ES2342159T3 - Integracion aleatoria de un polinucleotido despues de linealizacion in vivo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento no terapéutico para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped mediante preparación en la célula huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5'' y 3'' libres a partir de un vector, en el que dicho procedimiento comprende: a) Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5'' y 3'' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en el genoma de la célula huésped; b) producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5'' y 3'' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y, c) mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido liberado en dicho genoma de la célula huésped, y en el que dicha célula huésped es una célula no humana.
Description
Integración aleatoria de un polinucleótido
después de linealización in vivo.
La invención se refiere a un procedimiento de
liberación in vivo de un fragmento de ADN lineal de un vector
con el fin de integrar este fragmento en el genoma celular. La
invención se refiere además al uso de este procedimiento y a los
resultados de este uso.
El primer gran avance de la genética inversa
hace 20 años fue la transgénesis. La transgénesis es la técnica que
permite introducir una secuencia de ADN exógeno en una célula
huésped. Por ejemplo, la microinyección de ADN en un huevo
fecundado por mamífero conduce, en un cierto número de casos, a la
integración de la molécula de ADN microinyectado en el genoma del
huevo fecundado. La transgénesis implica que un fragmento de ADN
extraño se introduzca en el genoma de un organismo multicelular y
se transmita a la progenie. Por tanto, el ADN extraño debe estar
presente en una forma estable en el embrión en una fase precoz de
desarrollo con el fin de transmitirse a la progenie.
La transfección de ADN en células de mamífero
por medio de precipitación de fosfato de calcio precipitado también
puede conducir, en un cierto número de casos, a la integración del
ADN exógeno en el genoma de la célula huésped que se llama
transfección estable. El ADN exógeno puede introducirse en células
bajo dos formas, bien lineal o circular. Cuando el ADN se introduce
en forma lineal, el fragmento lineal se prepara in vitro
antes de su introducción en la célula huésped, generalmente por
escisión del fragmento deseado con enzima de restricción de, por
ejemplo, un plásmido. En lo que se refiere al ADN en forma circular,
el ADN introducido es generalmente un plásmido superenrollado.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las células tienen sistemas de
mantenimiento y reparación de su ADN. Una de las señales
particulares de estrés que activa la intervención de estos sistemas
es la generación de extremos libres de ADN en la célula. La célula
tiene entonces dos soluciones para resolver este tipo de
problema:
- -
- La primera solución es la degradación del ADN que presenta los extremos libres (por ejemplo, el caso en el que la célula debe eliminar un ADN que puede tener una actividad viral). Esta solución se basa en la presencia en estos sistemas de mantenimiento y reparación de exonucleasas que degradan el ADN digeriéndolo a partir de los extremos libres.
- -
- Otra solución es la recombinación de los extremos libres con el genoma celular. Esta recombinación puede tomar diferentes formas, particularmente la integración de la molécula exógena en el genoma de la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Como consecuencia, los trabajos que tienen como
objetivo integrar el ADN exógeno mediante la introducción de ADN
bicatenario desnudo en forma circular o lineal se encuentran con
tres tipos de problemas principales, además de un cierto número de
problemas colaterales.
- -
- El primero de estos problemas es la eficiencia de la integración de la molécula exógena en el ADN del huésped celular. Esta falta de eficiencia implica la inyección de una cantidad muy alta de ADN exógeno para un número muy pequeño de integración. En algunas especies tales como peces, plantas o insectos, las exonucleasas son tan eficaces que el ADN exógeno nunca se integra en el cromosoma y permanece episomal. Por ejemplo, si se usa la forma circular para el ADN exógeno, para tener la integración es necesario una mella. De hecho, el procedimiento de integración necesita la presencia de un extremo libre. Si se usa la forma lineal, la mayoría del ADN exógeno es degradada por las exonucleasas debido a la presencia de los extremos libres.
- -
- El segundo problema es la integridad del ADN integrado. El fragmento lineal de ADN exógeno expone sus extremos libres a las exonucleasas celulares antes de su llegada al núcleo. Esta exhibición prolongada de sus extremos en la célula limita de una forma significativa las oportunidades del ADN exógeno para integrarse completamente en el genoma celular. Una forma para aumentar las oportunidades de integrarse completamente en el genoma consiste en añadir algunos nucleótidos protuberantes de ADN monocatenario cohesivos a cada extremo del ADN exógeno, por ejemplo, preparados por digestión con la misma enzima de restricción. Estas extremidades cohesivas permiten que los fragmentos de ADN se asocien en un multímero y evitan la degradación completa del ADN antes de su integración. Otra forma para aumentar las oportunidades es rodear el fragmento de ADN para integrarlo con secuencias de ADN largas y neutras. En el caso del ADN exógeno está incluido en un plásmido superenrollado, el fragmento integrado comprende no sólo el ADN exógeno, sino también el vector completo.
- -
- El tercer problema es el control del número de copias integradas. La multimerización, deliberada o no, del ADN exógeno presenta el inconveniente de favorecer la inserción de varias copias del fragmento de ADN exógeno. Similarmente, cuando el ADN exógeno tiene una forma circular, el plásmido se integra como un concatémero. Esta inserción múltiple tiene por consecuencia introducir una inestabilidad de cromosoma y dar como resultado problemas de regulación de la expresión debido a la presencia del mismo gen en múltiples copias.
\vskip1.000000\baselineskip
La transgénesis es más que nunca una herramienta
esencial para los biólogos. El estudio de enfermedades humanas se
basa en gran parte en el uso de modelos animales. Están disponibles
una gran cantidad de informaciones de secuencias génicas para la
industria farmacéutica. Estas informaciones proporcionarían nuevas
dianas para fármacos. Sin embargo, la función de la mayoría de los
genes y las proteínas relacionadas en un organismo sigue siendo
desconocida y la eficiencia de la validación de dianas no parece
haber cambiado significativamente.
Los estudios genéticos y la genómica estructural
han mostrado que las rutas bioquímicas y la fisiología están
sumamente conservadas en todo el mundo animal. Por tanto, pueden
usarse modelos animales para investigar procedimientos relevantes
para enfermedades humanas. El modelo animal puede usarse para
identificar y validar eficazmente dianas de cribado óptimas. La
selección de dianas de cribado puede mejorarse y conducirá a menos
fallos y a un procedimiento de desarrollo de fármacos más
eficaz.
El ratón es un modelo de mamífero muy conocido
que se usa abundantemente. El procedimiento más ampliamente usado
para la producción de animales transgénicos es la microinyección de
ADN en los pronúcleos de embriones fecundados. Este procedimiento
es bastante eficiente para la producción de ratones transgénicos
pero es mucho menos eficaz para la producción de mamíferos
transgénicos grandes tales como vacas y ovejas. Además, los animales
transgénicos del procedimiento de transgénesis disponible son
frecuentemente un mosaico para el transgén dando como resultado la
falta de transmisión del transgén a la progenie. Algunos animales
presentan una alta resistencia a la transgénesis tales como peces o
aves. Entre ellos, el problema de transgénesis de peces se detalla
más a continuación.
Los peces de pecera han alcanzado una alta
popularidad como modelos de vertebrados en la biología y la genética
del desarrollo. De hecho, el pez cebra (Danio rerio) es un
sistema de modelo popular para estudios de desarrollo de
vertebrados porque ofrece la oportunidad de combinar análisis de
genética clásica con un embrión fácilmente accesible y manipulable.
Los estudios genéticos de los peces cebra se benefician del tiempo
de generación de 2-3 meses, la capacidad de las
hembras de poner rutinariamente cientos de huevos y el pequeño
tamaño de los adultos. Los estudios embriológicos se benefician de
los grandes embriones transparentes.
Sin embargo, la utilidad de peces de pecera está
todavía limitada por la falta de algunas herramientas metodológicas,
sobre todo una tecnología simple y eficaz para la transgénesis, que
se ha convertido en una técnica importante en la investigación
fundamental y tiene varias aplicaciones en agronomía y biomedicina.
En particular, los intentos por establecer células madre
embriónicas (ES) en peces como vectores celulares para la
transgénesis ha sido hasta la fecha poco satisfactorios.
Por tanto, el procedimiento de elección para
generar peces transgénicos sigue siendo la inyección de altas
concentraciones de ADN (aproximadamente 10^{6} copias de
plásmidos) en el citoplasma de embriones en la fase de una célula.
Los plásmidos han sido microinyectados en forma linealizada y
circular y en ambos tipos de experimentos se ha logrado la
transgénesis. Esta tecnología es rápida y fácil debido a la
transparencia y al gran tamaño de la mayoría de los huevos de
peces, pero desafortunadamente también es bastante ineficaz con una
frecuencia de integración genómica y transmisión de la línea
germinal que normalmente se encuentra en un intervalo de un pequeño
porcentaje [Stuart y col., 1988 Development 103,
403-412; Stuart y col., 1990, Development 109,
577-584; Culp y col., 1991, Proc Natl Acad Sci USA,
88, 7953-57; Lin y col., 1994 Developmental biology
161, 77-83; Collas y col., 1998 Transgenic Research,
7, 303-309]. Estudios recientes han mostrado que
probablemente esto es debido a integraciones tardías y de mosaicos:
el ADN persiste en una forma sin integrar en el citoplasma del
huevo y sólo es heredado por un subconjunto de blastómeros. Después
de la inyección, las secuencias de plásmidos se amplifican
transitoriamente y forman largos concatémeros que están constituidos
por muchas copias de longitud la unidad del plásmido dispuesto en
tándem (Stuart y col. 1988, anteriormente). El ADN extraño
normalmente se inserta en un sitio en el genoma del huésped pero
normalmente está constituido por matrices de tándem del constructo
inyectado original (Culp y col., 1991, anteriormente).
Generalmente se acepta que es difícil aumentar
la frecuencia de peces transgénicos generados por microinyección de
plásmidos. El inyectar mayores cantidades de ADN es tóxico para los
embriones por lo que debe intentarse mejorar la eficiencia de
integración. Se han realizado varios intentos por mejorar la tasa de
integración y transmisión de transgenes. Por ejemplo, se ha
notificado el uso de complejos de ADN-NLS, aunque la
mayoría de los autores no encontraron mejoras con esta tecnología
[Liang y col., 2000 Mol Reprod Dev 55, 8-13]. En
principio, las tecnologías que usan repeticiones flanqueantes de
virus adenoasociados [Fu, 1998 Nature Biotech, 16,
253-257] o de transposones [Izsvak y col., 2000 J
Mol Biol 302, 93-102] también pueden aumentar la
integración de transgenes. Sin embargo, al leal saber de los
inventores no se han notificado resultados positivos con estas
técnicas, que también experimentan la presencia potencialmente
perjudicial de repeticiones en los plásmidos. Además, estos
vectores están limitados por el tamaño de las secuencias de ADN que
pueden manipularse en ellos. Se ha observado un aumento en la
frecuencia de transformación de fragmentos lineales en Hansenula
polymorpha mediante la adición de una enzima de restricción
(van Dijk y col., 2001 Mol Genet Genomics 266,
646-656). Sin embargo, la adición de enzima de
restricción estaba asociada a una preferencia de integración en
sitios de escisión genómicos de dicha enzima de restricción.
Por tanto, han aparecido varios procedimientos
para mejorar y desarrollar nuevas rutas para aumentar la eficiencia
de la transgénesis. Sin embargo, una cantidad muy limitada de
procedimientos permite un mejor control y quedan varias especies
resistentes o muy ineficaces para esta tecnología. Los principales
problemas encontrados son:
- -
- Control y eficiencia de la transgénesis
- -
- Acontecimientos de integración precoces (transmisión de la línea germinal)
- -
- El control del número de copias integradas.
La presente invención tiene exactamente como
objetivo ofrecer un procedimiento que permita mejorar la eficiencia
de integración aleatoria de ADN durante la transgénesis y permitir
un mejor control de la integridad del ADN integrado, además de
reducir el número de copias de ADN integrado.
El procedimiento para integrar aleatoriamente un
ADN exógeno en el ADN genómico según la invención consiste en la
linealización del polinucleótido de ADN que va a integrarse que no
tiene extremos libres 5' y 3' a partir de un vector en la célula
huésped.
El procedimiento según la invención consiste en
un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en
un genoma de la célula huésped mediante preparación (in vivo
o in ovo) en la célula huésped de dicho polinucleótido
lineal que tiene extremos 5' y 3' libres, comprendiendo dicho
procedimiento:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión y encontrándose dicho sitio de escisión en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado en dicho genoma de la célula huésped.
Opcionalmente, dicho procedimiento comprende
además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en
dicha célula huésped un agente de escisión o un vector que comprende
un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
Preferentemente, dicho procedimiento comprende además, antes de la
etapa (b), una etapa adicional de introducir en dicha célula
huésped dicho agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que
comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es
un vector de expresión o un ARNm. Opcionalmente, dicha célula
huésped es una célula transgénica que expresa dicho agente de
escisión. Dicha secuencia de polinucleótidos que va a integrarse
según la presente invención no puede someterse a recombinación
homóloga con el genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho
polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de identidad
con una secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente
menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de
identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho
polinucleótido que va a integrarse no tienen homología con una
secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del
90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía
más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las
que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud,
preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más
preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente,
los sitios escindidos no generan extremos cohesivos.
Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a
escindirse no comprende ningún sitio de escisión. Preferentemente,
dicho vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va
a linealizarse comprende además dicho ácido nucleico que codifica
dicho agente de escisión. Preferentemente, dicha secuencia de
polinucleótidos está flanqueada por al menos un sitio de escisión.
Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a
linealizarse está flanqueada por dos sitios de escisión.
Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de
endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa
correspondiente. Más preferentemente, dicha endonucleasa tiene un
sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más
preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en
particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha
meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por
I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
Pi-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, Pi-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se
selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu
I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente,
dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es
un vector de ADN bicatenario. Opcionalmente, dicho vector es un
plásmido o un vector viral. Preferentemente, dicho vector es un
plásmido. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos es
una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una
secuencia reguladora o una secuencia de reconocimiento para una
molécula. Preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del
grupo que está constituido por una célula madre, una célula
somática, un gameto, un blastómero y un huevo. Más preferentemente,
dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido
por una célula madre, un blastómero y un huevo. Opcionalmente,
dicho procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido
en un genoma de la célula huésped se usa para transfección estable o
transgénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la presente invención, el
procedimiento consiste en un procedimiento para integrar
aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped
mediante preparación (in vivo o in ovo) en la célula
huésped de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3'
libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las
siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de endonucleasa y encontrándose dicho sitio de endonucleasa en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de endonucleasa no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- opcionalmente, introducir en dicha célula huésped o la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa presente en dicho vector o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa; y,
- c)
- producir la escisión de dicho sitio en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,
- d)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, la etapa b) consiste en
introducir en dicha célula huésped la endonucleasa que escinde dicho
sitio de endonucleasa. Preferentemente, las etapas a) y b) son
simultáneas. Opcionalmente, dicho vector que comprende un ácido
nucleico que codifica dicha endonucleasa es un vector de expresión o
un ARNm. Opcionalmente, dicha célula huésped es una célula
transgénica que expresa dicha endonucleasa. Dicha secuencia de
polinucleótidos que va a integrarse según la presente invención no
puede hacer significativamente una recombinación homóloga con el
genoma de la célula huésped. Opcionalmente, dicho polinucleótido que
va a integrarse tiene menos del 70% de identidad con una secuencia
genómica de la célula huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%,
más preferentemente menos del 40, 30 ó 20% de identidad.
Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido
que va a integrarse no tienen homología con una secuencia genómica
de la célula huésped, preferentemente menos del 90% de identidad,
más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente
menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas
secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud, preferentemente entre
3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100
pb de longitud. Preferentemente, los sitios escindidos no generan
extremos cohesivos. Opcionalmente, dicho vector comprende además una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la endonucleasa.
Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse y dicho ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa
están constituidos cada uno por un vector distinto.
Preferentemente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse no comprende ningún sitio de endonucleasa.
Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos está flanqueada
por al menos un sitio de endonucleasa. Preferentemente, dicha
secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse está flanqueada
por dos sitios de endonucleasa. Preferentemente, dicha endonucleasa
tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos.
Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa,
en particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha
meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por
I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PO-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
Pi-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev y
F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se
selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu
I, I-Cre I y I-Sce I.
Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente,
dicho vector es bicatenario. Opcionalmente, dicho polinucleótido
puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un
antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y
potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una molécula.
Preferentemente, dicha célula huésped se selecciona del grupo que
está constituido por una célula madre, una célula somática, un
gameto, un blastómero y un huevo. Más preferentemente, dicha célula
huésped se selecciona del grupo que está constituido por una célula
madre, un blastómero y un huevo. Opcionalmente, dicho procedimiento
para integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la
célula huésped se usa para transfección estable o transgénesis.
La presente invención se refiere a una
composición para transgénesis o para la transfección estable que
comprende:
- 1)
- un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse aleatoriamente, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,
- 2)
- un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
Preferentemente, dicha composición se usa para
transgénesis. Preferentemente, dicha composición comprende el
agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende un
ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es un vector
de expresión o un ARNm. Dicho transgén que va a integrarse según la
presente invención no puede hacer significativamente una
recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped.
Opcionalmente, dicho transgén que va a integrarse tiene menos del
70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped,
preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del
40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3'
de dicho transgén que va a integrarse no tienen homología con una
secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del
90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía
más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las
que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud,
preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más preferentemente
1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente, los sitios
escindidos no generan extremos cohesivos. Preferentemente, dicho
transgén no comprende ningún sitio de escisión. Opcionalmente, dicho
vector que comprende dicho transgén comprende además una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica el agente de escisión.
Opcionalmente, dicho transgén y dicho ácido nucleico que codifica
dicho agente de escisión están constituidos cada uno por un vector
distinto. Preferentemente, dicho transgén está flanqueado por al
menos un sitio de escisión. Preferentemente, dicho transgén está
flanqueado por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho sitio
de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión
es la endonucleasa correspondiente. Preferentemente, dicha
endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12
nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una
meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2.
Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, Pi-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se
selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu
I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente,
dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es
bicatenario. Preferentemente, dicho vector es un plásmido.
Opcionalmente, dicho transgén puede comprender una secuencia que
codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora
tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento
para una molécula.
La invención se refiere al uso de la composición
según la presente invención para producir células, animales no
humanos o plantas transgénicos. Preferentemente, dichos animales no
humanos se seleccionan de mamíferos no humanos, aves, reptiles,
anfibios y peces. Por ejemplo, la invención contempla ganado
(vacas), cabras, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos
(arañas, mariposas, moscas), peces, calamares, Amphoxius, Xenopus,
aves, pollos, ascidios y razas ovinas (ovejas). Más particularmente,
la invención contempla peces tales como pez espinoso, Astyanax,
medaka y pez cebra, aves como pollos y roedores tales como
ratones.
La presente invención también se refiere a las
células resultantes de cualquier procedimiento de linealización
in vivo o in ovo de un polinucleótido y de integración
de polinucleótidos aleatoria según la presente invención y a sus
usos, por ejemplo, para la producción de proteínas u otros genes,
biomoléculas, biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, plantas
y animales transgénicos o para el tratamiento o la profilaxis de una
afección o trastorno en un individuo. Más particularmente, la
invención se refiere a cualquier animal transgénico no humano y a
cualquier planta transgénica que comprende una célula resultante de
cualquier procedimiento de linealización in vivo de un
polinucleótido y de integración de polinucleótidos aleatoria según
la presente invención. La invención también se refiere a cualquier
uso de una célula, de un animal transgénico no humano o de una
planta transgénica según la presente invención para la producción de
proteína, antisentido, biomolécula, biomaterial o vacuna. La
invención se refiere además al uso de cualquier célula resultante
para el tratamiento o la profilaxis de una afección o trastorno en
un individuo.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética
en un individuo en necesidad del mismo mediante integración
aleatoria de un polinucleótido que comprende las etapas de:
- a)
- Introducir en dicha célula del individuo un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula del individuo a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dichas células del individuo creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula del individuo; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dichas células del genoma del individuo; dicha integración aleatoria de dicho polinucleótido compensa el defecto genético que causa dicha enfermedad genética.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, dicho procedimiento comprende
además, antes de la etapa (b), una etapa adicional de introducir en
dichas células del individuo un agente de escisión o un vector que
comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
Dicha secuencia de polinucleótidos que va a integrarse según la
presente invención no puede hacer significativamente una
recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped.
Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos
del 70% de identidad con una secuencia genómica de la célula
huésped, preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente
menos del 40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias
de 5' y 3' de dicho polinucleótido que va a integrarse no tienen
homología con una secuencia genómica de la célula huésped,
preferentemente menos del 90% de identidad, más preferentemente
menos del 80 ó 70%, todavía más preferentemente menos del 50, 40, 30
ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y 3' tienen
5 kb de longitud, preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud,
más preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud.
Preferentemente, los sitios escindidos no generan extremos
cohesivos. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que
va a escindirse no comprende ningún sitio de escisión.
