ES2350178T3 - Procedimiento de producción de bibliotecas de proteínas y de selección de proteínas a partir de las mismas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque (a) en uno o dos lugares (loci) cromosómicos de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación; (b) se expande por lo menos una de las células así modificadas, que como alteración posee las señales específicas de recombinación en los loci de gen; (c) se transfecta a las células expandidas un gran número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y (d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que las han expresado.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento caracterizado en las reivindicaciones para la producción de una biblioteca (o banco) de proteínas de gran diversidad y para la selección de proteínas a partir de la misma, en especial de anticuerpos monoclonales humanos que tengan la especificidad deseada. La presente invención se refiere, pues, a un procedimiento para la producción de una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque

(a)

en una o dos regiones o lugares cromosómicos (loci) de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b)

se expande por lo menos una de las células así modificadas, que presenta como alteración las señales específicas de recombinación en los lugares (loci) de gen;

(c)

en las células expandidas se transfecta un gran número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d)

el gran número de secuencias diferentes de DNA se integran en los lugares (loci) de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación

y a la recombinasa específica de las mismas,

formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los lugares (loci) de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que se han expresado.

Hasta ahora se han realizado múltiples intentos encaminados a la producción de anticuerpos que tengan la especificidad deseada, en un rendimiento elevado y con buena compatibilidad humana, en especial anticuerpos destinados a agentes terapéuticos, a continuación se describen brevemente los procedimientos individuales.

Anticuerpos de hibridoma

En la década de los años setenta, Köhler y Milstein desarrollaron un método para la producción de anticuerpos, la técnica del hibridoma (Köhler y Milstein, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity; Nature 256, 495-497, 1975). Requiere en primer lugar la inmunización de un animal de ensayo (por lo general un ratón

o una rata). A continuación se extraen el bazo o ganglios linfáticos y se obtienen los linfocitos B (materiales previos de la síntesis de células productoras de anticuerpos), que existen en ellos en gran número. Debido a “su” reordenamiento genético individual, cada linfocito B produce anticuerpos que tienen una única especificidad de unión. Los descendientes de este linfocito B, los clones de linfocito B, producen exclusivamente anticuerpos que tienen esta especificidad de unión.

Algunas de las células obtenidas del bazo de un animal inmunizado producen anticuerpos de la especificidad deseada. Para poderlos producir “in vitro”, se tienen que multiplicar los linfocitos B en un cultivo celular. Esto se consigue fusionándolos con células de mieloma, derivadas de un tumor de células plasmáticas. Las células de hibridoma resultantes tienen las propiedades de los dos componentes fusionados: por un lado tienen la inmortalidad de las células cancerosas, por lo lado producen el correspondiente anticuerpo del componente linfocito B. Los descendientes de una célula de hibridoma individual (es decir, su clon) producen anticuerpos que tienen una especificidad definida. Por ello, estos anticuerpos se denominan anticuerpos monoclonales. La técnica de la producción de hibridomas se representa esquemáticamente en la figura 1. Una ventaja de los anticuerpos monoclonales con respecto a los anticuerpos policlonales estriba en que

pueden

producirse en cantidades en principio ilimitadas

gracias a las células que ahora son

inmortales.

Inconvenientes

Con

la anterior técnica de hibridoma se inmunizan

ratones y después se fusionan los linfocitos B de ratón con una línea celular de mieloma. Las células de hibridoma así formadas se propagan después por separado en forma de clones individuales de células y se analiza el líquido sobrenadante de los clones individuales para determinar si tiene la especificidad de anticuerpo deseada. Los clones individuales identificados tienen que subclonar a continuación de modo inmediato en una segunda ronda de selección, ya que en esta fase temporal son genéticamente inestables.

Este procedimiento requiere mucha dedicación de tiempo, de modo que a fin de cuentas solamente podrán verificarse como máximo algunos millares de clones de hibridoma y determinar si tienen la especificidad deseada. La construcción y la exploración de una biblioteca de hibridomas con esta técnica solamente son posibles de forma muy limitada. Por ello, la automatización de este procedimiento

es

muy difícil. Esta técnica convencional no permite la

producción de anticuerpos humanos.

Razas

de ratones, que producen anticuerpos de

hibridomas humanos

Un caso especial son los anticuerpos de hibridomas humanos, que se obtienen de ratones transgénicos, cuyo lugar

o locus de gen de inmunoglobulina se reemplaza por porciones del locus de gen de inmunoglobulina humana (Jakobovits, Production of fully human antibodies by transgenic mice; Curr. Opin. Biotechnol. 6, 561-566, 1995; Lonberg y Huszar, Human antibodies from transgenic mice; Int. Rev. Immunol. 13, 65-93, 1995; Kucherlapati y col., patente US-6114598: Generation of xenogeneic antibodies). Los genes de anticuerpos humanos se reordenan, sufren un cambio de clase (class switch) y una hipermutación somática. Estos ratones transgénicos producen, pues, anticuerpos humanos en células de ratones, que (a diferencia de las células de hibridomas humanos) conducen a hibridomas murinos estables.

Inconvenientes

Es cierto que con esta técnica se pueden producir anticuerpos humanos, pero esta técnica es tan laboriosa y complicada como la técnica de los hibridomas antes debatida. Hasta el presente se sabe muy poco de la calidad real de las razas de ratones transgénicos que se generan. Por ello se han formulado preguntas como las siguientes: ¿Interfieren los anticuerpos humanizados en otras señales de los ratones? ¿Qué calidad tiene la respuesta inmune de los ratones? ¿Cuántos genes de anticuerpo funcionan / están en el genoma del ratón? Etc. Por consiguiente, actualmente no está claro si estos “ratones humanizados” podrán satisfacer las esperanzas que se han puesto en ellos.

Anticuerpos de hibridoma humanizados

Ya se dispone de un gran número de anticuerpos de hibridoma de ratón que son potencialmente interesantes desde el punto de vista terapéutico. Pero un problema para su utilización terapéutica estriba en su origen murino, ya que el sistema inmune humano detecta como ajenas las proteínas de una especie ajena. Esto se aplica también a los anticuerpos de ratón. Surge la llamada respuesta inmune “HAMA” (anticuerpos humanos anti-ratón). En pocos días, los anticuerpos generados por el sistema inmune humano suelen neutralizar los anticuerpos de ratón empleados con fines terapéuticos y los convierten en ineficaces. Por lo tanto, una terapia reiterada solo es posible con muchas limitaciones (Courtenay-Luck y col., Development of Primary and Secondary Immune Responses to Mouse Monoclonal Antibodies Used in the Diagnosis and Therapy of Malignant Neoplasms; Cancer Res. 46, 6489-6493, 1986; Lamers y col., Inhibition of bispecific monoclonal antibody (bsAb) targeted cytolysis by human antimouse antibodies in ovarian carcinoma patients treated with bsAb targeted activated T lymphocytes; Int. J. Cancer 60, 450-457, 1995).

La gran mayoría de anticuerpos HAMA va dirigida contra la porción constante de los anticuerpos, razón por la cual se ha pasado a la producción de anticuerpos quiméricos. Estos contienen un dominio variable de anticuerpo de ratón, al que siguen los dominios constantes de anticuerpo humano. Para ello se coloca en primer lugar un gen de anticuerpo humano en un vector de clonación (Wright y col., Genetically engineered Antibodies: Progress and Prospects; Critical Rev. Immunol. 12, 125-168, 1992). Los distintos dominios del anticuerpo forman unidades compactas de plegado, que están unidades entre sí mediante una hebra peptídica. Si se reemplazan dominios completos de anticuerpo, las posibilidades de fallo del funcionamiento de los anticuerpos serán mínimas. Con la invención de la PCR es posible sin ningún problema la producción de cDNA quiméricos, porque con esta técnica se simplifican notablemente las clonaciones exactas. Los anticuerpos quiméricos resultantes se siguen fijando sobre el antígeno, pero se reduce en gran manera la respuesta HAMA.

Pero más importante que la reacción HAMA es todavía otro punto: dado que los dominios constantes proceden ahora del hombre, estos anticuerpos quiméricos activan también mucho mejor algunas funciones del auxiliar (helper), como son la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o la activación de complemento. Esta es otra razón, por la que algunos de tales anticuerpos humanizados ya se están utilizando clínicamente (McLaughlin y col., Clinical status and optimal use of Rituximab for B-cell lymphomas; Oncology 12, 1763-1777, 1998).

Inconvenientes

También la humanización de anticuerpos de hibridoma ya existentes es muy laboriosa y requiere mucha dedicación de tiempo. Además a menudo suele ser también problemática la estabilidad de los hibridomas así obtenidos: las células mutan o secretan pocos anticuerpos al medio.

Humanización por recombinación homóloga

En la patente US-5202238 se describe un método, con el que se pueden humanizar los anticuerpos murinos monoclonales. La parte central del método consiste en la llamada “recombinación homóloga”. Con ella se recombinan secuencias humanas, flanqueadas por secuencias murinas genómicas apropiadas, en una posición exacta del locus activo del anticuerpo. La gran ventaja de este método está en que se conservan en su mayor parte las señales del locus del anticuerpo optimizadas para una buena producción de anticuerpo (Yarnold y Fell, Chimerization of antitumor antibodies via homologous recombination conversion vectors; Cancer Research 54, 506-512, 1994; Fell y col., Homologous recombination in hibridoma cells: heavy chain chimeric antibody produced by gene targeting; PNAS 86, 8507-8511,

1989).

Inconvenientes

De modo similar a la generación de hibridomas, en este procedimiento se requiere mucha dedicación de tiempo antes de poder aislar un solo hibridoma humanizado. Millares de clones tienen que cultivarse por separado y analizarse. Otro inconveniente deriva del marcador de selección empleado: este conduce al parecer a un número elevado de revertidos (el locus del anticuerpo humano recombinado se recorta de nuevo en la reacción inversa) y/o a una merma del nivel de expresión (Baker y col., J. Immunological Methods 168, 25-32, 1994). Por otro lado, los genes de resistencia empleados impiden la presentación de los anticuerpos en la superficie, cuando se incorporan al intrón entre el exón CH3 y el exón M1 de una IgG.

Anticuerpos recombinantes

En los últimos años, con la construcción de los anticuerpos recombinantes se ha abierto una nueva vía para la producción de fragmentos de anticuerpo basada en métodos de tecnología genética (Breitling y Dübel, 1997, “Rekombinante Antikörper”, editorial Spektrum, ISBN 3-8274-0029-5). En este método ya no se generan los anticuerpos en un animal experimental (ni en el organismo humano), sino “in vitro”, en bacterias o en un cultivo celular. Para ello es esencial la parte del anticuerpo que se une al antígeno. Por lo general, con el fin de conseguir un buen rendimiento, se prescinde del resto de la molécula del anticuerpo. Estos fragmentos ya no pueden transmitir de modo natural todas las funciones de un anticuerpo obtenido de forma natural. Pero trabajando así se pueden fusionar de modo relativamente fácil con enzimas o con otros anticuerpos. Estos anticuerpos recombinantes adquieren así propiedades completamente nuevas. El término “anticuerpos recombinantes” indica un fragmento de anticuerpo producido “in vitro” por tecnología genética, que por lo demás se define exclusivamente por su especificidad de antígeno.

Inconvenientes

A los anticuerpos recombinantes les falta la parte constante de anticuerpo y, por tanto, las funciones efectoras que son esenciales para muchos usos terapéuticos. Por consiguiente, para muchos usos se “injertan” “cabezas buscadoras de anticuerpo” de nueva creación en los vectores eucariotas de expresión, es decir, se emplea el método antes descrito que requiere mucha dedicación de trabajo. Aparte del trabajo experimental requerido, puede suceder que se obtenga una mala expresión, porque en el sistema bacteriano hay otros codones que pueden ser más preferidos que en los sistemas eucariotas. Otro inconveniente deriva de las propiedades de los anticuerpos de “cadena simple” (scFv) que se emplean con mayor frecuencia: por lo general son relativamente inestable y se agregan con facilidad. Además, parece que muchos dominios variables son atacados por las proteasas de la E. coli. Por consiguiente, deberán considerarse con precaución las complejidades publicadas de las bibliotecas de anticuerpos scFv (hasta 1011). Aparte de los problemas recién descritos, en estas bibliotecas existen además muchos artefactos de clonación. Esto significa a su vez que, a más tardar después de 4 rondas de selección, los clones seleccionados acaban representando casi exclusivamente artefactos. Otro inconveniente es el hecho de que por lo general se requiere más de una ronda de selección para obtener los anticuerpos deseados. Esto se debe a que por fago solamente se presentan 0,1 anticuerpos scFv en la superficie del fago. Es muy probable que este valor varíe mucho en función del anticuerpo presentado. Otro inconveniente es que

la

identidad del clon concreto (es decir, ¿el clon

seleccionado

produce realmente un anticuerpo?) tiene que

comprobarse por métodos relativamente costosos.

Presentación de anticuerpos en la superficie de las células de hibridoma

Este método se basa en la técnica de hibridoma recién descrita. Pero, a diferencia de ella, se emplea (y se produce) una línea celular de mieloma estable, que ancla en grandes cantidades una proteína de unión de anticuerpo (p.ej. la proteína G) sobre la superficie de las células (Breitling y col., Selección de anticuerpos monoclonales, 1999; DE 199 00 635 A1; solicitud PCT que lleva el número PCT DE 00/00079). Con ello se evita buena parte del trabajo que requieren la clonación y la subclonación de los hibridomas monoclonales. En su lugar, las especificidades de anticuerpo deseadas pueden aislarse en el clasificador FACS o en las esferillas magnéticas de un conjunto (pool) de hibridomas, porque los anticuerpos producidos se anclan sobre la superficie de las células gracias a la unión con la proteína descrita de fijación de anticuerpos.

Inconvenientes

Esta técnica evita solamente una parte del costoso trabajo de selección de las especificidades de los anticuerpos individuales. Sigue siendo necesaria la inmunización de ratones y la fusión posterior de los linfocitos B de ratón con una línea celular de mieloma. Esto se realiza con una eficacia relativamente mala: por lo general por fusión y ratón se generan solamente 100-500 hibridomas distintos. Las células de hibridoma así formadas presentan una gran variabilidad, que no se desea, en el número de anticuerpos presentados, lo cual merma en gran manera la selección realizada en el clasificador FACS. Por otro lado, debido al anclaje no covalente de los anticuerpos sobre la superficie, surge una interferencia (cross talk) de las especificidades de los distintos anticuerpos. Por ello, las distintas células de hibridoma presentan en la superficie no solo “sus” anticuerpos correspondientes, sino también otras especificidades de anticuerpo, que otras células de hibridoma han entregado al medio. Este procedimiento requiere también mucha dedicación de trabajo, de modo que a fin de cuentas se pueden generar como máximo algunas decenas de millares de hibridomas distintos (y después comprobar si poseen la especificidad deseada). Por consiguiente, con esta técnica existe solamente una posibilidad limitada de construcción y de exploración de una biblioteca de hibridomas. Esto se aplica también a la automatización de este procedimiento. Esta técnica tampoco permite la

producción de anticuerpos humanos. Intercambio de cassettes por recombinación específica

Existe actualmente una serie de procedimientos, que permiten una recombinación específica de lugar (locus) de DNA dentro de una célula eucariota (véase p.ej. Sauer, patente US-4959317: Site-specific recombination of DNA in eukaryotic cells; Leboulch y col., patente US-5928914: “Methods and compositions for transforming cells; Feng y col., Sitespecific chromosomal integration in mammalian cells: highly efficient CRE recombinase-mediated cassette exchange; J. Mol. Biol. 292, 779-785, 1999). Todos estos procedimientos emplean una recombinasa (p.ej. Flp, Cre, Int, etc.), que reconoce secuencias específicas de DNA y las recombina con otras secuencias de DNA. Son características de este procedimiento las eficacias a menudo relativamente elevadas de los acontecimientos de recombinación específica, que pueden conseguirse con este procedimiento “in vitro”, pero también “in vivo”. Este procedimiento se emplea p.ej. como auxiliar de clonación (intercambio de los cassettes de DNA “in vitro”), pero también para recombinación “in vivo” en bacterias vivas, en células eucariotas vivas o incluso en ratones transgénicos.

Inconvenientes

Hasta ahora no se ha descrito el intercambio de cassettes de genes de anticuerpos en células eucariotas en combinación con la expresión en la superficie y la posterior selección de anticuerpos monoclonales.

El problema técnico que subyace en la presente invención es, pues, el desarrollo de un procedimiento para la producción de una biblioteca de proteínas, con preferencia de una biblioteca de anticuerpos, o bien la selección de proteínas, con preferencia anticuerpos, que tengan las especificidades deseadas, que no tenga los inconvenientes los procedimientos convencionales descritos en páginas anteriores. Este procedimiento debería poder aplicarse también p.ej. a la generación de una biblioteca de diferentes receptores de células T. Este procedimiento deberá combinar entre sí en especial las ventajas de la técnica de los anticuerpos recombinantes con la de los anticuerpos de hibridoma:

-

la selección sencilla de reactividades específicas a partir de un gran número de anticuerpos distintos (más en general: de proteínas distintas), a ser posible en combinación con una gran intensidad de señal durante el proceso de selección (p.ej. cada una de las células presenta anticuerpos iguales);

-

la modificación relativamente sencilla de los genes expresados, p.ej. la fusión de cadenas cortas de anticuerpos con un anticuerpo de cadena única (anticuerpos biespecífico)

o la fusión con otra porción de proteína (véase también: Bispecific Antibodies, de Michael W. Fanger, editorial Springer, 1995, ISBN 3-540-58885-X);

-la producción de grandes cantidades de anticuerpos (proteínas) seleccionados que tienen una buena calidad para fines de diagnóstico o de terapia, en especial con una variante que se entrega al medio de cultivo y

-con la verificación y caracterización sencillas de la línea celular o sub-biblioteca seleccionada.

La solución de este problema técnico se consigue con el desarrollo de las formas de ejecución definidas en las reivindicaciones. Con la presente invención puede acelerarse la selección de las células, que producen proteínas específicas (p.ej. anticuerpos monoclonales). El número de células, que se pueden analizar para determinar si tienen una especificidad predeterminada, puede incrementarse en varios órdenes de magnitud con el procedimiento de la invención. La selección de proteínas (anticuerpos) se realiza en una sola ronda. Esto es posible gracias al gran número de proteínas (anticuerpos) presentadas en la superficie de las células y además gracias al número relativamente homogéneo de proteínas (anticuerpos) presentadas por las células correspondientes. Mediante la biblioteca de anticuerpos producidos con arreglo al procedimiento de la invención puede realizarse fácilmente la búsqueda de las especificidades de los diferentes anticuerpos. Esta automatización permite además la búsqueda de anticuerpos expresados de modo monoclonal, con lo cual puede aprovecharse mejor la gigantesca anchura de banda de la aplicación de los anticuerpos monoclonales. Con ello a su vez se puede aprovechar mejor el potencial obviamente grande de los anticuerpos humanos o humanizados en la terapia de enfermedades. Con la selección simplificada de anticuerpos monoclonales de hibridoma recién nombrada se obtienen clones de células, que producen anticuerpos monoclonales en grandes cantidades y, si se comparan con los anticuerpos recombinantes, también en una calidad superior. Por otro lado, la selección de las células puede realizarse sin la incorporación de marcadores de resistencia, lo cual es ventajoso, porque estos en muchos casos merman manifiestamente la expresión del producto genético modificado y al mismo tiempo la estabilidad de las líneas celulares obtenidas. De este modo, p.ej. la integración del marcador de resistencia entre el exón CH3 (eventualmente el exón CH4) y el exón M1 impide que una variante de empalme fijada sobre la membrana pueda anclar los anticuerpos sobre la superficie de las células que los presentan, con lo cual se impide una expresión especialmente simple basada en la expresión superficial de los anticuerpos específicos de antígenos (figura 2). Además, una forma de ejecución de la presente invención permite la humanización sencilla de los hibridomas murinos y de este modo p.ej. también el establecimiento de un amplio abanico de anticuerpos monoclonales de la misma especificidad de antígeno pero distintas porciones Fc. Gracias a este aspecto puede sacarse provecho del gran trabajo previo en el ámbito de los anticuerpos murinos monoclonales para la producción relativamente sencilla de agentes terapéuticos humanos.

El procedimiento de la invención se basa en que un número grande y muy uniforme de anticuerpos, si se compara de una célula a otra, se une mediante enlace covalente a superficie de una célula eucariota y por ello pueden esperarse señales comparables entre una célula y otra. De este modo pueden seleccionarse de modo simple los anticuerpos específicos junto con las células, que los presentan, entre un gran número de células. Como resultado de esta selección se obtiene un anticuerpo monoclonal. Se obtiene el grupo de células que presentan a los anticuerpos por reestructuración de una célula eucariota. Esto se realiza en especial mediante varios acontecimientos sucesivos de recombinación homóloga (figuras 3, 4, 7 y 8) y específica (figuras 5, 6 y 9). Son especialmente idóneas para ellos las células de hibridoma murino (figura 3). Como alternativa puede utilizarse también p.ej. una línea celular de mieloma humano como punto de partida para las recombinaciones homólogas sucesivas (figura 4). Esto tiene la ventaja adicional de que se evita la glucosilación ligeramente diferente de los anticuerpos producidos en células murinas, si se comparan con los producidos en células humanas. Pueden utilizarse también otras líneas celulares estables, en especial aquellas líneas celulares que generan un determina producto genético en grandes cantidades, p.ej. un linfoma de células T.

Con el procedimiento de la invención se genera una gran variedad de anticuerpos (figuras 5, 6, 9). Otro elemento de esta invención permite la selección de células individuales entre la gran variedad generada previamente. Esto es posible por la presentación de los anticuerpos en la superficie (figuras 2, 9, 10). A diferencia de la técnica aplicada hasta el presente, esto se realiza (a) con preferencia por la unión covalente de los anticuerpos a la superficie de las células y

(b) mediante células eucariotas, con preferencia células de mamíferos, con lo cual se evitan los inconvenientes antes descritos de algunas de las técnicas aplicadas hasta el

presente.

En una forma de ejecución especial, el procedimiento de la invención conlleva una hipermutación somática de los anticuerpos (y genes) presentados, en especial para seleccionar anticuerpos que puedan unirse a un antígeno con mayor afinidad. Para ello pueden emplearse p.ej. en el contexto de los lugares (loci) de gen de anticuerpo dos vectores de expresión para el RAD54, RecQ4 y para la DNApolimerasa polX-mu (figura 11), en especial en combinación con un vector, que expresa el RNA anti-sentido contra XRCC2, XRCC3 o RAD51B. Como alternativa p.ej.:

-con una PCR susceptible de error se introduce un gran número de mutaciones no dirigidas, en especial en genes de anticuerpos variables ya preseleccionados;

-se recombina un gran número de estos genes de anticuerpos variables mutados mediante señales de recombinación específicas y se introducen en el locus de anticuerpo (figuras 5, 6); y

-a continuación se seleccionan las células p.ej. con un clasificador FACS, que presentan en la superficie un anticuerpo de mayor afinidad (figura 10).

Dichas mutaciones no dirigidas pueden combinarse entre sí p.ej. con arreglo al procedimiento desarrollado por Stemmer (Nature 370, 389-391, 1994). También es posible mediante las señales de recombinación específicas intercambiar en una célula productora de anticuerpos preseleccionados sencillamente el dominio variable de una cadena de anticuerpos por un gran número de otros dominios variables (figuras 5, 6, 9) y a continuación buscar las variantes más afines. De este modo, el procedimiento de la invención apunta hacia nuevas vías que permiten “in vitro” la hipermutación somática y la posterior selección de los anticuerpos más afines (figuras 10, 11).

Resumiendo, el procedimiento de la invención presenta las ventajas siguientes: permite la producción de una biblioteca muy compleja p.ej. como fuente de anticuerpos monoclonales (figuras 6, 9) y también la selección sencilla, en especial de anticuerpos monoclonales humanos muy afines (figura 10, 11). Al mismo tiempo pueden ampliarse las perspectivas de éxito de dicha selección. Gracias al número grande y relativamente uniforme de anticuerpos presentados de igual especificidad puede aumentarse la intensidad de señal durante la búsqueda de anticuerpos monoclonales específicos. Los anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad que pueden obtenerse con buen rendimiento por el procedimiento de la invención pueden utilizarse p.ej. como agentes para el diagnóstico y la terapia de tumores. Además, en lugar de anticuerpos pueden presentarse también otras proteínas o dominios individuales de proteínas, en especial exones, sobre la superficie en cada caso de “su” célula, con lo cual es posible una búsqueda especialmente simple de componentes de unión para estos fragmentos proteicos presentados.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Representación esquemática de la producción de células de hibridoma. Los linfoblastos B se fusionan con una línea celular de mieloma (p.ej. Ag8.653) por lo general añadiendo una mezcla de polietilenglicol (PEG) con DMSO. A continuación se propagan los distintos clones de las células por dilución limitada y después de aprox. 14 días se analiza el líquido sobrenadante de su cultivo celular para determinar la reactividad de los anticuerpos específicos buscados. La célula de hibridoma resultante hereda las propiedades de las dos células progenitoras: la célula de mieloma controla la inmortalidad de una línea de células tumorales y algunas señales de regulación para la producción eficaz de anticuerpos, mientras que el linfoblasto B aporta una reactividad de anticuerpo específica de los fragmentos de anticuerpo recombinados genómicamente. Inicialmente, la célula de hibridoma resultante es genéticamente inestable, de

modo que por lo

menos en una ronda posterior de selección

tiene

que establecerse una variante genéticamente más

estable.

