JP3298842B2 - 外来性遺伝子のゲノム上部位特異的挿入により作製されたトランスジェニック又はキメラ動物 - Google Patents

外来性遺伝子のゲノム上部位特異的挿入により作製されたトランスジェニック又はキメラ動物

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、不活化遺伝子と異
なる遺伝子の組込みによる、真核性レセプター生物のゲ
ノム中に存在する遺伝子のコピーの特異的置換方法に係
る。好ましくは、レセプター遺伝子はトランスフェクト
された宿主細胞中に少なくとも2つ存在する。レセプタ
ー遺伝子は別の遺伝子を挿入される遺伝子として規定さ
れる。
【０００２】より詳細には、本発明は動物の正常な遺伝
機能を維持すると同時に内在プロモーターの制御下に外
来遺伝子を発現させるようにターゲッティングにより外
来遺伝子を導入されたトランスジェニック動物の生産に
係る。
【０００３】「別の又は外来遺伝子」なる用語は、ゲノ
ム(RNA又はDNA)中に通常見いだされるようなレセプター
遺伝子に対して「外来又は別の」遺伝子の全体又は一部
に対応する全ヌクレオチド配列を意味するか、又は正常
遺伝子の人工的に修飾された配列又はこの配列のフラグ
メントに対応する。
【０００４】本発明は更に、これらのトランスジェニッ
ク動物の生産方法にも係る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】トランスジェニック動
物の生産において、胚細胞系に異種DNA配列を導入する
ために使用されている慣用方法は、外来遺伝子のゲノム
組込み部位も、こうして導入したコピーの数も制御する
ことができない。外来遺伝子の組込みはランダムに行わ
れ、一般に、遺伝子の複数のコピーが多くの場合は双頭
-尾形として同時に組込まれ、組込み部位及び組込まれ
るコピー数はトランスジェニック動物により異なる。
【０００６】その結果、挿入点に位置する内在細胞遺伝
子がこうして不活化され、ランダムな挿入が多数である
ためにこのことを容易に検出できないという事態が生じ
得る。これらの遺伝子の産物が動物の発生に重要である
場合、動物は大いに撹乱される。また、外来遺伝子のラ
ンダムな挿入は遺伝子の発現に不適当な部位で行われる
可能性がある。更に、動物間で挿入部位及び挿入数が異
なるため、発現調査の解釈は極めて困難になる。
【０００７】トランスジェニック動物の生産に伴う主要
な問題は、外来遺伝子の発現を得ることである。一般
に、2つの型の実験がマウスで実施されている。
【０００８】胚系に導入された遺伝子は、 −固有の調節配列を有するコーディング配列を含む「完
全」遺伝子、又は −別の遺伝子のプロモーター配列に融合された遺伝子の
コーディング配列から形成される複合遺伝子であり、2
つのフラグメントは多くの場合2つの異なる動物種に属
する。
【０００９】こうして種々の組織における遺伝子の発現
の特異性はそれらの遺伝子の調節配列により決定される
という事実を確認することができた。
【００１０】従って、トランスジェニック動物で外来遺
伝子を発現するために適当なプロモーターの選択は極め
て重要である。
【００１１】他方、胚性幹細胞におけるマウス遺伝子の
部位特異的突然変異は、「遺伝子ターゲッティング(gen
e targeting)」(Thomas他, 1987; Thompson他,. 1989)
の方法を使用することにより最近実現された。
【００１２】前者では、マウス遺伝子HPRTを挿入及び置
換により突然変異誘発させ、後者では、突然変異遺伝子
HPRTを修正した。Thompson他はキメラマウスが獲得され
るまで実験を拡大し、胚細胞系における遺伝子修飾の継
代を確認した。
【００１３】引用文献の各々では、外来プロモーターの
制御下でベクターに含まれる突然変異又は修正を含む外
来配列と、それらのゲノム相同染色体との間の相同組換
により、厳密な組込み部位をターゲッティングした。こ
こで留意すべきことであるが、従来技術の著者は突然変
異による活性化が検出可能な表現型を伴う特異的遺伝子
(HPRT)で実験を行っている。Thomas他により記載された
ターゲッティングによる突然変異は、遺伝子HPRTを不活
化し、従って、通常HPRTと結合している検出可能な表現
型を消滅させる効果があった。従って、プロモーターTK
の制御下の選択遺伝子NeoＲは形質転換細胞を選択でき
るように挿入DNAに組み込まれていた。留意すべき点と
して、従来技術に記載されている実験はレセプター遺伝
子(例えばHPRT)又は挿入遺伝子(例えばNeoＲ)によるに
よる選択を含むものであった。従って、挿入部位及び／
又は挿入される遺伝子の型は選択可能な形質を与える遺
伝子に制限される。
【００１４】更に、従来技術によるとベクター上の外来
配列は組込み部位をターゲッティングすると同時に修飾
を導入するように機能する。相同組換後、修飾された遺
伝子は正常な遺伝子環境に常に存在する。
【００１５】トランスジェニック動物の生産過程で生じ
る問題は、外来遺伝子の挿入点に存在する内在細胞遺伝
子を不活化する危険であることに留意されたい。
【００１６】不活化遺伝子の産物の機能に従い、このよ
うな不活化はトランスジェニック動物に重大な生理学的
又は形態学的障害を招き、又はその生存を妨げさえす
る。
【００１７】一方、遺伝子の不活化は該当遺伝子がウイ
ルスレセプター又は他の感染性物質をコードしているな
らば有利であるとみなされ得る。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記欠点を
解決する可能性を検討し、所定のケースでトランスジェ
ニック動物の生産過程に重要な機能を有する1又は複数
の内在細胞遺伝子の可能な不活化に結び付けた。
【００１９】本発明の目的は、真核細胞のゲノムに完全
組換遺伝子を供給するために相補的DNAと組換られる
と、機能性にされ得るか又はその機能がより有効にされ
得る遺伝子の一部により構成される所謂挿入DNAの特に
ターゲッティングによる特異的置換方法を提供すること
であり、該方法は、 −挿入部位が相補的DNAを含む選択されたレセプター遺
伝子に存在しており、 −それ自体挿入DNAと、挿入DNAの両側に位置し且つレセ
プター遺伝子中の所望の挿入部位の側にある2つのゲノ
ム配列に夫々相同である2つの所謂「フランキング」配列
とを含む挿入物を含むベクターで真核細胞をトランスフ
ェクトし、−挿入DNAがレセプター遺伝子に対して異種
(heterologue)であり、 −フランキング配列が、該相補的DNAを構成し且つレセ
プター遺伝子の対応配列との相同組換により、真核細胞
