CN117701634A - 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，获得F0代小鼠；将含有打靶序列的F0代小鼠与野生型小鼠杂交，得到含有打靶序列的杂合性小鼠；将得到的含有打靶序列的杂合性小鼠与Vil‑Cre阳性小鼠杂交，得到肠道ITGB5基因敲除动物模型。本发明获得条件性基因敲除(Conditional Knockout，CKO)小鼠，为研究ITGB5基因影响肠道对ETEC F4ac型细菌的抗性提供了便捷、可靠、经济的动物模型。

Description

一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。

背景技术

F4ac菌毛的产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是引起新生仔猪细菌性腹泻的主要病原微生物，研究报告表明ETEC需要通过菌毛黏附至宿主细胞，附着后通过分泌的蛋白质来破坏宿主细胞，操纵宿主细胞的信号传导途径，避免宿主细胞产生免疫反应并成功定植，释放毒素，导致肠道内电解质平衡紊乱，最终导致腹泻。

仔猪对ETEC F4ac的易感性由小肠上皮表面的特异性受体决定。本课题组前期选取4对ETEC F4ac抗性和易感的全同胞仔猪为试验对象，采用iTRAQ蛋白质组定量技术鉴定其小肠蛋白表达差异，结果富集到唯一的整合素信号通路(Integrin signallingpatinway：PO0034)，说明该通路对ETEC F4acR感染仔猪小肠黏膜进而引起仔猪腹泻具有重要作用，从基因位于染色体上的位置、基因的分子功能、基因的蛋白质分子量大小角度对候选基因进行分化，发现ITGB5最有可能为ETEC F4acR的候选基因。ITGB5属于整合素家族成员，整合蛋白是参与细胞黏附的细胞表面受体，是通过细胞表面介导细菌黏附的粘连蛋白。ITGB5编码整合蛋白的β亚基，编码细胞表面糖蛋白，其主要功能为参与免疫细胞的黏附作用，它的作用机制是调节邻近细胞或胞外基质的黏附分子。经过搜寻鉴别ITGB5基因单核苷酸多样性，并分析ITGB5基因多态性与黏附表型的关联性，我们发现这些位点与黏附的关联性较强，ITGB5基因的缺失会显著降低黏附到IPEC-J2细胞上的ETEC数目，而该基因的过表达会导致细菌黏附于IPEC-J2的数量增加，这些结论支持ITGB5基因是ETEC F4ac的受体基因的假设，但是依然需要更加深入的研究来验证这一推论，例如进行动物模型实验。论文“Diurnal，localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tipsin wild-type but not Itgb5-/-or Mfge8-/-mouse retina.”提到Itgb5-/-小鼠，文章中所使用的Itgb5-/-小鼠为非特异性基因敲除的小鼠或者说是全身性基因敲除的小鼠，由于有些基因对小鼠个体很重要，敲除后会导致小鼠不能存活、不能正常发育、繁殖能力异常，因此，研究某个基因仅在某个器官、某个时期缺失后有什么功能，不能用全身性基因敲除方法。对于针对后续进行肠道研究实验建立的敲除鼠，需要使用条件性基因敲除的方法进行处理，而用于该方面研究的小鼠模型存在空白，针对以上现状，为深入了解ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用，迫切需要开发ITGB5基因敲除小鼠模型的构建方法，以克服当前实际应用中的不足。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。本发明是通过利用ITGB5基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶(Vil-Cre)的小鼠交配后，其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致ITGB5基因在肠道组织类型中功能性缺失，获得条件性基因敲除(Conditional Knockout，CKO)小鼠，为有目的地研究ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对ITGB5基因的gRNA，所述gRNA的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(2)构建同源重组载体，所述同源重组载体包括：5’同源臂、flox区域和3’同源臂；

(3)将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体注射到小鼠的受精卵中，取存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代小鼠，对F0代小鼠进行鉴定；

(4)将阳性的F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，对F1代小鼠进行鉴定；

(5)将步骤(4)得到的含有打靶序列的杂合性F1代小鼠与Vil-Cre重组酶阳性小鼠杂交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行鉴定，得到ITGB5条件性基因敲除小鼠模型。

进一步的，步骤(2)中，flox区域序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，步骤(2)中，5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示。

