. 6, 903–918 (1992); von Melchner et al., Selective disruption of genes expressed in totipotent embryonal stem cells, Genes & Dev 6, 919–927 (1992)). Mit dieser Technik erhaltene Mausmutanten entwickeln oft einen "Verlust des Funktionsphänotyps", der manchmal die biologische Signifikanz eines bestimmten Gens offenbart (Evans et al., Gene trapping and functional genomics, Trends in Genetics, 13, 370–374 (1997)). Alle der obigen Genfallen induzieren jedoch eine irreversible Inaktivierung ihres Ziels. Folglich ist eine Mausmutante, die aus einem ES-Zellklon erzeugt ist, nicht von einer Knock-out-Maus verschieden, die durch ein herkömmliches Gen-Targeting erhalten wird.
  • Kürzlich beschrieb WO 99/50426 eine konditionale Mutagenese durch die Verwendung einer Genfallenkassette, die zur Erzeugung von Mutationen (Genom-Umlagerung) fähig war, die temporär ein- und ausgeschaltet werden kann. Diese Genfallenkassetten umfassen zweckmäßig angeordnete frt- oder loxP-Rekombinasestellen, die – wenn sie Flp bzw. Cre ausgesetzt werden, die Genfallenkassette entfernen oder "umdrehen" (d.h. invertieren) und dadurch die Genom-Umlagerungen bewirken. Herkömmliche ortsspezifische Rekombinasen wie Flp und Cre, die in den obigen Dokumenten verwendet werden, rekombinieren jedoch reversibel zwischen identischen Erkennungsstellen (wie zwei loxP- oder FRT-Stellen). Bei einer konditionalen Genfallen-Einstellung, bei der die Rekombinase ein "Umdrehen" der Genfallenkassette bewirkt, wie in den obigen Dokumenten beschrieben ist, würde dies bedeuten, dass gleiche Mengen an Sense- und Antisense-Produkten erzeugt würden, wodurch eine Hälfte der Zielallel, die die Genfalle tragen, inaktiviert würden, während die andere Hälfte immer noch eine funktionelle Konfiguration hätte. Weil die meisten Gene des Säugergeoms rezessiv sind, ist die Inaktivierung eines Allels normalerweise nicht ausreichend, um einen beobachtbaren Phänotypen zu erzeugen. Daher ist es wichtig, das Gleichgewicht der Rekombinasereaktion in Richtung der Genfalleninversion zu verschieben, die eine Geninaktivierung bewirkt.
  • Hinsichtlich des oben erwähnten Cre/loxP-Rekombinationssystems ist bekannt, dass die Rekombination zwischen den Mutanten-loxP-Erkennungsstellen (z.B. die einfachen Mutanten-Erkennungsstellen lox66 und lox71; Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)) eine doppelte Mutanten- und Wildtyp-loxP-Stelle erzeugt (siehe SEQ ID Nr.: 4 und 5), jeweils auf einer Seite der invertierten DNA, erzeugt. Weil die letztere Kombination von loxP-Stellen von der Cre-Rekombinase weniger effektiv erkannt wird, ist die Inversion meistens unidirektional. Das obige lox66/lox71-System wird von Araki et al., Cell. Mol. Biol. 45(5), 737–750 (Juli 1999) in einem zweistufigen Genfallensystem verwendet. In einem ersten Schritt wird ein Genfallenvektor (mit einem funktionalen Gen, das von lox-Stellen in derselben Richtung flankiert ist) in ein endogenes Gen integriert. In einem zweiten Schritt wird das funktionale Gen mittels einer Cre-vermittelten Rekombination/Integration durch ein zweites funktionales Gen ersetzt.
  • In den unten aufgeführten Literaturstellen wurde zusätzlich zum obigen Cre/Mutanten-loxP-System angenommen, dass Rekombinasen, die normalerweise nichtidentische RRS erkennen, wie die von Phagen stammenden Integrasen der Integrase-(Nunes-Düby et al., Nucleic Acid Res. 26, 391–406 (1998)) oder Resolvasen-(Thorpe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)) Familie von Rekombinasen für eine unidirektionale Inversion verwendet werden kann.
  • Von den von Phagen stammenden Integrasen ist die Phage-λ-codierte Integrase (λInt) das am umfassendsten charakterisierte System (Übersichten: siehe Craig, Annu. Rev. Genet., 22, 77–105 (1988); Landy, Annu. Rev. Biochem, 58, 913–949 (1989); Landy, Curr. Op. Genet. Dev., 3, 699–707 (1993); Sadowsky, FASER J., 7, 9–17 (1993); Hallet und Sherratt, FEMS Microb. Rev., 21, 157–178 (1997)). Eine integrative Rekombination erfolgt zwischen einer im Phagen-Genom vorhandenen attP-Anhaftungsstelle und einer im Bakterien-Genom vorhandenen attB-Anhaftungsstelle. Wenn beide Stellen im selben DNA-Molekül in derselben Orientierung angeordnet werden wie derjenigen, die zur Integration verwendet wurde, wird das dazwischenliegende DNA-Segment aus dem parentalen Molekül deletiert. Im Gegensatz beispielsweise zum loxP/Cre-System sind attP- und attB-Stellen nichtidentisch, weisen aber eine bestimmte gemeinsame Sequenzidentität in der λ-Int bindenden Kernregion auf. Eine variierende Anzahl von Erkennungssequenzen, die die Kernregion flankiert, dient als Bindungsstellen für die akzessorischen Proteine IHF, Fis oder Xis. Bei einer integrativen Rekombination zwischen einer attP- und einer attB-Stelle werden zwei neue Stellen mit der Bezeichnung attR und attL erzeugt. Weil diese Stellen nur dann wieder zurück zu einem attP/attB-Paar zur exzidierenden Rekombination rekombiniert werden, wenn das Xis-Protein vorhanden ist, ist das λ-Int-System in dessen Abwesenheit unidirektional.
  • Dass das λ-Int-System das akzessorische IHF-Protein auch für integrative Rekombinationen benötigt, kompliziert seine biotechnologische Anwendung in Säugerzellen; die Verwendung von IHF-unabhängigen Mutanten-λ-Int-Formen in humanen Zellen ist jedoch kürzlich beschrieben worden (Lorbach et al., J. Mol. Biol. 296, 1175–1181 (2000)). Im Gegensatz zu λ-Int ist die Integrase des Phagen ΦC31 (hiernach C31-Int) dahingehend beschrieben worden, dass sie ein Paar der jeweiligen attP/attB-Stellen rekombiniert, ohne dass akzessorische Proteine erforderlich sind (Thorpe und Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)). Eine C31-Int-AttP/attB-Rekombination führt zu einer integrativen Reaktion, wenn die beiden Stellen auf verschiedenen Molekülen platziert werden, oder zu einer Deletion der dazwischenliegenden DNA, wenn die Stellen auf demselben DNA-Molekül in derselben Orientierung vorhanden sind, die zur Integration verwendet wurde. Weil das Produkt der Rekombination, ein Paar von attL/attR-Stellen, nicht mehr von C31-Int allein rekombiniert wird (Thorpe und Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)), ist die Reaktion unidirektional. C31-Int ist in humanen Zellen zur Integration und Deletion von DNA-Molekülen in humanen Zellen verwendet worden (Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 5995–6000 (2000)).
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die von der Erfindung der vorliegenden Anmeldung zu lösende Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Genfallensystems, das die obigen Nachteile nicht aufweist und selektive, unidirektionale Genom-Umlagerungen ermöglicht. Es wurde gefunden, dass die obige Aufgabe durch einen Genfallen-Konstrukt gelöst werden kann, bei dem spezielle Rekombinase/Rekombinase-Erkennungsstellensysteme (z.B. Systeme, die mutierte Rekombinase-Erkennungsstellen umfassen) verwendet werden, die eine unidirektionale Inversion zulassen, wobei solche Systeme vorzugsweise nur einmal rekombinieren (d.h. invertieren).
  • Die vorliegende Erfindung vereinigt ein konditionales Gen-Targeting mit einer Genfallen-Mutagenese. Ein konditionaler Genfallen-Vektor integriert typischerweise in ein Intron, ohne die Genfunktion zu stören. Eine Aktivierung der Genfalle durch eine ortsspezifische Rekombinase induziert jedoch eine Genzerstörung und einen Verlust seiner Funktion. Anders als beim konditionalen Gen-Targeting ist die Strategie nicht auf bekannte Gene beschränkt und kann verwendet werden, um alle Gene auf eine temporäre und/oder räumlich beschränkte Weise zu zerstören.
  • Somit macht die vorliegende Erfindung Folgendes verfügbar:
    • (1) Ein Genfallen-Konstrukt, das dazu fähig ist, in Genen konditionale Mutationen zu verursachen, umfassend eine Polyadenylierungsstelle umfassende Genzerstörungskassette, wobei die Genzerstörungskassette von zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen (RRS) flankiert wird, die aus mutanten loxP-Stellen, Mutanten-frt-Stellen und AttP/AttB-Stellen ausgewählt sind, die in entgegengesetzter Orientierung vorhanden sind und für die ortsspezifischen Rekombinasen Cre, Flp, ΦC31-Int und λ-Int spezifisch sind, wobei die ortsspezifischen Rekombinasen
    • (i) zu einer unidirektionalen Inversion einer doppelsträngigen Genzerstörungskassette, die von den beiden vorhandenen RRS, die in entgegengesetzter Orientierung vorhanden sind, flankiert ist, fähig sind und
    • (ii) die invertierte, doppeisträngige Genzerstörungskassette in einer Menge von mehr als 75%, bezogen auf die doppeisträngige Ausgangs-Zerstörungskassette, erzeugen.
    • (2) Eine bevorzugte Ausführungsform des in (1) oben konstruierten Genfallen-Konstrukts, umfassend
    • (a) eine Genzerstörungskassette, die von zwei RRS flankiert wird, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase spezifisch sind, die zur unidirektionalen Inversion einer doppelsträngigen Genzerstörungskassette fähig ist, und
    • (b) eine Selektionskassette, die in entgegengesetzter Orientierung in Bezug auf die Genzerstörungskassette angeordnet ist und von zwei RRS einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase in derselben Orientierung flankiert ist.
    • (3) Eine Zelle, die das in (1) oder (2) oben definierte Genfallen-Konstrukt umfasst, und
    • (4) eine transgene Maus, enthaltend in einem Intron eines Gens ein Genfallen-Konstrukt gemäß der Definition in (1)–(2) oben in einer Antisense-Richtung in Bezug auf das Gen.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1: Konditionaler Genfallen-Vektor zur Modifizierung von Genen, die in den Zielzellen exprimiert sind.
  • 2: Konditionaler Retrovirus-Genfallen-Vektor zur Modifizierung von exprimierten Genen.
  • 3: Konditionaler Genfallen-Vektor zur Modifizierung von Genen unabhängig von deren Expressionsgrad in den Zielzellen.
  • 4: Konditionaler Retrovirus-Genfallen-Vektor zur Modifizierung von Genen unabhängig von ihrer Expression.
  • 5 zeigt den konditionalen Genfallen-Vektor pRK57SA-β.
  • 6 zeigt eine Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA aus dem Genfallen-ES-Klon GT2.