のゲノムにおける完全組換遺伝子の再構成を可能にする
配列から選択されることを特徴とする。
【００２０】本発明はトランスジェニック動物の生産方
法にも係り、該方法は、相同組換(即ち外来遺伝子の正
確な組込み)のために選択された上記条件下でE.S.細胞
をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を組
み込むことが可能な段階(例えば胚盤胞段階)の胚に該ト
ランスフェクトした細胞を注入し、次に該胚を保有母体
に再移植し、妊娠期に得られたキメラ個体を対合させる
(accoupler)ことを特徴とする。E.S.細胞がキメラ動物
の胚系に転移移植したならば、置換した遺伝子に対して
ヘテロ接合性のトランスジェニック動物が子孫で対合(a
ccouplement)(F1)により得られる。
【００２１】受精後まもない(即ち24時間以内)卵細胞
に、本発明のベクターにより担持される遺伝子を挿入す
ることも可能である。こうして、卵細胞が単細胞状態に
ある間に挿入が行われる。
【００２２】本発明は更に、真核細胞のゲノムに組換遺
伝子(即ち挿入遺伝子)のターゲッティング挿入を実施す
ることが可能なプラスミドにも係り、該プラスミドはそ
れ自体挿入遺伝子と、挿入遺伝子の両側に位置し且つレ
セプター遺伝子中の所望の挿入部位の側にある2つのゲ
ノム配列に夫々相同である2つの所謂「フランキング」配
列とを含む挿入物を含むことを特徴とする。
【００２３】本発明は更に、少なくとも1個の内在遺伝
子が不活化遺伝子と異なる遺伝子の挿入により不活化さ
れたトランスジェニック動物にも係り、挿入遺伝子は不
活化内在遺伝子の調節配列の制御下にこの遺伝子の発現
を可能にする位置に挿入される。
【００２４】従って本発明の方法は、相同組換現象によ
り、外来遺伝子、特に正常時に関連するプロモーターを
欠失するコーディング配列を、真核生物のゲノム中で、
挿入が行われる遺伝子の内在プロモーターの制御下に外
来遺伝子の発現を可能にする部位にターゲッティングに
より挿入することができ、その結果、ターゲッティング
した内在遺伝子を不活化することができる。
【００２５】本発明の好適態様によると、ターゲッティ
ングされたレセプター遺伝子は、ゲノム中に少なくとも
2つ存在する遺伝子である。エレクトロポレーション(参
考資料11)を使用することにより、外来遺伝子のコピー
のみの導入を確保することができる。
【００２６】本発明のこの変形例によると、該当遺伝子
(即ち所謂挿入遺伝子)のターゲッティング挿入は、挿入
が行われる内在細胞遺伝子のコピーのみを不活化し、こ
の遺伝子の該コピー又は他のコピーを無傷且つ機能性の
ままにしておく。
【００２７】こうして、挿入が動物の発生のために必須
のレセプター遺伝子の単一コピーを不活化するとして
も、トランスジェニック動物の遺伝子機能は外来遺伝子
の導入により全く又はほとんど撹乱されない。従って、
動物の発生は外来遺伝子の挿入により影響されず、必須
遺伝子の不活化の場合に僅かな撹乱が生ずるとしても動
物に致死的ではあり得ない。ホモ接合状態における外来
遺伝子の挿入の効果は自明であり、ヘテロ接合個体の相
互交差(F1)後の第２世代(F2)で観察される。
【００２８】一方、遺伝子の全コピーの不活化が所望さ
れる場合、例えば遺伝子が感染性物質のレセプターをコ
ードする場合には、外来遺伝子の複数のコピーを導入す
る。導入される量の調節は既知の方法を使用することに
より確保され得る。
【００２９】従って、外来遺伝子のターゲッティング挿
入は、挿入が行われる内在遺伝子の調節配列の制御下遺
伝子が発現されるような部位への導入を可能にする。
【００３０】したがって本発明の方法は、所望の機能
(例えば種々の組織における発現特異性)を有する内在プ
ロモーターの後に外来遺伝子を挿入することができ、こ
れは、場合によりレセプター遺伝子の他のコピーを不活
化することなく可能である。
【００３１】本発明の特に好適な態様によると、挿入DN
Aはフランキング配列の間に、組換遺伝子を提供するた
めにレセプター遺伝子中で相補的DNAと組み換えられる
ように構成されたDNA配列と、形質転換細胞の選択を可
能にする選択物質及び選択物質の発現を可能とするプロ
モーターをコードする配列とを含み、レセプター遺伝子
及び発現産物をコードする組換遺伝子は選択可能な表現
型を与えない。
【００３２】このように、形質転換細胞の選択はレセプ
ター遺伝子及び挿入される遺伝子の性質に完全に独立し
ているが、これに対して従来記載されている方法では、
挿入される遺伝子又はレセプター遺伝子が必要に応じて
形質転換細胞の選択を可能にする発現産物をコードする
必要があった。本発明者により開発されたシステムは、
レセプター遺伝子及び挿入遺伝子又は相同組換により形
成される遺伝子の性質に関して完全な融通性を可能にす
る。本発明者らは驚くべきことに、かなりの寸法(例え
ば約7.5kb)の配列を挿入しても相同組換頻度に影響しな
いことを確認した。
【００３３】本発明のこの特徴に従ってDNA配列の挿入
が及ぼし得る効果は、挿入される配列の型に応じて、例
えばコーディング配列の置換、調節配列の置換、突然変
異による遺伝子の不活化もしくは再活性化、又は遺伝子
の発現率の改良を含む。本発明によると、挿入遺伝子の
発現が置換遺伝子の発現に完全に置換えられるように、
コーディング相又はコーディング相の一部を置換遺伝子
の開始コドンから開始する異種配列により置換すること
が可能である。この結果、トランスジェニック動物で望
ましくない融合タンパク質の形成を避けることができ
る。
【００３４】本発明のこの態様によると、挿入DNAはプ
ロモーターを欠失する異種コーディング配列をフランキ
ング配列間に含み得、コーディング配列は選択物質をコ
ードする遺伝子以外の配列である。挿入DNAは更に、フ
ランキング配列の間でコーディング配列の下流に、選択
物質をコードし且つ標的細胞におけるその発現を可能に
するプロモーターに関連する遺伝子を含む。
【００３５】こうして所望の特性(例えば所定の発現特
異性、又は転写地図等)を有する内在プロモーターに後
に異種コーディング配列を挿入することができ、形質転
換された細胞の選択性は異種コーディング配列の発現か
ら完全に独立している。この型の構築によると例えば、
異種コーディング配列により置換された遺伝子が標的細
胞で正常に発現されない場合にも形質転換細胞を選択す
ることができる。遺伝子のかなりの割合は動物の発生の
更に進んだ段階まで不活性のままであるので、このこと
はE.S.細胞(Embryonic Stem Cells)からトランスジェニ
ック動物を生産するのに特に重要である。遺伝子Hox-3.