Figura 2

A. Secuencias genómicas de un gen de anticuerpo IgG1 recombinado genómicamente. Se representa la estructura genómica de la cadenas corta con el promotor (P), el intensificador (e), el exón líder (L), los dominios vL (vL) con el segmento J genómicamente recombinado (J) y el exón de los dominios constantes de la cadena corta (cL). Se representa también la estructura genómica de la cadena larga con el promotor (P), el intensificador (e), el exón líder (L), los dominios vH (vH) con los segmentos D y J genómicamente recombinados (DJ) y el exón de los dominios constante CH1, bisagra (H), CH2 y CH3 de la cadena larga. En el extremo 3’ del gen IgG1 se encuentran dos exones, que codifican un ancla de membrana (M1 y M2).

B. mRNAs empalmados de un anticuerpo IgGl. Se representa el mRNA empalmado de la cadena corta y de dos mRNAs empalmados de modo diferencial de la cadena larga, que codifican una variante secretoria (sIgG1) o una variante unida a la membrana (mIgG1) de una IgG1.

C. Proteína de anticuerpo IgGl. Se representa la cadena corta de anticuerpo con los dominios vL y CL. Se ha desprendido el péptido líder. La cadena larga de anticuerpo existe en 2 variantes,

-con los dominios vH, CH1, H, CH2, CH3 (forma secretada; sIgG1) o

- con los dominios vH, CH1, H, CH2, CH3, M1 y M2 (forma unida a membrana; mIgG1).

Figura 3

Recombinación homóloga. Mediante la recombinación

homóloga se pueden modificar las secuencias de DNA de lugares (loci) de gen definidos. Esta técnica se aplica actualmente sobre todo para la producción de líneas celulares ES modificadas o de ratones transgénicos. El experimentador prescribe en primer lugar una primera secuencia definida de DNA, que está flanqueada por ambos lados por otras secuencias de DNA. Estas secuencias adicionales de DNA deberían contener por lo general regiones homólogas de una longitud >700 pares de bases (bp), que tienen su correspondencia en los cromosomas: los lugares (loci) de gen definidos con ellas. Dentro de estas secuencias adicionales de DNA tienen que producirse acontecimientos de recombinación (representados mediante líneas en forma de aspa), para que las regiones cromosómicas situadas entre las secuencias adicionales de DNA puedan intercambiarse entre DNA quimérico y cromosómico. Después de la transfección del DNA quimérico apropiado, en especial linealizado (representado por encima del DNA cromosómico), este acontecimiento muy singular tiene lugar en aprox. 1 de cada 107 células. En la figura se representan lugares (loci) de gen de la línea celular de hibridoma murino HEA125 apropiada para ello en el sentido de esta invención (véase también la figura 2). Si en virtud de una recombinación homóloga se modifica el anticuerpo presentado en la superficie, entonces la célula en cuestión podrá aislarse mediante un clasificador FACS. En función de la elección de las secuencias adicionales de DNA mencionadas, el experimentador decidirá si además de la introducción de dicha primera secuencia de DNA se suprimen regiones más o menos grandes después de la recombinación homóloga. En la figura se representan:

I. El intercambio del exón del dominio kappa constante murino por un exón, que codifica al dominio kappa constante humano;

II. El intercambio del exón CH1, CH2 y CH3 de los dominios constantes de IgG1 murina por un exón correspondiente de los dominios constantes de la IgG1 humana (el exón bisagra no se representa);

III. Igual que en el apartado II., pero en este caso se suprimen además las secuencias de DNA del intrón entre el dominio CH3 y el dominio M1 de la IgG1 codificada;

IV.

El intercambio del exón del dominio variable vL1 activo por un exón que codifica p.ej. el dominio vL2 seleccionable en el clasificador FACS, con lo cual se introducen al mismo tiempo las señales específicas de recombinación (FRT0 y FRT3), que la recombinasa Flp reconoce; y

V.

El intercambio del exón del dominio vH1 variable activo, que codifica p.ej. al dominio vH2 seleccionable en el clasificador FACS, con lo cual se introducen simultáneamente dos señales específicas de recombinación (loxP1 y loxP2), que la recombinasa Cre reconoce.

Si se realizan sucesivamente los acontecimientos de recombinación homólogas I, III, IV y V representados en la figura y se aíslan las líneas celulares correspondientes, entonces se forma una línea celular de hibridoma, que presenta en su superficie un anticuerpo monoclonal definido en un número relativamente grande. Gracias a las señales de recombinación específicas introducidas, los dominios variables de este anticuerpo monoclonal pueden intercambiarse de modo relativamente simple por los dominios correspondientes de otros anticuerpos o de grupos de anticuerpos.

Figura 4 Reestructuración de una línea celular humana por

recombinación homóloga. A diferencia de los acontecimientos

de recombinación homóloga representados en la figura 3, en la figura 4 se representa la modificación de una línea celular humana (p.ej. IM-9 o U266) mediante diversos acontecimientos de recombinación homólogas. En la figura se representan:

I. (b.) El intercambio de los exones CH1, CH2 y CH3 p.ej. de los dominios constantes de la IgA humana por los exones correspondientes de los dominios constantes de la IgG1 humana, con lo cual pueden suprimirse adicionalmente secuencias de DNA del intrón entre el dominio CH3 y el dominio M1 del IgG1/IgA codificado;

II. El intercambio del exón del dominio vL1 variable

activo

por un exón, que codifica p.ej. un dominio vL2

seleccionable

en el clasificador FACS, con lo cual se

introducen

simultáneamente dos señales de combinación

específicas (FRT0 y FRT3), que la recombinasa Flp reconoce (como en la figura 3); y

III. El intercambio del exón del dominio vH1 variable activo por un exón, que codifica p.ej. un dominio vH2 seleccionable en el FACS, con lo cual se introducen simultáneamente dos señales específicas de recombinación (loxP1 y loxP2), que la recombinasa Cre reconoce (igual que en la figura 3).

Figura 5

Recombinación específica. Con la recombinación específica pueden alterarse secuencias cromosómicas de DNA o lugares (loci) de gen definidos con una eficacia relativamente grande. Para ello, por influencia de una recombinasa como la Cre o la Flp, los DNAs recombinan entre sí en señales de recombinación específicas, con lo cual se intercambian las secuencias de DNA que están flanqueadas por estas señales. En este tipo de intercambio de cassettes, el DNA a intercambiar está flanqueado en cada caso por dos señales de recombinación distintas, que no reaccionan entre sí. En la figura se representa el intercambio de cassettes de las secuencias de DNA gracias a la Cre o Flp. Después de la transfección del DNA quimérico idóneo, es especial circular (representado por encima del DNA cromosómico), el DNA circular se integra en primer lugar por recombinación con una de las dos señales específicas de recombinación en el cromosoma (representado por líneas cruzadas). A continuación, un DNA también circular se corta por acción de la recombinasa (no se representa). Esto sucede por azar, ya sea en las mismas señales de recombinación que para la integración, ya sea en las dos señales de recombinación restantes. Con ello se produce un equilibrio entre las secuencias de DNA originales y las resultantes del intercambio. A continuación se presenta un anticuerpo modificado sobre la superficie (ver también la figura 2), de modo que la célula en cuestión puede aislarse mediante el clasificador FACS. En la figura se representan:

VI. El intercambio del exón de un dominio vkappa definido por un exón de un grupo de exones distintos, que codifican en cada caso a otros dominios vkappa;

VII. El intercambio del exón de un dominio vlambda

definido por un exón de un grupo de exones distintos, que codifican en cada caso a otros dominios vlambda; y

VIII. El intercambio del exón de un dominio vH definido por un exón de un grupo de distintos exones, que codifican en cada caso a otros dominios vH.

Si se ejecutan sucesivamente los acontecimientos de recombinación específica VI y VIII o bien VII y VIII representados en la figura y resulta enriquecido el grupo de células correspondiente, entonces se genera una biblioteca de anticuerpos de hibridoma, cuyos representantes individuales (células) presentan en cada caso un anticuerpo monoclonal definido en un número relativamente grande. Las células de

hibridoma que

se aíslan de este modo producen anticuerpos

monoclonales,

en especial humanos, en un rendimiento y

calidad elevados.

Figura 6

Introducción de señales de recombinación específica en lugares (loci) de gen activos. En la figura se representa:

I. La transfección de una línea celular con DNA-vector, que codifica a un gen de resistencia (p.ej. resistencia a G418), que está flanqueado por 2 sitios FRT diferentes, y la selección (p.ej. con G418) de una línea celular, que lleva integrado en el cromosoma el gen de resistencia junto con los sitios FRT en un lugar (locus) activo del gen.

II. El intercambio de cassettes del gen de resistencia mediante la recombinación específica con la Flp por las secuencias de DNA, que se codifican a los exones bisagra (no representado), CH2, CH3, M1 y eventualmente M2 de un anticuerpo IgG fusionado con un primer gen de un primer anticuerpo scFv (véase también la figura 2). El gen del primer anticuerpo scFv está flanqueado por dos lugar loxP distintos. La selección de este acontecimiento de recombinación se realiza p.ej. en el clasificador FACS por la presentación de la proteína de fusión del anticuerpo scFv en la superficie celular.

III. El intercambio del primer gen de un primer anticuerpo scFv por otro gen de un grupo de más genes de más anticuerpos scFV mediante la Cre.

IV. Si se realizan sucesivamente los acontecimientos de recombinación I, II y III representados en la figura y se enriquece el grupo correspondiente de células, entonces se genera una biblioteca de anticuerpos scFv, cuyos representantes individuales (células) presentan en su superficie en cada caso un anticuerpo scFv monoclonal definido en un número relativamente grande. Las células aisladas de este modo producen anticuerpos monoclonales scFvCH2-CH3, en especial humanos, en un rendimiento y calidad buenos.

La secuencia circular de DNA de un primer gen de anticuerpo scFv representada en la figura 6, II., puede contener eventualmente otros genes de anticuerpos scFv, que están flanqueados en cada caso por un sitio loxP y un sitio loxP511 (p.ej. loxP scFv1 loxP511 loxP scFv2 loxP511...loxP scFvN loxP511). De este modo, una secuencia de DNA integrada por recombinación por la actividad de la Cre dentro de esta célula produce muchas células que presentan anticuerpos distintos. Con la combinación de un gran número de exones vH

y vL puede potenciarse el número grande mencionado.

Figura 7 Humanización de Humanización de una línea celular de hibridoma murino

(2)

por recombinación homóloga. Se representa el fenotipo de diversas células de hibridoma modificadas (2kh, 2h, 2H), después de haberse realizado los acontecimientos de recombinación homóloga descritos en la figura 3, en los apartados I. y II. o III. Los acontecimientos de recombinación muy poco frecuentes se realizan en aprox. 1 de cada 107 células. Las células modificadas tienen que seleccionarse a continuación, p.ej. en el clasificador FACS. En el centro de la figura se representa a título de ejemplo una célula de hibridoma recombinada homóloga (2H), en la que ha tenido lugar en primer lugar el acontecimiento de recombinación homóloga descrito en el apartado I. de la figura 3 y después el descrito en el apartado III. En la figura se representa:

I.

El intercambio del exón del dominio kappa constante murino por un exón, que lleva codificado un dominio kappa constante humano conduce a la presentación en superficie de un dominio kappa constante humano, permaneciendo constante la especificidad de antígeno que tiene el anticuerpo presentado (2kh);

II. El intercambio de los exones CH1, CH2 y CH3 del dominio constante de la IgG1 murina por los exones correspondientes de los dominios constantes de la IgG1 humana conduce a la presentación en superficie de los dominios constantes de la IgG1 humana, permaneciendo constante la especificidad de antígeno que tiene el anticuerpo presentado (2h) y

III. Igual que en II., pero se suprimen además secuencias de DNA del intrón entre el dominio CH3 y el dominio M1 de la IgG1 codificada (véase la figura 2) de modo que se presentan muchos más anticuerpos sobre la superficie de la célula de hibridoma (2H).

Si se realizan sucesivamente los acontecimientos de recombinación I y II o I y III representados en la figura y se aíslan las líneas celulares correspondientes, entonces se genera una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo monoclonal humanizado que tienen la especificidad de antígeno original (2H).

Figura 8

La introducción de señales de recombinación específica y modificación simultánea de la especificidad de anticuerpo de una línea celular de hibridoma (2H) por recombinación homóloga.

Se representa el fenotipo de las células de hibridoma modificadas (3aH, 3H), después de haberse realizado los acontecimientos de recombinación homóloga descritos en los apartados IV. y V. de la figura 3. A continuación se seleccionan las células modificadas p.ej. en el clasificador FACS. La línea celular de partida (2H) se describe en la figura 7. En el centro de la figura se representa a título de ejemplo una célula de hibridoma de recombinación homóloga (3H), en la que en primer lugar se ha realizado el acontecimiento de recombinación homóloga descrito en el apartado IV. de la figura 3 y después el acontecimiento del apartado V. En la figura se representan:

IV.

El intercambio del exón por el dominio vL1 variable activo por un exón, que codifica p.ej. el dominio vL2 seleccionable en el FACS, conduce a la presentación en superficie de un dominio vL alterado, con lo cual se altera la especificidad de antígeno del anticuerpo presentado (3aH), pero al mismo tiempo se introducen 2 sitios FRT y

V.

El posterior intercambio del exón del dominio activo variable vH1 por un exón, que codifica p.ej. un dominio vH2 seleccionable en el FACS, conduce a la presentación en superficie de un dominio vH alterado, con los cual se altera la especificidad de antígeno del anticuerpo presentado (3H), pero al mismo tiempo se introducen 2 sitios loxP.

Si se efectúan sucesivamente los acontecimientos de recombinación homóloga IV y V representados (también en la figura 3) y se aíslan las células en cuestión, entonces se genera una línea celular de hibridoma alterada, que presenta en su superficie un anticuerpo monoclonal humanizado alterado. La especificidad de antígeno que tiene este anticuerpo dependerá de los dominios variables recombinantes que incorpore.

Figura 9

Producción de una biblioteca de anticuerpos de hibridoma (2H, 3H, 4H, 5H, 6H) por recombinación específica. Se representa el fenotipo de las células de hibridoma modificadas (2H, 3H, 4H, 5H, 6H), después de haberse realizado en primer lugar los acontecimientos de recombinación homóloga descritos en los apartados I., III.,

IV. y V. de la figura 3 y después los acontecimientos de recombinación específica descritos en los apartados VI. &

VIII. o bien VII. & VIII. de la figura 5. La línea celular de partida (3H) se describe en la figura 8. La línea celular de hibridoma (3H) representada en la figura 9 se transfecta en cada caso con un grupo de distintas secuencias y después de los acontecimientos de recombinación específica se selecciona un grupo de fenotipos en el clasificador FACS. En la figura se representan:

IV.

El intercambio del exón del dominio vL3 variable activo por un grupo de exones conduce a la presentación en superficie de un grupo de dominio vL alterados de distintas maneras y

V.

El posterior cambio del exón del dominio vH3 variable activo por un grupo de exones conduce a la presentación en superficie de un grupo de dominios vH modificados de distintas maneras, con lo cual se altera la especificidad de antígeno que tienen los anticuerpos presentados (2H, 3H, 4H, 5H, 6H).

Si se llevan a cabo sucesivamente los acontecimientos de recombinación específicos IV y V representados en la figura con un grupo de células o con un grupo distintas secuencias de DNA y se enriquecen los correspondientes grupos de células distintas, entonces se genera una biblioteca de anticuerpos de hibridoma, cuyos representantes individuales se presentan en cada caso en la superficie de los distintos anticuerpos monoclonales humanizados. Con este procedimiento se empobrecen las células de partida (3H) y las células

recombinadas de modo defectuoso o de modo improductivo (0H).

Figura 10

Comparación de afinidades “on-line” de los anticuerpos presentados. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno es un índice de la proporción entre los antígenos unidos a anticuerpos y los anticuerpos libres y los antígenos libres en solución (en general: proporción entre receptor y ligando). Esto permite al mismo tiempo seleccionar con el clasificador FACS y comparar directamente las afinidades de los distintos anticuerpos presentados en superficie o proteínas (o bien las correspondientes células de hibridoma) presentadas en superficie con antígenos marcados con fluorescencia (triángulos rojos). Para normalizar el número de los anticuerpos presentados en cada caso por cada célula, estos pueden teñirse p.ej. como contraste con la proteína G marcada con FITC (círculos verdes). En el ejemplo representado, el anticuerpo presentado por la célula de hibridoma B se fija con mucha mayor afinidad sobre el antígeno, si se compara con el anticuerpo presentado por la célula A. El índice de afinidad es en este caso el cociente

de

la fluorescencia roja y la verde de las células

seleccionadas en el clasificador FACS.

Figura 11

Hipermutación

somática. En primer lugar, del modo

descrito

en la figura 9, se reemplazan por recombinación

específica los exones del dominio vL2 variable activo por un grupo de exones, que codifican en cada caso un dominio vL2

mutado de distinta manera (véanse también las figuras 5 y 6). De este modo se generan mutaciones improductivas (2d), anticuerpos menos afines (2c y 2e) y en casos raros se forman anticuerpos más afines (2b). Estos pueden clasificarse en el FACS, del modo descrito en la figura 10. Como alternativa, la expresión de RAD54, RecQ4 y al mismo de polX mu dentro de la línea celular de hibridoma (2) conducen a la introducción de mutaciones no dirigidas dentro de aprox. 1,5 kb en dirección a 3’ (downstream) de los promotores en cuestión de las cadenas anticuerpo corta y larga activas. Con preferencia, el RNA anti-sentido se expresa al mismo tiempo contra XRCC2, XRCC3 o RAD51B. El requisito para esta vía alternativa de introducción de hipermutaciones somáticas es el contexto del locus de gen de anticuerpo activo.

Figura 12

DNA quimérico murino-humano para la humanización de la línea celular de hibridoma HEA125.

A. Humanización del dominio constante kappa mediante el vector-DNA pBS-Mh-kappa-M. Se representa el vector pBS Mhkappa-M con las secuencias de DNA quimérico para la humanización del dominio constante kappa de la línea celular de hibridoma HEA125. El vector de clonación es el pBSIISK+ de Stratagene. Se subrayan los sitios de restricción. Se representan en azul los cebadores de secuenciación. Los cebadores de PCR HK1 y HK2 representados en azul y subrayado sirven para la multiplicación del exón humano, que codifica la cadena kappa constante. El DNA molde para ello es el DNA genómico humano. La secuencia que codifica el exón de dominio kappa constante humano se representa de color verde y escrito en minúsculas. Los cebadores de PCR MK1 y MK2 o bien MK3 y MK4, representados de rojo y escritos en minúsculas, sirven para la multiplicación de los sitios homólogos que flanquean al genoma de ratón de HEA125. Para ello, el DNA molde es el DNA genómico del HEA125. El límite entre las secuencias murinas y humanas se marca con los sitios de restricción NotI

o BstB1. Antes de la electroporación en las células HEA125 se linealiza el DNA-vector con la enzima de restricción BglI. Los cebadores de PCR HK3 y HK4 representados de color azul subrayados (en combinación con la presentación en superficie de los anticuerpos humanizados) sirven para la secuenciación y verificación de los subclones de la célula de hibridoma HEA125 alterados por recombinación homóloga.

B.

Humanización de los dominios constantes IgG1-CH1, CH2 y CH3 con el vector-DNA pBS-MhIgG1M. Se representa el vector pBS-MhIgG1M con las secuencias de DNA quimérico para la humanización de los dominios constantes IgG1-CH1, CH2 y CH3 de la línea celular de hibridoma HEA125. El vector de clonación es el pBSIISK+ de Stratagene. Se subrayan los sitios de restricción. Los cebadores de PCR HG1 y HG2, representados en color azul y subrayados, sirven para la multiplicación de los exones humanos que codifican a los dominios constantes de la IgG1. El DNA molde para ello es el DNA genómico humano. Los cebadores de PCR MG1 y MG2 o bien MG3 y MG4, representados de color rojo y en minúsculas, sirven para la multiplicación de los sitios homólogos que flanquean del genoma de ratón de HEA125. Para ello, el DNA

molde es el DNA genómico de HEA125. El límite entre las secuencias murinas y humanas se marca con dos sitios de restricción HindIII. Las secuencias humanas que codifican y los exones M1 murino y M2 murino se representan con letras minúsculas verdes. Antes de la electroporación de las células HEA125 se linealiza el DNA vector con la enzima de restricción SspI. Los cebadores de PCR HG3 y HG4 representados en color azul y subrayados (en combinación con la presentación en superficie de los anticuerpos humanizados) sirven para la secuenciación y verificación de los subclones de la célula de hibridoma HEA125 modificada por recombinación homóloga.

Se representan con letra cursiva azul subrayada 5 cebadores distintos (cebadores de delta-1 a delta-5), con ellos se pueden suprimir secuencias de DNA de una longitud entre aprox. 350 bp y aprox. 900 bp situadas entre la zona HindIII contigua y los cebadores correspondientes. Para ello se realiza una PCR con el cebador MG4 y los correspondientes cebadores de delta-1 a delta-5. Estos poseen un exceso adicional que sobresale HindIII no representado. De este modo pueden incorporarse por ligación 5 bandas de PCR en el vector pBS-MhIgG1M cortado con HindIII (digestión parcial) y EagI. Las deleciones resultantes del intrón entre los dominios CH3 y M1 conducen a una expresión más intensa en superficie. El vector pBS-MhIgG1M-delta-350 es idéntico al vector pBSMhIgG1M, pero le faltan las secuencias entre los cebadores MG3 (incluidas las secuencias del cebador MG3) y delta-1 (excluyendo las secuencias del cebador delta-1).

Figura 13

DNA de resistencia G418 murino quimérico para la introducción de señales de recombinación específicas en el lugar (locus) de gen vH y vkappa de la línea celular de hibridoma HEA125.

A. Introducción de sitios FRT en el lugar de gen vkappa de la línea celular de hibridoma HEA125 mediante el vector de DNA pBS-M-kappa-G418M. Se representa el vector pBS-M-kappaG418M con las secuencias de DNA quimérico para la introducción de sitios FRT en el lugar (locus) de gen activo vkappa de la línea celular de hibridoma HEA125. El vector de clonación es el pBSIISK+ de Stratagene. Se subrayan los sitios de restricción. Se multiplica el gen de resistencia PGKneo con los cebadores de PCR Neo1 y Neo2 (se representa de color rojo en minúsculas y subrayado) y después se incorpora por clonación en el AatII. Como fuente o molde del gen de resistencia PGKneo se emplea el vector ploxPfrtPGKneofrtloxP (Dr. Erich Greiner, DKFZ, Departamento de Biología Molecular de las Células I). La secuencia que codifica al gen de la neofosforiltransferasa II y al exón líder vkappa murino se representa de color verde y en minúsculas. El gen de la neofosforiltransferasa II está controlado por el promotor de la fosfoglicerina-quinasa (PGK; representado en color azul y en minúsculas). Los cebadores de PCR MVK1 y MVK2 o bien MVK3 y MVK4 representados de color rojo y en minúsculas sirven para la multiplicación de las regiones homólogas que flanquean los dominios vkappa del genoma murino de HEA125. Para ello el DNA molde es el DNA genómico de HEA125. En una PCR posterior, los cebadores mencionados aportan además las secuencias de la correspondiente zona FRT que flanquea y la mitad de la zona AatII. El límite entre las secuencias murina y PGKneo se marca con las sitios FRT0 o FRT3 representadas de color azul y en cursiva. Antes de la electroporación en las células HEA125 se linealiza el DNA del vector. Los cebadores de PCR KG418-3 y KG418-4 representados en color azul y subrayado (así como los cebadores fuera de las regiones representadas) sirven para la secuenciación y verificación de los subclones de la célula de hibridoma HEA125 modificada por recombinación homóloga.

B. Introducción de sitios loxP en el locus vH del gen de la línea celular de hibridoma HEA125 con el vector de DNA pBS-MvHG418M. Se representa el vector pBS-MvHG418M con las secuencias de DNA quimérico para la introducción de sitios loxP en el locus de gen vH activo de la línea celular de hibridoma HEA125. El vector de clonación es el pBSIISK+ de Stratagene. Los sitios de restricción se subrayan. Se incorpora por clonación el gen de resistencia PGKneo en AatII, la fuente del DNA es la misma que se ha representado en el apartado A. La secuencia que codifica al gen de neofosforiltransferasa II se representa de color verde y en minúsculas. El promotor PGK se representa en color azul y en cursiva. Al vector pBS-MvHG418M-delta-PGK le faltan las secuencias del promotor PGK representadas en color azul y en cursiva, por lo demás este vector es idéntico al pBSMvHG418M. Para generar este vector se multiplica el gen de neofosforiltransferasa II con los cebadores de PCR Neo2 y Neo3 (representados de color rojo, minúsculas y subrayado). Los cebadores aportan con ello sitios AatII que sobresalen en cada caso del extremo 5’. El molde es en este caso el vector ploxPfrtPGKneofrtloxP. Los cebadores de PCR MvH1 y MvH2 o bien MvH3 y MvH4 representados en rojo y minúsculas sirven para la multiplicación de las regiones homólogas que flanquean a los dominios vH del genoma de ratón de HEA125. Para ello, el DNA molde es el DNA genómico de HEA125. Dichos cebadores aportan además, en una PCR posterior, las secuencias de los sitios loxP que flanquean en cada caso y la mitad del sitio AatII. El límite entre las secuencias genómicas de ratón y las PGKneo se marca con los sitios loxP

o loxP511 que se representan en azul y en cursiva. Antes de la electroporación se linealiza el DNA-vector en las células HEA125. Los cebadores de PCR vHG418-3 y vHG418-4 representados de color azul y subrayados (así como los cebadores fuera de las regiones representadas) sirven para la secuenciación y verificación de los subclones de la célula de hibridoma HEA125 modificada por recombinación homóloga.

