CN112899311A

CN112899311A - 一种rs1-ko小鼠模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN112899311A
Application number: CN201911137316.4A
Authority: CN
Inventors: 孙晓东; 罗学廷; 刘舒
Original assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN112899311B

Abstract

本发明提供了一种试剂，所述试剂包括基因编辑器和gRNA，所述gRNA特异性结合RS1基因，优选地所述gRNA的靶向位点序列sgRNA1和/或sgRNA2，所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了一种利用本发明所述的试剂制备的分离细胞和非人哺乳动物及其制备方面。本发明提供了优化的造模方案，一方面模型得率高，整体胚胎的质量好，并且具有敲除率高、无外源基因片段导入的优点，另一方面小鼠模型视网膜多层变薄劈裂、病理表现更严重，并且与人的视网膜劈裂症表型更类似，是一种不引入外源基因的而有效的X连锁视网膜劈裂症模型非人哺乳动物模型。

Description

一种RS1-KO小鼠模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医学技术领域，具体地说，是一种RS1-KO 小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis，XLRS)是一种罕见的遗传性致盲性眼病,发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜,在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔，导致严重的视力下降。此病常发于男性，是引起男性青少年黄斑变性的最主要原因,女性作为携带者无特征性临床表现。

现有的X连锁视网膜劈裂症模型动物，均在模型细胞基因组中引入了外源基因，而外源基因对动物基因组的影响是不可估量的。

因此，本领域急需一种不引入外源基因的而有效的X连锁视网膜劈裂症模型非人哺乳动物模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种不引入外源基因的而有效的X连锁视网膜劈裂症模型非人哺乳动物模型。

在本发明的第一方面提供了一种试剂，其特征在于，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、 Cpf1、Cas9、Cas 13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA是引导所述基因编辑蛋白特异性结合RS1基因的RNA。

另一优选例中，所述gRNA的靶向位点序列sgRNA1和/或sgRNA2，所述sgRNA1 的靶向核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2的靶向核酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于RS1基因的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述组分(a)和/或(b)中的所述表达载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒 (AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

在另一优选例中，所述试剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述试剂的剂型为液体制剂。

在另一优选例中，所述试剂的剂型为注射剂型。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(c)的含量为0.1-99wt％，较佳地，10-90wt％，更佳地，30-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)和任选的组分(c) 占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在本发明的第二方面提供了一种分离的细胞，其特征在于，所述的细胞经如第一方面所述的试剂处理，且所述细胞中视网膜劈裂蛋白失活。

另一优选例中，所述细胞的基因组中RS1基因转录本的第一个外显子切除。

另一优选例中，所述细胞包括体细胞、生殖细胞和/或胚胎干细胞。

另一优选例中，所述细胞选自人、和/或非人哺乳动物的细胞。

另一优选例中，所述胚胎干细胞还包括少于14天的胚胎、和/或受精卵。

另一优选例中，所述细胞选自啮齿动物，如小鼠、和/或大鼠。

另一优选例中，所述细胞为小鼠的受精卵。

在本发明的第三方面提供了一种X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenileRetinoschisis，XLRS)的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(m1)提供一种非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中RS1基因转录本的第一个外显子切除，得到视网膜劈裂蛋白失活的非人哺乳动物细胞；和

(m2)利用步骤(m1)中得到的视网膜劈裂蛋白失活的细胞，制备得到视网膜劈裂蛋白失活的X连锁视网膜劈裂症的非人哺乳动物。

另一优选例中，所述细胞包括如第二方面所述的细胞和/或使用如第二方面所述的试剂处理的细胞。

另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、和/或大鼠。

在另一优选例中，所述方法还包括：(m3)对步骤(m2)获得的非人哺乳动物进行杂交，从而获得视网膜劈裂蛋白失活的纯合子代。

在本发明的第四方面提供了一种X连锁视网膜劈裂症的非人哺乳动物模型，其特征在于，所述非人哺乳动物模型利用如权利要求3所述的方法制备。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

