CN103946372B - 用于分泌产生蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明开发一种用于提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力的新技术，提供分泌产生多聚体蛋白质的方法。使用具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达的棒状杆菌型细菌作为表达宿主，分泌生产多聚体蛋白质。

Description

用于分泌产生蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及高效分泌产生异源蛋白质的棒状杆菌型细菌，和用于分泌产生异源蛋白质的方法。具体地，根据本发明分泌产生的异源蛋白质是多聚体蛋白质。
背景技术
关于用微生物分泌产生异源蛋白质，迄今为止已经报道了利用芽孢杆菌属细菌(Bacillusbacterium)(非专利文件1)、甲醇同化酵母(methanol-assimilatingyeast)、巴斯德毕赤酵母(非专利文件2)、曲霉菌属的丝状真菌(非专利文件3和4)等分泌产生异源蛋白质。
也有人尝试用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质。关于用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质，已经有报道用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum，下文也缩写为C.glutamicum)分泌核酸酶和酯酶(专利文件1、非专利文件5)，分泌蛋白质酶如枯草杆菌蛋白质酶(非专利文件6)，利用棒状杆菌型细菌细胞表层蛋白质PS1和PS2(也称作CspB)的信号肽来分泌蛋白质(专利文件2)，使用PS2(CspB)的信号肽来分泌纤连蛋白结合蛋白质(非专利文件7)，利用棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质PS2(CspB)和SlpA(也称作CspA)的信号肽来分泌转谷氨酰胺酶原(protransglutaminase)(专利文件3)，使用变异体型分泌系统分泌蛋白质(专利文件4)，用变异体菌株分泌转谷氨酰胺酶原(专利文件5)，利用Tat依赖性信号肽来分泌蛋白质(专利文件6)等。
有多种蛋白质被考虑作为用来分泌产生的蛋白质。然而，关于用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质，尚未有任何由多个亚单位构成的多聚体蛋白质(例如抗体相关分子)的分泌产生的报道。
金属肽酶是蛋白酶的一类，其需要诸如锌离子和钙离子这样的金属离子来对其进行激活，并具有分解多种类型蛋白质的活性。在这些金属肽酶中，属于M23/M37家族的金属肽酶(也称作M23/M37金属肽酶)是需要锌离子的金属内肽酶。基于序列信息已经知道谷氨酸棒状杆菌的Cgl0858基因是编码包括与M23/M37金属肽酶基序同源的区域的蛋白质的基因。但是，在谷氨酸棒状杆菌中Cgl0858基因编码的蛋白质的功能仍是未知的。另外，没有发现涉及对于任何生物物种，由于高表达编码包含与该M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质的基因会使得目标异源蛋白质的表达量提高。
青霉素结合蛋白质(PBP)是与β-内酰胺型抗生素结合的蛋白质的总称，与β-内酰胺型抗生素的结合抑制它们的酶功能。PBP一般是膜结合蛋白质，它们被认为对细菌细胞壁的合成是必不可少的。PBP根据其分子量分为高分子量PBP(HMW-PBP)和低分子量PBP(LMW-PBP)。其中，HMW-PBP进一步分为A类高分子量PBP(A类HMW-PBP)和B类高分子量PBP(B类HMW-PBP)。A类HMW-PBP具备具有交联肽聚糖部分的转肽酶活性的转肽酶活性域，和具有从二糖从二糖形成多糖链的转糖基酶活性的转糖基酶活性域；而B类HMW-PBP仅具有转肽酶活性域。
关于谷氨酸棒状杆菌的PBP的发现在非专利文件8、9等中有详细描述。在谷氨酸棒状杆菌中，迄今为止至少发现了9种PBP同源物。其中5种是HMW-PBP，包括两种A类HMW-PBP(PBP1a、PBP1b)和三种B类HMW-PBP(FstI、PBP2a、PBP2b)。已知谷氨酸棒状杆菌的A类HMW-PBP是负责细胞伸展的因子，B类HMW-PBP是在细胞分裂时负责形成隔膜壁的肽聚糖的因子。
但是，青霉素结合蛋白和异源蛋白质的分泌产生之间的关系尚不清楚。
现有技术参考文献
专利文件
专利文件1:美国专利No.4,965,197
专利文件2:日本专利特表平6-502548
专利文件3:日本专利4320769
专利文件4:日本专利申请特开平11-169182
专利文件5:日本专利4362651
专利文件6:日本专利4730302
非专利文件
非专利文件1:Microbiol.rev.，57，109-137(1993)
非专利文件2:Biotechnol.，11，905-910(1993)
非专利文件3:Biotechnol.，6，1419-1422(1988)
非专利文件4:Biotechnol.，9，976-981(1991)
非专利文件5:J.Bacteriol.，174，1854-1861(1992)
非专利文件6:Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)
非专利文件7:Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)
非专利文件8:Mol.Microbiol.，66，643-57(2007)
非专利文件9:AntonieVanLeeuwenhoek，94，99-109(2008)
