ES2281897T3 - Procedimiento para obtener la expresion, o para mejorar el nivel de expresion de un gen. - Google Patents
Procedimiento para obtener la expresion, o para mejorar el nivel de expresion de un gen. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2281897T3 ES2281897T3 ES95107952T ES95107952T ES2281897T3 ES 2281897 T3 ES2281897 T3 ES 2281897T3 ES 95107952 T ES95107952 T ES 95107952T ES 95107952 T ES95107952 T ES 95107952T ES 2281897 T3 ES2281897 T3 ES 2281897T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- dna
- sequences
- cells
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 0 CC1CCC(*)CC1 Chemical compound CC1CCC(*)CC1 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Abstract
Procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión de un gen, denominado gen receptor, en el genoma de una célula eucariota, siendo el gen receptor susceptible de hacerse funcional o más eficaz cuando se recombina con un ADN de complemento, comprendiendo dicho procedimiento: - la introducción en unas células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, de un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de complemento, denominado ADN de inserción, y dos secuencias denominadas ¿flanqueantes¿ a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor; - comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen, y siendo heterólogo con respecto al gen receptor; - siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas para permitir por recombinación homóloga, la yuxtaposición del ADN de inserción en el gen receptor, de manera que el ADN de inserción haga funcional o mejore el funcionamiento del gen receptor.
Description
Procedimiento para obtener la expresión, o para
mejorar el nivel de expresión de un gen.
\global\parskip0.920000\baselineskip
La invención se refiere a un procedimiento de
sustitución específica de una copia de un gen presente en el genoma
de un organismo eucariota receptor mediante la integración de un gen
diferente del gen inactivado. Preferentemente, el gen receptor
estará presente en la célula huésped transfectada en por lo menos 2
ejemplares. El gen receptor se define como el gen en el que se
realizará la inserción de un gen diferente.
- La invención se refiere a un procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión de un gen, denominado gen receptor, en el genoma de una célula eucariota, siendo dicho gen receptor susceptible de volverse funcional o más eficaz cuando está recombinado con un ADN de complemento, comprendiendo dicho procedimiento:
- -
- la introducción en unas células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, de un vector que contiene una inserción, y dos secuencias denominadas "flanqueantes" a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor;
- -
- comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen, y siendo heterólogo con respecto al gen receptor;
- -
- siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas para permitir por recombinación homóloga, la yuxtaposición del ADN de inserción en el gen receptor, de manera que el ADN de inserción haga funcional o mejore el funcionamiento del gen receptor.
Más particularmente, la invención se refiere a
la producción de animales transgénicos no humanos en los cuales el
gen extraño se ha introducido de forma localizada para permitir a la
vez el mantenimiento de las funciones genéticas normales del animal
y la expresión del gen extraño bajo el control de promotores
endógenos.
Por "gen diferente o extraño" se entiende
cualquier secuencia nucleotídica que corresponda a la totalidad o a
una parte de un gen "extraño o diferente" del gen receptor, tal
como se encuentra normalmente en el genoma (ARN o ADN), o
corresponde asimismo a una secuencia modificada artificialmente del
gen normal o incluso a un fragmento de dicha secuencia.
La invención se refiere asimismo al
procedimiento de producción de estos animales transgénicos no
humanos.
En la producción de animales transgénicos, los
métodos convencionales utilizados para la introducción de secuencias
de ADN heterólogas en la progenie celular germinal, no permiten
controlar el sitio de integración del gen extraño en el genoma, ni
el número de copias introducido de esta forma. La integración del
gen extraño se realiza al azar y, en general, varias copias del gen
se integran a la vez, a veces en forma de tándem
cabeza-cola, variando el sitio de integración y el
número de copias integradas de un animal transgénico a otro.
Puede, por lo tanto, darse el caso de que genes
celulares endógenos, situados en el punto de inserción se inactiven
de esta manera, sin que esto se detecte fácilmente debido a las
numerosas inserciones al azar. Si el producto de dichos genes es
importante para el desarrollo del animal, éste se alterará de forma
importante. Por otra parte, la inserción aleatoria del gen extraño
puede realizarse en un sitio que no sea apropiado para la expresión
del gen. Además, el hecho de que varíe el sitio y el número de
inserciones de animal en animal, hace que la interpretación de los
estudios de expresión resulte extremadamente difícil.
Un problema importante que se presenta en la
producción de animales transgénicos es la obtención de la expresión
del gen extraño. De forma general, se han llevado a cabo dos tipos
de experimentos en los ratones.
Los genes introducidos en la progenie germinal
son:
- -
- o bien genes "completos", que comprenden secuencias codificadoras flanqueadas por sus propias secuencias reguladoras;
- -
- o bien genes compuestos, formados por la secuencia codificadora de un gen fusionada con la secuencia promotora de otro gen, perteneciendo incluso los dos fragmentos a veces a dos especies animales distintas.
Se ha podido de esta forma confirmar que la
especificidad de la expresión de los genes en tal o cual tejido
está determinada por su(s) secuencias(s)
reguladoras.
La elección del promotor apropiado para la
expresión del gen extraño en el animal transgénico posee, por tanto,
una importancia primordial.
Por otra parte, la mutagénesis dirigida de genes
murinos en células de origen embrionario se ha llevado a cabo
recientemente apelando a una técnica de "administración genética
dirigida" (gene targeting) (Thomas et al., 1987; Thompson
et al., 1989).
\global\parskip1.000000\baselineskip
En el primer caso, el gen murino HPRT ha sufrido
una mutación mediante inserción y reemplazamiento y, en el segundo
caso, se ha corregido un gen HPRT mutado. Thomson et al han
ampliado sus experiencias hasta la obtención de ratones quiméricos
y han constatado el paso de la modificación genética a la progenie
celular germinal.
En cada uno de los documentos citados, el sitio
preciso de la integración se ha realizado de forma dirigida
mediante recombinación homóloga entre, por una parte, las secuencias
exógenas que incluyen la mutación o corrección incluidas en un
vector bajo el control de un promotor exógeno, y, por otra parte, su
homólogo genómico. Siendo así, es preciso subrayar que los autores
anteriores han llevado a cabo sus experimentos en un gen específico
(HPRT), cuya activación mediante mutación se acompañaba de un
fenotipo detectable. La mutación dirigida descrita por Thomas et
al. tenía como efecto inactivar el gen HPRT y, en consecuencia,
hacía desaparecer el fenotipo detectable normalmente asociado con
el HPRT. El gen de selección Neo^{R}, bajo el control de un
promotor TK, se incorporaba por lo tanto al ADN de inserción para
permitir la selección de los transformantes. Hay que señalar que
los experimentos descritos en la técnica anterior implicaban una
selección, bien por el gen receptor (por ejemplo HPRT), o bien por
el gen de inserción (por ejemplo, Neo^{R}). El sitio de inserción
y/o el tipo de gen insertado está por tanto limitado a los genes que
confieren un carácter seleccionable, una selección directa.
Además, en la técnica anterior, las secuencias
exógenas en el vector sirven por tanto a la vez para dirigir el
sitio de integración y para introducir la modificación. A
consecuencia de la recombinación homóloga, el gen modificado se
encuentra siempre en su entorno genético normal.
Recordemos que un problema que se plantea
durante la producción de animales transgénicos es el peligro de
inactivar un gen celular endógeno que se encuentre en el punto de
inserción del gen extraño.
Según la función del producto del gen
inactivado, dicha inactivación puede conducir a alteraciones
fisiológicas o morfológicas importantes en el animal transgénico, o
bien podría incluso impedir su supervivencia.
En cambio, la inactivación de un gen podría
considerarse como ventajoso si el gen en cuestión codificara para
un receptor vírico u otro agente infeccioso.
Los inventores han estudiado la posibilidad de
evitar los inconvenientes descritos anteriormente y asociados, en
ciertos casos, a la posible inactivación de uno o varios genes
celulares endógenos de función importante durante la producción de
animales transgénicos no humanos.
La invención tiene por objeto un procedimiento
de sustitución o de inserción específica, especialmente mediante
administración dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción,
constituido por la totalidad de un gen, o por una parte de un gen,
susceptible de volverse funcional, o cuyo funcionamiento pueda
volverse más eficaz, cuando se recombina con un ADN de complemento
para poder entonces producir un gen recombinante completo en el
genoma de una célula eucariota que no es ni una célula germinal
humana ni una célula embrionaria humana, caracterizado porque
- -
- el sitio de inserción se encuentra en un gen seleccionado, denominado gen receptor, y que contiene el ADN de complemento, y porque
- -
- se transfectan células eucariotas que no son ni células germinales humanas ni células embrionarias humanas con un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueadoras", a ambos lados del ADN de inserción, homólogas respectivamente a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor,
- -
- siendo el ADN de inserción heterólogo con respecto al gen receptor, y
- -
- siendo las secuencias flanqueadoras seleccionadas de entre las que constituyen dicho ADN de complemento, y que permiten, mediante recombinación homóloga con secuencias correspondientes del gen receptor, la reconstitución de un gen recombinante completo en el genoma de la célula eucariota.
Según el procedimiento de la invención, dicho
ADN de inserción puede contener o bien una secuencia codificante o
bien una secuencia reguladora, estando entonces el procedimiento
caracterizado porque:
- -
- el sitio de inserción se encuentra en un gen seleccionado denominado gen receptor y porque
- -
- se transfectan células eucariotas con un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueantes" a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor,
- -
- siendo el ADN de inserción heterólogo con respecto al gen receptor, y
- -
- siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas con el fin de permitir por recombinación homóloga según el caso, o bien la expresión de la secuencia codificadora del ADN completo bajo el control de las secuencias reguladoras del gen receptor, o bien la expresión de una secuencia codificadora del gen receptor bajo el control de secuencias reguladoras del ADN de inserción.
Por ejemplo, el ADN de inserción puede contener
una secuencia codificadora desprovista de elemento de regulación,
en particular de un promotor que le es propio.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de producción de animales transgénicos no humanos,
caracterizado porque células E.S. son transfectadas en las
condiciones no humanas que se acaban de describir y seleccionadas
para el acontecimiento de recombinación homóloga, a saber la
integración correcta del gen extraño, inyectándose las células
transfectadas en embriones no humanos en un estadio en el que son
aptos para integrar las células transfectadas (por ejemplo, en el
estadio de blastocisto), reimplantándose los embriones a
continuación en una madre portadora no humana y acoplándose los
individuos quiméricos no humanos obtenidos al final de la
gestación, y en los cuales se constata la colonización por las
células E.S. de la progenie germinal. Si las células E.S. han
colonizado la progenie germinal del animal quimérico no humano, se
obtendrán animales transgénicos heterocigóticos no humanos para el
gen sustituido mediante unión (F_{1}) en la descendencia.
Es posible asimismo insertar el ADN de
inserción, transportado por el vector de la invención, en el huevo
no humano, poco tiempo después de la fecundación (es decir, menos de
24 horas). De esta forma, la inserción se efectúa cuando el huevo
no humano se encuentra en estado unicelular.
La invención se refiere asimismo a un plásmido
apto para efectuar la inserción dirigida de un gen recombinante
denominado gen de inserción en el genoma de una célula eucariota,
caracterizado porque contiene una inserción que comprende a su vez
el gen de inserción y dos secuencias denominadas
"flanqueadoras", a ambos lados del gen de inserción, homólogas
respectivamente a las dos secuencias genómicas que lindan con el
sitio de inserción deseado en el gen receptor.