Figura 14

Cebadores para la multiplicación de una gran variedad de genes de anticuerpos humanos recombinados genómicos. Se representan los cebadores, con los que se puede multiplicar el DNA genómica de los genes variables correspondientes. Como cebadores de la contrahebra se emplean los correspondientes cebadores del segmento J. Las secuencias de genes humanos se identifican con arreglo al manual Immunoglobulin Facts Book (Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441351X). Las secuencias de DNA de los genes variables de anticuerpos que allí se describen se importan en base a los números de registro del Genbank, un banco de datos de acceso público, y a continuación se proponen cebadores específicos del gen vH. Estos se hibridan en cada caso aprox. a una distancia de 182 bp del extremo 5’ del codón de inicio ATG del exón líder. Con los cebadores de PCR específicos de vkappa y vlambda se procede de modo similar. Estos se hibridan dentro del intrón entre el exón líder y el exón vL. Los extremos 5’ de estos cebadores se hibridan en cada caso aprox. a una distancia de 130 bp del extremo 5’ del exón vL. Los extremos 5’ del cebador de contrahebra específico del segmento JH se hibridan aprox. a una distancia de 83 bp del extremo 3’ de los segmentos JH, contada en dirección a 3’. Los extremos 5’ de los cebadores de contrahebra específicos del segmento Jkappa y Jlambda se hibridan aprox. a una distancia de 89 bp del extremo 3’ de los segmentos JL, calculada en dirección a 3’. Con los cebadores de PCR descritos y el DNA genómico de linfocitos periféricos humanos como moldes se realizan las siguientes PCRs a 65ºC (±5ºC):

-4 segmentos Jlambda x 24 genes vlambda = 96 PCRs específicas de vlambda;

-5 segmentos Jkappa x 34 genes vkappa = 170 PCRs específicas de vkappa; y

-6 segmentos JH x 44 genes vH = 264 PCRs específicas de vH.

A. cebador vlambda humano y cebador Jlambda

B. cebador vkappa humano y cebador Jkappa

C. cebador vH humano y JH. Figura 15 Vectores para la introducción de exones variables en

los lugares (locus) de gen vH y vkappa de la línea celular de hibridoma HEA125 mediante recombinación específica.

A. Se representa el vector pBS-FRTvkappa, con el que mediante la Flp se puede volver a recombinar e integrar el antiguo dominio vkappa de HEA125 en el locus de gen vkappa de la línea celular de hibridoma HEA125. Los sitios de restricción se han subrayado. Las secuencias codificadoras del exón vkappa se representan en verde y minúsculas. Los cebadores de PCR vKHEA1 y vKHEA2, representados en rojo y minúsculas, sirven para la multiplicación del DNA genómico del gen vkappa activo de HEA125. Para ello, el DNA molde es el DNA genómico de HEA125. Los cebadores mencionados aportan además en una PCR posterior las secuencias del correspondiente sitio FRT flanqueante y un sitio BssHII. Mediante el BssHII se clona el fragmento de PCR en pBSIISK+. El límite de las secuencias vkappa genómicas se marca con los sitios FRT0 o FRT3 que se representan de color azul y en cursiva. Los cebadores de PCR KG418-3 y KG418-4 representados en la figura 13A de color azul y subrayados sirven para la secuenciación y verificación de los subclones modificados por recombinación específica de la célula de hibridoma HEA125.

La secuencia del locus de gen HEA125-vkappa activo resulta de las figuras 15A (exón vkappa recombinado genómico activo) y 13A (regiones que flanqueantes 5’ y 3’), por ello en las figuras se representan dos sitios FRT adicionales, que no existen en el genoma de HEA-125.

B. Se representa el vector pBS-loxPvHmyc, con el que mediante la Cre se puede volver a recombinar e integrar el antiguo dominio vH de HEA125 (+ myc-tag) en el locus de gen vH de la línea celular de hibridoma HEA125. Se subrayan los sitios de restricción. Las secuencias que codifican al exón líder y al exón vH se representan de verde y minúsculas. Los cebadores de PCR vHEA1 y vHEA2 representados de rojo y minúsculas sirven para la multiplicación del DNA genómico del gen activo vH de HEA125. Para ello, el DNA molde es el DNA genómico de HEA125. En una PCR posterior, los cebadores mencionados aportan además las secuencias de los sitios flanqueantes loxP y un sitio BssHII. Mediante el BssHII se clona el fragmento de PCR en pBSIISK+. El límite de las secuencias vH genómicas se marca con los sitios loxP o loxP511 representadas en azul y cursiva. Además de las secuencias de origen natural de HEA125 se introduce en la región del CDR3 un myc-tag representado en color magenta y subrayado. Para ello se sintetiza la secuencia de DNA representada y se clona mediante los sitios de restricción BsmB1 y BglII que la flanquean. Prescindiendo de este myctag, el vector pBS loxPvH es idéntico al vector pBSloxPvHmyc.

Los cebadores de PCR vHG418-3 y vHG418-4 representados en la figura 13B de azul y subrayados sirven para la secuenciación y verificación de los subclones modificados por recombinación específica de la célula de hibridoma HEA125. La secuencia del lugar de gen vH de HEA125 activo resulta de las figuras 15B (exón vH recombinado genómico activo) y 13B (regiones flanqueantes 5’ y 3’), con lo cual en las figuras se representan dos sitios loxP adicionales, que no existen en el genoma de HEA125. En la figura 15B se representa además en el CDR3 del dominio vH un myc-tag, que tampoco existe en el genoma original del HEA125.

C. Se representa el vector de clonación pBS-FRTklon.

D. Se representa el vector de clonación pBS-loxPklon. Figura 16 Vector para la introducción de señales de recombinación

específica en lugares (loci) de gen preseleccionados. Se representa el vector pBS loxP-IgG1, con el que mediante la Flp se recombinan e integran los dominios constantes, incluidos los dominios de membrana M1 y M2, de una IgG1 p.ej. en una cassette de FRT preseleccionada. Este vector aporta además una cassette loxP, en la que mediante la Cre pueden recombinarse e integrarse p.ej. los dominios variables. El vector de clonación es inicialmente el vector pBS FRTvKappa (figura 15A) cortado con AatII. En este se colocan secuencia de oligonucleótido sintético, que codifican al sitio loxP y al loxP511 con un sitio BamH1 adicional. El vector resultante se corta con BamH1. Los cebadores de PCR hIgG1-1 y hIgG1-2 representados de azul y subrayado sirven para la multiplicación de un gen de IgG1 genómico quimérico. En una reacción PCR posterior, estos cebadores aportan en cada caso un sitio BamH1. Para ello, el DNA molde es el vector pBSMhIgG1M descrito en la figura 12B (como alternativa, el pBSMhIgG1Mdelta350). Después del ligado de esta banda de PCR digerida también con BamH1 surge el vector pBS-loxP-IgG1, o como alternativa el vector pBS-loxP-IgG1delta350. Se han subrayado los sitios de restricción. El límite entre las secuencias murinas y humanas se marca con el sitio de restricción HindIII. Las secuencias humanas codificadoras y los exones murino M1 y murino M2 se representan de verde y con minúsculas. El aceptor de empalme del extremo 5’ del exón bisagra se representa en rojo y subrayado.

A partir del vector pBS-loxP-IgG1 se obtiene el vector pBS-loxP-IgG1deltaCH1. Ambos vectores son idénticos, pero al vector pBS-loxP-IgG1deltaCH1 le faltan las secuencias de DNA entre el sitio PfM1 y el sitio BamH1. Para ello se corta el vector pBS-loxP-IgG1 con BamH1 y se clona e integra un fragmento obtenido mediante los cebadores de PCR deltaCH1-1 y hIgG1-2. Como molde de DNA se emplea el vector pBS-loxP-IgG1.

Figura 17

Anticuerpos biespecíficos y bifuncionales presentados por las células de hibridoma.

(A) Anticuerpos biespecíficos. Se representa el vector pBS-FRT-kappaHEAscFv215, gracias al cual mediante la Flp puede recombinarse e integrarse un gen quimérico en el locus de gen vkappa activo de la línea celular de hibridoma HEA125mhloxPmycFRTG418 (ejemplo 12). Bajo el control del promotor kappa (con exón líder endógeno) y del intensificador kappa situado en el intrón contiguo (antes del exón ckappa endógeno), este gen quimérico codifica:

-el dominio vkappa de HEA125 (verde y minúsculas);

-

fusionado al dominio murino ckappa de HEA125 (azul y mayúsculas);

-

fusionado a una secuencia de engarce (linker) (azul y cursiva);

-

fusionado al dominio vH del anticuerpo scFv 215 (azul y minúsculas);

-fusionado a un engarce GlySer (azul y cursiva);

-

fusionado al dominio vkappa del anticuerpo scFv 215 (verde y minúsculas); y

-

finalmente fusionado a un myc-tag y a un His-tag (en cada caso azul y cursiva). Se subrayan los sitios de restricción. El sitio de restricción PvuII / MscI entre paréntesis contiene secuencias residuales surgidas de la clonación. Los cebadores de PCR vHEAcDNA1 y vHEAcDNA2, representados en rojo y minúsculas, sirven para la multiplicación del cDNA del gen kappa activo de HEA125. Para ello, el DNA molde es el cDNA de HEA125. En una PCR posterior, el cebador vHEAcDNA2 aporta las secuencias del engarce flanqueante representado hasta el sitio PvuII inclusive. Este fragmento de PCR se liga en el vector de clonación pBS-FRTvkappa cortado con MscI (véase la figura 15A). A continuación se corta con PvuII el vector resultante pBS-FRT-kappaHEAPvuII. Los cebadores de PCR scFv1 y scFv2 representados de rojo y minúsculas sirven para la multiplicación del DNA que codifica al anticuerpo scFv. El DNA molde es en este caso el plásmido pOPE101-215. Después de la clonación de este fragmento de PCR se obtiene el vector pBS-FRT-kappaHEAscFv215.

B.

Anticuerpo bifuncionales. Se representa el vector pBS-FRT-kappaHEAbla, con el que mediante la Flp puede recombinarse e integrarse un gen quimérico bifuncional en el locus de gen vkappa activo de la línea celular de hibridoma HEA125-mhloxPmycFRTG418 (ejemplo 13). Bajo el control del promotor kappa (con exón líder endógeno) y del intensificador kappa situado en el intrón contiguo (antes del exón ckappa endógeno), este gen quimérico codifica:

-el dominio vkappa de HEA125 (verde y minúsculas);

-

fusionado al dominio murino ckappa de HEA125 (azul y mayúsculas);

-

fusionado a una secuencia de engarce (linker) (magenta y cursiva); y

-

fusionado a la secuencia codificadora de la betalactamasa (verde y minúsculas).

Se subrayan los sitios de restricción. Los sitios de restricción PvuII o PvuII / MscI entre paréntesis contienen secuencias residuales surgidas a raíz de la clonación. El punto de partida es el vector pBS-FRT-kappaHEAPvuII cortado con PvuII y descrito en la figura 17A. Los cebadores de PCR bla1 y bla2, representados de rojo y minúsculas, sirven para la multiplicación del DNA que codifica a la beta-lactamasa. Para ello, el DNA molde es el plásmido pBSIISK+. Después de la clonación de este fragmento de PCR se obtiene el vector pBS-FRT-kappaHEAbla.

Figura 18 Otros ejemplos de anticuerpos modificados presentados por células de hibridoma.

A. Alteración de la especificidad de anticuerpos mediante la recombinación específica. Se representa el vector pBS-FRT-vkappa215, con el que mediante la Flp se puede recombinar un exón vkappa modificado en el locus de gen vkappa activo de la línea celular de hibridoma HEA125mhloxPmycFRTG418 (ejemplo 14). Bajo el control del promotor kappa (con exón líder endógeno) y del intensificador kappa situado en el intrón contiguo (antes del exón ckappa endógeno), este exón codifica el dominio vkappa del anticuerpo 215 (Kontermann y col., Characterization of the epitope recognised by a monoclonal antibody directed against the largest subunit of Drosophila RNA polymerase II; Biol. Chem. Hoppe-Seiler 376, 473-481, 1995; verde y minúsculas). Este dominio vkappa se empalma con el dominio ckappa codificado endógeno del HEA125. Se subrayan los sitios de

restricción.

Los cebadores de PCR K215-1 y K215-2

representados

en rojo y minúsculas sirven para la

multiplicación

del dominio vkappa(215). El cebador de PCR

K215-1 aporta una mutación puntual silenciosa, que sirve para la introducción de un sitio EcoRV. Para ello, el DNA molde es el plásmido pOPE101-215 (véase la figura 17A). Este fragmento de PCR se liga en el vector pBS-FRTvkappa (véase la figura 15A), cortado con EarI y AvaII. De este modo se obtiene el vector pBS-FRT-vkappa215.

B. Anticuerpos Fab por recombinación específica. Se representa el vector pBS-loxP-FdHEA, con el que mediante la Cre se puede recombinar un exón vH modificado en el locus de gen vH activo de la línea celular de hibridoma HEA125-mhRek (ejemplo 15). Bajo el control del promotor vH y del intensificador IgG1 situado en el intrón contiguo (antes del exón CH1 endógeno), este exón codifica el dominio vH del anticuerpo HEA125 (verde y minúsculas). Este dominio vH se empalma con el dominio contiguo IgG1-CH1 (verde y minúsculas). Se subrayan los sitios de restricción. Los cebadores de PCR Fd1 y Fd2 representados en rojo y minúsculas sirven para la multiplicación del dominio IgG1-CH1. El cebador Fd2 de PCR aporta un codón de paro y un sitio SalI. Para ello, el DNA molde es el DNA genómico de HEA125. Este fragmento de PCR se liga en el vector pBS-loxPvH (véase la figura 15B), que se corta con el SalI. De este modo se obtiene el vector pBS-loxP-FdHEA.

Abreviaturas Ag8 línea celular de mieloma X63AG8.653 banco de anticuerpos un gran número (>100) de células

productoras de anticuerpos o de los

correspondientes genes o proteínas de anticuerpos biblioteca de anticuerpos véase banco de anticuerpos bla beta-lactamasa, gen de la misma bp pares de bases antígeno ligando que se une específicamente a un

anticuerpo; en el sentido de esta invención también un ligando que se une específicamente a un receptor;

anticuerpo proteína que se une específicamente a un antígeno; en el sentido de esta invención se

entiende también más en general aquella proteína,

que se une específicamente a un ligando;

cH dominios constantes de la cadena larga de anticuerpo, gen de los mismos

CH1 primer dominio constante de una inmunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgD, IgM), exón del mismo

CH2 segundo dominio constante de una inmunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgD, IgM), exón del mismo

CH3 tercer dominio constante de una inmunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgD, IgM), exón del mismo

CH4

cuarto dominio constante de una inmunoglobulina

(IgE, IgM), exón del mismo

cL

dominio constante de la cadena corta de

anticuerpo, gen del mismo

D

segmento D del dominio vH

DMSO

sulfóxido de dimetilo

downstream partiendo del extremo 5’ de una secuencia de DNA

en dirección al extremo 3’ e intensificador (enhancer) Fab porción de anticuerpo que consta de cadena corta,

dominios vH y CH1, gen de la misma clasificador FACS seleccionador de células activado por

fluorescencia FRT dianas de reconocimiento de Flp FRT0 GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC FRT3 GAAGTTCCTATTCTTCAAATAGTATAGGAACTTC G418 véase Neo H bisagra (hinge), exón de bisagra

His-tag una sucesión de 5 ó 6 histidinas idóneas para la purificación por afinidad con un quelato de níquel; secuencias de DNA de la misma

JH segmento de unión del dominio vH, segmento de gen del mismo

Jlambda segmento de unión del dominio vlambda, segmento de gen del mismo

Jkappa segmento de unión del dominio vkappa, segmento de gen del mismo

L líder, péptido de señal, exón del mismo; los exones líderes de los genes de anticuerpos codifican solamente la porción del extremo N del péptido líder

loxP secuencias de DNA, que la recombinasa Cre

reconoce

sitio lox66 TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT

sitio lox71 ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA

sitio loxP ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT

sitio loxP511 ATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTAT

sitio loxG ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTGC

M dominio de membrana de una inmunoglobulina (IgA1, IgA2), exón del mismo

M1 primer dominio de membrana de una inmunoglobulina

(IgG, IgE, IgD, IgM), exón del mismo

M2

segundo dominio de membrana de una

inmunoglobulina (IgG, IgE, IgD, IgM), exón

del

mismo

mIgG1 IgG1 situada sobre membrana; mRNA de la misma

myc-tag

secuencia de péptido, que el anticuerpo

monoclonal 1-9E10 reconoce; secuencia de DNA del

mismo

mieloma

componente de fusión para la producción de un

hibridoma; descendiente de una línea celular de

plasmacitomas

Neo

el gen de neofosforiltransferasa II transmite

resistencia a la neomicina o al G418, gen del

mismo

P

promotor

pBS185

vector de expresión Cre de Life Technologies

(Gibco-BRL) nº 10347-011

PEG

polietilenglicol

pGH-1

gen de Neo y gen de HSV-tk flanqueado por un

sitio loxP; Gu y Rajewsky, Cell 73, 1155-1164,

1993;

PGK

fosfoglicerina-quinasa

PGKneo

gen de resistencia al neo (G418), controlado por

el promotor PGK

pMC-Cre

vector de expresión Cre; Gu y Rajewsky, Cell 73,

1155-1164, 1993; véase también animal transgénico

en web: www.med.umich.edu/tamc/mta.html

pIC-Cre

Cre vector de expresión Cre; Gu y Rajewsky, Cell

73, 1155-1164, 1993

pOG44

vector de expresión Flp de Invitrogen; nº de

producto: V6005-20 o del kit Flp-In™ pcDNA5/FRT

Core con nº de producto K6010-02

polX mu número de registro del banco de datos EMBL: AJ251804 (ratón), AJ131891 (Homo sapiens); mRNA completo

pOPE101-215 número de registro del banco de datos EMBL: ASY14585; gen sintético de un anticuerpo scFv(215); véase también Kontermann y col., Biol. Chem. Hoppe-Seiler 376, 473-481, 1995

pREP4 Invitrogen V004-50; plásmido replicable episómico en células de mamíferos, seleccionable por higromicina

pSH47 número de registro del banco de datos EMBL: AF298782; vector de expresión Cre para levaduras

pSVlacZT vector de sustrato de recombinación Cre para la detección de la actividad de la Cre; Torres y Kühn, en: Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, 1997, Oxford University Press, ISBN 0-19-963677-X

proteína G proteína de unión a anticuerpo para la detección de dominios constantes de anticuerpo

RAD 54

número de registro del banco de datos EMBL:

BC001965; mRNA completo

RAD51B

número de registro del banco de datos EMBL:

U84138; mRNA completo

RecQ4

número de registro del banco de datos EMBL:

AB006532; mRNA completo

scFv, scFvn anticuerpo Fv de cadena simple

sIgG1

IgG1 secretada; mRNA de la misma

Stop

codón de paro

upstream partiendo del extremo 3’ de una secuencia de DNA en dirección al extremo 5’

vH, vH1, vHn dominio variable de la cadena larga de anticuerpo

vL, vL1, vLn dominio variable de la cadena corta de anticuerpo

vlambda dominio variable de la cadena corta lambda del anticuerpo

vkappa dominio variable de la cadena corta kappa del anticuerpo

XRCC2 número de registro del banco de datos EMBL: AF035587; mRNA completo

XRCC3 número de registro del banco de datos EMBL: AF035586; mRNA completo. Un primer aspecto de la presente invención es, pues, un

procedimiento para la producción de una biblioteca de

proteínas, en especial de una biblioteca de anticuerpos

humanos (figuras 5, 6, 9), dicho procedimiento se caracteriza

porque:

-en uno o dos lugares (loci) activos de gen, en especial en los genes vH y vL expresados de una línea celular B se introducen señales específicas de recombinación (es decir, se generan aceptores de secuencias de DNA; figuras 3, 4, 6), en especial por recombinación homóloga (figuras 3, 4);

-se expande la línea celular resultante;

-con relativamente pocos cebadores de PCR específicos

de segmentos de gen, en especial con cebadores específicos de vH, vkappa y vlambda, y con contracebadores específicos de

los segmentos JH, Jkappa y Jlambda se multiplica un gran número de diferentes fragmentos de genes (figura 14);

-el gran número los fragmentos de genes multiplicados están en cada caso flanqueados por señales específicas de recombinación (es decir, se generan secuencias de DNA dador, figuras 5, 6);

-dicho gran número de fragmentos de gen multiplicados se transfiere a la línea celular mencionada y en ella, por influencia de una recombinasa específica, en especial de Cre

o de la Flp, tiene lugar un gran número de acontecimientos de recombinación específica (figura 5, 6) dentro de los lugares (loci) de gen activos mencionados y

-debido a los acontecimientos de recombinación específica se generan distintas células que en cada caso presentan sobre la superficie de las células correspondientes distintas proteínas, modificadas con respecto a las células de partida, en especial anticuerpos (figura 9).

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento, con el que se pueden modificar de modo sencillo y ventajoso los genes ya existentes, en especial los genes de anticuerpos o los grupos de genes de anticuerpos en el contexto de su lugar (locus) cromosómico de gen, en especial con el fin de obtener anticuerpos más afines (figura 10, 11), biespecíficos (figura 17A) o bifuncionales (figura 17B). Este procedimiento se caracteriza porque:

-

dichos genes, en especial los genes de anticuerpos, se mutan o alteran en especial de modo no dirigido, o bien se

reemplazan por un grupo de genes o fragmentos de gen similares;

-

dichos genes mutados codifican a una proteína, que se presenta sobre la superficie de la célula que la codifica y

-esta presentación en la superficie se aprovecha para la selección de las células alteradas que contienen una mutación o mutaciones.

Finalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento, con el que se alteran de modo sencillo y ventajoso las células de hibridoma de ratón ya existentes, en especial con el que se pueden humanizar dichas células (figuras 3, 7). Este procedimiento se caracteriza porque:

-dichas células de hibridoma pueden alterarse con una recombinación homóloga del locus de anticuerpo activo, sin que se utilice un marcado de resistencia que pueda interferir;

-dicha recombinación homóloga conduce a un producto genético alterado, en especial a un anticuerpo humanizado;

-dicho producto genético alterado, en especial el anticuerpo humanizado se presenta sobre la superficie de dicha célula de hibridoma modificada por recombinación homóloga y

-esta presentación en la superficie se aprovecha para la selección de la célula alterada.

En una primera forma de ejecución, la presente invención se refiere, pues, a un procedimiento para la producción de una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque:

(a)

en uno o dos lugares (loci) cromosómicos de los genes de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b)

se expande por lo menos una de las células así modificadas, que como alteración posee señales específicas de recombinación en los lugares (loci) de gen;

(c)

se transfecta a las células expandidas un gran número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d)

el gran número de secuencias diferentes de DNA se integran en los lugares (loci) de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, con ello se produce un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los lugares (loci) de gen, y de este modo las proteínas expresadas se unen a la superficie de las correspondientes células que se han expresado.

En una forma preferida de ejecución, el procedimiento de la invención se caracteriza porque en el paso (a) tiene lugar la introducción de señales de recombinación por recombinación homóloga del DNA transfectado con los correspondientes lugares (loci) de gen, las señales de recombinación del DNA transfectado están flanqueadas por regiones homólogas de los correspondientes lugares (loci) de gen de la célula y en el paso (b) se expande por lo menos una de las células alteradas por recombinación homóloga, que posee como alteración las señales específicas de recombinación en los lugares (loci) de gen.

Otra forma preferida de ejecución del procedimiento anterior se refiere a un procedimiento para la producción de una biblioteca de células eucariotas productoras de anticuerpos, caracterizado porque

(a)

en una o dos regiones o lugares cromosómicos (loci) de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

(b)

se expande por lo menos una de las células así modificadas, que como alteración posee las señales específicas de recombinación en los lugares (loci) de gen;

(c)

en las células expandidas se transfecta un gran número de secuencias diferentes de DNA, que contienen en cada caso distintos genes vH, genes vlambda o vkappa, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

(d)

el gran número de secuencias diferentes de DNA se integra lugares (loci) de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, con ello se genera un gran número de células, que en cada caso expresan distintos anticuerpos, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los lugares (loci) de gen, y de este modo los anticuerpos expresados se unen a la superficie de las correspondientes células que los han expresado.