发明内容
本发明要实现的目的
本发明的一个目标是开发一种用于提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力的新技术，由此提供分泌产生多聚体蛋白质的棒状杆菌型细菌，和使用这种细菌分泌产生多聚体蛋白质的方法。
实现目标的手段
本发明人为实现前述目标进行了多方研究，结果他们发现，在利用棒状杆菌型细菌作为表达宿主产生异源蛋白质的方法中，通过修饰棒状杆菌型细菌而增加其编码金属肽酶的基因的表达可以提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力，从而完成了本发明。
即，本发明涉及如下：
1.一种棒状杆菌型细菌，其具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达。
2.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，其中，所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或修饰该基因的表达调控序列而提高的。
3.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中，所述金属肽酶是M23/M37金属肽酶或包含与M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质。
4.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中，所述金属肽酶是下面(A)或(B)中所示的蛋白质：
(A)具有SEQIDNO:4所示的氨基酸的蛋白质，
(B)具有包括1～10个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，并且具有如下性质的蛋白质：当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加。
5.如上所述的棒状杆菌型细菌，其还经过修饰而降低了青霉素结合蛋白的活性。
6.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中降低了细胞表层蛋白的活性。
7.如上所述的棒状杆菌型细菌，其属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。
8.如上所述的棒状杆菌型细菌，其是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
9.如上所述的棒状杆菌型细菌，
其中，所述棒状杆菌型细菌具有用于分泌表达所述多聚体蛋白质的基因构建体，以及
其中，所述基因构建体包括：在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在该启动子序列下游的、编码在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及连接在该编码信号肽的核酸序列下游的、编码所述多聚体蛋白质的核酸序列。
10.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述多聚体蛋白质是抗体相关分子。
11.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述抗体相关分子由选自Fab、F(ab')2、和Fc融合蛋白中的一种或多种蛋白质构成。
12.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中所述多聚体蛋白质是血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)。
13.产生多聚体蛋白质的方法，其包括：
培养根据权利要求1～12中任一项的棒状杆菌型细菌；以及
收集分泌产生的蛋白质。
附图简述
图1显示由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858编码的蛋白质和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物编码的蛋白质的氨基酸序列的比对。
图2是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株和其金属肽酶表达增强菌株中共表达曲妥珠单抗的Fab片段的H链区和L链区的非还原型SDS-PAGE的结果的照片。
图3是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株和其金属肽酶表达增强菌株中表达曲妥珠单抗的F(ab')2片段的Western印迹的结果的照片。
图4是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株、其金属肽酶表达增强菌株以及谷氨酸棒状杆菌YDK010ΔPBP1a菌株的金属肽酶表达增强菌株中共表达曲妥珠单抗的Fab片段的H链区和L链区的非还原型SDS-PAGE的结果的照片。
图5是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株和其金属肽酶表达增强菌株中表达血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)的非还原型SDS-PAGE的结果的照片。
图6是显示在谷氨酸棒状杆菌YDK010ΔPBP1a菌株和其金属肽酶表达增强菌株中表达阿达木单抗(adalimumab)的Fab(H&L)片段的非还原型SDS-PAGE的结果的照片。
