CN113930427A - 靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向CD274基因的gRNA，利用Cas9将CD274基因的第3个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的CD274基因敲除小鼠是作为研究EAE疾病的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法。
背景技术
脊髓炎是指由病毒、细菌、螺旋体、立克次体、寄生虫、原虫、支原体等生物原性感染，或由感染所致的脊髓灰质或(和)白质的炎性病变，以病变水平以下肢体瘫痪、感觉障碍和植物神经功能障碍为其临床特征。临床上虽有急性、亚急性和慢性等不同的表现形式，但在病理学上均有病变部位神经细胞变性，坏死、缺失；白质中髓鞘脱失、炎性细胞浸润、胶质细胞增生等改变。因此，脊髓炎包括了大量的脊髓炎性疾病。实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。国内外学者试用多种易感动物建立EAE模型，以阐明EAE的发病机制，并为其病情的监测、复发的预防、治疗方案的选择以及新疗法或新药物的筛选等提供可靠依据，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。
从鸟类到哺乳类的多种动物如鸡、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、羊、犬、猴等均可成功诱发EAE，但不同种属或同一种属不同品系动物的敏感性有很大差异。豚鼠对诱发EAE相当敏感，但其品系复杂，有关试剂缺乏，一般不常用作实验对象。相比之下大鼠及小鼠的背景知识及相关试剂则较为全面，遗传学、免疫学等方面的研究也较深入，且其EAE在临床、病理、免疫及生化改变等方面都与人类脱髓鞘疾病较为相似，因此应用最为广泛。
程序性死亡配体1(PD-L1)也称为分化簇274(CD274)是人类中由CD274 基因编码的蛋白质。通常，免疫系统对与外源或内源性危险信号相关的外来抗原起反应，这引发抗原特异性CD8+T细胞和/或CD4+辅助细胞的增殖。PD-L1与PD-1 结合传递抑制信号，其减少淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时减少调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)中的细胞凋亡。
EAE是一种T细胞介导的炎性脱髓鞘疾病，与多发性硬化症具有许多临床和组织学特征，并且由髓鞘反应性CD4+Th1细胞诱导。有研究表明：PD-L1缺陷型 (PD-L1–/–)小鼠与野生型小鼠相比，PD-L1–/–小鼠的CD4+和CD8+T细胞反应显着增强，使用实验性自身免疫性脑脊髓炎髓鞘少突胶质细胞模型的研究表明，T细胞和宿主组织中的PD-L1限制了体内自身反应性CD4+T细胞的反应， PD-L1缺陷可将129S4/SvJae耐药菌株转化为实验性自身免疫性脑脊髓炎易感菌株；将致脑炎T细胞从野生型小鼠转移到PD-L1–/–受体导致疾病恶化。在易感C57BL/6背景下，PD-L1–/–小鼠的EAE也比野生型对照更严重。在EAE诱导期间向野生型C57BL/6小鼠施用PD-L1阻断mAb(10F.9G2)也会导致严重临床疾病的快速发作。PD-L1–/–小鼠对EAE的易感性增加证明了PD-L1在调节体内自反应CD4+T细胞反应中的重要作用。结果表明，PD-L1的T细胞，APC，和宿主组织中发挥着负向调节T细胞应答的关键作用。
为了研究该疾病的发病机理以及开发有效治疗方式，构建该疾病的小鼠模型对于该疾病的研究不可或缺，传统ES打靶基因敲除因嵌合体阳性率较低，并且需要与工具鼠交配才能获得删除Neo的杂合子，因此构建周期长达10-12个月。如何跨越“嵌合体”阶段并自删除Neo以减少两代繁育时间，才是真正快速的关键。
发明内容
针对现有技术不足，本发明设计了简单有效的方式，能利用Crispr/Cas9 系统快速在小鼠体内将CD274基因敲除，构建EAE疾病动物模型。Crispr/Cas9 技术能够在gRNA的指引下在精准切割DNA造成双链断裂，在DNA双链修复时将突变引入基因组DNA中(附图1)。同时在gRNA的指引下，基因组中的大片段 DNA能够被切除。Cas/gRNA复合物行使功能需要PAM序列，不同Cas酶，其对应的PAM并不完全相同。gRNA通常包括：靶标结合区和Cas蛋白识别区。靶标结合区与Cas蛋白识别区通常以5’到3’的方向连接。靶标结合区的长度通常为15～25个碱基，更通常为18～22个碱基，如20个碱基。靶标结合区与DNA的模板链特异性结合，从而将Cas9招募到预定位点。通常，DNA模板链上gRNA结合区域的对侧区紧邻PAM，或者隔开数个碱基(例如10个以内，或8个以内，或5个以内)。本发明针对鼠源CD274基因，设计四条gRNA靶向该基因第三外显子，在Cas9核酸酶作用下靶向破坏第三外显子，随后引起该基因丧失生物功能，通过应用高通量电转受精卵方式，获得Cd274基因敲除小鼠。
本发明包括以下技术方案：
一组靶向小鼠CD274基因的gRNA，包括四条gRNA，其核酸序列分别为：
gRNA1＝SEQ ID NO 1＝5’-GTATGGCAGCAACGTCACGATGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO 2＝5’-TGCTGCATAATCAGCTACGGTGG-3’；
gRNA3＝SEQ ID NO 3＝5’-TGCTTGCGTTAGTGGTGTACTGG-3’；
gRNA4＝SEQ ID NO 4＝5’-GACGTCAAGCTGCAGGACGCAGG-3’。
进一步，一种小鼠CD274基因的基因敲除试剂盒，所述试剂盒中包括上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4将小鼠CD274基因敲除。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4靶向切割小鼠CD274基因的第 3个外显子的5＇端和3＇端的两侧。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3将CD274基因第3个外显子之间的246bp 的DNA切除，切除后的基因在转录形成的mRNA第2个外显子与第4个外显子剪切时融合，翻译蛋白质时形成移码突变。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，包括以下步骤：
1)通过针对CD274基因设计、构建两对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；
2)F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配(雄性小鼠到8周龄，雌性小鼠到6周龄)，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子小鼠；