  • 7 zeigt den Testvektor für die C31-Int-vermittelte Inversion, pRK73, und das Produkt der Inversion, pRK73-Inv.
  • 8 zeigt die Struktur des C31-Int-Expressionsvektors pRK65.
  • 9 zeigt die PCR-Produkte, die mit den Primern P64-1 und P64-3 erzeugt werden, und einen Sequenzvergleich der PCR-Produkte.
  • 10 zeigt die Rekombinations-Substratvektoren, die für die Cre-vermittelte Inversion verwendet werden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Genfallen-Konstrukte (1) und (2) werden hiernach ausführlicher beschrieben:
    Die vorliegende Erfindung macht ein ortsspezifisches Rekombinationssystem verfügbar, das eine unidirektionale Inversion von Sequenzen ermöglicht, die von RRS-Stellen flankiert werden. Zum Beispiel ist beim Cre/loxP-System bekannt, dass die Rekombination zwischen mutierten loxP-Erkennungsstellen (z.B. einfach mutierten Erkennungsstellen lox66 und lox71; Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995); siehe die SEQ ID Nr.: 2 und 3) eine doppelt mutierte und eine Wildtypen-loxP-Stelle (siehe SEQ ID Nr.: 4 und) jeweils auf einer Seite der invertierten DNA erzeugt. Weil diese Kombination von loxP-Stellen von der Cre-Rekombinase weniger effektiv erkannt wird, ist die Inversion "unidirektional".
  • Ein Rekombinationssystem ist gemäß der vorliegenden Erfindung "unidirektional", wenn eine Reaktion einer ortsspezifischen Rekombinase, die den RRS innerhalb des Konstrukts entspricht, das invertierte Doppelstrang-DNA-Segment in einer Menge von mehr als 75%, vorzugsweise mehr als 90%, bezogen auf das Ausgangs-Doppelstrang-DNA-Segment, erzeugt.
  • Die Inversion eines funktionellen DNA-Segments wird dadurch erreicht, dass flankierende RRS-Stellen in gegenüberliegenden Richtungen orientiert sind. Geeignete RRS gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Konstrukte, bei denen die beiden RRS aus mutierten loxP-Stellen, mutierten frt-Stellen und AttP/AttB-Stellen ausgewählt sind und die ortsspezifische Rekombinase Cre, Flp, ΦC31-Int bzw. λ-Int ist. Bevorzugte RRS sind Konstrukte, bei denen die beiden RRS einzelne mutierte loxP-Stellen, vorzugsweise eine lox66- und eine lox71-Stelle (SEQ ID Nr.: 2 und 3) oder eine AttP- und eine AttB-Stelle von ΦC31 sind, wie in Fig. veranschaulicht ist, und die ortsspezifische Rekombinase Cre bzw. ΦC31 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Genzerstörungskassette des Konstrukts (1) weiterhin eines oder mehrere der folgenden funktionellen Elemente: ein Spleißakzeptor, ein Spleißdonor, eine innere Eintrittsstelle für Ribosomen (IRES), ein Gen, das für ein Reporterprotein codiert, ein Resistenzgen und ein Gen, das für eine weitere ortsspezifische Rekombinase codiert. Geeignete Spleißakzeptoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, den Spleißakzeptor vom Adenovirus-Typ 2 des Exons 2, veranschaulicht in SEQ ID Nr.: 1; geeignete Donoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, den Spleißdonor des Adenovirus-Exons 1; geeignete IRES umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenige des ECM-Virus, die in SEQ ID Nr.: 8 veranschaulicht ist.
  • Geeignete Polyadenylierungssequenzen für das Konstrukt (1) sind die Polyadenylierungsstellen-Sequenz des Rinder-Wachstumshormons (bpA) oder diejenige, die in SEQ ID Nr.: 6 veranschaulicht ist.
  • Geeignete Reportergene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, E. coli β-Galactosidase (siehe SEQ ID Nr.: 10), Leuchtkäfer-Luciferase, fluoreszente Proteine (z.B. GFP) und humane plazentare alkalische Phosphatase (PLAP). Geeignete Reseistenzgene umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Neomicinphosphotransferase, Purimicin (siehe SEQ ID Nr.: 9) und Hygromicin. Eine geeignete weitere (sekundäre) ortsspezifische Rekombinase sind alle Rekombinasen, die die RRS des Genfallenkonstrukts nicht stören.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Konstrukt (1) weiterhin ein Selektions-DNA-Segment ("Selektionskassette"), das zur Selektion von Genen mit einem eingearbeiteten Genfallenkonstrukt geeignet ist, wobei das Selektions-DNA-Segment ein Reporter- oder Resistenzgen und flankierende Rekombinase-Erkennungsstellen in derselben Orientierung umfasst. Geeignete Resistenzgene sind die oben erwähnten, jedoch mit der Maßgabe, dass sie das Resistenzgen der Genzerstörungskassette nicht stören. Geeignete Rekombinase-Erkennungsstellen in derselben Orientierung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, loxP und Mutanten davon (siehe die SEQ ID Nr.: 5, 2 und 3), frt und Mutanten davon (siehe SEQ ID Nr.: 7), jedoch mit der Maßgabe, dass diese RRS die RRS der Genzerstörungskassette nicht stören.
  • Der Aktivierungsmechanismus einer konditionalen Genfalle basiert auf der Fähigkeit einer ortsspezifischen Rekombinase (z.B. Cre oder Flp), ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das von zwei RRS (z.B. loxP oder frt), die in entgegengesetzten Orientierungen insertiert sind, flankiert wird (Abremski et al., Cell, 32, 1301–1311 (1983); Hamilton et al., J. Mol. Biol., 178, 481–486 (1984); Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995); Vetter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7284–7288 (1983)). Wenn dies im Zusammenhang mit einem Genfallenvektor verwendet wird, können Sequenzelemente, die die Genexpression stören (z.B. Spleißstellen, Polyadenylierungssignale) zuerst in ein Intron in Antisense-Richtung in Bezug auf das Gen insertiert werden. Weil diese Elemente auf dem nicht transkribierten DNA-Strang verbleiben, stören sie die Gentranskription nicht. Wann oder wo eine Genzerstörung erwüscht ist, wird eine Inversion induziert, indem die zweckmäßige ortsspezifische Rekombinase exprimiert wird.
  • Die bevorzugten Funktionstypen mit Bezug auf die Erfindung sind Plasmid- (1 und 3) oder retrovirale Vektoren (2 und 4), die in Bezug auf Integrationen in Introne selektieren können. Die Selektion basiert auf der Expression eines Reportergens, das entweder einen aktiven zellulären Promotor (exprimierte Gene) (1 und 2) oder den Erwerb eines endogenen Transkriptions-Terminierungs-(Polyadenylierungs-)Signals benötigt (3 und 4).
  • Die Hauptelemente eines konditionalen Genfallenvektors der Ausführungsformen (1) und (2) der Erfindung, die in Bezug auf Integrationen selektieren, sind (i) eine konditionale Genzerstörungskassette, die eine 3'-Spleißstelle (Spleißakzeptor; SA; siehe SEQ ID Nr.: 1) und eine Polyadenylierungssequenz (PlyA; siehe SEQ ID Nr.: 6) enthält, die von zwei RRS (RRS1) einer ortsspezifischen Rekombinase (rec1) in entgegengesetzter Orientierung flankiert wird, und (ii) eine Selektionskassette, die ein Reporter- oder selektierbares Markergen enthält, das von einer Stromaufwärts-SA- und einer Stromabwärts-polyA-Stelle flankiert wird. Die Selektionskassette wird von zwei RRS (RRS2) in derselben Orientierung flankiert, die von der zweiten Rekombinase (rec2) erkannt werden, und befindet sich in der entgegengesetzten Orientierung zur Genzerstörungskassette (1 und 3). Die Selektion in Bezug auf die Genexpression ergibt Rekombinanten, bei denen das Reportergen mit den regulatorischen Elementen eines endogenen Gens verschmolzen ist. Von diesen Fusionen erzeugte Transkripte codieren ein gestutztes zelluläres Protein, das seine normale Funktion verloren hat. Weil die Selektion in Bezug auf ein Genfallen-Ereignis auf der Expression der Selektionskassette beruht, die an sich mutagen ist, muss diese entfernt werden, um die Genfunktion wieder zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem rec2 in Rekombinanten exprimiert wird, die auf Genfallen-Integrationen selektiert sind. In einem begünstigten Funktionsprozess wird die konditionale Genfalle in ES-Zellen transduziert. Nach Auswahl auf Integrationen in die Introns von exprimierten Genen wird rec2 transitorisch in individuellen Klonen exprimiert, wodurch die Selektionskassette deletiert wird, um die Genfunktion wiederherzustellen. Die resultierenden Klone, die nur die Genzerstörungskassette enthalten, werden zur Bildung von transgenen Mausstämmen verwendet. Solche Mausstämme werden mit rec1 exprimierenden Mausstämmen gekreuzt, wodurch doppelt transgener Nachwuchs erhalten wird, bei dem die Genzerstörungskassette zu ihrer mutagenen (Sense-)Orientierung reversiert ist.
  • Als weitere bevorzugte Ausführungsform macht die Erfindung einen konditionalen Genfallen-Vektor verfügbar, der in Bezug auf Integrationen in alle Gene selektiert. Dies wird erreicht, indem die Elemente der ursprünglichen Selektionskassette durch ein Reportergen ersetzt werden, das mit einem konstitutiven Stromaufwärts-Promotor und einem Stromabwärts-5'-Spleiß stelle (Spleißdonor) fusioniert ist (Zambrowicz, et al., 1998) (3 und 4). Eine Expression dieser Genfalle hängt vom Erwerb einer endogenen Polyadenylierungssequenz ab, was erfolgt, indem die Selektionskassette an die Stromabwärts-Exons des Zielgens gespleißt wird. Weil dieser Vorgang von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird, ist die Selektion in Bezug auf Genfallen-Integrationen von der Zielgen-Expression unabhängig. Wie bei der anderen konditionellen Genfalle besteht ein begünstigter Funktionsprozess in ihrer Transduktion in ES-Zellen und in der Erzeugung von mutierten Mausstämmen.
  • Somit macht die vorliegende Erfindung als bevorzugte Ausführungsform ein konditionales Genfallenkonstrukt verfügbar, das in Bezug auf Integrationen in exprimierte Gene selektiert. Beim Konstrukt umfasst die Genzerstörungskassette vorzugsweise einen Spleißakzeptor und eine Polyadenylierungssequenz, die von zwei RRS einer ersten ortsspezifischen Rekombinase flankiert werden, die zu einer unidirektionalen Inversion eines oben definierten Doppelstrang-DNA-Segments fähig sind. Das Konstrukt umfasst weiterhin ein Selektions-DNA-Segment (Selektionskassette), das ein Reporter- oder selektierbares DNA-Segment umfasst, das von einer Stromaufwärts-Spleißakzeptorsequenz und einer Stromabwärts-Polyadenylierungssequenz flankiert wird, wobei die Selektionskassette von zwei herkömmlichen RRS einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase in derselben Orientierung flankiert wird.