图7是显示在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株(野生菌株)和其金属肽酶表达增强菌株中表达曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的非还原型SDS-PAGE的结果的照片。
实施本发明的模式
<1>本发明的棒状杆菌型细菌
本发明提供了一种具有分泌产生多聚体蛋白质的能力的棒状杆菌型细菌，该细菌经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达(下文也称作“本发明的细菌”或“本发明棒状杆菌型细菌”)。
在本发明中，蛋白质被“分泌”的意思是蛋白质被转运出细菌细胞(细胞外转运)。蛋白质被“分泌”当然地包括蛋白质的所有分子最终以完全游离的形式存在于培养基中的情况，也包括蛋白质的所有分子存在于细胞表层中的情况，以及蛋白质的部分分子存在于培养基中，而其余分子存在于细胞表层中的情况。
也就是说，在本发明中，“分泌产生多聚体蛋白质的能力”是指本发明的细菌的如下的能力，即当在培养基中培养该细菌时，它能够将多聚体蛋白质分泌到培养基或细胞表层中，并将其积累到能够从培养基或细胞表层收集该多聚体蛋白质的程度。关于积累量，例如，培养基中的积累量可以优选为10μg/L或更多，更优选为1mg/L或更多，特别优选100mg/L或更多，更进一步优选1g/L或更多。另外，关于积累量，例如，细胞表层中的积累量可以是如下的量，即如果从细胞表层收集多聚体蛋白质并将其悬浮在作为培养基的相同体积的液体中时，悬浮液中多聚体蛋白质的浓度优选地为10μg/L或更多，更优选地1mg/L或更多，特别优选地100mg/L或更多。此外，在本发明中，术语要分泌产生的“蛋白质”是指也包含被称作肽或多肽的概念。
根据本发明要分泌产生的多聚体蛋白质无特别限定，只要其是异源多聚体蛋白质即可。在本发明中，“异源蛋白质”是指对于表达和分泌该蛋白质的棒状杆菌型细菌而言是外源(exogenous)的蛋白质。异源蛋白质可以是，例如，来自微生物的蛋白质，来自植物的蛋白质，来自动物的蛋白质，来自病毒的蛋白质，或者甚至氨基酸序列是人工设计的蛋白质。多聚体蛋白质是指可以作为由两个或多个亚单位构成的多聚体存在的蛋白质。在多聚体中，亚单位可以通过共价键例如二硫键连接，通过非共价键例如氢键和疏水相互作用连接，或者通过共价键与非共价键的组合连接。多聚体优选地包含一个或多个分子间二硫键。多聚体可以是由单一种类的亚单位构成的同多聚体，或者可以是由两种或多种亚单位构成的异多聚体。在多聚体蛋白质是异多聚体的情况下，只要构成异多聚体的亚单位中有至少一个亚单位是异源蛋白质即可。也就是说，可以是所有亚单位都是异源的，或者只有一部分亚单位是异源的。尽管多聚体蛋白质可能天然地是分泌性蛋白质，或者天然地是非分泌性蛋白质，但是优选天然地是分泌性蛋白质。“多聚体蛋白质”的具体实例将在下面提到。
根据本发明要分泌产生的多聚体蛋白质可由单一类型蛋白质构成，或由两种或更多种类型的蛋白质构成。当该多聚体蛋白质是异多聚体时，构成异多聚体的所有亚单位均被分泌产生。
在本发明中，棒状杆菌型细菌是好氧革兰氏阳性杆菌(bacilli)，包括棒状杆菌属细菌、短杆菌属细菌、以及微杆菌属细菌等。棒状杆菌型细菌包括以前被分类为短杆菌属但现在被归并到棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))。棒状杆菌型细菌还包括先前被分类到产氨棒状杆菌但现在通过16SrRNA核苷酸序列分析等被重新归类到Corynebacteriumstationis中的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，60，874-879(2010))。使用棒状杆菌型细菌的优点包括：它们与常规上用于分泌产生蛋白质的真菌、酵母、芽孢杆菌等相比，本身的蛋白质分泌量极少，因此对分泌产生的异源蛋白质的纯化过程有望得到简化或者省略；它们能够在含有糖、氨、无机盐等的简单培养基中良好生长，因此在培养基成本、培养方法、培养生产率等方面是优异的；等等。
这些棒状杆菌型细菌的具体实例包括如下种：
嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)
乙酰谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)
解烷棒状杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)
帚石南棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)
百合棒状杆菌(Corynebacteriumlilium)
栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola)
嗜热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)
力士棒状杆菌(Corynebacteriumherculis)
双歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)
黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)
Brevibacteriumimmariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨酸棒状杆菌)
粉红短杆菌(Brevibacteriumroseum)
解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)
产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)(Corynebacteriumstationis)
白色短杆菌(Brevibacteriumalbum)