3)选择来自同一只F0代小鼠，基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后互配，获得F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定。理论上，F2 代小鼠中25％为纯合子，50％为杂合子，25％为野生小鼠。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中的测序引物为：
PCR测序引物＝SEQ ID NO 5＝5’-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3’。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：
F1＝SEQ ID NO 6＝5'-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3'；
R1＝SEQ ID NO 7＝5'-GAAGTGTGTGAACGAACGAATGAAC-3'。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，所述步骤3中PCR鉴定中的阳性扩增产物长度为437bp，阴性扩增产物长度为679bp。
进一步的，使用上述一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法获得的EAE疾病模型小鼠。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计了特异性靶向CD274基因的gRNA，利用Cas9将CD274基因的第3个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的CD274基因敲除小鼠是作为研究EAE疾病的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。
CD274是一种40kDa的1型跨膜蛋白，据推测其在特定事件如妊娠，组织同种异体移植，自身免疫性疾病和其他疾病状态在抑制免疫系统中起主要作用。通常，免疫系统对与外源或内源性危险信号相关的外来抗原起反应，这引发抗原特异性CD8+T细胞和/或CD4+辅助细胞的增殖。本发明设计的gRNA通过验证能够在小鼠受精卵中将CD274基因的第3个外显子高效且快速敲除，测序结果证实了小鼠体内CD274基因的敲除。其中，所述的gRNA序列在待改变的CD274基因上的靶序列上是唯一的。
附图说明
附图1.CD274基因敲除小鼠的构建方案示意图；图中，深色线段表示敲除区域，矩形代表CD274基因的外显子，gRNA region代表gRNA的结合区域。F1， R1代表用于小鼠鉴定的引物结合区域；
附图2.CD274基因敲除小鼠的鉴定策略；显示了用于鉴定小鼠的PCR引物的结合位点：F1、R1；靶向等位基因：437bp野生型等位基因：679bp；
附图3.CD274基因敲除小鼠的鉴定结果；靶向等位基因：437bp野生型等位基因：679bp；左图为DNA分子量标记，右图为PCR的鉴定产物图；(注： PCR在标准条件下以25μL体积进行35个循环，每个反应中都添加了F1和R1 引物；使用的Taq DNA聚合酶是P222；PCR基因分型中使用的两个对照是：水对照：不添加DNA模板。野生型对照：小鼠基因组DNA)；
附图4.CD274基因敲除小鼠的基因组测序结果,箭头指示处表明CD274基因被删除了246个碱基。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。
实施例
1.四条gRNA的序列设计
根据小鼠CD274基因的序列，设计并合成了4条针对CD274基因的gRNA 的序列：
gRNA1＝SEQ ID NO 1＝5’-GTATGGCAGCAACGTCACGATGG-3’；
gRNA2＝SEQ ID NO 2＝5’-TGCTGCATAATCAGCTACGGTGG-3’；
gRNA3＝SEQ ID NO 3＝5’-TGCTTGCGTTAGTGGTGTACTGG-3’；
gRNA4＝SEQ ID NO 4＝5’-GACGTCAAGCTGCAGGACGCAGG-3’。
2.Cas9/sgRNA的显微注射
4周龄的雌鼠注射30单位的PMSG(血清促性腺激素，Sigma)，48小时后注射30单位的hCG(Sigma)，随即将雌鼠与雄鼠交配。次日，获得小鼠受精卵。受精卵在KSOM(Millipore)中37℃，5％CO2培养2小时。将含有 Cas9mRNA(25ng/μl)，实验1中合成的gRNAs(各10ng/μl)的混合液通过显微注射至小鼠受精卵胞质。将注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，经过20天孕育生产后，最终可获得F0代小鼠，将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证基因组中的CD274基因被敲除，获得CD274基因敲除阳性小鼠；待雄性F0小鼠到8周龄，雌性小鼠到6周龄，可分别与野生型小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生14天后PCR鉴定,将筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的CD274基因敲除小鼠。
3.CD274基因敲除小鼠的PCR鉴定
根据CD274基因的被敲除区域，分别在第3个外显子5’端和3’端设计一对引物，如附图2所示：
F1＝SEQ ID NO 6＝5'-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3'；
R1＝SEQ ID NO 7＝5'-GAAGTGTGTGAACGAACGAATGAAC-3'。
野生型等位基因：一条带，679bp
杂合子：两条带437bp和679bp
纯合子：一条带437bp
DNA提取：包括如下步骤：我们使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction kit(Ver.5.0_Code No.9765)获得高纯度的基因组DNA。
a.在微量离心管中加入180μL缓冲液GL、20μL蛋白酶K和10μL RNase A每个尾片(2-5毫米)，注意不要剪太多尾巴。
b.56℃孵育过夜从。
c.C微量离心机中以12,000rpm旋转2分钟以去除杂质。
d.加入200μL Buffer GB和200μL无水乙醇，充分混合。
e.将离心柱置于收集管中。将样品以12,000rpm的速度旋转和离心2
分钟。丢弃流通。
f.向离心柱中加入500μL Buffer WA，12,000rpm离心1分钟。丢弃流通。
g.向离心柱中加入700μL Buffer WB，并以12,000rpm的速度离心1 分钟。丢弃流通。(注意：确保Buffer WB已与100％乙醇预混。加入Buffer WB时，将其加入管壁以洗掉残留的盐分。)
