JPH0779708B2

JPH0779708B2 - 遺伝子産物の製造法

Info

Publication number: JPH0779708B2
Application number: JP2006099A
Authority: JP
Inventors: モーリン，ゾーレン; アクゾーガーデス，ケン
Original assignee: ベンツォンファーマエイ／エス
Priority date: 1982-09-16
Filing date: 1990-01-11
Publication date: 1995-08-30
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: AU561754B2; CA1235667A; DE3377919D1; JPH0380094A; DK410783D0; JPH0759192B2; EP0106542A2; FI841977A0; FI86439C; IL69740A; HU201350B; IE832178L; JPS59501497A; IE56726B1; EP0106542A3; FI86439B; WO1984001172A1; DE106542T1; US4760022A; EP0106542B1

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、遺伝子及びその産生物を製造するための組
換えDNAの技術分野で有用なプラスミドの安定化法およ
びそのプラスミドの遺伝子の産物の製造法に関する。

技術背景大部分の天然のプラスミドがたとえ選択圧（selection
pressure）（プラスミドを保持するこれら微生物だけが
成育するのを保証するフアクター、一例として抗生物質
に対する耐性を伝達する遺伝子を有するプラスミドの場
合の栄養培地中の構成物質がある）がなくても維持し続
けるということは、プラスミド維持機能が発現されて、
これらの染色体外性要素（extrachromosomal element）
が高効率で存続しつづけるのを保証していることを示唆
している。このプラスミド維持機能は主として、細胞中
のプラスミド濃度を調節する遺伝子コントロール・サー
キツトを含む複製遺伝子で構成されている。成長細胞中
でこの複製コントロール・システムは、プラスミドのコ
ピー数を監視し、プラスミド複製の確率を増減させるこ
とによって平均値からの偏差を修正する。しかし、いず
れの複製コントロール・システムも、プラスミドの著し
く少ないコピーもしくはひとつだけのコピーしかもたな
い細胞が生成するのを防止できない。したがってかよう
な細胞からプラスミドのない娘細胞が生成する可能性が
あるということは明白である。この問題は勿論、低いコ
ピー数のプラスミドについても最も重大なことである。
さらに細胞分裂時のプラスミド分子の受身分配（passiv
e distribution）によって、ある程度の頻度でプラスミ
ドのない細胞が生成することは避けられない。細胞から
のプラスミド分子の喪失は不可逆なので、かような不安
定な状態の結末は、最終的には全集団にプラスミドがな
くなるということである。

細胞分裂時のプラスミドの不規則分配（randomdistribu
tion）のみならず、他のフアクターが、プラスミド維持
のためのセレクシヨンなしで培養される細胞の培養物か
らのプラスミドの喪失速度に影響を与えるときがある。
例えばいくつかのプラスミドは２つの新たに複製された
分子を分解するために特定の組換えシステムを要する
（Austinet al.,Cell 25,1981 pp.729〜36）。分解しな
ければマルチマー（multimer）が形成され（組合わされ
て）、このようにして、たとえ高いコピー数のプラスミ
ドでさえも娘細胞への分配の段階で低コピー数のプラス
ミドとして出現することがある。というのはプラスミド
のない細胞が生成する確率は、マルチマー構造体に組合
わされるプラスミド分子の数が増すにつれて増大するか
らである。組換えDNA技術にしばしばみられるもうひと
つの現象は、DNAフラグメントを挿入したために安定な
クローニングベクター（cloning vector）が不安定なハ
イブリツドプラスミドに変換する現象である。そしてこ
のDNAフラグメントが存在すると、プラスミドコピー数
の減少を起こすか又は細胞成長を消極的に妨害する有害
な産物を生成する。

かような場合はすべて、プラスミドの分離（segregatio
n）と喪失が、外部からでは容易に制御できない頻度
（高頻度もしくは低頻度）で起こる。

天然プラスミド、特に低コピー数プラスミドが安定なの
は、その複製コントロール・システムに加うるに、第２
セツトの維持機能が存在し、これが細胞分裂時のプラス
ミド分子の規則的な分配に積極的に関与しているという
ことを示唆している。かような機能は分配機能（partit
ioning function）と呼称されている。例えば、Meacock
et al.,Cell20,1980,pp.529〜42;Nordstrm et al.,P
lasmid4,1980,pp.332〜49;Seelke et al.,Plasmid 7,19
82,pp.163〜79の研究は、これらの機能が少なくとも一
部分がプラスミド自体によって［par部位（par region
s）中に］暗号とされているということを示した。かく
して、ある種のプラスミド欠失変異株は、通常の野生型
複製挙動を行うにもかかわらずその安定な維持性もしく
は遺伝を失い、プラスミドの安定性を保証する特定の機
能が除去されたことを示したのである（上記Nordstrm
et al.の文献参照）。

組換えDNA技術におけるベクターとして用いられる多く
のプラスミドは、野生型親プラスミドに比べて多量のDN
Aを除去されているので、これらプラスミドは不安定に
遺伝されやすい。このことは、プラスミドが不安定なこ
とによって結局プラスミドが細胞から完全になくなりか
ついずれの場合もプラスミドに暗号化された遺伝子の産
物の相対収率が減少するので、重大問題を提起する。こ
の問題は特に、セレクシヨン・プレツシヤー例えば抗生
物質の雰囲気下での微生物の培養は通常実施不可能でし
かも環境面からみて少なくとも好ましくないことが多
く、その微生物は多数世代にわたって培養される、大規
模生産時に特に著しい。少コピー／細胞で存在するにす
ぎないベクターは、不安定に遺伝されそれ故細胞から失
われやすい。プラスミドの相対的安定性を保証する比較
的高いコピー数を通常有するプラスミドでも、そのプラ
スミドに本来関しない（not naturally related;本来存
在していない）遺伝子を有するDNAフラグメントがその
中に挿入されると不安定になることが知られている。

発明の開示この発明は、そのプラスミドには本来関しない単一もし
くは複数の遺伝子が挿入されて保持され、加うるに分配
機能を発揮するDNAフラグメントが挿入されて保持され
ているプラスミドに関する。

“挿入される”という用語は、その単一もしくは複数の
遺伝子又はDNAフラグメントが、目的とするプラスミド
の組立て工程中の一段階でプラスミドに導入されたこと
を意味する。

これに関連して、“分配機能”という用語は、細胞分裂
時のプラスミド分子の定序分配（ordered distributio
n）を確実に行い、その機能を表現するプラスミドのタ
イプによって、ひとつ以上の遺伝子も含有しうるプラス
ミドの部位によって暗号化されている機能を意味する。
上記のようにかような部位は天然に生成する。すなわち
野生型プラスミドに見出されるが、par⁺表現型（phenot
ype）を表現するすなわち分配遺伝子が存在し、そして
そのプラスミドには本来関しない単一もしくは複数の遺
伝子が挿入されて保持されているプラスミドは新規なも
のであると信じられる。かくして、プラスミドとは微生
物中に本来存在する染色体外性要素と定義され、その要
素はそのもの自体もしくはその誘導体として単離するこ
とができる。

この発明のプラスミドは、挿入された単一もしくは複数
の遺伝子によって直接もしくは間接に伝達される工業も
しくは医学用の広範囲の産物、特にポリペプチド類、蛋
白類もしくはそのフラグメント、酵素類、酵素類の反応
による多数の非蛋白産物、ホルモン類のごとき低分子量
産物、及び核酸類を得ることを目的とする組換えDNA技
術分野におけるクローニング・ベクター又は産生ベクタ
ーとして用いることができる。そして真核遺伝子（euka
ryotic gene）ことに哺乳類遺伝子が特に重要である。

この発明の好ましい態様によれば、分配機能とは、野生
型耐性プラスミドR1の部位、したがって以下にR1par部
位（R1 par region）と記載される部位によって実際に
発現される機能である。この発明によって、かような部
位が、そのプラスミドには本来関しない単一もしくは複
数の遺伝子を保有する不安定なR1ミニプラスミドのみな
らず、そのプラスミドには本来関しない単一もしくは複
数の遺伝子を保有するプラスミドR1以外のしばしば分離
するプラスミドにも、いくらかのもしくは充分な安定性
を付与することが見出されたのである。特に有益な分配
機能のもうひとつの例は、その受容体プラスミド（reci
pient plasmid）に高い安定性を付与する野生型のプラ
スミドＦ（Seelke et al.上記文献）に見出されたとい
うことである。以下において、主としてR1par機能（R1
par function）について延べられるが、R1 par機能に関
連する多くの現象は他のpar機能にも適用され、かつ広
い範囲のこの発明の一般思想がR1 par機能に限定されな
いということは理解されるべきである。

プラスミドR1の分配機能はいわゆるEcoR1−フラグメン
トによって発揮されるということはすでに提示された
（Nordstrm et al.Plasmid 4,1980,pp.332〜49参
照）。この発明に至る研究過程において驚くべきことに
は約19kbの長さ（19,000の塩基対）を有するEcoR1−Ａ
フラグメントが、その受容体プラスミドにpar⁺表現型を
付与する２つのしかも２つだけの異なった部位からなる
ことが見出されたのである。これらの部位はEcoR1−Ａ
フラグメントの両端に位置しており、またEcoR1−Ａフ
ラグメント中の他のDNA配列はいずれも、プラスミドを
安定化する機能をなんら有していないと現在信じられて
いる。このため、この二つの部位をそれぞれpar部位Ａ
（par region A）とpar部位Ｂ（par region B）と命名
し、それぞれparA及びparBと略称した。