  • Als weitere bevorzugte Ausführungsform macht die vorliegende Erfindung ein konditionales Genfallenkonstrukt verfügbar, das in Bezug auf Integrationen in alle Gene selektiert. Im Konstrukt umfasst die Genzerstörungskassette einen Spleißakzeptor und eine Polyadenylierungssequenz, die von zwei RRS einer ersten ortsspezifischen Rekombinase flankiert wird, die zur unidirektionalen Inversion eines oben definierten doppelsträngigen DNA-Segments fähig ist. Das Konstrukt umfasst weiterhin ein Selektions-DNA-Segment (Selektionskassette), das ein Reporter- oder selektierbares Markergen umfasst, das mit einem konstitutiven Stromaufwärts-Promotor und einer Stromabwärts-Spleißdonorstelle fusioniert ist, wobei die Selektionskassette von zwei RRS einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase in derselben Orientierung flankiert wird.
  • In den bevorzugten Ausführungsformen kann es sich bei den RRS der zweiten ortsspezifischen Rekombinase um ein beliebiges RRS handeln, jedoch mit der Vorraussetzung, dass sie die RRS der ersten Rekombinase nicht stören.
  • Die Zelle von Ausführungsform (3) der Erfindung kann durch herkömmliche Verfahren einschließlich der Elektroporation oder der retroviralen Infektion hergestellt werden. Die Zelle (3) kann zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen verwendet werden.
  • Das Konstrukt (2) ist für ein Verfahren zur Erzeugung von konditionalen Mutationen in allen Genen eines Organismus brauchbar, das Folgendes umfasst:
    • (i) die Einführung eines in (2) oben definierten Genfallenkonstrukts in eine geeignete Zelle,
    • (ii) die Auswahl von Zellen, in denen das Konstrukt in ein Gen eingearbeitet ist,
    • (iii) die Identifizierung und/oder Isolierung des Gens, in das das Konstrukt eingearbeitet wird,
    • (iv) die Deletion der Selektionskassette aus dem eingefangenen Gen,
    • (v) die Induktion einer Mutation im gefangenen Gen durch die Inversion des funktionellen DNA-Segments.
  • In einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens wird die Mutation in Schritt (v) durch eine ortsspezifische Rekombinase bewirkt, die zu einer unidirektionalen Inversion der funktionellen DNA des Genfallenkonstrukts fähig ist. Das Verfahren ist zur temporär und/oder räumlich eingeschränkten Inaktivierung aller Gene, aus denen ein lebender Organismus besteht, und zur Herstellung von transgenen Säugern geeignet, wobei in Schritt (i) das Genfallenkonstrukt als ES-Zelle eingeführt wird.
  • Das obige Verfahren weist gegenüber der gegenwärtigen Technik die folgenden Vorteile auf:
    • i) Mutationen sind in vorbeschriebenen Zellen und Geweben und in vorbeschriebenen Zeitintervallen induzierbar;
    • (ii) Mutationen können in allen Genen einschließlich denjenigen, für die geklonte Sequenzen nicht verfügbar sind, induziert werden;
    • (iii) die Funktionsanalyse der mutierten Gene in zweckmäßigen Organismen ist relativ schnell und preiswert.
  • Die transgene Maus (4) ist brauchbar, um eine Genfunktion in verschiedenen Entwicklungsstufen zu untersuchen.
  • Die anliegenden Figuren erläutern die vorliegende Erfindung weiter:
  • 1 zeigt eine begünstigte Funktionsform des Verfahrens, das eine durch Elektroporation transduzierte konditionelle Genfalle zum Einfangen von exprimierten Genen betrifft.
    • A: Zielgen nach der Insertion eines konditionalen Genfallenvektors in ein Intron eines exprimierten Gens. In Transkripten, die am Promotor des Zielgens beginnen, werden das LacZ- und das Puromycin-Resistenzgen (Selektionskassette) mittels einer Spleißakzeptorstelle mit den Stromaufwärts-Exonen fusioniert. Die Fusion zerstört und inaktiviert das Zielgen.
    • B: Modifiziertes Allel nach einer FLP-vermittelten Deletion der Selektionskassette. Ein Ausschneiden von Sequenzen, die von den frt-Erkennungsstellen flankiert werden, die das Spleißakzeptorsignal einschließen, stellt die Wildtyp-Transkription und die Genfunktion wieder her.
    • C: Zielgen nach einer Cre-vermittelten Inversion der loxP-flankierten Genfallenelemente (Genzerstörungskassette). Eine Genfalleninversion positioniert die Spleißakzeptor- und die Poly-A-Stellen in Senserichtung, die mutagen ist.
    • SA: Spleißakzeptor-Signalsequenz; SD: Spleißdonor-Signalsequenz; pA: Polyadenylierungssequenz; lacZ: β-Galactosidase; puro: Puromycin-Resistenzgen; gefüllte Rechecke: Exone; gefüllte Dreiecke: loxP-Erkennungsstellen, loxP: Wildtyp-loxP-Stelle, lox66: einzelne mutierte lox-Stelle, lox71: einzelne mutierte lox-Stelle; lox66/71: doppelte mutierte lox-Stelle; schattierte Dreiecke: FRT-Erkennungsstellen (frt); dicke durchgezogene Linien: mRNA-Transkripte; dünne durchgezogene Linie: Intron; dünne gepunktete Linien: mittels Rekombinase vermittelte Deletion oder Inversion zwischen lox- oder FRT-Stellen. Cre: Cre-Rekombinase; FLP: FLP-Rekombinase. Ires: innere Eintrittsstelle für Ribosomen.
  • 2 zeigt eine begünstigte Funktionsform des Verfahrens, die eine durch Retroviren transduzierte konditionale Genfalle zum Einfangen von exprimierten Genen betrifft.
    • A: Retroviraler Plasmidvektor.
    • B. Zielgen nach der Insertion eines konditionalen Genfallen-Provirus in ein Intron eines exprimierten Gens. Eine Virusreplikation und eine LTR-vermittelte Duplikation positionieren die Genzerstörungskassette in U3 zwischen mutierten loxP-Stellen sowohl in proviralen 5'- als auch 3'-LTR. Darüber hinaus positioniert sie die Selektionskassette, die in den Körper des Virus zwischen den beiden frt-Stellen insertiert ist, zwischen zwei frt-Stellen. Transkripte, die im zellulären Promotor initiieren, werden von einer Strom aufwärts-Spleißakzeptorstelle an die Selektionskassette gespleißt. Diese Fusion zerstört und inaktiviert das Zielgen.
    • C: Modifiziertes Allel nach einer FLP-vermittelten Exzision aller proviralen Sequenzen, die zwischen den frt-Stellen angeordnet sind. Dadurch wird die Genfunktion wiederhergestellt, und nur eine Kopie der Genzerstörungskassette verbleibt.
    • D: Zielgen nach einer Cre-vermittelten Inversion der loxP-flankierten Genfallenelemente. Die LTR-Inversion positioniert die Genzerstörungskassette in einer mutagenen Sense-Orientierung.
    • LTR = lange terminale Wiederholung, U3 = 3'-einzigartige Region der retroviralen LTR, R = repetitive Region der retroviralen LTR, U5 = 5'-einzigartige Region der retroviralen LTR, SA = Spleißakzeptor-Signalsequenz; SD = Spleißdonorsequenz; pA = Polyadenylierungssequenz; Puro = Puromycin-Resistenzgen; lx = loxP-Erkennungsstellen; frt = Flp-Erkennungsstellen; dünne durchgezogene Linien = Intron; dünne gepunktete Linien = Sequenzen, die mittels mRNA-Verarbeitung herausgeschnitten sind; Pfeile bedeuten die Transkriptionsorientierung.
  • 3 zeigt eine begünstigte Funktionsform des Verfahrens, das eine konditionale Genfalle betrifft, die mittels Elektroporation zum Einfangen aller Gene transduziert ist.
    • A: Zielgen nach der Insertion eines konditionalen Genfallenvektors in ein Intron eines Gens. Transkripte, die im unabhängigen pgk-Promotor initiieren, exprimieren das Puromycin-Resistenzgen nach einem Spleißen in Stromabwärts-Exone, wodurch eine Polyadenylierungsstelle erhalten wird. Das Spleißen wird durch eine Spleißdonor-Sequenz vermittelt, die stromabwärts von pgkpuro insertiert wird. Die Fusion der Selektionskassette zu Stromabwärts-Kassetten inaktiviert das Zielgen.
    • B: Modifiziertes Allel nach einer FLP-vermittelten Deletion der Selektionskassette, wodurch die Genfunktion wiederhergestellt wird.
    • C: Zielgen nach einer Cre-vermittelten Inversion der Genzerstörungskassette, wodurch die Mutation bewirkt wird.
    • SA: Spleißakzeptor-Signalsequenz; SD = Spleißdonor-Signalsequenz; pA = Polyadenylierungssequenz; lacZ: β-Galacosidase; puro: Puromycin-Resistenzgen; gefüllte Rechtecke: Exone; gefüllte Dreiecke: loxP-Erkennungsstellen, loxP: Wildtyp-loxP-Stelle, lox66: einzelne mutierte lox-Stelle, lox71: einzelne mutierte lox-Stelle; lox66/71: doppelte mutierte lox-Stelle; schattierte Dreiecke: FRT-Erkennungsstellen (frt); dicke durchgezogene Linien: mRNA-Transkripte; dünne durchgezogene Linien: Intron; dünne gepunktete Linien: mittels Rekombinase vermittelte Deletion oder Inversion zwischen lox- oder FRT-Stellen. Cre: Cre-Rekombinase; FLP: FLP-Rekombinase. Ires: innere Eintrittsstelle für Ribosomen; pgk: Phosphoglyceratkinase-Promotor.
  • 4 zeigt eine begünstigte Funktionsform des Verfahrens, das von Retroviren transduzierte eine konditionale Genfalle zum Einfangen aller Gene betrifft.
    • A: Retroviraler Plasmidvektor
    • B. Zielgen nach der Insertion eines konditionalen Genfallen-Provirus in ein Intron eines Gens. Eine Virusreplikation und eine LTR-vermittelte Duplikation positionieren die Genzerstörungskassette in U3 zwischen mutierten loxP-Stellen sowohl in proviralen 5'- als auch 3'-LTR. Darüber hinaus positioniert sie die Selektionskassette, die in den Körper des Virus zwischen den beiden frt-Stellen insertiert ist, zwischen zwei frt-Stellen. Transkripte, die im unabhängigen pgk-Promotor initiieren, exprimieren das Puromycin-Resistenzgen nach einem Spleißen in Stromabwärts-Exone, wodurch eine Polyadenylierungsstelle erworben wird. Das Spleißen wird von einer Spleißdonorsequenz vermittelt, die stromabwärts von pgkpuro insertiert ist. Die Fusion der Selektionskassette an die Stromabwärts-Exone inaktiviert das Zielgen.
    • C: Modifiziertes Allel nach einer FLP-vermittelten Exzision aller proviralen Sequenzen, die zwischen den frt-Stellen angeordnet sind. Dadurch wird die Genfunktion wiederhergestellt, und nur eine Kopie der Genzerstörungskassette verbleibt.
    • D: Zielgen nach einer Cre-vermittelten Inversion der loxP-flankierten Genfallenelemente. Die LTR-Inversion positioniert die Genzerstörungskassette in einer mutagenen Sense-Orientierung.
