DE60037949T2

DE60037949T2 - Thermosensitives Plasmid für coryneforme Bakterien

Info

Publication number: DE60037949T2
Application number: DE60037949T
Authority: DE
Inventors: Jun Kawasaki-shi Nakamura; Sohei Kawasaki-shi Kanno; Eiichiro Kawasaki-shi Kimura; Kazuhiko Kawasaki-shi Matsui; Tsuyoshi Kawasaki-shi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2020-03-17
Also published as: DE60037949T4; BR0001326A; EP1038966B1; US6303383B1; DE60037949D1; JP2000262288A; EP1038966A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues temperaturempfindliches Plasmid für coryneforme Bakterien. Dieses Plasmid kann zur Modifizierung eines chromosomalen Gens von coryneformen Bakterien verwendet werden, welche für die Produktion nützlicher Substanzen, wie Aminosäuren durch Fermentierung, verwendet werden, um ihre genetischen Eigenschaften zu ändern. So kann das Plasmid zum Züchten von Mikroorganismen verwendet werden, die für die Produktion von Aminosäuren durch Fermentierung usw. nützlich sind.
Technischer Hintergrund
Es wurde bereits über einen Versuch berichtet, die genetischen Eigenschaften coryneformer Bakterien durch das beabsichtigte Modifizieren eines besonderen Gens auf ihren Chromosomen zu verändern, oder durch das stabile Einschließen eines Gens einer definierten Kopienanzahl auf den Chromosomen, wodurch solche coryneformen Bakterien für die Herstellung nützlicher Substanzen, wie beispielsweise Aminosäuren, durch Fermentierung benutzt werden können ( Japanische Patentveröffentlichung Offenlegung (Kokai) Nr. 5-7491 ). Das erfordert ein Plasmid, bei dem die Replikations-Kontrollregion der Plasmid-DNA die autonome Replikation des Plasmids ermöglicht, welche modifiziert werden soll, damit es eine Replikations-Kontrollregion ist, die eine temperaturempfindliche Mutation hat, welche die Replikation unmöglich macht, wenn die Kulturtemperatur erhöht ist. Wenn jedoch ein derartiges Plasmid, welches eine temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion enthält, in coryneformen Bakterien verwendet wird, die ein anderes Plasmid mit einer Replikations-Kontrollregion vom Wildtyp haben, von dem die temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion stammt, kann zwischen den Plasmiden eine homologe Replikation verursacht werden. So ist das Phänomen, dass ein Plasmid, das von einer Transformante beherbergt wird, nicht länger die temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion hat, beobachtet worden. Gleichermaßen, wenn beabsichtigt ist, ein Gen auf einem Chromosom coryneformer Bakterien unter Verwendung eines derartigen Plasmids zu modifizieren, ist das Phänomen, dass dieses Plasmid aufgrund einer Inkompatibilität in dem Züchtungsverfahren eliminiert wird, ebenfalls beobachtet worden, wenn ein coryneformes Wirtsbakterium ein Plasmid beherbergt, welches eine Replikations-Kontrollregion gleichen Ursprungs wie das zuvor erwähnte Plasmid besitzt.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein temperaturempfindliches Plasmid zu gewinnen, welches keine Homologie mit bereits beschriebenen temperaturempfindlichen Plasmiden aufweist und keine Inkompatibilität hiermit aufweist, wodurch ein Verfahren bereitgestellt wird, um genetische Merkmale eines Wirts in einem kurzem Zeitraum effizient zu modifizieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben aktiv geforscht, um das oben erwähnte Ziel zu erreichen. Als Ergebnis haben sie erfolgreich ein Plasmid, das in Anspruch 1 definiert ist, welches eine Mutation enthält, die dessen autonome Replikation bei einer niedrigen Temperatur erlaubt, aber nicht dessen autonome Replikation bei einer erhöhten Temperatur erlaubt, aus dem Plasmid pAM330 gewonnen, welches aus dem Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 extrahiert wurde ( Japanische Patentveröffentlichung Offenlegung (Kokai) Nr. 58-67699 ; Miwa, K. et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901 (1984)). Auf diese Weise haben sie die vorliegende Erfindung vollbracht.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung ein Plasmid, wie in Anspruch 1 definiert, bereitstellt, welches eine temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion und ein Markergen enthält, wobei die empfindliche Replikations-Kontrollregion aus dem Plasmid pAM330 stammt, welches von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 beherbergt wird, und dem Plasmid ermöglicht, sich autonom bei einer niedrigen Temperatur zu replizieren, aber dem Plasmid nicht ermöglicht, autonom bei einer erhöhten Temperatur in coryneformen Bakterien innerhalb eines Temperaturbereiches, in dem die Bakterien wachsen können, zu replizieren.