El ADN de inserción puede ser un gen, o una
parte de un gen, heterólogo a la especie transfectada.
La invención se refiere asimismo a unos animales
transgénicos no humanos en los cuales al menos un gen endógeno, que
preferentemente está presente en el genoma con al menos dos
ejemplares, ha sido inactivado por la inserción de un gen que es
diferente del gen inactivado, siendo el gen de inserción insertado
en una posición que permite la expresión de este gen bajo el
control de las secuencias reguladoras del gen endógeno
inactivado.
El procedimiento de la invención permite por
tanto, gracias al fenómeno de recombinación homóloga, insertar de
una forma dirigida genes extraños, en particular secuencias
codificadoras desprovistas del promotor con el que normalmente se
asocian, en el genoma de un organismo eucariota, en un sitio que
permite su expresión bajo el control del promotor endógeno del gen
en el que se realiza la inserción, y en consecuencia, inactivar el
gen endógeno dirigi-
do.
do.
Según un modo de realización preferido de la
invención, el gen receptor localizado es un gen que está presente
en el genoma en por lo menos dos ejemplares. La utilización de la
técnica de electroporación (Ref. 11), asegura la introducción de
sólo una copia del gen extraño.
Según esta variante de la invención, la
inserción dirigida del gen de interés (es decir, del gen denominado
de inserción), tiene por efecto inactivar la única copia del gen
celular endógeno en el que se lleva a cabo la inserción y deja
intacta y funcional la(s) otra(s) copia(s) de
dicho gen.
De esta manera, el funcionamiento genético del
animal transgénico no humano no se altera o se altera poco por la
introducción del gen extraño, aún en el caso de que la inserción
inactive una única copia de un gen receptor esencial para el
desarrollo del animal. O bien, su desarrollo no se vería por tanto
afectado por la inserción del gen extraño o bien las alteraciones
menores posibles en el caso de la inactivación de un gen crítico no
serían probablemente letales para el animal no humano. Los efectos
de la inserción del gen extraño en el estado homocigoto, podrían
ser de cualquier tipo y se observarían en la segunda generación
(F_{2}), tras cruzamientos de individuos no humanos heterocigotos
(F_{1}) entre ellos.
Si, por el contrario, se desea la inactivación
de todas las copias de un gen, por ejemplo, en el caso en el que el
gen codifique para un receptor de agente infeccioso, se introducen
múltiples copias del gen extraño. El control de la cantidad
introducida puede asegurarse apelando a técnicas conocidas.
La inserción dirigida del gen extraño permite
por tanto su introducción en un sitio en el que su expresión está
bajo el control de las secuencias reguladoras del gen endógeno en el
que se realiza la inserción.
El procedimiento de la invención permite de este
modo insertar el gen extraño detrás de un promotor endógeno que
posee las funciones deseadas (por ejemplo, especificidad de
expresión en tal o cual tejido), y ello, llegado el caso, sin
inactivar las otras copias del gen receptor.
Según un modo de realización preferido, el ADN
de inserción, o el vector, contiene unas secuencias intercaladas
entre el ADN de inserción y las secuencias flanqueantes. Estas
secuencias pueden contener por ejemplo una secuencia que codifica
para un agente selectivo que permite la selección de los
transformantes y eventualmente un gen marcador por ejemplo el
LacZ.
Según un modo de realización particularmente
preferido de la invención, el ADN de inserción incluye entre las
secuencias flanqueadoras, por una parte, una secuencia de ADN
destinada a ser recombinada con el ADN de complemento en el gen
receptor para proporcionar un gen recombinante y, por otra parte,
una secuencia que codifica para un agente selectivo que permite la
selección de los transformantes y un promotor que permita la
expresión de un agente selectivo, codificando el gen receptor y el
gen recombinante para productos de expresión que no confieren
fenotipo seleccionable. Según esta variante, la inserción del
plásmido de la invención comprende, entre las secuencias
flanqueantes, por una parte una secuencia de ADN destinada a ser
recombinada con el ADN de complemento en el gen receptor, y, por
otra parte, una secuencia que codifica para un agente selectivo que
permite la selección de los transformantes y un promotor que permite
la expresión del agente selectivo, siendo la secuencia de ADN
destinada a ser recombinada con el ADN de complemento, distinta de
un gen que codifica para un agente selectivo.
De esta forma, la selección de los
transformantes es independiente por completo de la naturaleza del
gen receptor y del gen insertado, contrariamente a los
procedimientos descritos hasta ahora, en los cuales el gen insertado
o el gen receptor debía necesariamente codificar para un producto
de expresión que permitiera la selección de los transformantes. El
sistema desarrollado por los inventores permite una flexibilidad
total en lo que se refiere a la naturaleza del gen receptor y del
gen insertado o del gen formado por la recombinación homóloga. Los
inventores han constatado de una manera sorprendente que la
inserción de secuencias de tamaño importante (por ejemplo, de
aproximadamente 7,5 kb), no afecta a la frecuencia de recombinación
homóloga.
El efecto que puede tener la inserción de la
secuencia de ADN según este aspecto de la invención incluye, según
el tipo de secuencia insertada, por ejemplo, la sustitución de una
secuencia codificadora, la sustitución de una secuencia reguladora,
la inactivación o la reactivación de un gen mediante mutación o la
mejora de la tasa de expresión de un gen. Es posible, según la
invención, sustituir una fase codificadora o una parte de una fase
codificadora por una secuencia heteróloga que empieza en el codon de
iniciación del gen sustituido con el fin de que la expresión del
gen insertado sustituya por completo la expresión del gen
sustituido. Esto evita la formación de proteínas de fusión que
podría ser indeseable en un animal transgénico no humano.
Según este modo de realización de la invención,
el ADN de inserción puede incluir entre las secuencias flanqueadoras
una secuencia codificadora heteróloga desprovista de promotor,
siendo la secuencia codificadora distinta de un gen que codifica
para un agente de selección. El ADN de inserción puede incluir
además, corriente abajo de la secuencia codificadora y siempre
entre las secuencias flanqueadoras, un gen que codifica para un
agente de selección, asociado a un promotor que permite su
expresión en la célula diana.
De esta forma, la secuencia codificadora
heteróloga puede insertarse detrás de un promotor endógeno que posee
las propiedades deseadas, por ejemplo una cierta especificidad de
expresión, o clave de transcripción, etc., siendo la selectabilidad
de las células transformadas independiente por completo de la
expresión de la secuencia codificadora heteróloga. Este tipo de
construcción permite, por ejemplo, seleccionar los transformantes
aún en el caso de que el gen sustituido por la secuencia
codificadora heteróloga no se exprese normalmente en las células
diana. Esto resulta particularmente importante en la producción de
animales transgénicos no humanos a partir de células E.S.
("Embryonic Stem Cells"), ya que una proporción importante de
los genes permanece inactiva hasta un estado más avanzado de
desarrollo del animal no humano. El gen HOXC8 (conocido asimismo
con el nombre de Hox-3.1) es un ejemplo de este tipo
de gen. Por otra parte, si la secuencia codificadora codifica para
una proteína fácilmente detectable, por ejemplo, la
\beta-Gal, puede seguirse el desarrollo de la
clave de transcripción del gen endógeno sustituido. El vector pGN es
un ejemplo de este tipo de construcción.
Según otro modo de realización de la invención,
el ADN de inserción puede incluir una secuencia reguladora extraña.
El sitio de inserción y, por consiguiente, las secuencias
flanqueadoras, se seleccionan en función del objetivo deseado, a
saber, o bien la inserción de la secuencia reguladora extraña para
dar un efecto de "doble promotor" con la secuencia reguladora
endógena, o bien la sustitución de un promotor endógeno por el
promotor extraño. La secuencia codificadora que se encuentra bajo el
control de la secuencia reguladora puede ser endógena.
Otra posibilidad sería la inserción dirigida de
un ADN extraño que comprende a la vez una secuencia reguladora y
una secuencia codificadora. Es posible que la secuencia reguladora
sea la que se asocia de modo natural con la secuencia
codificadora.
El procedimiento de la invención emplea un
vector que contiene dos secuencias "flanqueadoras" a ambos
lados del gen extraño. Estas secuencias flanqueadoras tienen por lo
menos 150 pares de bases y son preferentemente inferiores a la
longitud del gen receptor. Es esencial que estas dos secuencias
flanqueadoras sean homólogas con las dos secuencias genómicas que
lindan con el sitio de inserción deseado. La secuencia flanqueadora
del vector que se encuentra corriente arriba del gen extraño a
introducir, es normalmente homóloga con la secuencia genómica
situada por el lado del extremo 5' del sitio de inserción. De la
misma manera, la secuencia flanqueadora del vector que se encuentra
corriente abajo del gen extraño, es normalmente homóloga con la
secuencia genómica que está situada en el lado del extremo 3' del
sitio de inserción.
\newpage
Es posible introducir secuencias
"intercaladoras" entre una u otra de las secuencias
flanqueadoras y el gen extraño, por ejemplo secuencias que permiten
la selección de los tranformantes, marcadores, secuencias que
permiten la clonación del vector, etc. ...
La posición de dichas secuencias intercaladoras
con respecto al gen extraño debe sin embargo ser elegida con el fin
de no impedir la expresión del gen extraño, particularmente de la
secuencia extraña de ADN codificadora extraña bajo el control del
promotor endógeno, o, inversamente, la secuencia codificadora de ADN
endógeno bajo el control de elementos de regulación extraños
aportados por la secuencia de inserción.
A pesar de la presencia de las secuencias
flanqueadoras, que alienta una recombinación homóloga, es posible
que algunas integraciones se realicen al azar. Con el fin de
comprobar que la inserción dirigida se ha producido bien en el
sitio diana y no en otro lugar, se utiliza la técnica de la
"Polymerase Chain Reaction" (PCR) ("Reacción en cadena de la
polimerasa") (véase Ref. 10) para amplificar la secuencia de ADN
del locus en el cual se realiza la inserción o debería haber tenido
lugar. De esta manera, sólo son seleccionados los clones
transformados tras una recombinación homóloga.
Las secuencias flanqueadoras del vector se
seleccionan evidentemente en función del sitio de inserción deseado
para que la recombinación homóloga pueda realizarse. Llegado el
caso, las secuencias flanqueadoras pueden comprender secuencias
réplicas del promotor endógeno y/o de las modificaciones en las
secuencias que preceden al codon de iniciación para mejorar la tasa
de traducción (secuencias corriente arriba) y secuencias réplicas
de las secuencias de terminación, especialmente sitios de
poliadenilación (secuencias corriente abajo).
El gen de inserción puede consistir en cualquier
gen de interés. Se citarán como ejemplos no limitativos, el gen
lacZ (como en el modelo descrito más adelante), los genes que
codifican para la interleucina o el interferón, los genes de
receptor, por ejemplo del ácido retinoico o beta-3
adrenérgico o de H.I.V., y genes conocidos por tener relación con
determinadas enfermedades, por ejemplo la miopatía, etc. ...
Las células eucariotas que no son ni células
germinales humanas ni células embrionarias humanas, transformadas
mediante el procedimiento de la invención están incluidas asimismo
por la presente solicitud.
Según una variante preferida de la invención,
las células eucariotas son cepas celulares embrionarias no humanas
(véanse las Refs. 14 y 15).