Preferentemente, dicho vector que comprende dicha secuencia de
polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse comprende además
dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que va a
linealizarse o escindirse está flanqueada por al menos un sitio de
escisión. Preferentemente, dicha secuencia de polinucleótidos que
va a linealizarse o escindirse está flanqueada por dos sitios de
escisión. Preferentemente, dicho sitio de escisión es un sitio de
endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa
correspondiente. Más preferentemente, dicha endonucleasa tiene un
sitio de reconocimiento de al menos 12 nucleótidos. Todavía más
preferentemente, dicha endonucleasa es una meganucleasa, en
particular una meganucleasa de la Figura 2. Opcionalmente, dicha
meganucleasa se selecciona del grupo que está constituido por
I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, Pl-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv 1, F-Tev I y
F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se
selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu
I, I-Cre I y I-Sce I.
Opcionalmente, dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente,
dicho vector es un vector de ADN bicatenario. Opcionalmente, dicho
vector es un plásmido o un vector viral. Preferentemente, dicho
vector es un plásmido. Preferentemente, dicha secuencia de
polinucleótidos es una secuencia que codifica un polipéptido o un
antisentido, una secuencia reguladora o una secuencia de
reconocimiento para una molécula. Preferentemente, dichas células
del individuo es una célula madre o una célula somática.
La invención se refiere a un procedimiento para
producir un animal transgénico. Más particularmente, la invención
se refiere a un procedimiento para producir un animal transgénico no
humano en el que las células madre embriónicas se transfectan
mediante el procedimiento según la presente invención y se criban
para el acontecimiento de integración aleatoria, las células se
inyectan en embriones en una fase en la que pueden integrar las
células transfectadas, por ejemplo, en la fase de blastocisto, los
embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los
individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los
que se observa la colonización por células madre embriónicas de la
línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos. Por
lo demás, la invención se refiere a un procedimiento para producir
un animal transgénico no humano en el que los huevos fecundados se
transfectan mediante el procedimiento según la presente invención, y
o los huevos se reimplantan en una madre sustituta y los individuos
transgénicos se obtienen al final de la gestación o los huevos se
incuban en condiciones apropiadas para el desarrollo del animal
transgénico.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un diagrama esquemático que
representa una realización del procedimiento para integrar un
transgén siendo dicho transgén liberado in vivo a partir de
un vector de plásmido superenrollado. El transgén está flanqueado
por dos sitios de escisión. El agente de escisión se añade y produce
in vivo una rotura bicatenaria en los dos sitios de
escisión. El transgén lineal se libera y una copia del transgén se
integra en el genoma.
La Figura 2 es una tabla que desvela la
meganucleasa conocida. T. significa teórico, Exp demonstración
experimental y Pot potencial.
La Figura 3 es un diagrama esquemático que
representa algunas rutas para la preparación del vector lineal
según la presente invención.
La Figura 4 es un diagrama esquemático de
constructos de ADN descritos en el Ejemplo 1.
"I-Sce I" se refiere al sitio de
reconocimiento y de escisión de la endonucleasa
I-Sce I. "IR" se refiere a repetición
invertida. "pA_{sv40}" se refiere a la señal de
poliadenilación de SV40.
La Figura 5 es un diagrama esquemático que
desvela el sistema de validación usado en el Ejemplo 1.
"I-Sce I", "IR", "pA_{sv40}" se
refieren respectivamente al sitio de reconocimiento y de escisión de
la endonucleasa I-Sce I, repetición invertida y la
señal de poliadenilación de SV40.
La Figura 6 es una reproducción fototipográfica
de un gel de electroforesis del análisis de Southern después de una
digestión con EcoR V del genoma de la célula transfectada con
tanto pVirtkU3R\betageo como pCMV-1 SceI y un
diagrama que describe el fragmento de restricción obtenido. +IN
significa que las células también se transfectaron con un plásmido
que codifica una integrasa. Si una copia del fragmento
\DeltaU_{3}RfigeopA_{sv40} se integra en el genoma de la
célula, el análisis de Southern muestra una banda a 1,2 kb y otra de
al menos 2,5 kb. Si el fragmento
\DeltaU_{3}R\betageopA_{sv40} se integra en el genoma de la
célula con al menos dos copias consecutivas, el análisis de
Southern muestra al menos una banda a 1,2 kb y una banda a 2,5
kb.
La Figura 7 muestra los resultados de la
transfección estable en células COS con el procedimiento de
linealización in vivo.
La Figura 7A es una diagrama que ilustra la
estructura del constructo ppSNIE. Los sitios de escisión HindIII y
I-Sce I (I-SceICS) están indicados
además por la localización de la sonda NEO (Probe).
La Figura 7B es una reproducción fototipográfica
de un análisis de transferencia de Southern. La transferencia
izquierda se corresponde con una cotransfección con los plásmidos
ppSNIE y pCMV-I-SceI (-). La
transferencia derecha se corresponde con una cotransfección con los
plásmidos ppSNIE y pCMV-I-SceI
(+).
La Figura 8 muestra la expresión transitoria de
GFP en embriones inyectados con
\alpha-actina-GFP.
La Figura 8A es un diagrama que ilustra la
mejora de la expresión transitoria de GFP cuando la meganucleasa se
añade al tampón de inyección. Paneles derechos: embriones
descorionados que expresan GFP a diferentes niveles. Para
observaciones rutinarias, los coriones no se eliminan. S: fuerte; M:
moderado; D: débil.
La Figura 8B es una tabla que resume las
frecuencias de los diferentes patrones de expresión muscular de GFP
agrupada como se muestra en la figura 7A. N (negativo), D (débil), M
(moderado) y fuerte (F).
La Figura 9 muestra la eficiencia de la
transgénesis en medaka.
La Figura 9A es una tabla que muestra la
eficiencia de la transgénesis en medaka tras la inyección de
p\alphaact-GFPM2. Carril 1: fragmento lineal
correspondiente al promotor de \alpha-actina y el
gen indicador GFP obtenido por digestión con I-SceI
in vitro y purificación en gel de agarosa.
La Figura 9B es una reproducción fototipográfica
de un análisis de transferencia de Southern de estructuras de
inserto en líneas p\alphaact-GFPM2 inyectadas con
(carriles 1 a 4) o sin (carril C) la meganucleasa. P: control
p\alphaact-GFPM2 digerido con BamHI. Promotor de
\alpha-actina: cuadro gris. EGFP, poliA: cuadro
blanco. La enzima de restricción usada en el filtro representado es
BamHI. La sonda usada se obtuvo con digestos de XhoI y EcoRV y se
corresponde con el promotor de actina y el gen indicador GFP. En
Southern, dos fragmentos de 1 y 2 kb correspondientes
respectivamente a GFP/pA y a la región aguas abajo del promotor de
actina (3'\alphap) se observan en el carril 1 a 4.
5'\alphap+pBluSK: banda de 4,8 kb, diagnóstico de la región aguas
arriba del promotor ligado a la secuencia de plásmi-
dos.
dos.
La Figura 10 es un diagrama esquemático de los
constructos de plásmidos usados para la transgénesis mediada por
meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por
un vector que expresa I-SceI.
La Figura 10A es un diagrama del constructo de
plásmidos Megafluo. Las flechas I-Sce I indican la
localización del sitio de escisión de I-Sce I. Un
promotor fuerte (promotor del gen Gas5 de ratón) está dirigiendo la
transcripción de un indicador fluorescente
(DSRed1-E5 de Clontech). Dos sitios de
reconocimiento/escisión de I-Sce I en la misma
orientación están flanqueando el transgén subclonado en un derivado
de vector pUC.
La Figura 10B es un diagrama del vector que
expresa I-Sce I (pl-SceI/EGFP). La
secuencia codificante de la proteína I-Sce I se
subclonó en el MCS de pIRES2-EGFP (Clontech). El
promotor de CMV está accionando la transcripción de un único ARN de
tanto la proteína I-Sce I como del indicador
fluorescente de EGFP como una expresión bicistrónica.
La Figura 11 muestra los resultados de la
transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in
ovo del transgén por un vector que expresa
I-SceI.
La Figura 11A es una reproducción
fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la extracción de
ADN genómico. Los carriles 1, 25, 2, 3, 4 son extracción de ADN
genómico de ratones de tres semanas de edad. Los carriles A y B son
extracción de ADN genómico de ratones nacidos muertos. Se cargaron
aproximadamente 500 ng de DBA en un gel de agarosa al 1% en TAE. El
ADN genómico de los animales nacidos muertos (A y B) se degrada como
cabía esperar a partir del animal muerto, pero todavía puede usarse
el ADN para un análisis por PCR.
La Figura 11B es una reproducción
fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación
por PCR de un fragmento del gen \beta-globina de
ratón y de la secuencia de indicador de Megafluo (Red5). Panel
izquierdo: todas las muestras de ADN genómico son adecuadas para
amplificación por PCR ya que se detecta el producto de PCR de 494
pb para el gen \beta-globina. Panel derecho: los
animales 1 y 25 y el animal nacido muerto A son transgénicos ya que
se detecta el fragmento de 484 pb del gen indicador Megafluo
(DSRedE1-5). Los carriles 1, 25, 2, 3, 4 son
extracción de ADN genómico de ratones de tres semanas de edad. Los
carriles A y B son extracción de ADN genómico de ratones nacidos
muertos. El control negativo (-) se corresponde con el plásmido
pl-SceI/EGFP. El control positivo (+) se corresponde
con el plásmido de Megafluo. Wt se corresponde con ADN genómico
extraído de ratones sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el
control de contaminación por PCR realizado sin ADN.
La Figura 11C es una reproducción
fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación
por PCR de un subfragmento de pl-Sce I/EGFP. El
control positivo (+) se corresponde con el plásmido
pl-SceI/EGFP. Wt se corresponde con ADN genómico
extraído de ratones sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el
control de contaminación por PCR realizado sin ADN.
La Figura 12 muestra los resultados de la
"transgénesis clásica". La Figura 12 es una reproducción
fototipográfica de un gel de agarosa que muestra la amplificación
por PCR de la secuencia de indicador de Megafluo (Red5). Los
carriles 14 a 21 se corresponden con los 8 recién nacidos.
La Figura 13 es un diagrama esquemático de los
constructos de plásmidos usados para la transgénesis mediada por
meganucleasa mediante linealización in ovo del transgén por
un vector que expresa PI-SceI. El promotor de Gas5
acciona la expresión del gen indicador LagoZ (una secuencia de LacZ
casi libre de CPG). Estas dos secuencias están flanqueadas por dos
sitios de reconocimiento/escisión de PI-SceI en la
misma orientación que separan las secuencias de esqueleto del
vector. Un único sitio de I-SceI de
reconocimiento/escisión está presente entre el promotor y el gen
indicador.
La Figura 14 muestra los resultados de la
transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in
ovo del transgén por la proteína I-Sce I o
PI-Sce I con el constructo
PIFF-Lago. La Figura 14 es una reproducción
fototipográfica de un gel de agarosa que muestra los resultados de
PCR de un fragmento del gen indicador (LagoZ). El control positivo
se corresponde con el plásmido PIFFLago. Wt se corresponde con un
ADN genómico de ratón sin inyectar B6SJL. C se corresponde con el
control de contaminación por PCR realizado sin ADN.
Panel izquierdo: se realiza el genotipado por
PCR en los ADN genómicos de los nueve embriones de 12 días después
de la inoculación (dpi) inyectados con el plásmido PIFFLago más
proteína I-SceI. El producto de PCR de 370 pb del
indicador Lago se detecta en cuatro de nueve embriones (número 101,
102, 103, 105).
Panel derecho: se realiza el genotipado por PCR
en los ADN genómicos de los nueve embriones de 14 dpi inyectados
con el plásmido PIFFLago más proteína I-SceI. El
producto de PCR de 370 pb del indicador Lago se detecta en tres de
diez embriones (número 111, 112, 114).
La Figura 15 muestra los resultados de la
transgénesis mediada por meganucleasa mediante linealización in
ovo del transgén por la proteína I-Sce I con el
constructo PIFF-Lago. La Figura 14 es una
reproducción fototipográfica de un análisis de transferencia de
Southern.
El genotipado de los nueve embriones de 12 dpi
inyectados con plásmido PIFFLago más proteína I-SceI
se realiza por experimentos de transferencia de Southern. Los ADN
genómicos se digirieron con enzima de restricción EcoRI. Se usaron
dos sondas diferentes marcadas con digoxigenina; una que se hibrida
a las secuencias de Gas5 y la segunda al gen indicador Lago. La
detección se realiza con el sustrato CDP-Star
(Roche) quimioluminiscente sobre películas Hyperfilm ECL
(Amersham). Se detecta un fragmento de 3,1 kpb con la sonda Gas5 y
se corresponde con el gen Gas5 de ratón endógeno. Los animales 105,
103 y 101 son transgénicos ya que se detecta una banda adicional.
Este fragmento también se detecta cuando la transferencia se
deshibrida y se vuelve a sondar con la sonda Lago (panel
derecho).
Por "transgénesis" se pretende la
introducción de nuevas secuencias de ADN en el genoma,
preferentemente dando como resultado la producción de animales o
plantas transgénicos.
Como se usa indistintamente en el presente
documento, los términos "ácido nucleico"
"oligonucleótido" y "polinucleótido"
incluyen ARN, ADN o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un
nucleótido en o bien la cadena sencilla o la forma de dúplex. El
término "polinucleótido" se refiere a un polímero de unidades
que comprenden una purina o pirimidina, un resto de azúcar de
ribosa o desoxirribosa y un grupo fosfato, o enlace fosfodiéster.
"Polinucleótidos" también se refiere a polinucleótidos que
comprenden "nucleótidos modificados" que comprenden al menos
una de las siguientes modificaciones (a) un grupo de enlace
alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga
de pirimidina o (d) un azúcar análogo.
Por "in vivo" se desea en una célula
estando dicha célula aislada o comprendida en un organismo. El
término "in vivo" engloba "in ovo". Por
"in ovo" se desea en un huevo.
Flanqueado: Un polinucleótido que va a
linealizarse o escindirse está flanqueado por un sitio de escisión
si un sitio tal está presente en o cerca tanto en uno como en ambos
extremos del polinucleótido. Puede haber un sitio de escisión
presente o cerca de un extremo del polinucleótido que va a
linealizarse o escindirse o puede haber dos sitios de escisión, uno
en o cerca de cada extremo del polinucleótido que va a linealizarse
o escindirse. Por "cerca" se desea preferentemente en la
presente invención que el sitio de escisión se localice a menos de
1 kb, preferentemente menos de 500 pb, más preferentemente menos de
200 ó 100 pb del extremo del polinucleótido que va a
integrarse.
Por escisión se pretende en la presente
invención la formación de una rotura bicatenaria de ADN. Por
"agente de escisión" se desea el agente que puede escindir el
"sitio de escisión".
Por "endonucleasa" se desea una enzima que
produce una rotura bicatenaria en la molécula de ADN en
localizaciones altamente específicas. Esta endonucleasa puede ser
natural. Preferentemente, la enzima es una endonucleasa o
meganucleasa casera. Esta endonucleasa también puede ser
sintética.
Por "biomolécula" se pretende en la
presente invención cualquier molécula orgánica que es una parte
esencial de un organismo vivo tal como polipéptido, proteína,
polinucleótido de ADN o ARN.
Por "extremos libres" se pretenden
extremos romos y nucleótidos protuberantes de 5' o 3' disponibles
para la degradación de exonucleasa. Por tanto, en el caso de una
molécula lineal, cualquier modificación de 5' y 3' que suprima o
disminuya significativamente la degradación de exonucleasa no se
considerará como extremos libres. Por ejemplo, un polinucleótido
lineal que comprende estructuras secundarias o nucleótidos
modificados en sus extremidades que confieren una resistencia a
exonucleasa no se considera que tenga extremos libres.
"Células" o "células huésped"
son términos usados indistintamente en este documento. Se entiende
que tales términos se refieren no sólo a la célula objeto
particular, sino a la progenie o la posible progenie de una célula
tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en
generaciones sucesivas debido tanto a una mutación como a
influencias medioambientales, tal progenie puede no ser idéntica a
la célula parental, pero todavía están incluidas dentro del alcance
del término como se usa en este documento. La célula puede ser una
célula madre (preferentemente una célula madre embriónica), una
célula somática, un gameto, un blastómero y un huevo
(preferentemente un huevo fecundado).
Por "polinucleótido exógeno" se
pretende un polinucleótido sin ninguna similitud con el cromosoma
de la célula huésped. Por "sin similitud" se desea menos del
50% de identidad, preferentemente 40 ó 30% de identidad, más
preferentemente menos del 20% de identidad con una secuencia del
cromosoma de la célula huésped. La similitud de polinucleótidos es
tan baja que el polinucleótido no puede hacer recombinación
homóloga con el cromosoma de la célula huésped.
"Identidad" se refiere a identidad de
secuencias entre dos moléculas de ácidos nucleicos. La identidad
puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que
puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en
la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las
moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o
identidad entre secuencias de ácidos nucleicos es una función del
número de nucleótidos idénticos o de apareamiento en posiciones
compartidas por las secuencias de ácidos nucleicos. Pueden usarse
diversos algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la
identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST que están
disponibles como una parte del paquete de análisis de secuencias por
GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con,
por ejemplo, parámetros por defecto.
Como se usa en este documento, el término
"transgén" significa una secuencia de ácidos nucleicos
(o un transcrito antisentido para la misma) que se ha introducido
en un genoma de la célula. Un transgén podría ser parcial o
completamente heterólogo, es decir, extraño para el animal/planta o
célula transgénico en el que se introduce; o es homólogo a un gen
endógeno del animal o célula transgénico en el que se introduce,
pero se introduce en el genoma del animal en una localización que
se diferencia de la del gen natural. Un transgén puede incluir una
o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro
ácido nucleico tal como intrones que pueden ser necesarios para la
expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado. En toda la
presente invención, el polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse e integrarse es un transgén.
Los "animales no humanos" o
"animales transgénicos" de la invención incluyen, pero no se
limitan a, mamíferos tales como roedores, primates no humanos,
ovejas, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, peces, ascidios.
Los animales no humanos preferidos se seleccionan de la familia de
los roedores que incluye rata y ratón, lo más preferentemente
ratón, aunque los anfibios transgénicos tales como miembros del
género Xenopus y los pollos transgénicos, vaca, ovejas, y peces
también pueden proporcionar herramientas importantes.
Un "animal transgénico" o
"planta transgénica" se refiere a cualquier animal o
planta en el que una o más de las células del animal o planta
contienen un transgén introducido a modo de intervención humana tal
como por técnicas transgénicas muy conocidas en la técnica. El
transgén se introduce en la célula, directamente o indirectamente
mediante introducción en un precursor de la célula, a modo de
manipulación genética deliberada tal como por microinyección o por
infección con un virus recombinante. El término manipulación
genética no incluye cruce clásico ni fecundación in vitro,
sino que se refiere a la introducción de una molécula de ADN
recombinante. Esta molécula se integra dentro de un cromosoma.
Además, "animal transgénico" o "planta transgénica"
también incluye aquellos animales o plantas recombinantes en los que
la alteración génica de uno o más genes se produce por intervención
humana que incluye la técnica antisentido. Por animal transgénico
también se desea un embrión transgénico.
El término "vector" se refiere a una
molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico
al que se ha ligado. Un tipo de vector preferido es un episoma, es
decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Los
vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o
expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados. Los vectores
que pueden dirigir la expresión de genes a los que están
operativamente ligados se denominan en este documento "vectores
de expresión". Un vector según la presente invención comprende,
pero no se limita a, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un
BAC (artificial bacteriano), un vector de baculovirus, un fago, un
fagómido, un cósmido, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN
o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede estar
constituida por un ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético o
sintético. En general, los vectores de expresión de utilidad en las
técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de
"plásmidos" que se refieren generalmente a bucles de ADN
bicatenario circular que, en su forma de vector, no están unidos al
cromosoma. Aquellos expertos en la materia conocen una gran cantidad
de vectores adecuados y están comercialmente disponibles tales como
los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60,
pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiXI74,
pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene);
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene);
pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pOE-30
(QIAexpress).
Los vectores virales incluyen retrovirus,
adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados),
coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como
ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por
ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular),
paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de
cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN
bicatenario que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo,
virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de
Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por
ejemplo, variolovacuna, viruela aviar y canaripox). Otros virus
incluyen, por ejemplo, virus de Norwalk, togavirus, flavivirus,
reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis.
Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma
aviar, tipo C de los mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D,
grupo de HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin,
J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en
Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Fields, y col., Eds.,
Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
Otros ejemplos incluyen virus de la leucemia murina, virus del
sarcoma murino, virus del tumor mamario de ratón, virus de la
leucemia bovina, virus de la leucemia felina, virus del sarcoma
felino, virus de la leucemia aviar, virus de la leucemia de células
T humanas, virus endógeno de babuino, virus de la leucemia del mono
gibón, virus del mono Mason Pfizer, virus de la inmunodeficiencia
simia, virus del sarcoma simio, virus del sarcoma de Rous y
lentivirus. Otros ejemplos de vectores se describen, por ejemplo, en
McVey y col., documento US5.801.030, cuyas enseñanzas se incorporan
en este documento por referencia.