小さいフラグメントはプラスミドに挿入しやすくしかも
得られたプラスミドは宿主細胞に形質転換しやすいの
で、できるだけ小さいDNAフラグメントで作動させるの
が有利であることから、この発明はひとつの態様とし
て、プラスミドR1のEcoR1フラグメントより短くてR1 pa
r部位を有するDNAフラグメントが挿入されてこれを保持
するプラスミドを提供するものである。この挿入された
DNAフラグメントは通常、その主な要素としてR1 par部
位Ａ部位、R1 par部位Ｂ部位、又はR1 par部位ＡとR1 p
ar部位Ｂの両者からなる。このことは、宿主プラスミド
に挿入されたDNAフラグメントのすべてが実質的に、両
方の部位のいずれか一つもしくは両者で構成されている
ことを意味する。そのフラグメント上の残りのDNAは主
として適切な制限座位（restriction site）を提供する
ためのものであり、受容体プラスミド上の対応又は適合
性制限座位と容易に適合する所望の端部を有するDNAフ
ラグメントを提供する。かような端部もリンカーによっ
て提供できる。しかし、par部位ＡからなるDNAフラグメ
ント及びpar部位ＢからなるDNAフラグメントは、同じプ
ラスミドに別々にもしくは連続的に導入できて、そのプ
ラスミドは、同一DNAフラグメント上にあるpar部位Ａと
par部位Ｂとを挿入することによって表現型ParA⁺、ParB⁺
を樹立したプラスミドを表現型について同一であるとい
うことに留意することが重要である。例えば、parB部位
のごときpar部位をすでに保持しているプラスミドをさ
らに安定化したいならばそのプラスミドは適切な制限酵
素で制限して、そしてこの制限座位と適合性の端部を有
しかつpar部位のごとき他のpar部位を有するDNAフラグ
メントを挿入してもよい。また逆の方法すなわち、すで
にparA部位を有するプラスミドにparB部位を同様にして
挿入する方法を採用してもよい。

したがって興味あるプラスミドは、R1 par部位ＡとR1 p
arB部位とからなる挿入されたDNAフラグメントが約6kb
を超えない長さ、特に4kbを超えない長さことに3kbを超
えない長さを有するプラスミドである。挿入されたDNA
フラグメントがR1 par部位Ａを有するときは通常約4kb
超えない長さを有し、特に約2.5kbを超えない長さ、こ
とに約2kbを超えない長さを有する。挿入されたDNAフラ
グメントがR1 par部位Ｂからなるときは通常約2kbを超
えない長さを有し、特に約1.5kbを超えない長さ、こと
に約1kbを超えない長さを有する。上記の理由から小さ
いDNAフラグメントを選択しているがEcoR1−Ａフラグメ
ント全体を挿入することによってプラスミドの安定性を
得る可能性を除外するものではない。このことは例え
ば、安定化させるべきプラスミドの大きさが余り重要で
ない場合には許容することができる。フラグメント全体
が挿入される際は、抗生物質耐性を伝達する遺伝子をも
つDNAフラグメントを有することがスクリーニングする
のに有利である。しかしある種の理由からEcoR1−Ａフ
ラグメントの大きさを小さくしたい際は、EcoR1−Ａフ
ラグメントを制限酵素PstIで部分的に制限するか、又は
その大きなフラグメントから各R1 par部位を切除し対で
各部位を同じDNAフラグメントに逐次転移させ、次いで
このフラグメントを安定化させるべきプラスミドに挿入
させるなどのごとき種々の方法で行うことができる。

この発明の原理したがって安定化されるプラスミドは、
挿入されたR1 par部位によって安定化されるR1ミニプラ
スミド（R1ミニプラスミドはオリジナルのR1 DNAの多く
が除去され、その結果通常R1 par部位を含有していな
い）のごとき、挿入された分配部位と本来の関係（natu
ral relation）を持つプラスミドであってもよく、又は
分配機能と本来の関係を持たないプラスミドであっても
よい。この発明に係る有用で有効な分配機能によって、
R1 par部位によってR1ミニプラスミドを安定化する場合
のように本来の関係にあるプラスミドのみならず、分配
機能が本来の関係にないプラスミドについても充分な安
定性を保証しうるということは興味深いことである。後
者の例は、pMB1プラスミドもしくはその誘導体やpBR322
プラスミドもしくはその誘導体のごとき非R1プラスミド
にR1 par部位を挿入するものである（これらのプラスミ
ドは通常安定であるが、そのプラスミドと本来関係でな
い単一もしくは複数の遺伝子が挿入されると不安定にな
りやすい）。一方の例は、そのプラスミドを有する細菌
を培養中の少なくとも一段階において、低コピー数で広
い宿主域を有するプラスミド類（多くの異なった宿主菌
株もしくは種中に複製できるプラスミド類であり、この
クラスのものは２以上のタイプの微生物に複製しうるい
わゆるシヤトルベクターを含む）及びその誘導体、例え
ばRK2のごとき、低コピー数例えば0.5〜５コピー／細胞
を有するある種のプラスミドの安定化にR1 par部位を用
いる場合である。R1と別に、安定化を要する不適合性
（incompatibility）グループInc FIIの他のプラスミド
には例えばR100とR6が含まれる。不安定なプラスミドＦ
誘導体の安定化にR1 par部位を用いることもこの発明の
範囲に含まれる。

この発明の安定化法が重要であるプラスミドのひとつの
例は条件ランアウエイ複製プラスミド（conditional ru
naway replication）である。すなわち、そのプラスミ
ドを有する宿主微生物がある条件下で培養される際に一
定の低いプラスミドコピー数を有し、またそのプラスミ
ドを有する宿主微生物がある異なる条件で培養される際
その複製のコントロールを失い、そのプラスミドコピー
数が、宿主細胞の成長が停止するまで指数関数的に増大
するプラスミド類である。この発明の安定化法が特に必
要なランアウエイ複製プラスミドは、約３〜５コピー／
細胞を超えないコピー数を有するランアウエイ複製プラ
スミドであり、特にかようなプラスミドはそのプラスミ
ドを有する微生物がかような低コピー数を保証する条件
下で培養されると、約0.5〜１コピー／細胞を超えない
コピー数を有し（0.5という数字は複製頻度が1/細胞周
期以下であることを意味すると理解される）、その宿主
微生物がプラスミドコピー数を実質的に増大するのを保
証するある異なる条件下で培養されると少なくとも約50
0〜1000コピー／細胞の範囲のコピー数を有するランア
ウエイ複製プラスミドである。

ある条件下（代表的には約30℃のような低温）で低プラ
スミドコピー数であるということは、プラスミドを、宿
主細胞に対して若干毒性もしくは致死性の産物の遺伝情
報を指定する外来遺伝子を挿入するためのベクターとし
て用いるときは望ましいことである。というのは、例え
ば低温でプラスミド複製速度が低いことからその遺伝子
はたとえ表現されるとしても少量表現されるだけである
ので、細胞は培養の増殖過程で損傷しないままで存続す
るからである。しかし、低温で細胞を培養するがごとき
増殖過程の条件下で上記のように極端に低いコピー数を
有するプラスミド中にpar部位がないと、このプラスミ
ドを３〜５コピー数／細胞を超えないような低コピー数
を保証する条件下で培養する３〜５コピー／細胞を超え
ないコピー数を有するプラスミドについて約１％／世代
の頻度で微生物集団からプラスミドが失われる結果にな
る。約0.5〜１コピー／細胞を超えないコピー数を有す
るプラスミド喪失の頻度は約５％／細胞／世代である。
プラスミドを安定化する分配機能がなければ、そのプラ
スミドは、ランアウエイ複製を誘導するのに経済的であ
るような栄養培地中の密度にその細胞が到達する前に、
その細胞から失われてしまうことは明白である。このこ
とは、量産規模の培養に到達するために何百世代もの細
胞培養を要する大量生産の場合に特に明白である。

かようなランアウエイ複製は、そのプラスミドの本来も
っている複製コントロール遺伝子（単一もしくは複数）
［native replication control gene（ｓ）］の上流側
（upstream）に調節しうるプロモーター（regulatable
promoter）を挿入することによって条件付きにすること
ができる（この現象の詳細な記載は、“Plasmids with
Conditional Uncontrolled Replication Behaviour"の
標題で本願と同じ日に出願された本願出願人の係続中の
出願にある）。ランアウエイ複製挙動を有するプラスミ
ドとしては多くの異なるタイプのものであってもよい
が、好ましいランアウエイ複製プラスミドはR1タイプの
プラスミドである。