Das zuvor erwähnte Markergen ist vorzugsweise ein Antibiotika-Resistenzgen, was aus einem Bakterium stammt, das zum Genus streptococcus gehört, und spezifische Beispiele hierfür schließen ein Kanamycin-Resistenzgen, ein Tetracyclin-Resistenzgen, ein Spectinomycin-Resistenzgen usw. ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des zuvor erwähnten Plasmids enthält das Plasmid weiter eine Replikationskontroll-Region, die eine autonome Replikation des Plasmids in Escherichia-Bakterien ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Plasmid mit einer temperaturempfindlichen Replikations-Kontrollregion bereit, welches eine Replikations-Kontrollregion ist, die in der Nucleotidsequenz in SEQ ID Nr. 17 enthalten ist und aus dem Plasmid pAM330 stammt, welches von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 beherbergt wird, welches eine Mutation enthält, die Prolin an der Aminosäureposition 73 durch eine Aminosäure ersetzt, die nicht Prolin in der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 18 ist, und eine autonome Replikation bei einer niedrigen Temperatur erlaubt, aber keine autonome Replikation bei einer erhöhten Temperatur erlaubt, innerhalb eines Temperaturbereichs, in dem coryneforme Bakterien wachsen können.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines coryneformen Bakteriums bereit, bei dem ein DNA-Fragment in dessen Chromosom eingebaut ist, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einschleusen eines rekombinanten Plasmids, welches durch Ligieren eines DNA-Fragmentes mit einer Sequenz, die homolog zu einer DNA-Sequenz, die auf einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums vorhanden ist, mit dem zuvor erwähnten Plasmid, in eine coryneformen Bakterienzelle,
(b) Kultivieren des Bakteriums bei einer Temperatur, bei der das Plasmid autonom replizierbar ist, um eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment und der DNA-Sequenz mit einer Sequenz, die homolog zu dem DNA-Fragment ist, welches auf dem Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhanden ist, und
(c) Selektieren eines Bakteriums, bei dem das DNA-Fragment zusammen mit dem Plasmid in das Chromosom eingebaut ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des zuvor erwähnten Verfahrens umfasst das Verfahren ferner die folgenden Schritte:

(d) Kultivieren des Bakteriums, um eine homologe Rekombination zwischen dem in das Chromosom eingebauten DNA-Fragments und einer DNA-Sequenz zu verursachen, welche eine Sequenz hat, die homolog zum DNA-Fragment ist, und ursprünglich auf dem Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhanden ist,
(e) Kultivieren des Bakteriums bei 31–37°C, um die ursprünglich auf dem Chromosom vorhandene DNA-Sequenz sowie das Plasmid aus dem Chromosom zu eliminieren, und
(f) Selektieren eines Bakteriums, bei dem die DNA-Sequenz auf dem Chromosom durch das DNA-Fragment ersetzt ist.

Der Begriff „temperatursensitive Replikations-Kontrollregion", welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf eine Replikations-Kontrollregion, die ein Plasmid autonom replizierbar macht, und eine Mutation hat, welche eine autonome Replikation eines Plasmids erlaubt, welches die Region enthält, aber autonome Replikation des Plasmids bei einer Temperatur unmöglich macht, die höher als diese Temperatur ist. Des Weiteren wird ein Plasmid mit einer temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion als temperatursensitives Plasmid bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues temperatursensitives Plasmid bereit, welches aus coryneformen Bakterien stammt. Da das Plasmid zusammen mit anderen konventionell bekannten Plasmiden in einer coryneformen Bakterienzelle vorhanden sein kann, ist es für die Züchtung von Mikroorganismen, die ein derartiges Plasmid beherbergen usw. nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt das Herstellungsschema des Plasmids pK1 dar.
2 stellt das Herstellungsschema des Plasmids pSFK6 dar.
3 stellt das Herstellungsschema des Plasmids pSFKT1 dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das Plasmid der vorliegenden Erfindung hat eine Replikations-Kontrollregion, welche eine Temperaturempfindlichkeit aufweist, die von pAM330 stammt. pAM330 ist ein Plasmid, das von einem Wildtyp coryneformen Bakterium, Brevibacterium lactofermentum ATCC13689 beherbergt wird, und es kann aus dem Stamm durch ein konventionelles Verfahren zur Isolierung von Plasmiden isoliert werden. Der ATCC13869 Stamm kann von der American Type Culture Collection (Adresse: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) erhalten werden.
Da pAM330 eine Replikations-Kontrollregion hat, die sich von konventionell bekannten Plasmiden unterscheidet, die aus coryneformen Bakterien stammen, wie beispielsweise pHM1519 (K. Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984); Japanische Patentveröffentlichung Offenlegung (Kokai) Nr. 58-192900 ), weist es keine Inkompatibilität mit diesen Plasmiden auf, und daher kann es in coryneformen Bakterien zusammen mit diesen Plasmiden verwendet werden.