附图1是CRISPR/Cas9 gene targeting示意图。

附图2是全身性敲除/敲除小鼠繁育方案示意图。

附图3是经PCR扩增后电泳，得到的目的条带。

附图4是RS1-KO小鼠蛋白及形态检测，发现RS1蛋白缺失、视网膜组织紊乱，多层出现分裂。

附图5是RS1-KO小鼠暗适应ERG，发现b波均降低。

附图6是采用本发明设计的sgRNA对目的基因的敲除率结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建RS1基因敲除小鼠模型，在RS1基因转录本的第一个外显子切除内源性RS1基因约200bp左右片段，从而达到基因敲除效果。CRISPR/Cas9技术可以直接编辑胚胎，得率较高，整体胚胎的质量更好，并且具有敲除率高、无外源基因片段导入的优点。

在此基础上，发明人完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

RS1基因及蛋白

如本文所述，“RS1基因”、“XLRS1”均代指先天性视网膜劈裂症基因, 其编码长224个氨基酸的视网膜劈裂蛋白(Retinoschisin),表达于视网膜的光感受器细胞和双极细胞。鼠源RS1基因序列如SEQ ID NO.:3所示：

---attatcataagtaacgtgaacactgcacattcttccatataactgagccaccactaccaaagtca atgttttccagagcaggcagatgtcaacatgacaagttcttctgggagaaaacactctgttgtaccattcccctac aaatagaggttatttactcagcaggaacctgttcaaggtcactccctaggaaatgatgtcggagaaagaattaggg gcccacatcttccaactctactttctatttcatcctattactcgccttacagttaaagatggtagaacatcagcac ctcccttgctaaaccaacctatgtcAACAATACCTCCCCAGACTGCTTGTTGAGGCAGGGGACTATGTGGCTTAAT TGGATGGGGGCTGAGTGAAAGACCTAAGAACTAAATGAAATAAGATGCTTAAGTTAATCGCCTGCTCCTATGCCAG CTCTCCACTTCACTTAGATCTTGCTGTGACCAAGGACAAGGAGAAAATGCCACACAAGATTGAAGGCTTCTTCTTGTTACTTCT CTTTGGCTATGAAGgtatgtactattctactattggcatttattaatgtatttaataatgtgattta atatagaaatatatagaaaatagttgataaatagaaatgcaacctgagtaataaaaattgttggatgacaacatgc caattagttcacaggttattaatttaaaaggtcactgttgtgtggctctttgtcactgtcttgctcctggcttcct ggtttcatgaggaaccttctaaagttcaaatgatattgaaactcaacagaaagaaggaagggcctcagagtttcta taaaaacaactttaaattgcaacaattaatgagaagtcatgtttcttggaaattttaggaggcaaagttgaagcaa ttgtagaattta---(SEQ ID NO:3)

上述基因序列中大写下划线部分代表编码区；大写无下划线部分代表非编码区，小写下划线部分代表内含子区。

在本发明中，在“RS1-KO小鼠”、“RS1-KO非人哺乳动物”、“RS1-KO”均指在模型动物中将基因组的RS1基因转录本的第一个外显子切除内源性RS1 基因约200bp左右片段，从而达到基因敲除效果。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

如本文所用，术语“基因失活”、“基因敲除”可互换使用，指通过对某一目的基因进行中断、敲除等遗传操作，从而使得该目的基因的表达和/或活性大幅下降甚至完全丧失。

基因编辑器

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于Cas13(如CasRx)、 Cpf1、SaCas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白 (Cas 1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，

CRISPR序列由一段前导序列(leader)、众多短而保守的重复序列区 (repeat)和间隔区(spacer)组成。重复序列区含有回文序列，能够形成发卡结构。而间隔区就是被宿主俘获的外源DNA序列。这些被俘获的外源DNA序列相当于免疫系统的“黑名单”，当这些外源的遗传物质再次入侵宿主时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，引发宿主细胞的自我修复。

根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究和利用最广泛的为2类Ⅱ型，即为CRISPR/Cas9系统。该系统2013年在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。该系统操作简单，实验周期短，效率高，且广泛适用于多个物种。该系统需要设计一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列设计是在基因组序列中的 PAM(NGG)区的一段20nt左右核苷酸序列。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，激活细胞的非同源末端连接 (Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination， HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、随机的片段缺失或插入，或者利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

在本发明的一个实施例中，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建RS1基因敲除小鼠模型的sgRNA，包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1靶向位点核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2靶向位点核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明采取的技术方案是：