Efectivamente, una célula E.S. no humana mutada
puede ser inyectada en un embrión precoz el cual, después de su
reimplantación, podrá nacer bajo forma quimérica. Si la progenie
germinal es colonizada por la célula no humana mutada, el animal no
humano quimérico transmitirá la mutación a su descendencia. Se
podrán observar seguidamente en algunos individuos no humanos en
estado homocigótico los efectos de esta mutación en su desarrollo,
su comportamiento, su metabolismo, su patología, etc..
La figura 1 muestra el plásmido pGN, que forma
parte de la invención.
Las figuras 2 a y b muestran las moléculas pGMA
y pGMD construidas respectivamente a partir del plásmido pGN en
relación al gen HOXC8 (Hox-3.1) Estos plásmidos son
plásmidos de mutagénesis. Las dos partes del marco de lectura del
gen HOXC8 (Hox-3.1) se representan, en el cromosoma
15, con la secuencia "homeo" en negro. Las secuencias
correspondientes de HOXC8 (Hox-3.1) se han clonado
en el plásmido pGN.
(A: señal de poliadenilación; Enh/Pro:
potenciador-promotor).
07 y 08 representan los dos oligonucleótidos
utilizados en la PCR.
Las figuras 3 a 6 muestran los plásmidos
utilizados en la construcción del pGN.
La figura 7 ilustra la detección de
recombinación homóloga con la técnica de la Reacción de la
Polimerasa en Cadena (PCR) en células E.S. transfectadas.
La figura 8 (a) y (b) muestra análisis de
Southern de clones de individuos positivos (L5 y F2) y células E.S.
(C.C.E.).
El procedimiento de la invención tiene una
aplicación industrial muy amplia y puede variar según la naturaleza
del gen extraño introducido, por ejemplo para la producción de
animales transgénicos no humanos.
La genética de los mamíferos va a progresar de
manera considerable gracias a la posibilidad reciente de mutagenizar
específicamente cualquier gen, permitiendo así que se defina mejor
su función. Por esta tecnología que hace intervenir recombinación
homóloga y células E.S. no humanas, se aportarán informaciones
preciosas sobre oncogenes, factores de crecimiento, factores de
transcripción, etc., genes que atañen a materias muy actuales de la
investigación fundamental o aplicada. Una salida importante para la
investigación médica es la posibilidad de reproducir una enfermedad
humana cuya determinación genética es conocida (ciertas enfermedades
humanas con patología, tal como la miopatía de Duchesne), con el
objeto de estudiar mejor los mecanismos e investigar una
terapéutica.
Aplicando el procedimiento de la invención, un
gen conocido como responsable de una cierta enfermedad se inserta
de manera dirigida en el genoma de una célula E.S no humana. El
animal transgénico no humano que se produce a continuación presenta
un modelo útil de esta enfermedad.
Si es necesario, y como se describió
anteriormente, los funcionamientos genéticos normales pueden ser
mantenidos sustancialmente, a pesar de la inserción del gen
extraño.
Otra aplicación del procedimiento de la
invención consiste en el marcado genético de animales no humanos.
Esta aplicación consiste en insertar un gen de inserción que se
detecta fácilmente, por ejemplo el gen lacZ, y que puede por tanto
desempeñar el papel de un marcador celular. De esta forma, se
facilitan estudios de filiación, por ejemplo, en animales no
humanos de concurso y la raza puede continuar.
La inserción del gen lacZ como gen de inserción
posibilita asimismo estudios de promotor. Gracias a la posibilidad
de detectar la actividad \beta-galactosidasa, la
actividad y especificidad de diferentes promotores endógenos pueden
ser estudiadas haciendo diana en diferentes sitios en el mismo o
distintos tipos de células. Los mismos estudios se podrán efectuar
en un organismo entero, durante el desarrollo o en el estado adulto,
utilizando las técnicas de animales no humanos quiméricos o
transgénicos.
Los inventores han constatado de forma
sorprendente que la frecuencia de recombinación homóloga no está
afectada por la inserción de fragmentos de tamaño importante, por
ejemplo el LacZ. Esta observación ha sugerido a los inventores que
la técnica de recombinación homóloga se adaptaría bien a la
inserción de otros genes heterólogos que son de tamaño
importante.
La invención prevé asimismo la aplicación del
procedimiento de sustitución o de inserción específico para la
terapia génica.
Gracias a la posibilidad de modificar el genoma
de un animal no humano, el procedimiento de la invención puede por
tanto utilizarse asimismo como "terapia génica". Las
utilizaciones más evidentes consistirían en inactivar los genes de
receptores de agentes infecciosos (virus o bacterias) o tóxicos. Si
esta mutagénesis resultara letal, sería necesario restablecer la
función perdida sin restablecer la sensibilidad a los agentes
perjudiciales. Un gen modificado que codifica para tal receptor
podría ser reintroducido en la célula mutada, a menos que la
modificación pueda ser provocada mediante la recombinación homóloga.
Esta modificación del patrimonio genético conferiría al animal no
humano una inmunidad contra la enfermedad considerada.
Este protocolo puede intervenir también en el
cuadro de auto-injerto. Células, enfermas o sanas y
que no son ni células germinales humanas ni células embrionarias
humanas, tomadas de un paciente, podrían ser cuidadas e
inmunizadas, y después ser reimplantadas en el mismo individuo.
La técnica de la invención se presta también a
los estudios de actividad de productos farmacéuticos que se presume
tienen una actividad con respecto a productos de expresión de un gen
patológico relacionado con una enfermedad. En este caso, el gen de
inserción está constituido por el gen patológico o un fragmento de
éste y se administra al animal transgénico no humano el producto
farmacéutico a ensayar con el objeto de evaluar su actividad sobre
la enfermedad.
La invención se ilustrará haciendo referencia al
plásmido pGN y a su utilización en la inserción dirigida de un gen
extraño (lacZ, que codifica para el enzima
\beta-galactosidasa de E. coli) en el
genoma de una célula E.S. de ratón. El gen lacZ se escogió debido
al hecho de que su expresión puede detectarse fácilmente y es
simplemente a título ilustrativo.
La fase codificadora del enzima
\beta-galactosidasa de E. coli (lacZ;
1-3057) fusionada con una secuencia genómica
(7292-3) del gen murino Hox.3-1 (Ref
1), empieza por el codon de iniciación de dicho gen. Efectivamente,
la secuencia que precede al codon de iniciación de HOXC8
(Hox-3.1) es idéntica a la secuencia consenso
observada en los vertebrados (Ref 2), que permite de este modo una
tasa de traducción mejor de la \beta-galactosidasa
en las células de los vertebrados. Al gen lacZ le sigue una señal
de poliadenilación, por ejemplo del virus SV 40, como la mayoría de
los genes eucariotas, con el fin de estabilizar los ARN
mensajeros.
La actividad de la
\beta-galactosidasa de E. coli, que es
funcional en las células eucariotas, puede detectarse de distintas
formas. Las células que expresan el gen lacZ toman una coloración
azul, después de fijación, en presencia de X-Gal,
que es un sustrato de la \beta-galactosidasa (Ref.
3). Un nuevo sustrato, el FDG (fluororosceína
di-\beta-galactopiranósido),
permite detectar y dosificar la actividad
\beta-gal, mientras se conservan las células
vivas (Ref. 4). Las células que expresan lacZ acumulan un producto
fluorescente y pueden aislarse mediante un clasificador de células
o FACS (fluorescence-activated cell sorter,
Clasificador de células activadas por fluorescencia).
La unidad de transcripción del gen de
resistencia a la neomicina proviene en su mayor parte del plásmido
pRSV neo (Ref 5). El LTR (long terminal repeat, repetición terminal
larga) del virus del sarcoma de Rous proporciona en numerosas
células eucariotas secuencias activadora y promotora muy potentes
(Ref. 6). Del transposón bacteriano Tn5, proceden un promotor
activo en E. coli y la fase que codifica el enzima
fosfotransferasa (Ref. 7), al que sigue la señal de poliadenilación
del virus SV40. El mismo gen bajo el doble control de los promotores
RSV y Tn5 puede conferir a las bacterias la resistencia a la
neomicina o a la kanamicina, y a las células eucariotas la
resistencia al G418.
Mediante una simple mutuación puntual, la unidad
B de las secuencias activadoras (enhancer, potenciadoras) de la
cepa PyEC F9.1 del virus del Polioma se ha convertido en mucho más
activa en distintos tipos de células, y en particular en las
células de carcinoma embrionario (EC) (Ref 8). Dos copias de dicho
potenciador Py F9.1 se insertaron en tándem en el plásmido pGN,
corriente arriba del LTR-RSV, y en la orientación
"promotor tardío" de la región reguladora del Polioma.
Con el fin de mejorar la tasa de traducción de
la fosfotransferasa, la secuencia que precede al codon de iniciación
se ha modificado durante una mutagénesis por oligonucleótido. Así,
la secuencia T T C G C A U G se ha convertido en G C A C C
A U G, que corresponde mucho mejor a la secuencia consenso de
iniciación de la traducción en los vertebrados (Ref. 2).
Las mejoras aportadas a la unidad de
transcripción del gen de resistencia a la neomicina se han podido
estimar transfectando células cepas embrionarias (ES) de ratón. Con
una molaridad igual en plásmido, una construcción con los enhancer
F9.1 produjo 7,5x más de clones resistentes al G418 que el pRSV neo
y de 2 a 3x más que el pMC1 Neo descrito por Capecchi et al
(ref. 13). De nuevo, el número de clones aumentó 60x, es decir 450x
con relación al pRSV neo, modificando la secuencia de iniciación de
la traducción. La recombinación homóloga puede constituir un suceso
bastante raro, según las condiciones experimentales que se apliquen
(por ej, 1/1.000 para HPRT, ref 13). Un vector que presenta una
eficacia de selección elevada resulta, por lo tanto de gran
utilidad, tanto más cuanto que las condiciones de electroporación
dan lugar principalmente a la integración de una sola copia.
El plásmido pGN contiene, además, un origen de
replicación bacteriano del tipo co1E1, pBR322, que permite las
clonaciones y las preparaciones en E. coli.
Por último, un sitio de clonación múltiple
(M.C.S.), sintetizado in vitro, que únicamente contiene
sitios de corte únicos en pGN, se insertó corriente arriba de lacZ,
con el fin de facilitar las utilizaciones de dicho plásmido.
Las secuencias plasmídicas "flanqueadoras"
que provocan la recombinación homóloga se añaden a los extremos del
plásmido pGN después de la linearización del plásmido corriente
arriba de lacZ, por un sitio del MCS (véase fig 2). En este caso,
las secuencias flanqueadoras escogidas son homólogas a las
secuencias cromosómicas procedentes de HOXC8
(Hox-3.1), que deben posteriormente intervenir en la
recombinación homóloga.
La figura 2 sitúa la molécula construida a
partir del plásmido pGN con respecto al gen HOXC8
(Hox-3.1). En este caso, una recombinación entre
las secuencias plasmídicas y cromosómicas de HOXC8
(Hox-3.1) llevaría a una inserción al principio de
la fase codificante de dicho gen y, por lo tanto, a su inactivación
total.
El plásmido pGN reúne varias ventajas para esta
metodología, que es aplicable a cualquier gen. Pudiendo ser
bastante raro el suceso de la recombinación homóloga, (del orden de
1 por 1000 integraciones no homólogas), es necesario poder analizar
muchos clones cuya resistencia al G418 sea suficientemente intensa
como para que se exprese en cualquier parte del genoma. Las
modificaciones aportadas a la unidad de transcripción de la
fosfotransferasa responden perfectamente a estos problemas. El
método de mutagénesis por recombinación homóloga equivale a
inactivar un gen por una inserción o una sustitución, pero el
plásmido pGN presenta la ventaja suplementaria de poder sustituir
la expresión de la \beta-galactosidasa por la del
gen mutado. Por último, el MCS facilita las clonaciones de
fragmentos genómicos.