Die temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion, die von pAM330 stammt, kann durch Unterwerfen von pAM330 oder einem Plasmid, das von pAM330 stammt, gegenüber einer Mutagenesebehandlung gewonnen werden, und durch das Auswählen eines mutierten Plasmids, welches bei einer niedrigen Temperatur autonom replizierbar ist, aber welches nicht bei einer erhöhten Temperatur innerhalb des Temperaturbereichs, bei dem coryneforme Bakterien wachsen kann, autonom replizierbar ist.
Beispiele für die Mutagenesebehandlung schließen die in vitro-Behandlung mit Hydroxylamin etc. (siehe z. B. G. O. Humpherys et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108 (1976)), Behandlungen von Mikroorganismen, die ein Plasmid behergen mit UV-Bestrahlung, Mutagenen, welche für die gewöhnliche Mutagenesebehandlungen verwendet werden, wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und Salpetersäure usw. ein. Davon sind Verfahren, die eine in vitro-Behandlung verwenden, bevorzugt.
Durch Einschließen eines Markergens, wie beispielsweise eines Antibiotika-Resistenzgens, in ein Plasmid kann die autonome Replikationsfähigkeit des Plasmids, welches einer Mutagenesebehandlung unterworfen worden ist, auf Grundlage eines Phänotyps des Markergens in einer coryneformen Bakterienzelle bestimmt werden. Das heißt, dass wenn eine coryneforme Bakterienzelle, die mit einem derartigen Plasmid transformiert ist, welches einer Mutagenesebehandlung unterworfen worden ist, in einem Kulturmedium kultiviert wird, zu dem das entsprechende Antibiotikum in einer geeigneten Konzentration hinzugegeben worden ist, es beispielsweise in dem Medium wachsen kann, das Plasmid autonom replizierbar ist, und wenn es nicht wachsen kann, dass das Plasmid nicht autonom replizierbar ist.
Beispiele für das Markergen schließen Antibiotikaresistenzgene ein, die aus Bakterien stammen, die zu dem Genus Streptococcus gehören. Spezifisch kann ein Kanamycin-Resistenzgen, Tetracyclin-Resistenzgen und Spectinomycin-Resistenzgen erwähnt werden. Diese Gene können aus kommerziell erhältlichen Vektoren pDG873, pDG1513 und pDG1726 hergestellt werden (Anne-Marie Guerout-Fleury et al., Gene, 167, 335-337 (1995)). Diese Vektoren können aus dem Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Department of Biochemistry (484 West Twelfth Avenue, Columbus, Ohio, 43210, USA) bezogen werden.
Beispielsweise kann ein Kanamycin-Resistenzgen durch die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR, siehe White, T. J. et al., Trends Gent., 5, 185 (1989)) unter Verwendung von pDG873 als Matrize und Primern mit den SEQ ID Nr. 1 und 2 dargestellten Nucleotidsequenzen gewonnen werden.
Um ein Zielgen effizient unter Verwendung des Plasmids der vorliegenden Erfindung in ein Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen, enthalten die coryneformen Bakterien vorzugsweise ein Medikamentenresistenzgen als Markergen, welches eine ausreichende Medikamentenresistenz aufweist, selbst wenn es nur in einer Kopie des Gens in jeder Zelle enthalten ist. Das Kanamycin-Resistenzgen von Streptococcus faecalis weist eine hinreichende Medikamentenresistenz auf, selbst wenn nur eine Kopie davon in jeder Zelle der coryneformen Bakterien vorhanden ist. Genauer gesagt kann erwartet werden, dass ein coryneformes Bakterium, das ein Plasmid der vorliegenden Erfindung beherbergt, in einem Medium wachsen kann, welches mindestens 25 μg/ml Kanamycin unter einer geeigneten Bedingung enthält.
Außerdem enthält das Plasmid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise weiter eine Replikations-Kontrollregion, die eine autonome Replikation des Plasmids in Bakterien ermöglicht, die zum Genus Escherichia gehören. Wenn das erfindungsgemäße Plasmid als Shuttle-Vektor durch Zugabe einer Replikations-Kontrollregion hergestellt wird, welche in Escherichia coli funktioniert, wie oben beschrieben wurde, können benötigte Manipulierungen, wie beispielsweise die Herstellung von Plasmiden und die Herstellung eines rekombinanten Plasmids mit einem Zielgen unter Verwendung von Escherichia coli durchgeführt werden. Außerdem kann ein temperatursensitives Plasmid ebenfalls durch Herstellung von pMM330 oder dessen Derivat in einem Shuttle-Vektor und dann dessen Unterwerfung gegenüber einer Mutagenesebehandlung gewonnen werden.