1.确定RS1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，并与Cas9 核酸酶体外转录成mRNA；

2.将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵中，获得RS1基因敲除小鼠；所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2如SEQ ID NO:2 所示。

在本发明的一个实施例中，所述的方法中还包括以下步骤：

(1)小鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

(2)将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到小鼠受精卵中；

(3)受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

在本发明的一个实施例中，所述方法包括以下步骤：

(1)确定RS1基因待敲除的靶点，并将sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录；

(2)小鼠促排卵、体外受精，受精卵显微注射；

(3)取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

(4)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

(5)将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

(6)将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

在本发明的一个实施例中，所述的方法还包括步骤：鉴定RS1基因敲除小鼠动物模型。

在本发明的一个实施例中，所述鉴定RS1基因敲除小鼠动物模型具体为：

(1)取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

(2)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

(3)将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

(4)将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

X连锁视网膜劈裂症

视网膜电图

视网膜电图是光刺激视网膜时从角膜或相应部位记录到的视网膜总电反应，主要反映视网膜第一、二级神经元的功能。

正常的WT小鼠ERG依次有一个负相较小的a波和一个较大的正相b波。而本发明提供的RS1-KO小鼠的ERG明显异常：在暗适应视网膜电图检测视杆细胞反应时，与WT相比，b波明显减小，a波变化不明显。a波在暗适应下无变化，说明RS1-KO小鼠视网膜光感细胞中视杆细胞的视觉功能影响不大。虽然在视锥细胞表现出b波减小，但小鼠中视锥细胞数量较少，故对小鼠视锥细胞的视觉功能影响不明显。

本发明的技术方案，具有如下有益效果：

1.本发明提供了一种X连锁视网膜劈裂症模型非人哺乳动物模型，所述模型与人类X连锁视网膜劈裂症的病理表现相同，发病时间早，病理表现明显，是研究X连锁视网膜劈裂症疾病的理想模型。

2.本发明与现有模型的区别在于，本模型优化了造模方案，一方面不引入外源基因，另一方面转基因模型自发表现疾病病理症状，排除了研究X连锁视网膜劈裂症疾病过程中人为干预的影响。

3.本发明提供了优化的造模方案，一方面模型得率高，整体胚胎的质量好，并且具有敲除率高、无外源基因片段导入的优点，另一方面小鼠模型视网膜多层变薄劈裂、病理表现更严重，并且与人的视网膜劈裂症表型更类似。

4.本发明提供了的RS1-KO转基因造模方案影响小鼠的视锥细胞以及感光细胞与双极细胞之间的突触链接、而不影响视杆细胞功能，却意外地表现出了更贴近临床表现的疾病病理特征，这进一步为X连锁视网膜劈裂症疾病研究开拓了方向。

5.本发明为研究RS1与视网膜劈裂症的关系提供便捷、可靠、经济的动物模型，为其研究提供了可靠的理论依据。视网膜结构和视觉功能的检测表明：RS1-KO小鼠视网膜多层变薄、多层发生劈裂；同时小鼠的视觉功能异常主要是由于感光细胞与双极细胞之间的突触链接受损造成的，这正是基于RS1-KO小鼠视网膜外丛状层劈裂的结果，这与临床病人表征相同；本模型能够更好更准确的模拟人类疾病发病过程，为研究XLRS提供更为精准和丰富的实验动物对象。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1 RS1-KO小鼠模型的构建及鉴定

1.1材料

本实施例所用小鼠品系为：C57BL/6J，代孕母鼠品系为C57BL/6J，购自上海斯莱克实验动物有限公司，将小鼠随机分为对照组与实验组。

2方法

实验组按照以下方法进行实验：

2.1在目标基因内含子中寻找合适的靶序列

通过在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)及gRNA的设计原则，评估小鼠RS1基因序列上得分较高的靶位点设计gRNA，靶位点核酸序列信息如下：

sgRNA1：AGGGGACTATGTGGCTTAATTGG(SEQ ID NO:1)；

sgRNA2：GGTATGTACTATTCTACTATTGG(SEQ ID NO:2)；

RS1基因序列如SEQ ID NO:3所示。

2.2Cas9 mRNA制备

将线性化及纯化DNA并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA：纯化sgRNA至合适转基因注射的纯度。

