KR101250991B1 - 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 형질전환 동물의 제조방법 - Google Patents
초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 형질전환 동물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD) 기술 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 형질전환 동물의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로 초음파 영상을 기반으로 유전자를 전달함으로써 ED 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계의 마우스 배아의 뇌실에 유전자를 주입할 수 있고, 아데노바이러스를 마우스 배아의 뇌실에 주입함으로써, 목적 단백질이 초기 발생 단계의 마우스 배아의 뇌세포에서 안정적으로 발현됨을 확인하였으므로, 최적화된 UIGD 기술 및 아데노바이러스 유래의 유전자 전달체는 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 형질전환 동물의 제조방법에 관한 것이다.
형질전환 동물(transgenic animals)은 인위적으로 외부의 유전자를 삽입하거나 또는 유전자를 제거하여 의도하는 유전형질을 발현시킨 동물을 말하며, 생명체에서의 특정 유전자의 역할을 파악하는 기초연구에 유용하게 쓰일 수 있다. 즉, 그 기능이 의심되는 유전자를 삽입 또는 결실시키고, 그 영향이 어떻게 나타나는지를 관찰하여 상기 유전자가 매개하는 생리적 기능을 유추할 수 있다. 뿐만 아니라, 형질전환 동물은 사람 질병의 모델로서 사용할 수 있고, 질병의 원인이나 질병의 진행과정 등을 파악하거나 잠재적 치료약품의 효과나 부작용을 알아보는데 매우 유용하다. 현재 치매, 암, 심장병, 유전병 등의 질병에 걸린 형질전환 마우스들이 개발되고 있다.
형질전환 마우스의 제작이 1980년에 최초로 성공하였는데, 형질전환 동물을 제조하는 방법에는 바이러스 벡터에 원하는 DNA를 삽입하여 숙주세포에 감염시키는 방법, 특정 DNA를 직접 동물의 수정란에 주입하는 방법, 또는 특정 DNA를 먼저 줄기 세포에 주입한 다음 이를 발생중인 수정란에 도입하는 방법 등이 있다. 이러한 형질전환 동물을 제작하는 과정은 실제로 많은 시간과 노력이 요구되고, 외부에서 넣어준 유전자는 염색체의 특정한 부위가 아닌 임의의 부위에 들어가게 되는데, 유전자가 들어간 부위와 세포의 환경에 따라 유전자 발현 효율에 차이가 난다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 마우스 태아 뇌의 빈 공간에 플라스미드 DNA를 주입한 후 전기자극을 주어 유전자를 전달하는 In utero electoporation법이 개발되었다(Saito, T. & Nakatsuji, N, 2001, Dev . Biol, 240, 237~246; Tabata, H. & Nakajima, K, 2001, Neuroscience, 103, 865~872). 이는, 특정 유전자를 시간 및 부위 특이적으로 발현하게 하였고, 기존의 방법에 비해 쉽고 빠르게 이용가능함을 확인하였으나, 플라스미드는 유전자를 지속적으로 발현시키기 어렵고 육안으로 관찰하여 유전자를 주입해야 하므로, 수정 후 13 내지 14일 이후에나 유전자 도입이 가능하다는 단점이 있다.
현재, 초음파 영상을 통하여 자궁 내의 태아로 유전자를 주입하는 기술(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD)이 개발되고 있고, 이를 이용하면 수정 후 8 내지 9일의 마우스 태아에게도 유전자를 도입할 수 있게 됨으로써, 기존의 육안에 의한 유전자 주입 기술에 비해 더 작은 태아에게도 원하는 유전자를 특정부위에 도입할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 신경으로 분화되기 시작하는 시점이 수정 후 10일(E10)인 것을 고려하면, 신경으로 분화되기 전에 유전자를 도입하여 유전자의 효율적인 국소 발현을 유도할 수 있다는 장점이 있다.
외래 유전자를 개체에 도입할 수 있는 전달체로서 바이러스가 주로 사용되고 있고, 주요 바이러스 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 등이 있으며, 그 밖에 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 또는 폭스바이러스 등이 사용되고 있다.