    • LTR = lange terminale Wiederholung, U3 = 3'-einzigartige Region der retroviralen LTR, R = repetitive Region der retroviralen LTR, U5 = 5'-einzigartige Region der retroviralen LTR, SA = Spleißakzeptor-Signalsequenz; SD = Spleißdonorsequenz; pA = Polyadenylierungssequenz; Puro = Puromycin-Resistenzgen; lx = loxP-Erkennungsstellen; frt = Flp-Erkennungsstellen; dünne durchgezogene Linien = Intron; dünne gepunktete Linien = Sequenzen, die mittels mRNA-Verarbeitung herausgeschnitten sind; pgk = Phosphoglyceratkinase-Promotor; Pfeile bedeuten die Transkriptionsorientierung.
  • 5 zeigt dien konditionalen Genfallenvektor pRK57SA-β
    • A: Ursprüngliche Konfiguration des konditionalen Genfallenvektors nach einer Insertion in ein Intron eines exprimierten Gens. In Transkripten, die am Promotor des Zielgens anfangen, wird das β-geo-Gen mittels einer Spleißakzeptorstelle mit den Stromaufwärts-Exons verschmolzen. Die Verschmelzung zerstört und inaktiviert das Zielgen. Die Spleißakzeptor-β-geo-Kassette wird von zwei mutierten lox-Stellen in einer entgegengesetzten Orientierung flankiert. Der Pfeil bedeutet die Transkriptionsrichtung des β-neo-Gens.
    • B: Konditionaler Genfallenvektor nach einer Cre-vermittelten Inversion der lox-flankierten Genfallenelemente (Genzerstörungskassette). Eine Genfalleninversion positioniert die Spleißakzeptor- und die Poly-A-Stellen in Antisense-Orientierung, die nichtmutagen ist. Die Rekombination von lox66- und lox71-Stellen erzeugt ein loxP-Wildtyp- und eine doppelt mutierte lox66/71-Stelle.
    • SA: Spleißakzeptor-Signalsequenz; pA = Polyadenylierungssequenz; β-geo: Fusionsgen von β-Galactosidase und Neomycinphosphotransferase; gefülltes Rechteck: Exon; Dreiecke: loxP-Erkennungsstellen, loxP: Wildtyp-loxP-Stelle, lox66: einzelne mutierte lox-Stelle, lox71: einzelne mutierte lox-Stelle; lox66/71: doppelte mutierte lox-Stelle; dicke durchgezogene Linien: mRNA-Transkript; dünne gepunktete Linien: mittels Rekombinase vermittelte Deletion oder Inversion zwischen lox-Stellen. Cre: Cre-Rekombinase.
  • 6 zeigt eine Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA aus dem Genfallen-ES-Klon GT2. Beim Verdau mit BamHI und XmnI und einem Segment des Neomycinphosphotransferase-Gens als Sonde ergibt der integrierte pRK57SA-β-Vektor eine Bande von 3,06 kb, bei einer Crevermittelten Inversion wird die Bande zu einer Größe von 1,17 kb vermindert. Veranschaulicht sind Proben von GT2-Zellen 6 Tage nach der Infektion mit dem Cre-exprimierenden Retrovirus pBABE-pgkCre, dem Kontrollvirus pBABE-Srf oder nicht virusbehandelte. Die Bande, die auf eine Inversion des Genfallenvektors hindeutet, erscheint nur in der Probe, die mit dem Cre-exprimierenden Retrovirus behandelt wurde.
  • 7 zeigt den Testvektor für eine C31-Int-vermittelte Inversion, pRK73, und das Produkt der Inversion, pRK73-Inv.
    • A: Das Plasmid pRK73 enthält die 1,1-kb-Kassette der codierenden Region des Puromycinresistenzgens und ein Polyadenylierungssignal, das 5' von der attB-Erkennungsstelle von C31-Int mit 84 bp und 3' von der attP-Erkennungsstelle von C31-Int flankiert ist. Diese attB- und diese attP-Stelle sind im Vergleich zur Orientierung von attB und attP vor der Integration des phiC31-Phagen in das Bakteriengenom einander gegenüberliegend orientiert (dicke schwarze Pfeile). Darüber hinaus ist die Kassette von zwei Cre-Rekombinase-Erkennungs-(loxP-)Stellen in einander entgegengesetzter Orientierung flankiert. Zur besseren Orientierung sind die halben Stellen der att-Sequenzen mit einer Richtung (dünner Pfeil) markiert und mit 1–4 nummeriert. Die Positionen, bei denen die PCR-Primer P64-1 und P64-3 an den pRK73-Vektor hybridisieren, sind mit einem Pfeil markiert, der in die 3'-Richtung beider Oligonucleotide weist.
    • B: Das Inversionsprodukt pRK73-Inv, das aus der C31-Int-vermittelten Rekombination zwischen den att-Stellen von pRK73 erwartet wird. Die Rekombination zwischen einem Paar von attB/attP-Stellen erzeugt ein Paar von attR/attL-Stellen, die die invertierte Puromycin-Kassette flankieren. In dieser Konfiguration amplifizieren die Primer P64-1 und P64-3 ein PCR-Produkt mit 608 bp.
  • 8 zeigt die Struktur des C31-Int-Expressionsvektors pRK65.
  • Die C31-Int codierende Region mit 1,85 kb wird vom CMV-Promotor zur Expression in Säugerzellen exprimiert. Ein Hybridintron mit 300 bp zwischen dem Promotor und dem codierenden Bereich ergibt eine Spleißdonor- und eine Spleißakzeptor-Stelle; der codierenden Region folgt eine synthetische Polyadenylierungs-Signalsequenz. Das erwartete Transkript ist als dünne Linie dargestellt.
  • 9 zeigt die PCR-Produkte, die mit den Primern P64-1 und P64-3 erzeugt werden, und einen Sequenzvergleich der PCR-Produkte.
    • A: Analyse der PCR-Produkte auf einem Agarosegel aus PCR-Reaktionen, bei denen die Primer P64-1 und P64-3 auf DNA, die aus MEF5-5-Zellen extrahiert wurde, die 2 Tage zuvor mit dem Plasmid pRK73 allein (Spur 4), mit pRK73 + CMV-Cre (Spur 3), mit pRK73 + pRK65 (Spur 2) transfiziert wurden, und von nichttransfizierten Zellen (Spur 1) verwendet wurde. Die Produkte mit einer scheinbaren Größe von etwa 650 bp im Vergleich zum verwendeten Größenmarker von Spur 2 wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und gereinigt. Die PCR-Produkte wurden in einen sequenzierenden Plasmidvektor geklont und ergaben die Plasmide pRK80b und pRK80c. Das Insert dieser Plasmide wurde mittels der reversen Primer (seq80b und seq80c) sequenziert und mit der vorhergesagten Sequenz des Vektors pRK73 nach der C31-Int-vermittelten Inversion der att-flankierten Kassette, pRK73-Inv, verglichen. Beide PCR-Produkte wiesen eine 100-%ige Identität mit der vorhergesagten attR-Sequenz nach der Inversion auf. Die erzeugte attR-Stelle ist in einem Kasten mit derselben Sequenzbezeichnung dargestellt, die in 7B verwendet wird. Die Nucleotidpositionen der verglichenen Sequenzen pRK73, seq80b und seq80c sind markiert.
  • 10 zeigt Rekombinationssubstrat-Vektoren, die zur Cre-vermittelten Inversion verwendet werden.
  • Das Plasmid pRK74 enthält einen CMV-Promotor zur Expression in Säugerzellen, gefolgt von einer Kassette, die das β-Galactosidase-Gen von E. coli und eine Polyadenylierungssequenz in inverser Orientierung zum CMV-Promotor enthält. Diese Kassette wird von den einzeln mutierten lox-Stellen lox66 und lox71 in entgegengesetzter Richtung flankiert (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)). Das Plasmid pRK76 ist wie pRK74 strukturiert, außer, dass die inverse β-Galactosidase-Kassette von einer doppelt mutierten lox66/71-Stelle und einer Wildtyp-loxP-Stelle flankiert ist. Der gerade Pfeil bedeutet die Transkriptionsorientierung der β-Galactosidase-Kassette.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch nicht dahingehend aufgefasst werden dürfen, dass sie die Erfindung einschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Ein Plasmidvektor, der eine Spleißakzeptor-Sequenz enthält, gefolgt von einem Fusionsgen aus β-Galactosidase und Neomycinphosphotransferase (SA-β-geo), flankiert von zwei verschiedenen mutierten lox-Stellen in entgegengesetzter Orientierung, wurde konstruiert und als Genfalle in ES-Zellen verwendet. Zelllinien, die eine β-Galactosidaseaktivität aufwiesen, wurden zur Expression von Cre mit einem retroviralen Vektor infiziert, um die Inaktivierung des Genfallenvektors durch eine rekombinasevermittelte Inversion des von lox flankierten DNA-Segments zu untersuchen.
  • A. Konstruktion des Genfallenvektors pRK57SA-β:
  • Als erster Schritt der Vektorkonstruktion wurde ein synthetisches DNA-Fragment mit 74 bp mit hervorstehenden XbaI-Enden, das eine lox66- und eine lox71-Cre-Rekombinase-Erkennungsstelle in entgegengesetzter Orientierung enthielt (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)), getrennt durch eine Xho-Stelle, wurde in die XbaI-Stelle des Plasmids pNEB193 ligasiert (New England Biolabs), was zum Vektor pRK57 führte. Das synthetische DNA-Fragment wurde erhalten, indem die beiden synthetischen Oligonucleotide lox 3 (5'-CTAGATAACT TCGTATAGCA TACATTATAC GAACGGTACT CGAGATAACT TCGTATAATG TATGCTATAC GAACGGTA-3'; SEQ-ID Nr.: 11) und lox4 (5'-CTAGATACCG TTCGTATAGC ATACATTATA CGAAGTTATC TCGAGTACCG TTCGTATAAT GTATGCTATA CGAAGTTAT-3'; SEQ-ID Nr.: 12) einem Annealing unterzogen wurden. Als Nächstes wurde das Plasmid pRK57 mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten, mit Kalbsdarm-Phosphatase dephosporyliert, und die hervorstehenden 5'-Enden wurden mit Desoxynucleotidtriphosphaten unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase I gefüllt. Dieser Vektor wurde in ein DNA-Fragment von 4,3 kb ligasiert, das aus dem Plasmid ROSAbetageo isoliert war (Friedrich et al., Genes&Development 5, 1513–1523 (1991)), das durch einen Verdau mit dem Restriktionsenzym XhoI erhalten wurde und dessen hervorstehende 5'-Enden wie beschrieben gefüllt wurden. Das Ligationsprodukt, der Vektor pRK57SA-β (SEQ-ID Nr.: 13) enthält eine Kassette mit dem Adenovirus-Typ-2-Spleißakzeptor vom Exon2 der größeren späten Region (SA, Pos. 525 bis 628; SEQ-ID Nr.: 1), ein Fusionsgen der β-Galactosidase von E. coli und Neomycin-Phosphotransferase (β-geo, Pos. 667 bis 4548) und das Transkriptionsterminierungs- und Polyadenylierungssignal des Rinder-Wachstumshormon-Gens (pA, Pos. 4561 bis 4843). Diese SA-β-geo-Kassette ist von einer lox66-Stelle 5' zum Spleißakzeptor (Pos. 446–bis 479) und einer lox71-Stelle 3' zu den Rinderwachstumshormon-Gensequenzen (Pos. 4869 bis 4902) flankiert. Die beiden lox-Stellen sind in entgegengesetzter Orientierung zueinander orientiert. Der Vektor pRK57SA-β enthält BamHI-Stellen an den Positionen 427, 503 und 3723, eine einzige XmnI-Stelle an Position 6788 und eine einzige KpnI-Stelle an Position 413.