2.3显微注射受精卵

使用显微注射仪器将上述sgRNA、Cas9 mRNA按((25ng/uL和50ng/uL) 比例混匀后，注射入体外受精小鼠受精卵的胞浆部分，构建形成特定的小鼠胚胎细胞(受精卵)。体外培养1-2小时后将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管，胚胎移植的小鼠出生即为F0代小鼠。

2.4小鼠基因型鉴定

(1)提取上述步骤所得子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定；

(2)将目标基因发生敲除的小鼠分别与野生型小鼠杂交。

具体方案见图2，基因型鉴定方法如下：

(1)基因组DNA提取：

A、消化：小鼠出生约一周内，剪取0.5cm小鼠脚趾，放入1.5ml EP管中，稍离心后加入500ul裂解液(配方：100mM Tris pH8.0，5mM EDTA pH8.0，0.5％ SDS，NaCl 1.17g/100ml)、0.5ul蛋白酶K(浓度：20mg/ml，溶解在pH7.4， 20mM Tris和1mM CaCl2中，50％甘油缓冲液，-20℃保存)，混匀，55℃水浴消化过夜；

B、酚氯仿抽提：

1)取出EP管，来回颠倒混匀，1,2000rpm离心10min；

2)吸上清400ul到新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿，上下颠倒混匀3min，稍静置后1,2000rpm离心5min；

3)轻轻吸取上清至一新的1.5ml EP管中(不要吸到下层的苯酚或沉淀物)，向上清中加入等体积氯仿，上下颠倒混匀3min，稍静置后1,2000rpm离心3min；

4)吸取上清至另一新的1.5ml EP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和 2.5倍体积的无水乙醇，摇匀，-20℃放置约30min；

5)4℃离心机，1,2000rpm离心10min，去上清，将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇；

6)待DNA干燥后，加入30ul无菌ddH2O溶解，测浓度，-20℃保存。

对照组无设计sgRNA步骤，直接敲除目的基因，其余步骤均同实验组。

(2)PCR鉴定

针对靶点上下游约200～300bp区域分别设计正反向PCR引物。

1)引物信息见表1

表1

2)PCR反应体系见表2。

表2

注：如果序列复杂，可换其他的酶进行PCR，加入5％DMSO、GC enhancer 等(TM值标注DMSO的，建议客户在PCR体系中加入DMSO，该TM值为含DMSO 值)

(3)测序分析

A、PCR产物直接测序(50ul体系，自带引物S)：如果缺失或插入大片段，可直接通过电泳图看出，割目的带测序即可；

B、或PCR产物割胶回收、连PMD18T载体，DH5α转化后涂板直接送平板测序(PCR建议使用Taq酶)；

C、测序结果通过chromas彩图看结果；如果是单峰，直接跟WT序列比对 (DNAMAN软件)，分析是WT or纯合子；彩图为后双峰的，通过截图与WT序列比对，分析出mutant序列。

结果：

基因敲除的关键在于靶点选择，作用于正确靶点可通过序列突变使基因功能缺失。通过分析小鼠RS1基因结构，在RS1基因转录本第一个外显子序列设计sgRNA，挑选出敲除效率最高的sgRNA1-2。

3.1Founder信息

3.1.1F1代信息

F1 4#♂(ko)&7#♀(KO)2018.9.7生，2018.9.13剪1-8#

3.1.2凝胶电泳如图3：

1#，3#～8#为纯合子(KO，656bp)，PCR为单条小带，正向引物测序即可。 WT与H2O分别为野生型和空白对照。

3.1.3测序结果分析(正向引物测序)

将突变型等位基因的PCR产物进行测序，测序结果与野生型基因组序列比对，用于确认突变基因序列在基因组中的具体位置及突变碱基数。序列比对结果如下：

4#、5#、6#、7#、8#：KO

AGGCAGGGGACTATG------------(202)-------------tggcatttattaatgta -202bp(exon1敲除，-ATG)