특히, 아데노바이러스는 80 내지 90 ㎚의 외피가 없는 바이러스로서, 정20면체 캡시드(icosahedral capsid) 내에 약 36 kb 길이의 선형이중쇄 DNA(linear double-stranded DNA)의 유전자를 포함하고 있다. 아데노바이러스가 유전자 전달을 위한 좋은 벡터로 사용될 수 있는 이유로는, 이들 유전자로부터 조기 서열 E1을 제거하여 복제능력이 없어 지속적인 감염력이 없고, 고역가(1012 입자/㎖ 이상)의 재조합 아데노바이러스 생산이 가능하며, 비교적 큰 cDNA 삽입이 가능하며(최대 7.5 kb), 레트로바이러스와 달리 유전자의 발현을 위해 세포증식을 필요로 하지 않으며, 전달된 유전자가 숙주 염색체에 삽입되지 않아 일시적인 재조합 유전자 발현만 있으므로 유전자 삽입으로 인한 비정상적인 변이를 초래할 위험이 없다. 아데노바이러스는 세포의 특이 수용체에 결합하여 세포 내로 이입됨으로써 엔도솜(endosome)을 파괴하고 세포질로 나와 핵으로 이동하여 바이러스 단백질을 합성하며, 자신의 DNA를 복제하여 104∼105개의 자손(progeny)을 방출한다. DNA 복제가 일어나기 전에 4개의 초기발현 유전자(E1~E4)가 먼저 발현되는데, 이 중 E1의 결손이 있으면 거의 모든 세포에서 바이러스 증식이 억제되나, 인간의 배아 신세포에서 유도된 293 세포에서는 증식이 가능하다. E1 및 E3 유전자 부위가 제거되고 외부 유전자가 삽입된 아데노바이러스를 293 세포에 이입하여 증식 불능 재조합 아데노바이러스(replication-defective recombinant adenovirus) 벡터를 대량으로 얻을 수 있다(Ilan Y et al., Semin Liver Dis, 1999;19:49-59). 이러한 재조합 아데노바이러스 벡터는 생체 내에서의 유전자 발현의 영향을 연구하는데 이용되고 있다.
현재, 초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultra Image guided gene delivery, UIGD) 기술 및 아데노바이러스 시스템을 이용하여 마우스 배아의 뇌에 유전자를 도입하여 형질전환 동물을 제조함에 있어서, 유전자 도입 후 성체 단계까지 이식유전자의 발현이 유지되는 형질전환 개체를 제작한 보고가 없다. 또한, 초음파 영상을 통해 배아의 뇌에 특정 유전자를 도입하는 기술에 있어서, 최적의 재조합 아데노바이러스 확립이 요구되며, 초음파 영상화 및 목적 유전자 주입의 기술을 최적화할 필요가 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 형질전환 마우스 제조 방법에 대한 문제점을 극복하고, 특정 부위에서만 목적 유전자가 국소발현할 수 있는 동시에 초기 발생 단계에서 형질전환 동물 제조 방법을 개발하기 위해 연구한 결과, 초음파 영상 이미지를 이용함으로써 배자기(embryonic day) 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계의 마우스 배아에 유전자를 주입할 수 있는 시스템을 확립하였고, 배아에 목적 유전자를 도입하는 전달체로서 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용한 결과, 목적 단백질이 초기 발생 단계의 포유동물 배아의 뇌세포에서 안정적으로 발현됨을 확인하였으므로, UIGD 기술에 기반한 유전자 전달체뿐만 아니라 UIGD 기술의 최적화된 시스템을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 아데노바이러스 벡터를 이용한 형질전환 동물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물을 제공한다.
최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 이용하여 초기 발생 단계에 있는 미세한 배아의 뇌실 부위로 유전자 전달체를 주입할 수 있고, 이를 통해 뇌세포에서 목적 단백질의 안정적인 발현을 유도하였다. 따라서, 최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 이를 위한 아데노바이러스 유전자 전달체는 목적 단백질을 암호화하는 유전자가 무작위적으로 삽입 또는 제거되는 기존의 형질전환 동물과 달리 뇌 부위에서만 특이적으로 발현될 수 있게 하였고, 시간과 비용 절감의 효과를 확인함으로써, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아데노바이러스 벡터의 구조를 나타낸 그림이다.
도 2는 아데노바이러스 벡터(pAxCAwtit2)의 구조를 상세하게 나타낸 그림이다.