Los vectores según la presente invención pueden
comprender transposón (Ivicz y col. 1997, Cell, 91,
501-510; Raz y col., 1998, Current Biology, 8,
82-88; cuya divulgación se incorpora en este
documento por referencia).
Los vectores pueden comprender marcadores de
selección (por ejemplo, neomicina fosfotransferasa, histidinol
deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina
fosfotransferasa, timidina cinasa del virus del herpes simple,
adenosina desaminasa, glutamina sintetasa e
hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa
para cultivo celular eucariota; TRP1 para S. cerevisiae;
resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E.
coli; etc.). Sin embargo, se desea que la invención incluya
otras formas tales de vectores de expresión que cumplen funciones
equivalentes y que se harán conocidas en la técnica posteriormente a
la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene exactamente como
objetivo ofrecer un procedimiento que permita mejorar la eficiencia
de integración aleatoria de ADN durante la transgénesis o la
transfección estable y permitir un mejor control de la integridad
del ADN integrado, además de reducir el número de copias de ADN
integrado. La aplicación más interesante de la presente invención
es la transgénesis, más particularmente en especies en las que el
procedimiento de transgénesis es ineficaz.
El procedimiento según la invención consiste en
la linealización o escisión (in vivo) en la célula huésped
del polinucleótido de ADN que va a integrarse en el genoma de la
célula huésped (véase la Figura 1). La invención se refiere a un
procedimiento para integrar aleatoriamente un ADN exógeno en el ADN
genómico de la célula huésped en la que el polinucleótido que va a
integrarse está linealizado o escindido in vivo a partir de
un vector. La linealización o escisión in vivo del
polinucleótido que va a integrarse permite generar un fragmento
lineal con extremos libres disponible para recombinarse con el ADN
genómico de la célula huésped. Según este procedimiento, dicho
vector no tiene extremos libres que permitan la protección del
transgén contra la degradación. El procedimiento según la presente
invención no usa la recombinación homóloga. La integración de
polinucleótidos es aleatoria y no está dirigida a diana.
Por tanto, la invención se refiere a un
procedimiento para la generación in vivo de un polinucleótido
lineal con extremos libres 5' y 3' que se corresponden
esencialmente al transgén a partir de polinucleótido que no tiene
extremo libre, estando dicho polinucleótido lineal aleatoriamente
integrado en el genoma de la célula huésped. En una realización
particular de este procedimiento, dicho polinucleótido comprende el
vector que tiene un sitio de escisión, en el que dicho sitio de
escisión se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de
5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho
sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula
huésped. En una realización preferida de este procedimiento, dicho
polinucleótido comprende el vector y está flanqueada por un sitio
de escisión, en el que dicho sitio de escisión se encuentra en el
genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2
copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se
encuentra en el genoma de la célula huésped. Preferentemente, el
sitio escindido no genera extremos cohesivos. Preferentemente,
dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse in
vivo no comprende ningún sitio de escisión. Opcionalmente,
dicho vector comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el agente de escisión. Preferentemente, dicho sitio de
escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de escisión es
la endonucleasa correspondiente. Opcionalmente, el ácido nucleico
que codifica el agente de escisión comprende un vector de
expresión. Opcionalmente, el ácido nucleico que codifica el agente
de escisión es un ARNm. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede
comprender una secuencia que codifica un polipéptido o un
antisentido, una secuencia reguladora tal como promotor y
potenciador, y/o una secuencia de reconocimiento para una
molécula.
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El procedimiento según la invención consiste en
un procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en
el genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo
de dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a
partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las
siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, el procedimiento según la
invención consiste en un procedimiento para integrar aleatoriamente
un polinucleótido en el genoma de la célula huésped preparando in
vivo dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3'
libres a partir de un vector, comprendiendo dicho procedimiento las
siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la presente invención, el
procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el
genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de
dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a
partir de un vector comprende las siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias;
- b)
- introducir el agente de escisión o un vector que codifica dicho agente de escisión; y,
- c)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,
- d)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización de la presente invención, el
procedimiento para integrar aleatoriamente un polinucleótido en el
genoma de la célula huésped mediante preparación in vivo de
dicho polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a
partir de un vector comprende las siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped:
- -
- un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias; y,
- -
- el agente de escisión;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal de dicho vector que tiene extremos 5' y 3' libres en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido linealizado o escindido en dicho genoma de la célula huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de la invención es
extraordinario porque la liberación del polinucleótido que va a
integrarse sólo puede hacerse in vivo después de cruzar la
membrana plasmídica de la célula huésped, supuestamente dentro del
núcleo. Después de cruzar la membrana plasmídica, la liberación de
los extremos del polinucleótido, preferentemente por la
endonucleasa, puede lograrse en cualquier momento o en cualquier
compartimento de la célula huésped.
Sorprendentemente, la integridad del
polinucleótido que va a integrarse se mantiene, la eficiencia de la
transgénesis aumenta significativamente en comparación con tanto el
ADN circular como el ADN linealizado in vitro y el
polinucleótido se integra a un número de copias muy bajo. Para los
ratones, la tasa de transgénesis aumenta de 3 a 5 veces con el
procedimiento según la presente invención. Además, la integridad del
transgén es excelente y el transgén se integra frecuentemente en el
genoma de la célula a menos de tres copias, más frecuentemente sólo
una copia. Mediante procedimientos convencionales se integran al
menos de 10 a 20 copias como un concatémero y, si sólo se integra
una copia, que es un acontecimiento muy raro, la integridad del
transgén no se mantiene.
Más particularmente, la presente divulgación
muestra que la transgénesis mediada por meganucleasa es de hecho
una técnica muy simple que es espectacularmente más eficaz que los
otros procedimientos actualmente notificados en peces. El
procedimiento según la presente invención permite integrar
eficazmente ADN en el genoma de peces, más particularmente el
genoma de peces medaka (Oryzias latipes) o peces cebra
(Danio rerio) (véase el Ejemplo 2). La expresión del
transgén mejora espectacularmente. Incluso más sorprendente es el
espectacular aumento en la transmisión de la línea germinal.
Mientras que en experimentos de inyección en huevo clásicos no se
supera, en la mayoría de los casos, un pequeño porcentaje debido a
las integraciones quiméricas tardías, la frecuencia de transmisión
de la línea germinal en peces coinyectados con la meganucleasa se
reforzó al 50%, sugiriendo que se produjo una única inserción en la
fase de una célula del pez fundador. Además, en la mayoría de los
casos se producen integraciones únicas a bajas copias. Por tanto, la
linealización in ovo inducida por meganucleasa, limitando la
degradación de extremos libres de ADN preintegrativos, es un
procedimiento simple y eficaz para mejorar la transgénesis por
inyección en el huevo. Además, la generación de extremos libres de
polinucleótidos en la célula puede crear focos de recombinación que
podrían mejorar la integración de transgenes.
Por tanto, el procedimiento según la presente
invención presenta varias ventajas entre las cuales el aumento de
la eficiencia de la transgénesis o de la transfección estable y la
disminución del número de copias del polinucleótido integrado.
El procedimiento según la presente invención se
refiere a la integración aleatoria del transgén. Por tanto, el
transgén no está diseñado para someterse a recombinación homóloga
con el genoma de la célula huésped. La secuencia de 5' y 3' del
polinucleótido que va a integrarse en el genoma no tienen homologías
significativas con un locus del genoma del huésped. Opcionalmente,
dicho polinucleótido que va a integrarse tiene menos del 70% de
identidad con una secuencia genómica de la célula huésped,
preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del
40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3'
de dicho polinucleótido que va a integrarse tienen menos del 90% de
identidad con una secuencia genómica de la célula huésped,
preferentemente menos del 80 ó 70%, más preferentemente menos del
50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las que dichas secuencias de 5' y
3' tienen menos de 5 kb de longitud, preferentemente menos de 3 kb o
1,5 kb de longitud, más preferentemente menos de 1 kb, 500 pb o 100
pb de longitud.
Para introducir un transgén en un huevo de ratón
por recombinación homóloga, el experto en la materia normalmente
flanquea el transgén con aproximadamente 5 kb de secuencia homóloga,
nunca menos de 3 kb. La recombinación homóloga en huevo es un
acontecimiento extremadamente raro. De hecho, con 5 kb de secuencia
homóloga, la recombinación homóloga se produce en sólo 1 clon de
entre los 10 millones de huevos fecundados. En células embriónicas
de peces, la recombinación homóloga nunca se produce, más
particularmente en huevo fecundado de peces.
Para la transgénesis, el agente de escisión se
coinyecta preferentemente con el vector que comprende el transgén.
De hecho, una coinyección del agente de escisión evita el retraso
debido a la expresión del agente de escisión. Una integración
precoz del transgén es importante para disminuir el mosaicismo.
En una realización de la presente invención, el
procedimiento consiste en un procedimiento para integrar
aleatoriamente un polinucleótido en el genoma de la célula huésped
mediante preparación in vivo de dicho polinucleótido lineal
que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector,
comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, estando dicho polinucleótido flanqueado por al menos un sitio de endonucleasa que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente menos del 2, más preferentemente nunca se encuentra en el genoma de la célula huésped:
- b)
- opcionalmente, introducir en dicha célula huésped o la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa presente en dicho vector o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa de restricción; y,
- c)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,
- d)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido escindido en dicho genoma de la célula huésped.
En una realización particular de este
procedimiento, dicho polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse está flanqueado por dos sitios de endonucleasa.
Preferentemente, la etapa b) consiste en introducir en dicha célula
huésped la endonucleasa que escinde dicho sitio de endonucleasa
presente en dicho vector. Preferentemente, las etapas a) y b) son
simultáneas. Preferentemente, los sitios escindidos no generan
extremos cohesivos. Opcionalmente, dicho vector comprende además
una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la endonucleasa.
Opcionalmente, dicho polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse y dicho ácido nucleico que codifica dicha endonucleasa
están constituidos cada uno por un vector distinto. Preferentemente,
dicho polinucleótido que va a linealizarse o escindirse no
comprende ningún sitio de escisión. Preferentemente, dicho vector es
bicatenario. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender
una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una
secuencia reguladora tal como promotor y potenciador, y/o una
secuencia de reconocimiento para una molécula. Preferentemente,
dicha célula huésped se selecciona del grupo que está constituido
por una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero
y un huevo.
La presente invención se refiere a una
composición para transgénesis que comprende:
- 1)
- un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse, estando dicho transgén flanqueado por al menos un sitio de escisión que se encuentra en el genoma de la célula huésped a menos de 5 copias, preferentemente 2 copias, y más preferentemente dicho sitio de escisión no se encuentra en el genoma de la célula huésped; y,
- 2)
- un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
Preferentemente, dicha composición comprende el
agente de escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende un
ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión es un vector de
expresión o un ARNm. Dicho transgén que va a integrarse según la
presente invención no puede hacer significativamente una
recombinación homóloga con el genoma de la célula huésped.
Opcionalmente, dicho transgén que va a integrarse tiene menos del
70% de identidad con una secuencia genómica de la célula huésped,
preferentemente menos del 60 ó 50%, más preferentemente menos del
40, 30 ó 20% de identidad. Opcionalmente, las secuencias de 5' y 3'
de dicho transgén que va a integrarse no tienen homología con una
secuencia genómica de la célula huésped, preferentemente menos del
90% de identidad, más preferentemente menos del 80 ó 70%, todavía
más preferentemente menos del 50, 40, 30 ó 20% de identidad, en las
que dichas secuencias de 5' y 3' tienen 5 kb de longitud,
preferentemente entre 3 kb y 1,5 kb de longitud, más
preferentemente 1 kb, 500 pb o 100 pb de longitud. Preferentemente,
los sitios escindidos no generan extremos cohesivos.
Preferentemente, dicho transgén no comprende ningún sitio de
escisión. Opcionalmente, dicho vector que comprende dicho transgén
comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el
agente de escisión. Opcionalmente, dicho transgén y dicho ácido
nucleico que codifica dicho agente de escisión están constituidos
cada uno por un vector distinto. Preferentemente, dicho transgén
está flanqueado por dos sitios de escisión. Preferentemente, dicho
sitio de escisión es un sitio de endonucleasa y dicho agente de
escisión es la endonucleasa correspondiente. Preferentemente, dicha
endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al menos 12
nucleótidos. Todavía más preferentemente, dicha endonucleasa es una
meganucleasa, en particular una meganucleasa de la Figura 2.
Opcionalmente, dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II. Preferentemente, dicha meganucleasa se
selecciona del grupo que está constituido por I-Ceu
I, I-Cre I y I-Sce I. Opcionalmente,
dicha endonucleasa es sintética. Preferentemente, dicho vector es
bicatenario. Preferentemente, dicho vector es un plásmido.
Opcionalmente, dicho transgén puede comprender una secuencia que
codifica un polipéptido o un antisentido, una secuencia reguladora
tal como promotor y potenciador, y/o una secuencia de
reconocimiento para una molécula.
La invención se refiere al uso de la composición
según la presente invención para producir células, animales o
plantas transgénicos.
El sitio de escisión según la presente invención
no se encuentra preferentemente en el genoma de la célula huésped.
Si este sitio de escisión existe en el genoma de la célula, el
genoma de la célula presenta no más de 5, preferentemente 2,
sitios. Si en el vector existen algunos otros sitios distintos de
los sitios flanqueantes, están preferentemente localizados fuera de
la región que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse.
El sitio de escisión según la invención es una
secuencia o un elemento que es específico del agente de escisión.
El agente de escisión puede ser, por ejemplo, una ribozima, una
endonucleasa. Preferentemente, el agente de escisión es una
endonucleasa. El sitio de escisión según la invención podría ser un
nucleótido modificado que en condiciones apropiadas conduce a la
escisión de ADN. Tal nucleótido modificado podría ser, por ejemplo,
un nucleótido abásico (Lhomme y col., 1999, Biopolymer, 52,
65-83; cuya divulgación se incorpora en este
documento por referencia). La presencia de un nucleótido abásico
conduce a una escisión, por ejemplo, por la acción de la
AP-endonucleasa tal como la exonucleasa III.
En una realización particular de la presente
invención pueden usarse dos o más endonucleasas diferentes en el
presente procedimiento. El polinucleótido que va a integrarse está
flanqueado, por ejemplo, por dos sitios de endonucleasa diferentes
y el procedimiento comprende una etapa de introducir cada
endonucleasa o uno o varios vectores que codifican las
endonucleasas usadas.
Preferentemente, los sitios que flanquean la
secuencia de polinucleótidos que va a integrarse no generan extremos
cohesivos después de la escisión. Por tanto, si la escisión de los
sitios podría conducir a la generación de extremos cohesivos, los
sitios tienen preferentemente una orientación inversa de manera que
evitan la multimerización por los extremos cohesivos.
La endonucleasa necesita elegirse de manera que
genere en el genoma de la célula huésped un número muy bajo de
escisiones que puedan ser fácilmente reparadas por la célula sin
ninguna lesión para esta célula. De hecho, la célula sin ninguna
lesión toleraría un número muy bajo de escisiones en el cromosoma,
generalmente menos de 5 roturas bicatenarias, más preferentemente
menos de 2 roturas bicatenarias. Preferentemente, la endonucleasa
se elige de manera que genere cualquier rotura bicatenaria en el
cromosoma de la célula huésped.
Las enzimas de restricción de corte de cuatro y
seis bases comúnmente usadas no son convenientes para la presente
invención ya que normalmente conducirían a la escisión de ADN
cromosómico y a muerte de células debido a la existencia de muchos
sitios de restricción dentro del ADN celular.
Preferentemente, los sitios de endonucleasa que
flanquean la secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o
escindirse según la invención no se producen naturalmente en la
célula huésped. Preferentemente, si el vector que comprende la
secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse o escindirse es
un plásmido, los sitios de endonucleasa flanqueantes no se producen
en la bacteria usada para la producción de plásmidos.
Preferentemente, los sitios de endonucleasa flanqueantes se
corresponden con endonucleasas que tienen un sitio de reconocimiento
de al menos 10, 12, 15, 18, 20, 22 ó 25 nucleótidos. En una
realización particular, una endonucleasa usada en la presente
invención puede tolerar menos del 10% de cambio en su sitio de
reconocimiento, preferentemente el 5%, más preferentemente el
2%.
Una endonucleasa o meganucleasa casera que
reconoce una secuencia de ADN grande es un ejemplo de una
endonucleasa que puede usarse en la presente invención (Dalgaard y
col., 1997, Nucleic Acids Research, 25, 4626-463;
Chevalier y Stoddard, 2001, Nucleic Acids Research, 29,
3757-3774). Un ejemplo de una enzima meganucleasa es
I-Sce I que reconoce un sitio de 18 pb que no
parece que esté representado en ADN murino o humano.
I-SceI genera un corte en bisel de 4 pb con
nucleótidos protuberantes de 3'OH. Para más información sobre la
meganucleasa I-SceI véase el documento US 6.238.924
cuya enseñanza se incorpora en este documento por referencia. En una
realización preferida, el procedimiento según la presente invención
usa endonucleasa I-Sce I y el sitio de
reconocimiento y de escisión correspondiente.
Las meganucleasas constituyen una familia de
enzimas de corte muy raras. Véase la Figura 2 para una lista de
meganucleasas. Las endonucleasas caseras codificadas por intrones
ORF, genes independientes o secuencias intervinientes (inteínas) se
definen ahora como "meganucleasas". Tienen secuencias de
reconocimiento que abarcan 12-40 pb de ADN,
mientras que las enzimas de restricción "clásicas" reconocen
alargamientos de ADN mucho más cortos en el intervalo de
3-8 pb (hasta 12 pb para cortadoras raras). Las
meganucleasas están bastante bien caracterizadas estructuralmente y
mecanísticamente. Se clasifican en 4 familias separadas basándose en
los motivos de aminoácidos bastante bien conservados.
1 - La familia de los dodecapéptidos
(dodecámero, DOD, D1-D2, LAGLI-DADG,
P1-P2)
Ésta es la familia más grande de proteínas (más
de 150 secuencias) agrupadas por su motivo de secuencias más
generalmente conservado: una (5 secuencias) o dos copias (la enorme
mayoría) de una secuencia de doce residuos: el
di-dodecapéptido. Las meganucleasas con un
dodecapéptido (D) tienen una masa molecular de aproximadamente 20
kDa y actúan de homodímero. Aquellas con dos copias (DD) oscilan de
25 kDa (230 AA) a 50 kDa (HO, 545 AA) con 70 a 150 residuos entre
cada motivo y actúan de monómero.
2 - Familia GIG
El motivo común es corto, pero está bastante
bien conservado: KSGIY (10/11 AA) YIGS. Para estas meganucleasas
(28 secuencias) el sitio de escisión es diferente de la secuencia de
reconocimiento.
3 - Familia HC
Las secuencias en este grupo son ricas en
residuos de histidina y cisteína y la secuencia conservada es
aproximadamente: "SHLC - G - G - H - C". La enzima mejor
caracterizada: I-Ppo I
4 - Familia HNH y sin motivo
El último grupo de secuencias, reunidas porque
no tienen ninguno de los motivos previos, no están estructuralmente
bien caracterizadas. La secuencia consenso (HH - N - H - H en una
ventana de 35 residuos de aminoácidos) es bastante complicada.
Varias propiedades de estas proteínas son distintas de otras
meganucleasas porque dejan una extensión en 5' de 2 pb después de
una rotura bicatenaria o tienen un largo tamaño de corte en bisel de
al menos 10 nucleótidos. (La mayoría de las meganucleasas escinden
las dos cadenas de un ADN bicatenario y dejan un extremo
sobresaliente en 3' de 4 pares de bases)
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes clases se resumen:
CLASE I que se caracteriza por: un motivo
de dodecapéptido (D1, LAGLI, P1) o dos motivos de dodecapéptido (D1
- D2, LAGLI - GDAG, P1 - P2); y escisión dentro del sitio de
reconocimiento dejando un corte en bisel de 4 nt con nucleótidos
protuberantes de 3'OH. Hay 8 subfamilias que incluyen:
- Un motivo de dodecapéptido: algunos ejemplos son I-Ceu I, I-Cre I
- Dos motivos de dodecapéptido: algunos ejemplos son I-Chu I, I-Csm I, I-Dmo I, I-Pan I, I-Sce I, I-Sce II, I-Sce III, I-Sce IV, F-Sce I, F-Sce II, PI-Aae I, PI-Ape I, PI-Ceu I, PI-Cir I, PI-Ctr I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mfl I, PI-Mgo I, PI-Mja I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mtu I, PI-MtuH I, PI-Pab III, PI-Pfu I, PI-Pho I, PI-Pko I, PI-Psp I, PI-Rma I, PI-Sce I, PI-Ssp I, PI-Tfu I, PI-Tfu II, PI-Tli I, PI-Tli II, PI-Tsp I, PI-Tsp II, PI-Bsp I, PI-Mch I, PI-Mfa I, PI-Mga I, PI-Mga II, PI-Min I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm II, PI-Mth I, PI-Tag I, PI-Thy II
CLASE II que se caracteriza por: al menos
un motivo específico
(GIY-N_{10/11}-YIG); y escisión
fuera del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 2 nt
con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Algunos ejemplos son
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I
CLASE III que se caracteriza por: caja de
His-Cys
(SHLC-G-H-C) o sin
motivo definido; y o escisión dentro del sitio de reconocimiento
dejando un corte en bisel de 4 nt con nucleótidos protuberantes de
3'OH (un ejemplo es I-Ppo I) o escisión de tamaño
largo de corte en bisel de al menos 10 nucleótidos (algunos ejemplos
son I-Dir I, I-Hmu I,
I-Hmu II)
CLASE IV que se caracteriza por: mitad
del motivo específico
(GIY-N_{10/11}-YIG); y escisión
fuera del sitio de reconocimiento dejando un corte en bisel de 2 nt
con nucleótidos protuberantes de 3'OH. Un ejemplo es
I-Tev II
CLASE V que se caracteriza por: motivo
HNH
(HH-G-N-CH-H);
y escisión dentro del sitio de reconocimiento dejando un corte en
bisel de 2 nt con nucleótidos protuberantes de 5'OH. Un ejemplo es
I-Tev III.