56 Para la ejecución de este procedimiento y de las formas de ejecución específicas descritas a continuación, los expertos podrán proceder con arreglo a procedimientos ya conocidos en general o con arreglo a los métodos descritos a continuación y en los ejemplos. Introducción de sitios de reconocimiento de

recombinasas por recombinación homóloga

Un elemento fundamental de la presente invención es la introducción de secuencias alteradas de DNA, en especial de sitios de reconocimiento de recombinasas en el genoma de las líneas celulares mediante recombinación homóloga (figuras 3, 4, 8). De este modo pueden reemplazarse secuencias de DNA en un lugar (locus) de gen definido. Esto se consigue flanqueando las secuencias de DNA recién introducidas por regiones homólogas al locus de gen definido, que tienen por lo general una longitud >700 bp y en esta forma (en su mayor parte en forma de DNA linealizado; véase Hasty y col., Mol. Cell. Biol. 12, 2464-2474, 1992) se transfectan en las células. En algunos casos (aprox. 1 de cada 107 células) tiene lugar a continuación la deseada recombinación homóloga. Estos acontecimientos poco frecuentes o células recombinadas homólogas tienen que aislarse seguidamente p.ej. mediante un marcador de resistencia o mediante un clasificador FACS (véase a continuación). Los expertos ya conocen los procedimientos requeridos para ello (entre otros procedimientos de clonación, PCR, secuenciación, cultivo celular de células de hibridoma, recombinación homóloga, selección mediante G418, FACS) y que se han descrito en un gran número de manuales de laboratorio (entre otros el de Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual; 3ª edición, 2001, ISBN 0-87969-577-3). Se emplea actualmente una combinación de estos procedimientos o de otros similares con el elemento fundamental de la recombinación homóloga de secuencias alteradas de DNA en el genoma de una línea celular sobre todo para la generación de ratones transgénicos o de las líneas celulares ES necesarias para ello (Thomas y Capecchi, Cell 51, 503-512, 1987; Thompson y col., Cell 56, 313-321, 1989; Johnson y col., Science 245, 1234-1236, 1989; Doetschman y col., Nature 330, 576-578, 1987; “Transgene Tiere” (animales transgénicos) de J. Schenkel, 1995, editorial Spektrum, ISBN 3860252690; Vasquez y col., Manipulating the mammalian genome by homologous recombination; en: PNAS 98, 8403-8410, 2001; Torres y Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, 1997, Oxford University Press, ISBN 0-19-963677-X). Los sitios específicos de reconocimiento de recombinasas se emplean entre otros para suprimir exones individuales de genes definidos en tejidos definidos con las recombinasas inducidas específicas de dichos tejidos. En la presente invención se adaptan estas técnicas a otras líneas celulares apropiadas, en especial líneas celulares de hibridoma. También dentro de las líneas celulares de hibridoma se han realizado ya recombinaciones homólogas (Zou y col., Current Biology 4, 1099-1103, 1994; Shulman y col., Mol. and Cell. Biology 10, 4466-4472, 1990; Sun y col., J. of Immunology 152, 695-704, 1994; Baker y col., J. Immunological Methods 168, 25-32, 1994; Wood y col., PNAS 88, 8006-8010, 1991; Fell y col.,

PNAS 86, 8507-8511, 1989).

Recombinación específica

Los expertos conocen además sitios de reconocimiento idóneos y las correspondientes recombinasas (entre otros, Stricklett y col., The Cre/loxP system and gene targeting in the kidney; Am. J. Physiol. 276, F651-F657, 1999, revisado; Stricklett y col., Site-specific recombination using an epitope tagged bacteriophage P1 Cre recombinase; Gene. 215, 415-23, 1998; Van Duyne, A structural view of cre-loxp sitespecific recombination; Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 30, 87-104, 2001, revisado; Theodosiou y Xu, Use of FLP/FRT system to study Drosophila development; Methods 4, 355-65, 1998, revisado; Sadowski, The Flp recombinase of the 2microns plasmid of Saccharomyces cerevisiae; Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51, 53-91, 1995, revisado). Son ejemplos de sistemas apropiados:

-

el sistema Cre-lox (recombinasa Cre, sitios de reconocimiento específico loxP; véase entre otros el kit Creator™ de Clontech; patente US-4959317; Griffiths y col., EMBO Journal 13, 3245-3260, 1994);

-

el sistema Flp (recombinasa Flp, sitios de reconocimiento específico FRT; O’Gorman y col., Science 251,

1351-1355,

1991; kit completo Flp-In™ pcDNA5/FRT de

Invitrogen nº K60101-01) y

-

el sistema Gateway (lambda-integrasa Int e

Integration Host Factor IHF, sitios de reconocimiento específico attB x attP y attL x attR; véase entre otros

Gateway™ de Gibco BRL/Invitrogen); son preferidos el sistema Cre-lox y el sistema Flp.

El uso de varios sistemas dentro de una célula deberá preferirse cuando las señales específicas de recombinación tengan que introducirse en más de un lugar (locus) de gen, es decir, cuando tengan que generarse distintos aceptores de las secuencias de DNA. Son ejemplos de ello los loci de gen vH y vkappa de una línea celular de hibridoma, que en cada caso tendrán que estar flanqueados por sitios de reconocimiento específico de las recombinasas (figura 5). Si todos ellos fueran reconocidos por la misma recombinasa, entonces se producirían interferencia entre los diversos lugares (loci) de gen o entre los vectores de intercambio empleados. Esto no se aplica cuando se dispone de 4 sitios de reconocimiento distintos, no (o poco) recombinantes entre sí, p.ej. los sitios loxP siguientes: loxP, loxP511, loxG, lox66 y lox71. Entonces un tipo de recombinasa puede utilizarse para dos lugares (loci) de gen.

Los sitios loxP (los sitios FRT tienen una estructura muy similar) constan de dos repeticiones inversas de 13 bp de longitud, separadas por un espaciador de 8 bp de longitud. Este espaciador determina la direccionalidad de los DNA recombinados flanqueados por sitios loxP, es decir, con un sitio loxP (genómico) o FRT, el experimentador podrá determinar el lugar de gen cromosómico exacto y al mismo tiempo la orientación del DNA recombinado en él. Normalmente, las frecuencias más elevadas de recombinación se consiguen con el reemplazo de las cassettes de gen. Para ello, las secuencias de DNA a reemplazar tanto en el genoma como en los vectores de reemplazo están flanqueadas por dos sitios loxP o FRT ligeramente distintos, que por las diferencias de secuencia pueden recombinarse con un componente adecuado, pero no entre sí (figura 5). Esta técnica se ha descrito en la patente US-5928914 y en la publicación de Feng y col., (J. Mol. Biol. 292, 779-785, 1999) sobre el sistema Cre-lox y en las publicaciones de Seibler y Bode (Biochemistry 36, 17401747, 1997; Biochemistry 33, 12746-12751, 1994) sobre el sistema Flp. El reemplazo de cassettes tiene lugar también en los genes entre dos sitios de reconocimiento de igual identidad invertidos (p.ej. loxP-gen-Pxol). En este caso, el producto de una recombinación específica puede tener tres formas: 1. el gen entre los sitios loxP puede invertirse. Además, el gen entre los sitios loxP puede sustituirse por otro recombinando, que 2. se integra en la orientación correcta y 3. se integra en una orientación errónea entre los sitios de reconocimiento. Incluso cuando antes del reemplazo no exista entre los sitios de reconocimiento ningún marcador seleccionable negativamente, tendrá lugar una recombinación específica en aprox. un 1 % de las células, que hayan sobrevivido a la transfección (Feng y col., J. Mol. Biol. 292, 779-785, 1999).

Son también conocidos los procedimientos y vectores de expresión que permiten que dichas recombinasas se expresen de modo transitorio en células eucariotas (Taniguchi y col., Efficient production of Cre-mediated site-directed recombinants through the utilization of the puromycin resistance gene, pac: a transient gene-integration marker for ES cells. Nucleic Acids Res. 26, 679-680, 1998; Araki y col., Efficiency of recombination by Cre transient expression in embryonic stem cells: comparison of various promoters; J. Biochem. (Tokyo) 122, 977-82, 1997; Ludwig y col., FLPmediated sitespecific recombination in microinjected murine zygotes; Transgenic Res. 5, 385-395, 1996; vector de expresión Flp pOG44 de Invitrogen, nº V6005-20), de modo integrado estable o episómico en líneas celulares (Seibler y Bode, Biochemistry 36, 1740-1747, 1997) en animales transgénicos (Nelson y col., Expression of an AQP2 Cre recombinase transgene in kidney and male reproductive system of transgenic mice; Am. J. Physiol. 275, C216-226, 1998) o incluso de modo específico de tejidos (“Transgene Tiere” (animales transgénicos) de J. Schenkel, 1995, editorial Spektrum, ISBN 3860252690). Las recombinasas propiamente dichas pueden adquirirse en forma de proteínas purificadas (p.ej. el kit Creator™ de Clontech) y pueden eventualmente en esta forma transfectarse incluso al interior de las células.

Secuencias de DNA y lugares (loci) de gen apropiados

Son también conocidas las secuencias de DNA de genes apropiados, de fragmentos de gen (en especial vH, vlambda, vkappa y los correspondientes segmentos J) y lugares (loci) de gen del hombre (http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html; www.gdb.org; www.gdb.org/hugo; www.ncbi.nlm.nih.gov; www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink) o del ratón (www.informatics.jax.org), en especial los loci de gen de anticuerpo activos y la gran variedad de genes de anticuerpos (Immunoglobulin Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441351-X; http://imgt.cines.fr; banco de datos de Kabat: http://immuno.bme.nwe.edu) y los lugares (loci) de gen del receptor de células T (T-Cell Receptor Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8; http://imgt.cines.fr). En el sentido de esta invención son especialmente preferidos los loci de gen de anticuerpo activo, en especial la línea celular de hibridoma murino HEA125, que expresan genes de anticuerpos genómicamente recombinados.

También es posible emplear en un principio lugares de gen desconocidos, p.ej. por selección de células que tengan una relación de expresión lo más elevada posible de una resistencia a los antibióticos (figura 6). Vanin y col., (Development of hightiter retroviral producer cell lines by using Cre-mediated recombination; J. Virol. 71, 7820-7826, 1997) describen un procedimiento idóneo para ello, que es muy parecido al primer paso de procedimiento representado en la figura 6 (integración en lugar de reemplazo de cassettes). Para ello, el gen de resistencia seleccionado por la alta relación de expresión está flanqueado por señales específicas de recombinación. Un sistema parecido es el que vende Invitrogen (kit completo Flp-In™ pcDNA5/FRT, nº K6010-01; patentes US-5654182 y 5677177). Esto permite el reemplazo relativamente sencillo del gen de resistencia preseleccionado por ejemplo por un grupo de distintos genes de anticuerpos. Con preferencia, como paso intermedio se introducen antes otras señales adicionales de recombinación, que flanquean a una porción variable, es decir, reemplazable de gen, en especial por el hecho de estas junto con una porción constante del gen pueden recombinarse e integrarse en el locus de gen preseleccionado (figura 6). En este caso además:

1.

con la expresión de gen de resistencia se selecciona la integración de señales específicas de recombinación en un primer locus de gen activo (o bien en la correspondiente línea celular resistente),

2.

debido a las señales específicas de recombinación se recombina una porción constante de proteína, en especial los dominios de empalme diferencial (opcionalmente con CH1) CH2, CH3, M1 y M2 de un gen de la IgGl humana,

3.

de este modo se recombinan al mismo tiempo los genes de porciones variables de proteína, en especial un gen vH o un gen scFv de un anticuerpo, que está flanqueado además por 2 señales de recombinación específicas adicionales,

4.

se selecciona el acontecimiento de recombinación deseado en base a la presentación en superficie del anticuerpo expresado,

5.

a continuación se procede eventualmente de modo similar con los genes de la cadena corta del anticuerpo y

6.

por recombinación específica se recombina una gran variedad de anticuerpos distintos en los loci de gen mencionados.

Producción de secuencias de DNA complejas Otro elemento fundamental de la presente invención es la producción de un gran número de secuencias de DNA

distintas, en especial del mayor número posible de genes de anticuerpos distintos. En cada caso flanqueadas por los mencionados sitios de reconocimiento de la recombinasa, estas secuencias de DNA sirven como dadores de muchas secuencias de DNA distintas, que por influencia de las recombinasas se recombinan con una eficacia relativamente alta en los loci de gen mencionados con los aceptores mencionados de las secuencias de DNA. Los expertos ya conocen las técnicas requeridas para ello, en especial las técnicas PCR (véase entre otros Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual, 3ª edición, 2001, ISBN 0-87969-577-3; en especial el capítulo 8 en el que se describen las técnicas PCR) y las secuencias de DNA (véanse las páginas anteriores), que se han descrito en un gran número de publicaciones, sobre todo para la producción de bibliotecas de anticuerpos recombinantes (véase entre otros “Rekombinante Antikörper” (anticuerpos recombinantes), capítulo 2.2, de Breitling y Dübel, 1997, editorial Spektrum, ISBN 3-8274-0029-5). En especial el libro Immunoglobulin Facts Book (Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441351-X) es, junto con los números de registro para los bancos de datos que contiene, una excelente fuente de las aprox. 200 secuencias variables (y constantes) de anticuerpos humanos. La multiplicación de la gran variedad de genes de anticuerpos humanos recombinantes genómicos puede realizarse en el sentido de la presente invención p.ej. de modo relativamente sencillo por combinación de unos pocos (en cualquier caso menos de 50) cebadores de PCR específicos vH, vkappa y vlambda con (en cada caso menos de 6) contracebadores específicos de los segmentos JH, Jkappa y Jlambda (figura 14), para ello los cebadores se hibridan con preferencia con regiones genómicas evolutivamente poco conservadas. Lo mismo se diga de los genes de anticuerpos murinos. Como moldes de las menos de 1.000 reacciones PCR requeridas para ello se emplea el DNA genómico de un gran número de linfocitos B obtenidos en especial de la sangre humana. El DNA genómico de estos linfocitos B contiene muchos genes de anticuerpos recombinados genómicos distintos (vH, vkappa, vlambda), que pueden multiplicarse de modo muy simple por el procedimiento descrito hasta alcanzar una gran variedad. De manera muy similar, también la gran variedad de receptores de células T recombinados genómicos puede convertirse en un grupo de secuencias de DNA apropiadas con relativamente pocos reacciones PCR.

Para flanquear esta gran variedad de secuencias de DNA distintas con los sitios de reconocimiento mencionados de las recombinasas, estos pueden clonarse con un vector de clonación predeterminado, que ya contenga estos sitios de reconocimiento, o bien realizando una segunda PCR posterior que aporte con los cebadores PCR empleados estos sitios de reconocimiento. El grupo de los distintos productos de la PCR se clona seguidamente con preferencia en un plásmido (p.ej. el pUC19 de Biolabs, el pBluescript de Stratagene, los pCR-TOPO, pCR-XL-TOPO, pCR-Vector, pZErO-1, pCR-Blunt, pSinRep5 de Invitrogen). Opcionalmente, un origen de replicación puede conducir bajo la presión de selección a una replicación episómica estable (p.ej. los vectores pCEP4, pREP7, pREP10, pEBVHis o pREP4 de Invitrogen replicantes episómicos seleccionables con higromicina). De este modo puede prolongarse de modo muy sencillo el tiempo, dentro del cual puede realizarse una recombinación específica con los loci de gen mencionados. Para ello es necesaria, obviamente, la presencia de las recombinasas correspondientes o de los vectores de expresión correspondientes. En una forma de ejecución especialmente preferida, las cassettes de expresión de las recombinasas mencionadas se incorporan al vector de clonación recién mencionado.

Un grupo de plásmido distintos puede generarse en caso necesario también “in vitro” con una complejidad extremadamente elevada (>1012), evitando multiplicarlos previamente en bacterias (actualmente pueden lograrse de modo rutinario por electroporación complejidades de aprox. 109 clones bacterianos independientes por cada µg de DNA empleado; véase p.ej. Clontech nº C2023-1 330, la cepa KC8 de

E. coli >109 cfu/µg de pUC). Para ello se circularizan con preferencia en primer lugar con una ligasa los distintos productos de PCR descritos, que están flanqueados por los sitios de reconocimiento de recombinasas mencionados, que son dadores de secuencias de DNA, y se mezclan con un vector de clonación que contiene los mismos sitios de reconocimiento (aceptores de secuencias de DNA). Por influencia de las proteínas de recombinasa purificadas se genera “in vitro” una mezcla muy compleja de vectores de clonación que tienen distintas secuencias de DNA recombinadas. Los expertos también conocen este procedimiento, que ya es un producto comercial (véase entre otros el kit Creator™ de Clontech; Gateway™ de GibcoBRL /Invitrogen).

Aparte existen otros procedimientos que los expertos ya conocen, con los que puede producirse un gran número de secuencias de DNA distintas (p.ej. el barajado de DNA (DNAshuffeling) “in vitro”, Stemmer, Nature 370, 389-391, 1994, la multiplicación de la gran variedad de cDNA de anticuerpos

o de DNA genómico recortado pequeño y no dirigido). Cabe mencionar aquí en especial la producción de genes de anticuerpos muy diferentes por síntesis combinatoria de secuencias de DNA, en especial de diferentes secuencias de CDR-DNA (Breitling y col., 1990, “Bibliotecas de anticuerpos humanos sintéticos”, patente alemana nº P 40 02 897; véase también la biblioteca de anticuerpos HuCal de la empresa Morphosys).

Líneas celulares

La línea celular HEA125 de hibridoma murino preferida para el procedimiento de la invención produce un anticuerpo IgG1 de ratón con una cadena kappa de ratón. Este anticuerpo monoclonal reconoce al antígeno Ep-CAM asociado con tumores humanos con una afinidad y especificidad elevadas (Moldenhauer y col., Br. J. Cancer 56, 714-722, 1987; Momburg y col., Cancer Research 47, 2883-2891, 1987). Una subpoblación derivada de los mismos presenta relativamente muchos anticuerpos unidos a membrana en la superficie. Son también idóneas para el procedimiento de la invención otras líneas celulares, en especial otras células de hibridoma o líneas celular linfoides, p.ej. las líneas humanas:

-

la U266, que produce una cadena lambda y una IgE (Ikeyama y col., Purification and characterization of IgE produced by human myeloma cell line U266; Mol. Immunol. 23, 159-167, 1986);

-

la IM-9 (Lesniak y Roth, Regulation of receptor concentration by homologous hormone. Effect of human growth hormone on its receptor in IM-9 lymphocytes; J. Biol. Chem. 251, 3720-3729, 1976) y

-

la línea Jurkat de células T (Gillis y Watson, Biochemical and biological characterization of lymphocyte regulatory molecules; V. Identification of an interleukin 2producing human leukemia T cell line; J. Exp. Med. 152, 17091719, 1980) o

-

la línea DT40 de células B de pollo (Buerstedde y Takeda, Cell 67, 179-188, 1991). Las líneas celulares humanas tienen la ventaja adicional de que con ellas se evita la glucosilación algo diferente de las células murinas (Borrebaeck, Nat. Biotechnol. 17, 621, 1999). Las líneas de células T como la Jurkat deberán preferirse cuando tenga que producirse una biblioteca de receptores de células T, o bien cuando tenga que emplearse el locus de gen activo de receptor de células T. En cambio, la línea DT40 de células de pollo posee una eficacia relativamente muy elevada para la recombinación homóloga de DNA transfectado.

Transfección

También la transfección de las células eucariotas se realiza por procedimientos estándar ya conocidos por los expertos (Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual, 3ª edición, 2001, ISBN 0-87969-577-3; capítulo 16) p.ej. por electroporación (empresa AGS / Hybaid o bien

BioRad,

Manual de los electroporadores BTX o bien BioRad

GenePulser)

o por transfección p.ej. con el reactivo

LipofectAMINE™

2000 (Invitrogen, nº 1668-027), con el

reactivo DMRIE-C (Invitrogen, nº 10459-014), o con el reactivo LipofectAMINE™ (Invitrogen, nº 18324-012), con el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche, nº 1815091), con el reactivo de transfección liposómica DOTAP (Roche, nº 1811177)

o con el reactivo de transfección liposómica DOSPER (Roche, nº 1811169). La porción de los hibridomas electroporados con éxito se sitúa por lo general entre el 30 y el 40 % de las células empleadas. Para las transfecciones destinadas a una recombinación homóloga de las secuencias de DNA transfectadas, con preferencia se linealizan las secuencias de DNA mencionadas. Si se desea la recombinación específica de las secuencias de DNA transfectadas, entonces se emplearán con preferencia secuencias de DNA circulares, son idóneas para ello en especial los vectores replicantes episómicos en células de hibridoma (véanse las páginas anteriores). La porción de recombinaciones específicas realizadas con éxito por reemplazo de cassettes dentro de una célula eucariota se sitúa aprox. en el 1% de las células electroporadas con éxito (Feng y col., Site-specific chromosomal integration in mammalian cells: highly efficient CRE recombinase-mediated cassette exchange; J. Mol. Biol. 292, 779-785, 1999), de modo que empleando 3x 109 células se obtienen aprox. 107 acontecimientos distintos de recombinación específica.

Expresión en superficie / procedimiento de enriquecimiento

Otro elemento fundamental de la presente invención es el aislamiento o el enriquecimiento de aquellas células (a ser posible después de cada paso del procedimiento), en las que se ha realizado el acontecimiento de recombinación deseado (figuras 7, 8, 9). La invención lo permite con la detección de las proteínas alteradas sobre la superficie de las células vivas que las producen. También esto puede realizarse por procedimientos convencionales, que los expertos ya conocen, como el uso de esferillas magnéticas (empresa Dynal, Oslo, Noruega; manual técnico: “Cell Separation and Protein Purification” de Dynal; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, ISBN 0-471-52276-7) o de un clasificador FACS (Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 3ª edición, 1995, Wiley-Liss., Nueva York, ISBN 0-471-30376-3; Darzynkiewicz y col., Flow Cytometry, 2ª edición, 1994, Academic Press, ISBN 0-12564142-7; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, ISBN 0-471-52276-7). Los acontecimientos de recombinación homóloga muy raros (aprox. 1 de cada 107 células) pueden identificarse p.ej. con un aparato FACSVantage SE equipado con un turboclasificador o con un aparato FACSDiva (Becton-Dickinson) o con un MoFlow (Cytomation), en los que con la introducción señales de recombinación específica en loci de gen definidos puede realizarse además una preselección basada en un gen de resistencia recombinado (p.ej. a la geneticina (G418) de Sigma; Chauhan y Gottesman, Construction of a new universal vector for insertional mutagenesis by homologous recombination; Gene 120, 281, 1992). Este tipo de preselección no es esencial para la presente invención y se evitará en especial cuando el gen de resistencia integrado en el cromosoma impida la expresión en superficie de la proteína alterada por la recombinación homóloga. Un ejemplo de tal obstaculización de la expresión en superficie es la humanización de células de hibridoma por recombinación homóloga descrita por Yarnold y Fell (Cancer Research 54, 506-512, 1994). En este caso, el gen de resistencia se integra en el intrón, situado entre CH3 y M1, esencial para el empalme diferencial.

Pueden enriquecerse también los acontecimientos de recombinación específica más frecuentes (aprox. 1 entre 102 y 103 células en caso de intercambio de cassettes) por procedimientos estándar de detección de proteínas alteradas sobre la superficie de las células con un clasificador FACS o con esferillas magnéticas (figura 9), que se describen en los ejemplos posteriores.

Para ello, las proteínas alteradas se tiñen con preferencia antes de la clasificación en el FACS con anticuerpos mono- o policlonales marcados con fluorescencia (o con proteína G o similares), que son productos comerciales suministrados por muchas empresas (p.ej. Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU. o Dianova, Alemania o Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EE.UU. o BIOZOL, Alemania). Las señales claras se obtienen en especial con una tinción doble, en la que dos marcadores fluorescentes distintos detectan las proteínas codificadas por las secuencias de DNA intercambiadas (o su ausencia). Los expertos ya conocen los procedimientos requeridos para ello, que se han descrito en un gran número de publicaciones detalladas (p.ej. Scheffold y Kern, Recent developments in flow cytometry; J. Clin. Immunol. 20, 400-7, 2000; revisión; Thiel, A., Scheffold, A., Radbruch, Immunomagnetic cell sorting-pushing the limits; Immunotechnology 2, 89-96, 1998; revisión; así como los manuales de citometría antes citados). Por ejemplo, el intercambio de un dominio kappa murino por uno humano (por recombinación homóloga o específica) puede detectarse por tinción con un anticuerpo kappa de cabra antihumano marcado con FITC y después clasificarse, tiñiéndose al mismo tiempo con un anticuerpo kappa de cabra anti-murino marcado con PE. Se puede incluso detectar la ausencia de una señal, p.ej. por recombinación homóloga reemplazando el dominio vH de un anticuerpo IgG presentado sobre la superficie de un hibridoma por un gen de resistencia G418. Después de la preselección con G418, la tinción con un anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC proporciona otro enriquecimiento de los resultados de la recombinación homóloga con el clasificador FACS: las células de fluorescencia verde no han adquirido en este caso la resistencia G418 por la recombinación homóloga y por ello se empobrecen en el FACS. Puede ser útil también el uso de anticuerpos monoclonales específicos de epítopes, p.ej. un anticuerpo específico del epítope Mycl-9E10 (Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5, 3610-3616, 1985), con el que pueden detectarse p.ej. dominios vH alterados. Las secuencias de DNA intercambiadas pueden detectarse también directamente, sin tinción adicional, en el FACS, en el caso de que p.ej. se haya recombinado el gen de una EGFP (proteína fluorescente verde intensificado; Clontech) y se haya expresado.