Los plásmidos intermediarios se numeran según su
etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
1ª
etapa
Inserción de un engarce Xho I en el sitio Bgl I
de pRSV neo, satisfecha por el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa de E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
2ª
etapa
Inserción de un engarce Cla I en el sitio Nde I
de p1, satisfecha por la polimerasa Klenow.
\newpage
3ª
etapa
Inserción de un potenciador Py F9.1 Pvu
II-Pvu II aislado por un sitio único, Acc I, en el
sitio Cla I de p2. Selección de un clon que contenga dos
potenciadores orientado en el sentido "promotor tardío".
\vskip1.000000\baselineskip
4ª
etapa
Los dos enzimas, que dan lugar a "extremos
libres", pueden ser unidos directamente. Esta deleción elimina
el intrón del antígeno t de SV 40, que no es muy útil, y disminuye
de forma apreciable el tamaño de la unidad de transcripción de la
fosfotransferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
5ª
etapa
Inserción de un engarce Xho I en el sitio Bam HI
del plásmido pCH 110 (Pharmacia), satisfecha por la polimerasa
Klenow.
\vskip1.000000\baselineskip
6ª
etapa
La región 3' de la fase codificadora de la
\beta-galactosidasa, seguida por la señal de
poliadenilación del virus SV 40 se aísla del plásmido p5 por los
sitios Xho I-Aat II y se clona en el plásmido p4 por
los mismos sitios.
\vskip1.000000\baselineskip
7ª
etapa
La región 5' de la fase codificadora de la
\beta-galactosidasa se aísla del plásmido pMC 1871
(Pharmacia) por los sitios Pst I-Sac I y se clona
en el vector KS- (Stratagene) por los mismos sitios.
\vskip1.000000\baselineskip
8ª
etapa
Una secuencia genómica del gen HOXC8
(Hox-3.1), clonada en el vector KS-, se purifica por
digestiones sucesivas mediante el enzima Sac I, y a continuación
por la nucleasa Mung bean y, por último, por el enzima Apa I. Esta
inserción se fusiona con la parte 5' de la fase codificadora de la
\beta-galactosidasa mediante clonación en el
plásmido p7 digerida por Apa I-Sma I. La proteína
fusionada de este modo contiene el codon de iniciación de la
traducción del gen HOXC8 (Hox-3.1), seguido de la
fase codificadora de la \beta-galactosidasa
(comprobada a continuación mediante secuenciación).
9ª
etapa
La fusión HOXC8
(Hox-3.1)-5' lacZ se aísla del
plásmido p8 por los sitios Apa I-Sac I y se clona en
el plásmido p6 por los mismos sitios. Esta clonación tiene por
efecto reconstituir la fase codificadora de la
\beta-galactosidasa en su totalidad.
\vskip1.000000\baselineskip
10ª
etapa
El gen de resistencia a la neomicina (promotor
bacteriano y fase codificadora de la fosfotransferasa) se aisla del
pRSV neo por los sitios Hind III-Eco RI y se clona
en el vector KS+ (Stratagene).
\vskip1.000000\baselineskip
11ª
etapa
La secuencia de iniciación de la traducción de
la fosfotransferasa es modificada para que sea idéntica a la
secuencia consenso observada en los vertebrados y permitir de esta
forma una tasa superior de iniciación de la traducción y, por lo
tanto una resistencia acrecentada al G418 para las células de
mamíferos. La modificación crea de igual modo un sitio Apa LI que
permite controlar la eficacia de la mutagénesis.
Se sintetiza un oligonucleótido (Gene Assembler,
Pharmacia) (CTTGTTCAATCATGGTGCACGATCCTCA) que comprende una
región de desapareamiento con la secuencia del pRSV neo (subrayada)
y se fosforila seguidamente por la polinucleótido quinasa del
bacteriófago T4. Se prepara una matriz monocatenaria del plásmido
p10 gracias al origen f1 del plásmido KS+ y se hibridiza con el
oligonucleótido de mutagénesis. La segunda hebra se sintetiza y
repara por la polimerasa Klenow y la ADN ligasa del bacteriófago
T4. Después de la transformación de las bacterias, los clones
mutados se localizan mediante el oligonucleótido marcado con
^{32}P. La mutagénesis se ha comprobado digiriendo mediante Apa
LI, así como mediante secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
12ª
etapa
Un fragmento que contiene la secuencia
modificada de iniciación de la traducción del gen de resistencia a
la neomicina, se aísla del plásmido p11 por los enzimas Hind
III-EagI y se clona en el plásmido p9 por los
mismos sitios.
\vskip1.000000\baselineskip
13ª
etapa
Se sintetizan dos oligonucleótidos
complementarios (Gene Assembler, Pharmacia), y después se
fosforilan. Después de apareamiento, el MCS se clona en los sitios
Apa I-Sac II del plásmido p12, gracias a sus
extremos cohesivos.
El sitio de clonación múltiple se ha comprobado
asimismo mediante secuenciación.
Las secuencias flanqueadoras que se utilizan se
han seleccionado en función del sitio de inserción deseado (por
ejemplo, HOXC8 (Hox-3.1), véase Fig 2 a y b pGMA y
pGMD).
En la construcción del plásmido de mutagénesis
pGMD, se han clonado dos brazos del ADN homólogo en el locus HOXC8
(Hox-3.1), en los sitios Apa I-Nsi I
y Nsi I-Sac II del vector pGN. El brazo 5' empieza
en el sitio Sac II (CCGCGG) en el nucleótido 219 del ADNc c21 de
HOXC8 (Hox-3.1). Este fragmento abarca 6,8 kb en 5'
hasta el primer sitio BamHI. El brazo 3' empieza en el sitio Apa 1
(GGGCCC) en el nucleótido 885 del ADNc c21. Este fragmento abarca
1,5 kb en 3' hasta el primer sitio PstI. Se ha insertado un engarce
NsiI en el sitio BamHI del fragmento 5' y en el sitio PstI del
fragmento 3'. Los brazos 5' y 3' se han clonado en el vector pGN en
los sitios Nsi I-Sac II y Apa I-Nsi
I, respectivamente. Se ha publicado la secuencia del ADNc de HOXC8
(Hox-3.1) c21 (ref 1).
El plásmido de mutagénesis se lineariza mediante
digestión con Nsi I antes de electroporación de células E.S. Sus
extremos están formados por los dos brazos genómicos clonados en los
sitios Apa I-Nsi I y Nsi I-Sac II
del vector pGN.
El plásmido pGMD no presenta señal de
poliadenilación después del gen de resistencia pero, en cambio,
presenta una secuencia rica en AU responsable de una degradación
selectiva de ARNm, insertada en la secuencia del intrón de HOXC8
(Hox-3.1) del plásmido.
Otro plásmido de mutagénesis, pGMA, presenta
idéntica estructura que el pGMD pero contiene las señales de
poliadenilación y de terminación de transcripción del SV40 y no
presenta la secuencia AU de degradación de ARNm corriente abajo del
gen Neo^{r}. Estas modificaciones tenían como objetivo reducir la
proporción de transcritos de Neo^{r} en clones procedentes de la
integración al azar. Por el contrario, clones procedentes de
episodios de recombinación homóloga entre pGMD y un locus HOXC8
(Hox-3.1), deberían tener un crecimiento inalterado
durante la selección con G418, eliminándose la secuencia AT de
degradación de ARNm por el mismo procedimiento de recombinación, o
empalmándose con el intrón HOXC8 (Hox-3.1).
En las etapas experimentales que siguen, se ha
seguido el protocolo descrito por Thompson et al. 1989 para
la producción de animales quiméricos.
El método descrito por Thompson et al
1989, se ha utilizado para transfectar células embrionarias de
ratón. La utilización de la técnica de electroporación asegura la
introducción de una sola copia del gen extraño (lacZ) por célula.
Después de transfección, se han aislado varios clones que expresan
la \beta-galactosidasa.
Los plásmidos de mutagénesis pGMD y pGMA se han
linearizado e introducido mediante electroporación en células E.S.
con el fin de favorecer la inserción sólo de una copia en el genoma
(ref 11).
Las transfecciones iniciales se han realizado
para comparar la eficacia de localización del HOXC8
(Hox-3.1) de los plásmidos pGMA y pGMD (véase tabla
I).
La progenie celular E.S. "C.C.E." (ref 16)
se ha mantenido de una forma continua sobre cepas nutrientes
fibroblásticas (ref 17). Para los experimentos I y II, se
sometieron a electroporación 1,5 x 10^{7} células E.S. en 1,5 ml
de HeBS (ref 11) a 200 V, con 40 mg de plásmido linearizado, y
seguidamente distribuidas en cuatro cajas de cultivo (diámetro de
100 mm). Para el experimento III, el choque se ha llevado a cabo en
las mismas condiciones pero una cuarta parte de las células se han
distribuido en cuatro placas de 24 pocillos. Al día siguiente, se
añadieron 250 \mug ml^{-1} de G418. Cada transfección dio lugar
a aproximadamente 2.400 clones con pGMA y a aproximadamente 1.000
clones con pGMD.
El número medio de clones de células E.S.
resistentes al G418 en cada conjunto se indica en la tabla I, así
como el número de conjuntos que dan un resultado positivo con la
técnica PCR Un resultado positivo significa que se ha podido
observar una banda de 1,6 Kb en un gel de agarosa coloreado con
bromuro de etidio (véase figura 7). Se indica entre paréntesis (fig
8) el número de conjuntos que dan una señal positiva después de un
análisis Southern de la mezcla PCR y de hibridación de una sonda
específica que no contenía las secuencias de los iniciadores.
Se llevó a cabo la PCR sobre 10^{5} células de
un conjunto de 250 clones de la transfección II (véase vía D de la
figura 7). En las otras vías, se analizaron a la vez cuatro
conjuntos de la transfección III mezclando aproximadamente 4 x
5.000 células. Los iniciadores 07 y 08 utilizados en la PCR rodean
la secuencia 3' HOXC8 (Hox-3.1) del plásmido de
mutagénesis (fig 2). El fragmento de 1,6 Kb que abarca esta
secuencia 3' únicamente puede amplificarse en el caso de una
recombinación homóloga. Las vías 2, 3 y D ilustran resultados
positivos.
El ADN de los clones E.S. se preparó en el
momento de la réplica sobre filtro, utilizando el método
"boiling-proteinase K digestion boiling" (ref
18). Se llevaron a cabo 40 ciclos de amplificación (40 segundos a
94ºC, 1 minuto a 60ºC, 7 minutos a 72ºC), en una mezcla de reacción
de 100 \mul, que contenía 67 mM Tris-HCL (pH 8,6),
16,7 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 6,7 mM MgCl_{2}, 10 mM
de 2-mercaptoetanol, gelatina al 0,01% (p/v), 200
\muM dATP, dTTP y dCTP, 100 \muM dGTP, 100 \muM
7-deaza dGT, 600 ng de cada iniciador (07:
AACTTCCCTCTCTGCTATTC y 08 : CAGCAGAAACATACAAGCTG) y 3U de
polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus), cubierto con 100 \mul de
parafina. La mitad de la mezcla de reacción se aplicó a un gel de
agarosa al 0,7% coloreado con bromuro de etidio. El marcador de
tamaño es un digerido Eco RI + Hind III de ADN lambda.