  • B. Konstruktion von retroviralen Vektoren:
  • Ein NheI-Fragment mit 1,1 kb, das die codierende Sequenz für Cre-Rekombinase (Cre) mit einem N-terminalen nuklearen Lokalisierungssignal trug, das vom großen T-Antigen des Simian-Virus 40 stammte, wurde in das Plasmid pBluescript II KS(+) (Stratagene) insertiert, mit dem Restriktionsenzym XbaI geöffnet und mit Kalbsdarm-Phosphatase dephosporyliert. Das resultierende Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym SpeI geschnitten, mit Kalbsdarm-Phosphatase dephosporyliert, und die hervorstehenden 5'-Enden wurden mit Desoxynucleotidtriphosphaten gefüllt, wobei das Klenow-Fragment von E.-coli-DNA-Polymerase I verwendet wurde. Dieser Vektor wurde an ein Fragment mit glatten Enden ligasiert, das die Promotorregion des Maus-Phosphoglyceratkinase-Gens (PGK) 1a enthielt. Das Ligationsprodukt enthält eine Kassette mit dem PGK-Promotor und die cre codierende Sequenz im Rückgrat von pBluescript II KS(+). Diese Kassette wurde als NotI-Fragment mit 1,6 kb ausgeschnitten, wie beschrieben gefüllt und in die gefüllte SnaBI-Stelle eines Derivats des Vektors pBABEpuro auf der Grundlage des Moloney-Maus-Leukämievirus insertiert (Morgenstern und Land, Nucleic Acids Res. 18, 3587–3596 (1990)), wodurch der retrovirale cre-Expressionsvektor pBABE-pgkCre (SEQ-ID Nr.: 14) erzeugt wurde. Es wurde ein Kontrollvektor pBABE-Srf (SEQ-ID Nr.: 15) hergestellt, der eine kurze Polylinker-Region statt der pgkCre-Kassette enthielt. Die Plasmidformen dieser retroviralen Vektoren enthalten die folgenden funktionellen Elemente in einem Plasmid-Rückgrat, das mit pBABEpuro identisch ist:
    pBABE-pgkCre: Position
    partielles MMLV U3 8–335
    MMLV R 336–402
    MMLV U5 403–480
    MMLV-Primer-Bindungsstelle und verlängertes Verpackungssignal (einschließlich des mutierten Spleißdonors und dem 5'-Ende der gag codierenden Sequenz mit einem mutierten ATG-Startcodon)
    481–1374
    Maus-PGK-Promotor 1417–1921
    cre codierende Sequenz 1972–3024
    Promotor/Enhancer-deletiertes MMLV U3 3088-3168
    MMLV R 3187–3253
    MMLV U5 3254–3332
    pBABE-Srf:
    partielles MMLV U3 8–335
    MMLV R 336–402
    MMLV U5 403–480
    MMLV-Primer-Bindungsstelle und verlängertes Verpackungssignal (einschließlich des mutierten Spleißdonors und dem 5'-Ende der gag codierenden Sequenz mit einem mutierten ATG-Startcodon)
    481–1374
    Promotor/Enhancer-deletiertes MMLV U3 1451–1531
    MMLV R 1549–1616
    MMLV U5 1617–1695
    MMLV U5 cw 1617–1695
  • Infektiöse retrovirale Partikel wurden hergestellt, indem 2 × 107 Phoenix-eco-Verpackungszellen (http://www.stanford.edu/group/nolan/phoenix_info.html) mit insgesamt 100 μg der Plasmidformen der retroviralen Vektoren transfiziert wurden, wobei die Calciumphosphat-Kopräzipitationstechnik verwendet wurde. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Gewebekultur-Überstände geerntet, durch einen 0,45-μm-Filter filtriert und mit Polybrene zu einer Endkonzentration von 4 μg/ml gemischt. Dieser Virus-Überstand wurde dann zur Infizierung von ES-Zellklonen verwendet.
  • Zur Bestimmung des Titers des pBABE-pgkCre-Virus wurden serielle Verdünnungen des virushaltigen Überstands verwendet, um 10 000 NIH-3T3-Zellen zu infizieren, die das Plasmid pSVpaX1 (Buchholz et al., Nucleic Acids Res. 24, 4256–4262 (1996)) als stabiles Integrat trugen. Eine erfolgreiche Infektion mit dem Cre-Expressionsvirus führt zum Ausschneiden der pac/SV40polyA-Kassette aus dem pSVpaX1-Konstrukt und gleichzeitig zur Expression des β-Galactosidasegens. Die Expression dieses Markers wurde zwei Tage nach der Infektion überwacht, indem die Zellen fixiert und mit dem chromogenen Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid) gefärbt wurden. Die Anzahl der β-Galactosidase-positiven Zellen wurde verwendet, um den Titer der ursprünglichen, zur Infektion verwendeten Virussuspensionen zu bestimmen. Es wurde bestimmt, dass der Titer des pBABE-pgkCre-Virus-Überstands 5000 infektiöse Partikel pro Milliliter des Überstands enthielt.
  • C. Herstellung von β-Galactosidase exprimierenden ES-Zellklonen:
  • 100 μm des Vektors pRK57SA-β wurden mit KpnI linearisiert und in 3 × 107 Zellen der embryonischen Stammzelle (ES) E14 elektroporiert, gemäß der Beschreibung von Kühn et al., Science 254, 707–710 (1991), kultiviert. Zwei Tage nach der Elektroporation wurden die Zellen 7 Tage lang in einem Medium gezogen, das 275 mg/ml G418 (Gibco BRL) enthielt, um Klone auszuwählen, die den Genfallenvektor in ein exprimiertes Gen integrierten. Die gleichzeitige Expression des β-Geo-Fusionsgens ermöglicht ein Wachstum solcher Klone im G418 enthaltenden Medium aufgrund der Expression der Neomycin- Phosphotransferase. Am 9. Tag nach der Elektroporation wurden 60 G418-resistente Klone erhalten und weiter expandiert. Aliquote aller Klone wurden mittels einer Anfärbung von X-Gal auf die Expression einer β-Galactosidaseaktivität untersucht, was zu 23 positiven Klonen führte, die 1%–75% positive Zellen aufwiesen. Diese Klone wurden mittels einer Southern-Blot-Hybridisierung weiter auf die Anzahl von integrierten Vektorkopien analysiert. Es erwies sich, dass 11 der 23 Klone Integrate mit hoher Kopienzahl aufwiesen, und diese wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die beiden Einzelkopie-Integranten GT2 und GT6, die den höchsten Anteil an β-Galactosidase-positiven Zellen aufwiesen, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.
  • D. Infektion von ES-Zellklonen mit retroviralen Vektoren:
  • Um auf die induzierte Inversion der SA-β-geo-Kassette innerhalb des integrierten pRK57SA-β-Vektors in den Klonen GT2 und GT6 zu testen, wurden Zellen beider Klone entweder mit dem Cre-Rekombinase exprimierenden Retrovirus pBABE-pgkCre oder mit dem Kontroll-Retrovirus pBABE-Srf, dem das Cre-Gen fehlte, infiziert. Zur späteren Analyse der β-Galactosidase-Expression wurden einen Tag vor der Virusinfektion 5000 Zellen/Napf der Klone GT2 und GT6 in Näpfe von Kulturplatten mit 48 Näpfen (Falcon) plattiert. Zur Infektion wurde das Kulturmedium durch 300 ml virushaltige Überstände (die etwa 1500 infektiöse Teilchen enthielten, d.h. eine Infektionsrate von 30%) ersetzt, und die Zellen wurden 4 h lang weiter kultiviert. Nach 4 h wurden die Näpfe mit 300 ml Kulturmedium aufgefüllt und über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Überstände durch frisches Kulturmedium vollständig ersetzt und weitere 2 bis 6 Tage bis zur Analyse auf β-Galactosidase-Aktivität gezogen. Zur späteren Analyse der genomischen DNA des Klons GT2 wurden Zellen im Wesentlichen wie oben beschrieben behandelt, außer, dass 30 000 Zellen in Kulturplatten mit 24 Näpfen plattiert und mit 600 ml virushaltigen Überständen (die etwa 3000 infektiöse Teilchen enthielten; d.h. eine Infektionsrate von 10%) behandelt. Genomische DNA wurde aus diesen Proben am 6. Tag nach der Infektion hergestellt.
  • E. Histochemische Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität:
  • Zur Quantifizierung der Expression von β-Galactosidase wurden die ES-Zellen einen Tag vor der Analyse mit niedriger Dichte plattiert, um einzelne Zellen leicht beobachten zu können. Am folgenden Tag wurde das Kulturmedium aus den Näpfen entfernt, die Näpfe wurden einmal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und die Zellen wurden 5 min lang bei Raumtemperatur in einer Lösung von 2% Formaldehyd und 1% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Als Nächstes wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und schließlich 24 h lang in einer Anfärbelösung bei 37°C inkubiert (Anfärbelösung: 5 mM K3(Fe(CN)6), 5 mM K4(Fe(CN)6), 2 mM MgCl2, 1 mg/ml X-Gal (BioMool) in PBS). Blau angefärbte, β-Glactosidase-positive Zellen wurden detektiert und von negativen (transparenten) Zellen in einem Zellkultur-Binocular-Mikroskop bei einer Vergrößerung von 200× unterschieden. Für jede Bestimmung wurden mindestens 200 Zellen gezählt.
  • F. Southern-Blot-Hybridisierung:
  • Genomische DNA wurde unter Befolgung von Standardverfahren (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning. A laboratory manual. ColdSpring Harbour Laborstory Press (1989)) aus retrovirus-infizierten ES-Zellklonen hergestellt. Etwa 5 mg gereinigte DNA wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XmnI aufgeschlossen, um die Inversion des Genfallenvektors pRK57SA-β nachzuweisen. Aufgeschlossene DNA wurde in 0,8%igem Agarosegel abgetrennt und unter alkalischen Bedingungen 16 h lang auf Nylon-Membranen übertragen (GeneScreen Plus, NEN DuPont). Der Filter wurde getrocknet und 16 h lang bei 65°C mit einer Sonde hybridisiert, die den 3'-Teil des Neomycin-Phosphotransferase-Gens (Fragment mit ~600 bp PstI – XbaI des Plasmids pgk-neo (Soriano et al., Cell 64, 693–702 (1991)) darstellte. Die Sonde wurde mit p32-markiertem α-dTP (Amersham) radioaktiv markiert, wobei der Megaprime Kit (Amersham) verwendet wurde. Eine Hybridisierung wurde in einem Puffer durchgeführt, der aus 10% Dextransulfat, 1% SDS, 50 mM Tris und 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5, bestand. Nach der Hybridisierung wurde der Filter mit 2× SSC gewaschen und 3 Tage lang bei –80°C auf BioMax-MS1-Röntgenfilme einwirken gelassen.