La presentación en la superficie, en especial de anticuerpos, se consigue en la presente invención con preferencia por el empalme diferencial del mRNA de la cadena larga de anticuerpo (o de los correspondientes mRNAs quiméricos) (figura 2; Inmunología de Janeway y Travers, capítulos 3-24, 4ª edición, 1999, editorial Spektrum, ISBN 443062757). Esto conlleva la ventaja de que aparte de una variante unida a la membrana por enlace covalente se dispone también de grandes cantidades de la forma secretada al medio de cultivo para la caracterización rápida y simple de un clon de célula o de una biblioteca de células. La porción de anticuerpos unidos a la membrana y, por tanto, la intensidad de señal esperada puede aumentarse acortando el intrón situado entre el dominio CH3 y el dominio M1 de una IgG o IgA (o bien entre el dominio CH4 y el dominio M1 de una IgM), en especial en una longitud comprendida entre 300 bp y 1.000 bp (Peterson y Perry, PNAS 83, 8883-8887, 1986; Tsurushita y Korn, Molec. Cell. Biol. 7, 2602-2605, 1987; Galli y col., Genes Dev. 1, 471-481, 1987; Seipelt y Peterson, Molecular Immunology 32, 277-285, 1995; figura 3, III.). Como alternativa pueden emplearse también otras anclas de membrana, p.ej. el receptor de células T-alfa (número de registro EMBL = X02883, las secuencias del exón 3) o una molécula MHC, con lo cual pueden presentarse todavía más proteínas sobre la superficie. También es posible la unión no covalente de los anticuerpos sobre la superficie de las células por la proteína G situada sobre la membrana (Breitling y col., 1999, PCT DE 00/00079), pero esto conlleva el inconveniente de la interferencia (crosstalk): en este caso no todos los anticuerpos se codifican necesariamente con las células que los presentan.

La presentación en la superficie es de gran utilidad en especial cuando tienen que investigarse muchas (>102) células distintas entre sí por las proteínas expresadas, con arreglo a una actividad determinada de las proteínas. Según la presente invención, esto se consigue de modo muy similar a la técnica de los anticuerpos recombinantes, en la que esto se consigue en especial por la presentación de los anticuerpos en un fago (Breitling y col., Gene 104, 147-153, 1991) o en una bacteria (Fuchs y col., Bio/Technology 9, 1369-1372, 1991). Tal como allí se describe, pueden investigarse de este modo bibliotecas de proteínas esencialmente más complejas. La presente invención tiene la ventaja adicional de una intensidad de señales relativamente muy elevada gracias al gran número de proteínas similares presentadas en cada caso, en especial de anticuerpos. Un clasificador FACS trabaja actualmente con velocidades de clasificación de aprox. 108 células por hora (p.ej. FACSVantage SE, ver páginas anteriores), teniendo en cuenta que una biblioteca de proteínas todavía más compleja puede además enriquecerse previamente con esferillas magnéticas. La técnica de la clasificación FACS requerida para esta invención se ha descrito en Kern y col., (Nature Medicine 4, 975-978, 1998) y Maecker y col., (J. Immunol. Methods 255, 27-40, 2001), que con ella consiguieron identificar células T específicas de epítopes.

Biblioteca de anticuerpos de hibridoma

En una forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención, después de un paso de transfección con un grupo de secuencias de DNA distintas y posterior recombinación específica (figuras 5, 6) se realiza un enriquecimiento de células productoras de anticuerpos unidos a la superficie de una diversidad de anticuerpos lo más elevada posible (figura 9). Esto puede realizarse del modo antes descrito, es decir, el grupo de las células de hibridoma se tiñe del modo descrito con 2 reactivos distintos y después se clasifican en el FACS el mayor número posible de células. Con ello se empobrecen las células, que poseen una muestra de color típica de la célula inicial. Esto sucede p.ej. por detección de un epítope myc en el dominio vH de la célula inicial. Como alternativa puede sacarse provecho p.ej. de que la célula inicial antes de la recombinación específica no presente anticuerpos sobre la superficie, sino que en su lugar se haya insertado en el locus de gen de la línea celular monoespecífica un gen de resistencia G418. En cambio se enriquecen las células que presentan una cadena IgG en especial humana o una cadena kappa o lambda. Tales son las células que han pasado por una recombinación específica productiva.

El resultado de este proceder es una biblioteca compleja de hibridomas (>106 especificidades distintas de hibridomas) (figuras 5, 6, 9), cuyos componentes individuales presentan grandes cantidades de un anticuerpo humano sobre la superficie (aprox. de 104 a 106 moléculas de anticuerpo por célula). El número de los anticuerpos presentados por célula se sitúa en un marco relativamente estrecho, ya que todas las células proceden del mismo hibridoma parental. Es, pues, también objeto de la presente invención una biblioteca de anticuerpos, que puede obtenerse por el procedimiento de la invención. Esta biblioteca contiene con preferencia un grupo de por lo menos 100 células distintas, con mayor preferencia un grupo de por lo menos 1000 células.

El procedimiento descrito para la producción de una biblioteca de anticuerpos de hibridoma se describe también en las figuras 3, 5 y 9:

-el grupo antes descrito, lo más complejo posible de plásmidos de gen vL se electropora en el mayor número posible de células (aprox. 3x 109 células) de una línea celular monoespecífica, al mismo tiempo se electropora en las células p.ej. un vector de expresión de la Flp;

-la porción de los hibridomas electroporados con éxito se sitúa normalmente entre el 30 y el 40 % de las células empleadas. De este modo se genera un grupo de células de hibridoma, que presentan una frecuencia de aprox. 1 a 300 dominios vL distintos sobre la superficie, de modo que se genera una biblioteca de hibridomas de una complejidad de aprox. 107 hibridomas distintos (cantidad total: 3x 109 células), es decir, de anticuerpos distintos;

-este grupo de células de hibridoma se expande opcionalmente y después se tiñe con dos reactivos distintos, del modo ya descrito;

-a continuación se clasifica el mayor número posible de células en el FACS o con esferillas magnéticas. Se empobrecen con ellos las células de la línea celular monoespecífica y las células recombinadas improductivas; se enriquecen las células que presentan una cadena kappa o lambda humanas;

-el grupo de plásmidos de gen vH lo más complejo posible, recién descrito, se electropora en el mayor número posible de las células de hibridoma del grupo recién descrito. Al mismo tiempo se electropora un vector de expresión de la Cre en las células;

-de este modo se genera un grupo de células de hibridoma, que presentan sobre la superficie una frecuencia de aprox. 1 a 300 dominios vH distintos;

-se tiñe de nuevo este grupo de células de hibridoma del modo descrito con 2 reactivos de tinción distintos y

-a continuación se clasifica el mayor número posible de células en el FACS o con esferillas magnéticas. Con ello se empobrecen las células de la línea celular monoespecífica del locus de gen vH y las células recombinadas improductivas; se enriquecen las células que presentan una cadena IgG humana (figura 9).

Una forma especial de ejecución del procedimiento de la invención se caracteriza porque las células eucariotas son células de mamíferos, con preferencia linfocitos neoplásicos

o precursores de los mismos; células leucémicas, células de linfomas malignos o células de hibridoma.

En otra forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención para la producción de una biblioteca de anticuerpos, los genes vH, genes vlambda y/o genes vkappa son genes humanos. Es especialmente preferido un procedimiento, en el que los loci de gen son loci de anticuerpos y contienen el gen vH, el gen vlambda o el gen vkappa activos.

El procedimiento de la invención comprende también un procedimiento para la producción de una biblioteca de células productoras de receptores de células T, en la que las distintas secuencias de DNA contienen distintos genes de receptor T-alfa o distintos genes de receptor T-beta, así como un procedimiento para la producción de una biblioteca de células que expresan exones, en la que las distintas secuencias de DNA contienen distintos exones genómicos, que codifican las señales de empalme. Es especialmente preferida una forma de ejecución, en la que los loci de gen son loci de receptor de células T y contienen al gen receptor de T-alfa activo o el gen receptor de T-beta activo.

En otra forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención para la producción de una biblioteca de anticuerpos, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos, que están unidos por enlace covalente a la superficie de las células que los expresan. Es especialmente preferida una forma de ejecución, en la que los anticuerpos monoclonales expresados por la célula en cuestión están unidos mediante enlace covalente a la superficie de la célula que los expresa por empalme diferencial de los dominios constantes de una IgG, IgM, IgA, IgD o IgE.

Con el procedimiento de la invención se obtienen con preferencia más de 102 células distintas por cada célula individual expandida, que en cada caso expresan proteínas distintas.

En otra forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención para la producción de una biblioteca de células eucariotas generadoras de anticuerpos, las regiones homólogas del DNA transfectado se extienden hasta los loci de gen de las células que flanquean las señales de recombinación específica a lo largo de por lo menos 400 pares de bases.

En otra forma de ejecución todavía más preferida del procedimiento de la invención para la producción de una biblioteca de células eucariotas generadoras de anticuerpos, el intrón se ha acortado en dirección al extremo 5’ antes del exón M1 de un gen de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE en más de 50 pares de bases.

En otra forma preferida de ejecución del procedimiento de la invención después de la transfección con un gran número de secuencias diferentes de DNA, a partir del gran número de células distintas generadas con ello se realiza un enriquecimiento de las células en cuestión, que presentan en la superficie las superficies unidas a la superficie de las células correspondientes que las han expresado, de modo que la población de las células surge con una diversidad de proteínas lo más grande posible.

Es especialmente preferida una forma de ejecución del procedimiento de la invención, en el que durante los pasos de transfección con un gran número de secuencias diferentes de DNA se transfectan a y/o se activan además en los loci de gen, que en cada caso están flanqueados por sitios de reconocimiento de una recombinasa, las secuencias de DNA con secuencias de DNA expresables, codificadoras de la recombinasa correspondiente.

La presente invención se refiere también a una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, con preferencia productoras de anticuerpos, que pueden obtenerse con arreglo al procedimiento de la invención.

Selección de anticuerpos

La presente invención se refiere también a un procedimiento para el aislamiento de un anticuerpo monoclonal que tiene la especificidad deseada (véase la figura 9), dicho procedimiento está caracterizado porque se incuba un banco de anticuerpos generado con arreglo al procedimiento de la invención junto con el antígeno correspondiente y a continuación se aísla o se enriquece la línea celular, que tiene unido el antígeno sobre su superficie.

Los expertos ya conocen los procedimientos relativos a la puesta en contacto del antígeno con una biblioteca de anticuerpos y relativos a la selección del anticuerpo deseado (Liddell y Weeks, 1996, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, editorial Spektrum, ISBN 3827400481; Goding, J.W., 1996, “Production and Application of Monoclonale Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, tercera edición; publicado por la editorial Academic Press Limited, 24-28 Oval Road, Londres NW1 7DX; ISBN 0-12-2870239). Estos procedimientos se han descrito también con detalle para la selección de anticuerpo recombinantes presentados en superficie a partir de bibliotecas de fagos (véase entre otro de Kruif y col., PNAS 92, 3938-3942, 1995) y a partir de bibliotecas bacterianas (Fuchs y col., J. of Immunotechnology 2, 97-102, 1996). En la presente invención, estos procedimientos se adaptan en especial a la exploración de poblaciones de células eucariotas mediante esferillas magnéticas o un clasificador FACS. Los expertos conocen también estos procedimientos: son idénticos a la tinción de células vivas para el FACS (clasificador celular activado por fluorescencia) y se han descrito con detalle en un gran número de manuales especiales de laboratorio (véanse las páginas anteriores).

Las células de la biblioteca de anticuerpo obtenidas con arreglo al procedimiento de la invención se tiñen con preferencia con un antígeno biotinilado y después marcado con estreptavidina-FITC (o directamente con un antígeno marcado con FITC) y se seleccionan los acontecimientos de tinción más intensa. Si se desea, la biblioteca de anticuerpos puede también teñirse con una mezcla de anticuerpos marcados opcionalmente de distintas maneras y se seleccionan de nuevo los acontecimientos de tinción más intensa. Después se expanden las células individuales en el cultivo celular y producen en cada caso el anticuerpo monoclonal deseado, en especial humano. Por lo general para la selección específica de antígeno se requiere solamente una sola ronda de selección, ya que el número muy elevado de anticuerpos presentados produce señales muy claras. Existe también en especial la posibilidad de recurrir a los anticuerpos de una biblioteca de anticuerpos de hibridoma secretados en una variante de empalme al líquido sobrenadante del cultivo, a la subbiblioteca formada a partir de ellos o a clones individuales para la caracterización de una actividad buscada. En la biblioteca de anticuerpos de la invención podrían estar también representadas las especificidades de anticuerpos contra antígenos humanos, gracias a la nueva combinación de los dominios vH y vL.

Selección de anticuerpos más afines

En una forma especialmente preferida de ejecución, el procedimiento de la invención está caracterizado además porque con él se generan anticuerpos muy afines. Para ello, los expertos podrán proceder con arreglo a los procedimientos descritos a continuación.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales más afines pueden seleccionarse en el clasificador FACS. Para ello, tal como se ha descrito anteriormente, se tiñe la biblioteca de anticuerpos o un grupo de células de hibridoma específicas de distintos antígenos, derivado de la biblioteca anterior, con el antígeno marcado con ficoeritrita (PE). Estas células se tiñen con la proteína G marcada con FITC. Después, en el clasificador FACS, se seleccionan los acontecimientos de tinción con el mayor cociente entre tinción-PE y tinción-FITC. Se expanden las células individuales en el cultivo celular y producen en cada caso un anticuerpo monoclonal humano de afinidad relativamente elevada para con el antígeno empleado para la selección. Esto constituye un método muy sencillo para encontrar los anticuerpos monoclonales muy afines. De este modo, la normalización fácil de efectuar del número de anticuerpos presentados permite una comparación de afinidad “on line” de las especificidades de anticuerpo encontradas, ya que la relación entre antígenos unidos a anticuerpo y no unidos es un índice directo de la afinidad del anticuerpo para con su antígeno (figura 10).

En una forma preferida de ejecución, el procedimiento presente se caracteriza porque el aislamiento de anticuerpos de gran afinidad se realiza antes que la introducción de mutaciones dentro de los genes de anticuerpos variables. Esto puede realizarse p.ej. mediante la ejecución de una hipermutación somática o de una conversión de los genes de anticuerpos, que tal como se ha descrito se realiza antes que la selección de anticuerpos alterados, en especial más

afines,

presentados sobre la superficie de las células

(figura 11).

Puede

realizarse por ejemplo un barajado de cadenas

(chain-shuffling) y después la sección de los anticuerpos monoclonales muy afines. Para ello en primer lugar, tal como se ha descrito, p.ej. a partir de la biblioteca de

anticuerpos generados se selecciona un grupo de células de hibridoma específicas de antígeno, derivadas de dicha biblioteca, estando el antígeno marcado con FITC. Se expande en el cultivo celular este grupo de células de hibridoma seleccionadas. A continuación se intercambia uno de los dominios variables, tal como se ha descrito previamente, gracias a un acontecimiento específico de recombinación por un grupo de distintas secuencias de DNA, en especial por otros dominios variables (conversión genética). Se expande en el cultivo celular el grupo resultante de células de hibridoma. A continuación, a partir de este grupo, tal como se ha descrito previamente, se seleccionan los anticuerpos monoclonales humanos relativamente muy afines (figura 10) mediante un clasificador FACS. Este es también un método muy sencillo para generar un grupo de hibridomas, a partir del cual pueden aislarse anticuerpos monoclonales muy afines.

Como alternativa puede introducirse en un DNA molde, en especial en dominios variables preseleccionados, un gran número de mutaciones no dirigidas por una PCR susceptible de error (Stemmer, Nature 370, 389-391, 1994). A continuación, tal como se ha descrito antes, se recombina el mayor número posible de estos genes variables mutados de anticuerpos mediante señales de recombinación específicas en el locus de anticuerpo y después se seleccionan las células, p.ej. en el clasificador FACS, que presentan sobre la superficie el anticuerpo de mayor afinidad. Las mutaciones no dirigidas pueden también combinarse entre sí con arreglo al procedimiento desarrollado por Stemmer (conversión genética/hipermutación somática).

Otra vía de la invención para la generación de mutaciones no dirigidas recurre a vectores eucariotas de expresión, que expresan los genes RAD54, RecQ4, y/o el DNA del gen PolX-mu en células linfoides, en especial en combinación con el RNA antisentido contra XRCC2, XRCC3 o RAD51B (Kitao y col., Cloning of two new human helicase genes of the RecQ family: biological significance of multiple species in higher eukaryotes; Genomics 54, 443-452, 1998; Aoufouchi y col., Two novel human and mouse DNA polymerases of the polX family; Nucleic Acids Res. 28, 3684-3693, 2000; Sale y col., Ablation of XRCC2/3 transforms immunoglobulin v gene conversion into somatic hypermutation; Nature 412, 921926, 2001; vectores de expresión p.ej. pCEP4, pREP7, pREP10, pEBVHis o pREP4 de Invitrogen). Los productos genéticos RAD54, RecQ4 y DNA PolX mu forman parte del complejo de mutadores causantes de la introducción de hipermutaciones somáticas en los genes activos de anticuerpos, mientras que la represión de la expresión de XRCC2, XRCC3 o RAD51B mediante múltiples roturas de la hebra individual inicia al parecer las hipermutaciones somáticas. Para ello, en especial en el proceso de formación de células de memoria del organismo se mutan de modo no dirigido aprox. 1,5 kb de secuencias de DNA en dirección al extremo 3’ (downstream) hipermutación somática puede procederse por ejemplo de manera que a partir de la biblioteca de anticuerpos de la invención se seleccione un grupo de células de hibridoma derivadas de la misma, específicas de antígeno, estando el antígeno marcado con FITC, tal como se ha descrito previamente. Este grupo de células de hibridoma seleccionadas se expande en el cultivo celular y después se electropora en estas células una mezcla de los vectores de expresión descritos previamente. Se expande en el cultivo celular el grupo resultante de células de hibridoma. A continuación se seleccionan de este grupo, tal como se ha descrito antes, los anticuerpos monoclonales humanos muy afines con el clasificador FACS.

después

del promotor activo vH, vkappa o vlambda,

prescindiendo

del tipo de secuencias de DNA que están

presentes

en este tramo. Para la generación de una

Es especialmente preferida una forma de ejecución del presente procedimiento, en el que la célula se transfecta con un gran número de secuencias de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación y de este modo se obtiene un gran número de secuencias de DNA mediante una PCR “proclive al error”.

Humanización de hibridomas ya existentes

La presente invención se refiere también a procedimientos para la humanización de hibridomas murinos ya existentes por recombinación homóloga (figura 3, 7). Para ello puede transformarse por ejemplo cualquier célula de hibridoma de IgG1 murino elegible de modo discrecional con un vector de DNA predeterminado siempre igual en una célula de hibridoma de IgG1 humano (figura 3, 7) con otros vectores de DNA en IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE o IgM humanas. A su vez, otros vectores de DNA permiten la reestructuración de un hibridoma de IgM murino, etc. Este procedimiento especialmente sencillo y ventajoso puede ejecutarse sin emplear un marcador de resistencia que pudiera interferir (véase también Baker y col., J. Immunological Methods 168, 25-32, 1994), porque se aprovecha la alteración debida a la presentación en superficie del producto genético alterado para la selección de la célula alterada (figura 7). Este procedimiento es posible gracias a que se dispone de clasificadores FACS muy rápidos (p.ej. el FACSVantage SE, de Becton-Dickinson), que actualmente pueden clasificar aprox. 108 células por hora, con lo cual pueden hallarse incluso los acontecimientos muy infrecuentes de recombinación homóloga. Por lo demás se emplean aquí técnicas estándar ya conocidas de los técnicos.

Por tanto, la presente invención se refiere también a un procedimiento para la humanización de una célula de hibridoma, caracterizado porque:

(a)

se transfecta a una línea celular de hibridoma una secuencia de DNA que codifica a uno o más dominios constantes de las IgG, IgM, IgA, IgD o IgE humanas;

(b)

la secuencia de DNA de los dominios constantes de las IgG, IgM, IgA, IgD o IgE humanas se flanquea con secuencias de DNA, que son homólogas con las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean los dominios constantes del locus de gen activo de dichas células de hibridoma, que codifica la cadena larga del anticuerpo;

(c)

se expande una o pocas células, que gracias a la recombinación homóloga expresan una cadena larga de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE con una porción constante humanizada;

(d)

se transfecta a la línea celular de hibridoma una secuencia de DNA que codifica a un dominio constante kappa o lambda humano, dicha secuencia de DNA está flanqueada por secuencias de DNA que son homólogas con las regiones genéticas cromosómicas, que flanquean el dominio constante kappa o lambda del locus de gen kappa o lambda activo de la célula de hibridoma;

(e)

a continuación se expanden una o pocas células, que por una recombinación homóloga expresan una cadena kappa o lambda con una porción constante humanizada; con lo cual los anticuerpos expresados por la unión covalente de a variante de empalme situada en la membrana de la cadena larga de anticuerpo están unidos a la superficie de las células correspondientes que los han expresado, lo cual permite la detección y la selección de las células en

cuestión,

que presentan dominios constantes de anticuerpo

humanizados.

En

una forma preferida de ejecución de este

procedimiento

se humanizan en primer lugar los dominios

constantes de la cadena corta de anticuerpo y después los dominios constantes de la cadena larga de anticuerpo, para ello es todavía más preferido el procedimiento en el que se humanizan solamente los dominios constantes de la cadena larga del anticuerpo o solamente los dominios constantes de

la cadena corta del anticuerpo.

En otra forma preferida de ejecución del procedimiento presente se acorta el intrón en dirección al extremo 5’ antes del exón M1 del gen activo de la IgG, IgM, IgA, IgD o IgE en más de 50 pares de bases.

En otra forma preferida de ejecución del presente procedimiento se fusionan a los dominios constantes humanizados secuencias adicionales de DNA que codifican a proteínas, con preferencia que codifican una secuencia de engarce y un anticuerpo de cadena única, que está fusionado por su extremo C con el dominio constante de la cadena corta de anticuerpo.

En otra forma preferida de ejecución del presente procedimiento, las regiones homólogas de las secuencias de DNA transfectadas se extienden hacia los loci de gen de anticuerpo correspondientes de la célula de hibridoma a lo largo por lo menos de 400 pares de bases.

En otra forma preferida de ejecución del presente procedimiento, en las recombinaciones homólogas no se introducen en las células marcadores de resistencia, que se emplean para la selección de los acontecimientos de recombinación homóloga.

En lo referente a los vectores y células hospedantes preferidos para el procedimiento de la invención se remite a las precisiones presentes (véanse los apartados “Producción de secuencias de DNA complejas” y “Líneas celulares”).

La invención se ilustra con los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

Humanización de un anticuerpo de hibridoma

Como ejemplo de anticuerpo monoclonal a humanizar se toma la línea celular de hibridoma HEA125.

Esta línea celular de hibridoma murino produce un anticuerpo IgG1 murino junto con una cadena kappa murina. Este anticuerpo monoclonal reconoce al antígeno Ep-CAM asociado a tumores humanos con una afinidad y especificidad relativamente altas (Moldenhauer y col., Br. J. Cancer 56, 714-722, 1987).

a. Condiciones de cultivo

Se cultiva la línea celular HEA125 y se expande. Como medio de cultivo se emplea el RPMI 1640 (Gibco BRL nº 31870025) al que se añade un 10% de FCS y piruvato 1 mM. Los expertos ya conocen el resto de condiciones de cultivo (recipientes de plástico de tipo Falcon 25 cm3; estufa a 37°C; gaseado con 5-7,5% de CO2, como máximo 106 células por ml, etc.).

b. Selección de una subpoblación de HEA125

En primer lugar se lavan las células expandidas 2x con Dulbeccos PBS (DPBS) enfriado con hielo y se tiñen aprox. 107 células por 400 µl con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC (Dianova). Como contratinción para

identificar

las células muertas se emplea el yoduro de

propidio (1 µg/ml).