この明細書において“安定性”という用語（及び関連用
語）は、宿主細胞からのプラスミドの喪失の頻度が２×
10^-4／細胞／世代より少ないことを意味するよう意図さ
れている。野生型プラスミドと同様に安定な、すなわち
遺伝子の突然変異率のレベルに相当する３×10^-6／細胞
／世代より少ない喪失頻度を有するプラスミドを得るこ
とは、そのプラスミドにpar機能を組込むことによって
可能なことは明白である。この後者の喪失頻度（freque
ncy of loss,LF）値は、EcoR1−Ａフラグメントの全体
がプラスミド中に挿入されたときのようにR1 par部位Ａ
とR1 par部位Ｂの両方でプラスミドが安定化される際に
みとめられる。

しかし、上記のように、プラスミドR1のpar⁺表現型はEc
oR1−Ａフラグメントの各々別個のpar部位に位置してい
る。これらのpar部位は各々、安定化機能もしくは分配
機能を欠くプラスミドと定義される不安定なプラスミド
に安定化効果を与えることが見出された。par^-表現型の
かようなプラスミドは通常、高い頻度もしくは低い頻度
で宿主細胞から失われる。かくして、例えばそのpar部
位の欠失したプラスミドR1誘導体は、宿主細胞から約1.
5×10^-2／細胞／世代の頻度で失われる。同様に、par^-
表現型のプラスミドp15誘導体は約１×10^-2／細胞／世
代の頻度で失われ、いくつかのプラスミドpMB1（pBR32
2）誘導体（実施例3.3に記載した１例のごとき）は約６
×10^-3／細胞／世代の頻度で失われることがある。逆に
parAもしくはparBだけで安定化されたR1プラスミドは約
10^-4／細胞／世代のLF値を有し、これらのpar部位のい
ずれかを有するDNAフラグメントが不安定なベクターに
挿入されると100倍安定化されることに相当する。対応
するp15誘導体についての数値は約８×10^-4(ParA⁺）,2
×10^-6(ParB⁺）であり、対応するpMB1誘導体についての
数値は５×10^-5(ParB⁺）である。parAとparBの部位の両
者を有するプラスミドは約10^-6／細胞／世代のLF値すな
わち10⁴倍の安定性を有する。容易に参照するため、異
なるオリジンの安定化されたレプリコンと不安定なレプ
リコンについて得られた結果を第１表に示した。これは
各par部位が他のpar部位と独立して作動し、そのpar部
位は少なくともR1プラスミドとp15プラスミドを安定化
するのにほぼ同等に有効であり、またそれらの作動もし
くは効果は累積的であることを示している。この知見は
不安定なプラスミドを安定化するのに必要な度合を決定
するときに利用できる。余りにも著しい安定化を必要と
しない場合、すなわち安定化されるべきプラスミドが極
端に不安定でないと評価された（10^-2／細胞／世代より
小さいLF値を有する）場合は、十分な安定性を得るた
め、すなわち数百世代にわたる大量生産用細菌集団から
プラスミドが徐々に失われるのを防止するためには、pa
r部位のひとつを有するDNAフラグメントを挿入すれば充
分であろう。一方プラスミドが著しく不安定な場合は
（10^-2よりも大きいLF値を有する）、そのプラスミドの
著しい安定性を保証するためには両方のpar部位を挿入
することが必要であるか又は少なくとも有利であろう。

これらの測定可能なLF値は、上記定義のタイプのいずれ
のプラスミドが、遺伝子産物の量産にベクターとして使
用できて、その結果そのプラスミドには本来存在しない
少なくともひとつの遺伝子を有すべきである場合に利用
できる。かくしてこの発明は別の態様として、上記特性
のいずれかを有するparで安定化されたプラスミドを有
する細菌を培養し次いでそのプラスミドの遺伝子産物を
その細菌培養物から収穫する、プラスミドDNAから遺伝
子産物を生産する方法を提供するものである。培養自体
は、問題の細菌種に最適なことが知られている通常の栄
養培地を含む通常の技術を用いて適切に行われる。その
安定化法について、特定の組成の栄養培地を要しないと
いうことは特筆に値する。また遺伝子産物の収穫は、製
造される特定の遺伝子産物（同一性（アイデンテイテ
イ）と性質、宿主細菌の性質などに適する公知の方法に
したがって行われる。培養は細菌の少なくとも100世代
にわたって続けられる。大量生産時、細菌を増殖するの
に必要な細胞世代数は100世代を超えてもよい。このよ
うな環境下において、プラスミドのLF値は、プラスミド
の喪失が２×10^-4／細胞／世代より小さいように、その
中のpar部位の存在によって選択される。このLF値はひ
とつのpar部位だけで通常得ることができる。しかしい
くつかの場合には、10^-5／細胞／世代より小さい、特に
５×10^-6／細胞／世代より小さいプラスミドのLF値を得
ることが好ましい。

これらの非常に小さなLF値は、いくつかの例ではひとつ
だけのpar部位（特にR1 par部位Ｂ）の挿入によって得
ることができるが、通常両方のR1 par部位の存在が必要
である。

この発明は他の態様として上記定義のタイプのプラスミ
ドを有する細菌を提供するものである。プラスミド維持
を保証するのにいずれの特定の突然変異株もしくは菌株
を必要としないということはこの発明のプラスミド特有
の利点である。かくして、グラム陰性菌のごとくかよう
なプラスミドを保有しうる細菌の種と菌株のいずれをも
用いることができる。この発明のプラスミドが複製でき
てそれらの安定性を維持できる細菌の特例は大腸菌（エ
シエリヒア・コリ）である。

さいごにこの発明は主要素としてR1 par部位からなるDN
Aフラグメントを提供するものである。これは、宿主プ
ラスミドに挿入されたDNAフラグメントのすべてが実質
的に両方のpar部位のいずれかによって構成され、そのD
NAの残りの部分は受容体プラスミドの適合性制限座位へ
の挿入用の適切な制限座位を備えている。R1 par部位Ａ
とR1 par部位Ｂを有する挿入されたDNAフラグメント
は、この原理によって約6kbを超えない長さであるべき
で特に約4kbを超えずことに3kbを超えない長さであるべ
きである。そのDNAフラグメントがR1 parAを含む際は、
通常約4kbを超えない長さを有し、特に約2.5kbを超えな
い長さことに約2kbを超えない長さを有する。そのDNAフ
ラグメントがR1 par部位Ｂを有する際は、通常約2kbを
超えない長さを有し、特に約1.5kbを超えない長さこと
に約1kbを超えない長さを有する。制限酵素マツピング
によってparA部位が約1800bp（塩基対）の長さの部位に
狭められ、parB部位が約900bpに狭められた、小さくて
それ故に容易に挿入しうるDNAフラグメントがそれらの
安定化機能を保持していたということは驚くべき知見で
ある。par⁺表現型を実際に有する単一もしくは複数の遺
伝子はさらに小さくすることが可能である。

par⁺表現型を有する組立てハイブリツドプラスミド（co
nstruction hybrid plasmid）について重要な問題は、
この表現型をスクリーニングする早くて簡単な方法がな
いことであった。一般に適正なハイブリツドプラスミド
は、セレクシヨン圧なしでのプラスミドの培養中のプラ
スミドの高い安定性をもたらすpar⁺表現型によって同定
することができる。しかしこのタイプのスクリーニング
法は冗長であり、いずれの場合もその親プラスミドが不
安定に遺伝されているさいに適切であるに過ぎない。い
まや下記に概説するような別のスクリーニング法が開発
されたのである。

ａ）parA⁺フラグメント挿入のためのスクリーニング法 parA⁺部位をともに有している２つの異なるプラスミド
（別個の非適合性グループからの）が同じ細胞中に存在
すると、多分それらプラスミドが細胞中の分配装置を争
い合うからある頻度で互に排斥し合うものである。（不
適合性）。parによって伝達された不適合性表現型のこ
のタイプのものはparハイブリツドをスクリーニングす
るのに利用できる。例えばparA⁺プラスミドはlac遺伝子
とparA⁺部位を持つ他のプラスミドを有するΔlacエシエ
リヒア・コリ菌株（例えばCSH50）に形質転換すること
ができる。通常入って来るプラスミドはpar⁺で伝達され
た不適合性を常在性parA⁺プラスミドに対して発揮す
る。常在性プラスミドのLac⁺表現型によって、かような
不適合性は、もし形質転換細胞が入ってくるプラスミド
にだけ認められる耐性標識（resistance marker）に基
づいて選択されるならば容易に検出される。一方その常
在性プラスミドが存在するか否かはマツコンキイラクト
ースプレート（McConkey lactose plates）のような指
示基質（indicator substrates）にスコアされる。かよ
うなプレートから新しい同様なプレートへ移すレプリカ
平板法のコロニイは、Lac^-細胞の発生を示す無着色のコ
ロニイとして、常在性プラスミドの移転のごく低いレベ
ルでも提示する。もうひとつの安定性試験もしくはより
広範囲の不適合性試験が潜在するparA⁺ハイブリツドプ
ラスミドの性質を試験するのに必要なときがある。この
ようにして入ってくるプラスミドと常在性プラスミドと
の適正な（適合性の）組合せを行うことによって、lnc⁺
(Par⁺)フラグメントをプラスミドに挿入しプラスミドが
不安定か安定かを速やかにスクリーニングすることが可
能である。