h.重复步骤g
i.将离心柱置于收集管中，并以12,000rpm的速度离心2分钟。
j.将离心柱放入新的1.5毫升管中。在柱膜中心加入50～200μL无菌水或洗脱缓冲液，静置5min。(注：将无菌水或洗脱缓冲液加热至65℃可提高洗脱率。)
k.要洗脱DNA，请将色谱柱以12,000rpm的速度离心2分钟。为了增加DNA的产量，在离心柱膜的中心加入流通和/或50～200μL无菌水或洗脱缓冲液，让柱静置5分钟。以12,000rpm离心2分钟。
l.量化到基因组DNA。洗脱的基因组DNA可以通过电泳或电泳定量
以下为PCR条件：
PCR Mixture(primer concentration:10μM):
PCR Reaction Conditions:
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得结果如图3所示。
4.CD274基因敲除小鼠的基因组测序方案
将小鼠基因组DNA提取后使用引物F1R1进行扩增，将扩增产物送往苏州金唯智公司进行测序，
PCR测序引物＝SEQ ID NO 5＝5’-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3’
测序引结果如附图4所示。
根据上述实验结果可知：本发明设计了特异性靶向CD274基因的gRNA，利用Cas9将CD274基因的第3个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的CD274基因敲除小鼠是作为研究EAE疾病的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。本发明设计的gRNA通过验证能够在小鼠受精卵中将CD274基因的第3个外显子高效且快速敲除，测序结果证实了小鼠体内CD274基因的敲除。其中，所述的sgRNA序列在待改变的CD274基因上的靶序列上是唯一的。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 赛业（苏州）生物科技有限公司
<120> 靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法
<130> 2021
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
gtatggcagc aacgtcacga tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
tgctgcataa tcagctacgg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
tgcttgcgtt agtggtgtac tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<400> 4
gacgtcaagc tgcaggacgc agg 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 5
attatctagc ttgcatcacc accac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 6
attatctagc ttgcatcacc accac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 7
gaagtgtgtg aacgaacgaa tgaac 25
Claims (10)
1.一组靶向小鼠CD274基因的gRNA，其特征在于，包括四条gRNA，其核酸序列分别为：
gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- GTATGGCAGCAACGTCACGATGG-3’；
gRNA2=SEQ ID NO 2=5’- TGCTGCATAATCAGCTACGGTGG-3’；
gRNA3=SEQ ID NO 3=5’- TGCTTGCGTTAGTGGTGTACTGG-3’；
gRNA4=SEQ ID NO 4=5’- GACGTCAAGCTGCAGGACGCAGG-3’。
2.一种小鼠CD274基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠CD274基因的gRNA。
3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠CD274基因的gRNA构建EAE疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4将小鼠CD274基因敲除。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4靶向切割小鼠CD274基因的第3个外显子的5＇端和3＇端的两侧。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3将CD274基因第3个外显子之间的246bp的DNA切除，切除后的基因在转录形成的mRNA第2个外显子与第4个外显子剪切时融合，翻译蛋白质时形成移码突变。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）通过针对CD274基因设计、构建两对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；
2）F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子小鼠；
3）选择来自同一只F0代小鼠，基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后互配，获得F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序引物为：
PCR测序引物=SEQ ID NO 5= 5’-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3’。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：
F1=SEQ ID NO 6=5'-ATTATCTAGCTTGCATCACCACCAC-3'；
R1=SEQ ID NO 7=5'-GAAGTGTGTGAACGAACGAATGAAC-3'。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的
阳性扩增产物长度为437 bp，阴性扩增产物长度为679 bp。
10.如权利要求3-9任一项所述的方法构建获得的EAE疾病模型小鼠。
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2021
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220114 |