\vskip1.000000\baselineskip
Las meganucleasas también podrían codificarse
por genes "libres". Hasta la fecha se conocen 5 genes
caracterizados (F-Sce I, F-Sce II
(HO), F-Suv I, F-Tev I,
F-Tev II) en levadura y bacteriófagos.
Las meganucleasas podrían ser inteínas. Hasta la
fecha se han caracterizado 120 secuencias de proteínas (35 con
demostración experimental, 75 teóricas) en 46 especies y cepas
diferentes (7 eucariotas, 23 bacterias, 16 arqueas). Hay más de 200
secuencias posibles.
La endonucleasa en el procedimiento de la
invención puede elegirse del grupo que incluye, a título no
restrictivo: I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II. Preferentemente, dicha endonucleasa se
elige del grupo que está constituido por I-Ceu I,
I-Cre I, I-Sce I. Más
preferentemente, dicha endonucleasa es I-Sce I.
Algunas endonucleasas tales como la endonucleasa
I-Sce I podrían permanecer no covalentemente unidas
a una mitad de sitio de escisión después de la escisión (el sitio
grande para I-Sce I). Esta propiedad puede usarse
para proteger los extremos libres del polinucleótido escindido
contra la degradación de exonucleasa. De hecho, los sitios de
escisión están orientados de manera que la mitad del sitio que tiene
la capacidad de unión se coloca en las extremidades del
polinucleótido. Además, algunas endonucleasas de restricción tales
como la endonucleasa I-Sce I presentan
adicionalmente una secuencia similar a NLS (secuencia de
localización nuclear) que permite elegir como diana el núcleo. Esta
propiedad adicional puede usarse para facilitar la elección como
diana del núcleo del polinucleótido linealizado o escindido si la
linealización o escisión se produce en el citoplasma.
Por tanto, en una realización de la presente
invención, los sitios flanqueantes están orientados de manera que
la mitad de los sitios que tienen una capacidad de unión de
endonucleasa se colocan hacia el polinucleótido que va a
linealizarse o escindirse. En esta realización, los extremos libres
del polinucleótido escindido se protegen de la degradación de
exonucleasa y/o se facilita el transporte del polinucleótido
escindido al núcleo.
Por lo demás, la presencia de una endonucleasa
en la mitad del sitio escindido del polinucleótido escindido o
linealizado enmascara los extremos libres y hace que estos extremos
estén menos disponibles para recombinarse con el genoma de la
célula huésped.
Por tanto, en una realización alternativa de la
presente invención, los sitios flanqueantes están orientados de
manera que la mitad de los sitios que tienen una capacidad de unión
de endonucleasa se colocan hacia el vector.
Las endonucleasas sintéticas también se
consideran en la presente invención. Estas endonucleasas sintéticas
comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio de
escisión de ADN.
El dominio de reconocimiento de ADN puede
derivarse de proteínas que se producen naturalmente que presentan
un dominio de reconocimiento de ADN tal como el dominio de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción tipo IIS (por
ejemplo, aminoácidos 1-382 de FokI, documento US
5.356.802, cuya divulgación se incorpora en este documento por
referencia). Los dominios de reconocimientos adecuados incluyen,
pero no se limitan a, el dominio de reconocimientos de motivos de
dedo de cinc; motivos de dominio homeo; dominios POU; otros dominios
de proteínas de unión a ADN de represor tal como represor lambda,
represor lac, cro, ga14; dominios de proteínas de unión a ADN de
oncogenes tales como myc, jun; y otras proteínas de unión a ADN
específicas de secuencia que se producen naturalmente que reconocen
más de 6 pares de bases. El dominio de reconocimiento de ADN podría
comprender los siguientes motivos:
hélice-giro-hélice, dedo de cinc,
receptor esteroideo,
hélice-bucle-hélice u otro motivo
helicoidal como cremallera de leucina. El dominio de reconocimiento
de ADN es preferentemente una combinación de dominios de
reconocimiento de ADN existentes si su sitio de reconocimiento tiene
menos del 10 nucleótidos (documento WO 96/20951, cuya divulgación
se incorpora en este documento por referencia), por ejemplo, una
combinación de al menos tres dedos de cinc (documentos US 6.013.453;
US 6.007.988, cuyas divulgaciones se incorporan en este documento
por referencia). El dominio de reconocimiento de ADN existente
puede ser modificado o natural. Sin embargo, tal dominio de
reconocimiento de ADN también podría ser sintético. El dominio de
reconocimiento de ADN también podría ser un polinucleótido natural o
modificado.
El dominio de escisión de ADN puede derivarse de
proteínas que contienen un dominio de escisión de ADN tal como el
dominio de escisión de la endonucleasa de restricción tipo II (por
ejemplo, aminoácidos 383-578 de Fokl, documento US
5.356.802, cuya divulgación se adjunta en este documento por
referencia).
La acción del agente de escisión sobre la célula
huésped puede obtenerse tanto mediante administración a la célula
huésped del agente de escisión, preferentemente la endonucleasa,
como por expresión del agente de escisión, preferentemente la
endonucleasa, en la célula huésped. En este último caso, el
procedimiento de la invención puede realizarse transformando la
célula huésped con un ácido nucleico que codifica el agente de
escisión, preferentemente la endonucleasa, bajo el control de
secuencias de regulación, en particular un promotor adaptado a la
célula huésped. Otra alternativa para la expresión del agente de
escisión es la introducción de un ARNm que codifica el agente de
escisión en la célula huésped. En la presente invención, el vector
que comprende un ácido nucleico que codifica el agente de escisión
también designa un ARNm que codifica el agente de escisión.
La invención también contempla el uso de célula
huésped de un animal o planta transgénico que expresa el agente de
escisión. En este caso, la introducción del agente de escisión o un
ácido nucleico que codifica el agente de escisión ya no es
necesaria. El ácido nucleico que codifica el agente de escisión está
preferentemente operativamente ligado a un promotor específico de
la línea germinal tal como VASA, promotores de la síntesis de
proteínas en ovocito, promotor fuerte con expresión tan pronto como
en la fase II.
El vector que comprende un ácido nucleico que
codifica el agente de escisión, preferentemente una endonucleasa,
contiene toda o parte de la secuencia codificante para la
endonucleasa operativamente ligada a una o más secuencias de
control de la expresión por lo que la secuencia codificante está
bajo el control de señales de transcripción para permitir la
producción o síntesis de la endonucleasa. Por tanto, dicho ácido
nucleico que codifica dicha endonucleasa está comprendida en un
casete de expresión. Más particularmente, el vector comprende un
origen de replicación, un promotor operativamente ligado a dicho
ácido nucleico codificante, un sitio de unión a ribosoma, un sitio
de corte y empalme de ARN (cuando se usa ADN genómico), un sitio de
poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. La
selección del promotor dependerá de la ruta deseada para expresar
la endonucleasa.
De hecho, para un huésped eucariota, el promotor
puede ser un promotor fuerte tal como el promotor de metalotioneína,
un promotor de SV40, un promotor retroviral, el promotor de
citomegalovirus (CMV), un promotor ubicuo tal como promotor de
vilina o actina, un promotor constitutivo o inducible, un promotor
específico de tejido o promotores específicos de tumores tales como
el promotor de \alpha-fetoproteína, el promotor de
amilasa (especialmente, el promotor de amilasa murina), el promotor
de catepsina E, el promotor del receptor muscarínico M1 o el
promotor de \gamma-glutamiltransferasa.
Opcionalmente, el vector podría contener adicionalmente un
potenciador y aislante (Kaffer y col., Genes Dev. 2000, 14,
1908-19; documentos EP 859.059; WO96/04390, cuyas
divulgaciones se incorporan en este documento por referencia). Si la
célula huésped es un huevo fecundado o una célula de blástula, el
agente de escisión, preferentemente la endonucleasa, necesita
expresarse en una fase temprana.
Los elementos que permiten la producción o
síntesis de la endonucleasa pueden ser nativos, derivados de
elementos nativos o preparados de novo. Entonces, los
elementos pueden aislarse y fusionarse juntos mediante
procedimientos conocidos en la técnica tales como usando sitios de
clonación y restricción compatibles. Una ventaja del procedimiento
según la presente invención es que sólo una expresión transitoria de
la endonucleasa apropiada es necesaria para escindir el
polinucleótido lineal que va a integrarse en el genoma de la célula
huésped.
Si la célula huésped es procariota, los vectores
de la presente invención contendrán, por tanto, al menos un
promotor que puede ser reconocido por una ARN polimerasa procariota
y así permitir la transcripción de un polinucleótido que está
operativamente ligado a ese promotor. El vector puede tener
múltiples promotores procariotas si se desea. El (Los)
promotor(es) procariota(s) específico(s)
empleado(s) dependerá(n) de la célula procariota que va a
ser el huésped del vector. Ejemplos de promotores adecuados incluyen
promotores procariotas constitutivos o inducibles tales como los
promotores \lambdapL o \lambdapR, el promotor de T6 polimerasa,
el promotor de T7 polimerasa u otros promotores bien caracterizados
(por ejemplo, lac, recA, gal, trp, ara, hut, etc.). Lo más
preferentemente, el promotor usado para la expresión en células
procariotas será inducible.
Los vectores de expresión eucariotas preferidos
contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación
del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción
eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los diversos
procedimientos empleados en la preparación de plásmidos y la
transformación de organismos huésped son muy conocidos en la
técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células
tanto procariotas como eucariotas, además de los procedimientos
recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring
Harbor Laboratory Press: 1989) capítulos 16 y 17; cuya enseñanza se
incorpora en este documento por referencia.
El polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse con el procedimiento de la invención puede ser cualquier
polinucleótido natural o sintético. Dicho polinucleótido es
preferentemente exógeno a la célula huésped. Más preferentemente,
dicho polinucleótido es no similar a la secuencia de cromosomas de
la célula huésped. Puede comprender una secuencia de genes o una
secuencia de intergenes. Puede comprender secuencia codificante o
no codificante. Dicha secuencia codificante codifica cualquier
producto deseado que incluye péptidos, proteínas y ARN. El
polinucleótido puede codificar una proteína indicadora. Puede
comprender una secuencia codificante para un polipéptido o un
antisentido, o una secuencia reguladora tal como un promotor, un
potenciador, un silenciador, etc. Puede comprender una secuencia de
reconocimiento para una molécula tal como una hormona, un factor de
transcripción, una endonucleasa, un polinucleótido, etc.
El polinucleótido que va a integrarse puede
comprender un gen indicador tal como
\beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa
alcalina, proteína verde fluorescente, tirosinasa, proteínas DsRed.
Por gen indicador se desea cualquier ácido nucleico que codifica un
producto fácilmente ensayado. Preferentemente, el gen indicador está
bajo el control de un promotor fuerte o un promotor específico de
tejido.
Más particularmente, el polinucleótido que va a
integrarse con el procedimiento de la invención puede elegirse del
grupo que incluye, a título no restrictivo:
- Proteínas que codifican genes: proteínas secretadas tales como eritropoyetina, albúmina, hormona de crecimiento, \alpha1-antitripsina; proteínas de superficie; por lo demás, proteínas tales como hemoglobina (\alpha, \beta, \gamma, \varepsilon), colágenos (tipo I, II, III, IV, \alpha1 a 5), receptores de quimiocina, interferones (a, \beta, \gamma), caspasa, p53, etc.
- Secuencias que codifican ARN de transferencia: ARNt para codones inusuales (ARNt mitocondrial o sintético),
- Secuencias que codifican el gen \alpha de vacunación, un superantígeno, un adyuvante (C3d);
- Secuencias que codifican un péptido tal como un péptido de CMH reducido;
- Secuencias que codifican una cadena de HLA;
- Secuencias que codifican la combinación de citocromo p450;
- Secuencias que codifican una ruta metabólica (lisina o fenilalanina).
- Secuencias reguladoras de cromatina tales como el gen de la inactivación del cromosoma X (gen xist), gen con efecto materno (gen ddk), secuencia de apertura de cromatina (HNF4), secuencia rica en CpG con bajo o alto número de sitios SP1 (CCCGCC/G o C/GGCGGG), secuencia de MAR o SAR, origen de replicación cromosómico eucariota, bacteriano o viral:
- secuencias reguladoras de la transcripción tales como secuencias que controlan la apertura de cromosomas para la transcripción (región de control de locus LCR, región de control dominante DCR), promotores constitutivos eucariotas o específicos de tejido, promotores inducibles (metaloproteína, operadores bacterianos, promotor T7, promotor inducible de tetraciclina (tet-ON y tet-OFF), potenciadores, silenciadores, ARN polimerasa (T7 polimerasa o polimerasa viral), sitios internos de entrada al ribosoma IRES seguidos de un gen de interés;
- Secuencias interesantes para la manipulación del genoma tales como sitios de meganucleasas (ej: I-Sce I, I-Tev III, F-Sce I, F-Sce II, I-Ceu I, I-Dmo I, I-Chu I, PI-Sce I, PI-Pspl o sitios para meganucleasas sintéticas); secuencias repetidas (ALU, SINES, LINES); micro y minisatélites; sitios de RAG, IoxP, FRT o \beta-resolvasa; secuencias de repeticiones invertidas de transposones; transposones; provirus; LTR de transposones y virus;
- Secuencias antisentido y ribozimas: antisentido de ARNm, más particularmente de ARNm de p53, Rb, p16, p21, ARNm de proteínas implicadas en la manipulación del genoma tales como meganucleasas, RAG, transcriptasas, ARNm virales.
En el caso de un gen, el polinucleótido incluye
preferentemente todos los elementos necesarios para la expresión
del gen. Por tanto, el polinucleótido codificante está
operativamente ligado a una o más secuencias de control de la
expresión por lo que la secuencia codificante está bajo el control
de señales de transcripción para permitir la producción o síntesis
del producto codificado. Dicho polinucleótido codificante está
comprendido en un casete de expresión. Más particularmente, el
vector comprende un origen de replicación, un promotor
operativamente ligado a dicho ácido nucleico codificante, un sitio
de unión a ribosoma, un sitio de corte y empalme de ARN (cuando se
usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de
terminación de la transcripción. La selección del promotor
dependerá de la ruta deseada para expresar el producto codificado.
De hecho, el promotor puede ser un promotor fuerte tal como el
promotor de metalotioneína, un promotor de SV40, un promotor
retroviral, el promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor ubicuo
tal como promotor de vilina o actina, un promotor constitutivo o
inducible, un promotor específico de tejido (véase el documento WO
98/56902, Tabla 1; cuya divulgación se incorpora en este documento
por referencia) o promotores específicos de tumores tales como el
promotor de \alpha-fetoproteína, el promotor de
amilasa (especialmente, el promotor de amilasa murina), el promotor
de catepsina E, el promotor del receptor muscarínico M1 o el
promotor de \gamma-glutamiltransferasa.
Opcionalmente, el vector podría contener adicionalmente un
potenciador y aislante (Kaffer y col., Genes Dev. 2000, 14,
1908-19; documento EP 859.059; WO96/04390, cuyas
divulgaciones se incorporan en este documento por referencia).
Los elementos que permiten la producción o
síntesis del transgén pueden ser nativos, derivados de elementos
nativos o preparados de novo. Entonces, los elementos pueden
aislarse y fusionarse juntos mediante procedimientos conocidos en
la técnica tales como usando sitios de clonación y restricción
compatibles.
Los vectores de expresión eucariotas preferidos
contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación
del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción
eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los diversos
procedimientos empleados en la preparación de plásmidos y la
transformación de organismos huésped son muy conocidos en la
técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células
tanto procariotas como eucariotas, además de los procedimientos
recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring
Harbor Laboratory Press: 1989) capítulos 16 y 17; cuya enseñanza se
incorpora en este documento por referencia.
En una realización preferida de la invención, el
vector que comprende la secuencia de polinucleótidos que va a
linealizarse o escindirse también comprende la secuencia que
codifica el agente de escisión, preferentemente la endonucleasa,
correspondiente a los sitios flanqueantes. En esta realización
bastante preferida, el gen que codifica el agente de escisión,
preferentemente la endonucleasa, contiene sus propias secuencias de
regulación y, por tanto, no está situado en el mismo marco de
lectura abierto que el polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse.
El vector que comprende el polinucleótido que va
a linealizarse o escindirse en el genoma de la célula huésped
flanqueado por el sitio de escisión puede prepararse según
procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo,
este vector puede prepararse por síntesis química, tecnología de
ADN/ARN recombinante o una combinación de ambos (Sambrook y col.,
Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor University Press, Nueva York (1989); y Ausubel y
col., Eds., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley &
Sons, Nueva York (1997); cuyas divulgaciones se incorporan en este
documento por referencia).
El vector que comprende el polinucleótido que va
a linealizarse o escindirse según la presente invención no presenta
ningún extremo 5' o 3' libre. El vector es ventajosamente una
molécula de ADN circular tal como un plásmido, pero también puede
ser una molécula lineal que tiene sus extremos inaccesibles para la
exonucleasa. En un primer ejemplo, los extremos adoptan una
estructura secundaria tal como una horquilla que protege los
extremos de la exonucleolisis. En un segundo ejemplo, los extremos
podrían modificarse químicamente con el fin de bloquear la acción
de exonucleasas. Tales modificaciones pueden ser, por ejemplo, el
uso de enlaces de fosfotioato que son resistentes a exonucleasa
(Putney 1981; Olsen y Ecktein 1990). En un tercer ejemplo, los
extremos podrían ligarse a moléculas estéricamente bloqueantes que
impiden el acceso a la exonucleasa. Tales moléculas pueden ser, por
ejemplo, una proteína o una poliamida. Esta proteína podría tener
algo de afinidad por el núcleo y podría desencadenar el vector al
núcleo. Preferentemente, el sustituyente de bloqueo tiene un peso
molecular de no más de 1 kD. Puede usarse una variedad de
sustituyentes no tóxicos tales como biotina, colesterol u otros
esteroides, o un colorante fluorescente catiónico no
intercalante.
La Figura 3 desvela algunos ejemplos de vectores
lineales según la presente invención. En la Figura 3A, un vector
lineal puede obtenerse a partir de un plásmido que comprende el
polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por
dos sitios de endonucleasa tales como sitios de
I-Tev III, flanqueados por sí mismos por otra
endonucleasa tal como los sitios F-Tev I. In
vitro, la endonucleasa F-Tev I escinde los
sitios F-Tev I y esta escisión produce extremos
protuberantes que pueden adoptar una estructura de horquilla.
Opcionalmente puede usarse una ligasa con el fin de cerrar
covalentemente el bucle. La célula huésped puede transfectarse con
este constructo lineal con las horquillas en sus extremos estando el
polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por
dos sitios de endonucleasa tales como los sitios
I-Tev III.
Similarmente, en la Figura 3B, un vector lineal
con una horquilla en cada uno de los extremos puede prepararse como
sigue. In vitro, el polinucleótido que va a linealizarse o
escindirse se prepara con extremos romos o extremos cohesivos. Este
polinucleótido se mezcla con oligonucleótidos que forman una
horquilla presentando tal horquilla un sitio de escisión,
preferentemente un sitio de endonucleasa, en su cola. El extremo de
la cola de horquilla puede ser romo o cohesivo. Se hace una
ligación con el fin de unir covalentemente la horquilla y el
polinucleótido que va a linealizarse o escindirse. (Perrin y col.,
EMBO J 1993, 12, 2939-2947; cuya enseñanza se
incorpora en este documento por referencia).