ｂ）parB⁺フラグメント挿入のためのスクリーニング法またparB⁺部位をともに有する２つの無縁のプラスミド
が互に不適合であることも示されたので、parA⁺ハイブ
リツドの作製について述べられたのと同じスクリーニン
グ法がparB⁺ハイブリツドの作製に適合する。

ｃ）parA⁺,B⁺フラグメント挿入のためのスクリーニング
法 Tn5を挿入されたEcoR1−Ａフラグメントは上記記載によ
ってparA⁺ハイブリツドとparB⁺ハイブリツドの両者を移
転さすポテンシヤルを有するだけでなく、parA⁺,parB⁺
フラグメントを有するプラスミドの直接選択(Km^R)を行
わせる。かくしてそのフラグメントが大きいにもかかわ
らず、極めて少数のハイブリツドでも容易に選択され
る。両方のpar⁺部位からなる小さい法のDNAフラグメン
トも勿論parA⁺プラスミドとparB⁺プラスミドの両者に対
して不適合性を示す。

図面の説明図面について以下に説明する。

第１〜５図と第７〜17図は各実施例に記載のプラスミド
の制限マツプを示す。

第６図はR1からのPstI−Ｄフラグメントの詳細なマツプ
（比例尺に合わせて作図されていない）を示し、及び第18図は異なるpar部位を有する異なるタイプのレプリ
コンをPar^-レプリコンと比較した安定性曲線を示す。

第１〜５図と第７〜17図には各実施例に記載のプラスミ
ドの直線状制限マツプが示され、そのマツプに、プラス
ミドの表現型と遺伝子型とが親プラスミドを示す水平線
の上に示されている。かくしてparAはプラスミドの維持
を保証するプラスミドR1の部位のうちのひとつを示し、
parBはプラスミドの維持を保証するプラスミドR1の他の
部位を示す。iceIはコリシンE1に対する免疫性を伝達す
る遺伝子を示す。oriもしくはoriVはプラスミド複製の
オリジンを示す。blaはアンピシリンに対する耐性の遺
伝情報を指定する遺伝子を示す。IRはTn5上の逆方向反
復構造を示す。Km^Rはカナマイシン耐性を示す。Cm^Rはク
ロラムフエニコール耐性を示す。Ap^Rはアンピシリン耐
性を示す。Tc^Rテトラサイクリン耐性を示す。repAはR1
複製に必要な蛋白の合成の遺伝情報を指定する遺伝子を
示す。lacZ、lacY及びlacAは挿入されたlacオペロンを
示し、そのlacZはβ−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指
定し、lacYはパーミアーゼの遺伝情報を指定し、lacAは
トランスアセチラーゼの遺伝情報を指定する。repA−la
cZはrepA遺伝子とlacZ遺伝子間の融合体（fusion）を示
す。copBはrepAプロモーター（R1プラスミドの）からの
転写を抑制するポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝
子を示す。copAはRepA−RNAの翻訳を抑制するRNA分子の
遺伝情報を指定する遺伝子を示す。CI₈₅₇はλP_Rプロモ
ーターの活性を制御する感熱性λリプレツサー合成の遺
伝情報を指定する遺伝子を示す。Pdeoはdeoプロモータ
ーを示す。矢印は転写の方向を示し、三角形はDNAの挿
入を意味する。フイルドイン部分とブランク部分は挿入
された遺伝子を示す。点線は欠失を示す。

水平線の下に制限酵素に対する座位が示され、ＥはEcoR
1を意味し、ＰはPstIを意味する。B₁は第１図と第５図
は除いてBamHIを意味し、これらの図においてTn5DNAを
除いてB₁はBalIを意味する。H₁はHpaIを意味する。Evは
EcoRVを意味する。B₂はBglIIを意味し、S₁はSalIを意味
する。H₃はHindIIIを意味しＣはClaIを意味する。

第６図において、PstI−Ｄフラグメントがさらにマツピ
ングされた。水平線より上の数字は制限座位間の塩基対
の数を示す。水平線の下に、制限酵素のための座位が示
され、R₁はRsaIを、ＰはPstIを、H₁はHpaIを示す。

第18図に、実施例において作製され試験されたR1、p15
及びpBR322それぞれの誘導体の安定性曲線を示す。各曲
線は100世台以上続けた少なくとも２つの液体培養物に
ついて平均したものを示す。この図から、parAとparBの
両方を含むプラスミドは著しく安定に遺伝されているこ
とが分かる。またparBだけを含むプラスミド及びparAだ
けで安定化されたてミニーR1プラスミドの場合も同様で
ある。

Par^-プラスミドの曲線から、一定の喪失速度のために、
予想どおりに、プラスミドを保有する細胞の頻度が最初
から指数函数的に減少することが分かる。後の段階で、
プラスミド保有細胞の頻度はプラスミドのない細胞の成
長速度がわずかに早くなったことから明らかにより急速
に減少している（実線で示す）。点線はこのより早い成
長速度について調整され喪失の実際の頻度を示す曲線を
示す。

対照的に、表現型的にPar^-であるプラスミド類は、すな
わちR1プラスミドは1.5×10^-2／細胞／世代の頻度で、p
15プラスミドは１×10^-2／細胞／世代の頻度で、いくつ
かのpBR322プラスミド類（実施例3.3に記載の例）は６
×10^-3／細胞／世代の頻度で喪失する。事実、p15Par^-
誘導体とpBR322Par^-誘導体の喪失頻度は、これらのベク
ターのコピー数を考慮すると驚くほど高い。例えばp15
のコピー数は15−20/細胞のオーダーであり、プラスミ
ドが二項分布すると仮定するなら10^-9／細胞／世代の喪
失速度が予想される。それにもかかわらず高い喪失速度
が観察されるのは、p15レプリコンが、多分loxP様の分
解機能（loxP−like resolution function）を欠いてい
るので、recA依存のコーインテグレイト（recA depende
nt cointergrates）を形成するという事実（Austin et
al.,Cell25,1981,pp.729〜36）によって容易に説明され
る。またpBR322誘導体はコーインテグレイトを形成する
ことが知られており、そしてコピー数が例えば大きなク
ローン化されたフラグメント（large cloned fragmen
t）のために減少すると、かなり不安定になる。

原料と方法用いたエシエリヒア・コリｋ−12菌株はCSH50である
（Δpro−lac,rpsL;J.Miller:Experiments in Molecula
r Genetics,Cold Spring Harbor,New York,1972参
照）。いくつかのプラスミドとバクテリオフアージを使
用した（第２表）。

用いた実験技術は微生物遺伝学（J.Miller:Experiments
inMolecular Genetics,Cold Spring Harber,New York,
1972）及び遺伝子操作（Davis,Botstein and Roth:A ma
nual for genetic engineering:Advanced Bacterial Ge
netics,Cold Spring Harbor,New York,1980）の各分野
に用いられる標準技術である。

すべての細胞は、0.2％グルコースと１μg/mlのチアミ
ンを含有するLB培地（Bertani,J.Bact62,1951,p.293）
又は0.2％グルコースと１％カサミノ酸を補充したA⁺Ｂ
ミニマル培地（Clark and Malφe,J.Mol.Biol.23,1967,
p,99）中で培養した。用いたプレートはLB培地と1.5％
の寒天を含有するLAプレートである。

マツコンキイラクトース指示プレートは製造メーカー
（Difco）が推薦するとおりにして作製した。そしてＸ
−galプレートは、20−40μg/mlの５−ブロモ−４−ク
ロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを、0.2％の
グルコースと１μg/mlのチアミンを補充したA⁺Ｂミニマ
ル培地に添加することによって作製した。

物理化学的方法透明な溶解物（lysate）はClewell and Helinski,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 62,1969,pp.1159〜66に記載の方法
にしたがって作製された。

プラスミドDNAの小規模製造はBirnboim et al.,Nucl.Ac
ids Res.7,1979,pp.1513−23の方法で行った。

プラスミドDNAの大規模製造と分析は、Stou−gaad and
Molin,Anal.Biochem.118,1981.p.181にしたがってdye b
oyant desity gradient centrif ugationを用いて行っ
た。

DNA調製物のポリアクリルアミドゲル電気泳動法とアガ
ロールゲル電気泳動法による分析は特にMolin and Nord
strm,Methods in Plasmid Biology,Odense Universit
y 1982に記載のとおりにした行った。

制限エンドヌクレアーゼ類は、製造メーカー（Boehring
er,Mannheim or Biolabs,New England）の説明書にした
がって37℃で用いた。二重及び三重のダイジエスト（di
gest）は、最低の塩濃度を要する酵素で開始し次の酵素
を添加する前に緩衝液を添加して調整することによって
行った。

エクソヌクレアーゼBal31での処理は次のように行っ
た。0.1単位のBal31を50μｇの線状DNAに添加し、試料
として１分、２分、４分、８分、16分、32分及び60分後
に60mM EDTA中に採取しフェノールで抽出しエタノール
で沈殿とし、次いで20μlTE緩衝液に再度懸濁させた。2
0μｌの半量を適切な制限酵素でダイジエストし、アガ
ロースゲル電気泳動法に付して欠失したDNAの欠失部の
平均サイズを測定した。一方の半量には適切なリンカー
を添加し、その混合物を過剰のT4 DNAリガーゼとともに
48時間連結反応に付した。