进一步的，步骤(3)中，对产出F0代小鼠进行PCR鉴定，其中，

5’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；

3’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。

进一步的，步骤(4)中，对F1代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。

进一步的，步骤(5)中，对F2代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。

进一步的，步骤(5)中，对F2代小鼠进行Cre作用效果PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。

进一步的，步骤(5)中，对F2代小鼠进行肠道基因型qRT-PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。

本发明的第二方面，提供一种条件性基因敲除小鼠模型，所述条件性基因敲除小鼠模型由所述的构建方法构建得到。

本发明的第三方面，提供所述的条件性基因敲除小鼠模型在ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用

本发明的有益效果：

(1)本发明是通过利用ITGB5基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶(Vil-Cre)的小鼠交配后，其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致ITGB5基因在肠道组织类型中功能性缺失，获得条件性基因敲除(Conditional Knockout，CKO)小鼠，为有目的地研究ITGB5基因对ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。

(2)本发明构建得到的ITGB条件性基因敲除小鼠模型为进一步研究ITGB5基因的生物学功能奠定了基础，为特异性针对ITGB5基因的研究提供了理想模型，减少了全身敲除引起的其他机制的变化。本发明用小鼠模型模拟仔猪腹泻，为仔猪腹泻的致病机理研究和通过转基因技术对仔猪腹泻抗性基因进行功能验证奠定基础。

附图说明

图1为ITGB5条件性基因敲除小鼠策略图。

图2为同源重组载体质粒图谱。

图3为同源重组载体酶切鉴定电泳图。(BglII酶切鉴定结果，理论条带大小为6967bp、3329bp、2410bp；M：1kb；DNA ladder 10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图4为F0代小鼠鉴定策略示意图。

图5为同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图。(数字为F0代小鼠编号；WT为野生型对照；M为1kb DNA marker)。

图6为F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定电泳图。PCR鉴定阳性小鼠为：3、4、15、16、17号；经测序确认均为阳性。(数字为F1代小鼠编号；WT为野生型对照；M为1kb DNAladder)。

图7为肠道组织flox位点插入情况的PCR鉴定结果，根据专利中的flox位点PCR鉴定方法，单独鉴定flox位点插入情况，纯合子：313bp；杂合子：251bp和313bp；野生型：251bp。M：2000bp DNA ladder(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图8为肠道组织Cre作用效果基因型鉴定结果，根据专利中的Cre作用效果PCR鉴定方法，含有Cre的样本：657bp；不含Cre的样本：1399bp；野生型：1273bp。M：2000bp DNAladder(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。

图9为小鼠模型ITGB5条件性基因条件性敲除效果，图9中A为实时荧光定量PCR结果；图9中B为western blot实验结果；图9中C为免疫荧光实验结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明所用C57BL/6J小鼠、Vil-Cre重组酶的阳性小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，实验全程保证动物福利。

实施例1：ITGB5基因定点突变小鼠模型的构建

(1)小鼠ITGB5基因的gRNA设计、构建和纯化

CAS9是一种核酸酶，可通过crRNA和tracrRNA(或反式激活crRNA)的介导实现特异DNA序列的剪切。考虑到CRISPR/Cas9技术周期短、效率高的优点，设计ITGB5条件性基因敲除小鼠策略，见图1。根据策略，确定flox区域为ITGB5基因的exont2，exon2翻译起始于ITGB5基因编码区的2.9％，敲除该区域会引起读码框移码突变，使翻译提前终止。具体来看，选择敲除ITGB5基因部分intron 1，exon 2及部分intron 2，敲除区域共486bp，包含ITGB5基因整个编码区的2.9％；序列表中序列1的第1-284位为intron1；第285-370位为exon 2，共86bp(序列中灰色标记部分)；第371-731位为intron 2；intron 1，exon 2及intron 2核苷酸序列如下：