Beispiele für das Plasmid, welches in Escherichia coli funktionsfähig ist, schließen beispielsweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, PMW118, pMW219, pMW218 usw. ein.
Herstellung von Plasmid-DNA, Verdau und Ligierung von DNA, Transformation, PCR, Entwurf der Oligonucleotide, die als Primer verwendet werden, und ähnliche können durch konventionelle Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, erreicht werden. Diese Verfahren sind beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben, usw.
Als spezifische Beispiele des Plasmids der vorliegenden Erfindung können die temperaturempfindlichen Plasmide erwähnt werden, welche in den unten erwähnten Beispielen gewonnen werden, p48K, pSFKT1, pSFKT2, pSFKT3, pSFKT4, pSFKT5 und pSFKT6. Diese Plasmide sind bei mindestens 25°C autonom replizierbar, aber sie sind bei 37°C in coryneformen Bakterien nicht autonom replizierbar.
p48K hat die Nucleotidsequenz in SEQ ID Nr. 17 der Sequenzliste, welche eine temperatursensitive Replikations-Kontrollregion des Wildtyps enthält, welche eine Mutation einschließt, wobei eine Substitution des T für C an der Nucleotidposition 1255, eine Mutation durch Substitution von T für C an Nucleotidposition 1534, eine Mutation durch Substitution von A für G an der Nucleotidposition 1866, eine Mutation durch Substitution von A für G an der Nucleotidposition 2058, eine Mutation durch Substitution von T für C an der Nucleotidposition 2187 und eine Mutation durch Substitution von A für G an der Nucleotidposition 3193 einschließt. Des Weiteren haben pSFKT1, pSFKT2, pSFKT3, pSFKT4, pSFKT5 und pSFKT6 jeweils die zuvor erwähnten Mutationen in der genannten Reihenfolge. Das erfindungsgemäße Plasmid ist in Anspruch 1 definiert. Die Nucleotidsequenz, welche in SEQ ID Nr. 17 dargestellt ist, enthält ein offenes Leseraster (ORF). Unter den oben erwähnten Mutationen ersetzt die Mutation der Substituierung von T für C an der Nucleotidposition 1534 Prolin an der Position 73 von N-Terminus aus gesehen durch Serin in der Aminosäuresequenz, welche durch den ORF kodiert wird (dargestellt in SEQ ID Nr. 18). Die anderen Nucleotidsubstitutionen verursachen keine Aminosäuresubstitution in der zuvor erwähnten Aminosäuresequenz. Die Plasmide, die eine derartige Nucleotidsequenz enthalten, welche Prolin durch eine andere Aminosäure neben Serin ersetzt, und eine temperaturempfindliche Replikations-Kontrollregion enthalten, welche eine autonome Replikation der Plasmide bei niedriger Temperatur erlaubt, aber keine autonome Replikation bei einer erhöhten Temperatur erlaubt, innerhalb des Temperaturbereichs, in dem coryneforme Bakterien wachsen können, sind ebenfalls vom Schutzbereich des Plasmids der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die temperatursensitive Replikations-Kontrollregion kann aus dem erfindungsgemäßen Plasmid genommen werden und verwendet werden, um einen Vektor für eine Gensubstitution herzustellen. Die Replikations-Kontrollregion enthält Regionen, die für Enzyme kodieren, die an der autonomen Replikation des Plasmids beteiligt sind, und einen Replikations-Ursprung (Ori-Bereich), welcher durch die Enzyme erkannt wird, so dass die Replikation starten kann. Die Replikations-Kontrollregion kann durch Verdauen des Plasmids, mit einem Restriktionsenzym ausgeschnitten werden, welches diese Regionen nicht erkennt, und DNA, die mit der ausgeschnittenen DNA ligiert ist, als Replicon dienen. Das heißt, dass Derivate, die vom Plasmid der vorliegenden Erfindung konstruiert werden können, ebenfalls vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Das erfindungsgemäße Plasmid kann für den Einbau eines DNA-Fragments in ein Chromosom, eine Gensubstitution oder eine Gen-Zerstörung unter Verwendung homologer Rekombination verwendet werden. Beispielsweise kann das Einbauen eines DNA-Fragments in ein Chromosom wie folgt durchgeführt werden. Ein DNA-Fragment, welches eine Sequenz besitzt, die homolog zu einer DNA-Sequenz ist, die auf einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums vorhanden ist, wird mit dem Plasmid der vorliegenden Erfindung ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren, und das coryneforme Bakterium wird mit dem rekombinanten Plasmid transformiert. Eine Transformante wird bei einer niedrigen Temperatur kultiviert, um eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment und der DNA-Sequenz mit einer zu dem DNA-Fragment homologen Sequenz zu verursachen, wobei die Sequenz homolog zum DNA-Fragment ist und auf dem Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhanden ist, und ein Bakterium, bei dem das DNA-Fragment zusammen mit dem Plasmid in das Chromosom eingebaut worden ist, wird ausgewählt.