制限されたプラスミドDNAの連結反応は、ブラントエン
ドの連結反応を除いては製造メーカーの推薦するとおり
に、過剰のT4DNAリガーゼとATPを添加して行った。

微生物学的方法分配試験（patrioning test）I:Lac⁺ベクターの作製に
よって、非選択的マツコンキイ・ラクトースプレートも
しくはＸ−galプレート上に単にストリークすることに
よってプラスミドのpar⁺表現型の測定が可能になった。
これらのプラスミドを有する細菌（Δlac）は、その指
示プレート上に着色コロニーとして容易にスコアされる
Lac⁺表現型を伝達する。一方プラスミドのない細胞はLa
c^-表現型を有し、無着色コロニーとして出現する。

分配試験II:（Lac^-プラスミドに用いる）；選択プレー
ト（抗生物質を含有するプレート）からコロニーをもう
ひとつの選択プレート上にストリークした。このプレー
トから、ひとつのコロニイをLAプレート上にストリーク
し単集落を形成させた。このLAプレートからの約10のコ
ロニイを1mlの0.9％NaCl中に懸濁させ、10^-4と10^-5との
それぞれの希釈率まで希釈した。0.1mlつづの10^-4希釈
液と10^-5希釈液をLAプレート上にひろげた。これらのプ
レートから50コロニイの耐性パターン（弱い不安定性が
予想される際は200コロニイ）は適切な選択プレート上
で試験された。次いで喪失頻度（LF値）が式： LF＝１−（ν）（1/27）（式中、νはプラスミドを有する細胞の頻度であり、ひ
とつのコロニイが27世代の間に成長すると想定してい
る）に基づいて計算される。この方法に特有なのは統計的揺
動（statistical fluctuation）が大きいことである。

分配試験III:Lac⁺プラスミドとLac^-プラスミドの安定性
の定量法。ひとつの完全コロニイ（complete colony）
を選択プレートから採取し、1mlの0.9％NaClに再懸濁し
て10⁸細胞/mlの濃度とする。その10^-3希釈液の２×0.1m
lを２×10mlのLB培地への接種に用い、30℃で振動させ
ながら培養された。約５×10⁸細胞/mlの細胞密度におい
て、その培養物は10⁴倍と10⁵倍とに希釈された。10⁴希
釈液の0.1ml（５×10³細胞）が新しいLB培地の10mlに接
種するのに用いられ、10⁵希釈液はマツコンキイラクト
ースプレート上にひろげた。そしてこれらのプレートを
30℃で一夜培養した。５×10⁸/mlから５×10²/mlへの希
釈は増殖の20世代（2²⁰）に相当する。その結果ひとつ
の希釈から次の希釈までのプラスミド保有細胞の頻度の
変化は、増殖の20世代の間に起こる変化に相当する。よ
り一般的に、LF値は次のように計算することができる。

（式中ν_１とν_２はそれぞれ、g₁及びg₂世代後のプラス
ミド保有細胞の頻度であり、LFは喪失頻度／細胞／世代
である。その結果次のようになる。

この式を用いることによって、最初に接種する細胞数の
揺動が原因の誤差は回避される。この式のより簡便な近
似式は LF＝1n（ν_１／ν_２）／（g₂／g₁）である。

不適合性試験挿入されたpar部位を有すると信じられるプラスミド
は、同じpar部位を有し、他の点では適合性のレプリコ
ンが互いに不適合性であり選択圧がないと２つのうちの
いずれかが喪失するに至るという観察事実を利用するこ
とによってスクリーニングされた。この試験は、試験す
べきプラスミドを他のプラスミドを保有する細菌株に形
質転換し、両プラスミドを二重選択プレート上で選択す
ることによって行われる。二重選択プレート（２つの異
なる抗生物質を有するプレート）上にストリークした
後、不適合性が定性的もしくは定量的に測定される。

不適合性の定性試験のために、二重選択プレートからコ
ロニイをLAプレート上にストリークし単集落（単コロニ
イ）を形成させた。このプレートから得た約10のコロニ
イを0.9％NaCl溶液の0.1mlに溶解し10^-4と10^-5のそれぞ
れに希釈した。10^-4希釈液と10^-5希釈液の0.1mlづつをL
Aプレート上にひろげた。これらのプレートから、50コ
ロニイ（もしくは弱い不適合性が予想される際は200コ
ロニイ）が適切な選択プレート上で試験された。Lac⁺プ
ラスミドが検体中に含まれている場合、マツインキイ・
ラクトースプレートが選択プレート上でのレプリカプレ
ート法の代わりに用いられる。Lac⁺プラスミドの場合、
そのスクリーニングはかくして、サスペクトされたpar⁺
プラスミドを、ハイブリツドプラスミドをすでに有する
Lac⁺表現型を伝達するPar₊菌株に形質転換することによ
って行われる。プラスミド不適合性及びその結果入って
くるプラスミドの特定のpar⁺表現型のプルーフは、マツ
コンキイプレート上のLac^-コローをスクリーニングし常
在性par⁺プラスミドが不安定化されたことを示すことに
よって容易に検出される。このスクリーニング手順の１
例が実施例４に記載されている。

不適合性の定量測定は、上記のごとく異種のプラスミド
集団を樹立した後のLac⁺プラスミドの喪失頻度を測定す
ることによって行われる。そのLF値は“分配試験III"に
記載されたのと同様にして測定した。

遺伝子技術細菌の形質転換は、Cohen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 62,1972,pp.2110−2114にしたがって行われ、低い
形質転換頻度が予想されるとき、コンピテント細胞の氷
上におけるDNAでの処理を数時間延長し、熱シヨツクの
後、その細胞を再び氷上で５〜30分間冷却するという改
変がなされた。この処理によって形質転換頻度が著しく
増加した。

バクテリオフアージλによる感染は0.2％のマルトース
を補充したLB培地中で（λ受容体であるmalB蛋白を誘導
するため）振盪しながら一夜10mlの培養物を培養するこ
とによって行った。その細胞を0.9％NaCl溶液で洗浄し2
mlの0.01MMgSO₄中に再懸濁し１時間培養した。λ懸濁物
の希釈物（10⁰、10^-1、10^-2）を作製し、そのフアージ希
釈液の0.1mlを用いて飢餓細胞の懸濁液の0.2mlに感染さ
せた。この感染混合物の10⁰、10^-1及び10^-2希釈液を選択
プレート上にひろげた。

Tn5（Km^R）を有するプラスミドをトランスポーズさせる
ためのソースはフアージλb221::Tn5であり、その付着
部位が削除されていたので、それは溶原化できず、その
フアージの懸濁液が、トランスポジシヨン（transposit
ion）の望まれるプラスミド含有細胞に感染させるため
に用いられた。感染は上記のようにして行われ、カナマ
イシン耐性細胞が選択された。数千のKm^Rコロニーが採
取され、これらの10^-2希釈液の0.2mlを用いて100mlLB培
地に接種した。培養物は一夜培養され、この細胞混合物
からプラスミドDNAが製造され、E.Coli K 12菌株CSH50
をカナマイシン耐性に形質転換するのに用いられた。

実施例１ R1から得られるEcoR1−ＡフラグメントへのTn5（Km^R）
の挿入プラスミドpKN184、すなわちプラスミドpSF2124と、プ
ラスミドR1（Nordstrm et al.,Plasmid4,1980,p.32
2）からの19kb EcoR1−Ａフラグメント（parA部位とpar
B部位を持つ）とで構成されたプラスミドを有するE.Col
i K−12菌株CSH50の細胞を“原料と材料”の項で述べた
ようにしてバクテリオフフアージλb211::Tn5の懸濁液
で感染させた。200μg/mlのカナマイシン含有のLAプレ
ート上でカナマイシン耐性を選択した後、コロニーを採
取し混合した。これらの10^-2希釈液の0.1mlを用いて100
mlのLB培地に接種した。その培養物を一夜培養した。そ
の培養物から得られたプラスミドDNAを用いて、200μg/
mlのカナマイシン含有のプレート上でカナマイシン耐性
を選択するE.Coli K−12菌株に形質転換した。

このようにして、カナマイシンに対する耐性を伝達し、
約5kb（5000塩基対）に相当するフアージDNAの挿入され
たプラスミドpOU1が見出された。このプラスミドは、プ
ラスミドDNAを作製しアガロースゲル上で分析すること
によって測定される大きさが34kbのひとつの分子量を有
し、またKm^R、Ap^R、ParA⁺及びParB⁺の表現型を有する。

プラスミドDNAはpOU1から作製され、そしてそのプラス
ミドは、そのプラスミドDNAを精製し単一もしくは複数
の制限酵素で切断し得られたフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動法で分析することによって、制限酵素でマ
ツピングされた（第１図参照）。このようにして、pKN1
84のEcoR1−Ａフラグメントに挿入されたλ::Tn5フラグ
メントはKm^Rの遺伝情報を指定する遺伝子を有すること
が同定されまたそのフラグメントの位置が第１図に示す
ように決定された。プラスミドpOU1は他の分析やプラス
ミド組立てにも用いられた。