Se

lava de nuevo con DPBS enfriado con hielo, se

clasifica

el 5 % de la población de las células con un

clasificador FACS (FACSVantage SE, Becton-Dickinson), que emiten la fluorescencia verde más intensa. Como resultado se encuentra una subpoblación de células HEA125, que se expande

en las condiciones de cultivo recién indicadas y que presenta relativamente muchos anticuerpos unidos a la membrana.

c. Secuencias de DNA murino-humano quimérico

Con varios fragmentos de gen individuales se hace una composición en el vector de clonación pBSIISK+ (Stratagene) para formar secuencias de DNA murino-humano quiméricas. Los distintos fragmentos se generan por PCR (Roche Diagnostics; Expand Long Template PCR System; véase también las condiciones de la PCR). Como molde para las secuencias genéticas murinas genómicas se emplea el DNA genómico de la línea celular de hibridoma murino HEA125, como molde para las secuencias genéticas humanas genómicas se emplea el DNA genómico de glóbulos sanguíneos humanos. El aislamiento del DNA genómico y las técnicas de clonación requeridas se han descrito en diversos manuales de laboratorio (véase p.ej. Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual, 3ª edición, 2001, ISBN 0-87969-577-3). En la figura 12 se representan las secuencias de DNA quiméricas resultantes, cuya secuencia se verifica. Los cebadores empleados para la clonación en el pBSIISK+ se describen en la figura 12. En la figura 12A se representan la secuencia de DNA quimérico del vector pBS-MhkappaM, que se emplea para la humanización de la cadena kappa constante de HEA125. En la figura 12B se representa la secuencia de DNA quimérico del vector pBSMhIgG1M, que se emplea para la humanización de los dominios constantes IgG1 CH1, CH2 y CH3 de HEA125.

d. Condiciones óptimas para la electroporación de HEA125

Las condiciones óptimas de electroporación para la transfección de HEA125 con DNA se evalúan del modo siguiente:

-se cultivan las células en medio RPMI + 10 de FCS;

-después se lavan 2x con DPBS enfriado con hielo;

-se recogen aprox. 107 células por cada 400 µl de tampón DPBS;

-a las células de 400 µl células se les añaden en cada caso 10 µg de DNA plásmido “supercoiled” pEGFP N3 MCS (Clontech);

-

se mezclan en una cubeta de electroporación de 4 mm de anchura;

-

se incuba la cubeta con las células sobre hielo durante 10 min;

-a continuación con el electroporador BTX (AGS) se dan en cada caso 1 ó 2 impulsos de corriente de 500 V de una duración en cada caso de 2 ms;

-

se incuba de nuevo sobre hielo durante 10 min;

-

se cultivan en cada caso 107 células en 10 ml de RPMI

+ 10 % de FCS + 20 % de medio acondicionado para ello en frascos de 50 cm3;

-2 días más tarde se lavan 2x con DPBS enfriado con hielo y

-en el clasificador FACS se mide la fluorescencia verde provocada por el EGFP.

Como resultado, del 30 al 50 % de las células de hibridoma transfectadas, analizadas en el clasificador FACS, presentan una fluorescencia verde relativamente acusada

(control: electroporación con un DNA de vector irrelevante).

e. Humanización de los dominios C-kappa de HEA125

Se linealiza el vector de humanización pBS-MhkappaM kappa murino quimérico, descrito en el ejemplo 1c y la figura 12A, con la enzima de restricción BglI y en cada caso 10 µg del DNA plásmido linealizado se tratan con la subpoblación expandida de células HEA125, descrita en el ejemplo 1b. Estas células se transfectan en las condiciones de electroporación optimizada descritas en el ejemplo 1d. Después de 2-4 días en cultivo (descrito en el ejemplo 1a) se lavan las células 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 108 células por cada 4 ml con anticuerpo kappa de cabra anti-murino marcado con FITC y al mismo tiempo con anticuerpo kappa de cabra anti-humano conjugado con PE (Southern Biotechnology Associates). Como contratinción para la identificación de las células muertas se emplea el yoduro de propidio. Se lavan de nuevo las células con DPBS enfriado con hielo y se seleccionan en el clasificador FACS, que permite clasificar aprox. 108 células en 2 horas.

Como resultado se clasifican 2-5 células distintas por cada 108 células HEA125, que presentan una fluorescencia roja acusada, específica de la ficoeritrita (PE). Se expanden las células individuales en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas. A continuación se lavan de nuevo los clones resultantes del modo descrito, se tiñen con el anticuerpo kappa de cabra anti-murino marcado con FITC y al mismo tiempo con anticuerpo kappa de cabra anti-humano conjugado con PE y se analizan en el FACS. Se siguen propagando dos clones que tienen una señal de florescencia roja acusada. Se multiplica el dominio kappa constante genómico de estos clones por PCR y empleando los cebadores HK3 y HK4 (cebadores: véase la figura 12A) y se secuencia. Como resultado se sigue propagando el clon hkappa de HEA125 con el dominio kappa humano constante codificado genómico. La secuencia de la transición del DNA kappa murino genómico al DNA kappa humano genómico de este clon se representa en la figura 12 A.

f. Humanización de los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 de IgG1

Se linealiza el vector de humanización pBS-MhIgG1M de la IgG1 murina quimérica, descrito en el ejemplo 1c y en la figura 12B, con la enzima de restricción SspI y cada 10 µg de DNA plásmido linealizado se trata con células del subclon hkappa de HEA125 parcialmente humanizado, descrito en el ejemplo 1e. El cultivo celular, la selección en el FACS, la tinción de las células son idénticos a los descritos en el ejemplo 1e, excepto que en lugar del anticuerpo kappa de cabra anti-humano conjugado con PE se emplea un anticuerpo IgG de cabra anti-humano conjugado con PE. Como resultado se clasifican inicialmente 1-3 células individuales por cada 108 células HEA125-hkappa, que presentan una fluorescencia roja claramente marcada, específica de la ficoeritrita (PE). Después de la secuenciación de control de las regiones recombinantes homólogas mediante los cebadores de PCR HG3 y HG4 (véase la figura 12B) se sigue propagando la línea celular HEA125-hIgG1hkappa, que además de un dominio kappa humano constante codificada genómicamente a los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 de la IgG1. La secuencia de la transición del DNA de IgG1 murino genómico al DNA de IgG1 humano genómico de este clon se representa en la figura 12B.

De este modo se han humanizado los dominios constantes de una célula de hibridoma murino productora de IgG1, que en principio puede elegirse a discreción, para convertirlos en IgG1 humana. Las células de hibridoma murino, que producen las IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE o IgM, pueden humanizarse de modo muy similar con otras secuencias de DNA quiméricas. En función del vector de humanización empleado pueden también transformarse o alterarse los distintos grupos de anticuerpos, con lo cual por ejemplo una IgM murina puede transformarse en una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 o IgE humana. Lo mismo se diga de la transformación de un dominio constante kappa murino en un dominio constante lambda humano.

Ejemplo 2

Logro de una expresión superficial más intensa de anticuerpos

En lugar del vector de humanización pBS-MhIgG1M de IgG1 murina quimérico, descrito en el ejemplo 1f, se emplea el vector pBS-MhIgGlMdelta350, que tiene la deleción descrita en la figura 12B de aprox. 350 bp en el intrón entre el dominio CH3 y el M1, pero por lo demás es idéntico al vector pBSMhIgG1M descrito en el ejemplo 1f y en la figura 12B. El procedimiento es el mismo que el descrito en el ejemplo 1f. También en este caso se encuentran 1-2 entre aprox. 108 células que tienen una recombinación homóloga en la región

del locus de gen de la cadena larga.

Como resultado de este ejemplo se propaga la línea celular HEA125-mhIgG1hkappa, que, comparada con la línea celular HEA125-hIgG1hkappa descrita en el ejemplo 1f, debido al intrón acortado entre el dominio CH3 y el dominio M1 de la IgG1 tiene un número claramente mayor de anticuerpos humanizados unidos a la membrana (véase también la figura 7, célula de hibridoma 2H).

Ejemplo 3

Introducción de señales de recombinación específica en el locus de gen vH de HEA125

a. Secuencias de DNA quimérico

Se combinan varios fragmentos individuales de gen en el vector de clonación pBSIISK+ para formar secuencias de DNA quimérico. Los distintos fragmentos de gen se generan por PCR (Roche Diagnostics; Expand Long Template PCR System; véanse también las condiciones de la PCR). Los cebadores de PCR empleados se representan en la figura 13B. Como molde de las secuencias genéticas murinas genómicas se emplea el DNA genómico de la línea celular de hibridoma murino HEA125. Como molde del gen de resistencia PGKneo se emplea el vector ploxPfrtPGKneofrtloxP (Erich Greiner, DKFZ, Departamento de Biología Molecular de las Células I). En la figura 13B se representa el vector pBS-MvHG418M resultante, cuya secuencia se verifica a continuación.

b. Preselección con G418

La línea celular HEA125-hIgG1hkappa obtenida en el ejemplo 2 se transfecta con el vector linealizado pBSMvHG418M descrito en la figura 13B, para ello se aplican las condiciones de electroporación descritas en el ejemplo 1d. Dos días después de la electroporación se someten las células transfectadas de DNA a una preselección con G418 (según el lote: 400-800 µg de G418 pro ml durante 14 días; el resto de condiciones del cultivo celular es igual al ejemplo 1). A continuación se tiñen las células resistentes a G418 expandidas del modo descrito en el ejemplo 1b con anticuerpos IgG de cabra anti-humanos marcados con FITC y se seleccionan en el clasificador FACS. Como resultado se clasifican del modo antes descrito aprox. 2.000 células individuales, que no presentan tinción específica de anticuerpo (es decir, una fluorescencia verde lo más pequeña posible). Estas células concretas se expanden en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas.

c. Introducción de sitio loxP en el locus de gen vH

De los clones obtenidos en el ejemplo 3b se aísla el DNA, que en cada caso se emplea como molde para una PCR (Roche Diagnostics; Expand Long Template PCR System; véanse también las condiciones de la PCR). Los cebadores de PCR vHG418-3 y vHG418-4 empleados para ello se describen en la figura 13B. Se separan por tamaños las correspondientes bandas PCR en un gel de TAE-agarosa del 0,8 % y se comparan con el resultado esperado. Como resultado, 8 de los 2.000 clones analizados presentan una banda PCR del tamaño esperado de aprox. 1,85 kb. Después de la secuenciación de control del DNA genómico (o de la banda PCR descrita) PCR-Bande) se sigue propagando como resultado el clon HEA125-mhIgGlhkappaloxPG418 con señales de recombinación específicas codificadas genómicamente (loxP y loxP511) en la región del locus de gen vH activo.

d. Recombinación específica

Se reúnen las células de los aprox. 2.000 clones descritos en el ejemplo 3b, como alternativa se emplea el clon expandido HEA125-mhIgG1hKappa-loxPG418 descrito en el ejemplo 3c. En estas células se electropora el vector pBSloxPvHmyc representado en la figura 15B. Este vector codifica al gen vH de HEA125 recombinado genómicamente, que está flanqueado por un sitio loxP y una sitio loxP511. Además del gen vH de HEA125 se inserta en la región CDR3 del dominio vH un myc-tag. Al mismo tiempo se electropora en las células un vector de expresión pMC-Cre (véanse las condiciones en el ejemplo 1d). Después de 2-4 días de cultivo (descrito en el ejemplo 1a) se lavan las células 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 108 células por ml con el anticuerpo IgG de cabra anti-humano conjugado con FITC (Dianova). Como alternativa se tiñen con el anticuerpo 1-9E10 anti-myc marcado con FITC. Como contratinción para la identificación de células muertas se emplea el yoduro de propidio. Después de un nuevo lavado con DPBS enfriado con hielo se seleccionan en el clasificador FACS las células individuales de fluorescencia FITC más intensa.

Se obtienen:

-

el clon de partida HEA125-mhIgGlhKappa-loxPG418 descrito en el ejemplo 3c aprox. el 1% de las células con

fluorescencia FITC relativamente intensa;

-

el conjunto de células reunidas descrito en el ejemplo 3b aprox. 15 células con fluorescencia FITC relativamente intensa por cada 108 células clasificadas.

Un total de 20 células individuales clasificadas se expanden en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas. A continuación se comprueba la resistencia de los clones individuales al G418 del modo descrito en el ejemplo 3b. Como resultado, 17 de los 20 clones verificados fueron sensibles al G418. Después de la PCR y la secuenciación del locus de gen vH con los cebadores de PCR vHG418-3 y vHG418-4 (véase la figura 13B), se sigue expandiendo la línea celular HEA125-mhloxPmyc sensible al G418. Se lavan las células de este clon 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 108 células por ml con anticuerpo anti-myc marcados con FITC (epítope Myc1-9E10; Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5, 3610-3616, 1985). Como contratinción para la identificación de las células muertas se emplea el yoduro

de

propidio. En el clasificador FACS se detecta la

fluorescencia

verde intensa de la línea celular HEA125

mhloxPmyc.

La línea celular HEA125-mhloxPmyc sensible al G418 resultante produce un anticuerpo IgG1 de hibridoma monoclonal de una especificidad definida (en este ejemplo, los dominios vH de HEA125 con un c-myc-tag adicional en la CDR3 del dominio vH) con dominios constantes humanizados. Además, el exón vH dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. Una gran parte de los anticuerpos producidos (del orden de 104 a 106 moléculas de anticuerpo) se halla unida mediante enlace covalente a un anclaje de

membrana sobre la superficie de las células de hibridoma. Ejemplo 4 Introducción de señales de recombinación específica en

el locus de gen vkappa de HEA125

a. Secuencias de DNA quimérico

Tal como se ha descrito en el ejemplo 3 se combinan varios fragmentos de gen individuales en el vector de clonación pBS para formar secuencias de DNA quimérico. En la figura 13A se representan el vector de DNA resultante, el pBS-MkappaG418M, cuya secuencia se verifica a continuación.

b. Preselección con G418

La línea celular HEA125-mhloxPmyc obtenida en el ejemplo 3d se electropora con el vector con el vector pBSMkappaG418M linealizado descrito en el ejemplo 4a del modo descrito en el ejemplo 3b, a continuación se realiza la selección con G418 del modo descrito y se seleccionan en el clasificador FACS las células sin cada kappa expresada. Pero para la tinción, a diferencia del ejemplo 3b, se tiñe con anticuerpo kappa de cabra anti-humano marcado con FITC. Como resultado se clasifican del modo descrito en el ejemplo 3b aprox. 2.000 células individuales, que no presentan tinción kappa específica (es decir, fluorescencia verde lo más pequeña posible). Se expanden estas células en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas.

c. Introducción de sitios FRT en el locus de gen vkappa

De los clones descritos en el ejemplo 4b se aísla el DNA genómico del modo ya descrito, se realiza una PCR y se verifica el tamaño esperado de la banda PCR. Los cebadores de PCR KG418-3 y KG418-4 empleados para ello se describen en la figura 13A. Como resultado, 14 de los 2.000 clones analizados presentan una banda PCR del tamaño esperado, es decir de aprox. 1,9 kb. Después de la secuenciación de control del DNA genómico (o de la banda PCR descrita) se sigue propagando como resultado el clon HEA125-mhloxPmycFRTG418 con señales de recombinación específicas codificadas genómicamente (FRT0 y FRT3) en la región del locus de gen vkappa activo. La línea celular resultante HEA125-mhloxPmycFRTG418 produce un anticuerpo IgG1 de hibridoma monoclonal de una especificidad definida (en este ejemplo: el dominio vH de HEA125 con un cmyc-tag adicional en el CDR3 del dominio vH) con dominios constantes humanizados. Además, el exón vH dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. En lugar del dominio vkappa se halla un gen de resistencia G418, que está flanqueado por 2 sitios FRT distintos.

d. Recombinación específica

Se reúnen las células de los aprox. 2.000 clones descritos en el ejemplo 4b, como alternativa se emplea el clon HEA125-mhloxPmycFRTG418 expandido descrito en el ejemplo 4c. Se electropora en estas células el vector pBS-FRTvkappa representado en la figura 15A. Este vector codifica al gen vkappa recombinado genómico de HEA125 (sin exón líder), que está flanqueado por un sitio FRT0 y un sitio FRT3. Al mismo tiempo se electropora el vector de expresión de Flp pOG44 en las células (véanse las condiciones en el ejemplo 1d). Después de 2-4 días de cultivo (descrito en el ejemplo 1a) se lavan las células 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 108 células por ml con anticuerpo kappa de cabra antihumano conjugado con PE (Dianova). Como contratinción para la identificación de células muertas se emplea el yoduro de propidio. Después de un nuevo lavado con DPBS enfriado con hielo se seleccionan en un clasificador FACS las células individuales que tienen fluorescencia PE intensa.

Se obtienen:

-

El clon inicial descrito en el ejemplo 4c HEA125mhloxPmycFRTG418 aprox. 1% de células con fluorescencia PE relativamente intensa;

-

El grupo de células descrito en el ejemplo 4b aprox. 20 células con fluorescencia PE relativamente intensa por cada 108 células clasificadas.

En total aprox. 20 células individuales clasificadas se expanden en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas. A continuación se verifica la resistencia de los clones individuales al G418 del modo descrito en el ejemplo 4b. Como resultado, 18 de los 20 clones verificados son sensibles al G418, entre ellos todos los subclones derivados del clon HEA125-mhloxPmycFRTG418. Después de la PCR y secuenciación del locus de gen vkappa con los cebadores de PCR KG418-3 y KG418-4 (véase la figura 13A) se sigue expandiendo la línea celular HEA125-mhRek sensible al G418.

La línea celular resultante HEA125-mhRek produce un anticuerpo IgG1 de hibridoma monoclonal de una especificidad definida con dominios constantes humanizados. En este ejemplo, el dominio vH de HEA125 codifica a un c-myc-tag adicional en la CDR3 del dominio vH, que puede detectarse con el anticuerpo monoclonal 1-9E10 en un clasificador FACS. Además, el exón vH activo dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. El exón vkappa activo dentro del locus de gen vkappa está flanqueado por 2 sitios FRT distintos. Una gran parte de los anticuerpos producidos se halla unido con enlace covalentes a un anclaje de membrana sobre la superficie de las células de hibridoma.

Ejemplo 5

Producción de una biblioteca de genes vlambda

a. Análisis computerizado de genes vlambda humanos

Ya se conocen las secuencias genómicas del locus de gen vlambda humano (“One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus”; Genome Res. 7, 250-261, 1997; número de registro: D87000; D87007; D87009; D87010; D87014; D87015; D87016; D87017; D87018; D87021; D87022; D87023; D87024; X51755; X51754; véase también el libro Immunoglobulin Facts Book, Lefranc y Lefranc, en el que se describen 33 genes vlambda funcionales). El análisis computerizado de 24 genes vlambda humanos conocidos no indica ningún sitio de restricción BstBI, BssHII, ClaI, DraI, HpaI, MluI, NotI, NruI, SacII, SalI, SnaBI, XhoI, EagI ni SwaI dentro de una región de aprox. 300 bp en dirección al extremo 5’ (upstream) del codón de inicio del exón líder de los genes analizados hasta la correspondiente señal de recombinación genómica del final del CDR3. Se analiza además la región de los segmentos J, en cada caso contados a partir del extremo 5’ de los 4 segmentos de gen Jlambda activos, hasta aprox. 200 bp en dirección a 3’ (downstream) del extremo 3’ de los segmentos J (véase D87018 y D87023). Como resultado, en especial los sitios de restricción BssHII, MluI, NotI, SalI, XhoI y EagI son idóneos para la clonación del gran abanico de genes vlambda humanos.

b. Cebadores de PCR específicos de los genes vlambda

Se generan cebadores de PCR específicos de los genes vlambda, que en cada caso se hibridan en el intrón entre el exón líder y el correspondiente exón vlambda (figura 14A). La región equiparable del locus vkappa activo del gen de HEA125 está situada aproximadamente en el sitio de corte SwaI del intrón entre el exón líder y el exón vkappa. Los cebadores se hibridan en las regiones, que están situados en cada caso aprox. 130-170 bp en dirección a 5’ (upstream) del extremo 5’ del correspondiente exón vlambda. La temperatura de hibridación de los cebadores se calcula en cada caso en aprox. 65°C. Para el cálculo de la temperatura de hibridación se aplica la fórmula:

temperatura de hibridación = (2ºC x número de AT bp + 4ºC x número de GC bp) -5ºC

c. Cebadores de PCR específicos de segmentos de gen Jlambda

Se separan los en total 4 segmentos de gen Jlambda humano activos en cada caso por un intrón de los exones clambda constantes contiguos. En cada caso a aprox. 89 bp (en la región del sitio de corte BsaI en el caso del HEA125) en dirección al extremo 3’ (downstream) contados a partir de los extremos 3’ de los segmentos Jlambda, se generan en total 4 cebadores de PCR específicos de segmentos de genes Jlambda con una temperatura de hibridación calculada en cada caso de aprox. 65ºC (figura 14A).

d. Multiplicación de genes vlambda humanos por PCR

Como DNA molde se emplea el DNA genómico de los linfocitos B humanos. El aislamiento del DNA genómico se ha descrito en diversos manuales de laboratorio (véase p.ej. Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual, 3ª edición, capítulo 6, 2001, ISBN 0-87969-577-3). Los cebadores PCR se han descrito en los ejemplos 5b y 5c. Se obtiene una gran abanico de genes vlambda humanos recombinados genómicos por combinación de los 4 cebadores distintos de segmentos de gen Jlambda con 24 cebadores distintos específicos de genes vlambda, es decir, se realizan 96 reacciones PCR distintas. Las condiciones para la PCR se han descrito en el Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostics). A continuación se seleccionan por tamaños las bandas de PCR de una longitud aprox. de 560 bp y se purifican (Qiagen, kit de purificación a través de gel). Estas en total 96 bandas de PCR sirven en cada caso como molde para otra PCR en las condiciones descritas, pero esta vez en lugar del cebador descrito en el ejemplo 5b se emplea el cebador PCR cuyas secuencias se prolonga por el extremo 5’ con las bases

siguientes:

-

5’ attataACGCGT... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos de genes vlambda descritos en el ejemplo 5b (de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio de restricción MluI necesario para la clonación);

-

5’ ttcGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos de genes vlambda descritos en el ejemplo 5b (de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio FRT0 necesario para una estrategia de clonación alternativa);

-

5’ attataGCGGCCGC... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores PCR específicos del segmento de gen Jlambda descritos en el ejemplo 5c (de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio de restricción NotI necesario para la clonación) y

-

5’ ttcGAAGTTCCTATACTATTTGAAGAATAGGAACTTC... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos del segmento de gen Jlambda descritos en el ejemplo 5c (de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio FRT3 necesario para una estrategia alternativa de clonación).

Tal como se ha descrito se seleccionan por tamaños las bandas de la PCR y se purifican, de modo que como resultado surgen 96 bandas de PCR, en cada caso flanqueadas por secuencias FRT0 y FRT3. Se obtienen otras 96 bandas de PCR, en cada caso flanqueadas por los sitios de restricción MluI y NotI.

e. Clonación de genes vlambda humanos

En el vector de clonación pBS-FRTvkappa, 2 sitios FRT distintos flanquean al das exón vkappa activo de HEA125 (figura 15A). En presencia de la recombinasa Flp específica de FRT, esto permite el intercambio “in vitro” de las secuencias de DNA flanqueadas por los sitios FRT descritos. En primer lugar se clona en el vector de clonación pBS-FRTvkappa cortado con AatII la siguiente secuencia de DNA también cortada con AatII:

imagen1

Después de la transfección del DNA recombinado resultante en

E. coli se aíslan los clones individuales y se verifican sus secuencias. Para ello se obtiene el vector de clonación pBS-FRTklon (figura 15C), cuyos sitios FRT en lugar del exón vkappa representado en la figura 15A flanquean a los sitios de restricción MluI, SalI y NotI descritos antes o bien en la figura 15C.

Después de la digestión del DNA de vector aislado (kit de purificación de plásmidos, Qiagen) con las enzimas de restricción MluI y NotI se ligan las 96 bandas de PCR distintas, digeridas del modo correspondiente, descritas en el ejemplo 5d, se transfieren los productos de ligación resultantes a la E. coli y después se aísla una mezcla muy compleja de DNA vector (>106 transformandos distintos) (pBS-FRTklonvlambda) (Qiagen, kit de purificación de plásmidos). Como alternativa se incuban las 96 bandas distintas de PCR, circularizadas con la T4-DNA-ligasa, descritas en el ejemplo 5d, flanqueadas por sitios FRT, junto con la recombinasa de Flp y con el vector pBS-FRTklon, se cortan los productos resultantes de la recombinación con la enzima de restricción SalI y del modo recién descrito se transfectan a E. coli y finalmente se aísla una mezcla muy compleja de DNA vector (pBS-FRTklon-vlambda).

f. Recombinación específica de genes vlambda humanos en HEA125

Se electroporan las mezclas muy complejas descritas en el ejemplo 5e de DNA de vector vlambda humana (pBS-FRTklonvlambda) junto con el vector de expresión de Flp pOG44 a las células del clon expandido HEA125-mhloxPmycFRTG418 (véase el ejemplo 4c), se tiñen las células después de 3 días con anticuerpo kappa de cabra anti-humano marcado con FITC del modo ya descrito se aíslan las células en el clasificador FACS. Como resultado se obtienen de este modo aprox. un 0,7 % de las células clasificadas (o aprox. 106 células), que se reúnen entre sí, ya que en el FACS presentan una acusada fluorescencia verde. Esta biblioteca de células vlambda se expande en cultivo celular.

El resultado de este procedimiento es una biblioteca de hibridomas compleja (>106 especificidades de hibridoma distintas) (figura 9), cuyos distintos componentes presentan sobre la superficie grandes cantidades de cadenas vlambda humanas en cada caso distintas, que en cada caso están fusionadas con un dominio kappa constante humano.