多角短杆菌(Brevibacteriumcerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)
这些棒状杆菌型细菌的具体实例包括如下菌株：
嗜醋酸棒状杆菌ATCC13870
醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806
解烷棒状杆菌ATCC21511
帚石南棒状杆菌ATCC15991
谷氨酸棒状杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、ATCC13869、FERMBP-734
百合棒状杆菌ATCC15990
栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965
嗜热产氨棒状杆菌AJ12340(FERMBP-1539)
力士棒状杆菌ATCC13868
双歧短杆菌ATCC14020
黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERMBP-2205)
BrevibacteriumimmariophilumATCC14068
乳酸发酵短杆菌ATCC13869
粉红短杆菌ATCC13825
解糖短杆菌ATCC14066
硫殖短杆菌ATCC19240
产氨短杆菌(Corynebacteriumstationis)ATCC6871、ATCC6872
白色短杆菌ATCC15111
多角短杆菌ATCC15112
嗜氨微杆菌ATCC15354
这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址：12301ParklawnDrive、Rockville、Maryland20852、P.O.Box1549、Manassas、VA20108、UnitedStatesofAmerica)获得。也就是说，针对各个菌株给予登录号，并可以通过使用该登录号订购这些菌株(http://www.atcc.org/)。菌株的登录号在美国典型培养物保藏中心的目录中列出。
特别地，作为抗链霉素(Sm)突变菌株从野生菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13869分离得到的谷氨酸棒状杆菌AJ12036菌株(FERMBP-734)被预测在负责蛋白质分泌的功能基因中具有突变，并显示极高的异源蛋白质分泌产生能力：以最佳培养条件下的蛋白质积累量计，与亲本菌株(野生型菌株)相比高达2-3倍，因此其优选地作为宿主细菌。AJ12036菌株最初于1984年3月26日作为国际保藏保藏在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(现为独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，AISTTsukubaCentral6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，并被给予登录号FERM-BP734。
而且，可以从以如上所述的作为亲本菌株通过使用诱变方法或遗传重组方法的棒状杆菌型细菌中选择蛋白质分泌产生能力增强的菌株，并用作宿主。例如，在利用紫外辐射或化学诱变剂如N-甲基-N'-亚硝基胍处理亲本菌株之后，可以选择蛋白质分泌产生能力增强的菌株。
进一步，如果使用通过修饰上述菌株使其不产生细胞表层蛋白质而获得的菌株作为宿主，则分泌在培养基中的或分泌在细胞表层上的异源蛋白质的纯化将变得容易，因此是特别优选的。这些修饰可以通过利用诱变或遗传重组向细胞表层蛋白质的编码区或其染色体上的表达调控区引入突变来实现。被修饰从而不产生细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌的实例包括谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株(WO2004/029254)，其是谷氨酸棒状杆菌AJ12036菌株(FERMBP-734)的细胞表层蛋白质PS2(CspB)缺陷型菌株。
具有分泌产生多聚体蛋白质的能力的棒状杆菌型细菌可以通过向如上所述的棒状杆菌型细菌中导入用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体，从而使细菌携带该基因构建体来获得。也就是说，本发明的细菌具有用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体。该“用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体”和导入它的方法将在下文进行解释。
本发明的细菌经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达。本发明的细菌可以通过修饰具有分泌产生多聚体蛋白质能力的棒状杆菌型细菌以提高其编码金属肽酶的基因的表达来获得。或者，本发明的细菌可以通过修饰棒状杆菌型细菌而提高其编码金属肽酶的基因的表达，然后赋予其分泌产生多聚体蛋白质的能力来获得。在本发明中，用于构建本发明的细菌的修饰和能力的赋予可以以任意顺序进行。本发明的细菌可以是从如下细菌获得的细菌：该细菌在其经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达之前就可以分泌产生多聚体蛋白质。或者，本发明的细菌可以是从这样的细菌获得的细菌：该细菌在接受修饰而提高编码金属肽酶的基因的表达之前，即使具有用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体也不能分泌产生多聚体蛋白质；但由于接受了提高编码金属肽酶的基因表达的修饰，其变得能够分泌产生多聚体蛋白质。