E.Coli CSH50/pOU1の菌株は、ドイツの（Deutsche Samm
lung Von Mikroorganismen,Grisebach−strasse 8,D−3
400 Gmttingen、以下DSMと略称）に寄託番号（Acesio
n No.）2712で寄託されている。

実施例２ par⁺フラグメントのクローニングに有用なプラスミドの
組立てプラスミドpJL99（Light and Molin,Mol.Gen.Gent.184,
1981,pp.56−61）は、プラスミドR1からのrepA遺伝子と
lacオペロンとの融合体を有し、そのプラスミドはLac⁺
表現型を伝達する。repA−lac融合体を有するPstI−Sal
IフラグメントはpJL99から切り取られてp15レプリコン
であるpGA46に挿入され（An and Friesen,J.Bact.140,1
979,pp.400−407）、プラスミドpJL124が組立てられ
る。このプラスミドのマツプを第２図に示す。プラスミ
ドpJL124もマツコンキイラクトース指示プレート上にLa
c⁺表現型を伝達する。しかしpJL124のPstI座位に、プロ
モーター活性をわずかにもしくは全くもたないDNAフラ
グメントを挿入すると、repAプロモーターの活性を妨害
し、これらのハイブリツドはマツコンキイラクトース指
示プレート上にLac⁺としてもはや出現しないということ
が見出された。しかしより鋭敏なＸ−gal指示プレート
上で、形質転換細胞のコロニーは、β−ガラクトシダー
ゼの表現型発現が減少するがそのハイブリツド中で全く
抑制されているわけではないということを指示するLac⁺
である。それ故にpJL124は、ハイブリツドプラスミドが
マツコンキイラクトース指示プレート上でLac^-形質転換
細胞として容易に検出されるから、PstIフラグメントを
クローンするのに用いることができる。さらにpJL124
は、p15レプリコンでありしたがって不安定なので（こ
のプラスミドは、そのプラスミドの喪失した細胞がセレ
クシヨン圧なしでラクトース指示プレート上に無着色の
コロニイを形成するから容易に検出される）、pJL124を
安定化しうるPstIフラグメントはＸ−galプレート上で
スクリーニングできる。

したがってPstI−par⁺フラグメントを単離する手順は次
の工程で構成される。

１）PstIで制限されたpJL124と他のプラスミドからのPs
tIフラグメントとの連結反応２）クロラムフエニコール含有のマツコンキイラクトー
スプレート上でプレーテイングするCSH50への形質転換３）Ｘ−gal指示プレート上のLac⁺表現型の安定した遺
伝の代わりにマツコンキイラクトースプレート上のLac^-
として出現するクロンの試験（“原料と方法”の項参
照） E.Coli CSH50/pJL124菌株はDSMに寄託番号2760で寄託さ
れている。

実施例３不安定なプラスミドをparA部位とparB部位とで安定化す
る方法 1.ミニーR1レプリコンプラスミドPOU71（DSM寄託番号2471）、すなわちプラス
ミドR1の基本的レプリコン、フアージEDλ_４からのλP_R
プロモーターと、cI₈₅₇レプレツサー遺伝子、Tn3トラン
スポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺伝情報を指定する
遺伝子及び特異なEcoR1座位（pOU71の組立てに関する詳
細な記載は、“Plasmids with Conditional Uncontroll
ed Replicaton Behaviour"という標題で本願と同じ日に
出願された本願出願人の関連出願中にある）とからな
る、プラスミドpKN1562のランアウエイ複製誘導体をEco
R1で制限した。そしてpOU1からのEcoR1−A::Tn5フラグ
メント（実施例１参照）を挿入した。次いで連結反応、
E.Coli 菌株CSH50への形質転換、50μg/mlのカナマイシ
ン含有のLAプレート上でのカナマイシン耐性細胞の選択
が行われた。

これらの形質転換細胞は、50μg/mlのカナマイシン含有
のLAプレート上にストリークし42℃で培養することによ
って、pOU71のランアウエイ複製表現型についてのスク
リーニングがなされた。ランアウエイ複製プラスミド含
有細胞は、これらの条件下では最後には成育を停止す
る。このようにしてプラスミドpOU71−184が同定され、
これは25.5kbの大きさで、ParA⁺,ParB⁺、Ap^R、Km^Rの表現
型を有する。

このプラスミドは実施例１に記載のようにして制限酵素
でマツピングを行った（第３図参照）。その制限マツプ
からEcoR1−A::Tn5フラグメントがpOU71のEcoR1座位に
正しく挿入されていることが分かる。

このプラスミドを有する細胞は、選択圧なしで、すなわ
ち抗生物質を含むプレート上で培養することなしで、LA
プレート上で100世代培養された。“原料と方法”に記
載の方法（分配試験II）の方法にしたがってその細胞を
測定したところ、プラスミドを喪失していないことが観
察された。一方、pOU71は同様な条件下で培養された細
胞から１％／世代の頻度で喪失した。かくしてpOU71−1
84F約10^-6／細胞／世代の喪失頻度で安定に遺伝されて
いることが測定された。

E.Coli CSH50/pOU71−184の菌株は、寄託番号2763でDSM
に寄託されている。

2.p15レプリコン Par^-p15レプリコンであるプラスミドpJL124（実施例２
参照）を制限酵素PstIで切断し、PstIで部分的に制限さ
れたプラスミドpKN184（実施例１参照）と混合され次い
で連結反応に付した。この連結反応混合物は、50μg/ml
のクロラムフエニコール含有のマツコンキイラクトース
指示板上でクロラムフエニコール耐性を選択するE.Coli
菌株CSH50に形質転換された。

１以上のPstIフラグメントを持つpJL124を有する細胞
（実施例２参照）は、Ｘ−galプレート上Lac⁺表現型の
の安定した遺伝について試験がなされた。安定に遺伝し
たプラスミドのひとつがparA部位とparB部位の両者を有
することが分かった。このプラスミドpOU2は24kbのサイ
ズで、Cm^R、Lac⁺、ParA⁺、ParB⁺の表現型を有する。

このプラスミドは実施例１に記載のようにして制限酵素
でマツプ化された（第４図参照）。この制限マツプから
PstIフラグメントがEcoR1−Ａフラグメントから削除さ
れていることが分かる。

このプラスミドを有する細胞は、選択圧なしで100世代
Ｘ−galプレート上で成育した。pOU2には、0.5〜１％／
細胞／世代の頻度で細胞から喪失するpJL124と対照的に
10^-6／細胞／世代より小さいLF値で安定して遺伝されて
いることが測定された。

E.Coli CSH50/pOU2菌株は寄託番号2713でDSMに寄託され
ている。

3.pMB1レプリコンプラスミドpF1403−11（第２表参照）はプラスミドＦか
らの遺伝子とlacオペロンとの融合体を有するpBR322の
不安定に遺伝された誘導体（pMB1レプリコン）である。
このプラスミドはAp^R、Lac⁺表現型を伝達する。プラスミ
ドpOU1からのEcoR1−A::Tn5フラグメント（実施例１）
を、上記遺伝子融合体のすぐ上流にある（immediatelyu
pstream）プラスミドpF1403−11の特異なEcoR1座位に挿
入し、次いで連結反応と、５μg/mlのアンピシリン含有
のプレート上でAp^Rを、50μg/mlのカナマイシン含有の
プレート上でKm^Rを、マツコンキイ指示プレート上でLac
⁺をそれぞれ選択するE.Coli 菌株CSH50への形質転換を
行った。

得られたプラスミドpOU10は実施例１に記載したのと同
様にして制限酵素でマツプ化し（第５図参照）、EcoR1
−A::Tn5フラグメントの挿入が確認された。このプラス
ミドは34kbの大きさでありKm^R、Ap^R、Lac⁺、ParA⁺、ParB⁺の
表現型を有する。

このプラスミドは実施例3.1に記載したのと同様にして
安定な遺伝について試験した。その結果、pOU10が10^-6
／細胞／世代より小さいLF値で安定に遺伝されており、
一方pF1403−11は６×10^-3／世代の頻度で細胞から喪失
していることが示された。

E.Coli CSH50/pOU10は寄託番号2714でDSMに寄託されて
いる。

実施例４ pJL124を安定化するEcoR1−ＡフラグメントからのPstI
フラグメントのクローニング EcoR1−Ａフラグメントを多数の制限酵素で制限し、得
られた物理的地図を第１図を示した。この図から分かる
ように、このフラグメントは多数のPstIフラグメントで
構成されている。Par⁺表現型を伝達するフラグメントの
大きさを小さくするために、スクリーニングベクターpJ
L124中の１以上のPstIフラグメント上に多分保有される
par部位をサブクローンする（subclone）することを試
みた（実施例２参照）。正しい表現型−マツコンキイラ
クトースプレート上のLac^-と選択圧なしでの安定した遺
伝−で多数のクローンを分析した結果、PsTI−Ｄフラグ
メント（第１図参照）がこの表現型を伝達していること
を示した。他のいずれの単一のPstIフラグメントもpJL1
24を安定化することはできなかった。1.8kbのPstIフラ
グメント中に位置する、pJL124安定下の原因である部位
をparBと名付けた。