도 3은 ED 14.5 시기의 배아에 대하여 항-GFP 항체 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체로 공염색한 결과를 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle);
VZ: 뇌실영역(ventricular zone);
녹색: 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP); 및
적색: 항-class Ⅲ β-tubulin.
도 2는 아데노바이러스 벡터(pAxCAwtit2)의 구조를 상세하게 나타낸 그림이다.
도 3은 ED 14.5 시기의 배아에 대하여 항-GFP 항체 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체로 공염색한 결과를 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle);
VZ: 뇌실영역(ventricular zone);
녹색: 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP); 및
적색: 항-class Ⅲ β-tubulin.
하기, 본 발명에서 사용한 용어를 정의한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "목적 단백질"은 숙주세포에서 발현하고자 하는 또는 발현할 수 있는 모든 단백질을 포함한다. 예를 들면, 성장속도 등을 조절하는 단백질, 상업적 가치를 가지는 외부 단백질, 바이러스 또는 다른 미생물에 대한 질병 저항성을 주는 단백질, 치료하고자 하는 질병과 관련된 효소 또는 단백질, 및 세포 내 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환(transfection)"은 플라스미드 형태의DNA를 세포에 물리화학적으로 직접 도입하거나 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 외래 유전자를 발현시키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술(ultrasound image-guided gene delivery, UIGD)을 이용한, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 구체적으로,
1) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프로모터는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter)를 사용할 수 있으고, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), SRα 프로모터(Molecular and Cellular Biology, 8: 466-472, 1991), EF-1α 프로모터(Gene 91: 217-223, 1990), 또는 CMV 프로모터 (Foecking M.K. 등, Gene 45: 101-105 (1986))인 것이 바람직하며, CAG 프로모터인 것이 가장 바람직하나, 생체 내에서 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터는 모두 사용가능하다.
상기 CAG 프로모터는 시토메갈로바이러스 인헨서(cytomegalovirus enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 시그날(rabbit β-globin poly A signal)로 구성될 수 있다.
상기 단계 1)의 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 특별하게 한정되지 않고, 뇌세포에서 발현시키기 위한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, 예를 들면, 효소, 성장인자, 사이토카인, 수용체 및 구조 단백질과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 사용될 수 있다. 상기 유전자는 아데노바이러스 벡터 중에 존재하는 프로모터에 의해 발현이 제어되도록, 재조합 아데노바이러스 벡터 내에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한 상기 유전자의 전사를 위해서 프로모터 및 전사 개시부위와 공동하는 다른 조절요소, 예를 들면 인핸서 서열이 벡터 내에 존재할 수도 있고, 도입된 유전자는 그 하류에 터미네이터 서열을 함유할 수 있다.
상기 단계 1)의 재조합 아데노바이러스 벡터는 하기 도 1에 도시된 개열지도를 갖는 것이 바람직하고, 도 2에 도시된 개열지도를 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있으며, 아데노바이러스 생산 세포주인 293 세포를 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
단계 2)의 아데노바이러스는 입자는 목적 유전자가 포함된 형태로 배아에 주입됨으로써 목적 유전자가 표적 세포 또는 조직에 효과적으로 전달되는 동시에 높은 농도의 유전자 발현을 유도할 수 있다. 또한, E1 및 E3 유전자의 결손으로 바이러스 DNA의 복제가 일어나지 않아 감염 안정성을 가지고, 높은 역가의 바이러스 벡터를 얻을 수 있으며, 신경세포처럼 분열하지 않는 세포에서도 감염이 가능하며, 체세포의 변이가 일어날 가능성이 매우 적다.
상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 마우스인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 배아는 배자기(embryonic day, ED) 6 내지 14일인 것이 바람직하고, ED 8 내지 12일인 것이 더욱 바람직하며, 신경 분화 시점 전인 ED 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계의 배아인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 미세주입은 그 말단이 10° 내지 50° 각도로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것이 바람직하고 20° 내지 30°로 연마된 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 25°로 연마된 것을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 시토메갈로바이러스 인헨서(cytomegalovirus enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter) 및 토끼 β-글로빈 종결자(rabbit β-globin terminator)로 구성된 CAG 프로모터를 가지는 상용벡터(pAxCAwtit2, TaKaRa, Osaka, Japan)에 목적 유전자로서 GFP 유전자를 이와 작용가능하게 연결하여, 아데노바이러스 제작에 적합하도록 재조합 아데노바이러스 벡터를 제작하였다(도 1 및 2 참조).