  • G. Ergebnisse:
  • Der Plasmidvektor pRK57SA-β, der als konditionale Genfalle dient, wurde konstruiert, indem eine Kassette, die aus einer Spleißakzeptorsequenz, gefolgt vom β-Geo-Gen (SA-β-geo), bestand, zwischen zwei mutierten loxP-Stellen, lox66 und lox71 angeordnet wurde. Diese Erkennungsstellen für Cre-Rekombinase befinden sich in einer entgegengesetzten Orientierung zueinander und ermöglichen die Inversion der mutagenen Spleißakzeptor-β-geo-Kassette innerhalb des Vektors bei der Expression von Cre (5). Bei der Rekombination einer lox66- und einer lox71-Stelle werden eine Wildtyp-loxP- und eine doppelt mutierte lox66/71-Stelle erzeugt (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)). Weil die Kombination von loxP- und lox66/71-Stellen von Cre viel weniger effizient als ein Paar von lox66- und lox71-Stellen rekombiniert wird, wird das Resultat der Inversionsreaktion in Richtung der Reaktionsprodukte verschoben, die 80–90% aller rekombinierten Moleküle darstellen (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)). Im Gegensatz dazu würde die Verwendung zwei entgegengesetzt orientierter Wildtyp-loxP-Stellen für eine Cre-vermittelte Inversion zu einem Gleichgewicht mit einem 50%igen Anteil für jedes der beiden Inversionsprodukte führen (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)).
  • Der Vektor pRK57SA-β wurde 5' zur lox66-Stelle linearisiert und mittels Elektroporation in murine embryonische Stammzellen (ES) eingeführt. Stabile transfizierte Klone, die den konditionalen Genfallenvektor in Gene integrierten, die aktiv in ES-Zellen transkribiert werden, wurden durch eine Selektion in einem G418 enthaltenden Zellkulturmedium erhalten. Überlebende Klone müssen das promotorfreie β-geo-Fusionsgen mittels eines Fusionstranskripts zwischen der Spleißdonorsequenz einer mRNA eines endogenen Gens und der Spleißakzeptorsequenz des in einem Intron angeordneten Genfallenvektors exprimieren.
  • Nach der Etablierung von G418-resistenten Klonen wurde die Expression der β-Galactosidoseaktivität durch ein histochemisches Anfärben getestet. Wie erwartet wies nur ein Bruchteil der G418-resistenten Klone eine gewisse β- Galactosidose-Aktivität auf, die zwischen 1%–75% der Zellen der individuellen Klone variierte. Darüber hinaus wurden diese Klone auf die Kopienzahl des integrierten konditionalen Genfallenvektors mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert. Zwei ES-Zellklone, GT2 und GT6, die eine einzelne Kopienintegration des Vektors und einen hohen Anteil an β-Galactosidase-positiven Zellen aufwiesen, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt.
  • Diese Klone wurden entweder mit dem Retrovirus-Vektor pBABE-pgkCre, der zur Expression von Cre-Rekombinase konstruiert ist, oder mit dem Retrovirus-Kontrollvektor pBABE-Srf, dem die Cre-Expressionskassette fehlt, infiziert. Die Inversion der lox-flankierten Sa-β-geo-Kassette wurde zwei und sechs Tage nach der Infektion mittels einer histochemischen X-Gal-Anfärbung auf die β-Galactosidaseaktivität und mittels Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA getestet. Wie unten in Tabelle 1 aufgeführt ist, war der Anteil von β-Galactosidase exprimierenden Zellen von beiden ES-Zellklonen, die eine blaue Anfärbung aufwiesen, zu beiden Zeitpunkten in den Proben, die mit dem Cre-Expressions-Retrovirus infiziert waren, im Vergleich zu Proben, die mit dem Kontrollvirus behandelt waren, um 14–27% signifikant reduziert. Tabelle 1:
    2 Tage nach der Infektion 6 Tage nach der Infektion
    pBABE-Srf % blaue Zellen pBABE-pgkCre % blaue Zellen Abnahme pBABE-Srf % blaue Zellen pBABE-pgkCre % blaue Zellen % Abnahme
    Klon GT2 73% 59% 14% 76% 49% 27%
    Klon GT6 67% 48% 19% 67% 47% 20%
  • Weil beim Klon GT2 nur 76% und beim Klon GT6 nur 67% der Zellen β-Galactosidase in der Kontrollprobe exprimierten, würde die Abnahme der blau angefärbten Zellen um 27% beim Klon GT2 und um 20% beim Klon GT6 am 6. Tag nach der Infektion mit dem Cre exprimierenden Virus einer Inversions rate von 36% beim Klon GT2 und von 30% beim Klon GT6 entsprechen. Diese Zahlen stehen in enger Übereinstimmung mit der berechneten Infektionsrate von 30% der Zellen mit dem pBABE-pgkCre-Virus-Überstand unter den angewandten Bedingungen (siehe oben); diese Übereinstimmung lässt vermuten, dass die meisten der Zellen, die mit dem Cre-Virus infiziert waren, eine (fast unidirektionale) Inversion des konditionalen Genfallenvektors erfuhren.
  • Die oben beobachtete Zunahme der nicht angefärbten, β-Galactosidasenegativen Zellen ist das erwartete Ergebnis einer Cre-vermittelten Inversion der lox-flankierten SA-β-geo-Kassette innerhalb ihrer genomischen Integrationsstelle: die SA-β-geo-Kassette in den Klonen GT2 und GT6 befindet sich ursprünglich in derselben Transkriptionsorientierung wie das endogene Gen, was zur Expression von β-Galactosidase aus einem Fusionstranskript führt. Bei einer Inversion dieser Kassette wird der Transkript des endogenen Gens nicht mehr durch ein Spleißen an die SA-β-geo-Kassette unterbrochen, die in inverser Orientierung nicht mehr in ein β-Galactosidase-Protein translatiert wird.
  • Darüber hinaus wurde die Inversionsreaktion der SA-β-geo-Kassette bei einer Behandlung mit dem Cre exprimierenden Retrovirus mittels einer Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA des Klons GT2 getestet. Bei einem Verdau von genomischer DNA mit BamHI und XmnI ergibt der Genfallenvektor in seiner ursprünglichen Konfiguration eine Bande von 3,06 kb, wobei ein Segment des β-geo-Gens als Sonde verwendet wird. Bei einer Inversion der lox-flankierten SA-β-geo-Kassette wird das von der Sonde detektierte Fragment auf 1,17 kb reduziert (5). Wie in 6 dargestellt ist, wird die erwartete Bande, die die Rekombinase-vermittelte Inversionsreaktion demonstriert, in der Probe der Genfalle ES-Klon-GT2, die mit dem Cre exprimierenden Retrovirus behandelt ist, spezifisch nachgewiesen, aber nicht in den Kontrollen. Die relativ schwache Stärke der auf eine Inversion hindeutenden Bande entspricht unter den Bedingungen, die bei der DNA- Herstellung angewandt wurden, der ineffizienten Infektion der GT2-Zellen mit dem Cre-Virus (Infektionsrate 10%).
  • Wir schließen aus diesem Experiment, dass es durch die Verwendung von mutierten lox-Stellen möglich ist, das DNA-Segment eines Genfallenvektors, der anfänglich für das eingefangene endogene Gen mutagen ist, vorzugsweise (> 50%) zu einer Konfiguration zu invertieren, die nicht mehr mutagen ist und seine Wildtyp-Expression ermöglicht.
  • Gleichermaßen würde eine Cre-vermittelte Inversion, wenn die Sa-β-geo-Kassette anfänglich in ein endogenes Gen integriert würde, eine Umschaltung ihrer Orientierung vorzugsweise zur mutagenen Form ermöglichen.
  • Beispiel 2
  • Es wurde ein Plasmidvektor konstruiert, der einen Test auf die Inversion eines DNA-Segments ermöglicht, das von den attB- und attP-Erkennungssequenzen der vom Phagen phiC31 stammenden Integrase (C31-Int) stammt. Dieser Vektor wurde zusammen mit einem Expressionsvektor für die Integrase phiC31 in eine murine Zelllinie transfiziert, und eine rekombinase-vermittelte Inversion wurde mittels einer spezifischen PCR-Reaktion nachgewiesen. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde geklont, und seine Sequenz wurde bestimmt. Die erhaltene Sequenz bestätigt, dass eine integrase-vermittelte Inversion des Testvektors in einer Säuger-Zelllinie erfolgt und dass die Rekombination an den bekannten Bruchstellen innerhalb der attB- und attP-Stellen erfolgt.