1はこの型の遺伝子の1例である。他方、コーディング配
列が容易に検出可能なタンパク質(例えばb-Gal)をコー
ドする場合、置換された内在遺伝子の転写地図を作成す
ることができる。ベクターpGNはこの型の構築の1例であ
る。
【００３６】本発明の他の態様によると、挿入DNAは外
来調節配列を含み得る。挿入部位、従ってフランキング
配列は所望の目的、即ち内在調節配列と共に「二重プロ
モーター」の効果を与えるために外来調節配列を挿入す
るのか、あるいは内在プロモーターを外来プロモーター
に置換するのかに応じて選択される。調節配列の制御下
にあるコーディング配列は内在配列であり得る。
【００３７】他の可能性は調節配列とコーディング配列
とを同時に含む外来DNAの標的挿入である。調節配列は
コーディング配列と自然に会合する配列である可能性が
ある。
【００３８】本発明の方法は、外来遺伝子の両側に2つ
の「フランキング」配列を含むベクターを使用する。これ
らのフランキング配列は少なくとも150塩基対を有して
おり、好ましくはレセプター遺伝子の長さよりも短い。
これらの2つのフランキング」配列は所望の挿入部位の側
の2つのゲノム配列に相同である点が重要である。導入
すべき外来遺伝子の上流に存在するベクターのフランキ
ング配列は通常、挿入部位の5'側に位置するゲノム配列
に相同である。同様に、外来遺伝子の下流に存在するベ
クターのフランキング配列は通常、挿入部位の3'側に位
置するゲノム配列に相同である。
【００３９】フランキング配列の一方又は他方と外来遺
伝子との間に「挿入」配列(例えば形質転換細胞の選択を
可能にする配列、マーカー、ベクターのクローニングを
可能にする配列等)を導入することが可能である。
【００４０】しかしながら、外来遺伝子に対するこれら
の挿入配列の位置は、外来遺伝子の発現を妨げないよう
に、特に内在プロモーターの制御下の外来コーディング
DNA配列、又は逆に挿入配列によりもたらされる外来調
節成分の制御下の内在DNAのコーディング配列から選択
されなければならない。
【００４１】相同組換を助長するフランキング配列の存
在にも拘わらず、所定数の組込みがランダムに生じる場
合がある。標的挿入が標的部位で正しく行われ、他の場
所では行われなかったことを確認するためには、「ポリ
メラーゼ鎖反応(P.C.R.)(参考資料10)」法を使用して、
挿入が行われるべきであった遺伝子座のDNA配列を増幅
する。こうして、相同組換後により形質転換されたクロ
ーンのみが選択される。
【００４２】ベクターのフランキング配列は自明の通
り、相同組換が行われ得るために所望される挿入部位に
応じて選択される。場合により、フランキング配列は内
在プロモーターの反復配列及び／又は翻訳率を改良する
ために開始コドンに先行する配列(上流の配列)及び特に
ポリアデニル化部位の終止配列の反復配列(下流配列)の
修飾を含み得る。
【００４３】挿入遺伝子は任意の該当遺伝子であり得
る。非限定的な具体例として遺伝子lac.Z(後述のモデ
ル)、インターロイキン又はインターフェロンをコード
する遺伝子、レセプター(例えばレチノン酸又はβ-3ア
ドレナリン又はH.I.V.)の遺伝子、及び所定の疾患(例え
ば筋萎縮症等)に関連するとして知られる遺伝子を挙げ
ることができる。
【００４４】本発明の好適変形例によると、真核細胞は
胚性幹細胞である(参考資料14及び15)。
【００４５】実際に、突然変異E.S.細胞は早期の胚に注
入され得、胚は再注入後、キメラ形で発生し得る。胚系
が突然変異細胞の転移移植を受けるならば、キメラ動物
はその子孫に突然変異を伝達する。この結果、この突然
変異が所定の個体でホモ接合体状態で該個体の発生、挙
動、代謝、病理等に及ぼす効果を観察することができ
る。
【００４６】本発明の方法は非常に広い工業用途があ
り、導入される外来遺伝子の種類に応じて変形可能であ
る。
【００４７】任意の遺伝子を特異的に突然変異誘発する
ことが最近可能になり、こうしてその役割をよりよく規
定できるようになったため、哺乳動物の遺伝学は著しく
前進しつつある。相同組換及びE.S.細胞に介入させるこ
の方法により、腫瘍遺伝子、交差因子、転写因子等、基
本研究又は応用研究の目下のテーマである遺伝子に貴重
な情報がもたらされる。医療研究に重要な手掛かりは、
遺伝子決定が既知の人体疾患(デュシェンミオパシーの
ような病理に係る所定の人体疾患)を再現し、そのメカ
ニズムを調査すると共に治療法を研究できるようにする
ことである。
【００４８】本発明の方法を適用することにより、所定
の疾患に関与するとして知られている遺伝子を、E.S.細
胞のゲノムにターゲッティングにより挿入する。その結
果として生産されるトランスジェニック動物はこの疾患
の有効なモデルを表す。
【００４９】必要に応じて上述のように、正常な遺伝子
機能は外来遺伝子の挿入にも拘わらずほぼ維持され得
る。
【００５０】本発明の方法の他の適用は、容易に検出さ
れ(例えばlac.Z遺伝し)、従って細胞マーカーの役割を
果し得る挿入遺伝子を挿入することである。こうして、
例えば群動物における血統の調査が容易になり、家系を
たどることができる。
【００５１】挿入遺伝子としてのlac.Z遺伝子の挿入は
同様にプロモーターの調査も可能にする。β-ガラクト
シダーゼ活性を検出できるため、同一型又は異なる型の
細胞で種々の部位をターゲッティングすることにより、
種々の内在プロモーターの活性及び特異性を調査するこ
とができる。キメラ又はトランスジェニック動物法を使
用することにより、発生過程又は成長状態で完全な生物
に同一の調査を実施することができる。
【００５２】本発明者は驚くべきことに、相同組換頻度
がかなりの寸法のフラグメント(例えばLac Z)の挿入に
より影響されないことを確認した。本発明者はこの知見
から、相同組換法が大きい寸法を有する他の異種遺伝子
の挿入に適合するものと想到した。
【００５３】動物のゲノムを修飾できるため、本発明の
方法は「遺伝子治療」にも使用することができる。最も明
白な使用は感染性物質（ウイルス又は細菌）又は毒性物
質のレセプターをコードする遺伝子を不活性化すること
である。この突然変異誘発が致死性であることが判明し
たならば、無害物質に対する感受性を回復することなく
失われた機能を回復する必要があろう。このようなレセ
プターをコードする修飾遺伝子は、修飾が相同組換によ
り生じるのでない限り突然変異細胞に再導入され得ない
と思われる。遺伝形質のこの修飾は該当疾患に対する免
疫を動物に与えると考えられる。
【００５４】このプロトコルは自己移植の枠にも介入し