Se aislaron a partir de los conjuntos positivos,
utilizando pipetas, tres clones independientes de células E.S. que
contenían el HOXC8 (Hox-3.1) mutado (identificado
por PCR). Se examinó su ADN mediante análisis de Southern después
de digestión con los enzimas de restricción indicados en la figura
8, con el fin de confirmar la localización específica y de hacer la
distinción entre los loci recombinados y salvajes. Se utilizaron
dos sondas diferentes en el análisis del extremo 3' de los loci
HOXC8 (Hox-3.1) en los clones mutados y en las
células E.S. no mutadas que actuaban como testigos (fig 8 c). La
primera sonda "a" estaba contenida en las secuencias HOXC8
(Hox-3.1) del plásmido de mutagénesis y demostraba
el número de integraciones de vector y sus enlaces físicos. Uno de
los tres clones recombinados contenía además una copia del plásmido
integrada al azar (fig. 8a, clon F_{2}). La segunda sonda
"b" que no estaba contenida en el vector de mutagénesis
distinguía entre los alelos HOXC8 (Hox-3.1)
recombinados y salvajes (fig. 8 b). El locus recombinado HOXC8
(Hox-3.1) presentaba, con las dos sondas, la imagen
de hibridación esperada a partir de los mapas de restricción del
vector de mutagénesis y del locus intacto. Además, se confirmó la
existencia de dos dominios de recombinación en el brazo 3' del
vector por la presencia o ausencia de la secuencia AT en el locus
HOXC8 (Hox-3.1) recombinado (por ejemplo, fig. 8,
clon L5). El extremo 5' del locus HOXC8 (Hox-3.1) se
analizó asimismo para el episodio de recombinación homóloga. Se
utilizaron enzimas de restricción que no presentaban sitios en la
secuencia HOXC8 (Hox-3.1) 5' de 6,8 Kb del vector
de mutagénesis, en la digestión de los ADN de los clones
recombinados. Estos ADN se sometieron seguidamente a una
electroforesis en un campo sometido a pulsos para diferenciar los
fragmentos de peso molecular elevado. Un análisis de Southern de
este gel indicó asimismo los alelos recombinados correctamente y
los alelos HOXC8 (Hox-3.1) salvajes, utilizando una
sonda que presentaba una secuencia corriente arriba del plásmido de
mutagénesis.
Los análisis de Southern demostraron que un
alelo del gen HOXC8 (Hox-3.1) se recombinó tal como
estaba previsto. La recombinación homóloga era equivalente a un
doble "crossing-over" (entrecruzamiento) entre
los brazos genómicos del plásmido de mutagénesis y las secuencias
cromosómicas homólogas (Fig. 2).
En los clones recombinantes, el gen lacZ se puso
bajo el control de las secuencias promotoras y reguladoras del
Hox-3.1, corriente arriba del codon AUG, pero las
señales 3' de maduración del ARNm procedían del SV40. En estos
clones recombinados, la expresión de lacZ no se podía detectar
mediante coloración con \beta-Gal, lo que es
coherente con la ausencia de transcripción de HOXC8
(Hox-3.1) en las células E.S. determinada mediante
análisis de protección de ARNasa. La actividad de
\beta-Gal se podía inducir en ciertas células
después de 3 ó 4 días de cultivo en presencia de 5.10^{-7} M de
ácido retinoico, condiciones que se sabe son inductoras de la
transcripción de HOXC8 (Hox-3.1) (ref 19).
Utilizando el vector de mutagénesis pGMA, que
presenta una homología total de 8,3 Kb de ADN con el locus HOXC8
(Hox-3.1), se sustituyó un fragmento de 120 pares de
bases por una inserción de 7,2 Kb. La frecuencia de esta
sustitución localizada (1/900) es comparable a la obtenida
recientemente (1/1000) con HPRT (ref 13) o con En-2
(1/260) (ref 20), siendo sin embargo en estos últimos casos el
fragmento heterólogo insertado de un tamaño mucho menos importante
(1,1 y 1,5 Kb respectivamente). Sorprendentemente, se constató que
con el vector pGMD se pudo obtener una frecuencia de recombinación
homóloga muy elevada (1/40). La eliminación de las señales 3' de
maduración del ARNm y la adición de la secuencia de degradación del
ARNm al gen de resistencia a la neomicina, ha tenido como
consecuencia reducir por 2,4 el número total de clones resistentes
al G418 (tabla I). La relación de localización específica era casi
10 veces más elevada (900/40). En los experimentos con pGMD, se ha
debido afectar incluso el mecanismo de recombinación homólogo. Una
explicación posible de estos resultados sería que una secuencia AT
de 51 pares de bases podría proporcionar, in vivo, un bucle
abierto en el plásmido de mutagénesis a causa de su temperatura de
fusión más baja. Si las secuencias HOXC8 (Hox-3.1)
vecinas del pGMD pueden verse influenciadas por esta apertura, a
cada lado de la región AT, podrían reaccionar de una manera más
eficaz, en estado monocatenario, con el locus cromosómico HOXC8
(Hox-3.1). El modelo de recombinación mitótica en
la levadura sugiere que se iniciaría por un intercambio de hebras de
este tipo, aunque el mecanismo de recombinación homólogo permanece
desconocido en los eucariotas más complejos.
La figura 8 muestra los resultados del análisis
de Southern efectuado en clones de individuos positivos (L5 y F2) y
en células E.S. (C.C.E.).
Las sondas utilizadas únicamente se hibridan con
las secuencias HOXC8 (Hox-3.1) incluidas en el
vector (a) o excluídas del vector de mutagénesis (b). La imagen de
hibridación del locus HOXC8 (Hox-3.1) recombinado
(triángulos abiertos) se distingue claramente del locus salvaje
(triángulos negros). Los asteriscos indican las bandas de
hibridación de una copia del plásmido que se ha integrado al azar.
El marcador de tamaño es un digesto Eco RI + Hind III de ADN
lambda.
La figura 8 (c) muestra los mapas de restricción
de los alelos HOXC8 (Hox-3.1) recombinados (rec) y
salvajes (wt). Las partes del vector de mutagénesis y del locus
HOXC8 (Hox-3.1) se indican con los mismos símbolos
que los utilizados en la figura 2. En este caso, la secuencia AT se
ha integrado mediante recombinación homóloga. La flecha vertical
indica el extremo 3' del plásmido de mutagénesis. La localización de
las sondas "a" y "b" utilizadas en el análisis de
Southern, se indica también. Las abreviaturas utilizadas en la
figura 8 son las siguientes: B, Bam HI; D, Dra I, E, Eco RI; H,
HInd III; S, Sal I; X, Xho I.
Se realizó una microinyección en unos
blastocistos con dos clones E.S. recombinantes que contenían un
alelo HOXC8 (Hox-3.1) intacto y un alelo
recombinado, no conteniendo estos clones ninguna otra copia del
plásmido de mutagénesis. Los cariotipos de estas células eran
normales.
Se microinyectaron de diez a quince células
mutadas por blastocisto. Tras reimplantación en las madres
portadoras, se recuperaron los embriones a los 9,5, 10,5 y 12,5
días después de la conjugación, y se analizaron para la expresión
de lacZ. La clave de transcripción de HOXC8
(Hox-3.1) en estos estadios se había determinado
previamente mediante análisis de hibridación in situ (ref
1). Los transcritos HOXC8 (Hox-3.1) son detectables
la primera vez en el estadio de gastrulación tardía y se reparten
en todos los tejidos de la parte posterior del animal. Más tarde,
el reparto se limita progresivamente en el espacio y se hace
específico del tejido. En el estadio de 12,5 días después de la
conjugación, la transcripción se localiza en la región cervical del
tubo neural, a nivel del corazón. Durante la embriogénesis, el
reparto de la transcripción de HOXC8 (Hox-3.1)
sufre, por tanto, modificaciones. El estadio de 10,5 días después
de la conjugación parece ser un período de transición, teniendo
lugar la transcripción a la vez en las dos regiones posteriores y en
el tubo neural cervical.
En embriones quiméricos de 9,5 y 10,5 días post
conjugación, la parte caudal en la yema posterior presentaba una
actividad \beta-Gal intensa, mientras que el
marcador no se ha detectado nunca en la región torácica anterior o
en la cabeza (Fig. 9a). En la región posterior, se han observado
células coloreadas por \beta-Gal en todos los
tejidos y de todas las capas embrionarias. Entre las dos yemas que
dan lugar a los miembros, se repartían células coloreadas en zonas
restringidas, en el ectodermo superficial (Fig. 9b), así como en
las regiones posteriores (Fig. 9c) y, en forma de líneas estrechas o
estrías, en el tubo neural (Fig. 9 b). Estas estrías presentaban un
reparto irregular y asimétrico en la pared del tubo neural. La
transcripción de HOXC8 (Hox-3.1) no se detectó en
la capa delgada de células hacia el cierre del tubo neural. Estas
células no han resistido quizás a los tratamientos aplicados al
realizar la hibridación in situ. Se ha observado que las
células del ectodermo neural forman parte, muy temprano, de partes
distintas del sistema nervioso y se desplazan en una dirección
radial, según unos movimientos laterales estrechos (ref 21). Estos
resultados son por tanto coherentes con esta observación.
La expresión de LacZ ha ilustrado por tanto
correctamente la primera parte de la transcripción del homeogen
HOXC8 (Hox-3.1), es decir, en todos los tejidos de
las regiones caudales de los embriones de 9,5 y 10,5 días post
conjugación, y ha proporcionado nuevas informaciones con respecto al
modo de transcripción de HOXC8 (Hox-3.1).
Por el contrario, la expresión de LacZ no se ha
observado en las regiones cervicales del tubo neural de embriones
quiméricos de 12,5 días, ni en la región anterior de embriones de
10,5 días; esto no constituía el resultado esperado a partir de los
estudios de hibridación in situ. La fase ulterior de
transcripción de HOXC8 (Hox-3.1) observada a partir
del día 10,5 en las zonas muy localizadas del tubo neural no se
evidenciaba por la actividad de \beta-Gal. Una
explicación posible de este resultado sería que, aunque la expresión
del LacZ esté bajo el control del promotor HOXC8
(Hox-3.1), las secuencias 3' del HOXC8
(Hox-3.1) están ausentes en el gen reportador. Es
posible que las secuencias 3' del codon de iniciación AUG del HOXC8
(Hox-3.1) tengan influencia en la expresión tardía
de HOXC8 (Hox-3.1) en el dominio anterior. Un efecto
de "dosificación génica" podría también explicar este
resultado. La autoactivación de varios homeogenes en
Drosophila se ha demostrado genéticamente o se ha sugerido
por la formación de complejos entre el ADN y las proteínas de las
homeosecuencias.
Si el componente tardío de la transcripción de
HOXC8 (Hox-3.1) en el tubo neural se mantiene
mediante un mecanismo parecido, la inactivación de un alelo podría
tener un efecto dominante en las células del ectodermo neural. Ya
que un alelo sólo produciría la proteína HOXC8
(Hox-3.1), la señal de activación se diluiría sobre
los dos promotores. La reducción de la autoinactivación en los dos
loci podría conducir de este modo a una detención total de la
iniciación de la transcripción. Esto podría explicar porqué no se ha
detectado ninguna expresión de LacZ en la región cervical del tubo
neural de embriones de 10,5 y 12,5 días.