Wenn das coryneforme Bakterium, das wie oben beschrieben gewonnen wird, kultiviert wird, um eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment zu verursachen, welches in dem Chromosom eingebaut ist, und der DNA-Sequenz, die ursprünglich auf dem Chromosom vorhanden ist, wird die ursprünglich auf dem Chromosom vorhandene DNA-Sequenz aus dem Chromosom mit dem Plasmid ausgeschnitten. Die ausgeschnittene DNA-Sequenz wird aus der bakteriellen Zelle deletiert, wenn das coryneforme Bakterium bei einer erhöhten Temperatur kultiviert wird. Auf diese Weise kann die DNA-Sequenz auf dem Chromosom durch das eingeschleuste DNA-Fragment ersetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung haben die Bedeutungen „niedrige Temperatur" und „erhöhte Temperatur" relative Bedeutungen, und die Grenze zwischen beiden ist nicht besonders beschränkt, sofern sie innerhalb eines Temperaturbereichs liegt, in dem coryneforme Bakterien wachsen können. Coryneforme Bakterien können für gewöhnlich bei 20°C bis 36°C wachsen. Die Grenzen der niedrigen Temperatur und der erhöhten Temperatur liegen innerhalb des Bereichs von beispielsweise 30°C bis 32°C, genauer gesagt bei ungefähr 31°C. Die niedrige Temperatur ist vorzugsweise 10–27°C, mehr bevorzugt 20–25°C. Die erhöhte Temperatur ist vorzugsweise 31–37°C, mehr bevorzugt 31–36°C.
Um die beschriebene, hergestellte rekombinante DNA in das Bakterium einzuschleusen, welches zum Genus Corynebacterium gehört, kann jedes bekannte Transformationsverfahren werden. Beispielsweise ist ein Verfahren zur Behandlung von Empfängerzellen mit Calciumchlorid anwendbar, um die Permeabilität für DNA zu erhöhen, welches für Escherichia coli K-12 beschrieben worden ist (siehe Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)); und ein Verfahren zur Herstellung kompetenter Zellen aus Zellen, die in der Wachstumsphase sind, gefolgt von der Einschleusung der DNA hierein, welches für Bacillus subtilis beschrieben worden ist (siehe Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)). Zusätzlich dazu ist das Verfahren zur Herstellung von DNA-Empfängerzellen in den Protoplasten oder Sphäroblasten verwendbar, welche rekombinante DNAs leicht aufnehmen, gefolgt von der Einschleusung der rekombinanten DNA in die Zellen, was für Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefen bekanntermaßen anwendbar ist (siehe Chang, S. und Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. und Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A.; Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Das Verfahren der Transformation, welches in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist das Elektropulsverfahren (Bezug genommen wird auf die Japanische Patentveröffentlichungs-Offenlegung (Kokai) Nr. 2-207791 ).
Die in der vorliegenden Erfindung genannten „coryneformen Bakterien" schließen Bakterien ein, die bisher in den Genus Brevivacterium klassifiziert worden sind, aber die gegenwärtig im Genus Corynebacterium zusammengefasst werden (Int. J. Syst. Bacteriol. 41, 255 (1981)), und schließen Bakterien ein, die zum Genus Brevibacterium gehören, die nahe Verwandte des Genus Corynebacterium sind. Beispiele solcher coryneformer L-Glutaminsäure-produzierender Bakterien schließen die folgenden ein.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
Brevibacterium ammoniaphilum
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung weiter spezifisch unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt.
<1> Konstruktion eines Vektors, welcher ein Medikamenten-Resistenzgen aus Streptococcus faecalis enthält
Das Kanamycin-Resistenzgen von Streptococcus faecalis wurde mittels PCR aus einem bekannten Plasmid amplifiziert, welches dieses Gen enthält. Die Nucleotidsequenz des Kanamycin-Resistenzgens von Streptococcus faecalis ist bereits aufgeklärt worden (Trieu-Cuot, P. und Courvalin, P., Gene, 23 (3), 331-341 (1983)). Auf Grundlage dieser Sequenz wurden die Primer, die in SEQ ID Nr. 1 und 2 dargestellt sind, synthetisiert, und es wurde eine PCR unter Verwendung von pDG783 (Anne-Marie Guerout-Fleury et al., Gene, 167, 335-337 (1995)) als Matrize durchgeführt, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, welches das Kanamycin-Resistenzgen und dessen Promotor enthält.