小鼠信息见表3。

表3

提交小鼠信息

编号	雌雄信息	DOB	来源(父母编号)	编辑信息
					4#	♀	2018.9.7	4#♂&7#♀	-202bp,KO
5#	♀	2018.9.7	4#♂&7#♀	-202bp,KO
					6#	♂	2018.9.7	4#♂&7#♀	-202bp,KO
7#	♂	2018.9.7	4#♂&7#♀	-202bp,KO
					8#	♀	2018.9.7	4#♂&7#♀	-202bp,KO

3.2、RS1-KO小鼠(3周)RS1蛋白表达及形态检测见图4

RS1-KO小鼠在3周左右出现视网膜组织紊乱，多层出现劈裂。A.视网膜免疫组化发现RS1蛋白主要表达于WT小鼠视网膜内丛状层、内核层、外丛状层及感光细胞内节，而RS1-KO小鼠视网膜无RS1蛋白表达。同时可以观察到视网膜细胞层组织紊乱，内外核层分裂，内丛状层、外核层变薄。B.视网膜HE 染色发现内丛状层、外核层变薄，内核层、外丛状层、外核层、感光细胞外节层分裂，脉络膜分裂。其中外丛状层出现明显的劈裂腔，细胞之间的联系变少。

3.3、RS1-KO小鼠(3周)ERG见图5。

RS1-KO小鼠在3周左右出现视网膜功能下降，其ERG b波均降低。我们对 RS1-KO小鼠进行了视网膜电图检测。视网膜电图是光刺激视网膜时从角膜或相应部位记录到的视网膜总电反应，主要反映视网膜第一、二级神经元的功能。正常的WT小鼠ERG依次有一个负相较小的a波和一个较大的正相b波。而 RS1-KO小鼠的ERG明显异常：在暗适应视网膜电图检测视杆细胞反应时，与 WT相比，b波明显减小，a波变化不明显。a波在暗适应下无变化，说明RS1-KO 小鼠视网膜光感细胞中视杆细胞的视觉功能影响不大。虽然在视锥细胞表现出b波减小，但小鼠中视锥细胞数量较少，故对小鼠视锥细胞的视觉功能影响不明显。

结合视网膜结构形态检测，可以推测本发明提供的RS1-KO小鼠主要是由于视网膜感光细胞与双极细胞之间的突触链接受损致使RS1-KO小鼠视觉功能 (b波)异常，这正是RS1-KO小鼠发生在视网膜外丛状层的劈裂所造成的。

3.4敲除效率见图6。

两条RS1 sg RNA在HEK293T细胞中的敲除效率约为62％。A.在293T细胞中分别转染spCas9+sg1、spCas9+sg2，收集基因组DNA，并将PCR产物送测序，结果提示两条sgRNA分别在不同位点切割RS1基因。B.两条sg RNA切割效率分别为33.6％、49.2％。C.T7en1酶切检测sg RNA敲除RS1的效率，可以看到 sg1+sg2对RS1基因的敲除效率明显高出单条sg的效率。D.对T7en1酶切结果进行灰度值分析，sg1+sg2的敲除效率约为62％。

讨论与总结

目前针对XLRS1基因进行X连锁视网膜劈裂症模型构建的技术方案主要有以下3种：

第一种：将鼠源RS1基因5’端(intron2-exon3)和3’端(exon4-exon5) 整合到lacZ-neor载体上，构建删除部分外显子3、4以及整个内含子3的靶向载体。将该载体导入胚胎干细胞，并将突变的胚胎干细胞通过显微注射到小鼠胚胎，最后将胚胎植入怀孕母鼠子宫。该方法操作繁琐，敲除率较低，并且引入了外源基因neo片段，可能会对内源性基因产生不可预计的影响。

第二种：通过构建打靶载体，包含鼠源RS1b基因17.5kb片段，并将其中的第1个外显子替换成neo并导入胚胎，最后将胚胎植入怀孕母鼠子宫。该方法同样会将非小鼠内源性基因组neo片段整合到小鼠基因组，可能对内源性基因产生影响。

第三种是用亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosurea，ENU)处理得到随机突变的小鼠模型，主要得到的是在第2个外显子上的点突变和26个碱基缺失的小鼠模型。