Los efectos en F_{1} y en F_{2} de la
modificación aportada por la inserción dirigida se han observado
después de reproducción de las quimeras. Se ha constatado el paso de
la modificación a la progenie celular germinal.
1. Le Mouellic, H., Condamine, H.
y Brûlet, P. (1988). Genes & Development.
2, 125-135.
2. Cavenir, D.R. (1987).
Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361.
3. Sanes, J.R. Rubenstein, J.L.R.
y Nicolas, J.F. (1986) EMBO J. 5,
3133-3142.
4. Nolan, G.P., Fiering, S.,
Nicolas, J.F. y Herzenberg, L.A. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2603-2607.
5. Gorman, C., Padmanabhan, R. y
Howard, B.H. (1983). Science. 221,
661-553.
6. Gormann, C.M., Merlino, G.T.
Willingham, M.C. Pastan, I. y Howard, B. H.
(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
6777-6781.
7. Southern, P.J. y Berg, P.
(1982) J. Mol. Appl. Genet 1,
327-341.
8. Herbomel, P., Bourachot, B. y
Yaniv, M. (1984). Cell. 39,
653-662.
9. Robertson, E.J. (1987).
Teratocarcinomas and embruonic stem cells: A practical approach. IRL
Press, Oxford.
10. Kahn, A. (1988).
Médecine/Sciences 4, 515-518.
11. G. Chu, Hayakawa H.,
Berg. P. (1987) Nucleic Acid Research 15, Nr.
3, 1311-1326.
12. Thompson, S., Clarke, A.R.,
Pow, A.M., Hooper, M.L., Melton, D.W., (1989)
Cell, 56, 313-321.
13. Thomas, K.R., Capecchi, M.R.,
(1987) Cell, 51 503-512.
14. Evans, M.J., Kaufmann, M.H.
(1981) Nature, 292, 154-155.
15. Robertson, E.J., (1986)
Trends in Genetics, 9-13.
16. Robertson, E., Bradley, A.,
Kuehn, M. & Evans, M. Nature 323,
445-448 (1986).
17. Robertson, E.J. in Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells (ed. Robertson, E.J.)
71-112 (IRL, Oxford, 1987).
18. Kim, H.S. & Smithies, O.
Nucleic Acids Res. 16, 8887-8903
(1988).
19. Breier, G., Bucan, M.,
Francke, U., Colberg-Poley, A.M. &
Gruss, P. EMBO J. 5, 2209-2215
(1986).
20. Joyner, A.L., Skarnes, W.C.
& Rossant, J. Nature 338, 153-156
(1989).
21. McKay, R. D. G. Cell 58,
815-821 (1989).
Claims (4)
1. Procedimiento para obtener la expresión, o
para mejorar la tasa de expresión de un gen, denominado gen
receptor, en el genoma de una célula eucariota, siendo el gen
receptor susceptible de hacerse funcional o más eficaz cuando se
recombina con un ADN de complemento, comprendiendo dicho
procedimiento:
- -
- la introducción en unas células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, de un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de complemento, denominado ADN de inserción, y dos secuencias denominadas "flanqueantes" a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor;
- -
- comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen, y siendo heterólogo con respecto al gen receptor;
- -
- siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas para permitir por recombinación homóloga, la yuxtaposición del ADN de inserción en el gen receptor, de manera que el ADN de inserción haga funcional o mejore el funcionamiento del gen receptor.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el ADN de inserción está constituido por una parte por un
gen, por ejemplo una secuencia reguladora.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el gen receptor es un gen que normalmente no está
transcrito en la célula eucariota.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el gen receptor no presenta un fenotipo para
seleccionar.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8903630A FR2646438B1 (fr) | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
FR8903630 | 1989-03-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2281897T3 true ES2281897T3 (es) | 2007-10-01 |
Family
ID=9379875
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07007307T Expired - Lifetime ES2381039T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión, de un gen |
ES95107952T Expired - Lifetime ES2281897T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Procedimiento para obtener la expresion, o para mejorar el nivel de expresion de un gen. |
ES90905207T Expired - Lifetime ES2081977T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Procedimiento de sustitucion especifica de una copia de un gen presente en el genoma receptor mediante la integracion de un gen diferente de aquel en el que se ha realizado la integracion. |
ES95107951T Expired - Lifetime ES2375345T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Animal transgénico y procedimiento de cribado de productos farmacéuticos. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07007307T Expired - Lifetime ES2381039T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión, de un gen |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES90905207T Expired - Lifetime ES2081977T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Procedimiento de sustitucion especifica de una copia de un gen presente en el genoma receptor mediante la integracion de un gen diferente de aquel en el que se ha realizado la integracion. |
ES95107951T Expired - Lifetime ES2375345T3 (es) | 1989-03-20 | 1990-03-19 | Animal transgénico y procedimiento de cribado de productos farmacéuticos. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US6528313B1 (es) |
EP (4) | EP1826215B1 (es) |
JP (3) | JP3059481B2 (es) |
AT (4) | ATE529506T1 (es) |
DE (5) | DE95107951T1 (es) |
DK (4) | DK1826215T3 (es) |
ES (4) | ES2381039T3 (es) |
FR (2) | FR2646438B1 (es) |
HK (1) | HK150696A (es) |
LU (1) | LU91371I2 (es) |
NL (1) | NL300297I2 (es) |
SG (2) | SG49110A1 (es) |
WO (1) | WO1990011354A1 (es) |
Families Citing this family (194)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6048729A (en) | 1987-05-01 | 2000-04-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
FR2646438B1 (fr) * | 1989-03-20 | 2007-11-02 | Pasteur Institut | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
US6689610B1 (en) * | 1989-08-22 | 2004-02-10 | University Of Utah Research Foundation | Cells and non-human organisms containing predetermined genomic modifications and positive-negative selection methods and vectors for making same |
EP0747485B1 (en) * | 1989-11-06 | 1998-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Production of proteins using homologous recombination |
US5272071A (en) * | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
JP3501286B2 (ja) * | 1989-12-22 | 2004-03-02 | アプライド リサーチ システムズ,エーアールエス ホールディング ナームロゼ ベノートスハップ | 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 |
EP0539573A4 (en) * | 1991-05-15 | 1993-12-29 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous dna targeting |
WO1993004169A1 (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
NZ245015A (en) | 1991-11-05 | 1995-12-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production |
US5641670A (en) * | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
US6054288A (en) * | 1991-11-05 | 2000-04-25 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
US5968502A (en) | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
US6063630A (en) | 1991-11-05 | 2000-05-16 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy |
US6270989B1 (en) | 1991-11-05 | 2001-08-07 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and delivery |
US6692737B1 (en) | 1991-11-05 | 2004-02-17 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
US6531124B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-03-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
US6670178B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-12-30 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
EP0656747A4 (en) * | 1992-08-21 | 1997-05-07 | Univ California | COMPOSITION AND METHOD FOR CHANGING DNA SEQUENCES BY HOMOLOGOUS RECOMBINATION. |
DE4228162C1 (de) | 1992-08-25 | 1994-01-13 | Rajewsky Klaus Dr | Verfahren zum Ersetzen homologer Genabschnitte aus Säugern in der Keimbahn von nicht-menschlichen Säugern |
DK0695361T4 (da) | 1993-04-21 | 2010-03-22 | Univ Edinburgh | Ekspression af heterologe gener ifølge en målekspressionsprofil |
US5830729A (en) | 1996-04-18 | 1998-11-03 | Institut Pasteur | I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells |
US6924146B1 (en) * | 1997-02-21 | 2005-08-02 | Sigrid Wattler | Method of constructing vectors for homologous recombination directed mutagenesis |
EP0981637B1 (en) | 1997-03-14 | 2005-05-25 | Biogen Idec Inc. | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
DE69842225D1 (de) | 1997-04-16 | 2011-05-26 | Millennium Pharm Inc | Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der selektiv an ein cysteinreiches sekretiertes Protein (CRSP) bindet |
CA2797661C (en) | 1997-04-24 | 2015-06-16 | University Of Washington | Targeted gene modification by parvoviral vectors |
AU757930B2 (en) * | 1997-12-01 | 2003-03-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Optimization of cells for endogenous gene activation |
US6746852B1 (en) | 1998-05-08 | 2004-06-08 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | AGS proteins and nucleic acid molecules and uses thereof |
US6733991B1 (en) | 1998-05-08 | 2004-05-11 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | AGS proteins and nucleic acid molecules and uses therefor |
DE19857609A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Hannelore Ehrenreich | Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen |
EP2301947A3 (en) | 1999-02-26 | 2011-11-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Secreted proteins and uses thereof |
US7291714B1 (en) | 1999-06-30 | 2007-11-06 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycoprotein VI and uses thereof |
GB9918319D0 (en) * | 1999-08-03 | 1999-10-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
PT1210428E (pt) | 1999-08-23 | 2015-07-21 | Genetics Inst Llc | Pd-1, um recetor para b7-4 e suas utilizações |
GB0018876D0 (en) * | 2000-08-01 | 2000-09-20 | Applied Research Systems | Method of producing polypeptides |
CA2417432C (en) | 2000-09-01 | 2010-11-02 | The Center For Blood Research, Inc. | Modified polypeptides stabilized in a desired conformation and methods for producing same |
UA83458C2 (uk) | 2000-09-18 | 2008-07-25 | Байоджен Айдек Ма Інк. | Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf) |
US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
BR0115728A (pt) | 2000-11-28 | 2003-09-23 | Wyeth Corp | Análise da expressão de ácidos nucléicos kiaa e polipeptìdeos úteis no diagnóstico e tratamento de cáncer de próstata |
AU2002241524A1 (en) | 2000-11-28 | 2002-06-11 | Wyeth | Expression analysis of FKBP nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
EP1349918B1 (en) | 2000-12-06 | 2014-08-06 | Anthrogenesis Corporation | Method of collecting placental stem cells |
US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
MXPA03005406A (es) | 2000-12-20 | 2003-09-25 | Hoffmann La Roche | Conjugados de eritropoyetina. |
ATE505204T1 (de) | 2000-12-20 | 2011-04-15 | Hoffmann La Roche | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
PA8536201A1 (es) | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
CA2856986C (en) | 2001-02-14 | 2019-08-13 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placental stem cells for use in the treatment of neurological or renal diseases and disorders |
ES2522526T3 (es) | 2001-02-14 | 2014-11-14 | Anthrogenesis Corporation | Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma |
US8231878B2 (en) | 2001-03-20 | 2012-07-31 | Cosmo Research & Development S.P.A. | Receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
US8981061B2 (en) | 2001-03-20 | 2015-03-17 | Novo Nordisk A/S | Receptor TREM (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof |
JP2005508608A (ja) | 2001-03-22 | 2005-04-07 | アボット ゲーエムベーハー ウント カンパニー カーゲー | 問題遺伝子に対して特異的な抗体を発現するトランスジェニック動物及びその使用 |
CA2442066C (en) | 2001-04-02 | 2005-11-01 | Wyeth | Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor |
WO2002083855A2 (en) | 2001-04-16 | 2002-10-24 | Wyeth Holdings Corporation | Novel streptococcus pneumoniae open reading frames encoding polypeptide antigens and uses thereof |
FR2824844B1 (fr) * | 2001-05-18 | 2003-09-19 | Genoway | Procede de clonage par double selection et vecteurs pour ce procede |