상기 제조한 아데노바이러스 벡터를 재조합 아데노바이러스의 제조에 필요한 요소를 갖춘 293 세포에 도입하여 재조합 아데노바이러스를 수득하였다
본 발명자들은 가늘게 뽑은 모세관(capillary) 끝을 25° 각도로 연마하여 주입 바늘로써 사용하여, 배자기 8.5 내지 9.5일의 배아를 임신한 ICR 마우스의 자궁을 꺼내어 Vevo 660TM High-Resolution Imaging System(Visual Sonic Inc., Toronto, Canada)을 사용한 자궁 속 배아의 초음파 영상하에서, 배아의 뇌실(ventricle)에 상기 제조한 아데노바이러스를 주입하였다. 그리고 나서, 자궁을 모체 복부의 원래 위치에 옮겨놓은 후 배아를 발생시켰다.
본 발명자들은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 사용하여 배아 뇌실에 주입한 아데노바이러스 벡터의 발현 양상을 확인하기 위하여, 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 아데노바이러스를 주입한 후, ED 14.5일 시점에 GFP 단백질 및 신경세포 마커 단백질(class Ⅲ β-tubulin, TuJ1)의 발현양상을 비교하였다. 그 결과, ED 14.5일의 배아에서 신경전구세포(neural progenitor cell) 및 분화하는 뉴런들이 존재하는 부위에서 GFP 단백질이 발현하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
따라서, 마우스 배아에 대한 목적 유전자의 미세주입 시 초음파 영상을 이용함으로써, ED 8.5 내지 E9.5일의 초기 발생 단계 배아에 대해서도 뇌 부위에 유전자를 효과적으로 주입할 수 있는 시스템을 확립하였고, 목적 단백질이 초기 발생 단계의 포유동물 배아의 뇌세포에서 안정적으로 발현되는 최적의 유전자 전달체임을 확인하였으므로, 최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 이를 위한 아데노바이러스 벡터 기반의 유전자 전달체는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물을 제공한다.
상기 제조방법은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 이용한 것으로서 초기 발생 단계의 배아의 뇌실 부위에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 전달함으로써, 상기 목적 단백질이 뇌세포에 안정적으로 발현하는 형질전환 동물을 제조할 수 있다.
상기 동물은 포유동물인 것이 바람직하고, 특히, 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, 마우스인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조방법으로 형질전환된 동물은 뇌세포의 게놈 DNA 내로 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 안정적으로 삽입되어 기관, 조직 및 세포에서 목적하는 단백질이 안정적으로 발현되는 동물인 것이 바람직하다.
본 발명자들은 마우스 배아에 대한 외래 유전자 미세주입 시 초음파 영상을 이용함으로써, ED 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계 배아의 뇌 부위에 유전자를 주입할 수 있는 시스템을 확립하였고, 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 제조한 재조합 아데노바이러스를 마우스 배아의 뇌실에 주입함으로써, 목적 단백질이 초기 발생 단계의 포유동물 배아의 뇌세포에서 안정적으로 발현됨을 확인하였으므로, 상기 제조방법에 의해 제조된 형질전환 동물은 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
아데노바이러스
(
adenovirus
) 벡터의 제조
초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD) 기술에서 유전자 전달체로 적합한 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위하여, TaKaRa(Osaka, Japan)의 Adenovirus Expression Vector Kit(Dual Version)Ver.2 (Cat.#6170 v0904)의 pAxCAwtit2 벡터를 사용하였다. 상기 pAxCAwtit2 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)에 존재하는 SwaⅠ 인식서열(Klenow-blunted)을 SwaⅠ 제한효소로 처리하고 eGFP 서열을 삽입하여 재조합 아데노-GFP 벡터를 제조하였다(도 1 및 도 2). 이때, 상기 벡터는 고효율의 CAG 프로모터를 포함하였고, 상기 CAG 프로모터는 포유동물 세포에서 작용할 수 있는, 시토메갈로바이러스 인헨서(cytomegalovirus enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 시그날(rabbit β-globin poly A signal)로 구성되어 있었다.