以上三种方法操作繁琐，敲除率较低，并且第一、二种方法引入了外源基因neo片段，可能会对内源性基因产生不可预计的影响。同时，研究也证实这些RS1敲除小鼠部分表现为XLRS患者的特征，包括b波幅度显著降低、视网膜出现劈裂、光感受器退化以及神经节细胞层和内核层变薄，但视网膜神经细胞层和内核层变薄，内网层出现劈裂等表征与人的视网膜劈裂临床症状存在着差异。

针对上述缺陷，发明人设计了本发明一种RS1-KO小鼠模型的构建方法及其应用，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建RS1基因敲除小鼠模型，在RS1基因转录本的第一个外显子切除内源性RS1基因约200bp左右片段，从而达到基因敲除效果。CRISPR/Cas9技术可以直接编辑胚胎，得率较高，整体胚胎的质量更好，并且具有敲除率高、无外源基因片段导入的优点，同时该技术构建的小鼠模型视网膜多层变薄劈裂、病理表现更严重，并且与人的视网膜劈裂症表型更类似。关于本发明目前还未见有相关报道。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种RS1-KO小鼠模型的构建方法及其应用

<130> P2019-1568

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

aggggactat gtggcttaat tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

ggtatgtact attctactat tgg 23

<210> 3

<211> 912

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

attatcataa gtaacgtgaa cactgcacat tcttccatat aactgagcca ccactaccaa 60

agtcaatgtt ttccagagca ggcagatgtc aacatgacaa gttcttctgg gagaaaacac 120

tctgttgtac cattccccta caaatagagg ttatttactc agcaggaacc tgttcaaggt 180

cactccctag gaaatgatgt cggagaaaga attaggggcc cacatcttcc aactctactt 240

tctatttcat cctattactc gccttacagt taaagatggt agaacatcag cacctccctt 300

gctaaaccaa cctatgtcaa caatacctcc ccagactgct tgttgaggca ggggactatg 360

tggcttaatt ggatgggggc tgagtgaaag acctaagaac taaatgaaat aagatgctta 420

agttaatcgc ctgctcctat gccagctctc cacttcactt agatcttgct gtgaccaagg 480

acaaggagaa aatgccacac aagattgaag gcttcttctt gttacttctc tttggctatg 540

aaggtatgta ctattctact attggcattt attaatgtat ttaataatgt gatttaatat 600

agaaatatat agaaaatagt tgataaatag aaatgcaacc tgagtaataa aaattgttgg 660

atgacaacat gccaattagt tcacaggtta ttaatttaaa aggtcactgt tgtgtggctc 720

tttgtcactg tcttgctcct ggcttcctgg tttcatgagg aaccttctaa agttcaaatg 780

atattgaaac tcaacagaaa gaaggaaggg cctcagagtt tctataaaaa caactttaaa 840

ttgcaacaat taatgagaag tcatgtttct tggaaatttt aggaggcaaa gttgaagcaa 900

ttgtagaatt ta 912

Claims

1.一种试剂，其特征在于，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

2.如权利要求1所述的试剂，所述gRNA的靶向位点序列sgRNA1和/或sgRNA2，所述sgRNA1的靶向核酸序列如SEQ ID NO:1所示：AGGGGACTATGTGGCTTAATTGG；所述sgRNA2的靶向核酸序列如SEQ ID NO:2所示：GGTATGTACTATTCTACTATTGG。

3.如权利要求1所述的试剂，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合于RS1基因的核苷酸序列。

4.一种分离的细胞，其特征在于，所述的细胞经如权利要求1所述的试剂处理，且所述细胞中视网膜劈裂蛋白失活。

5.如权利要求3所述的细胞，所述细胞的基因组中RS1基因转录本的第一个外显子切除。

6.一种X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis，XLRS)的非人哺乳动物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求5所述的方法，所述细胞包括如权利要求3所述的细胞和/或使用如权利要求1所述的试剂处理的细胞。

8.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括：(m3)对步骤(m2)获得的非人哺乳动物进行杂交，从而获得视网膜劈裂蛋白失活的纯合子代。

9.一种X连锁视网膜劈裂症的非人哺乳动物模型，其特征在于，所述非人哺乳动物模型利用如权利要求5所述的方法制备。

10.如权利要求9所述的模型，所述非人哺乳动物选自下组：啮齿动物(如小鼠、大鼠)。