EP1406917A4 (en) * | 2001-06-15 | 2007-11-14 | New Century Pharmaceuticals | HUMAN ANALYTICAL MODELS FOR THE EVALUATION OF MEDICINAL PRODUCTS AND FOR TOXICOLOGICAL AND IMMUNOGENIC EXAMINATIONS |
IL160307A0 (en) | 2001-08-31 | 2004-07-25 | Univ Rockefeller | Phosphodiesterase activity and regulation of phosphodiesterase 1-b-mediated signaling in brain |
EP1525323B1 (en) | 2001-11-09 | 2015-01-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pgc-1beta, a novel pgc-1 homologue and uses therefor |
EP2301343A1 (en) | 2002-02-13 | 2011-03-30 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta and uses and methods of treatment using said cells |
US7153685B2 (en) | 2002-03-11 | 2006-12-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Tamoxifen and 4-hydroxytamoxifen-activated system for regulated production of proteins in eukaryotic cells |
US20100151556A1 (en) * | 2002-03-15 | 2010-06-17 | Cellectis | Hybrid and single chain meganucleases and use thereof |
WO2009095742A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-06 | Cellectis | New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof |
JP2005520519A (ja) * | 2002-03-15 | 2005-07-14 | セレクティス | ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼならびにその使用 |
US7498171B2 (en) | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
EP1572950B1 (en) | 2002-06-17 | 2012-10-10 | Thrasos, Inc. | Single domain tdf-related compounds and analogs thereof |
AU2003265556A1 (en) | 2002-08-20 | 2004-03-11 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer |
US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
CN1717177A (zh) | 2002-11-26 | 2006-01-04 | 人类起源公司 | 细胞治疗剂、细胞治疗单元及其用于治疗的方法 |
CA2802143C (en) | 2003-01-14 | 2018-06-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Sparc encoding polynucleotide as a cancer therapy sensitizer |
US20060206949A1 (en) | 2003-01-28 | 2006-09-14 | Sylvain Arnould | Custom-made meganuclease and use thereof |
US7875272B2 (en) | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
US8790637B2 (en) | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
WO2005001079A2 (en) | 2003-06-27 | 2005-01-06 | Ethicon, Incorporated | Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells |
US9592258B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-03-14 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells |
US11311574B2 (en) | 2003-08-08 | 2022-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
EP3222715A1 (en) | 2003-08-08 | 2017-09-27 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
BRPI0414887A (pt) | 2003-09-29 | 2006-12-12 | Warren Pharmaceuticals Inc E T | métodos de tratamento, prevenção, retardo do inìcio ou redução dos efeitos de citocinas pró-inflamatórias em um mamìfero e de tratamento, prevenção, retardo do inìcio de uma condição associada com um efeito de citocinas pró-inflamatórias em um mamìfero, e, composição farmacêutica |
KR20060120652A (ko) | 2003-10-07 | 2006-11-27 | 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 | 난소암의 확인, 평가, 예방 및 치료를 위한 핵산 분자 및단백질 |
US7951532B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-05-31 | Children's Hospital Medical Center | Method of screening a midkine modulating agent |
EP1734811A4 (en) * | 2003-11-21 | 2009-03-25 | Revivicor Inc | USE OF INTERFERENCE RNA IN TRANSGENIC ANIMAL PRODUCTION |
US7371539B2 (en) | 2003-12-03 | 2008-05-13 | President And Fellows Of Harvard College | Targeted polypeptide degradation |
SI1696947T1 (sl) * | 2003-12-19 | 2014-05-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih |
CA2571218C (en) | 2004-06-17 | 2015-11-03 | William D. Carlson | Tdf-related compounds and analogs thereof |
US7288385B2 (en) | 2004-06-25 | 2007-10-30 | The Salk Institute For Biological Studies | Increasing life span by modulation of Smek |
GB0426146D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Bioxell Spa | Therapeutic peptides and method |
JP5425400B2 (ja) | 2004-12-23 | 2014-02-26 | エシコン・インコーポレイテッド | 産褥由来細胞を用いた脳卒中および他の急性神経変性障害の治療 |
AU2006236521A1 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for modulating bone formation and mineralization by modulating KRC activity |
KR101419729B1 (ko) * | 2005-07-26 | 2014-07-17 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현 |
WO2007030820A2 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | The Johns Hopkins University | Manipulation of regulatory t cell and dc function by targeting neuritin gene using antibodies, agonists and antagonists |
JP2009508596A (ja) | 2005-09-19 | 2009-03-05 | ヒストジェニックス コーポレイション | 細胞支持基材及びその調製方法 |
PT2497780E (pt) | 2005-09-20 | 2015-08-20 | Thrasos Innovation Inc | Compostos relacionados com tdf e seus análogos |
US20070072795A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Anton Haselbeck | Treatment of neurodegenerative disorders |
US9388382B2 (en) | 2005-10-05 | 2016-07-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells |
PE20070771A1 (es) | 2005-10-13 | 2007-08-11 | Anthrogenesis Corp | Inmunomodulacion mediante el uso de celulas madres de la placenta |
WO2009134714A2 (en) * | 2008-04-28 | 2009-11-05 | Precision Biosciences, Inc. | Fusion molecules of rationally-designed dna-binding proteins and effector domains |
WO2007060495A1 (en) * | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
AU2006325710B2 (en) | 2005-12-16 | 2012-05-17 | Ethicon, Inc. | Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation |
US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
EP2471904B1 (en) | 2005-12-29 | 2018-10-24 | Celularity, Inc. | Placental stem cell populations |
DE102006004008A1 (de) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich | Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose |
WO2007112005A2 (en) | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme |
GB0607063D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Cellcentric Ltd | Compositions and methods for epigenetic modification of nucleic acid sequences in vivo |
US7875453B2 (en) | 2006-06-14 | 2011-01-25 | Bioe Llc | Differentiation of multi-lineage progenitor cells to hepatocytes |
DK2054074T3 (da) | 2006-08-04 | 2014-11-03 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Modificeret erythropoietin |
PL2049663T3 (pl) | 2006-08-11 | 2015-08-31 | Dow Agrosciences Llc | Homologiczna rekombinacja za pośrednictwem nukleazy z palcami cynkowymi |
US9580515B2 (en) | 2006-08-21 | 2017-02-28 | Zensun (Shanghai) Science & Technology, Co., Ltd. | Neukinase, a downstream protein of neuregulin |
PL2078073T3 (pl) | 2006-10-12 | 2013-12-31 | Ethicon Inc | Komórki pochodzące z nerki oraz sposoby ich zastosowania w leczeniu i regeneracji tkanki |
CA2666789C (en) | 2006-10-18 | 2016-11-22 | Yong Zhao | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
NZ597779A (en) | 2007-02-12 | 2013-07-26 | Anthrogenesis Corp | Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells |
KR101886610B1 (ko) * | 2007-06-01 | 2018-08-09 | 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
EP2167666A2 (en) | 2007-06-29 | 2010-03-31 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Methods for altering the genome of a monocot plant cell |
AR067536A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea |
CL2008002053A1 (es) | 2007-07-17 | 2009-05-22 | Hoffmann La Roche | Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion. |
WO2009010107A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hannelore Ehrenreich | Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis |
US9200253B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-12-01 | Anthrogenesis Corporation | Method of producing erythrocytes |
SI2203176T1 (sl) | 2007-09-28 | 2015-04-30 | Anthrogenesis Corporation | Tumorska supresija z uporabo humanega perfuzata placente in intermediarnih naravnih celic ubijalk, pridobljenih iz humane placente |
EP2214708A4 (en) | 2007-10-26 | 2011-01-12 | Centocor Ortho Biotech Inc | VECTORS, HOST CELLS, METHODS OF PRODUCTION AND USES |
US20110119779A1 (en) * | 2007-12-10 | 2011-05-19 | Aliva Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination |
WO2009101625A2 (en) | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Method for searching for homing endonucleases, their genes and their targets |
WO2009114321A2 (en) | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Precision Biosciencs, Inc. | Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering |
EP2281050B1 (en) | 2008-04-14 | 2014-04-02 | Sangamo BioSciences, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
KR101987351B1 (ko) | 2008-09-30 | 2019-06-10 | 아블렉시스, 엘엘씨 | 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물 |
RU2015130665A (ru) | 2008-11-19 | 2018-12-24 | Антродженезис Корпорейшн | Амниотические адгезивные клетки |
CN107028983A (zh) | 2008-12-19 | 2017-08-11 | 德普伊新特斯产品有限责任公司 | 肺部疾病和病症的治疗 |
US10179900B2 (en) | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
WO2010080985A1 (en) | 2009-01-08 | 2010-07-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for induced brown fat differentiation |
EP2396347B1 (en) | 2009-02-11 | 2017-04-12 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
US8722034B2 (en) | 2009-03-26 | 2014-05-13 | Depuy Synthes Products Llc | hUTC as therapy for Alzheimer's disease |
US8772008B2 (en) * | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
WO2010141606A2 (en) * | 2009-06-02 | 2010-12-09 | Davinci Biosciences Llc | Human gonadal stem cells |
EP2261242A1 (en) | 2009-06-10 | 2010-12-15 | Universite Catholique De Louvain | Aspartate-N-acetyltransferase enzyme, diagnostic method and therapeutic method |
DK2462230T3 (en) * | 2009-08-03 | 2015-10-19 | Recombinetics Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED RE-MODIFICATION |
US20110064717A1 (en) * | 2009-08-20 | 2011-03-17 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Homing endonuclease genes and their targets |
IN2012DN02532A (es) | 2009-09-23 | 2015-08-28 | Davinci Bioscineces Llc | |
US8323972B2 (en) | 2009-09-30 | 2012-12-04 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Mammary artery derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration |
US8889413B2 (en) | 2009-09-30 | 2014-11-18 | DePuy Synthes Products, LLC | Mammary artery derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration |
WO2011088163A1 (en) | 2010-01-14 | 2011-07-21 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for modulating skeletal remodeling and patterning by modulating shn2 activity, shn3 activity, or shn2 and shn3 activity in combination |
US10429384B2 (en) | 2010-01-22 | 2019-10-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of metabolic disorders |
WO2011094181A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of bone-related cancers using placental stem cells |
TWI518325B (zh) | 2010-02-04 | 2016-01-21 | 自治醫科大學 | 對alk抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療 |
US9255259B2 (en) * | 2010-02-09 | 2016-02-09 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
EP2553100B1 (en) | 2010-03-31 | 2017-07-05 | Ablexis, LLC | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
PT2556145T (pt) | 2010-04-07 | 2016-10-25 | Anthrogenesis Corp | Angiogénese usando células estaminais placentárias |
US8383793B2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-26 | St. Jude Children's Research Hospital | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer resistant to anaplastic lymphoma kinase (ALK) kinase inhibitors |
WO2012004671A2 (en) | 2010-07-07 | 2012-01-12 | Cellectis | Meganucleases variants cleaving a dna target sequence in the nanog gene and uses thereof |
JP5996533B2 (ja) | 2010-07-13 | 2016-09-21 | アントフロゲネシス コーポレーション | ナチュラルキラー細胞を生成させる方法 |
WO2012010976A2 (en) | 2010-07-15 | 2012-01-26 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a dna target sequence in the tert gene and uses thereof |
JP5735650B2 (ja) | 2010-09-14 | 2015-06-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | Peg化エリスロポエチンを精製するための方法 |
EP2625278A1 (en) | 2010-10-08 | 2013-08-14 | Regents of the University of Minnesota | A method to increase gene targeting frequency |
WO2012092485A1 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules |
AU2012262273B2 (en) | 2011-06-01 | 2017-09-14 | Celularity Inc. | Treatment of pain using placental stem cells |