得る。患者から採取した障害又は健常細胞は治療及び免
疫され、その後、同一固体に再注入され得る。
【００５５】本発明の方法は、疾患に関連する病理遺伝
子の発現産物に対する活性を有すると予想される医薬製
品の活性の調査にも適する。この場合、挿入遺伝子は病
理遺伝子により構成され、疾患に対する活性を評価する
ために医薬生成物をトランスジェニック動物に投与す
る。
【００５６】以下、プラスミドpGNと、マウスのE.S.細
胞のゲノムへの外来遺伝子(大腸菌のβ-ガラクトシダー
ゼ酵素をコードするlac.Z)の標的挿入におけるその使用
とに関して本発明を説明する。lac.Z遺伝子を選択した
のは、その発現を容易に検出することができるという理
由からであり、単なる例示に過ぎない。
【００５７】マウス遺伝子Hox.3-1(参考資料1)のゲノム
配列(7292-3)と融合した大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ
酵素のコーディング相(lac.Z; 1-3057)は、この遺伝子
の開始コドンから開始する。実際に、Hox-3.1の開始コ
ドンに先行する配列は脊椎動物に観察されるコンセンサ
ス配列と同一であり(参考資料2)、従って、脊椎動物の
細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの良好な翻訳率を実
現する。lac.Z遺伝子は真核遺伝子の大部分と同様に、
メッセンジャーRNAを安定化するために、ポリアデニル
化信号(例えばウイルスSV40)を伴う。
【００５８】真核細胞において機能的な大腸菌のβ-ガ
ラクトシダーゼの活性は、種々の方法で検出され得る。
lac.Z遺伝子を発現する細胞は、β-ガラクトシダーゼの
基質であるX-Galの存在下で固定後に青色に呈色する(参
考資料3)。新規基質FDG(フルオレセインジ-βガラクト
ピラノシド)は、生存細胞を維持しながらβ-gal活性を
検出及び定量することができる(参考資料4)。lac.Zを発
現する細胞は蛍光産物を蓄積し、細胞ソーター又はFACS
(蛍光活性化細胞ソーター)により単離され得る。
【００５９】ミオシン耐性遺伝子の転写単位の大部分は
プラスミドpRSV neoに由来する(参考資料5)。ラウス肉
腫ウイルスのLTR(long terminal repeat)は多数の真核
細胞で非常に強力なは活性及びプロモーター配列を与え
る(参考資料6)。細菌トランスポゾンTn5からは、大腸菌
中の活性プロモーターと、ウイルスSV40のポリアデニル
化信号を伴うホスホトランスフェラーゼ酵素のコーディ
ング相とが得られる(参考資料7)。プロモーターRSV及び
Tn5の二重制御下の同一遺伝子は、細菌にネオマイシン
又はカナマイシン耐性、真核細胞にG418耐性を与え得
る。
【００６０】単なる点突然変異の結果として、ポリオー
マウイルスのPyEC F9.1株の活性配列(エンハンサー)のB
単位は、種々の型の細胞、特に胚性癌(EC)細胞で更に著
しく活性になった(参考資料8)。このエンハンサーPy F
9.1の2つのコピーをLTR-RSVの上流でプラスミドpGNに、
ポリオームの調節領域の「後期プロモーター」の方向に双
頭形で挿入した。
【００６１】ホスホトランスフェラーゼの翻訳率を改良
するために、オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発時
に開始コドンに先行する配列を修飾した。こうして配列
TTCGCAUGは脊椎動物における翻訳の開始コンセンサス配
列によりよく対応するGCACCAUGになった(参考資料2)。
【００６２】マウスの胚性幹(ES)細胞をトランスフェク
トすることにより、ネオマイシン耐性遺伝子の転写単位
に加えられた改良を評価することができた。プラスミド
中のモル濃度が等しいとき、エンハンサーPy F9.1を用
いて構築するとpRSV neoの7.5倍及びCapecchi他(参考資
料13)により記載されているpMCl Neoの2〜3倍のG418耐
性クローンが産生された。更に、翻訳開始配列を修飾す
ることにより、クローンの数はpRSV neoの60倍、又は45
0倍に増加した。相同組換は適用される実験条件に応じ
て非常に低頻度であり得る(例えば参考資料13によるとH
PRTで1/1000)。したがって、電気泳動条件が主に単独コ
ピーの主に組込みを与えるのであれば、高い選択効率を
有するベクターは非常に有用である。
【００６３】プラスミドpGNは更に、大腸菌におけるク
ローニング及び調製を可能にするcolE1, pBR322型の細
菌複製開始点を含む。
【００６４】最後に、このプラスミドを使用し易くする
ために、in vitroで合成され、pGNに独自の切断部位し
か含まない多重クローニング部位(M.C.S.)をlac.Zの上
流に挿入した。
【００６５】lac.Zの上流でMCS部位によるプラスミドの
直鎖化後、相同組換を生じるプラスミド性「フランキン
グ」配列をプラスミドpGNの末端に加える(図２)。この場
合、選択されたフランキング配列は、相同組換に後で介
入する以前にHox-3.1に由来する染色体配列に相同であ
った。
【００６６】図２は、プラスミドpGNから構築される分
子の位置を遺伝子Hox-3.1と比較して示す。この場合、H
ox-3.1のプラスミド配列と染色体配列との組換はこの遺
伝子のコーディング相の始点への挿入をもたらし、した
がって、その完全な不活化をもたらす筈である。
【００６７】プラスミドpGNは任意の遺伝子に適用可能
なこの方法のための複数の利点を兼備する。相同組換は
低頻度(非相同組込の約1/1000)であり得、G418耐性がゲ
ノムの任意の部分で発現されるために十分強力であるよ
うな多数のクローンを分析できることが必要である。ホ
スホトランスフェラーゼの転写単位に加えられる修飾は
これらの問題を完全に解決する。相同組換による突然変
異誘発法は挿入又は置換による遺伝子の不活化と等価で
あるが、プラスミドpGNは突然変異遺伝子の発現をβガ
ラクトシダーゼの発現に置換えることができるという付
加的な利点を有する。最後に、MCSはゲノムフラグメン
トのクローニングを容易にする。
【００６８】
【実施例】［実施例１］プラスミドpGNの構築 中間プラスミドを段階に従って番号付けした。第１段階 ：pRSV neoのBglＩ部位へのXhoＩ部位の挿入 大腸菌のDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによ
り充填されたpRSV neoのBglＩ部位へリンカーXhoＩの挿
入。第２段階 ：プラスミドp1のNdeＩ部位へのClaＩ部位の挿入 クレノウフラグメントにより充填されたp1のNdeＩ部位
へリンカーClaＩの挿入。第３段階 ：プラスミドp2のClaＩ部位へのエンハンサーPy F9.1の挿
入 単独部位AccＩにより単離されたエンハンサーPy F9.1 P
vuII-PvuIIをp2のClaＩ部位に挿入。「後期プロモータ
ー」方向に方向付けられた2つのエンハンサーを含むクロ
ーンの選択。第４段階 ：プラスミドp3のSmaＩ-HpaＩ欠失 「 自由端(bouts-francs)」末端を与える2種の酵素は直接
結合され得る。この欠失はさほど有用ではないSV 40のt
抗原のイントロンを除去し、ホスホトランスフェラーゼ
の転写単位の寸法を著しく減少させる。第５段階 ：pCHl10のBamHＩ部位へのXhoＩ部位の挿入 クレノウポリメラーゼにより充填されたプラスミドpCH
110(Pharmacia)のBamHＩ部位へのリンカーXhoＩの挿
入。第６段階 ：プラスミドp4への3'lac.Z-polyA SV 40の挿入 ウイルスSV 40のポリアデニル化シグナルを伴うβ-ガラ
クトシダーゼのコーディング相の3'部分をXhoＩ-AbatII
部位によりプラスミドp5から単離し、同一部位によりプ
ラスミドp4にクローニングした。第７段階 ：ベクターKS-への5'lac.Zの挿入 β-ガラクトシダーゼのコーディング相の5'部分をPstＩ
-SacＩ部位でプラスミドpMC 1871(Pharmacia)から単離
し、同一部位でベクターKS-(Stratagene)にクローニン
グした。第８段階 ：ゲノム配列Hox-3.1と5'lac.Zとの融合 ベクターKS-にクローニングした遺伝子Hox-3.1のゲノム
配列を酵素SacＩ、ヤエナリ(Mung bean)ヌクレアーゼ及
び酵素ApaＩによる連続消化により精製した。この挿入
物をApaＩ-SmaＩにより消化したプラスミドp7へのクロ
ーニングによりβ-ガラクトシダーゼのコーディング相
の5'部分と融合した。こうして融合したタンパク質は遺
伝子Hox-3.1の翻訳開始コドンと、それに続くβ-ガラク
トシダーゼのコーディング相とを含む(配列決定により
確認)。
【００６９】 第９段階：プラスミドp6へのHox-3.1-5' lac.Zの挿入 融合物Hox-3.1-5' lac.Zをプラスミドp8からApaＩ-Sac
Ｉ部位で単離し、同一部位でプラスミドp6にクローニン
グした。このクローニングはβ-ガラクトシダーゼのコ
ーディング相を完全に再構成する効果を有する。第10段階 ：ベクターKS+への遺伝子NeoＲの挿入 ネオマイシン耐性遺伝子(ホスホトランスフェラーゼの
細菌性プロモーター及びコーディング相)をpRSV neoか
らHindIII-EcoRＩ部位で単離し、ベクターKS+(Stratage
ne)にクローニングした。第11段階 ：p10におけるNeoＲの開始配列の突然変異誘発 ホスホトランスフェラーゼの翻訳開始配列を、脊椎動物
で観察されるコンセンサス配列と同一になるように修飾
し、こうして高い翻訳開始率、従って哺乳動物細胞の高
いG418耐性を可能にした。修飾は更に、突然変異誘発効
率を調節することを可能にするApaLＩ部位を生成する。
【００７０】 pRSV neoの配列との不一致領域(下線部)を含むオリゴヌ
クレオチド(CTTGTTCAATCATGGTGCACGATCCTCA)を合成し(G
ene Assembler, Pharmacia)、その後、バクテリオファ
ージT4のポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリル化
した。プラスミドKS+のf1起源によりプラスミドp10の一
重鎖マトリックスを調製し、突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドとハイブリダイズした。クレノウポリメラーゼ及
びバクテリオファージT4のDNAリガーゼにより第２の鎖
を合成及び修復した。細菌の形質転換後、突然変異クロ
ーンを３２Pで標識したオリゴヌクレオチドによりスク
リーニングした。Apa LIによる消化及び配列決定により
突然変異誘発を確認した。第12段階 ：プラスミドp9における開始配列の置換 ネオマイシン耐性遺伝子の翻訳を開始する修飾配列を含
むフラグメントを酵素HindIII-EagＩによりプラスミドp
11から単離し、同一部位でプラスミドp9にクローニング
した。第13段階 ：プラスミドp12への多重クローニング部位の挿入 2つの相補的オリゴクレオチドを合成(Gene Assembler,
Pharmacia)し、その後、ホスホリル化した。対合後、付
着末端によりMCSをプラスミドp12のApaＩ-SacII部位に
クローニングした。
【００７１】 多重クローニング部位を同様に配列決定により確認し
た。 ［実施例２］lac.Z'の上流でM.C.S.の部位により直鎖化したプラスミ
ドpGNの末端への「フランキング」配列の付加 使用した配列は、所望の挿入部位に応じて選択した(例
えばHox-3.1、第2a及びb図pGMA及びpGMD参照)。
【００７２】突然変異誘発プラスミドpGMDの構築におい
て、遺伝子座Hox-3.1に相同の2つのDNA末端をベクターp
GNのApaＩ-NsII及びNsII-SacII部位にクローニングし
た。5'アームはHox-3.1のcDNA c21のヌクレオチド219の
SacII部位(CCGCGG)で開始する。このフラグメントは5'
から第１のBamHＩ部位まで6.8kbにわたって伸びてい
る。3'アームはcDNA c21の885ヌクレオチドのApaＩ部位
(GGGCCC)で開始する。このフラグメントは3'から第１の
PstＩ部位まで1.5kbにわたって伸びている。リンカーNs
IIを5'フラグメントのBamHＩ部位及び3'フラグメントの
PstＩ部位に挿入した。5'及び3'アームをベクターpGNの
NsII-SacII及びApaＩ-NsII部位に夫々クローニングし
た。Hox-3.1 c21のcDNAの配列は文献に開示されている
(参考資料1)。
【００７３】突然変異誘発プラスミドをE.S.細胞の電気
泳動前にNsII消化により直鎖化した。ベクターpGNのApa
Ｉ-NsII及びNsII-SacII部位にクローニングした2つのゲ
ノムアームからその末端を形成した。
【００７４】プラスミドpGMDは耐性遺伝子の後にポリア
デニル化シグナルをもたず、逆に、プラスミドのHox-3.