Los vectores que comprenden el polinucleótido
que va a linealizarse o escindirse flanqueado por el sitio de
escisión y/o el ácido nucleico que codifica el agente de escisión,
preferentemente la endonucleasa, pueden introducirse en una célula
mediante una variedad de procedimientos (por ejemplo,
transformación, transfección, captación directa, bombardeo de
proyectiles, usando liposomas). Ejemplos de procedimientos adecuados
de transfección o transformación de células incluyen precipitación
de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, infección,
lipofección y captación directa. Tales procedimientos se describen
en más detalle, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, segunda edición. Cold Spring Harbor University
Press, Nueva York (1989); y Ausubel, y col., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1998), cuya
enseñanza se incorpora en este documento por referencia. Otros
procedimientos adecuados también se describen en la técnica. En una
realización de la presente invención, los vectores están asociados
a la sustancia susceptible de permitir o de facilitar la
transformación de la célula huésped. Los vectores que comprenden el
polinucleótido que va a linealizarse o escindirse flanqueado por el
sitio de escisión y/o el ácido nucleico que codifica el agente de
escisión, preferentemente la endonucleasa, también pueden
introducirse en una célula huésped dirigiendo el vector a los
fosfolípidos de la membrana celular. Por ejemplo, dirigiendo el
vector a una proteína VSV-G, una proteína viral con
afinidad por todos los fosfolípidos de la membrana celular. Un
constructo tal puede producirse usando procedimientos muy conocidos
para aquellos expertos en la materia.
El agente de escisión, preferentemente la
endonucleasa, puede introducirse en una célula según procedimientos
generalmente conocidos en la técnica que son apropiados para la
endonucleasa particular y el tipo de célula. Por ejemplo, una
endonucleasa puede introducirse en una célula por captación directa,
microinyección, precipitación de fosfato de calcio,
electroporación, infección y lipofección. Tales procedimientos se
describen en más detalle, por ejemplo, en Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring
Harbor University Press, Nueva York (1989); y Ausubel, y col.,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
Nueva York (1998), cuya enseñanza se incorpora en este documento por
referencia. Otros procedimientos adecuados también se describen en
la técnica. La endonucleasa puede acoplarse a un facilitador de la
entrada de proteínas para facilitar la introducción de la enzima en
una célula. Ejemplos de facilitadores de la entrada de proteínas
incluyen tat, HSV VP22 y la toxina del carbunco. El acoplamiento de
una proteína a un facilitador de la entrada de proteínas puede
llevarse a cabo usando procedimientos muy conocidos para aquellos
expertos en la técnica. Las estrategias de liberación de proteínas
(por ejemplo, HSV VP22, toxina del carbunco) pueden evaluarse según
los procedimientos de la invención descritos en este documento.
Una vez en la célula, los vectores que
comprenden el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse
flanqueado por el sitio de escisión y, si es necesario, el ácido
nucleico que codifica el agente de escisión, preferentemente la
endonucleasa, o el propio agente de escisión, preferentemente la
endonucleasa, se importan o se translocan por la célula desde el
citoplasma hasta el núcleo.
Como se usa en este documento, una célula se
refiere a una célula procariota tal como una célula bacteriana o
una célula eucariota tal como una célula de animal, planta o
levadura. Más preferentemente, la célula es una célula eucariota.
La célula puede ser una célula madre (preferentemente una célula
madre embriónica), una célula somática, un gameto, un blastómero o
un huevo (preferentemente un huevo fecundado). La célula huésped
puede provenir de pez, ave, mamíferos no humanos, insecto, anfibio,
reptil, preferentemente de medaka, pez cebra, ratones, pollos,
Xenopus, ovejas, vaca conejo, más preferentemente de peces, pollos y
ratones. La célula huésped puede tener todas las fases de
diferenciación, de células totipotentes a diferenciadas. Ejemplos de
células de mamífero incluyen células humanas (tales como células
HeLa), bovinas, ovinas, porcinas, murinas (tales como células madre
embriónicas), de conejo y mono (tales como células COS1). La célula
puede ser una célula embriónica, célula madre de médula ósea u otra
célula progenitora. Si la célula es una célula somática, la célula
puede ser, por ejemplo, una célula epitelial, fibroblasto, célula de
músculo liso, célula sanguínea (incluyendo una célula
hematopoyética, eritrocito, célula T, célula B, etc.), célula
tumoral, célula de músculo cardiaco, macrófago, célula dendrítica,
célula neuronal (por ejemplo, una célula glial o astrocito, o célula
infectada por patógenos, por ejemplo, aquellas infectadas por
bacterias, virus, virusoides, parásitos o priones). De hecho, el
procedimiento para integrar un polinucleótido en el genoma de la
célula huésped según la presente invención está muy adaptado para
la transfección estable.
Por tanto, el procedimiento de la invención es
particularmente bastante útil para la transgénesis para la terapia
génica, producción de proteína recombinante en animales o plantas,
producción de animales transgénicos como modelos. Como
consecuencia, la invención tiene por objeto un procedimiento de
transgénesis de un organismo pluricelular que consiste en
administrar a dicho organismo una composición que comprende uno o
varios vectores que comprenden el polinucleótido que va a
escindirse o linealizarse y, opcionalmente el agente de escisión,
como se define previamente, posiblemente asociados a una sustancia
susceptible de permitir o de facilitar la transformación de uno o
varios tipos celulares de dicho organismo por dicho vector para
entonces generar en dichas células la molécula lineal lista para
ser integrada sometiendo dichas células a la acción de la
escisión.
El procedimiento de la invención se realiza
in ovo o in vivo en células tales como células en
cultivo o directamente in situ en un tejido, órgano u
organismo multicelular.
El procedimiento de transgénesis según la
invención es particularmente bastante deseado para animales elegidos
del grupo que incluye, pero que no se restringe a: ganado (vacas),
cabras, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos (arañas,
mariposas, moscas), peces, calamar, Amphoxius, Xenopus, aves,
pollos, ascidios y razas ovinas (ovejas).
Los peces transgénicos se producen introduciendo
un vector según la presente invención en células de pez, gametos
tales como espermatozoide o célula embriónica, preferentemente
células embriónicas, y más preferentemente en un embrión de una
célula. Si el vector se introduce en células embriónicas, el pez
transgénico se obtiene permitiendo que la célula o células
embriónicas se transformen en un pez. La introducción de los
vectores en células embriónicas de peces y el posterior desarrollo
del pez se simplifican por el hecho de que los embriones se
desarrollan fuera del pez progenitor. Alternativamente, si el vector
se introduce en el espermatozoide, la fecundación de los oocitos se
hace con el espermatozoide transfectado y se permite que el embrión
se transforme en un pez. Preferentemente, el espermatozoide se
transfecta con el vector que comprende el transgén y con el agente
de escisión.
El pez transgénico se selecciona del grupo que
está constituido por salmón, trucha, atún, mero, siluro, pez cebra,
medaka, carpa, pez espinoso, Astyanax, tilapia, carpa dorada,
lubina, pez espinoso, Astyanax, esturión y locha. Los más
preferidos son medaka y pez cebra. Sin embargo, el procedimiento
según la presente invención también podría aplicarse para producir
especies transgénicas acuáticas tales como Xenopus, gamba, erizo de
mar.
\vskip1.000000\baselineskip
La célula huésped en el procedimiento de la
invención puede elegirse del grupo que incluye, pero que no se
restringe a:
Para fin de producción industrial:
- K. lactis, P. pastoris, S. cerevisi\ae, S. pombe, A. immersus, P. limus, E. coli
2) Vacunas bacterianas o eucariotas:
- Listeria monocytognese, bacilo Calmette Guerin
- S. cerevisi\ae, S. pombe, C. albicans, Plasmodium falciparum, amebas
\vskip1.000000\baselineskip
1) Producción de biomoléculas
- Soja, colza, trigo, maíz, arroz
2) Plantas transgénicas
- Tomates, fresas, manzanas, cítricos, tabaco
3) Medicina alimentaria y plantas para
vacunas
- Espinaca, cereal
4) Producción de biomateriales
- Caucho, papel, madera
\vskip1.000000\baselineskip
1) Producción de biomoléculas y vacunas
- Vacas, cabras, ovejas, conejo, roedores, marmotas, monos, insectos
2) Animales transgénicos
- Peces, calamar, Amphoxius, Xenopus, aves, pollos, ganado, razas ovinas
3) Producción de biomateriales
- Gusanos de seda, arañas, mariposas, moscas, ovejas, bovino, raza ovina
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La presente invención también se refiere a las
células resultantes y a sus usos, por ejemplo, para la producción
de proteínas u otros genes, biomoléculas, biomateriales, plantas
transgénicas, vacunas, animales transgénicos o para el tratamiento
o la profilaxis de una afección o trastorno en un individuo (por
ejemplo, un ser humano u otro vertebrado mamífero) que se produce
como resultado de un defecto genético. Por ejemplo, las células
pueden producirse (por ejemplo, ex vivo) mediante los
procedimientos descritos en este documento y luego se introducen en
un individuo usando procedimientos conocidos. Alternativamente, las
células pueden modificarse en el individuo (sin extraerse del
individuo).
Por tanto, la invención se refiere además a un
procedimiento de producción de proteínas, biomoléculas,
biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, animales transgénicos
o a un procedimiento de tratamiento o profilaxis de una enfermedad
genética en un individuo en necesidad del mismo, en el que tal
procedimiento comprende el procedimiento de linealización o
escisión in vivo según la presente invención.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el
que las células madre embriónicas se transfectan mediante el
procedimiento según la presente invención y opcionalmente se criban
para el acontecimiento de integración aleatoria, las células se
inyectan en embriones en una fase en la que pueden integrar las
células transfectadas, por ejemplo en la fase de blastocisto, los
embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los
individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los
que se observa la colonización por células madre embriónicas de la
línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos.
Además, la invención también se refiere a un
procedimiento para producir un animal transgénico no humano en el
que huevos fecundados se transfectan mediante el procedimiento según
la presente invención. Si es necesario, los huevos se reimplantan
en una madre sustituta y los individuos transgénicos se obtienen al
final de la gestación. Opcionalmente, los huevos pueden cribarse
para el acontecimiento de integración aleatoria antes de la
reimplantación en una madre sustituta. Por lo demás, los huevos se
incuban en condiciones que permitan el crecimiento del embrión y la
generación del animal transgénico.
Por ejemplo, generalmente pueden obtenerse
embriones de peces o células embriónicas recogiendo huevos
inmediatamente después de ser puestos. Dependiendo del tipo de pez,
generalmente se prefiere que los huevos se fecunden antes de o en
el momento de la recogida. Esto se realiza preferentemente poniendo
juntos un pez macho y hembra en una pecera que permita la recogida
de huevos en condiciones que estimulen el apareamiento. Después de
recoger los huevos se prefiere eliminar el corión del embrión antes
de la exposición del embrión para introducir los vectores. Esto
puede hacerse manualmente o, preferentemente, usando una proteasa
tal como pronasa. Un huevo fecundado antes de la primera división
celular se considera un embrión de una célula. Por tanto, el huevo
fecundado se considera una célula embriónica. Preferentemente, una
célula huésped según la presente invención es una célula embriónica
de pez, preferentemente un huevo fecundado o un blastómero de un
embrión en la fase de blástula. Lo más preferentemente, la célula
huésped es un huevo fecundado.
Los vectores que comprenden el polinucleótido
que va a linealizarse o escindirse según la presente invención
pueden introducirse en células embriónicas de peces usando cualquier
técnica adecuada (por ejemplo, transformación, transfección,
captación directa, bombardeo de proyectiles, usando liposomas).
Muchas técnicas para tal introducción de material genético exógeno
se han demostrado en peces y otros animales. Éstas incluyen
microinyección (Culp, 1991, anteriormente), electroporación (Inoue
y col., 1990, Cell. Differ. Develop. 29, 123-128;
Müller y col. 1993, FEBS Lett. 324, 27-32; Murakami
y col. J. Biotechnol. 34, 35-42; Müller y col. 1992,
Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1, 276-281; Symonds y
col. 1994, Aquaculture 119, 313-327), bombardeo con
pistola de partículas (Zelennin y col., 1991 FEBS Lett. 287,
118-120) y el uso de liposomas (Szelei y col., 1994,
Transgenic Res. 3, 116-119) (la enseñanza de estos
documentos se incorpora en este documento por referencia).
Preferentemente, los vectores se introducen por microinyección.
El agente de escisión, preferentemente la
endonucleasa, puede introducirse en una célula embriónica de pez
según procedimientos generalmente conocidos en la técnica que son
apropiados para la endonucleasa particular y el tipo de célula.
Preferentemente, el agente de escisión se coinyecta con el vector
que comprende el transgén.
Después de la introducción del (de los)
vector(es) según la presente invención se deja que el embrión
se transforme en pez. Esto implica generalmente no más de incubar
los embriones bajo las mismas condiciones usadas para incubar el
huevo. Sin embargo, las células embriónicas también pueden incubarse
brevemente en un tampón isotónico. Si es apropiado, la expresión
del transgén puede observarse durante el desarrollo del embrión.
El pez o embrión de pez que alberga el transgén
puede identificarse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el
genoma de peces puede sondarse para la presencia del transgén por
transferencia de Southern o Northern. La presencia del transgén
también puede detectarse usando PCR u otras técnicas de
amplificación de ácidos nucleicos específicos de secuencia. La
presencia de este producto puede ensayarse con el fin de identificar
el producto de expresión del transgén.
El pez transgénico puede proporcionar un pez con
la característica deseada de forma que el pez o un descendiente del
pez tiene la característica deseada. Ejemplos de una característica
deseada incluyen valor nutritivo potenciado y/o novedoso,
resistencia a enfermedades, potenciación del crecimiento
(crecimiento más rápido, aumento del tamaño corporal o aumento del
tamaño de la camada) o producción de una proteína deseada. Por
proteína deseada se indica una proteína que confiere un rasgo
característico al pez en el que se produce o una proteína que
cuando se aísla del pez es deseable para usos fuera del pez. La
proteína deseada puede producirse en un tejido específico, un
subconjunto de tejidos o en una amplia gama de tejidos. Ejemplos de
proteínas deseadas incluyen proteínas que corrigen una afección
anormal en el pez o proteínas terapéuticas para el pez o algún otro
animal.
El pez transgénico puede usarse como modelo de
estudio. El patrón de expresión de un gen, más particularmente un
gen de pez, puede estudiarse con tal pez transgénico midiendo o
identificando la expresión del transgén en tejido diferente
(expresión específica de tejido) a diferentes tiempos durante el
desarrollo (expresión regulada por el desarrollo o expresión
específica de la etapa de desarrollo), en diferentes líneas
celulares (expresión específica de la línea celular). Los peces
transgénicos también son útiles para identificar compuestos o genes
que afectan la expresión de un gen que ha sido introducido por
transgénesis, preferentemente un gen de pez. Una forma de analizar
la expresión en el tejido de pez diferente es diseccionar el pez y
ensayar en la muestra de tejido separada. El ARN puede detectarse
usando cualquiera de las numerosas técnicas de detección de ácidos
nucleicos. Se prefiere el uso de proteínas indicadoras ya que estas
proteínas se detectan fácilmente. Una forma preferida de ensayar el
patrón de expresión del transgén durante el desarrollo es usar un
producto de expresión que puede detectarse en embriones o animales
vivos tales como GFP o DsRed.
En una aplicación de la presente invención, la
introducción del transgén puede crear una mutación por inserción en
el pez. Tales genes mutados se clonan fácilmente porque el transgén
insertado sirve de marca para la clonación. Los genes que afectan
cualquier procedimiento de interés que puede detectarse pueden
identificarse por tal mutagénesis por inserción. Además, en otra
aplicación, el transgén es un gen indicador usado en un constructo
de trampa de genes. Por trampa de genes se indica un gen indicador
que sólo puede expresarse después de que el ADN se integre en un
gen activo en la célula huésped, en este caso una célula de pez. Los
vectores de trampas de genes son particularmente útiles para
identificar inserciones en genes activos. (Kitajima y col., Biochem
Cell Biol 1998 76:1029-37; Zambrowicz y col., Int J
Dev Biol 1998 42 1025-36; Cecconi y col., FEBS Lett.
2000 480 63-71; la enseñanza de estos documentos se
incorpora en este documento por referencia).
Por tanto, el procedimiento de la invención es
particularmente bastante útil para la producción de pez de proteína
recombinante, producción de peces transgénicos como modelos. Como
consecuencia, la invención tiene por objeto un procedimiento de
transgénesis de peces que consiste en administrar a dicha célula
embriónica de pez una composición que comprende uno o varios
vectores que comprenden el polinucleótido que va a escindirse y,
opcionalmente el agente de escisión, como se define previamente,
posiblemente asociados a una sustancia susceptible de permitir o de
facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares de dicho
organismo por dicho vector para entonces generar en dichas células
la molécula lineal lista para ser integrada sometiendo dichas
células a la acción de la escisión.
La presente invención también se refiere a las
células resultantes y a sus usos, por ejemplo, para la producción
de pez transgénico como modelo o comida, o para producir proteínas u
otros genes, biomoléculas, biomateriales y vacunas.
Por tanto, la invención se refiere además a un
procedimiento de producción de proteínas, biomoléculas,
biomateriales, plantas transgénicas, vacunas, pez transgénico, en
el que tal procedimiento comprende el procedimiento de
linealización o escisión in vivo o in ovo según la
presente invención.
Además, la invención también se refiere a un
procedimiento para producir un pez transgénico en el que huevos
fecundados se transfectan mediante el procedimiento según la
presente invención y los huevos se incuban en condiciones que
permitan su transformación en pez transgénico. Opcionalmente, los
huevos pueden cribarse para el acontecimiento de integración
aleatoria antes de su incubación.
Las informaciones detalladas para el pez pueden
aplicarse a las especies de no mamíferos tales como Xenopus, gamba,
erizo de mar, ascidias, aves, pollos, Amphoxius.
La invención también contempla un procedimiento
de transgénesis en el que un material genético completo (el ADN
contenido en un núcleo) se transfiere junto con el vector que
comprende el polinucleótido que va a integrarse en el genoma del
huésped y el agente de escisión en un huevo sin fecundar cuyo núcleo
propio se ha eliminado.
Por tanto, la invención tiene por objeto una
composición farmacéutica que comprende como agente activo un vector
que comprende el polinucleótido que va a linealizarse o escindirse
según la presente invención, posiblemente asociado en la
composición farmacéutica a una sustancia susceptible de permitir o
de facilitar la transformación de uno o varios tipos celulares por
dicho vector. Una realización de la composición farmacéutica según
la invención consiste en asociar dicha composición en un kit
transgénico a una composición que contiene el agente de escisión,
preferentemente una endonucleasa de restricción.
La invención tiene finalmente por objeto el uso
de un vector que comprende el polinucleótido que va a linealizarse
o escindirse según la presente invención para la preparación de una
composición farmacéutica prevista para transformar uno o varios
tipos celulares de un sujeto al que se administra dicha composición
estando dichas células expuestas después de la transformación a la
acción del agente de escisión, preferentemente una endonucleasa de
restricción. Como se indica previamente, dicho vector está
posiblemente asociado en la composición farmacéutica según la
invención a una sustancia susceptible de permitir o de facilitar la
transformación de uno o varios tipos celulares por dicha
molécula.
La invención se refiere a un procedimiento de
tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo
en necesidad del mismo mediante integración aleatoria de un
polinucleótido en el genoma del individuo según la presente
invención. Una enfermedad genética se debe frecuentemente a una baja
expresión de un gen o por la expresión de un gen mutado que no es
funcional. Por ejemplo, mediante la integración de un gen correcto
con los elementos apropiados para su expresión, el gen puede
expresarse y el defecto genético puede compensarse. En caso de una
enfermedad genética debida a una sobreexpresión de un gen, la
integración de un polinucleótido que permite la expresión de un
antisentido, por ejemplo, podría impedir la expresión de este gen y
compensar el defecto genético debido a la sobreexpresión. El
procedimiento según la presente invención puede aplicarse a una
cualquiera de las terapias génicas contempladas.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
(véanse las Figuras 4 y
5)
El plásmido pU_{3}R se obtuvo por la inserción
en el plásmido pBS KS+ (Stratagene, # X52328) del fragmento de 990
pb del segmento 7840-8330 del virus de la leucemia
murina de Moloney (MoMULV) que comprende la secuencia U_{3} de la
secuencia de repetición invertida de 3' seguida de la secuencia R.
El fragmento U_{3}R comprendía las secuencias de potenciador y
promotor de MoMULV y la señal de poliadenilación AATAAA contenida en
la secuencia R. El plásmido pVirU_{3}R se obtuvo en dos etapas.