さらにPstI−Ｄフラグメントを分析するために、このフ
ラグメントをpOU93に生成する、pBR322のbla遺伝子中の
特異なPstI座位にクローンされた（第７図参照、このプ
ラスミドは寄託番号2724でDSMに寄託されている）。こ
のプラスミドのマツピングによって、そのPstI−Ｄフラ
グメントが３つのRsaI座位を有することが示された（第
６図参照）。RsaIはブラントエンドを生成し、それ故に
その900bp RsaIフラグメントが次のようにしてプラスミ
ドpHP34のSmaI座位（Prentki et al.,Gene 17,1982,pp.
189−96）に挿入された。pOU93がRsaIで制限され、SmaI
で制限されたpHP34と混合され、次いで連結反応に付さ
れた。連結反応混合物はすでにプラスミドpOU94（表現
型的にLac⁺とparB⁺であるp15の誘導体、第８図参照、こ
のプラスミドは寄託番号2725号でDSMに寄託されてい
る）を有し、50μg/mlのアンピシリン含有のプレート上
でアンピシリン耐性を選択しているE.Coli菌株に形質転
換した。

異なるプラスミドに保有されているparB⁺部位によって
表現される不適合性によって、pOU94は、表現型がparB⁺
である他のプラスミドがE.Coli細胞に導入されると失わ
れる。したがってマツコンキプレート上にその細胞をス
トリークし、無着色コロニー（Lac^-）をスクリーニング
することによって正しい挿入と形質転換細胞を選択する
ことが可能になる。900bp RsaIフラグメントを含むこと
が見出されたひとつの不適合性プラスミドpHP34誘導体
をpOU13と命名した。このプラスミドは5.3kbのサイズ
で、次の表現型Tc^R、Ap^R、ParB⁺を有する。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制
限酵素によってマツピングした（第９図参照）。このマ
ツピングによってRsaIフラグメントは、pHP34のSmaI座
位が２つのEcoR1座位の側にあるので900bpEcoR1フラグ
メントに変換された。

E.Coli CSH50/pOU13菌株は寄託番号2716号でDSMに寄託
されている。

pOU13からの900 bp EcoR1フラグメントが、cat遺伝子
（Cm^Rの遺伝情報を指定する遺伝子）中に特異なEcoR1座
位を有する、Ap^R、Cm^RランアウエイミニR1誘導体であるp
OU101のEcoR1座位に（pOU101の組立ての説明は“Plasmi
ds with Conditional Uncontrolled Replication Behav
iour"の標題で本願と同じ日に出願された本願出願人の
関連出願中にある。）挿入され、8.2kbの大きさでCm^S、A
p^R、parB⁺の表現型を有するプラスミドpOU14を組立て
た。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制
限酵素によってマツプ化した（第10図参照）。

このプラスミドは実施例3.1に記載したのと同様にして
安定な遺伝について試験した。その結果、30℃において
pOU14は1×10^-4／細胞／世代より小さいLF値を有し安定
に遺伝され、一方pOU101は１％／世代の頻度で細胞から
失われることが示された。

E.Coli CSH50/pOU14菌株は寄託番号2717でDSMに寄託さ
れている。

実施例５ parBフラグメントによるミニ−R1プラスミドの安定化プラスミドpOU90、すなわちプラスミドR1の基本的レプ
リコン、フアージEDλ４からのλP_RプロモーターとCI
₈₅₇リプレッサー、Tn3トランスンポゾンからのβ−ラク
タマーゼの遺伝情報を指定する遺伝子、及びpKN184から
のEcoR1−Ａフラグメントからなる、pKN1562のランアウ
エイ複製誘導体（pOU90の組立ての詳細な説明は、Plasm
ids with Conditional Uncontrolled Replication Beha
viour"の標題で本願と同じ日に出された本願出願人の関
連出願中にある）にはpKN184からのEcoR1−Ａフラグメ
ントが挿入されているが、このプラスミドをSallで制限
し連結反応に付してプラスミドpOU61を作製した。この
プラスミドをマツコンキイプレート上でLac^-表現型を選
択するE.Coli CSH50菌株に形質転換させた。

pOU61を実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で
マツピングした（第11図参照）。この制限地図からpOU6
1はその右端部にparB部位を持つ3.6kbのサイズのEcoR1
−Ａフラグメントを有することが分かる。このプラスミ
ドは安定な遺伝について実施例3.1に記載したのと同様
にして試験した。その結果、pOU61は1×10^-4／細胞／世
代より小さいLF値を有し安定に遺伝されていることを示
した。

E.Coli CSH50/pOU61菌株は寄託番号2723でDSMに寄託さ
れている。

実施例６ parBフラグメントによるプラスミドpF1403−11の安定化プラスミドpOU1（実施例１参照）をSalIで制限し、SalI
ですでに制限されたプラスミドpF1403−11と混合し、次
いで連結反応に付し、マツコンキイラクトース指示プレ
ート上アンピリシン耐性コロニーを選択するE.Coli 菌
株CSH50に形質転換した。これらLac⁺クローンのいくつ
かを、原料と方法の項に記載したのと同様にして、マツ
コンキイプレート上でLac⁺表現型が安定に遺伝されてい
るものをスクリーニングした。

この安定に遺伝されたプラスミドを実施例１に記載した
のと同様にして制限酵素で地図化した（第12図参照）。
この制限地図から、このプラスミドはparB部位が入って
いるpOU1のSalIフラグメントを有していることが分か
る。pF1403−11とpOU1からのSalIフラグメントで構成さ
れるこのプラスミドをpOU12と命名した。これは16kbの
大きさで、ParB⁺、Lac⁺、Ap^Rの表現型を有する。pOU12は
５×10^-5／細胞／世代より小さいLF値を有し安定に遺伝
されていた。

E.Coli CSH50/pOU12菌株は寄託番号2715でDSMに寄託さ
れている。

実施例７ parAフラグメントによるp15フラグメントの安定化プラスミドpMC903（Casadaban et al.,J.Bact.143,198
0,p.971）をEcoR1で制限し、プラスミドpOU43（第13図
参照、DSM寄託番号2720）からの、parA部位を有するEco
R1フラグメントを挿入し、次いで連結し、E.Coli 菌株C
SH50に形質転換した。得られたプラスミドはpOU45と命
名され、 13.4kbのサイズでParA⁺、Lac^-、Ap^R、Km^Rの表現型を有す
る。

このプラスミドを実施例１に記載したのと同様にして制
限酵素で地図化した（第14図参照）。この制限地図か
ら、parA部位にが、その挿入によって不活性化されるla
cオペロン中に挿入されたことが分かる。

原料と方法の項に記載したのと同様にして安定性を試験
したところ、このプラスミドが８×10^-4／細胞／世代の
LF値で安定に遺伝されていることが分かった。一方pMC9
03は１％／細胞／世代のLF値を有する。

E.Coli CSH50/pOU45菌株は寄託番号2721号でDSMに寄託
されている。

実施例８ parA部位によるミニ−R1プラスミドの安定化プラスミド43からのEcoR1フラグメントを、ミニ−R1プ
ラスミドのpOU82（DSM寄託番号2482号）に挿入した。こ
のプラスミドはプラスミドR1の基本的レプリコン、フア
ージEDλ４からのλP_RプロモーターとCIリプレッサー遺
伝子、Tn3トランスポゾンからのβ−ラクタマーゼの遺
伝情報を指定する遺伝子、pVH1424からのdeoプロモータ
ーとlacZ遺伝子のアミノターミナル端（aminoterminal
end）、及びpSKS104からの残余のlacオペロンとからな
る（pOU82組立ての詳細な説明は、“Plasmids with Con
ditional Uncontrolled Replication Behaviour"の標題
で本願と同じ日に出願された本願出願人の関連出願中に
ある）。プラスミドpOU82はAp^RとLac⁺表現型を伝達し、
EcoR1フラグメントをクローンするのに有用である特異
なEcoR1座位を有する。このプラスミドは選択圧なしで
１％／世代の頻度で喪失される。

2.4kbのEcoR1フラグメントを１配向に挿入されたたプラ
スミドをpOU47と命名した。このプラスミドは14kbのサ
イズで、parA⁺、Lac⁺、Ap^Rの表現型を有する。

pOU47を実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で
地図化した（第15図参照）。

E.Coli CSH50/pOU47菌株は寄託番号2722号でDSMに寄託
されている。

ParA部位を有するEcoR1フラグメントを、エクソヌクレ
アーゼBal31によって400bpまでさらに小さくした。この
削除処理は、pOU47の特異なBamHI座位を利用し、“原料
と方法”の項に記載したのと同様にして行った。組立て
られたプラスミドはpOU472と命名された。このプラスミ
ドは13kbのサイズでParA⁺,Lac⁺、Ap^Rの表現型を有する。

pOU472を実施例１に記載したのと同様にして制限酵素で
マツピングした（第16図参照）。この制限マツプからpO
U472はBal31での削除によって生成した2.0kbのEcoR1フ
ラグメントを有することが分かる。

“原料と方法”の項に記載したのと同様にして安定性を
試験した結果、このプラスミドが全parA部位が2.0kbEco
R1フラグメントに含まれていることを意味し安定に遺伝
されていることが分かった。