  • A. Plasmidkonstruktionen:
  • Konstruktion des Rekombinations-Testvektors pRK73 (SEQ-ID Nr.: 16). Zuerst wurde eine attB-Stelle (Thorpe und Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)), die durch das Annealing der beiden synthetischen Oligonucleotide C31-4 (5'-CGTGA CGG TCT CGA AGC CGC GGT GCG GGT GCC AGG GCG TGC CCT TGG GCT CCC CGG GCG CGT ACT CCA CCT CAC CCA TCT GGT CCA; SEQ-ID Nr.: 17) und C31-5 (5'-CG TGG ACC AGA TGG GTG AGG TGG AGT ACG CGC CCG GGG AGC CCA AGG GCA CGC CCT GGC CCA CGC ACC GCG GCT TCG AGA CCG TCA; SEQ-ID Nr.: 18) erzeugt wurde, in die BstBI-Restriktionsstelle des Vektors PSV-Pax1 ((Buchholz et al., Nucleic Acids Res., 24, 4256–4262 (1996)) 5' von seinem Puromycin-Resistenzgen und der loxP-Stelle ligasiert, wodurch das Plasmid pRK52 erhalten wurde. Die Sequenz und die Orientierung der geklonten attB-Stelle wurde durch eine DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Als Nächstes wurde eine attP-Stelle, die durch das Annealing der beiden synthetischen Oligonucleotide C31-6-2 (GATCCAGAAG CGGTTTTCGG GAGTAGTGCC CCAACTGGGG TAACCTTTGAG TTCTCTCAGTT GGGGGCGTAG GGTCGCCGAC ATGACACG; SEQ-ID Nr.: 19) und C31-7-2 (GATCCGTGTC ATGTCGGCGA CCCTACGCCC CCAACTGAGA GAACTCAAAG GTTACCCCAG TTGGGGCACT ACTCCCGAAA ACCGCTTCTG; SEQ-ID Nr.: 20) erzeugt wurde, in die BamHI-Restriktionsstelle des Plasmids pRK52 stromabwärts vom Puromycin-Resistenzgen und der loxP-Stelle ligasiert, wodurch das Plasmid pRK64-dir erhalten wurde. Bei diesem Plasmid befinden sich die neu geklonten attB- und attP-Stellen in derselben Orientierung und flankieren das Puromycin-Resistenzgen. Als Nächstes wurde ein HindII + NruI-Fragment mit 260 bp, das die attP- und eine loxP-Stelle enthielt, aus pRK64-dir isoliert und in das Plasmid pRK52 ligasiert, das zuvor mit BamHI + NruI geöffnet worden war (wobei das hervorstehende BamHI-Ende mit dem Klenow-Enzym und Nucleotiden gefüllt wurde), so dass das Fragment, das die Stromabwärts-loxP-Stelle enthielt, entfernt wurde. Das erzeugte Plasmid pRK73 trägt ein Puromycin-Resistenzgen, das von einer attB- und einer attP-Stelle in entgegengesetzter Orientierung flankiert wird, sowie ein Paar von loxP-Stellen in entgegengesetzter Orientierung (7A). Die Sequenz und die Orientierung der neu geklonten attP-Stelle in pRK73 wurde mittels einer DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
  • Konstruktion des C31-Int-Expressionsvektors pRK65 (SEQ-ID Nr.: 21): Zuerst wurde das C31-Int-Gen des Phagen phiC31 mittels PCR aus der Phagen-DNA amplifiziert (DSM-Nr. 49156; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 16, 38124 Braunschweig, Deutschland), wobei die Primer PC31-1 (5'-ATAAGAAT GCGGCCGC CCGAT ATG ACA CAA GGG GTT GTG ACC GGG-3'; SEQ-ID Nr.: 22) und PC31-3 (5'-ATAAGAAT GCGGCCGC ATC CGC CGC TAC GTC TTC CGT GCC-3'; SEQ-ID Nr.: 23) verwendet wurden. Die Enden des PCR-Produkts wurden mit NotI aufgeschlossen, und das Produkt wurde in das Plasmid pBluescript II KS ligasiert, mit NotI geöffnet, wodurch das Plasmid pRK40 erhalten wurde. Die DNA-Sequenz des Inserts von 1,85 kb wurde bestimmt, und es wurde gefunden, dass sie mit Ausnahme eines Fehlers im Stopp-Codon mit dem veröffentlichten C31-Int-Gen identisch war (Kuhstoss and Rao, 3. Mol. Biol. 222, 897–908 (1991)). Dieser Fehler wurde durch eine PCR-Amplifizierung des Fragments von 300 bp aus dem Plasmid pRK40 repariert, wobei die Primer PC31-8 (5'-CCCGTTGGCA GGAAGCACTT CCGG-3'; SEQ-ID Nr.: 24) und PC31-9 (5'-GGATCCTCGA GCCGCGGGCG GCCGCCTACG CCGCTACGTC TTCCGTGCCG TCCTG-3'; SEQ-ID Nr.: 25) verwendet wurden, die ein korrigiertes Stopp-Codon ergeben. Die Enden dieses PCR-Fragments wurden mit Eco47III und XhoI aufgeschlossen und das Fragment in das Plasmid pRK40 ligasiert, mit Eco47III und XhoI geöffnet, wodurch das defekte Stopp-Codon entfernt wurde. Das resultierende Plasmid pRK55 enthält das korrekte C31-Int-Gen, wie durch eine DNA-Sequenzanalyse bestätigt wurde. Das Gen wurde aus pRK55 als Fragment von 1,85 kb durch einen Verdau mit NotI und XhoI isoliert und in das Plasmid pRK50 ligasiert, mit NotI und XhoI geöffnet, wodurch der C31-Int-Expressionsvektor pRK65 erhalten wurde. PRK65 enthält einen unmittelbar frühen Cytomegalovirus-Genpromotor mit 700 bp (Position 1–700) und ein Hybrid-Intron mit 270 bp (Position 700–970) stromaufwärts von der NotI-Stelle und eine synthetische Polyadenylierungssequenz mit 189 bp (Position 2831–3020) stromabwärts von der XhoI-Stelle (wobei alle Elemente von pRK50 stammen). Zur Erzeugung des Cre-Expressionsplasmids CMV-Cre wurde die Codierungssequenz von Cre-Rekombinase in die NotI- und XhoI-Stellen des Plasmids pRK50 geklont.
  • B. Transfektion von Zellen und PCR-Amplifizierung:
  • MEF5-5-Maus-Fibroblasten (Schwenk et al., Nucleic Acids Research, 26, 1427–1432 (1998)) (20 000 Zellen pro Napf einer Platte mit 12 Näpfen (Falcon)) wurden mit 0,5 μg pRK73 allein oder zusammen mit 125 ng pRK65 oder CMV-Cre transfiziert, wobei das FuGene-Transfektionsreagens (Roche Diagnostics) verwendet wurde. Nach 2 Tagen wurde DNA aus diesen Zellen extrahiert und zur PCR-Amplifizierung mit den Primern P64-1 ((5'-TCA GCA ACC AGG CTC CCC AGC AGG C-3'; SEQ-ID Nr.: 26) und P64-3 (5'-TAG AGG ATC ATA AAT CAG CCA TAC CAC-3'; SEQ-ID Nr.: 27) verwendet, wobei der Expand High Fidelity PCR kit (Roche Diagnostics) verwendet wurde.
  • PCR-Produkte wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel getrennt, mit QuiaEx® (Quiagen) extrahiert und mittels des TA-Klonierungskits (Invitrogen) in den Vektor pCR2.1 geklont, was zu den Plasmiden pRK80b und pRK80c führte. Die Sequenzen der Inserte, die mittels des reversen Sequenzierungsprimers bzw. Standardverfahren (MWG Biotech) bestimmt wurde, sind in den SEQ-ID Nr.: 28 bzw. 29 veranschaulicht.
  • C. Ergebnisse:
  • Als Testvektor für eine C31-Int-vermittelte DNA-Inversion wurde das Plasmid pRK73 gemäß der Beschreibung in A. oben konstruiert. PRK73 enthält ein DNA-Segment mit einer Größe von 1,1 kb (der codierenden Region des Puromycin-Resistenzgens), das 5' von attB mit 84 bp und 3' von der attP-Erkennungsstelle mit 84 bp von C31-Int flankiert ist (7A). Diese attB- und diese attP-Stelle sind einander entgegengesetzt orientiert, was eine Inversion des flankierten DNA-Segments (7B) im Vergleich zur natürlichen Orientierung von attB und attB im Phagen phiC31 und dem Bakteriengenom ermöglicht, wodurch die Integration oder Deletion des Phagen-Genoms ermöglicht wird. Als Kontrolle enthält der Vektor pRK73 zusätzlich zwei Cre-Rekombinase-Erkennungs-(loxP-)Stellen in entgegengesetzter Orientierung neben den att-Stellen.
  • Das vorhergesagte Produkt der C31-Int-vermittelten Inversion von pRK73 ist in pRK73-inv (SEQ-ID Nr.: 30) aufgeführt.
  • Als zweite Komponente des gewünschten Testsystems konstruierten wir einen Säuger-Expressionsvektor für C31-Int, das Plasmid pRK65, das den CMV-IE- Promotor stromaufwärts von der C31-Int codierenden Region enthält, gefolgt von einem synthetischen Polyadenylierungssignal (8).
  • Der Rekombinationssubstrat-Vektor pRK73 wurde entweder allein oder zusammen mit dem C31-Int-Expressionsvektor pRK65 oder zusammen mit einem Expressionsvektor für Cre-Rekombinase, CMV-Cre, in die murine Fibroblasten-Zelllinie MEF5-5 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde DNA aus den drei Proben hergestellt und auf das Auftreten des erwarteten, mit Cre oder C31 erzeugten Inversionsprodukts mittels einer spezifischen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) getestet. Unter Verwendung der Primer P64-1 und P64-3 zur Amplifizierung kann ein Produkt mit 608 bp erst nach einer Rekombinase-vermittelten Inversion zwischen der lox- oder der att-Stelle erhalten werden (7B). Dieses Produkt stellt die Verbindung 5' des Puromycin-Resistenzgens dar, die von einer attB-Stelle im Vektor pRK73 eingenommen wird; nach einer C31-Int-vermittelten Inversion würde diese Stelle zu einer attR-Stelle rekombiniert.
  • Wie in 9A veranschaulicht ist, wurde ein solches Amplifizierungsprodukt nur in denjenigen Proben gefunden, die mit den Cre- oder C31-Rekombinase-Expressionsvektoren cotransfiziert waren. Um zu beweisen, dass das PCR-Produkt, das nach einer Cotransfektion der Plasmide pRK73 und pRK65 gefunden wurde, tatsächlich das Inversionsprodukt einer C31-Int-vermittelten Rekombination darstellt, wurde dieses DNA-Fragment in einen Plasmidvektor geklont, und seine DNA-Sequenz wurde bestimmt. Zwei unabhängige Klone, pRK80b und pRK80c, wurden analysiert und wiesen exakt die Sequenz einer attR-Stelle auf, die von einer C31-Int-vermittelten Rekombination erwartet wird (Thorpe und Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)), was zur Inversion des attB/attP-flankierten Puromycin-Resistenzgens führt (9B). Obwohl dies hier nicht formal bewiesen ist, folgt aus der Kenntnis zur C31-Int-vermittelten Rekombination (Thorpe and Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)), dass die 3' vom invertierten Puromycin-Resistenzgen angeordnete Verbindung eine attL-Stelle veranschaulicht.
  • Zusammengefasst demonstriert dieses Experiment, dass es möglich ist, in einer Säuger-Zelllinie ein DNA-Segment zu invertieren, das von einem Paar von C31-Int attB/attP-Erkennungsstellen flankiert ist, wodurch ein Paar von attR/attL-Stellen erzeugt wird. Weil die Kombination von attR/attL nicht von C31-Int allein rekombiniert wird (Thorpe and Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5505–5510 (1998)), stellt die oben beschriebene Reaktion ein System zur unidirektionalen Inversion von DNA-Segmenten dar.
  • Beispiel 3
  • Es wurden Plasmidvektoren konstruiert, die es ermöglichen, die Effizienz der Cre-Rekombinase-vermittelten Inversion eines DNA-Segments, das von verschiedenen einfach mutierten lox-Stellen flankiert ist, im Vergleich zur Inversion desselben DNA-Segments zu testen, das von einer Wildtyp-loxP-Stelle und einer doppelt mutierten lox-Stelle flankiert ist. Diese Vektoren wurden zusammen mit einem Cre-Expressionsvektor in eine Maus-Zelllinie transfiziert, und die relative Inversionseffizienz wurde über die Expression von β-Galactosidase als Reportergen bestimmt.