재조합
아데노바이러스의
제조
Adenovirus Expression Vector Kit(Dual Version)Ver.2(Cat.#6170 v0904, TaKaRa, Osaka, Japan)를 사용하여, 제조사가 지시한 프로토콜에 따라, 상기 실시예 <1-1>에서 준비한 아데노바이러스 벡터를 293 세포에 도입하여 재조합 아데노바이러스를 제조 및 정제하였다.
초음파 영상을 이용한 마우스 배아 뇌실로의 유전자 전달
<3-1> 주입 바늘의 제조
모세관(capillary)(World Precision Instruments, Sarasota, FL)을 Flaming/Brown micropipette puller P-87(Sutter Instrument co., San Francisco, CA)을 이용하여 가늘게 만든 후, micropipette grinder EG-44(Narishige, Japan)를 이용하여 25°각도로 연마하여 주입 바늘을 제조하였다.
<3-2> 마우스 태아 뇌실에 유전자 주사
배자기(embryonic day, ED) 9.5일이 된 배아를 임신한 ICR 마우스에, 틸레타민-졸라제팜(tiletamine-zolazepam)(Zoletil) 20 ㎎/㎏과 자일라진(xylazine) 10 ㎎/㎏으로 구성된 마취제를 복강내 주사(intraPeritoneal injection)한 후, 39℃의 발열판(Heating plate) 위에 마우스를 올려놓고 발 부분을 테이프로 고정하였다. 면도기를 사용하여 복부를 제모하고 개복한 뒤, 자궁을 꺼내서 깨끗한 페트리 접시(petri plate) 위에 올려놓은 후 초음파 검사용 겔을(Ultrasound transmission gel)(Sanipia, Korea)로 자궁 위를 덮어주었다. 그런 다음, Vevo 660TM High-Resolution Imaging System(Visual Sonic Inc., Toronto, Canada)을 사용하여 자궁 속의 태아 영상을 보면서, 태아의 뇌실(ventricle)에 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 주입바늘인 마이크로파이펫(micropipette)으로 상기 <실시예 2>에서 제조한 아데노바이러스(2.7×1010 pfu/㎖) 0.5 ㎕를 주사하여 전달하였다. 그런 다음, 꺼낸 자궁을 모체 복부의 원래 위치에 옮겨놓은 후 개복한 부위를 비흡수성 봉합사 Black silk 5-0, 50 ㎝(아이리, 한국)를 사용하여 봉합하였다.
마우스 뇌에서
아데노바이러스
벡터의 발현 양상 확인
ED 14.5일의 배아 뇌를 동결절단(cryosectioning)한 후, 항-GFP 항체(Invitrogen) 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체(TuJ1)(Covance)로 공염색하여 뇌 특이적인 목적 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 목적 유전자인 GFP, 및 신경세포 마커인 class Ⅲ β-tubulin이 공동발현되는 것으로 나타남으로써, 발생중인 뉴런 또는 신경세포에 아데노바이러스 벡터를 통한 목적유전자가 도입되어 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
이를 통해, GFP 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 뇌 부위에 효과적으로 감염되며, 마우스 신경세포에서 유전자를 안정적으로 잘 발현한다는 것을 알 수 있었다.
Claims (14)
1) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계를 포함하고,
상기 단계 1)의 프로모터는 CAG, CMV, SRα 및 EF-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조방법.
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계를 포함하고,
상기 단계 1)의 프로모터는 CAG, CMV, SRα 및 EF-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 프로모터는 CAG 프로모터인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 재조합 아데노바이러스 벡터는 도 1에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 아데노바이러스 생산 세포주는 293 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 포유동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 배아는 배자기 8 내지 12일의 배아인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 배아는 배자기 8.5 내지 9.5일의 배아인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 미세주입은 말단이 20° 내지 30°로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 미세주입은 말단이 24 내지 26°로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 제조방법.
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KR20030021154A (ko) * | 2000-03-17 | 2003-03-12 | 안티캔서, 인코포레이티드 | 유전자 발현의 전신 광학 영상화 및 이의 용도 |
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