En primer lugar, la secuencia
5'-ATTACCCTGTTATCCCTAATGAAAGA-3'
que comprendía el sitio de reconocimiento y de escisión de la
endonucleasa I-Sce I seguido de la repetición
invertida del virus MoMULV se insertó aguas arriba de la secuencia
U_{3}R del plásmido pU_{3}R. Este sitio de endonucleasa
I-Sce I se llama en este ejemplo "sitio de
endonucleasa I-Sce I de 5'". En segundo lugar,
la secuencia 5'-TAGGGA
TAACAGGGTAATTTACTTTCA-3' que comprendía la repetición invertida del virus MoMULV seguida del sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I se insertó aguas abajo de la secuencia U_{3}R del plásmido intermedio. Este sitio de endonucleasa I-Sce I se llama en este ejemplo "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". La orientación de los sitios de endonucleasa I-Sce I se hizo de manera que mantuvieran el sitio pequeño (TAGGGAT o ATCCCAT) hacia la secuencia U_{3}R. Por tanto, la orientación del sitio era opuesta con el fin de evitar la generación de extremos cohesivos. Esta orientación se llama "el sitio pequeño hacia el centro del inserto". El plásmido pVirU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en el plásmido pVirU_{3}R de un fragmento de restricción Xho/de 5,3 kb que comprendía el gen de fusión \beta-geo del plásmido pRSV\betageo (Friedrich y Soriano, 1991, Genes Dev, 5, 1513-1523; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) (fusión del gen lacZ que codifica el gen de \beta-galactosidasa bacteriano fusionado en fase en su extremo 3' con el gen de resistencia neo que codifica la neomicina fosfotransferasa) seguido del sitio de poliadenilación del virus SV40 en el sitio Xho/localizado entre la secuencia R y la repetición invertida del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'".En el plásmido pVirU_{3}R\betageo, la expresión de \betageo se controló por el promotor U_{3} de MoMULV. El sitio de poliadenilación de SV40 está dirigido hacia el "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". El plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en pVirU_{3}R\betageo aguas arriba del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 5'" del fragmento de restricción BamHI-NsiI de 2,5 kb del plásmido pHSVTK (Mansour y col., 1988, Nature, 336, 348-352; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) que comprende un gen que codifica la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple HHV1 bajo el control de su propio promotor y sin su sitio de poliadenilación. La expresión del gen tk usa el sitio de poliadenilación de la secuencia R del virus MoMULV. Véase la
Figura 4.
TAACAGGGTAATTTACTTTCA-3' que comprendía la repetición invertida del virus MoMULV seguida del sitio de reconocimiento y de escisión de la endonucleasa I-Sce I se insertó aguas abajo de la secuencia U_{3}R del plásmido intermedio. Este sitio de endonucleasa I-Sce I se llama en este ejemplo "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". La orientación de los sitios de endonucleasa I-Sce I se hizo de manera que mantuvieran el sitio pequeño (TAGGGAT o ATCCCAT) hacia la secuencia U_{3}R. Por tanto, la orientación del sitio era opuesta con el fin de evitar la generación de extremos cohesivos. Esta orientación se llama "el sitio pequeño hacia el centro del inserto". El plásmido pVirU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en el plásmido pVirU_{3}R de un fragmento de restricción Xho/de 5,3 kb que comprendía el gen de fusión \beta-geo del plásmido pRSV\betageo (Friedrich y Soriano, 1991, Genes Dev, 5, 1513-1523; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) (fusión del gen lacZ que codifica el gen de \beta-galactosidasa bacteriano fusionado en fase en su extremo 3' con el gen de resistencia neo que codifica la neomicina fosfotransferasa) seguido del sitio de poliadenilación del virus SV40 en el sitio Xho/localizado entre la secuencia R y la repetición invertida del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'".En el plásmido pVirU_{3}R\betageo, la expresión de \betageo se controló por el promotor U_{3} de MoMULV. El sitio de poliadenilación de SV40 está dirigido hacia el "sitio de endonucleasa I-Sce I de 3'". El plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se obtuvo por la inserción en pVirU_{3}R\betageo aguas arriba del "sitio de endonucleasa I-Sce I de 5'" del fragmento de restricción BamHI-NsiI de 2,5 kb del plásmido pHSVTK (Mansour y col., 1988, Nature, 336, 348-352; cuya divulgación se incorpora en este documento por referencia) que comprende un gen que codifica la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple HHV1 bajo el control de su propio promotor y sin su sitio de poliadenilación. La expresión del gen tk usa el sitio de poliadenilación de la secuencia R del virus MoMULV. Véase la
Figura 4.
Se cotransfectó pVirtkU_{3}R\betageo en el
organismo diana con el vector de expresión de la endonucleasa
I-Sce I pCMV-I Sce I + o
pCMV-I Sce I - (Choulika y col., 1995 Mol Cel Biol,
15, 1968-1973; cuya divulgación se incorpora en
este documento por referencia). pCMVI-SceI+ es un
vector en que el ORF que codifica la endonucleasa tiene una buena
orientación con respecto al promotor de CMV para la expresión de
endonucleasa I-Sce I. pCMVI-SceI se
refiere a un constructo de plásmidos en el que el ORF que codifica
la endonucleasa tiene una orientación inversa con respecto al
promotor de CMV y, por tanto, no conduce a la expresión de
endonucleasa.
Si el plásmido pVirtkU_{3}R\betageo se
escindió in vivo por la endonucleasa I Sce I, la escisión se
produjo aguas arriba y aguas abajo de los sitios de repeticiones
invertidas, concretamente en los sitios de reconocimiento y de
escisión de la endonucleasa I-Sce I. Si el plásmido
pVirtkU_{3}R\betageo se escindió in vivo por
I-Sce I, el promotor de MoMULV contenido por U_{3}
activó la transcripción del gen \betageo. Si el plásmido
pVirtkU_{3}R\betageo no se escindió, la transcripción del
cistrón que expresa el gen tk terminó por la poliadenilación
en la secuencia R localizada aguas abajo de U3 y se evitó la
expresión de \betageo. La selección de integración del fragmento
linealizado in vivo se hizo tanto en dos etapas como en sólo
una etapa. En la selección de dos etapas; en primer lugar, una
selección con 1 \muM de ganciclovir con el fin de eliminar clones
que presentan una integración del plásmido completo; y en segundo
lugar, una selección con 50 \mug/ml de G418 con el fin de
seleccionar los clones que expresan \betageo. En la selección de
una etapa, una selección con 50 \mug/ml de G418 con el fin de
seleccionar los clones que expresan \betageo. Véase la Figura
5.
El plásmido pU_{3}R\betageo se obtuvo por la
inserción en pU_{3}R de un fragmento de restricción Xho I
de 5,3 kb que comprendía el gen de fusión
\beta-geo del plásmido pRSV/\betageo (Friedrich
y Soriano, anteriormente) seguido del sitio de poliadenilación del
virus SV40 en el sitio Xho I localizado aguas debajo de la
secuencia R. En el plásmido pU_{3}R\betageo, la expresión de
\betageo se controló por el promotor U_{3} de MoMULV. El sitio
de poliadenilación de SV40 está dirigido hacia el sitio de
endonucleasa I-Sce I de 3'. Véase la Figura 4.
El fragmento U_{3}R\betageo lineal se aisló
después de la digestión de 10 \mug de plásmido
ptkU_{3}R\betageo por Xba I y Not I por
electroforesis sobre gel de agarosa al 0,8% con TAE 1X. Se aisló un
fragmento de 9,7 kb y se purificó sobre perlas de vidrio con el
protocolo de Gene-Clean II. El fragmento
U_{3}R\betageo purificado se resuspendió en H_{2}O, pH 7, para
la transfección. Véase la Figura 4.
20 h antes de la transfección, células 293T se
sembraron a una densidad de 5x10^{4} células por placa de 35 mm
en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) con 10% de suero
bovino fetal inactivado (SVFi). Las células se incuban en un
incubador de 1 atm (0,1 MPa), 5% de CO_{2}, 100% de humedad, 37ºC.
La transfección se hizo mediante precipitación de fosfato de calcio
con una mezcla de CaCl_{2} 125 mM, NaCl 8,18 \textperthousand
(peso/volumen), HEPES 5,94 \textperthousand, Na_{2}HPO_{4} 0,2
\textperthousand pH 7,12 a 25ºC en presencia de 2 \mug de ADN.
Los precipitados se mantuvieron 16 h sobre las células. Entonces, el
medio de cultivo con el precipitado se sustituyó por medio
DMEM-10% de SVFi recién preparado.
48 h después de la transfección, las células se
fijaron en una disolución al 4% de paraformaldehído durante 5 min a
25ºC. Las células se lavaron dos veces en PBS x1 (solución salina de
tampón fosfato). Entonces, las células se colocaron en medio de
coloración X Gal durante 24 h a 37ºC para la tinción histoquímica
por expresión de \beta-galactosidasa del gen
\betageo. Por lo demás, las células se colocaron en medio de
selección DMEM-10% de SVFi con 60 \mug/ml de
G418. El medio de selección se cambió por nuevo cada 48 h. La
selección se mantuvo durante 15 días hasta la aparición de clones
celulares aislados. Estos clones se aislaron en placas de 24
pocillos de 1 cm de diámetro y se amplificaron con el fin de
congelarse y analizarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron 2 \mug de mezcla de ADN
(pVirtkU_{3}R\betageo + pCMV-1 Sce I) a una
densidad 5x10^{4} células por placa de 35 mm con las siguientes
relaciones y en presencia de los siguientes controles de
transfección que se desvelan en la Tabla 1.
48 h después de la transfección, las células se
fijaron y la expresión de \beta-galactosidasa se
reveló por tinción histoquímica. Se contaron los clones que
mostraban expresión de \beta-galactosidasa (clones
\beta-gal) (véase la Tabla 2). Además, las
células se seleccionaron en un medio de cultivo que comprendía 60
\mug/ml de G418. El medio de cultivo celular se cambió por medio
recién preparado cada 48 h de incubación. Después de 15 días de
post-transfección, los clones resistentes a G418 se
aislaron y se amplificaron (véase la Tabla 2).
Los resultados muestran un aumento significativo
de la integración de constructos para el número de transfección
1.0. Este número de transfección se corresponde con la transfección
de un plásmido que comprende el polinucleótido que va a integrarse,
concretamente
U_{3}R-\betageo-poliA_{sv40},
flanqueado por dos sitios de endonucleasa I-Sce I
con un plásmido que comprende un casete de expresión para
endonucleasa I-Sce I. La integración del plásmido
con linealización in vivo fue aproximadamente 4 a 10 veces
más eficaz que el fragmento lineal U_{3}R\betageo.
El ADN genómico de los clones aislados se
extrajo y se analizó por hibridación de Southern (digestión de ADN
genómico con EcoR V) con sondas que comprendían un fragmento
de restricción EcoRI de 3 kb que contenía el gen lacZ
del plásmido pGemnlslacZ (vector pGem de Promega en el que ha sido
insertado el gen lacZ y una secuencia de localización nuclear).
Véase la Figura 6. El análisis de Southern mostró que la integración
es única y no en tándem. De hecho, una integración en tándem
mostraría una banda de 2,6 kb que nunca se vio. Algunas veces, como
en el carril 12, se produjeron varios acontecimientos de
integración. Por tanto, el procedimiento de linealización in
vivo hace la integración única.
Se hicieron algunos experimentos con una
cotransfección con un plásmido que expresa una integrasa (+IN). La
integrasa usada en este experimento es el fragmento activo del virus
MoMULV. De hecho, el ácido nucleico que codifica el fragmento
activo se ha clonado en un vector de expresión. La integración
mostró un aumento de aproximadamente 6 veces en comparación con el
procedimiento de linealización in vivo sin ninguna integrasa.
Por tanto, opcionalmente, el procedimiento para integrar un
polinucleótido en el genoma de la célula huésped según la invención
también comprende la introducción en la propia célula huésped de
integrasa o un ácido nucleico que codifica integrasa.
El sitio de integración de los constructos
integrados en 24 clones aislados diferentes se clonó por PCR inversa
y se analizó por secuenciación. Se caracterizaron los empalmes
entre los constructos integrados y el ADN genómico. Estos empalmes
mostraron que la integridad del polinucleótido que va a integrarse
se conserva y que la inserción es única.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se obtuvo el plásmido intermedio
ppSV40NeoIRESegfp en dos etapas. Primera, el casete que contenía el
promotor de virus simio 40 (pSV40) y el gen de resistencia neo que
codifica la neomicina fosfotransferasa se escindió del plásmido
pcDNA3.1+ (Clonetech, Palo Alto, CA, EE.UU.) y se clonó en el
plásmido pIRES2-EGFP (Clonetech, Palo Alto, CA,
EE.UU.) en el sitio SmaI dando como resultado la inserción del
casete pSV40-Neo aguas arriba del elemento
bicistrónico IRES y el gen EGFP. Segunda, el casete PyTknIslacz del
plásmido pPytknIslacz (Henry y col., C. R. Acad. Sci. III,
322(12): 1061-1070 (1999)) se escindió y se
sustituyó por el casete
pSV40-Neo-IRES-EGFP
(ppSNIE) completo y se insertó antes del sitio SV40 poliA.
A partir de este constructo inicial se derivó un
plásmido insertando la secuencia correspondiente al sitio de
escisión I-SceI tanto aguas arriba del promotor de
SV40 (5') como aguas abajo del sitio SV40 poliA (3'). Véase la
Figura 7A.
Un día antes de la transfección, 5 x 10^{4}
células COS se sembraron en una placa de 6 pocillos en medio DMEM
(medio Eagle modificado por Dulbecco) complementado con 10% de suero
bovino fetal, L-glutamina 2 mM y se incubaron a
37ºC en una atmósfera de 7% de CO_{2}. La transfección se hizo por
el método Effectene (Qiagen, Chatsworth, CA, EE.UU). El protocolo
de transfección se ha ajustado según las recomendaciones del
fabricante. Brevemente, 1 \mug de ADN de plásmido se diluyó en
100 \mul de tampón condensación de ADN en presencia de reactivo
potenciador (la relación de ADN/potenciador es 1/8). Después de un
periodo de incubación de 5 min se añaden 10 \mul de Effectene al
ADN (la relación de ADN/Effectene es 1/10). La mezcla se agita con
vórtex y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Luego se
añaden 600 \mul de medio completo al complejo de ADN/Effectene,
se mezcla y se rocía sobre las células. Las células se lavan al día
siguiente y se incuban durante un periodo total de 48 h a 37ºC, 7%
de CO_{2}.
Se realiza un análisis FACS^{TM} en una
alícuota de las células transfectadas usando un citómetro de flujo
FACscan y el software CellQuest (Becton-Dickinson,
Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Las células restantes se siembran en
placa en una placa de 10 cm y se añade medio de selección que
contiene G418 (Life Technologies) a la concentración de 400
\mug/ml. Alternativamente, las células se resuspendieron a la
densidad de 2000 células/ml y 100 \mul de suspensión se sembraron
en placas de 96 pocillos. Después de 3 semanas, los clones
resistentes se aislaron y se amplificaron en placas de 24 pocillos
para análisis adicionales.
Se extrajo ADN genómico de células cultivadas
usando el kit High Pure DNA Prep (Roche, Mannheim, Alemania) y se
cuantificó usando el kit de cuantificación Picogreen^{TM} dsDNA
(Molecular Probes, Eugene, ON, EE.UU.) según protocolos del
fabricante.
Se digerió 1 \mug de ADN genómico de clones
independientes con enzima de restricción HindIII (NEB, Beverly, MA,
EE.UU.). Después de la electroforesis del ADN y la transferencia en
membranas Hybond-N+ (Amersham, Pisscataway, NJ,
EE.UU.), las transferencias se sondaron con la sonda NEO usando un
protocolo de detección de ácidos nucleicos basado en DIG no
radiactivo (Roche, Mannheim, Alemania).
El plásmido ppSNIE se cotransfectó con el vector
de expresión de la endonucleasa I-SceI
pCMV-1-SceI+ (Choulika y col., 1995
Mol Cel Biol, 15, 1968-1973). Como controles
negativos, el plásmido ppSNIE se cotransfectó con
pCMV-I-SceI- en el que el ORF que
codifica la endonucleasa tiene una orientación inversa y, por tanto,
no permite la expresión de I-SceI. Se usó 1 \mug
de mezcla de ADN (0,5 \mug de plásmido ppSNIE + 0,5 \mug de
pCMV-I-SceI-) o (0,5 \mug de plásmido
ppSNIE + 0,5 \mug de pCMV-I-SceI+) para
transfectar 5x10^{4} células en placas de 6 pocillos. 48 h
después de la transfección, las células se recogieron y se
analizaron por citometría de flujo. Reproduciblemente, la tasa de
transfección de células COS estaba entre el 35 y el 45% de células
GFP+. Por tanto, la cotransfección del plásmido ppSNIE con vectores
de expresión de I-SceI
(pCMV-I-SceI+) o de control
(pCMV-1-SceI-) no afectó la
expresión transitoria del indicador de EGFP.
Las células restantes se sembraron en placas de
10 cm y se añadió medio de selección. Tres semanas después, los
clones resistentes se aislaron y se amplificaron. Se extrajo ADN
genómico de clones independientes y se analizó por hibridación de
Southern. Se digirieron 0,5 \mug de ADN genómico con enzima de
restricción HindIII, se separó en gel de agarosa y se transfirió
sobre membrana de nailon. Entonces, la transferencia se sondó con
la sonda Neo.
Los resultados se muestran en la figura 7B. Como
cabía esperar, todos los clones menos los nº 3 y nº 26 mostraron
una banda de 1,5 kb correspondiente al fragmento HindIII dentro del
casete ppSNIE. La intensidad de la banda de 1,5 kb es sumamente
variable en clones de la cotransfección de I-SceI-
con la presencia de enormes concatémeros (véanse los clones nº 5,
6, 8 y en un menor grado los clones nº 11, 15, 16). A diferencia,
las bandas en clones de cotransfección de I-SceI+
son menos intensas sugiriendo la presencia de un número pequeño de
copias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se inyectó ADN plasmídico circular que llevaba
un promotor específico de músculo seguido de un gen indicador GFP y
flanqueado por dos sitios de reconocimientos I-Sce I
en embriones de peces en la fase de una célula. Cuando este
constructo se coinyectó con la meganucleasa I-Sce I en un
tampón sin magnesio (de manera que la enzima quedara inactiva
extracelularmente), la expresión muscular de GFP esperada mejoró
espectacularmente (el 80% de los embriones presentaron una fuerte
fluorescencia en la musculatura del tronco con respecto al 20%
cuando las inyecciones se realizaron sin la meganucleasa). Incluso
más sorprendente fue el espectacular aumento en la transmisión de
la línea germinal. Mientras que en experimentos de inyección en
huevo clásicos no se supera, en la mayoría de los casos, un pequeño
porcentaje debido a las integraciones quiméricas tardías, la
frecuencia de transmisión de la línea germinal en peces coinyectados
con la meganucleasa se reforzó hasta el 50%, sugiriendo que se
produjo una única inserción en la fase de una célula del pez
fundador. Adicionalmente, el análisis de Southern confirmó que las
integraciones únicas a bajas copias se produjeron en la mayoría de
los casos. Para ensayar si los acontecimientos de integración
precoces pueden ser debidos a la escisión in vivo de ADN, y
no a la elección del núcleo como diana por la meganucleasa, los
constructos de control que llevaban sitios de reconocimientos
delecionados o mutados (unidos, pero no escindidos por la
meganucleasa I-Sce I) se inyectaron con la
meganucleasa. Los inventores proponen que la linealización in
ovo inducida por meganucleasa, limitando la degradación de
extremos libres de ADN preintegrativo, es un procedimiento simple y
eficiente para mejorar la transgénesis por inyección en huevo.
Este ejemplo muestra que la transgénesis mediada
por meganucleasa es de hecho una técnica muy simple que es
espectacularmente más eficaz que los otros procedimientos
actualmente notificados en peces.
El p\alphaact-GFPM2 se
construyó con dos secuencias de reconocimiento
I-SceI en un plásmido de 7,8 kb que llevaba un gen
indicador EGFP accionado por un promotor específico de músculo de
\alpha-actina (p\alphaact-GFP,
donación de Dr. Higashijima, [Higashijima, 1997 #698]). Brevemente,
se usaron dos etapas de subclonación para insertar
"megaligadores" en los sitios Eco RI y KpnI localizados en
ambos sitios del casete de
\alpha-actina/GFP/poliA en el poliligador
Bluescript. Los megaligadores se generaron hibridando
oligonucleótidos complementarios que contenían el sitio de
reconocimiento I-SceI (CCGCTAGGGATAACAGGGTAATATA)
flanqueado por extremos libres compatibles con cualquiera de los
productos de digestión de EcoRI o KpnI. Después de la ligación del
megaligador con el plásmido linealizado, el ADN se digirió de nuevo
por la enzima usada para linealizar el plásmido y se transformó por
pulso térmico en E. coli ultra-competente XL1
Blue (Stratagene). Los clones se secuenciaron para determinar la
orientación del sitio I-SceI no palindrómico.
Se obtuvieron varios otros constructos
insertando diferentes ligadores en el sitio KpnI:
p\alphaact-GFPM con sólo un sitio de
reconocimiento I-SceI,
p\alphaact-GFPDM con un sitio de reconocimiento
acortado (GGGTAATATA) y p\alphaact-GFPMM que
contenía una versión mutada (TAGGGtTAACAGGGTAAT) del sitio
I-SceI. Estos dos últimos sitios unen la
meganucleasa, pero no se escinden eficazmente [Colleaux, 1986;
Colleaux, 1988].