1のイントロンの配列に挿入されたmRNAの選択的分解に
関与するAU濃度の高い配列を有する。
【００７５】別の突然変位誘発プラスミドpGMAは、pGMD
と同一構造を有するが、SV40のポリアデニル化及び転写
終結シグナルを含み、遺伝子Neoｒの下流にmRNAの分解
に関与するAU配列を示さない。これらの修飾の目的は、
ランダムな組込みに由来するクローンにおけるNeoｒの
転写物の割合を減少させることである。一方、pGMDと遺
伝子座Hox-3.1との間の相同組換に由来するクローンはG
418選択の間に変わることなく増加すべきであり、mRNA
の分解のAT配列は組換方法自体により除去するか又はイ
ントロンHox-3.1でつないだ。
【００７６】その後の実験段階では、Thompson他、1989
により記載されているプロトコルに従い、キメラ動物を
生産した。 ［実施例３］マウスの胚性細胞のトランスフェクション Thompson他、1989により記載されている方法を使用して
マウスの胚性細胞をトランスフェクトした。電気泳動法
を使用することにより、細胞当たり外来遺伝子(lac.Z)
のただ1つの導入を確保した。トランスフェクション
後、β-ガラクトシダーゼを発現する複数のクローンを
単離した。
【００７７】突然変異誘発プラスミドpGMD及びpGMAを直
鎖化し、エレクトロポレーションによりE.S.細胞に導入
し、1つのコピーのみをゲノム挿入にし易いようにした
(参考資料11)。
【００７８】プラスミドpGMA及びpGMDのHox-3.1のター
ゲッティングの効果を比較(第１表)するために初期トラ
ンスフェクションを実施した。
【００７９】
【表１】 E.S.細胞系C.C.E.(参考資料16)をフィブロブラスト栄養
層に連続的に維持した(参考資料17)。実験Ｉ及びIIでは
1.5mlのHeBS中1.5×10７個のE.S.細胞を40mgの直鎖化プ
ラスミドと共に200Vでエレクトロポレーションを行い
(参考資料11)、その後、4個の培養箱(直径100mm)に広げ
た。実験IIIでは、24ウェルを有する4個のプレートに細
胞の4分の1を広げた以外は同一条件で衝撃を加えた。翌
日、250μg/mlのG418を加えた。各トランスフェクショ
ンの結果、pGMAで約2400クローン及びpGMDで約1000クロ
ーンが得られた。
【００８０】各集合におけるG418耐性E.S.細胞のクロー
ンの平均数と、P.C.R.法で陽性の結果を与える集合の数
とを第１表に示す。陽性の結果とは、臭化エチジウムで
染色したアガロースゲル上に1.6kbのバンドを観察でき
たことを意味する(図７)。P.C.R.混合物のサザン分析及
びプライマー配列を含まない特異的プローブのハイブリ
ダイゼーション後に陽性の結果を与える集合数を括弧内
に示す(図８)。
【００８１】P.C.R.による相同組換の検出 トランスフェクションIIの250クローンの集合の10５個
の細胞でP.C.R.を実施した(図７のレーンD参照)。他の
レーンでは約4×5000個の細胞を混合することによりト
ランスフェクションIIIの4つの集合を同時に分析した。
P.C.R.で使用したプライマー07及び08は突然変異誘発プ
ラスミドの3'Hox-3.1配列を囲んでいる(図２)。この3'
配列を含む1.6kbのフラグメントは相同組換の場合にし
か増幅され得ない。レーン2、3及びDは陽性の結果を示
す。
【００８２】「沸騰-プロテイナーゼK消化沸騰」法(参考
資料18)を使用することにより、フィルター上で複製時
にE.S.クローンのDNAを調製した。67mM Tris-HCl(pH8.
6)、16.7mM(NH４)２SO４、6.7mM MgCl２、10mM 2-メル
カプトエタノール、0.01％(p/v)ゼラチン、200μM dAT
P、dTTP及びdCTP、100μM dGTP、100μM 7-デアザdGT、
各プライマー(07: AACTTCCCTCTCTGCTATTC及び08:CAGCAG
AAACATACAAGCTG) 600ng並びに3UポリメラーゼTaq(Perki
n Elmer Cetus)を含む反応混合物100μlをパラフィン10
0μlで被覆し、この反応混合物中で40回の増幅サイクル
(94℃で40秒、60℃で1分間、72℃で7分間)を実施した。
反応混合物の半分を臭化エチジウムで染色した0.7％ア
ガロースゲルに加えた。サイズマーカーはλDNAのEcoR
Ｉ＋HindIII消化物とした。
【００８３】サザン分析 ピペットを使用することにより、突然変異Hox-3.1(P.C.
R.により同定)を含むE.S.細胞の3つの独立したクローン
を陽性集合から単離した。特異的標的を確認し且つ組換
遺伝子座と野生遺伝子座とを区別するために、図８に示
す制限酵素で消化後にサザン分析によりDNAを試験し
た。2つの異なるプローブを使用し、突然変異クローン
及び対照として非突然変異E.S.細胞における遺伝子座Ho
x-3.1の3'末端を分析した(図８c)。第１のプローブaは
突然変異誘発プラスミドの配列Hox-3.1に含まれてお
り、ベクターの組み込み数及びその物理的結合を立証し
た。組換えた3個のクローンのうちの1個は更に、ランダ
ムに組込まれたプラスミドのコピー(図８a、クローンF
2)を含んでいた。突然変異誘発ベクターに含まれていな
かった第２のプローブbは、組換及び野生対立遺伝子Hox
-3.1を区別していた(図８b)。組換遺伝子座Hox-3.1は、
突然変異誘発ベクター及び無傷の遺伝子座の制限地図か
ら予想されるハイブリダイゼーション像を2つのプロー
ブで示した。更に、ベクターの3'アームにおける2つの
組換領域の存在は組換遺伝子座Hox-3.1における配列AT
の有無により確認された(例えば図８、クローンL5)。遺
伝子座Hox-3.1の5'末端を同様に相同組換の場合につい
て分析した。突然変異誘発ベクターの6.8kbのHox-3.1
5'配列に部位を含まない制限酵素を組換クローンのDNA
の消化に使用した。これらのDNAをその後、パルス電界
で電気泳動にかけ、高分子量フラグメントを識別した。
このゲルのサザン分析の結果、突然変異誘発プラスミド
の上流に配列を有するプローブを使用することにより、
正確に組換えられた対立遺伝子と野生対立遺伝子Hox-3.
1とが判明した。
【００８４】サザン分析の結果、予想通り遺伝子Hox-3.