No se representa una forma preferida de ejecución con la que puede obtenerse una mezcla muy compleja, como la descrita para el pBS-FRTklon-vlambda. Para ello, en lugar del vector de clonación pBSIISK+ se emplea un vector episómico que se replica en células eucariotas (basado p.ej. en pCEP4, pREP7, pREP10, pEBVHis o pREP4 de Invitrogen). La recombinasa Flp se codifica para ello con una cassette de expresión regulable, que es estable cromosómicamente. Entre otras, la empresa Invitrogen suministra sistema de este tipo (GeneSwitch™ System K1060-01; T-Rex™ System K1020-01).

Ejemplo 6

Producción de una biblioteca de genes vkappa

a. Análisis computerizado de genes vkappa humanos

Ya son conocidas las secuencias genómicas del locus de gen vkappa humano (Immunoglobulin Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441351-X). El análisis computerizado de 34 genes vkappa humanos funcionales conocidos no indica ningún sitio de restricción BglI, BssHII, BstBI, ClaI, EagI, HindIII, MluI, NotI, NruI, PvuI, SacII, SfiI, SnaBI, SpeI ni StuI dentro de una región de aprox. 200300 bp en dirección a 5’ (upstream) del exón líder de los genes analizados hasta la correspondiente señal de recombinación genómica del final del CDR3. Se analiza además la región de los segmentos J, partiendo del extremo 5’ del segmento genético J1kappa activo hasta aprox. 200 bp en dirección a 3’ (downstream) contando desde el extremo 3’ del segmento genético J5kappa activo (ver número de registro J00242). Como resultado son, pues, idóneos los sitios de restricción BssHII, EagI, HindIII, MluI, NotI, SfiI y SpeI para la clonación de la gran variedad de genes vkappa humanos. El sitio de restricción SalI corta solamente una vez fuera del gen IGKV1D-43.

b. Cebadores de PCR específicos del gen vkappa

Se generan cebadores de PCR específicos del gen vkappa, que en cada caso se hibridan con el intrón entre el exón líder y el correspondiente exón vkappa (figura 14B). La región equiparable del locus vkappa activo de gen de HEA125 se sitúa aprox. en el sitio de corte SwaI del intrón entre el exón líder y el exón vkappa. Los cebadores se hibridan con regiones, que en cada caso están situadas aprox. 130-170 bp en dirección a 5’ (upstream) después del inicio del exón vkappa en cuestión. La temperatura de hibridación de los cebadores se calcula en cada caso aprox. en 65°C.

c. Cebadores de PCR específicos del segmento genético

Jkappa

Los en total 5 segmentos de gen Jkappa humanos activos están aglomerados a diferencia de los segmentos de gen Jlambda, por lo cual siempre se emplea el mismo exón ckappa constante, que está separado por un intrón de los segmentos Jkappa aglomerados. En cada caso aprox. a 89 bp (la región equiparable está situada en el caso del HEA125 en el sitio de corte BsaI) en dirección al extremo 3’ (downstream) contando a partir de los extremos 3’ de los distintos segmentos Jkappa, se generan en total 5 cebadores de PCR específicos del segmento de gen Jkappa con una temperatura de hibridación calculada en cada caso de aprox. 65ºC (figura 14B).

d. Multiplicación de genes vkappa humanos por PCR

Tal como se ha descrito en el ejemplo 5d para vlambda, se obtiene una gran variedad de genes vkappa humanos recombinados genómicos por combinación de 5 cebadores distintos de segmentos genéticos Jkappa con 34 cebadores distintos específicos de gen vkappa funcionales, es decir, es realizan 170 reacciones PCR distintas. Estas en total 170 bandas de PCR sirven en cada caso como moldes para reacciones PCR ulteriores, para ello en este caso del modo descrito en el ejemplo 5d se prolongan los cebadores empleados por su extremo 5’ con un sitio de restricción o con FRT0 o FRT3. Tal como se ha descrito se seleccionan las bandas PCR por tamaños y se purifican, de modo que como resultado se obtienen 170 bandas de PCR (aprox. 600 bp), flanqueadas en cada caso por secuencias FRT0 y FRT3. Se obtienen otras 170 bandas de PCR (aprox. 550 bp), flanqueadas en cada caso por sitios de restricción MluI y NotI.

e. Clonación de genes vkappa humanos

Después de la digestión del DNA de vector pBS-FRTklon (figura 15C) aislado, descrito en el ejemplo 5e, con las enzimas de restricción MluI y NotI se ligan las 170 bandas de PCR distintas flanqueadas por los sitios MluI y NotI, descritas en el ejemplo 6d y digeridas del modo correspondiente, se transfectan los productos de ligación resultantes a E. coli y después, del modo descrito en el ejemplo 5e, se aísla una mezcla compleja (>106 transformandos distintos) de DNA de vector (pBS-FRTklon-vkappa).

Como alternativa se incuban las 170 bandas de PCR distintas, en cada caso circularizadas, descritas en el ejemplo 6d, flanqueadas por sitios FRT, junto con la recombinasa de Flp con el vector pBS-FRTvkappa, se cortan los productos de recombinación resultantes con la enzima de restricción SalI, se transfectan del modo descrito en el ejemplo 5e a la E. coli y a continuación se aísla una mezcla muy compleja de DNA de vector (pBS-FRTklon-vkappa).

f. Recombinación específica de genes vkappa humanos en HEA125

Tal como se ha descrito en el ejemplo 5f para vlambda, se electroporan las mezclas muy complejas descritas en el ejemplo 6e del DNA de vector vkappa humano (pBS-FRTklonvkappa) junto con el vector de expresión Flp pOG44 a las células de la línea celular expandida HEA125mhloxPmycFRTG418; se tiñen con el anticuerpo kappa de cabra anti-humano marcado con FITC y del modo descrito se aíslan las células en el clasificador FACS. Como resultado se obtiene aprox. un 0,8% de las células clasificadas (o aprox. 106 células) y se reúnen entre sí, que en el FACS presentan una acusada fluorescencia verde. Se expande en cultivo celular esta biblioteca de células vkappa.

El resultado de este procedimiento es una compleja biblioteca de hibridomas (>106 especificidades distintas de hibridoma) (figura 9), cuyos componentes individuales presentan sobre la superficie grandes cantidades en cada caso de distintas cadenas vkappa humanas, fusionadas en cada caso con un dominio kappa humano constante.

Ejemplo 7

Producción de una biblioteca de anticuerpos

a. Análisis computerizado de genes vH humanos

Ya son conocidas las secuencias genómicas del locus de gen vH humano (números de registro del banco de datos EMBL: X97051; S64822; AB019437; AB019438; AB019439; AB019440; AB019441; véase también el libro Immunoglobulin Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441351-X). El análisis computerizado de los 44 genes vH funcionales humanos relacionados en los números de registro X97051; S64822; AB019437; AB019438; AB019439; AB019440 y AB019441 no indica ningún sitio de restricción BssHII, ClaI, MluI, NheI, NotI, NruI, PvuI, SalI, SfiI, SwaI ni XhoI dentro de una región de 300 bp en dirección al extremo 5’ (upstream) contados a partida del extremo 5’ del exón líder de los genes analizados hacia las señales de recombinación genómica que en cada caso flanquean al gen vH. Se analiza además la región de los segmentos JH, partiendo del extremo 5’ del segmento genético J1H activo hasta aprox. 200 bp en dirección al extremo 3’ (downstream) contando a partir del extremo 3’ del segmento de gen J6H activo (véanse los números de acceso X97051; S64822). Como resultado son, pues, idóneos en especial los sitios de restricción BssHII, MluI, NheI, NotI, SalI, SfiI y XhoI para la clonación de la gran variedad de genes vH humanos. Los sitios de restricción BssHII, MluI, NotI y SalI (exceptuando el gen IGKV1D-43) tampoco aparecen en las regiones genéticas vlambda y vkappa analizadas.

b. Cebadores de PCR específicos del gen vH

Se generan cebadores de PC específicos del gen vH, que en cada caso se hibridan aprox. a 182 bp en dirección al extremo 5’ (upstream) contando a partir del extremo 5’ del correspondiente exón líder de vH con los genes vH correspondientes (figura 14C). La temperatura de hibridación de los cebadores se calcula en cada caso aprox. en 65°C.

c. Cebadores de PCR específicos del segmento genético JH

Se aglomeran los en total 6 segmentos de gen JH humano activos igual que los segmentos de gen Jkappa, para ello se emplean siempre los mismos exones CH constantes (de todos modos en función de la eventual realización de un cambio de clase, class switch). El exón CH1 se separa con un intrón de los segmentos de gen JH aglomerados. En cada caso, aprox. a 83 bp (la región equiparable del HEA125 está situada en el sitio de corte Bsu36I) en dirección al extremo 3’ (downstream) contando a partir del extremo 3’ de los correspondientes segmentos genéticos JH, se generan en total 6 cebadores de PCR específicos del segmento genético JH con una temperatura de hibridación calculada en cada caso en torno a 65ºC (figura 14C).

d. Multiplicación de genes vH humanos por PCR

Tal como se ha descrito en el ejemplo 5d para el vlambda se obtiene la gran variedad de genes vH humanos recombinantes genómicos por la combinación de los 6 cebadores distintos de segmentos genéticos JH con los 44 cebadores distintos específicos del gen vH, es decir, se realizan 6x44 = 264 reacciones PCR distintas. 5 de los 6 cebadores de PCR específicos del segmento genético JH presentan bandas adicionales de PCR de peso molecular más elevado, que se

separan en gel de TAE-agarosa de la banda de la banda correspondiente de tamaño aprox. de 790 bp. Esto se debe a

que

p.ej. el cebador J2H de PCR multiplica no solo las

fusiones

vHJ2H recombinadas genómicas, sino también las

fusiones vHJ1H.

Tal como se ha descrito en el ejemplo 5d, estas en total 264 bandas de PCR de un tamaño aprox. de 790 bp sirven en cada caso como moldes para una PCR posterior en las condiciones descritas, pero esta vez en lugar de los cebadores descritos en el ejemplo 7b, se emplean cebadores de PC cuyas secuencias del extremo 5’ se han prolongado con las bases siguientes:

-

5’ attataACGCGT... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos del gen vH, descritas en el ejemplo 7b, de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio de restricción MluI necesario para la clonación);

-

5’ ttcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos del gen vH descritas en el ejemplo 7b, de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio loxP necesario para una estrategia de clonación alternativa);

-

5’ attataGCGGCCGC... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos del segmento de gen JH descritas en el ejemplo 7c, de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio de restricción NotI necesario para la clonación); y

-

5’ cctATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTAT... (aquí siguen en cada caso las secuencias de los cebadores de PCR específicos de segmentos de gen JH descritas en el ejemplo 7c, de este modo se introduce en el producto de la PCR un sitio loxP511 requerido para una estrategia alternativa de clonación).

Tal como se ha descrito se seleccionan las bandas de la PCR por tamaños y se purifican, de modo que como resultando se obtienen 264 bandas de PCR de un tamaño aprox. de 860 bp, blanqueadas en cada caso por secuencias loxP y loxP511. Se obtienen otras 264 bandas de PCR, en cada caso flanqueadas por sitios de restricción MluI y NotI.

e. Clonación de genes vH humanos

Después de la digestión del DNA de vector pBS-loxPklon aislado, descrito en la figura 15D (Qiagen, kit de purificación de plásmidos) con las enzimas de restricción MluI y NotI se ligan las 264 bandas de PCR distintas, oportunamente digeridas, descritas en el ejemplo 7d, se transfectan los productos de ligación resultantes a E. coli y después se aísla del modo descrito en el ejemplo 5e una mezcla muy compleja (>106 transformandos distintos) de DNA de vector (pBS-loxPklon-vH).

Como alternativa se incuban las 264 bandas de PCR distintas flanqueadas por sitios loxP, descritas en el ejemplo 7d, junto con la recombinasa de la Cre con el vector pBS-loxPklon, se cortan los productos resultantes de la recombinación con la enzima de restricción SalI, se transfectan a la E. coli del modo recién descrito y a vlambda se electroporan a las células las mezclas muy complejas, descritas en el ejemplo 7e, de DNA de vector vH humano (pBS-loxPklon-vH) junto con el vector de expresión de Cre pMC-Cre. Para ello se emplean las bibliotecas de células vlambda y vkappa descritas en el ejemplo 5f y 6f.

continuación

se aísla una mezcla muy compleja de DNA de

vector (pBS-loxPklon-vH).

f.

Recombinación específica de genes vH humanos en

HEA125

Tal

como se ha descrito en el ejemplo 5f para el

Se tiñen las células con anticuerpo IgG de cabra antihumano conjugado con PE y al mismo tiempo con anticuerpo monoclonal anti-mycl-9E10 marcado con FITC. Las células se aíslan del modo descrito en el clasificador FACS. Como resultado se obtiene con ello aprox. un 0,8% de las células clasificadas (o aprox. 107 células) y se reúnen entre sí las que presentan en el FACS una fluorescencia roja intensa junto con una fluorescencia verde lo más débil posible. Esta biblioteca de células de anticuerpo se expande en el cultivo celular y se congelan en nitrógeno líquido partes alícuotas de la misma.

El resultado de este procedimiento es una biblioteca compleja de anticuerpos (>107 especificidades distintas de hibridoma) (figura 9), cuyos diversos componentes presentan sobre la superficie grandes cantidades de distintos anticuerpos IgG1 humanos, fusionados con dominios humanos constantes. Al mismo tiempo, las células de hibridoma secretan la mayor parte de los anticuerpos producidos al medio circundante. Los distintos pasos del procedimiento se orientan principalmente por el estado ya conocido de la técnica.

Los dominios vlambda de esta biblioteca de anticuerpos están fusionados en este ejemplo con el dominio kappa constante. En otra forma preferida de ejecución, no representada, se altera por tanto el ejemplo 1e, de modo que en lugar del vector pBS-MhkappaM, representado en la figura 12A, se emplea ahora un vector que, después de la recombinación homóloga, codifica a un dominio constante lambda humano.

Ejemplo 8

Selección de anticuerpos monoclonales con el FACS/esferillas magnéticas

Se cultiva del modo descrito en el ejemplo 1a la biblioteca de anticuerpos descrita en el ejemplo 7f. Se lavan las células expandidas 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 107 células por cada 400 µl con BSA conjugado con FITC. Como contratinción para la identificación de las células muertas se emplea el yoduro de propidio (1 µg/ml). Después de un nuevo lavado con DPBS enfriado con hielo se seleccionan las células en un clasificador FACS. Como resultado se encuentran aprox. 15 de cada 107 células de hibridoma, que poseen una fluorescencia verde relativamente intensa. Se expanden las células individuales clasificadas del modo descrito en el ejemplo 1a (eventualmente junto con células irradiadas del “feeder”) y se analiza la especificidad de antígeno que tiene el líquido sobrenadante y los anticuerpos secretados que contiene en un ensayo Western Blot. Como resultado de ello, el líquido sobrenadante de 2 clones reacciona con BSA (PM aprox. 68 kd), otros 5 clones presentan una coloración específica de FITC-BSA (PM aprox. 72 kd).

Paralelamente aprox. 108 células de la biblioteca de anticuerpos descrita en el ejemplo 7f se lavan 2x con DPBS enfriado con hielo y después se incuban en 5 ml de tampón DPBS durante 5 minutos con esferillas magnéticas recubiertas de BSA o de ovalbúmina. Se eliminan por lavado con intervención de un imán las células no fijadas y las demás células fijadas sobre las esferillas magnéticas se cultivan del modo descrito en el ejemplo 1a. Como resultado, en un ensayo Western Blot el líquido sobrenadante de las células enriquecidas de las esferillas magnéticas recubiertas con BSA reacciona con BSA (PM aprox. 68 kd), pero no con la ovalbúmina, mientras que el líquido sobrenadante de las células enriquecidas de las esferillas magnéticas recubiertas con ovalbúmina no presenta coloración alguna con BSA.

Ejemplo 9

Selección de anticuerpos monoclonales más afines en el clasificador FACS

Se purifican con proteína G-sefarosa los anticuerpos anti-FITC secretados por los cinco clones específicos de FITC-BSA descritos en el ejemplo 8 y en cada caso una parte de los mismos se conjuga con peroxidasa de rábano rusticano (anticuerpos anti-FITC-POX). Se ajusta en cada caso la concentración de los distintos anticuerpos purificados a 1 mg/ml en PBS.

Se recubre una placa ELISA con FITC-BSA (en cada caso 0,1 µg en 100 µl de PBS), se bloquea (con un 1% leche en polvo en 200 µl de PBS) y se hacen competir los 5 anticuerpos distintos conjugados con peroxidasa (diluidos en cada caso 1:2000 en 100 µl de PBS-Tween 20) con cantidades crecientes de los anticuerpos no conjugados con peroxidasa. Los anticuerpos no conjugados con peroxidasa se preincuban en cada caso durante 10 minutos con el antígeno FITC recubierto. Después de los pasos de lavado intercalados se detectan la peroxidasa residual fijada con el sustrato OPD / H2O2.

En estos ensayos de competición, el anticuerpo antiFITC2 producido por el clon anti-FITC2 demostró ser el anticuerpo relativamente más afín. Si se parte en cada caso

de

anticuerpos anti-FITC1, 2, 3, 4 ó 5 conjugados con

peroxidasa

y diluidos 1:2000, entonces se obtiene una

inhibición semimáxima de la señal de ELISA del:

-

anticuerpo POX anti-FITCl en el anticuerpo anti-FITC2 diluido 1:1000;

-

anticuerpo POX anti-FITC2 en el anticuerpo anti-FITC2 diluido 1:500;

-

anticuerpo POX anti-FITC3 en el anticuerpo anti-FITC2 diluido 1:2000;

-

anticuerpo POX anti-FITC4 en el anticuerpo anti-FITC2 diluido 1:2000;

-anticuerpo POX anti-FITC5 en el anticuerpo anti-FITC2

diluido 1:5000.

Después se mezclan 106 células del clon anti-FITC2 con aprox. 107 células del clon anti-FITC5, se lavan 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen con FITC-BSA (10 µg/ml) y al mismo tiempo con proteína G conjugada con PE (10 µg/ml). Para detectar las células muertas se utiliza el yoduro de propidio, del modo ya descrito. Después de un nuevo lavado con DPBS se analizan las células en el clasificador FACS (figura 10). Aprox. el 10% de las células vivas presenta una relación entre la fluorescencia verde y roja de aprox. 0,8 (±0,2), mientras que aprox. el 90% de las células vivas presenta una relación entre la fluorescencia verde y roja de aprox. 0,08 (±0,03).

Tal como se ha descrito antes se clasifican en cada caso por separado aprox. 106 células de estas poblaciones, se aísla de ellos el DNA genómico y se emplea como molde para una PCR con los cebadores vHG418-3 y -4 (figura 13B). Se procede exactamente igual con las células de los clones antiFITC2 y anti-FITC5. Se separan por tamaños las bandas de PCR en un gel de TAE-agarosa al 1 %, con lo cual la banda de PCR ligera y diferenciablemente mayor de la población de células clasificadas con una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de aprox. 0,8 corresponde al clon anti-FITC2 (aprox. 1,95 kb), mientras que la banda de PCR ligeramente menor también correspondiente de la población de células clasificadas que tienen una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de aprox. 0,08 corresponde al clon anti

FITC5.

En este ejemplo se presenta un método muy sencillo para encontrar los anticuerpos monoclonales muy afines. Una normalización fácil de realizar del número de los anticuerpos presentados permite la comparación de afinidad “on line” de las especificidades de los anticuerpos hallados (figura 10).

Ejemplo 10

Barajado de cadenas (chain-shuffling) y selección de anticuerpo monoclonales muy afines

Se recombina en la línea celular anti-FITC5 expandida, descrita en el ejemplo 9, se recombina e integra la gran variedad de genes vH descrita en el ejemplo 7e del modo descrito en el ejemplo 7f con intervención de un vector de expresión de Cre. La biblioteca resultante de anticuerpos anti-FITC se tiñe del modo descrito en el ejemplo 9 con FITCBSA y al mismo tiempo con proteína G conjugada con PE.

Como resultado, aprox. el 70 % de las células vivas presenta una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de aprox. 0,08 (±0,03), mientras que aprox. el 0,02% de las células vivas presenta una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de 0,2 a 0,7 (±0,1).

En este ejemplo se pone de manifiesto un método muy sencillo para producir un grupo de hibridomas, a partir de la cual se pueden aislar anticuerpos monoclonales relativamente muy afines.

Ejemplo 11

Realización de una hipermutación somática para obtener anticuerpos muy afines

Ya son conocidas las secuencias de cDNA de los genes RAD 54, RecQ4, polX mu, RAD51B, XRCC2 y XRCC3. En primer lugar se clonan las secuencias de cDNA de los genes RAD54, RecQ4 o polX mu bajo el control de un promotor RSV en el vector de expresión eucariota pREP4 (Invitrogen) y se verifica la secuencia correcta. De este modo se obtienen los vectores de expresión pREP4-RAD54, pREP4-RecQ4 y pREP4-polXmu y los vectores de expresión de RNA antisentido pREP4-RAD51B, pREP4-XRCC2 y pREP4-XRCC3.

Se mezcla el DNA circular de los vectores pREP4-XRCC2, pREp4-RAD54, pREP4-RecQ4 y pREP4-polXmu en proporción 1:1:1:1 y se electropora en las condiciones optimizadas descritas en el ejemplo 1d en la línea celular anti-FITC5 expandida descrita en el ejemplo 9. A continuación se cultivan las células del modo descrito en el ejemplo 1a durante 2-3 días. Opcionalmente pueden seleccionarse a continuación con higromicina las células que han recibido los vectores pREP4 replicantes episómicos. Seguidamente se tiñen las células del modo descrito en el ejemplo con FITC-BSA y al mismo tiempo con la proteína G conjugada con PE. Como resultado, aprox. un 90% de las células vivas presenta una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de aprox. 0,08 (± 0,03), mientras que aprox. un 0,002% de las células vivas presenta una proporción entre la fluorescencia verde y la roja de aprox. de 0,2 a 0,7 (± 0,2).

En este ejemplo se pone de manifiesto otro método muy

simple de producir un grupo de hibridomas, a partir del cual

se pueden aislar anticuerpos monoclonales relativamente muy

afines.

Ejemplo 12

Producción de un anticuerpo biespecífico

a. Secuencias de DNA quimérico

Se combinan varios fragmentos diferentes de gen con un vector de clonación pBSIISK+ para formar secuencias de DNA quimérico. Para ello se generan los distintos fragmentos de gen por PCR (Roche Diagnostics; Expand Long Template PCR System; véanse también las condiciones de la PCR).

Como molde para las secuencias de gen se emplea un cDNA de la línea celular de hibridoma murino HEA125 así como un vector de expresión para el anticuerpo scFv 215 (Kontermann y col., Characterization of the epitope recognised by a monoclonal antibody directed against the largest subunit of Drosophila RNA polymerase II; Biol. Chem. Hoppe-Seiler 376, 473-481, 1995). Se sintetiza la región de la secuencia de engarce entre el ckappa (HEA) y anticuerpo scFv(215) con un oligonucleótido de PCR sobresaliente sintético. Como resultado se obtiene el vector pBS-FRT-kappaHEAscFv215. En la figura 17A se representa la secuencia de DNA quimérico resultante, dicha secuencia se verifica seguidamente.

b. Recombinación específica en el locus de gen vkappa

Se electropora en la línea celular HEA125-mhloxPmycFRTG418 el vector pBS-FRT-kappaHEAscFv215 descrito. Al mismo tiempo se electropora el vector de expresión de Flp pOG44 en las células (véanse las condiciones en el ejemplo 1d). Después de un cultivo de 2-4 días (véanse las condiciones en el ejemplo 1a) se lavan las células 2x con DPBS enfriado con hielo y se tiñen aprox. 108 células por ml con un anticuerpo kappa de cabra anti-murino conjugado con PE (Southern Biotechnology Associates). Como contratinción para la identificación de células muertas se emplea el yoduro de propidio. Después de un nuevo lavado con DPBS enfriado con hielo se seleccionan en un clasificador FACS las células individuales que tienen una fluorescencia PE intensa. De este modo, a partir del clon HEA125-mhloxPmycFRTG418 descrito en el ejemplo 12a se obtiene aprox. un 0,1% de células con fluorescencia PE relativamente intensa. A continuación se expanden 5 células individuales clasificadas en las condiciones de cultivo descritas en el ejemplo 1a durante 2-3 semanas. Seguidamente se tiñen de nuevo los clones resultantes con anticuerpo kappa de cabra anti-murino marcado con PE y se analizan en el FACS. Se siguen propagando dos clones con señal acusa de fluorescencia roja. El DNA genómico de estos clones se multiplica por PCR con los cebadores KG418-3 y KG418-4 (véanse los cebadores en la figura 13A; véase también la figura 17A) y se secuencia.

La línea celular HEA125-mhloxPmycFRTscFv215 obtenida como resultado produce un anticuerpo IgG1 de hibridoma monoclonal biespecífico, que tiene una especificidad definida (en este ejemplo, el dominio vH de HEA125 con un c-myc-tag adicional en el CDR3 del dominio vH) para con los dominios IgG1 constantes humanizados. Además, el exón vH dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. En la región del locus de gen vkappa murino activo flanqueado por los sitios FRT se codifica el dominio vkappa de HEA125, que está fusionado con el dominio ckappa murino, una secuencia de engarce y el anticuerpo scFv215.