En todos los experimentos se usaron embriones y
adultos de medaka de una cepa Orange-Red
(amablemente proporcionada por A. Shima, Universidad de Tokio,
Japón y Y. Ishikawa, Chiba, Japón). Los peces se criaron en peceras
de 20 litros a 26ºC. Los adultos se colocaron bajo un régimen de
reproducción (14 h de luz/10 h de oscuridad). Los huevos se
recogieron inmediatamente después del desove (con el amanecer), se
limpiaron y se colocaron en medio de cría de embriones de Yamamoto
[Yamamoto, 1975]. Para la inyección se seleccionaron embriones en
la fase de una célula con un blastodisco recientemente formado
[Iwamatsu; 1994] y se transfirieron a 4ºC para detener el
desarrollo. Aproximadamente se posicionaron a la vez diez embriones,
discos citoplásmicos hacia arriba, en ranuras de agarosa hechas con
un molde de plástico como se describe en [Westerfield; 1993]. En
todos los experimentos se usaron un estereomicroscopio Olympus SZX12
equipado con un micromanipulador MM3 (Fine Science Tools, Alemania)
y un inyector a presión (FemtoJet, Eppendorf, Alemania). Se
extrajeron capilares de vidrio de borosilicato (diámetro externo de
1 mm, GC100T, Clark Electromedical Instruments, RU) usando un
extractor vertical (PC-10, Narashige, Japón). Los
capilares se rellenaron con la disolución de inyección (ADN: 10
\mug/ml; tampón de meganucleasa (Roche Diagnostic, Alemania):
0,5x; meganucleasa I-SceI: 1 unidad/\mul; 0,1% de
rojo de fenol) usando microcargadores estériles (Femtotips,
Eppendorf, Alemania). Inmediatamente antes de la inyección, las
puntas de las micropipetas se rompieron a aproximadamente un
micrómetro de diámetro con pinzas finas. El ADN se inyectó a través
del corión insertando la pipeta directamente en el blastodisco fino.
Un pulso de presión dio como resultado la inyección de una gotita
(volumen estimado de 300 pl) visualizada por el rojo de fenol.
Entonces, los embriones se eliminaron de la agarosa y se colocaron
en placas de Petri a 26ºC. La expresión de GFP se cribó primero a
los tres días después de la inyección. Entonces, los embriones se
criaron hasta la madurez sexual y se hicieron cruces por
emparejamiento para identificar peces que habían transmitido el
transgén a su progenie.
Para la transferencia de Southern, el ADN
genómico del peces F1 se extrajo usando proteinasa K y fenol
[Sambrook y Russel; 2001]. Para conseguir suficiente ADN se usaron
todos los peces de un mes de edad. Para evitar ADNsas, los músculos
de los peces más viejos se diseccionaron para la extracción de ADN.
El ADN se digirió hasta finalización con BamHI, EcoRI, XbaI, XhoI.
Los patrones de ADN se prepararon digiriendo el plásmido
paact-GFP por las enzimas correspondientes. Usando
un contenido de ADN estimado de 10^{9} pb por genoma haploide se
cargaron 50 pg de plásmido p\alphaact-GFP
digerido. Las muestras (10 \mug por carril) se sometieron a
electroforesis en agarosa al 0,9% en 1xTBE y se transfirieron a una
membrana Zetaprobe de nailon (Biorad) mediante transferencia
capilar hacia arriba como recomendó el fabricante de Zetaprobe. Los
filtros se hibridaron en una botella rotatoria durante la noche a
65ºC con sondas radiomarcadas cebadas aleatoriamente (fragmento
XhoI/EcoRV) correspondientes a
\alpha-actina/GfP/poliA.
Los embriones se observaron y se puntuaron
usando un microscopio de disección MZFLIII Leica usando un filtro
de excitación de 370 a 420 nm y un filtro de emisión LP a 455 nm.
Las fotografías se adquirieron usando una cámara digital Nikon
DXM1200. Para la fotografía, los embriones se descorionaron con
enzima de eclosión [Yasumasu; 1994] siguiendo el procedimiento
descrito en [Wakamatsu; 1993] y se pusieron en glicerina al 80% en
PBS o en medio de montaje Vectashield.
La expresión transitoria de GFP en músculos de
embriones inyectados mejora cuando la meganucleasa se coinyecta con
el constructo.
El ADN de plásmido circular que llevaba el
promotor de actina p\alphaact-GFPM2 seguido de un
gen indicador GFP y flanqueado por dos sitios de reconocimiento
I-SceI (p\alphaact-GFPM2) se probó primero
para la expresión inyectándolo en embriones en la fase de una
célula (fase 2a, [Iwamatsu; 1994]). La concentración de ADN (13
ng/\mul) se eligió como la más alta que no condujo a una
mortalidad significativa de los huevos inyectados.
La expresión del gen indicador GFP en los
embriones se examinó en varias fases de desarrollo distintas usando
microscopía binocular de fluorescencia. La aparición de la expresión
de GFP se observó primero en unos pocos embriones después de dos
días (fase x).
Generalmente, los embriones se puntuaron después
de tres días de desarrollo cuando la expresión de GFP de
\alpha-actina muscular estaba en proceso. Los
embriones se agruparon según la intensidad de fluorescencia con el
fin de estimar cuantitativamente el nivel y la distribución de
expresión transgénica en cada experimento.
Aproximadamente el 50 por ciento de los
embriones no mostraron fluorescencia muscular y se clasificaron como
negativos (N) (Fig. 8B). En los otros embriones, el número de
células positivas para GFP osciló de unas pocas células
(clasificado como débil, D) a casi un marcado de células de músculo
casi ubicuo (fuerte, F). Cuando la expresión se detectó en un
dominio grande de la cola, pero en ningún sitio más, la expresión se
calificó como moderada (M). La expresión en células de músculo
individuales siempre fue suficientemente fuerte como para ser
fácilmente detectable y no se observó expresión ectópica.
Cuando p\alphaact-GFPM2 se
linealizó in vitro con I-SceI, se purificó en un gel
de agarosa y se inyectó a las mismas condiciones que se notifican
anteriormente, los resultados fueron similares a los obtenidos con
p\alphaact-GFPM2 circular (Fig. 8B).
Cuando p\alphaact-GFPM2 se
coinyectó con la meganucleasa I-SceI comercialmente
disponible en un tampón sin magnesio (de manera que la enzima
quedara inactiva extracelularmente), la expresión muscular de GFP
mejoró espectacularmente. Aproximadamente el 80% de los embriones
presentó una expresión moderada o fuerte en la musculatura del
tronco con respecto al 20% cuando la inyección se realizó sin la
enzima.
Por tanto, la expresión transgénica transitoria
en peces F0 mejoró inmediatamente y eficazmente por el protocolo de
meganucleasa mediante un mecanismo que supuestamente implica una
etapa de linealización in vivo del plásmido circular
inyectado.
Se sabe que la meganucleasa I-SceI tiene
algo de actividad de NLS. Para evaluar si los acontecimientos de
integración precoces eran de hecho debidos a una escisión in
vivo de ADN, y no a la elección del núcleo como diana por la
meganucleasa, los constructos de control que llevaban sitios de
reconocimientos delecionados (paact-GFPDM) o
mutados (p\alphaact-GFPMM) (unidos, pero no
escindidos por la meganucleasa) se coinyectaron con la
meganucleasa.
Tras la inyección, los embriones se agruparon
según los criterios descritos anteriormente (Fig. 8B). La
distribución de la expresión de GFP transitoria en embriones F0
coinyectados con p\alphaact-GFPDM o
p\alphaact-GFPMM y la meganucleasa fue similar a
la obtenida en experimentos que implican la inyección del constructo
p\alphaact-GFPM2 sin enzima. Por tanto, la
linealización in ovo de meganucleasa es un procedimiento
clave que mejora la expresión transitoria en los embriones de peces
en la fase de una célula inyectados.
La expresión muscular de GFP persistió en
algunos adultos que resultan de los experimentos de inyección. Por
tanto, un punto importante era investigar si y cómo el transgén se
transmitió a la siguiente generación y, en particular, si había
alguna correlación entre niveles de expresión en músculos adultos y
la frecuencia de transmisión de la línea germinal.
En un primer cribado en 30 adultos inyectados,
todos aquellos que no presentaron expresión de GFP en músculos
resultaron ser negativos para la transmisión del transgén de la
línea germinal. Por tanto, los peces negativos para GFP adultos se
consideraron a priori como negativos y posteriormente se
descartaron de los procedimientos de apareamiento de F0. Por tanto,
la observación de la expresión de GFP en adulto F0 simplificó
enormemente el cribado para peces transmisores.
Para investigar los efectos de la meganucleasa
sobre la frecuencia de aparición de fundadores transmisores de la
línea germinal, los peces inyectados se criaron hasta la madurez
sexual y se aparearon con parejas naturales. Entonces, el nivel de
fluorescencia muscular en su progenie de tres días de edad se puntuó
como se describe anteriormente (los resultados se resumen en la
Figura 9A).
Como cabía esperar, los peces fundadores
resultantes de la inyección sin la meganucleasa tenían líneas
germinales de mosaico y, en la mayoría de las líneas, las tasas de
herencia de F1 (como se ensayó por la expresión de GFP) eran
espectacularmente bajas (transmisión a sólo un bajo porcentaje de
los hermanos). En algunas líneas (con inserciones con alto número
de copias; véase más adelante) el transgén se transmitió a una tasa
moderada (del 30 al 50 por ciento).
A diferencia, la frecuencia de transmisión de la
línea germinal para fundadores coinyectados con el plásmido
circular y la meganucleasa se reforzó al 50% en la mayoría de las
líneas (Fig. 2A) que se corresponde con un aumento de 5 a 15 veces
en la frecuencia media de embriones positivos en la progenie.
Análisis de Southern adicionales confirmaron que
las integraciones únicas se produjeron en la mayoría de los casos a
un bajo número de copias (Fig. 9B).
El ADN se digirió primero con EcoRI o XhoI,
enzimas que no cortan o cortan una vez, respectivamente, en el
constructo de plásmidos (no mostrado).Todos los animales analizados
contuvieron un único fragmento de tamaño grande que se hibrida con
la sonda de inserto, sugerente de un único acontecimiento de
integración. Sin embargo, los inventores no pueden excluir la
existencia de varios acontecimientos tales porque las digestiones
con BamHI o XbaI dieron múltiples fragmentos de empalme. Con la
digestión con BamHI, como se representa en la Figura 9B, se
observaron dos fragmentos (1 y 2 kb) que se hibridaron con una sonda
correspondiente al inserto en el carril 1 a 4 en los que se
cargaron ADN de peces inyectados con la meganucleasa. Estos
fragmentos se correspondieron respectivamente con el GFP/pA y con
la región aguas abajo del promotor de actina (3'\alphap). La
presencia de una banda de 4,8 kb, diagnóstico de la región aguas
arriba del promotor ligado a la secuencia de plásmidos
(5'\alphap+pBluSK), sugirió que algunos transgenes se integraron
como repeticiones en tándem directas incluyendo el plásmido. Se
espera que este tipo de integración se produzca si sólo uno de los
dos sitios de reconocimiento I-SceI se corta y el
inserto se integra inmediatamente (sin corte adicional).
Este ejemplo expone una tecnología mediada por
meganucleasa que conduce a mejoras espectaculares en la transgénesis
de peces a varios niveles.
Primero, mejora la expresión transitoria (en F0)
de un constructo de ADN inyectado debido a un gran aumento en el
número de células que se expresan. Por tanto, la expresión del
mosaico del gen indicador en embriones inyectados disminuye
enormemente superando en parte una de las principales dificultades
de la transgénesis en peces. Este resultado abre un camino, por
ejemplo, para análisis más fáciles y más fidedignos de constructos
de promotores en especies de peces, una tarea que frecuentemente
implica su introducción transitoria preliminar por
microinyección.
Segundo, la tecnología mediada por meganucleasa
aumenta significativamente las tasas de transmisión de la línea
germinal en peces. Además, con el promotor específico de músculo
usado hubo una buena correlación entre el mantenimiento de la
expresión de indicador en peces inyectados adultos y la capacidad
para producir descendientes transgénicos. Por tanto, las
herramientas presentadas en este ejemplo simplifican enormemente la
tarea que requiere mucho tiempo de seleccionar los individuos F0
que pueden encontrar una familia transgénica.
Tercero y puede ser lo más sorprendente, la tasa
de transmisión en cada familia transmisora se reforzó
espectacularmente en estos experimentos. En la práctica esto
significa que familias de F1 grandes pueden generarse a partir de
un número razonable de huevos. Y, lo que es más importante, la tasa
de transmisión del 50% observada en la mayoría de los cruces entre
F0 transmisor y peces naturales sugiere fuertemente que un único
acontecimiento de inserción se produjo en una forma de no mosaico
en F0.
Los experimentos de control permiten proponer a
los inventores que la linealización in vivo es instrumental
en el aumento de las tasas de integración, aunque no es
necesariamente el único factor. Por ejemplo, un efecto de elección
del núcleo como diana de la enzima I-SceI puede estar en
juego en estos experimentos. Los inventores proponen que en una
primera etapa la ausencia de extremos de ADN libres en el plásmido
circular reduce la tasa de degradación citoplásmica del ADN
inyectado. Entonces, la posterior liberación de extremos libres
preintegrativos conduce a la eficiencia de integración típica de los
plásmidos lineales.
Finalmente, la integración de transgenes en
concatémeros largos, una característica frecuentemente encontrada
en peces, nunca se produjo en estos experimentos. En su lugar, los
inventores encontraron que el transgén se integró como repeticiones
en tándem directas cortas, un efecto beneficioso que es probable que
sea la razón del espectacular aumento en la expresión de niveles de
GFP.
Cabía esperar este tipo de inserción porque, en
el constructo plasmídico, los dos sitios ISce-I estaban en
la misma orientación. Los datos de transferencia de Southern también
sugieren que se produjo la integración de elementos repetidos en
tándem similares y comprendió algunas secuencias de plásmidos. Esto
indica que estos tándems están compuestos por varios plásmidos
cortados en sólo un sitio. Debido a que, in vitro,
ISce-I corta a una cinética similar en ambos sitios, una
posible explicación para ese fenómeno es que la cantidad de enzima
I-SceI era limitante con respecto a la concentración de ADN y
que la integración se produjo concomitantemente con el primer
corte.
Para mejorar adicionalmente la calidad de
integración puede proponerse cambiar las orientaciones de los sitios
I-SceI.
Las aplicaciones de esta técnica son numerosas,
sobre todo en varias especies de peces, pero también más
generalmente. Por ejemplo, prepara el terreno para experimentos más
sofisticados tales como experimentos de inactivación mediante
inyección de ADN en embriones u oocitos precoces.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el fin de mejorar la eficiencia de la
transgénesis, los inventores desarrollaron un procedimiento novedoso
basado en la linealización in ovo de un plásmido
superenrollado por meganucleasas.
Los constructos de plásmidos han sido diseñados
para llevar uno o dos sitios de reconocimiento/escisión para
meganucleasas que flanquean el transgén deseado que va a integrarse.
La fuente de meganucleasas se proporcionó tanto por proteínas
purificadas como por producción in ovo a partir de un vector
que expresa meganucleasas. La mejora de la transgénesis
(cuantitativa y cualitativa) se comparó con experimentos de
transgénesis "clásica" (es decir, inyección de un fragmento de
transgén prelinealizado y purificado). El control negativo se
realizó usando la misma preparación de superenrollamiento del ADN
de transgén libre de toda fuente de meganucleasas.
Las inyecciones se realizaron en la fase de una
célula en pronúcleos macho de huevos de ratón B6SJL. El vector de
expresión I-SceI se comprobó in ovo
microinyectando el plásmido pl-SceI/EGFP en la fase
de una célula en pronúcleos macho de huevos de ratón B6SJL. La
fluorescencia de EGFP ya se visualizó en la fase de 2 células en
embriones inyectados en un microscopio invertido con filtros de
EGFP. Debido a la naturaleza del constructo que llevaba un IRES
entre los dos ORF I-SceI y EGFP, a los inventores se
les aseguró en aproximadamente el 95% de los casos que cuando la
fluorescencia de EGFP se visualiza, I-SceI se
produce coordinadamente. Los plásmido Megafluo (Figura 10A) y
pl-SceI/EGFP (Figura 10B) se coinyectaron a
quinientas copias/pl. Los huevos inyectados se transfirieron a
ratón hembra de adopción B6CBA. Se comprobó el parto, los animales
nacidos muertos se recuperaron y su ADN se extrajo con el fin de
ser genotipado para una integración putativa del transgén
inyectado. Los ratones recién nacidos se tiparon a las 3 semanas
cortando un pequeño trozo de la cola. Entonces se realizó la
extracción de ADN, seguida del genotipado por PCR y/o experimentos
de Southern. A partir de este experimento se recuperaron 5 recién
nacidos y 2 nacidos muertos. Tras la extracción de ADN, la
recuperación de ADN se comprobó en gel de agarosa (Figura 11A). Con
el fin de comprobar la calidad del ADN genómico extraído se realizó
una PCR amplificando un subfragmento de 494 pb del gen
\beta-globina (panel derecho de la Figura 11 B). Todas las
muestras de ADN parecieron cualitativamente correctas cuando el
producto de PCR de \beta-globina esperado se
visualizó a partir de todas las muestras de ADN probadas. Con el fin
de probar la integración del transgén se realizó una PCR
amplificando 484 pb del gen indicador (DSRed1-E5)
(panel izquierdo de la Figura 11B). Entre la progenie de 5 ratones
de tres semanas de edad y los 2 nacidos muertos, 2 (número 1 y 25)
y 1 (número A) de ellos fueron transgénicos, respectivamente. En
general, estos resultados mostraron que el 40% de la progenie era
transgénica cuando se consideraron animales vivos y el 43% cuando se
consideraron en conjunto ratones inyectados vivos y nacidos
muertos.
Normalmente, cuando se realiza una coinyección
de plásmido en huevos en la fase de una célula de ratón, la
cointegración de ambos plásmidos se detecta en animales inyectados y
frecuentemente en la misma localización. Con el fin de probar la
integración del vector que expresa I-SceI
(pl-SceI/EGFP) también se realizó una PCR
amplificando un subfragmento de este plásmido. Todos los animales
recuperados (tanto los transgénicos para Megafluo como los no
transgénicos) fueron negativos para la presencia del vector que
expresa I-SceI (Figura 11C).
Con el fin de probar la transmisión del transgén
a la progenie F1, los animales transgénicos 1 y 25 se retrocruzaron
con animales sin inyectar B6SJL. Entre los 13 animales F1 y los 54
F1 derivados de 1 hembra y 25 machos, respectivamente, sólo un
animal F1 por cada uno retrocruzado era transgénico como se probó
por experimentos de transferencia de Southern usando una sonda que
se hibrida al promotor pGas 5. Estos resultados demostraron que
animales transgénicos obtenidos por transgénesis mediada por
meganucleasa eran fértiles y pueden transmitir el transgén a su
progenie. Los números indicaron una tasa de transmisión que oscila
del 2 al 8% y sugirieron que los fundadores eran mosaico para la
integración. Este resultado no era sorprendente ya que no se supone
que la producción de I-SceI a partir de sus
vectores de expresión correspondientes empiece antes de la fase de 2
células en huevos de ratón cuando la transcripción cigótica empieza
y el promotor de CMV empieza a ser activo en huevos de ratón.
El protocolo era equivalente en este
experimento, excepto que I-SceI se proporcionó como
una proteína purificada a una relación 1:5 de ADN/proteína. Se
coinyectaron 750 copias de plásmido superenrollado Megafluo (Figura
10A) con proteína I-SceI purificada (18 \muM). Los
huevos inyectados se transfirieron a ratón hembra de adopción
B6CBA. Entre nueve ratones recién nacidos, dos de ellos eran
transgénicos como se detectó por análisis de transferencia de
Southern usando tanto una sonda correspondiente al promotor Gas5
como las secuencias de esqueleto de plásmidos. Este resultado
mostró que los animales transgénicos se habían producido en este
experimento por este procedimiento con un rendimiento del 22%.
Se usó el mismo constructo de plásmidos,
Megafluo, en un protocolo clásico para transgénesis de ratones, es
decir, inyección de un transgén prelinealizado. Se realizaron dos
tipos de experimentos, uno usando el subfragmento de Ndel de 1796
pb y el otro usando el subfragmento de I-SceI de
1824 pb, llevando ambos subfragmentos el promotor Gas5 y el gen
fluorescente indicador. Se realizaron dos series de inyección para
el fragmento de I-SceI. La primera correspondiente
a la inyección de 500 copias/pl del fragmento de ADN ha conducido al
nacimiento de 2 ratones que eran negativos por PCR de Red5. La
segunda correspondiente a la inyección de 750 copias/pl del
fragmento de I-Sce ha conducido al nacimiento de 8
ratones negativos para la integración. La inyección de 750
copias/pl del fragmento de Ndel ha conducido al nacimiento de 8.
Entre los 8 recién nacidos, sólo uno era transgénico (número 18)
(Figura 12). En este experimento, el número de transgénicos fue del
12,5%. En los tres experimentos, 1 animal transgénico de 18
animales nacidos redujo el número al 5,5% de animales transgénicos
obtenidos cuando se usó la misma secuencia de ADN que en comparación
con números obtenidos a partir de transgénesis mediada por
meganucleasa. La transmisión a F1 del macho transgénico 18 se probó
cruzando este macho con hembras B6SJL. Entre los 25 animales F1, 1
de 6 y 3 de 19 obtenidos fueron transgénicos como se detecta en un
análisis de transferencia de Southern usando una sonda de promotor.