从Ensembl(https：//asia.ensembl.org/index.html)网站上获得小鼠基因组中ITGB5(ENSMUSG00000022817)基因的序列和结构信息，在基因的编码区域设计gRNA。本发明中针对的转录本(Ensembl号)：Itgb5-201(ENSMUST00000069345.6)，利用crispr.mit.edu(http：//crispr.mit.edu/)来设计gRNA序列；向导RNA(gRNA)是一个短的合成RNA，由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列(靶位点)组成，合成gRNA1和gRNA2均由各自靶序列转录的RNA与gRNA的骨架序列连接而成，序列如下：

gRNA1，Sequence(5’-3’)：TGCCCCGGTGAGGACCAGCATGG；(SEQ ID No.1)；

gRNA2，Sequence(5’-3’)：ACCCAGAAAAGAAACCCTTGAGG；(SEQ ID No.2)。

(2)对ITGB5基因进行flox修饰

同源定向修复(HDR)可以将特定的外源突变引入到目标基因DNA中，将含有flox序列的DNA修复模板(即包含3.0kb 5’同源臂、0.7kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂的序列)与gRNA和Cas9一起，通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，骨架载体是PBR322，该载体包含3.0kb 5’同源臂(SEQ ID No.4，具体核苷酸序列请见序列表)、0.7kb的flox区域(SEQ ID No.3，具体核苷酸序列请见序列表)和3.0kb3’同源臂(SEQ IDNo.5，具体核苷酸序列请见序列表)，同源重组载体图质粒图谱见图2，酶切鉴定电泳图见图3。

(3)F0代小鼠获得及基因型鉴定

运用体外转录的方式，将Cas9 mRNA、gRNA(gRNA1和gRNA2)和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中。对于4-6周龄C57BL/6J小鼠，向雌小鼠腹腔内注射5个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，约46-48h后再注射5IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可诱发排卵，供体雌鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼，交配后第四天收集供体雌鼠子宫中的囊胚，在显微镜下选择状态好的胚胎缓慢吹入受体雌鼠子宫中，子宫和肠系膜送回腹腔，移植手术成功后，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，鉴定策略示意图见图4，其中：

5’同源臂重组PCR鉴定所用引物：

Forward，Sequence(5’-3’)：AATGGCCTGTGGAGGCTAAC(SEQ ID No.6)；

Reverse，Sequence(5’-3’)：TTCCACTCCCAATGACGGTG(SEQ ID No.7)；

目的片段为：4.6kb WT：7.7kb。

3’同源臂重组PCR鉴定所用引物：

Forward，Sequence(5’-3’)：GCCCTAAAAGGCTAGGGAGC(SEQ ID No.8)；

Reverse，Sequence(5’-3’)：AGCCTTGATTCAGACAGCCT(SEQ ID No.9)；

目的片段为：4.0kb WT：7.3kb。

5’同源臂和3’同源臂的PCR反应条件相同，反应体系的区别仅在于所用的的引物不同(使用各自的引物)，具体的PCR反应体系为：

表1反应体系

PCR反应条件为：94℃3min，98℃15sec，61℃15sec，68℃4min(98-68℃循环35次)，68℃5min，12℃维持。

结果见图5，由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠。

(4)F1代小鼠繁育及基因型鉴定

F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠。通过PCR方法及测序对其进行基因型鉴定：取1-2周F1代小鼠进行基因型鉴定，取需要鉴定的1～3mm小鼠尾尖组织于1.5ml的EP管中，用眼科钳剪碎所取组织。将剪碎的组织浸泡在预添加了200μl 1×Proteinase K的裂解液中，各组分添加完成后涡旋震荡，充分混匀后再使用，55℃孵育40-90min，孵育完成后，将样品置于95℃或者沸水浴中加热5min灭活Proteinase K，将裂解产物涡旋震荡充分混匀后，12,000rpm离心5min，取上清即可进行PCR反应，鉴定方式同步骤(3)，F1代阳性小鼠基本信息见下表：