Ejemplo 13

Producción de un anticuerpo bifuncional

Tal como se ha descrito en el ejemplo 12 se electropora la línea celular HEA125-mhloxPmycFRTG418 con DNA quimérico, se tiñe con anticuerpo kappa de cabra anti-murino conjugado con PE, se clasifican las células individuales que tienen una fluorescencia PE relativamente intensa, se expanden los clones individuales y se verifica la secuencia genómica. A diferencia del ejemplo 12, en lugar del vector pBS-FRTkappaHEAscFv215 descrito, se emplea el vector pBS-FRTkappaHEAbla (figura 17B). De este modo, a partir del clon HEA125-mhloxPmycFRTG418 de partida se obtiene aprox. un 0,1% de células con fluorescencia PE relativamente intensa.

Como resultado se obtiene la línea celular HEA125mhloxPmycFRTbla que produce un anticuerpo IgG1 monoclonal de hibridoma que tiene una especificidad definida (en este ejemplo, el dominio vH de HEA125 con un c-myc-tag adicional en el CDR3 del dominio vH) con dominios IgG1 constantes humanizados. Además, el exón vH dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. En la región del locus de gen vkappa murino activo, flanqueado por los sitios FRT, se codifica el dominio vkappa de HEA125, que está fusionado con el dominio ckappa murino, una secuencia de engarce y el gen de la beta-lactamasa.

Ejemplo 14

Modificación de la especificidad de anticuerpo por recombinación específica

Tal como se describe en el ejemplo 12 se electropora la línea celular HEA125-mhloxPmycFRTG418 con DNA quimérico, se tiñe con anticuerpo kappa de cabra anti-humano conjugado con PE, se clasifican las células individuales de fluorescencia PE relativamente intensa, se expanden los clones individuales y se verifica la secuencia genómica. A diferencia de ejemplo 12 en lugar del vector pBS-FRT-kappaHEAscFv215 descrito se emplea ahora el vector pBS-FRT-kappa215 (figura 18A). De este modo, a partir del clon HEA125-mhloxPmycFRTG418 descrito se obtiene aprox. un 0,1% de células con fluorescencia PE relativamente intensa.

Como resultado se obtiene la línea celular HEA125mhloxPmycFRT215 que produce un anticuerpo IgG1 de hibridoma monoclonal de una especificidad definida (en este ejemplo, el dominio vH de HEA125 tiene un c-myc-tag adicional en el CDR3 del dominio vH) con dominios constantes humanizados. Además, el exón vH dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. En la región del locus de gen vkappa murino activo, flanqueado por sitios FRT, se codifica el dominio vkappa del anticuerpo 215. Con un procedimiento similar se obtiene un dominio vH alterado.

Ejemplo 15

Producción de un anticuerpo Fab por recombinación específica

a. Secuencias de DNA quimérico

Se combinan varios fragmentos individuales de gen en el vector de clonación pBSIISK+ para formar secuencias de DNA quimérico. Se producen los distintos fragmentos de gen por PCR (Roche Diagnostics; Expand Long Template PCR System; véanse también las condiciones de la PCR). Como molde de las secuencias de gen se emplea el cDNA de la línea celular de hibridoma murino HEA125. Como resultado se obtiene el vector pBS-loxP-FdHEA. Este vector codifica al dominio vH de HEA125 fusionado con el domino CH1 de la IgG1 murina. En la figura 18B se representa la secuencia de DNA quimérico resultante, cuya secuencia se verifica seguidamente.

b. Recombinación específica en el locus de gen vH

Se electropora el vector pBS-loxP-FdHEA descrito en el ejemplo 15a junto con el vector de expresión de Cre pMC-Cre del modo descrito en el ejemplo 1d en la línea celular HEA125-mhRek descrita en el ejemplo 4d y después por dilución limitada de las aprox. 107 células empleadas se propagan por separado aprox. 2.000 clones. Se recubre una placa ELISA en cada caso con 100 µl del correspondiente líquido sobrenadante del cultivo celular de los 2.000 clones descritos, se bloquea (con un 1 % de leche en polvo en 200 µl de PBS) y después se tiñe con anticuerpo 1-9E10 anti-myc conjugado con peroxidasa

o con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón combinado con peroxidasa (Dianova) (diluido en cada caso 1:2000 en 100 µl de PBS). Después de los pasos de lavado intercalados se detecta la peroxidasa residual fijada con el sustrato OPD.

Como resultado, 3 de los clones analizados presentan

una señal elevada cuando se tiñen con el anticuerpo IgG de

cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa, mientras que al mismo tiempo no se detecta señal alguna cuando se tiñen con un anticuerpo 1-9E10 anti-myc conjugado con peroxidasa. Se verifica la secuencia genómica del clone y finalmente se propaga el clon HEA125-Fab.

La línea celular resultante HEA125-Fab secreta un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de una especificidad definida (en este ejemplo: los dominios vH y vkappa de HEA125) con un dominio kappa constante humanizado. Además, el exón vH-CH1 dentro del locus de gen vH está flanqueado por 2 sitios loxP distintos. El exón vkappa está flanqueado por 2 sitios FRT distintos.

Ejemplo 16

Biblioteca de receptores de células T

Ya son conocidos los lugares (loci) de gen de los receptores alfa y beta o gama y delta de células T (véase el libro: T-Cell Receptor Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8). A partir de la línea celular HEA125-mhRek (ejemplo 4) y de modo muy similar al descrito en el ejemplo 1e se intercambia en primer lugar el dominio kappa constante por el dominio constante del receptor alfa de células T. Para ello se emplean solamente las secuencias de DNA codificadoras de los 121 aminoácidos del extremo N del dominio constante (y del engarce con el dominio de membrana) del receptor alfa de células T, y después un codón de paro, es decir, sin anclaje de membrana o sin los 20 aminoácidos del extremo C. A continuación y de modo similar al ejemplo 1f se intercambia el dominio constante CH1 de la IgG1 por los 150 aminoácidos del extremo N del dominio constante del receptor beta de las células T (fusionados con el exón bisagra de una IgG1). El dador de empalme de este exón quimérico procede de la región bisagra de una IgG1. La clonación y posterior recombinación específica de la gran variedad de dominios variables de los receptores T-alfa y Tbeta de células T se realiza de modo similar a los ejemplos 6 y 7 con cebadores específicos de segmentos de genes o con intervención de la Cre y la Flp. De este modo se obtiene una biblioteca de receptores de células T, en el que están fusionadas las correspondientes cadenas beta con el dominio de bisagra, CH2 y CH3 de una IgG1. Una parte considerable de estas proteínas de fusión se presenta sobre la superficie de las células gracias a la variante de empalme de la porción IgG1 situada en la membrana.

La selección de ligantes específicos se realiza de modo similar al ejemplo 8 ó 9. Como alternativa se tiñen las células de la biblioteca de receptores de células T con la proteína G marcada con PE, mientras que las células de la línea celular de linfoma Jurkat se tiñen con el anticuerpo anti-CD5 marcado con FITC. Cada 107 de las células así teñidas se lavan 2x con DPBS, se mezclan entre sí y se incuban en 1 ml de medio RPMI sobre hielo durante 30 min. A continuación se seleccionan dobletes en el clasificador FACS, que poseen doble fluorescencia roja-verde. La selección de ligantes más afines (o menos afines) se realiza de modo similar a los ejemplos 10 y 11.

Ejemplo 17

Loci de gen de receptores de células T

Ya son conocidos los loci de gen de los receptores alfa y beta de células T (T-Cell Receptor Facts Book, Lefranc y Lefranc, 2001, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8). A partir de la línea de células T Jurkat humanas se flanquean en primer lugar, de modo similar a los ejemplos 3 y 4, los dominios variables activos del receptor alfa y beta de células T con sitios FRT o con loxP. A continuación, de modo similar a los ejemplos 6 y 7, se realiza la clonación y la consiguiente recombinación específica de la gran variedad de dominios variables de receptores alfa y beta de células T. Para ello se emplean cebadores específicos de segmentos de gen o las recombinasas específicas Cre y Flp. De este modo se genera una biblioteca de receptores de células T con receptores de células T situados sobre la membrana. Las dos cadenas del receptor de células T están ancladas sobre la membrana celular gracias a su anclaje natural. La selección de ligantes específicos se realiza de modo similar al ejemplo 8 ó 9. La selección de ligantes más afines (o menos afines) se realiza de modo similar a los ejemplos 10 y 11.

Ejemplo 18

Recombinación

específica en lugares (loci) de gen

apropiados

a.

Línea celular con señales de recombinación

específicas en un locus de gen activo

En la línea celular Jurkat

se electropora el vector

linealizado

pBS-MvHG418MdeltaPGK (figura 13B) y del modo

descrito

en el ejemplo 3b se seleccionan las células

resistentes al G418. Por dilución limitada se obtiene el clon de la célula Jurkat G418.

b. DNA quimérico

En la línea celular Jurkat G418 se electropora el vector pBS-loxP-IgG1 descrito en la figura 16 junto con el vector de expresión pOG44 de la Flp del modo descrito en el ejemplo 1d y a continuación por dilución limitada se propagan por separado aprox. 500 clones entre aprox. las 107 células empleadas. De estos 500 clones, 4 clones resultaron sensibles al G418. Por secuenciación del DNA genómico con un cebador de PCR específico de FRT se obtiene la línea celular Jurkat loxP-IgG1.

c. Recombinación específica

A continuación en las células de la línea celular Jurkat loxp-IgG1 expandida, descrita en el ejemplo 18b, se electropora el vector pBS loxPvH (figura 15B) junto con el vector de expresión de la Cre pMC-Cre, se tiñen las células después de 3 días con el anticuerpo IgG1 de cabra anti-humano marcado con FITC y del modo ya descrito se aíslan las células en el clasificador FACS. Como resultado se clasifican 425 de las aprox. 106 células y de ellas se propagan por separado 10

clones,

que en el FACS poseen una acusada fluorescencia

verde.

Después de la secuenciación del DNA genómico

amplificado

por PCR se obtiene como resultado de este

procedimiento la línea celular Jurkat loxPvHEAIgG1. Esta línea celular codifica el dominio vH de HEA125 fusionado con los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 humanos. Una porción de esta cadena larga de anticuerpo se presenta sobre la variante de este procedimiento. Se recombina en la línea celular preseleccionada Jurkat G418 un gen de anticuerpo scFv flanqueado por loxP, fusionado con dominios bisagra, CH2, CH3, M1 y M2 como cassette de gen. Este acontecimiento de recombinación puede seleccionarse directamente en base a la expresión en superficie del anticuerpo scFv recombinado. Lo mismo se diga de la recombinación específica eventualmente posterior de un gran número de diferentes cassettes de gen de anticuerpo scFv.

superficie

de las células de la línea celular Jurkat

loxPvHEAIgG1.

En

la figura 6 se representa esquemáticamente una

Como alternativo pueden utilizarse como materiales de partida las líneas celulares ya existentes, que se obtienen de modo similar al procedimiento descrito en el ejemplo 18a. Son ejemplos de ello las líneas celulares comercializadas por Invitrogen: Flp-In™ 293 (R750-07), Flp-In™ CV-1 (R752-07) y Flp-In™ CHO (R758-07).

En otra ejecución experimental preferida, una selección sencilla de los acontecimientos de recombinación deseados permite tanto la integración del gen de resistencia en la cassette de la recombinasa (véase el ejemplo 18a, selección con G418), como también la segregación del gen de resistencia con la Flp o la Cre (véase el ejemplo 18b). Un ejemplo de ello es la fusión del gen de la neofosforiltransferasa II con el gen de la timidina-quinasa del herpes simple. Para la selección de células, que han perdido el gen quimérico integrado se utiliza entonces el ganciclovir (Syntex nº 115561), que en presencia de la timidina-quinasa (TK) se convierte en un tóxico para las células (Masour y col., Nature 336, 348-352, 1988). Previamente pueden generarse líneas celulares, cuya TK endógena haya dejado de funcionar, de modo muy sencillo por selección con el ganciclovir.

Ejemplo 19

“Trampa de exones” (exon trap) y presentación en superficie

a. Línea celular de trampa de exón (exon trap)

Se electropora en las células de la línea celular expandida Jurkat G418 descrita en el ejemplo 18a el vector pBS-loxPIgGdeltaCH1 (figura 16) junto con el vector de expresión pOG44 de la Flp, del modo descrito en el ejemplo 1d y después por dilución limitada de las aprox. 107 células empleadas se propagan por separado aprox. 500 clones. De estos 500 clones, 5 resultaron positivos al G418. Por secuenciación del DNA genómico con el cebador de PCR específico de la FRT se obtiene la línea celular Jurkat loxPIgG1deltaCH1. Esta línea celular codifica los dominios constantes de bisagra, CH2, CH3, M1 y M2 de un anticuerpo IgG1 bajo el control de un promotor Jurkat endógeno. En la región de los dominios variables se halla una cassette de intercambio loxP. El aceptor de empalme del extremo 5’ del exón bisagra se representa en la figura 16 junto con el marco abierto de lectura.

b. DNA genómico

Se purifican los linfocitos humanos por métodos estándar a través de gradientes de Ficoll y obtenerse de este modo el DNA genómico (véase p.ej. Sambrook y Russell: Molecular Cloning, a laboratory manual, 3ª edición, 2001, ISBN 0-87969-577-3). Se corta este DNA con AatII, NotI, MluI

o SalI y en cada caso se selecciona por tamaños en un TAE-gel de agarosa del 0,8 % (1-5 kb). El DNA seleccionado por tamaños se clona a continuación en el vector pBS-loxPklon descrito en la figura 15D y finalmente se aísla una mezcla muy compleja (>106 transformandos distintos) del DNA de vector (Qiagen, kit de purificación de plásmidos).

c. Recombinación específica

La mezcla muy compleja de DNA de vector descrita en el ejemplo 19b se electropora junto con el vector de expresión de la Cre pMC-Cre en las células del clon expandido Jurkat loxP-IgG1deltaCH1, se tiñen las células después de 3 días con el anticuerpo IgG de cabra anti-humano marcado con FITC y del modo ya descrito se aíslan las células en el clasificador FACS. Como resultado se clasifican 125 de las aprox. 108 células y se reúnen entre sí las que poseen una acuosa fluorescencia verde en el FACS. Esta biblioteca de trampa de exones (exon-trap) se expande por cultivo celular.

El resultado de este procedimiento es una biblioteca de trampa de exones, cuyos distintos componentes presentan sobre la superficie de las células en cada caso distintos dominios codificados por exón humanos, fusionados en cada caso con un dominio constante CH2 y CH3.

Ejemplo 20 Búsqueda de diferencias entre 2 mezclas complejas;

búsqueda de antígenos asociados a tumores

Se mezclan aprox. 108 linfocitos T humanos remarcados normales, purificados a través de un gradiente de Ficoll, con aprox. 107 células de la biblioteca de anticuerpos descrita en el ejemplo 7 en 5 ml de tampón DPBS y se preincuban sobre hielo durante 10 min. Se tiñen las células de la biblioteca de anticuerpos descrita en el ejemplo 7 con proteína G marcada con PE del modo antes descrito. A continuación se tiñen aprox. 106 células de la línea de linfoma Jurkat con un anticuerpo anti-CD5 marcado con FITC y se agregan. Además, inmediatamente antes se irradian las células Jurkat con 400 rad. Pasados 20 min más sobre hielo, en el clasificador FACS se seleccionan dobletes, que poseen una doble fluorescencia roja-verde. Como resultado se clasifican 5 células individuales y se expanden. El líquido sobrenadante del cultivo celular de una de estas 5 líneas celulares emite en el FACS una señal específica de las células Jurkat, si se compara con la coloración de los linfocitos obtenidos de la sangre. La detección de los anticuerpos secretados al medio se realiza con el anticuerpo IgG de cabra anti-humano marcado con FITC (Dianova).

Los expertos podrán variar o combinar entre sí de múltiples maneras los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores, p.ej.:

-un dominio constante kappa murino puede reemplazarse también por un dominio constante lambda humano (ejemplo 1e);

-uno de los en total 9 vectores de trampa de exones distintos con sitios desplazados de dador de empalme o de aceptor de empalme permite obtener en cada caso un producto genético en el marco de lectura correcto, para ello puede estar predeterminado un exón líder o no (en el último caso se necesitan solamente 3 vectores distintos de trampa de exones; ejemplo 19);

-en principio es apropiado cualquier locus de gen activo, para, partiendo de una línea celular, generar por recombinación específica una gran variedad de células distintas o de productos genéticos asociados con ellas (ejemplos 3, 4, 17, 18, 19);

-también las señales específicas de recombinación iguales pueden flanquear a las secuencias variables (ejemplos 3, 4, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19);

-o las señales de recombinación inversas iguales pueden flanquear a las secuencias variables;

-o se recombinan varias (muchas) secuencias variables dispuestas una detrás de otra, que en cada caso están flanqueadas por señales de recombinación (figura 6);

-en lugar de un vector de expresión de recombinasa puede emplearse también la proteína de recombinasa propiamente dicha;

-la proteína de recombinasa puede fusionarse con un dominio represor Tet, para aumentar de este modo la eficacia de recombinación de los plásmidos con los sitios del operador Tet;

-se puede generar una línea celular, que produzca las recombinasas específicas requeridas, en especial inducibles (ejemplos 3d, 4d), de este modo puede p.ej. comprobarse de modo muy sencillo la actividad de la Cre con el vector pSVlacZT;

-la gran variedad de genes de anticuerpos (ejemplos 5, 6, 7, 18) puede obtenerse también por síntesis química de muchos CDRs distintos dentro de una o de pocas estructuras de genes de anticuerpos predeterminados;

-o por multiplicación de cDNA o de bibliotecas de anticuerpos scFv (ejemplo 18) mediante una PCR;

-se puede seleccionar la gran variedad de los genes de anticuerpos variables recombinados por selección negativa con ganciclovir (ejemplo 18);

-pueden insertarse también otros segmentos de gen seleccionables (p.ej. el EGFP) en lugar de un gen de resistencia al G418 o de un epítope de myc (ejemplos 3, 4, 18);

-es posible la aplicación tanto de una cassette de recombinación seleccionable positivamente (p.ej. G418) como negativamente (p.ej. con ganciclovir) (ejemplo 18);

-

pueden combinarse bibliotecas (ejemplos 7, 16, 17, 18, 19) con arreglos (arrays) de todo tipo para conseguir una exploración masiva paralela;

-

pueden obtenerse de modo muy sencillo múltiples formes de anticuerpos biespecíficos, bifuncionales o alterados en general (ejemplos 12, 13, 14, 15, 18);

-puede utilizarse la variante de empalme de un anticuerpo secretada al medio de cultivo (en general: de una proteína de fusión correspondiente; ejemplos 12, 13, 16, 18, 19) para la caracterización rápida y sencilla de una línea celular seleccionada (ejemplo 9) o incluso para la caracterización de una subbiblioteca (ejemplo 8) o incluso para la caracterización de una biblioteca generada;

-puede utilizarse la variante de empalme secretada, en

5 especial de un anticuerpo humano si fuera necesario directamente como sustancia farmacológicamente activa;

-pueden combinarse las bibliotecas de células T (ejemplos 16, 17) con bibliotecas de células de antígenos unidos a MHC para la búsqueda de epítopes específicos de

10 células T.

Claims (25)

1. Reivindicaciones

   1. Procedimiento para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas, caracterizado porque

   (a) en uno o dos lugares (loci) cromosómicos de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

   (b) se expande por lo menos una de las células así

   modificadas,

   que como alteración posee las señales

   específicas de recombinación en los loci de gen;

   (c)

   se transfecta a las células expandidas un gran

   número de secuencias diferentes de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

   (d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, formándose un gran número de células, que en cada caso expresan diversas proteínas, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen, y uniéndose las proteínas expresadas a la superficie de las correspondientes células que las han expresado.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el paso (a) tiene lugar la introducción de las señales de recombinación por recombinación homóloga del DNA transfectado con los correspondientes loci de gen, las señales de recombinación del DNA transfectado están flanqueadas por regiones homólogas de los correspondientes loci de gen de la

   célula y en el paso (b) se expande por lo menos una de las células alteradas por recombinación homóloga, que como alteración presenta las señales específicas de recombinación en los loci de gen.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 para generar una biblioteca de células eucariotas productoras de anticuerpos, caracterizado porque

   (a) en una o dos regiones o lugares cromosómicos (loci) de gen de las células se introducen en primer lugar señales específicas de recombinación;

   (b) se expande por lo menos una de las células así

   modificadas,

   que como alteración presenta las señales

   específicas de recombinación en los loci de gen;

   (c)

   se transfecta a las células expandidas un gran

   número de secuencias diferentes de DNA, que contienen en cada caso distintos genes vH, vlambda o vkappa, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación; y

   (d) se integra el gran número de secuencias diferentes de DNA en los loci de gen de las células expandidas debido a las señales específicas de recombinación y a la recombinasa específica de las mismas, en el que se genera un gran número de células, que en cada caso expresan anticuerpos distintos, que en cada caso se codifican con las diferentes secuencias de DNA que se han integrado en los loci de gen y en el que los anticuerpos expresados están unidos a la superficie de las

   correspondientes células que los han expresado.
4. 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que señales de recombinación son señales loxP, FRT

   o att.

5. 5.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que las células eucariotas son células de mamíferos o células de hibridoma.

6. 6.

   Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células de mamíferos son linfocitos neoplásicos o precursores de los mismos, células leucémicas o células de linfomas malignos.

7. 7.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 6, en el que los genes vH, genes vlambda y/o genes vkappa son genes humanos.

8. 8.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 2 y de 4 a 7 para la producción de una biblioteca de células productoras de receptores de células T, en el que las distintas secuencias de DNA contienen distintos genes de receptor alfa de T o genes de receptor beta de T.

9. 9.

   Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7 para la producción de una biblioteca de células que expresan exones, en el que las distintas secuencias de DNA contienen distintos exones genómicos, que codifican señales de empalme.

10. 10.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 7, en el que los loci de gen son loci de anticuerpo y contienen el gen vH, gen vlambda o vkappa activos.

11. 11. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que

    los loci de gen son loci de receptor de células T y contienen

    el gen de receptor alfa T activo o el gen de receptor beta T activo.

12. 12.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 7, 10 y 11, en el que los anticuerpos son anticuerpos humanos monoclonales, que están unidos a la superficie de la célula, que los expresa, mediante enlace covalente.

13. 13.

    Procedimiento según la reivindicación 12, en el que los anticuerpos monoclonales humanos expresados por la célula correspondiente por empalme diferencial de los dominios constantes de una IgG, IgM, IgA, IgD o IgE están unidos a la superficie de la célula, que los expresa, mediante enlace covalente.

14. 14.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 13, en el que por cada célula expandida se obtienen más de 102 células distintas, que en cada caso expresan proteínas distintas.

15. 15.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 3 a 14, en el que las regiones homólogas del DNA transfectado a los correspondientes loci de gen de la célula, que flanquean a las señales específicas de recombinación, se extienden por lo menos a lo largo de 400 pares de bases.

16. 16.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 11 a 15, en el que el intrón en dirección al extremo 5’ antes del exón M1 de un gen de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE se ha acortado en más de 50 pares de bases.

17. 17.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 16, en el que después de la transfección con un gran número de secuencias diferentes de DNA, a partir del gran

    número de células distintas resultantes se efectúa un enriquecimiento de aquellas células, que en la superficie celular presentan proteínas unidas a la superficie, que han sido expresadas por las células correspondientes, de modo que se genera una población de células con la mayor diversidad posible de proteínas.

18. 18.

    Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 17, en el que en los pasos de transfección del gran número de secuencias diferentes de DNA a los loci de gen, que en cada caso están flanqueados por sitios de reconocimiento de una recombinasa, se transfectan y/o activan además secuencias de DNA expresables, que codifican a la recombinasa correspondiente.

19. 19.

    Biblioteca de células eucariotas productoras de proteínas que puede obtenerse con arreglo a un procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 18, dicha biblioteca es una biblioteca de células eucariotas productoras de anticuerpos.

20. 20.

    Procedimiento para el aislamiento de un anticuerpo monoclonal que tiene una especificidad deseada, caracterizado porque se incuba una biblioteca según la reivindicación 19 con un antígeno y a continuación se aísla la célula que tiene el antígeno unido a su superficie.

21. 21.

    Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado además porque se aíslan anticuerpos muy afines.

22. 22.

    Procedimiento según la reivindicación 21, en el que antes del aislamiento de los anticuerpos muy afines se

    realiza la introducción de mutaciones dentro de los genes variables de los anticuerpos.

23. 23.

    Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la célula se transfecta con un vector de expresión, que

    5 expresa la secuencia de DNA que codifica al RAD54, polX mu y/o RecQ4.
24. 24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, en el que la célula se transfecta con un vector de expresión, que expresa al RNA antisentido, que es complementario de los

    10 genes RAD51B, XRCC2 o XRCC3.
25. 25. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 22 a 24, en el que la célula se transfecta con un gran número de secuencias de DNA, que en cada caso están flanqueadas por señales específicas de recombinación y en el que el gran

    15 número de secuencias de DNA se obtienen por una PCR propensa al error (“error-prone”-PCR).