Estos resultados indicaron que la transmisión usando
"transgénesis clásica" es aproximadamente el 16%.
También se comprobó la integración de 750
copias/pI del plásmido Megafluo superenrollado por sí mismo. Se
realizaron dos experimentos independientes. Se obtienen 10 y 11
ratones, respectivamente. Usando tanto PCR como análisis de
transferencia de Southern con el fin de genotipar los ratones no se
detectaron animales transgénicos.
Con el fin de probar la eficiencia de la
transgénesis mediada por meganucleasa por otra meganucleasa los
inventores realizaron experimentos usando una proteína
PI-SceI purificada. El constructo transgénico,
PIFFLago, se describe en la Figura 13. El promotor Gas5 que conduce
a la expresión del gen indicador LagoZ (una secuencia LacZ libre de
CPG) está flanqueado por dos sitios de reconocimiento/escisión
PI-SceI en la misma orientación que separan las
secuencias de esqueleto del vector. Entre el promotor y el gen
indicador está presente un único sitio I-SceI.
Se realizó la coinyección de 750 copias/pl de
PIFFLAgo con proteína PI-SceI purificada a una
relación de ADN de diana/proteína de 1:25. Tras la transferencia de
los huevos inyectados, la madre de adopción se sacrificó en el día
12 de gestación y los embriones inyectados se genotiparon tanto por
PCR (Lago) como por análisis de transferencia de Southern con una
sonda correspondiente a la secuencia del gen indicador. Entre los 10
embriones genotipados, 3 de ellos fueron transgénicos (Figura 14,
panel derecho). Se detectó un fragmento de 7 kb en el ADN genómico
de aquellos embriones por la sonda Lago correspondiente a una
integración de repetición invertida en tándem. Este resultado
mostró que la eficiencia de la transgénesis mediada por
Pl-SceI era aproximadamente el 30%.
Usando el mismo constructo transgénico, la
transgénesis mediada por I-SceI se probó
coinyectando PIFFLago a 750 copias/pl con una 1:169 de diana de ADN
de I-SceI/molécula de proteína. Tras las
transferencia de los huevos inyectados, la madre de adopción se
sacrificó en el día 12 de gestación y los embriones inyectados se
genotiparon tanto por PCR (Lago) como por análisis de transferencia
de Southern con una sonda correspondiente a la secuencia del gen
indicador. Entre los 9 embriones obtenidos, 3 de ellos fueron
transgénicos (Figura 14, panel izquierdo; Figura 15). Este
resultado muestra que una linealización mediada por
I-SceI de un transgén en este experimento condujo a
un tercio de embriones transgénicos.
Se producen disoluciones de ADN de plásmido
(superenrollado) en columnas EndoFree de Qiagen. Después de la
precipitación, los plásmidos se resuspendieron luego a la
concentración deseada en tampón de Brinster, TRIS 10 mM, EDTA 0,25
mM. La disolución madre de I-SceI contuvo 150 \mug/ml (10
unidades/\mul) en HEPES 25 mM, pH 8, glicerina al 5%. La Tabla 3
indica cantidades de I-SceI para una serie de
relaciones de proteína:ADN.
Las muestras para inyecciones deberán prepararse
considerando que la glicerina estaba presente en la disolución
madre de I-SceI. Dependiendo de la cantidad de disolución de
I-SceI usada deberá añadirse algo de cantidad de disolución
que contiene glicerina (tampón X) para tener en cada caso una
concentración de glicerina final constante única. Para las
inyecciones, los inventores usaron muestras al 1% de glicerina y una
relación de proteína:ADN de 5:1.
(500 copias de plásmidos es equivalente a 3,01
10^{-20} mol. I-SceI es 29,3 KDa)
Se usó un protocolo similar para la transgénesis
mediada por PI-SceI, MM 51kDa. Basándose en la condición de
actividad de Pl-SceI se preparó una disolución madre de 1,15
mg/ml de PI-SceI que contenía glicerina al 20%. Se
usaron dos relaciones finales de ADN/para inyecciones: 50x (307,3
\mug/ml de PI-SceI en glicerina al 5,35% y HEPES 7 mM) y
94x (307,3 \mug/ml de PI-SceI en glicerina al 6,25%). Se
prepararon a partir de diluciones de la disolución madre de
PI-SceI en tampón de dilución.
Tampón de dilución:
HEPES 25 mM, glicerina al 5%, pH 8 a 25ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó la misma construcción superenrollada
tanto con un vector que expresa meganucleasa como con la proteína
purificada. Además, se usó la forma prelinealizada y purificada
in vitro del mismo transgén para comparar la "transgénesis
clásica" con la transgénesis mediada por meganucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de plásmido se realizó usando el
kit EndoFree de Qiagen (QIAGEN). El ADN recuperado se precipitó con
acetato de Na, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en tampón
de Brinster (TRIS 10 mM-EDTA 0,25 mM) a la
concentración deseada para inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se digirió Megafluo para liberar el transgén de las secuencias del vector de plásmido. Para este fin se usaron dos enzimas diferentes: enzimas Ndel o I-SceI que conducen a 1796 pb y 1824 pb, respectivamente.
- 2.
- Los productos de digestión de restricción se separaron en gel de agarosa usando TAE al 0,8%.
- 3.
- El gel se colocó sobre un transiluminador y la banda deseada se cortó y luego se purificó con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN).
- 4.
- Tras la elución del ADN en Tris (pH 7,6), el ADN se precipitó, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en tampón de Brinster a una concentración de 500 copias/pl.
- 5.
- El ADN se conservó a -20 grados centígrados.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Inyección intraperitoneal de hembras B6SJL de 3 semanas de edad con PEM (Folligon de Intervet) a 5 UI/ratón, 3 días antes de la inyección
- -
- Inyección intraperitoneal de hembras B6SJL de 3 semanas de edad con HCG (Chorulon de Intervet) a 5 UI/ratón, un día antes de la inyección y cruce con machos B6SJL
- -
- Cruce de hembras B6CBA de adopción con machos vasectomizados B6CBA.
- -
- Sacrificar las hembras B6SJL cruzadas con B6SJL, recuperar los oviductos y colocarlos en medios PBI
- -
- Separar los oocitos en 100 \mul de hialuronidasa a 0,5 mg/ml cortando la ampolla con pinzas durante 2'
- -
- Aclarar los huevos en PBI
- -
- Transferir los huevos a Whitten cubierto con aceite siliconizado y mantenerlos a 37ºC, 5% de CO_{2}.
- -
- Los huevos fecundados se microinyectaron en PBI usando un microinyector Eppendorf (Femtojet 5247) con micromanipuladores (Transferman NK2 5188) en un microscopio invertido Nikon (TE2000-U) usando capilares de contención e inyección (GC 100-10 y GC 100F-10 de Phymep)
- -
- Anestesia de hembras B6CBA por inyección intraperitoneal de avertina a 150 \mug/ml con 400 \mul/ratón
- -
- Transferencia de los huevos inyectados a oviductos diseccionados
\vskip1.000000\baselineskip
- 1)
- Añadir 750 \mul de tampón de cola y 40 \mul de proteinasa K por 1 cm de cola
- o 500 \mul de tampón de cola y 30 \mul de proteinasa K por membrana de embrión
- 2)
- Incubar a 56ºC durante la noche
- 3)
- Mezclar 5' en la mezcladora Eppendorf
- 4)
- Añadir 250 \mul de NaCl saturado (= 6 M) por cola
- o 170 \mul de NaCl saturado (\approx 6 M) por membrana de embrión
- 5)
- Mezclar 5' en la mezcladora Eppendorf
- 6)
- Centrifugar 10' a 13000 rpm
- 7)
- Recoger 750 \mul de sobrenadante en un tubo Eppendorf nuevo por cola
- o 500 \mul de sobrenadante por membrana de embrión
- 8)
- Añadir 500 \mul de isopropanol por cola
- o 350 \mul de isopropanol por membrana de embrión
- 9)
- Mezclar 2' en la mezcladora Eppendorf
- 10)
- Centrifugar 1' a 13000 rpm
- 11)
- Lavar el sedimento dos veces con 500 \mul de EtOH al 70% a TA
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- Marcado de 1 \mug de secuencias de ADN plasmídico purificado durante la noche usando el kit de marcación Dig de Roche. Las sondas se purificaron en G-50 sephadex. La cuantificación de la sonda se comprobó en un reacción de transferencia por puntos con el control de Dig del kit de Roche.
- b)
- Se digirieron de 1 a 7 \mug de ADN genómico durante la noche con enzima de restricción EcoRI (NEB)
- c)
- El ADN digerido se cargó en geles de agarosa al 0,8%-TAE
- d)
- Los geles se desnaturalizaron durante 30' en disolución desnaturalizante (NaOH (0,5 M) + NaCl (1,5 M)), luego se neutralizaron en disolución neutralizante (Tris (pH 7,4, 0,5 M) + NaCl (1,5 M))
- e)
- La transferencia de ADN se hizo por capilaridad en 10xSSC durante la noche en una membrana Hybond-N+ de nailon (Amersham)
- f)
- El ADN se fijó en la membrana por reticulación UV (Stratalinker de Stratagene) y se secó en estufa durante 2 h en una estufa a 80ºC
- g)
- Las membranas se prehibridaron en tampón de hibridación durante una hora a 68ºC en una estufa rotatoria
- h)
- La hibridación se realizó en tampón de hibridación con una sonda marcada con Dig predesnaturalizada (10 ng/ml) durante la noche a 68ºC en una estufa rotatoria
- i)
- Dos lavados de 5' a TA con una disolución de lavado precalentada en una plataforma rotatoria
- j)
- Un lavado de 5' a TA en tampón I (1x)/Tween al 0,3%
- k)
- Bloqueo de las membranas en disolución de bloqueo durante 30' en bolsas de plástico herméticamente cerradas centrifugadas a 250 rpm
- l)
- Incubación de los fragmentos Fab anti-digoxigenina-Ap (Roche) a 0,0375 U/ml durante 30' en disolución de bloqueo
- m)
- Dos lavados en tampón I (1x)/Tween al 0,3% de 30' cada uno
- n)
- 5' en tampón de revelación (tampón III)
- o)
- Revelación de membranas con sustrato quimioluminiscente CDP-Star de Roche
\newpage
- Tampón de hibridación: NaPi 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM
- Disolución de lavado: NaPi 40 mM, SDS al 1%
- Tampón I (10x): ácido maleico 1 M, NaCl 1,5 M, pH 7,5
- Disolución de bloqueo: reactivo de bloqueo (Roche) a 10% peso/volumen en tampón I
- Tampón III (1x): por litro: Tris 100 mM (pH 9,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 50 mM
\vskip1.000000\baselineskip
- 100 ng de ADN genómico o 1 ng de ADN de plásmido
- 1 \muM de cada cebador
- Mezcla RED Taq Ready (Sigma)
- DMSO del 5 al 10% dependiendo del cebador usado (véanse las condiciones de PCR)
- Qsp con agua esterilizada en autoclave hasta 10 \mul
- Recubrimiento con aceite mineral y colocar en ciclador térmico.
\vskip1.000000\baselineskip
- Desnaturalización 3' a 94ºC, 1 ciclo
- Desnaturalización 20'' a 94ºC
- Hibridación 30'' a temperatura variable dependiendo de los cebadores, Tm 35 ciclos
- Amplificación 20'' a 72ºC
- Ronda final de amplificación a 72ºC durante 3'
- Los productos de PCR se analizan en gel de agarosa al 2,5%-TAE
- PCR de \beta-globina
- DMSO al 10%, hibridación a 51ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos usados para la amplificación
por PCR del gen \beta-globina de ratón que
conducen a la amplificación de un fragmento de 494 pb
- Amplificación por PCR de Red
- DMSO al 10%, hibridación a 55ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos usados para la amplificación
por PCR de indicador de la secuencia de Megafluo que conducen a la
amplificación de un fragmento de 484 pb
- Amplificación por PCR de I-SceI
- DMSO al 10%, hibridación a 55ºC
\newpage
Oligonucleótidos usados para la amplificación
por PCR de un subfragmento de las secuencias de
pl-SceI/EGFP que conducen a la amplificación de un
fragmento de 400 pb
- Amplificación por PCR de Lago
- DMSO al 5%, hibridación a 51ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos usados para la amplificación
por PCR de indicador de la secuencia de PIFFLago que conducen a la
amplificación de un fragmento de 370 pb
- Controles de PCR:
- Control de contaminación: reacción de PCR idéntica excepto sin ADN, pero sólo agua (C) Control positivo: ADN de ratón B6SJL (wt) para garantizar que la muestra de ADN es ``amplificable con el uso de cebadores para la beta-globina de ratón demostrando que un gen de copia única puede amplificarse con los ADN genómico que van a genotiparse.
- El ADN de plásmido superenrollado positivo/negativo se usó sistemáticamente como controles en todos los experimentos de PCR.
Claims (39)
1. Un procedimiento no terapéutico para integrar
aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula huésped
mediante preparación en la célula huésped de dicho polinucleótido
lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de un vector, en
el que dicho procedimiento comprende:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido liberado en dicho genoma de la célula huésped,
y en el que dicha célula huésped es una célula
no humana.
2. Un procedimiento in vitro para
integrar aleatoriamente un polinucleótido en un genoma de la célula
huésped mediante preparación en la célula huésped de dicho
polinucleótido lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de
un vector, en el que dicho procedimiento comprende:
- a)
- Introducir en dicha célula huésped un vector que no tiene extremos 5' y 3' libres y que comprende dicho polinucleótido, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en el genoma de la célula huésped;
- b)
- producir la escisión de dicho(s) sitio(s) en dicha célula huésped, creando o liberando así dicho polinucleótido en una forma lineal que tiene extremos 5' y 3' libres a partir de dicho vector en dicha célula huésped; y,
- c)
- mantener la célula huésped en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para producir la integración aleatoria de dicho polinucleótido liberado en dicho genoma de la célula huésped,
y en el que dicha célula huésped es una célula
somática no embriónica humana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa
(b), una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped un
agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que
codifica dicho agente de escisión.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicho procedimiento comprende además, antes de la etapa (b),
una etapa adicional de introducir en dicha célula huésped un agente
de escisión.
5. Procedimiento según la reivindicación
1-4, en el que dicho polinucleótido está flanqueado
por al menos un sitio de escisión.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho polinucleótido está flanqueado por dos sitios de
escisión.
7. Procedimiento según la reivindicación
1-6, en el que dicho sitio de escisión es un sitio
de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa
correspondiente.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al
menos 12 nucleótidos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha endonucleasa es una meganucleasa.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I,
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III, I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape-I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-MfI I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-TIi I, PI-TIi II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Sce I.
12. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha endonucleasa es sintética.
13. Procedimiento según la reivindicación
1-12, en el que dicho polinucleótido no puede
someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula
huésped.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido no tienen
homología con una secuencia genómica de la célula huésped.
15. Procedimiento según la reivindicación
1-14, en el que dicho vector es un plásmido.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-15, en el que dicha célula
huésped no humana se selecciona del grupo que está constituido por
una célula madre, una célula somática, un gameto, un blastómero y
un huevo.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicha célula huésped no humana es una célula madre.
18. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicha célula huésped no humana es una célula somática.
19. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicha célula huésped no humana es un huevo.
20. Procedimiento según la reivindicación
1-19, en el que dicha secuencia de polinucleótidos
es una secuencia que codifica un polipéptido o un antisentido, una
secuencia reguladora o una secuencia de reconocimiento para una
molécula.
21. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que dicha célula huésped no humana proviene de pez, ave,
mamíferos no humanos, insecto, anfibio o reptil.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicha célula huésped proviene de medaka, pez cebra, pez
espinoso, Astyanax, ratones, pollos, Xenopus, ovejas, vaca,
conejo.
23. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 3-22, en el que el
procedimiento comprende además la etapa de generar una célula de
mamífero o pez, un animal mamífero no humano o pez transgénicos o
una planta transgénica para producir proteína, biomolécula,
biomaterial o vacuna.
24. Un procedimiento para producir un animal
transgénico no humano, en el que células madre embriónicas se
transfectan mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y
3-22, las células se inyectan en embriones en una
fase en la que pueden integrar las células transfectadas, los
embriones se reimplantan luego en una madre sustituta y los
individuos quiméricos obtenidos al final de la gestación, y en los
que se observa la colonización por células madre embriónicas de la
línea germinal, se aparean para obtener animales transgénicos.
25. Un procedimiento para producir un animal
transgénico no humano en el que el huevo fecundado se transfecta
mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y
3-22, los huevos se reimplantan en una madre
sustituta y los individuos transgénicos se obtienen al final de la
gestación.
26. Un procedimiento para producir un animal
transgénico no humano en el que el huevo fecundado se transfecta
mediante el procedimiento según la reivindicación 1 y
3-22, los huevos se incuban en condiciones
apropiadas para desarrollar dicho animal transgénico.
27. Una composición para transgénesis que
comprende:
- 1)
- un vector que no tiene extremos libres 5' y 3' y que comprende un transgén que va a integrarse en un genoma de la célula huésped, comprendiendo dicho vector al menos un sitio de escisión que no se encuentra en dicho genoma de la célula huésped; y,
- 2)
- un agente de escisión o un vector que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
28. Composición según la reivindicación 27, en
la que dicho polinucleótido está flanqueado por al menos un sitio
de escisión.
29. Composición según la reivindicación 28, en
la que dicho polinucleótido está flanqueado por dos sitios de
escisión.
30. Composición según la reivindicación
26-29, en la que dicho sitio de escisión es un sitio
de endonucleasa y dicho agente de escisión es la endonucleasa
correspondiente.
31. Composición según la reivindicación 30, en
la que dicha endonucleasa tiene un sitio de reconocimiento de al
menos 12 nucleótidos.
32. Composición según la reivindicación 31, en
la que dicha endonucleasa es una meganucleasa.
33. Composición según la reivindicación 32, en
la que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Chu I, I-Csm I.
I-Dmo I, I-Pan I,
I-Sce I, I-Sce II,
I-Sce III. I-Sce IV,
F-Sce I, F-Sce II,
PI-Aae I, PI-Ape I,
PI-Ceu I, PI-Cir I,
PI-Ctr I, PI-Dra I,
PI-Mav I, PI-Mfl I,
PI-Mgo I, PI-Mja I,
PI-Mka I, PI-Mle I,
PI-Mtu I, PI-MtuH I,
PI-Pab III, PI-Pfu I,
PI-Pho I, PI-Pko I,
PI-Psp I, PI-Rma I,
PI-Sce I, PI-Ssp I,
PI-Tfu I, PI-Tfu II,
PI-Tli I, PI-Tli II,
PI-Tsp I, PI-Tsp II,
PI-Bsp I, PI-Mch I,
PI-Mfa I, PI-Mga I,
PI-Mga II, PI-Min I,
PI-Mma I, PI-Msh I,
PI-Msm II, PI-Mth I,
PI-Tag I, PI-Thy II,
I-Ncr I, I-Ncr II,
I-Pan II, I-Tev I,
I-Ppo I, I-Dir I,
I-Hmu I, I-Hmu II,
I-Tev II, I-Tev III,
F-Sce I, F-Sce II (HO),
F-Suv I, F-Tev I y
F-Tev II.
34. Composición según la reivindicación 33, en
la que dicha meganucleasa se selecciona del grupo que está
constituido por I-Ceu I, I-Cre I,
I-Sce I.
35. Composición según la reivindicación 32, en
la que dicha endonucleasa es sintética.
36. Composición según la reivindicación
27-35, en la que dicho vector es un plásmido.
37. Composición según la reivindicación
27-36, en la que dicho vector que comprende dicha
secuencia de polinucleótidos que va a linealizarse comprende además
dicho ácido nucleico que codifica dicho agente de escisión.
38. Composición según la reivindicación
27-37, en la que dicho polinucleótido no puede
someterse a recombinación homóloga con el genoma de la célula
huésped.
39. Composición según la reivindicación 38, en
la que las secuencias de 5' y 3' de dicho polinucleótido no tienen
homología con una secuencia genómica de la célula huésped.
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| WO2006074956A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | Bayer Bioscience N.V. | Improved plant transformation methods |
| MX2008000764A (es) * | 2005-07-18 | 2008-03-24 | Pioneer Hi Bred Int | Sitios de recombinacion frt modificados y metodos de uso. |
| WO2009134714A2 (en) * | 2008-04-28 | 2009-11-05 | Precision Biosciences, Inc. | Fusion molecules of rationally-designed dna-binding proteins and effector domains |
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| EP2167666A2 (en) | 2007-06-29 | 2010-03-31 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Methods for altering the genome of a monocot plant cell |
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| EP2859122B1 (en) | 2012-06-12 | 2018-08-15 | Syngenta Participations AG | Methods and compositions for determination of vector backbone in a nucleic acid sample |
| EP2925779A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Institut Pasteur | Use of anti-fcyri and/or anti-fcyriia antibodies for treating arthritis, inflammation, thrombocytopenia and allergic shock |
| CA2971517A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Universite De Nantes | Anti il-34 antibodies |
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