表3 F1代阳性小鼠基本信息

结果见图6，通过PCR鉴定，编号为3、4、15、16、17的小鼠为阳性小鼠。

单独鉴定flox位点插入情况，纯合子：313bp条带；杂合子：251bp和313bp条带；野生型：251bp条带。

flox位点PCR鉴定时引物对序列分别为：

Forward，Sequence(5’-3’)：GCAGGAGCAGGAGTTGCTAA(SEQ ID No.10)；

Reverse，Sequence(5’-3’)：AGCTCCAAGGAACAGGATGC(SEQ ID No.11)。

PCR反应体系：

表2 PCR反应体系

PCR反应条件为：94℃5min，94℃30sec，59℃30sec，72℃1min(94-72℃循环35次)，72℃5min，12℃维持。

通过PCR鉴定，这些经测序确认均为阳性的小鼠即F1代flox杂合小鼠。

(5)F2代小鼠繁育及基因型鉴定

取步骤(4)中获取的F1代小鼠flox杂合小鼠与Vil-Cre重组酶的阳性小鼠杂交，获得F2代小鼠。

单独鉴定F2代小鼠flox位点插入情况，纯合子：313bp条带；杂合子：251bp和313bp条带；野生型：251bp条带，鉴定方式同步骤(4)。

在F2代小鼠1-2周时取一小块表达Cre的组织，抽提基因组DNA，通过PCR的方法对flox区域进行扩增，直接鉴定肠道组织Cre作用效果。

Cre作用效果PCR鉴定时引物对序列分别为：

Forward，Sequence(5’-3’)：TTCTCCACTAAGGGTGTGCG(SEQ ID No.12)；

Reverse，Sequence(5’-3’)：GGGAGTGCAGCTCAGTGTAG(SEQ ID No.13)。

含有Cre的样本：657bp条带；不含Cre的样本：1399bp条带；野生型：1273bp条带。

PCR反应体系为：

表4 PCR反应体系

PCR反应条件为：95℃3min，98℃15sec，61℃15sec，68℃1min(98-68℃循环35次)，68℃5 min，12℃维持。

PCR鉴定结果如图7、图8所示，通过PCR鉴定，编号为19、51、81、83、84、86的小鼠为敲除ITGB5鼠；编号为61、64、85、87、88、101、103、105、107的小鼠为未敲除ITGB5鼠。

通过qRT-PCR、western blot、免疫荧光实验对肠道进行基因型鉴定。

qRT-PCR引物序列

Forward，Sequence(5’-3’)：TTCCGCCATCTGCTGCCTCT(SEQ ID No.14)；

Reverse，Sequence(5’-3’)：CCTTCCGCCAACCAATCTTCTCC(SEQ ID No.15)。

表5 qRT-PCR反应体系

PCR反应条件为：预变性95℃30sec；循环反应：95℃10sec，60℃30 sec(95-60℃循环40次)；溶解曲线95℃15sec，60℃60 sec，95℃15sec。

结果见图9，图9中A、图9中B和图9中C分别为小鼠空肠组织通过qRT-PCR、westernblot、免疫荧光进行的实验，目的是为了在mRNA、蛋白水平对特异性敲除组织肠道进行ITGB5基因敲除效果鉴定。control(itgb5^+/+)为ITGB5基因未敲除，experimental(itgb5^-/-)为ITGB5基因敲除组，图9中A可以看出experimental组的ITGB5的RNA表达明显低于control组；图9中B和C可以看出experimental组的ITGB5的蛋白表达明显低于control组。可以说明ITGB5在RNA、蛋白水平表达均显著降低，说明ITGB5在肠道组织敲除成功。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对ITGB5基因的gRNA，所述gRNA的序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(2)构建同源重组载体，所述同源重组载体包括：5’同源臂、flox区域和3’同源臂；

(3)将Cas9 mRNA、gRNA和同源重组载体注射到小鼠的受精卵中，取存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代小鼠，对F0代小鼠进行鉴定；

(4)将阳性的F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，对F1代小鼠进行鉴定；

(5)将步骤(4)得到的含有打靶序列的杂合性F1代小鼠与Vil-Cre重组酶阳性小鼠杂交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行鉴定，得到ITGB5条件性基因敲除小鼠模型。

2.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，flox区域序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，对产出F0代小鼠进行PCR鉴定，其中，

5’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.6和SEQ ID No.7；

3’同源臂重组PCR鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。

5.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对F1代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11。

6.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11。

7.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行Cre作用效果PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.12和SEQID No.13。

8.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行肠道基因型qRT-PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。

9.一种条件性基因敲除小鼠模型，其特征在于，所述条件性基因敲除小鼠模型由权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到。

10.权利要求9所述的条件性基因敲除小鼠模型在ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用。