1の対立遺伝子が組換えられたことが判明した。相同組
換は突然変異誘発プラスミドのゲノムアームと相同染色
体配列との間の二重「交差(crossing-over)」に等価であ
った(図２)。
【００８５】組換クローンで遺伝子lac ZはAUGコドンの
上流のHox-3.1のプロモーター及び調節配列の制御下に
おかれたが、mRNAの成熟3'シグナルはSV40から由来して
いた。これらの組換配列において、lac Zの発現はβ-Ga
l染色により検出することができず、これは、RNアーゼ
の保護分析により決定されたE.S.細胞中のHox-3.1の転
写の不在に一致していた。β-Galの活性は、Hox-3.1の
転写を誘導するとして知られている条件である5×10−
７Mレチノイン酸の存在下に3又は4日間培養後に所定の
細胞で誘導可能であった(参考資料19)。
【００８６】8.3kb DNAと遺伝子座Hox-3.1との完全な相
同を示す突然変異誘発ベクターpGMAを使用することによ
り、120bpのフラグメントを7.2kbの挿入により置換し
た。この標的置換の頻度(1/900)はHPRT(参考資料13)又
はEn-2(参考資料20)で最近得られた頻度(夫々1/1000及
び1/260)に匹敵し、しかもこれらの文献で挿入した異種
フラグメントのほうが著しく小さいサイズ(夫々1.1及び
1.5kb)であった。驚くべきことに、ベクターpGMDで非常
に高い相同組換頻度(1/40)が得られることが確認され
た。mRNAの成熟3'シグナルの除去及びネオマイシン耐性
遺伝子へのmRNA分解配列の付加は、G418耐性クローンの
総数を2.4倍減少させる効果があった(第１表)。特異的
ターゲッティング比はほぼ10倍に増加した(900/40)。pG
MDを用いる実験でも同一の相同組換メカニズムが作用を
受ける筈であった。これらの結果は、51bpのAT配列がよ
り低い融合温度のために突然変異誘発プラスミドでin v
IVoで開環を提供し得るのであろうと説明することがで
きる。pGMDの隣接配列Hox-3.1がこの開環によりAT領域
の各側で作用され得るならば、該配列は一重鎖状態で染
色体遺伝子座Hox-3.1とより有効に反応し得るであろ
う。相同組換メカニズムはより複雑な真核生物では依然
解明されていないが、酵母での分裂組換モデルによると
このような鎖交換により誘導されると予想される。
【００８７】図８は陽性個体クローン(L5及びF2)とE.S.
細胞(C.C.E.)で実施したサザン分析の結果を示す。
【００８８】使用したプローブはベクターに含まれる
(a)か又は突然変異誘発ベクターから除外される(b)配列
Hox-3.1にしかハイブリダイズしない。組換遺伝子座Hox
-3.1のハイブリダイゼーション像(白三角)は野生遺伝子
座(黒三角)と明白に区別される。星印はランダムに組込
まれたプラスミドのコピーのハイブリダイゼーションバ
ンドを示す。サイズマーカーはλDNAのEcoRＩ＋HindIII
消化物である。
【００８９】図８(c)は組換(rec)及び野生(wt)対立遺伝
子Hox-3.1の制限地図を示す。突然変異誘発ベクター及
び遺伝子座Hox-3.1の部分を、図２に使用したと同一の
記号で示す。この場合、AT配列は相同組換により組込ん
だ。鉛直方向の矢印は突然変異誘発プラスミドの3'末端
を示す。サザン分析で使用したプローブa及びbの位置も
示す。図８で使用した略記は、B, BamHＩ; D, DraＩ;
E, EcoRＩ; H, HindIII; S, SalＩ; X, XhoＩである。 ［実施例４］キメラ胚の生成 無傷の対立遺伝子Hox-3.1及び組換対立遺伝子を含み且
つ突然変異誘プローブの他のコピーを含まない2つの組
換E.S.クローンを使用して胚盤胞へのマイクロインジェ
クションを実施した。これらの細胞の核型は正常であっ
た。
【００９０】10〜15個の突然変異細胞を胚盤胞によりマ
イクロインジェクションした。保有母体への再移植後、
胚をp.c.9.5、10.5及び12.5日に集め、lac Zの発現を分
析した。これらの段階におけるHox-3.1の転写地図は予
めin situハイブリダイゼーション分析により決定され
ている(参考資料1)。転写物Hox-3.1は後期原腸形成段階
で最初に検出可能であり、動物の後部の全組織に分配さ
れている。より後期では、分配は徐々に空間に限定さ
れ、組織に特異的になる。p.c.12.5日の段階で、転写は
神経管の頸管領域で中心レベルに位置付けられる。胚形
成の過程でHox-3.1の転写分配は修飾を受ける。p.c.10.
5日の段階は遷移期間であると思われ、転写は2つの後部
領域と神経頸管とで同時に行われる。
【００９１】p.c.9.5及び10.5日のキメラ胚で、後部芽
の尾部分は強いβ-Gal活性を示し、一方、前部胸郭領域
又は頭部ではマーカーは検出されなかった(図9a)。後部
領域において、β-Galにより染色された細胞は全組織及
び全胚層で観察された。肢を形成する2つの芽の間で、
染色細胞は後部領域(図9c)と同様に表面外胚葉(図9b)の
制限されたゾーンに分配されており、神経管(図9b)には
細線又は筋状に分配されていた。これらの筋は神経管の
壁に不規則且つ非対称に分配されていた。Hox-3.1の転
写は神経管の閉鎖部付近の細胞の薄い層には検出されな
かった。これらの細胞はin situハイブリダイゼーショ
ン時に加えられた処理に抵抗できなかったものと思われ
る。神経外胚葉の細胞は非常に早く神経系の種々の部分
の一部を形成し、狭い横運動にしたがって径方向に移動
することが観察されている(参考資料21)。したがって、
これらの結果はこの観察に一致する。
【００９２】したがって、Lac Zの発現はp.c.9.5及び1
0.5日の胚の尾領域の全組織で相同遺伝子Hox-3.1の転写
の第１の部分を正確に示し、Hox-3.1の転写モードに関
する新しい情報を提供した。
【００９３】一方、Lac Zの発現は12.5日のキメラ胚の
神経管の頸管領域にも10.5日の胚の後部領域にも観察さ
れなかった。これはin situハイブリダイゼーション調
査から予想される結果ではなかった。神経管の非常に局
限されたゾーンで10.5日から観察されたHox-3.1の転写
の後期相は、β-Galの活性により立証されていなかっ
た。この結果については、Lac Zの発現がプロモーターH
ox-3.1の制御下にあるにも拘わらず、Hox-3.1の3'配列
がリポーター遺伝子内に不在であるという説明が可能で
ある。Hox-3.1のAUG開始コドンの3'配列が前部領域でHo
x-3.1の後期発現に影響したという可能性もある。「遺伝
子量」効果もこの結果を説明し得る。Drosophilaにおけ
る複数の相同遺伝子の自己活性化は、遺伝的に立証さ
れ、又はDNAとホメオボックス(homeobox)のタンパク質
との複合体の形成により示唆された。
【００９４】神経管におけるHox-3.1の転写の後期化合
物が類似の機構により維持されるならば、対立遺伝子の
不活化は神経外胚葉の細胞で主要な効果をもち得る。た
だ1つの対立遺伝子がタンパク質Hox-3.1を産生するの
で、活性化信号は2つのプロモーターで希釈される。2つ
の遺伝子座における自己不活化の還元はこうして転写開
始の完全な阻止を誘導し得る。これは、Lac Zの発現が1
0.5及び12.5日の胚の神経管の頸管領域で全く検出され
なかったことを説明し得る。 ［実施例５］胚細胞系における修飾の継代: トランスジェニック動物
の生産 標的挿入により加えられる修飾のF１及びF２における効
果がキメラの生殖後に観察された。胚細胞系における修
飾の継代が確認された。
【００９５】参考資料 1. Le Mouellic, H., Condamine, H. et Brulet, P. (1