E.Coli CSH50/pOU472菌株は寄託番号2726号でDSMに寄託
されている。

実施例９ parA部位を有するミニ−R1プラスミドの組立てプラスミ
ドpOU90（実施例５参照）を、BamHIで切断しそしてSau3
Aで部分的に切断してEcoR−Ａフラグメントの一部を切
りとり、左端6kbが保持され連結反応に付された。得ら
れたプラスミドのpOU91はE.Coli菌株CSH50に形質転換さ
れた。pOU91は18.75kbのサイズでPar⁺、Ap^R、Lac⁺の表現
型を有する。このプラスミドを実施例１の記載と同様に
して制限酵素で地図化された（第17図参照）。

プラスミド安定性は、pOU91含有細胞を（対照としてpOU
82含有細胞を用い）マツコンキイプレート上選択圧なし
で30℃で25世代培養することによって測定された。pOU9
1で形質転換された細胞は赤いコロニーを生成したが（L
ac⁺）、一方pOU82で形質転換された細胞は赤と白の両方
のコロニーを生成し、これは選択がない期間はpOU82が
いくつかの細胞から失われたことを示す。

E.Coli CSH/pOU91菌株は寄託番号2483でDSMに寄託され
ている。

実施例10 parA⁺,parB⁺ミニ−R1プラスミドの組立てプラスミドpOU
82（実施例８参照）がEcoR1で制限され、次いでparA部
位を有する、pOU43からのEcoR1フラグメント（実施例７
と第13図参照）が挿入される。このEcoR1フラグメント
は、エクソヌクレアーゼBal31によって左端部の500bpが
切りとられ、ひとつのEcoR1を有している。このプラス
ミドの特異的EcoR1座位に、pOU13からのEcoR1フラグメ
ント（実施例４と第９図参照）が挿入される。得られた
プラスミドは、parA⁺,ParB⁺の表現型を伝達するが、次
いでプラスミドpOU94をすでに有しているE.Coli 菌株CS
H50に形質転換でき、またこのpOU82誘導体は、マツコン
キイラクトース指示プレート上で培養すると、このプレ
ートのみを有する細胞のコロニーが中心部に赤色を呈
し、周縁部が無色を呈することを意味する弱いLac⁺表現
型を伝達すること以外は、実施例４に記載したのと実質
的に同様にスクリーニングできる。

実施例11 parA⁺,parB⁺ミニ−R1プラスミドの組立てプラスミドpOU
61（実施例５参照）をEcoR1で制限し、parA部位を有す
る、pOU43からのEcoR1フラグメントを挿入し連結した。
得られたプラスミドは、ParA⁺,ParB⁺表現型を伝達する
が、すでにプラスミドpOU2を有するE.Coli 菌株CSH50に
形質転換できそして実施例４に記載の方法に対応するし
かたでスクリーニングできる。所望のプラスミドを有す
る細胞のコロニーはマツコンキイラクトースプレート上
で無着色コロニー（Lac^-）として出現する。

（この明細書及び請求の範囲を通じて、Par^-、Par^-、par⁺
又はpar⁺は特別に指示がない場合、parとParの用語は分
配機能の表現を意味する。）

【図面の簡単な説明】

第１〜５図と第７〜17図は各実施例に記載のプラスミド
の制限マツプを示す。第６図はR1からのPstI−Ｄフラグメントの詳細なマツプ
（比例尺に合わせて作図されていない）を示し、及び第18図は異なるpar部位を有する異なるタイプのレプリ
コンをPar^-レプリコンと比較した安定性曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き微生物の受託番号ＤＳＭ２７２０微生物の受託番号ＤＳＭ２４８２微生物の受託番号ＤＳＭ２７１２微生物の受託番号ＤＳＭ２７６０微生物の受託番号ＤＳＭ２７６３微生物の受託番号ＤＳＭ２７１３微生物の受託番号ＤＳＭ２７１４微生物の受託番号ＤＳＭ２７１６微生物の受託番号ＤＳＭ２７１７微生物の受託番号ＤＳＭ２７２３微生物の受託番号ＤＳＭ２７１５微生物の受託番号ＤＳＭ２７２１微生物の受託番号ＤＳＭ２７２２微生物の受託番号ＤＳＭ２７２６微生物の受託番号ＤＳＭ２４８３

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グラム陰性菌内で複製し、そのグラム陰性
菌中で分配機能を奏しかつプラスミドR1のpar部位に由
来する部位で本質的に構成されたDNAフラグメントを挿
入することによって安定化されたプラスミドであって、
前記DNAフラグメントが19キロ塩基対以下の長さを有し
かつプラスミドR1のpar部位Ａ、par部位Ｂ又はpar部位
Ａとpar部位Ｂとの両方からなり、前記プラスミドがそ
のプラスミドには本来関連がなくかつ遺伝子産物をコー
ドする単一もしくは複数の挿入された遺伝子からなるプ
ラスミドを保有する細菌を、培養し、前記プラスミドの遺伝子産物を細菌培養物から
収穫することからなる、プラスミドDNAの遺伝子産物の
製造方法。
【請求項２】挿入されたDNAフラグメントが、R1par部位
ＡとR1par部位Ｂとからなり、約6kbを超えない長さ、特
に4kbを超えない長さ、ことに3kbを超えない長さを有す
る請求の範囲第１項の方法。
【請求項３】挿入されたDNAフラグメントが、R1par部位
Ａからなり、約4kbを超えない長さ、特に約2.5kbを超え
ない長さ、ことに約2kbを超えない長さを有する請求の
範囲第１項の方法。
【請求項４】挿入されたDNAフラグメントが、R1par部位
Ｂからなり、約2kbを超えない長さ、特に約1.5kbを超え
ない長さ、ことに約1kbを超えない長さを有する請求の
範囲第１項の方法。
【請求項５】プラスミドが、抗生物質耐性を伝達する遺
伝子を追加して有する請求の範囲第１〜４項のいずれか
の方法。
【請求項６】プラスミドが、分配機能を奏する挿入され
たDNAフラグメントがない場合に不安定に遺伝されるプ
ラスミドである請求の範囲第１〜５項のいずれかの方
法。
【請求項７】プラスミドが、P15プラスミドもしくはそ
の誘導体、又は高いコピー数で宿主範囲の広いプラスミ
ドもしくはその誘導体である請求の範囲第６項の方法。
【請求項８】プラスミドが、そのプラスミドに本来関連
のない単一もしくは複数の遺伝子からなるDNAフラグメ
ントを有することから、不安定に遺伝される請求の範囲
第６項の方法。
【請求項９】プラスミドが、pBR322プラスミドもしくは
その誘導体のようなpMB1プラスミドもしくはその誘導体
である請求の範囲第８項の方法。
【請求項１０】プラスミドが、プラスミドを有する細菌
を培養中少なくとも一段階において、低いコピー数を有
する請求の範囲第６項の方法。
【請求項１１】プラスミドが、約0.5〜５コピー／細胞
のコピー数を有する請求の範囲第10項の方法。
【請求項１２】プラスミドが、R1とその誘導体を含む不
適合性グループIncFIIのプラスミド、Ｆとその誘導体、
及び低コピー数で宿主範囲が広いプラスミドとその誘導
体から選択される請求の範囲第10項もしくは11項の方
法。
【請求項１３】プラスミドが、条件ランアウエイ複製プ
ラスミドである請求の範囲第10項もしくは11項の方法。
【請求項１４】プラスミドが、そのプラスミドを有する
宿主微生物がある種の条件下で培養される際約３−５コ
ピー／細胞を超えないコピー数を有し、かつその宿主微
生物がある種の異なる条件下で培養される際少なくとも
約500〜1000コピー／細胞の範囲のコピー数を有する請
求の範囲第13項の方法。
【請求項１５】プラスミドが、ひとつの温度で約３〜５
コピー／細胞を超えないプラスミドコピー数を有し、そ
してより高温では少なくとも約500〜1000コピー／細胞
の範囲のプラスミドコピー数を有する請求の範囲第14項
の方法。
【請求項１６】約３〜５コピー／細胞を超えないプラス
ミドコピー数が約0.5〜１コピー／細胞の範囲にある請
求の範囲第14項もしくは第15項の方法。
【請求項１７】調節しうるプロモーターが、そのプラス
ミドの本来もっている単一もしくは複数の複製制御遺伝
子の上流側に挿入された請求の範囲第１、14、15もしく
は16項の方法。
【請求項１８】プラスミドがR1型プラスミドである請求
の範囲第14〜16項のいずれかの方法。
【請求項１９】細菌がグラム陰性菌である請求の範囲第
１〜18項のいずれかの方法。
【請求項２０】グラム陰性菌がエシエリヒア・コリであ
る請求の範囲第19項の方法。
【請求項２１】培養が、細菌の少なくとも100世代行わ
れる請求の範囲第１〜20項のいずれかの方法。
【請求項２２】プラスミドの喪失が２×10^-4／細胞／世
代を超えない請求の範囲第21項の方法。
【請求項２３】プラスミドの喪失が10^-5／細胞／世代を
超えない請求の範囲第22項の方法。
【請求項２４】プラスミドの喪失が５×10^-6／細胞／世
代を超えない請求の範囲第23項の方法。