Nachdem das zuvor erwähnte DNA-Fragment unter Verwendung von SUPREC02 (Takara Shuzo Co., Ltd.) gereinigt worden war, wurde es vollständig mit den Restriktionsenzymen HindIII und HincII verdaut, und die Enden geglättet. Die Glättung der Enden wurde durch die Verwendung eines Blunting-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) erzielt. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem DNA-Fragment gemischt und ligiert, welches durch Durchführung einer PCR unter Verwendung der Primer, die in SEQ ID Nr. 3 und 4 sowie pHSG399 (siehe S. Takeshita, et al., Gene, 61, 63-73 (1987)) als Matrize gewonnen worden waren, und bei dem das gewonnene Amplifikationsprodukt an den Enden geglättet wurde. Die Ligationsreaktion wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 durchgeführt, welcher von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt wird. Kompetente Zellen von Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit der ligierten DNA transformiert, auf L-Medium ausplattiert (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 7,2), welches 10 μg/ml IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) enthält, 40 μg/ml X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid) und 25 μg/ml Kanamycin, und über Nacht kultiviert. Die auftretenden blauen Kolonien wurden herausgepickt und isolierte Einzelkolonien wurden verwendet, um Transformantenstämme zu gewinnen.
Die Plasmide wurden aus den Transformantenstämmen durch das Alkaliverfahren hergestellt (Text für Bioengineering Experiments, herausgegeben von der Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 105, Baifukan, 1992) und die Restriktionskarten wurden hergestellt. Eines mit einer Restriktionskarte, die äquivalent der in 1 ist, wurde als pK1 bezeichnet. Dieses Plasmid wird stabil in Escherichia coli zurückgehalten und verleiht dem Wirt eine Kanamycinresistenz. Außerdem kann es als Klonierungsvektor passend verwendet werden, da es das lacZ'-Gen enthält.
<2> Konstruktion des Shuttle-Vektors pSFK6
Als Material zum Erhalt eines temperatursensitiven Replikations-Kontrollbereichs wurden ein Plasmidvektor, der sowohl in Escherichia coli-Zellen und coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, hergestellt. Das Plasmid pAM330, das aus Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 exprimiert wurde (siehe Japanische Patentveröffentlichung Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 58-67699 ), wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und die Enden wurden geglättet. Dieses Fragment wurde mit einem Fragment ligiert, welches durch vollständiges Verdauen des zuvor erwähnten pK1 gewonnen wurde, durch das Restriktionsenzym BsaAI. Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 wurde mit der ligierten DNA transformiert. Die Transformation wurde durch das Elektropulsverfahren durchgeführt (siehe Japanische Patentveröffentlichung Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 2-207791 ).
Die Transformanten wurden auf einer M-CM2B-Platte ausgewählt (10 g/l Polypepton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 10 μg/ml Biotin, 15 g/l Agar, pH 7,2), welche 25 μg/ml Kanamycin enthält. Nach einer Kultivierung für zwei Tage wurden Kolonien herausgepickt und einzelne Kolonien abgetrennt, um Transformanten zu gewinnen. Die Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten hergestellt und die Restriktionskarten wurden hergestellt. Eines mit der gleichen Restriktionskarte, die in 2 gezeigt ist, wurde als pSFK6 bezeichnet. Dieses Plasmid ist sowohl in Escherichia coli und coryneformen Bakterien autonom replizierbar und verleiht dem Wirt eine Kanamycinzresistenz.
Da die Primer, die in SEQ ID Nr. 3 und 4 gezeigt sind, welche für die Konstruktion von pK1 verwendet wurden, EcoRV- und StuI-Stellen haben, kann das Kanamycin-Resistenzgen durch Verdau von pSFK6 durch EcoRV und StuI alleine entfernt werden. pSFK6, dem das Kanamycin-Resistenzgen entfernt worden war, wurde sowohl mit pDG1513 und pDG1726 mit einem Tetracyclin-Resistenzgen bzw. Spectinomycin-Resistenzgen, welches aus Bakterien stammt, die zum Genus Streptococcus gehören (Anne-Marie Guerot-Fleury et al., Gene, 167, 335-337 (1995)), welche wiederum mit BamHI und ClaI, ClaI und EcoRI bzw. PstI und BamHI verdaut worden waren, ligiert und die Enden geglättet, um pSFT6 und pSFS6 zu gewinnen. Jedes hiervon verleiht dem Wirt jeweils Tetracyclin-Resistenz oder Spectinomycin-Resistenz.