  • A. Vektorkonstruktion:
  • Konstruktion von pRK74 (SEQ-ID Nr.: 31): Ausgehend vom Plassmid pRK62, das mit dem Plasmid pRK57 identisch ist (siehe Beispiel 1), außer, dass ein Paar von (irrelevanten) FRT-Stellen in die PmeI-Stelle insertiert wurde, wurde eine XhoI – NotI-Kassette (wobei die hervorstehenden Enden aufgefüllt waren) in die NotI-Stelle von pRK62 (aufgefüllten Enden) ligasiert. Die Kassette von 4,4 kb enthält eine Spleißakzeptor-Sequenz von 120 bp vom Exon2 der größeren späteren Region des Adenovirus-Typs 2, gefolgt von der inneren Ribosomen-Eintrittsstelle eines ECMV-Virus und der codierenden Region von β-Galactosidase (AgeI-BamHI-Fragment von Plasmid pCH110; Pharmacia) und eine Polyadenylierungssequenz des Plasmids PSV-Pax1 (Buchholz et al., Nucleic Acids Res., 24, 4256–4262 (1996)). Das resultierende Plasmid pRK72 enthält die β-Galactosidase-Kassette zwischen einem Paar von lox66- und lox71-Stellen in entgegengesetzter Orientierung. Als Nächstes wurde das Plasmid pRK72 mit PacI geöffnet und mit einem PmeI-HindIII-Fragment (Enden geglättet) mit 850 bp des Plasmids pRK50 ligasiert, wodurch eine CMV-Promotor- und eine Spleißdonorstelle erhalten wurden (Choi et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3070–3074 (1991)), was zum Plasmid pRK74 führte. Zum pRK76 abzuleiten, wurde das Plasmid pRK72 mit SalI (gefüllte Enden) geöffnet und mit dem PmeI-HindIII-Fragment (Enden geglättet) mit 850 bp des Plasmids pRK50 ligasiert, was zum Plasmid pRK75 führte. PRK75 wurde mit dem Cre-Expressionsvektor p705-Cre (Buchholz et al., Nucleic Acids Research, 24, 3118–3119 (1996)) in E.-coli-DH5-Zellen cotransformiert, wodurch die β-Galactosidase-Kassette in Bakterien invertiert wurde. Einer der invertierten Subklone wurde als pRK76 (SEQ-ID Nr.: 32) bezeichnet. Zur Erzeugung des Cre-Expressionsplasmids CMV-Cre wurde die codierende Sequenz von Cre-Rekombinase in die NotI- und XhoI-Stellen des Plasmids pRK50 (SEQ-ID Nr: 33) geklont.
  • B. Transfektion und Messung der β-Galactosidase-Aktivität:
  • MEF5-5-Mausfibroblasten (Schwenk et al., Nucleic Acids Research, 26, 1427–1432 (1998)) (10 000 Zellen pro Napf einer Platte mit 24 Näpfen (Falcon)) wurden mit 1 μg pRK74 oder pRK76 allein oder zusammen mit 500 ng CMV-Cre-Plasmid transfiziert, wobei das FuGene-Transfektionsreagens (Roche Diagnostics) verwendet wurde. Nach 2 Tagen wurden die Zellen lysiert, und die β-Galactosidase-Aktivitäten wurden mit der β-Galactosidase-Reportergen-Anordnung (Roche Diagnostics) nach den Richtlinien des Herstellers unter Verwendung eines Luminometers Lumat LB 9507 (Berthold) bestimmt.
  • C. Ergebnisse:
  • Die Wirksamkeit der Cre-vermittelten Inversion eines DNA-Segments, das von den einfachen mutierten lox66- und lox71-Stellen flankiert war, wurde mit der Inversion desselben DNA-Segments, das von einer Wildtyp-loxP-Stelle und einer doppelt mutierten lox-Stelle unter Verwendung der Rekombinations-Substratvektoren pRK74 und pRK76 flankiert war, verglichen (10). Das Plasmid pRK74 enthält einen CMV-Promotor zur Expression in Säugerzellen, gefolgt von einer Kassette, die das E.-coli-β- Galactosidasegen und eine Polyadenylierungssequenz in inverser Orientierung zum CMV-Promotor enthält. Diese Kassette ist von den einfach mutierten lox-Stellen lox66 und lox71 in entgegengesetzter Orientierung flankiert (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)). Bei einer Expression von Cre-Rekombinase kann diese Kassette invertiert werden und ermöglicht die Erzeugung von β-Galactosidase als Maß für die Rekombinationseffizienz. Das Plasmid pRK76 ist wie pRK74 strukturiert, außer, dass die inverse β-Galactosidasekassette von einer doppelt mutierten lox-Stelle lox66/71 und einer Wildtyp-loxP-Stelle flankiert ist. Weil die Stellen lox66 und lox71 zu einem Paar aus lox66/71 (mit der Bezeichnung lox72 in Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)) und loxP-Stellen (Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995)) rekombiniert sind, ermöglicht der Vergleich der β-Galactosidase-Aktivitäten, die aus den Plasmiden pRK74 oder pRK76 nach einer Coexpression von Cre-Rekombinase erzeugt werden, einen Vergleich der relativen Effizienz, mit der ein Paar von lox66//lox71- oder lox66/71//loxP-Stellen rekombiniert wird.
  • PRK74 und pRK76 wurden vorrübergehend entweder allein oder mit dem Cre-Expressinsvektor CMV-Cre in eine murine Fibroblasen-Zelllinie transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen lysiert, und die Grade der β-Galactosidase-Aktivität in den Lysaten wurde mittels Chemolumineszenz bestimmt. Wie in Tabelle 2 unten aufgeführt ist, führte die Coexpression von Cre mit dem Plasmid pRK74 zu einer Erhöhung von 20024 RLU, während die Coexpression von Cre mit dem Plasmid pRK76 eine verminderte Aktivitätserhöhung von 7554 RLU aufwies. Wenn der letztere Wert als eine Inversionseffizienz von 1 definiert wird, wird das Plasmid pRK74 mit einer um das 2,64-Fache höheren Effizienz rekombiniert (Tabelle 2). Tabelle 2
    Plasmide β-Galactosidase-Aktivität (relative Lichteinheiten (RLU) Aktivitätsanstieg Relativer Anstieg
    pRK74 pRK74 + CMV-Cre 1923 21 947 20 024 2,64
    pRK76 pRK76 + CMV-Cre 5252 12 826 7574 1
    Keine DNA 1660
  • Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass ein Paar von lox66/loxP-Stellen (in pRK76) durch Cre in Säugerzellen (mittels Inversion) rekombiniert werden kann, wobei dieser Typ von Erkennungsstellen aber um das 3-fache weniger effizient als ein Paar von lox66/lox71-Stellen (in pRK74) erkannt wird. Somit sollte unter Gleichgewichtsbedingungen unter der Voraussetzung eines Sättigungsgrades von Cre-Rekombinase ein Plasmid, das eine der beiden lox-Stellen-Kombinationen enthält, so rekombiniert werden, dass etwa 75% der Moleküle die lox66/71//loxP-Konformation und etwa 25% der Moleküle die lox66/lox71-Konformation enthalten. Dieses Ergebnis bestätigt die ähnliche Beobachtung, die von Albert et al., The Plant Journal, 7, 649–659 (1995) für Pflanzenzellen erhalten wurde und bestätigt, dass eine ungleiche Rekombination zwischen mutierten lox-Stellen auch in einer murinen Zelllinie erfolgt.
  • Zusammenfassend kann diese Reaktion zum Verschieben des Gleichgewichts einer Cre-vermittelten Inversionsreaktion zu derjenigen Seite des Produkts, die das Paar von lox66/71//loxP-Stellen enthält, verwendet werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (11)

  1. Genfallen-Konstrukt, das dazu fähig ist, in Genen konditionale Mutationen zu verursachen, umfassend eine Polyadenylierungsstelle umfassende Genzerstörungskassette, wobei die Genzerstörungskassette von zwei Rekombinase-Erkennungssequenzen (RRS) flankiert wird, die aus mutanten loxP-Stellen, Mutanten-frt-Stellen und AttP/AttB-Stellen ausgewählt sind, die in entgegengesetzter Orientierung vorhanden sind und für die ortsspezifischen Rekombinasen Cre, Flp, ΦC31-Int und λ-Int spezifisch sind, wobei die ortsspezifischen Rekombinasen (i) zu einer unidirektionalen Inversion einer doppelsträngigen Genzerstörungskassette, die von den beiden vorhandenen RRS, die in entgegengesetzter Orientierung vorhanden sind, flankiert ist, fähig sind und (ii) die invertierte, doppelsträngige Genzerstörungskassette in einer Menge von mehr als 75%, bezogen auf die doppelsträngige Ausgangs-Zerstörungskassette, erzeugen.
  2. Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die RRS für eine ortsspezifische Rekombinase spezifisch sind, durch welche die invertierte, doppelsträngige Genzerstörungskassette in einer Menge von mehr als 90%, bezogen auf die doppelsträngige Ausgangs-Zerstörungskassette, erzeugt wird.
  3. Konstrukt nach Anspruch 2, wobei die beiden RRS einzelne mutante loxP-Stellen vorzugsweise eine lox66- und eine lox71-Stelle (SEQ-ID NR.: 2 und 3) oder eine AttP- und eine AttB-Stelle von ΦC31 sind und die ortsspezifische Rekombinase Cre bzw. ΦC31 ist.
  4. Konstrukt nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Genzerstörungskassette von zwei RRS-Paaren in entgegengesetzter Orientierung flankiert ist.
  5. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Genzerstörungskassette weiterhin ein oder mehr des Folgenden umfasst: einen Spleißakzeptor, einen Spleißdonor, eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle, ein Gen codierend für ein Reporterprotein, ein Resistenzgen und ein Gen, das für eine weitere ortsspezifische Rekombinase codiert.
  6. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das weiterhin eine Selektionskassette umfasst, die zur Selektion von Genen mit einem eingearbeiteten Genfallen-Konstrukt geeignet ist, wobei die Selektionskassette weiterhin ein Reporter- oder ein Resistenzgen und flankierende Rekombinase-Erkennungsstellen in derselben Orientierung umfasst.
  7. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend (a) eine Genzerstörungskassette, die von zwei RRS flankiert wird, die für eine erste ortsspezifische Rekombinase spezifisch sind, die zur unidirektionalen Inversion einer doppelsträngigen Genzerstörungskassette fähig ist, und (b) eine Selektionskassette, die in entgegengesetzter Orientierung in Bezug auf die Genzerstörungskassette angeordnet ist und von zwei RRS einer zweiten ortsspezifischen Rekombinase in derselben Orientierung flankiert ist.
  8. Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die Genzerstörungskassette einen Spleißakzeptor und eine Polyadenylierungssequenz umfasst, die von den beiden RRS der ersten ortsspezifischen Rekombinase flankiert sind, und die Selektionskassette ein Reporter- oder ein selektierbares Markergen umfasst, das stromaufwärts von einer Spleißakzeptor-Sequenz und stromabwärts von einer Polyadenylierungssequenz flankiert ist, wobei das Konstrukt ein konditionales Genfallen-Konstrukt ist, das Integrationen in exprimierte Gene selektiert.
  9. Konstrukt nach Anspruch 7, wobei die Genzerstörungskassette einen Spleißakzeptor und eine Polyadenylierungssequenz umfasst, die von den beiden RRS der ersten ortsspezifischen Rekombinase flankiert sind und die Selektionskassette ein Reporter- oder ein selektierbares Markergen umfasst, die stromaufwärts mit einer konstitutiven Promotor- und stromabwärts mit einer Spleiß-Donorstelle verknüpft sind, wobei das Konstrukt ein konditionales Genfallen-Konstrukt ist, das Integrationen in alle Gene selektiert.
  10. Zeile, umfassend das in den Ansprüchen 1 bis 9 definierte Genfallen-Konstrukt.
  11. Transgene Maus, enthaltend in einem Intron eines Gens ein Genfallen-Konstrukt gemäß der Definition in den Ansprüchen 1 bis 9 in einer Antisense-Richtung in Bezug auf das Gen.
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