US8969519B2 (en) | 2011-09-13 | 2015-03-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for brown fat induction and activity using FNDC5 |
WO2013053076A1 (en) | 2011-10-10 | 2013-04-18 | Zensun (Shanghai)Science & Technology Limited | Compositions and methods for treating heart failure |
GB2496375A (en) | 2011-10-28 | 2013-05-15 | Kymab Ltd | A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof |
GB201122047D0 (en) | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
AU2012358810B2 (en) | 2011-12-23 | 2018-03-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Detection of human umbilical cord tissue-derived cells |
US9663568B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-05-30 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1 |
ES2640268T3 (es) | 2012-02-15 | 2017-11-02 | Novo Nordisk A/S | Anticuerpos que se unen a y bloquean un receptor desencadenante expresado en células mieloides 1 (TREM-1) |
US9550830B2 (en) | 2012-02-15 | 2017-01-24 | Novo Nordisk A/S | Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) |
EP2711428A1 (en) | 2012-09-21 | 2014-03-26 | Lonza Biologics plc. | Site-specific integration |
PL2887959T3 (pl) | 2012-08-23 | 2019-04-30 | Agensys Inc | Koniugaty leków i przeciwciał (adc), które wiążą białka 158p1d7 |
US20160272980A1 (en) | 2012-11-16 | 2016-09-22 | Total Marketing Services | Method for targeted modification of algae genomes |
WO2014102688A1 (en) | 2012-12-27 | 2014-07-03 | Cellectis | New design matrix for improvement of homology-directed gene targeting |
EP2953635A4 (en) | 2013-02-05 | 2016-10-26 | Anthrogenesis Corp | NATURAL KILLER CELLS FROM PLAZENTA |
WO2014138921A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Apotex Inc. | Enhanced liquid formulation stability of erythropoietin alpha through purification processing |
WO2015017552A1 (en) | 2013-08-01 | 2015-02-05 | Agensys, Inc. | Antibody drug conjugates (adc) that bind to cd37 proteins |
GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
KR20240029114A (ko) | 2014-07-17 | 2024-03-05 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발 |
WO2016040499A1 (en) | 2014-09-09 | 2016-03-17 | Matrix Genetics, Llc | Targeted mutagenesis in spirulina |
US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
EP3268038B1 (en) | 2015-03-09 | 2021-05-05 | Agensys, Inc. | Antibody drug conjugates (adc) that bind to flt3 proteins |
WO2016166268A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Cellectis | Engineering animal or plant genome using dna-guided argonaute interference systems (dais) from mesophilic prokaryotes |
EP3091076A1 (en) | 2015-05-07 | 2016-11-09 | Limagrain Europe | Polynucleotide responsible of haploid induction in maize plants and related processes |
US20210106661A1 (en) | 2015-10-29 | 2021-04-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using pm20d1 and n-lipidated amino acids |
US10584363B2 (en) | 2016-06-03 | 2020-03-10 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods of producing and using single-stranded deoxyribonucleic acids and compositions for use in practicing the same |
CN109415427A (zh) | 2016-07-15 | 2019-03-01 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法 |
WO2018073391A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Cellectis | Targeted gene insertion for improved immune cells therapy |
EP3684919A1 (en) | 2017-10-19 | 2020-07-29 | Cellectis | Targeted gene integration of nk inhibitors genes for improved immune cells therapy |
SG11202005952TA (en) | 2017-12-29 | 2020-07-29 | Hoffmann La Roche | Process for providing pegylated protein composition |
US20200323993A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-10-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for providing pegylated protein composition |
ES2905105T3 (es) | 2017-12-29 | 2022-04-07 | Hoffmann La Roche | Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada |
AR117566A1 (es) | 2018-04-02 | 2021-08-18 | Bristol Myers Squibb Co | Anticuerpos anti-trem-1 y sus usos |
WO2020214690A1 (en) | 2019-04-15 | 2020-10-22 | Qwixel Therapeutics | Fusion protein composition(s) comprising targeted masked type i interferons (ifna and ifnb) and an antibody against tumor antigen, for use in the treatment of cancer |
US20240058466A1 (en) | 2019-10-04 | 2024-02-22 | TAE Life Sciences | Antibody Compositions Comprising Fc Mutations and Site-Specific Conjugation Properties For Use In Treating Cancer, Immunological Disorders, and Methods Thereof |
WO2022067214A2 (en) | 2020-09-28 | 2022-03-31 | Vestaron Corporation | Mu-diguetoxin-dc1a variant polypeptides for pest control |
WO2022159414A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-28 | University Of Rochester | Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction |
CA3217862A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Radius Pharmaceuticals, Inc. | Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor |
AU2022292462A1 (en) | 2021-06-18 | 2023-12-07 | Nammi Therapeutics, Inc. | FUSION PROTEIN COMPOSITION(S) COMPRISING MASKED TYPE I INTERFERONS (IFNα AND IFNβ) FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER AND METHODS THEREOF |
WO2023122805A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Vestaron Corporation | Sorbitol driven selection pressure method |
WO2024026406A2 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Vestaron Corporation | Next Generation ACTX Peptides |
EP4360451A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Limagrain Europe | Mutants for haploid induction |
WO2024091824A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Ada Forsyth Institute, Inc. | Differentiation and reprogramming of chondrocyte |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0074808A3 (en) * | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
US4748119A (en) * | 1983-09-19 | 1988-05-31 | Alexander Rich | Process for altering and regulating gene expression |
US4736866A (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic non-human mammals |
DE3752347T2 (de) * | 1986-05-20 | 2002-09-26 | Gen Hospital Corp | Verfahren zur pharmakokinetischen Studie der Insulin-Expression mit nicht-menschlichem Transgen-Säugetier |
EP0832981A1 (en) * | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
ATE132266T1 (de) * | 1987-05-01 | 1996-01-15 | Stratagene Inc | Mutagenesetest durch verwendung von nicht menschlichen lebewesen, die test-dns-sequenzen enthalten |
US5650503A (en) | 1988-11-11 | 1997-07-22 | Ppl Therapeutics (Scotland) Limited | Genetic construct of which protein coding DNA comprises introns and is designed for protein production in transgenic animals |
FR2646438B1 (fr) | 1989-03-20 | 2007-11-02 | Pasteur Institut | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
US5574205A (en) * | 1989-07-25 | 1996-11-12 | Cell Genesys | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
EP0747485B1 (en) | 1989-11-06 | 1998-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Production of proteins using homologous recombination |
US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
WO1993004169A1 (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
JPH05174148A (ja) * | 1991-12-26 | 1993-07-13 | Sony Corp | 動き検出回路 |
WO1993016177A1 (en) | 1992-02-11 | 1993-08-19 | Cell Genesys, Inc. | Homogenotization of gene-targeting events |
US5639618A (en) | 1994-05-13 | 1997-06-17 | Plurion, Inc. | Method of isolating a lineage specific stem cell in vitro |
-
1989
- 1989-03-20 FR FR8903630A patent/FR2646438B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-19 DE DE95107951T patent/DE95107951T1/de active Pending
- 1990-03-19 SG SG1996006082A patent/SG49110A1/en unknown
- 1990-03-19 DK DK07007307.7T patent/DK1826215T3/da active
- 1990-03-19 DK DK95107952T patent/DK0682112T3/da active
- 1990-03-19 AT AT95107951T patent/ATE529506T1/de active
- 1990-03-19 JP JP2505154A patent/JP3059481B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DE DE200712000066 patent/DE122007000066I1/de active Pending
- 1990-03-19 WO PCT/FR1990/000185 patent/WO1990011354A1/fr active IP Right Grant
- 1990-03-19 AT AT07007307T patent/ATE543904T1/de active
- 1990-03-19 DE DE69034238T patent/DE69034238T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DK DK95107951.6T patent/DK0682111T3/da active
- 1990-03-19 ES ES07007307T patent/ES2381039T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DE DE69024440T patent/DE69024440T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 EP EP07007307A patent/EP1826215B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 AT AT90905207T patent/ATE132189T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-19 ES ES95107952T patent/ES2281897T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 SG SG1996006087A patent/SG49112A1/en unknown
- 1990-03-19 EP EP95107952A patent/EP0682112B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DE DE07007307T patent/DE07007307T1/de active Pending
- 1990-03-19 ES ES90905207T patent/ES2081977T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 DK DK90905207.8T patent/DK0419621T3/da active
- 1990-03-19 AT AT95107952T patent/ATE359363T1/de active
- 1990-03-19 ES ES95107951T patent/ES2375345T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 EP EP90905207A patent/EP0419621B1/fr not_active Revoked
- 1990-03-19 EP EP95107951A patent/EP0682111B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-06 US US08/301,037 patent/US6528313B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-06 US US08/466,699 patent/US6638768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-06 US US08/466,539 patent/US6528314B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-08 HK HK150696A patent/HK150696A/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-04-06 JP JP09936699A patent/JP3298842B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-21 JP JP2000287359A patent/JP3298864B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-13 US US10/639,754 patent/US20040250301A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-02-04 US US10/770,418 patent/US20040203153A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-03-13 US US11/717,037 patent/US20080182331A1/en not_active Abandoned
- 2007-07-10 NL NL300297C patent/NL300297I2/nl unknown
- 2007-10-10 LU LU91371C patent/LU91371I2/fr unknown
-
2008
- 2008-12-22 FR FR0807354A patent/FR2942104B1/fr active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2281897T3 (es) | Procedimiento para obtener la expresion, o para mejorar el nivel de expresion de un gen. | |
US20230203541A1 (en) | Optimized gene editing utilizing a recombinant endonuclease system | |
Behringer et al. | Two 3'sequences direct adult erythroid-specific expression of human beta-globin genes in transgenic mice. | |
Green et al. | The role of antisense RNA in gene regulation | |
ES2151463T3 (es) | Constructos de adn para la activacion y la modificacion de la expresion de genes endogenos. | |
ES2263206T3 (es) | Adn regulador transcripcional de ef-1-alfa de hamster. | |
ES2284161T3 (es) | Generacion de anticuerpos xenogenicos. | |
ES2342159T3 (es) | Integracion aleatoria de un polinucleotido despues de linealizacion in vivo. | |
MX2007014139A (es) | Piggybac como una herramienta para manipulacion genetica y analisis en vertebrados. | |
Gopal-Srivastava et al. | Identification of a lens-specific regulatory region (LSR) of the murine αB-crystallin gene | |
EP1373297A2 (en) | A lac operator-repressor system | |
JPH03504560A (ja) | 多薬剤耐性を試験するためのトランスジェニック動物 | |
CA2011784A1 (en) | Method for the targetted change of a gene | |
KR100372843B1 (ko) | 간질이유발된변이형생쥐및이의제조방법 | |
CN117701634A (zh) | 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 | |
Guan | Expression of a plant catalase gene in mice, and its potential role in protecting the transgenic mice against oxidative stress | |
Maurya | Regulatory mechanisms controlling distal-less related gene expression in lamprey | |
WO2002002782A1 (en) | Activation of gene expression in cloned eukaryotic genomic dna and methods of use thereof | |
JP2004105051A (ja) | 部位特異的突然変異導入法 | |
DE10020500A1 (de) | Vektorsystem zum Einbringen von DNA in eukaryonte Zellen |