<3> Konstruktion eines Plasmids mit temperatursensitiver Replikations-Kontrollregion
pSFK6 wurde mit Hydroxylamin in vitro behandelt. Die Hydroxylamin-Behandlung wurde gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt (siehe z. B. G. O. Humperys et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108 (1976)). DNA, die die Behandlung durchlaufen hatte, wurde eingesammelt und für die Transformation von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm verwendet. Die Transformanten wurden bei niedriger Temperatur (25°C) auf einer CM2B-Platte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin selektiert. Die auftretenden Transformanten wurden auf einer ähnlichen Selektionsplatte repliziert und bei einer erhöhten Temperatur (34°C) kultiviert. Ein Stamm, der bei der erhöhten Temperatur nicht auf der Selektionsplatte wachsen konnte, welche Kanamycin enthält, wurde gewonnen. Aus diesem Stamm wurde ein Plasmid gewonnen und als p48K bezeichnet.
<4> Bestimmung der Nucleotidsequenz der temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion
Die Nucleotidsequenzen der Segmente der Replikations-Kontrollregion im Plasmid pSFK6 mit einer Wildtyp-Replikations-Kontrollregion und dem Plasmid p48K mit einer temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion wurden bestimmt. Die Nucleotidsequenzen wurden mit Hilfe eines vollautomatisierten Sequenziergerätes, ABI310 (ABI), bestimmt, indem ein DNA-Sequenzierkit von ABI verwendet wurde. Im Ergebnis wurde herausgefunden, dass es 6 Nucleotidsubstitutionen zwischen der Wildtyp-Replikations-Kontrollregion und der temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion gibt. Die Nucleotidsequenz des Segments der temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion, welche in pSFK6 enthalten ist (vollständige Sequenz stammt aus pAM330), welche in coryneformen Bakterien funktionsfähig ist, ist in SEQ ID Nr. 17 gezeigt, und die Nucleotidsequenz des Segements der temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion, welche in p48K enthalten ist, welches in coryneformen Bakterien funtionsfähig ist, ist in SEQ ID Nr. 19 gezeigt. Des Weiteren sind die Aminosäuresequenzen, die durch die ORFs kodiert werden, die in diesen Nucleotidsequenzen enthalten sind, in SEQ ID Nr. 18 und 20 gezeigt. In der temperatursensitiven Replikations-Kontrollregion ist C an Position 1255 in T mutiert, C an Position 1534 in T, G an Position 1866 in A, G an Position 2058 in A, C an Position 2187 in T und G an Position 3193 in A. Darunter wird nur die Mutation an der Position 1534 durch eine Aminosäuremutation begleitet und verursacht eine Substitution von Serin für Prolin.
<5> Konstruktion von Shuttle-Vektoren mit temperatursensitiver Mutation
Jede der sechs Mutationen von p48K wurde in den Shuttle-Vektor pSFK6 (siehe 3) eingeschleust. Die Einschleusung der Mutationen wurde durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt (Mikaelian, I., Sergeant, A., Nucleic Acids Res., 20, 376 (1992)). Das spezifische Verfahren wird unten erwähnt. Um die Mutation von dem C an Position 1255 in T einzuschleusen, wurde eine PCR unter Verwendung einer Kombination aus den Primern, die in SEQ ID Nr. 5 und 6 gezeigt sind, durchgeführt, und eine Kombination aus den Primern, die in SEQ ID Nr. 7 und 8 gezeigt sind, und pAM330 wurde als Matrize verwendet. Jedes der gewonnenen Amplifikationsprodukte wurde durch Unterwerfen gegenüber einer Agarosegel-Elektrophorese und durch das Einsammeln derselben aus dem Gel gereinigt. Das Einsammeln der DNA-Fragmente aus dem Gel wurde durch EASYTRAP Ver. 2 durchgeführt (Takara Shuzo Co., Ltd.). Die gereinigten DNAs wurden in einem molaren Verhältnis von 1:1 gemischt, und sie wurden als Matrize für eine PCR verwendet, die unter Verwendung der Primer, die in SEQ ID Nr. 15 und 16 gezeigt sind, durchgeführt. Das Amplifikationsprodukt wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym MluI verdaut, und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 3,2 kb zu gewinnen. Gleichermaßen wurde pSFK6 ebenfalls vollständig mit dem Restriktionsenzym MluI verdaut, und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, um ein DNA-Fragment von ungefähr 3,8 kb zu gewinnen. Die gewonnen DNA-Fragmente wurden gemischt und ligiert, und sie wurden verwendet, um kompetente Zellen von Escherichia coli JM109 zu transformieren (Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Zellen wurden auf L-Medium, welches 25 μg/ml Kanamycin enthält, appliziert und über Nacht kultiviert. Die aufgetretenen Kolonien wurden herausgepickt und isolierte Einzelkolonien wurden verwendet, um Transformantenstämme zu gewinnen. Ein Plasmid wurde aus den Transformantenstämmen mit Hilfe des Alkaliverfahrens hergestellt, und die Nucleotidsequenz des Plasmids wurde bestimmt, um zu bestätigen, dass C an Position 1255 in der SEQ ID Nr. 17 gezeigten Sequenz in T mutiert war. Dieses Plasmid wurde als pSFKT1 (3) bezeichnet. Gleichermaßen wurden Plasmide, in die jeweils eine der fünf anderen Arten an Mutationen eingeschleust wurde, pSFKT2, pSFKT3, pSFKT4 pSFKT5 und pSFKT6, durch die Verwendung der Kombination an Primern, die in Tabelle 1 gezeigt sind, gewonnen.