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＧＮを示す。
【図２ａ】プラスミドｐＧＮから構築される分子ｐＧＭ
Ａを遺伝子Ｈｏｘ−３．１に比較して示す。このプラス
ミドは突然変異誘発プラスミドである。遺伝子Ｈｏｘ−
３．１のコーディング相の2部分を染色体１５上に黒い
四角で示す。Ｈｏｘ−３．１の対応配列をプラスミドｐ
ＧＮにクローニングした。（Ａ：ポリアデニル化信号、
Ｅｎｈ／Ｐｒｏ：エンハンサー−プロモーター）。０７
及び０８はＰＣＲで使用した２つのオリゴヌクレオチド
を示す。
【図２ｂ】プラスミドｐＧＮから構築される分子ｐＧＭ
Ｄを遺伝子Ｈｏｘ−３．１に比較して示す。このプラス
ミドは突然変異誘発プラスミドである。遺伝子Ｈｏｘ−
３．１のコーディング相の2部分を染色体１５上に黒い
四角で示す。Ｈｏｘ−３．１の対応配列をプラスミドｐ
ＧＮにクローニングした。（Ａ：ポリアデニル化信号、
Ｅｎｈ／Ｐｒｏ：エンハンサー−プロモーター）。０７
及び０８はＰＣＲで使用した２つのオリゴヌクレオチド
を示す。
【図３】ｐＧＮの構築に使用したプラスミドを示す。
【図４】ｐＧＮの構築に使用したプラスミドを示す。
【図５】ｐＧＮの構築に使用したプラスミドを示す。
【図６】ｐＧＮの構築に使用したプラスミドを示す。
【図７】トランスフェクトしたＥ．Ｓ．細胞上のポリメ
ラーゼ鎖反応（Ｐ．Ｃ．Ｒ．）法による相同組換検出を
示す。
【図８】ａは陽性個体クローン（L5及びF2）のサザン分
析を示し、ｂは陽性個体クローン（L5）及びE.S.細胞
（C.C.E.）のサザン分析を示す。ｃは組換（rec）及び
野生（wt）対立遺伝子Hox-3.1の制限地図を示す。突然
変異誘発ベクター及び遺伝子座Hox-3.1の部分を、図２
に使用したと同一の記号で示す。この場合、AT配列は相
同組換により組込んだ。縦方向の矢印は突然変異誘発プ
ラスミドの３’末端を示す。サザン分析で使用したプロ
ーブａ及びｂの位置も示す。図８で使用した略記は、B,
BamH I ; D, Dra I ; E, EcoR I ; H, Hind III ; S,
Sal I ; X, Xho I である。
【図９ａ】突然変異細胞を注入した胚を示す。
【図９ｂ】突然変異細胞を注入した胚を示す。
【図９ｃ】突然変異細胞を注入した胚を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．56，Ｐ．313−321 （Ｊａｎ．1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01K 67/027 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞のゲノムが、遺伝子の全体又は遺伝
    子の一部分により構成される異種DNA（挿入DNA とい
    う）を含んでおり、挿入DNA が、相補的DNA を含む内因
    性の遺伝子（受容体遺伝子という）に対して、挿入DNA
    及び相補的DNAの結合により挿入DNA 又は相補的DNA が
    機能的にされうるか又はその機能がより有効になるよう
    にゲノム内に位置している細胞（但し、挿入DNAは選択
    可能なマーカーをコードする遺伝子の部分から成るもの
    ではない）を含む、トランスジェニックまたはキメラ非
    ヒト動物。
  2. 【請求項２】 挿入DNA が、受容体遺伝子の調節配列の
    制御下で発現するコーディング配列、又は受容体遺伝子
    のコーディング配列の発現を可能にする調節配列を含む
    ことを特徴とする、請求項１に記載の動物。
  3. 【請求項３】 挿入DNA が、選択物質をコードする遺伝
    子のコーディング配列以外のコーディング配列で構成さ
    れることを特徴とする、請求項２に記載の動物。
  4. 【請求項４】 挿入DNA が、遺伝子の全体を含むことを
    特徴とする、請求項１に記載の動物。
  5. 【請求項５】 受容体遺伝子が、通常、細胞内で転写さ
    れない遺伝子であることを特徴とする、請求項１から４
    のいずれか一項に記載の動物。
  6. 【請求項６】 挿入DNA の挿入後受容体遺伝子が不活性
    であり、受容体遺伝子の発現の代わりに挿入DNA が発現
    することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項
    に記載の動物。
  7. 【請求項７】 挿入DNA が受容体遺伝子の一部と置換さ
    れていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか
    一項に記載の動物。
  8. 【請求項８】 受容体遺伝子が、挿入DNA の存在以外は
    天然の遺伝子環境にあることを特徴とする、請求項１か
    ら７のいずれか一項に記載の動物。
  9. 【請求項９】 ゲノムが、挿入DNA に隣接して、「介
    在」配列を含むことを特徴とする請求項１から８のいず
    れか一項に記載の動物。
  10. 【請求項１０】 該介在配列が選択物質またはマーカー
    の発現を可能にするプロモーターと共に選択物質をコー
    ドする配列を含むことを特徴とする請求項９ に記載の動
    物。
  11. 【請求項１１】 ゲノム中に少なくとも２つのコピーが
    存在する遺伝子の１つのコピーが、この遺伝子とは異な
    る遺伝子の挿入により不活性にされており、挿入遺伝子
    が不活化された内因性遺伝子の調節配列の制御下に挿入
    遺伝子の発現を可能にする位置に挿入されていることを
    特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載のト
    ランスジェニック動物。
  12. 【請求項１２】 遺伝子マーキングのために使われる、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の動物。
  13. 【請求項１３】 疾患に結びつけられる病理遺伝子の発
    現産物に対する活性があると予想される薬剤のスクリー
    ニング方法であって、請求項１から１１のいずれか一項
    に記載のトランスジェニック動物へ薬剤を投与し、挿入
    DNA が病理遺伝子又はそのフラグメントからなることを
    特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 挿入DNA 及び受容体遺伝子間の相同組
    換により生じる核酸であって、遺伝子の全体又は遺伝子
    の一部から構成され、受容体遺伝子に対して異種である
    挿入DNA と、受容体遺伝子とを含んでおり、挿入DNA
    が、相補的DNAを含む受容体遺伝子に対して、挿入DNA
    及び相補的DNA の結合により挿入DNA 又は相補的DNA が
    機能的にされうるか又はその機能がより有効になるよう
    に位置している前記核酸（但し、挿入DNA は選択可能な
    マーカーをコードする遺伝子の部分から成るものではな
    い）。
  15. 【請求項１５】 請求項１から１１のいずれか一項に記
    載のトランスジェニック動物の細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項１から１１のいずれか一項に記
    載のトランスジェニック動物から得られる細胞系。
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