Tabelle 1: Primer, die für die Konstruktion jedes Plasmids verwendet wurden
<6> Bestätigung der Temperatursensitivität des Shuttle-Vektors
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 wurde mit pSFKT2 transformiert, auf eine CM2B-Platte appliziert, die 25 μg/ml Kanamycin enthält, und bei 25°C für zwei Tage kultiviert. Die aufgetretenen Kolonien wurden herausgepickt, und in Einzelkolonien getrennt, und dann in CM2B-Nährlösung inokuliert und danach bei 25°C und 34°C in Abwesenheit von Kanamycin kultiviert. Dann wurde das Plasmid-Rückhalte-Verhältnis nach der Zellteilung über 15 Generationen bestimmt. Im Ergebnis, wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde bestätigt, dass das Plasmid bei 25°C nicht nach der Zellteilung über 15 Generationen deletiert wurde, während das Plasmid bei 34°C nicht beherbergt wird. Tabelle 2: Plasmid-Rückhalte-Verhältnis nach Zellteilung über 15 Generationen

Kulturtemperatur Plasmid-Rückhalte-Verhältnis

25°C 76%

34°C 0,04% oder weniger
SEQUENZLISTE

Claims

Plasmid, das eine temperatursensitive Replikationskontrollregion und ein Markergen enthält, wobei die sensitive Replikationskontrollregion eine codierende Region enthält, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 18 codiert, die eine Mutation enthält, die Prolin an der Aminosäureposition 73 durch eine andere Aminosäure als Prolin austauscht, wobei die temperatursensitive Kontrollregion die autonome Replikation bei einer niedrigen Temperatur ermöglicht, aber eine autonome Replikation bei einer erhöhten Temperatur innerhalb eines Temperaturbereich, in dem coryneforme Bakterien wachsen können, nicht erlaubt.
Plasmid gemäß Anspruch 1, wobei das Markergen ein Antibiotika-Resistenzgen ist, das aus einem Bakterium stammt, das zum Genus Streptococcus gehört.
Plasmid gemäß Anspruch 1 oder 2, welches ferner eine Replikationskontrollregion umfaßt, welche die autonome Replikation des Plasmids in einem Bakterium ermöglicht, das zum Genus Escherichia gehört.
Plasmid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Antibiotika-Resistenzgen, das von einem Bakterium stammt, welches zum Genus Streptococcus gehört, ausgewählt ist aus einem Kanamycin-Resistenzgen, einem Tetracyclin-Resistenzgen und einem Spectinomycin-Resistenzgen.
Verfahren zur Herstellung eines coryneformen Bakteriums, in dem ein DNA-Fragment in dessen Chromosom eingebaut ist, welches die folgenden Schritte umfaßt: a) Einschleusen eines rekombinanten Plasmids, das durch Ligieren eines DNA-Fragments mit einer homologen Sequenz zu einer DNA-Sequenz, die auf einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums vorhanden ist, mit dem Plasmid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 gewonnen wird, in eine coryneforme Bakterienzelle b) Kultivieren des Bakteriums bei einer Temperatur, bei der das Plasmid autonom replizierbar ist, um eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment und der DNA-Sequenz zu verursachen, welche eine Sequenz hat, die homolog zum DNA-Fragment ist, das auf dem Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhanden ist, und c) Auswählen eines Bakteriums, bei dem das DNA-Fragment zusammen mit dem Plasmid in das Chromosom eingebaut ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, welches ferner die folgenden Schritte umfaßt: d) Kultivieren des Bakteriums, um eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment, das in das Chromosom eingebaut ist, und einer DNA-Sequenz, die eine Sequenz hat, die homolog zu dem DNA-Fragment ist und ursprünglich auf dem Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhanden ist, verursacht, e) Kultivieren des Bakteriums bei 31 bis 37°C, um die DNA-Sequenz, die ursprünglich auf dem Chromosom vorhanden ist, und das Plasmid vom Chromosom zu eliminieren, und f) Auswählen eines Bakteriums, bei dem die DNA-Sequenz auf dem Chromosom durch das DNA-Fragment ersetzt ist.