下文中，将对金属肽酶和其编码基因进行说明。
金属肽酶是蛋白酶的一类，其活化需要诸如锌离子和钙离子这样的金属离子，并具有分解多种多样的蛋白质的活性。在本发明中，该活性也称为金属肽酶活性。虽然本发明中表达被增强的金属肽酶没有特别限制，但金属肽酶优选M23/M37金属肽酶。该M23/M37金属肽酶是需要锌离子的金属内肽酶。M23/M37金属肽酶的具体的例子包括例如，由头状葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)EPK1菌株的ale-1基因编码的蛋白质。
另外，在本发明中其表达被增强的金属肽酶可以包含与如上所述的这种金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质。例如，在本发明中其表达被增强的金属肽酶优选包含与M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质。含有与M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质的具体实例包括，例如：由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858基因编码的蛋白质和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源基因编码的蛋白质。含有与M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质的具体实例还包括例如：由大肠杆菌(E.coli)K12MG1655菌株的nlpD基因编码的蛋白质。
在本发明中其表达被增强的金属肽酶具有如下性质：当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌产生量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加。另外，在本发明中其表达被增强的金属肽酶可以具有或可以不具有金属肽酶活性。
“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加的性质”是指这样的性质：当其表达在棒状杆菌型细菌中提高时，则该棒状杆菌型细菌被赋予如下的能力：与未经修饰的菌株例如野生型菌株或亲本菌株中观察到的相比，分泌产生更大量的多聚体蛋白质。表述“与未经修饰的菌株中观察到的相比，分泌产生更大量的多聚体蛋白质”没有具体限制，只要与未经修饰的菌株中观察到的相比多聚体蛋白质的分泌产生量增加即可，例如，以在培养基和/或细胞表层中积累的量计，与未经修饰的菌株中观察到的相比，分泌产生的多聚体蛋白质的量大优选地10％或更多，更优选20％或更多，特别优选30％或更多，更优选100％或更多。另外，表述“与未经修饰的菌株中观察到的相比，分泌产生更大量的多聚体蛋白质”还可指：当对非修饰菌株的未浓缩培养上清液进行SDS-PAGE并用CBB染色时不能检测到该多聚体蛋白质，但当对经修饰的菌株的未浓缩培养上清液进行SDS-PAGE并用CBB染色时，能够检测到该多聚体蛋白质。
蛋白质是否具有“当其在棒状杆菌型细菌中该蛋白质的表达得到提高时，多聚体蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中观察到的分泌产生量相比增加”的性质，可以如下确定：从属于棒状杆菌型细菌的菌株出发，通过修饰提高该基因的表达来制备菌株，测定当在培养基中培养该经过修饰的菌株时观察到的多聚体蛋白质的分泌产生量，并将该量与当在培养基中培养未经修饰的菌株(未修饰菌株)时多聚体蛋白质的分泌产生量进行比较。作为如上所述的未修饰菌株，例如，可以使用具有用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体的棒状杆菌型细菌。具体来说，作为未修改菌株，例如，可以使用通过将用于分泌表达多聚体蛋白质的基因构建体导入到谷氨酸棒状杆菌AJ12036(FERMBP-734)或谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株中而得到的菌株。
另外，在本发明中，金属肽酶的“当其在棒状杆菌型细菌中该蛋白质的表达得到提高时，多聚体蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中观察到的分泌产生量增加的性质”，具体可以是金属肽酶活性。
蛋白质是否具有金属肽酶活性可以通过检测该活性来确定。金属肽酶活性可以通过本领域已知的方法来检测。具体地，金属肽酶活性可以利用例如金属蛋白酶分析试剂盒(OxfordBiomedicalResearch)等来测定。
头状葡萄球菌(S.capitis)EPK1菌株的ale-1基因以Genbank登录号BAA13069(VERSIONBAA13069.1GI:1890068)登录在NCBI数据库中。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858基因对应于以GenBank登录号BA000036(VERSIONBA000036.3GI:42602314)登录在NCBI数据库中的基因组序列中第916967-917680位序列的互补序列。由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:98所示。另外，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源基因的核苷酸序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
大肠杆菌(E.coli)K12MG1655菌株的nlpD基因对应于以GenBank登录号NC_000913(VERSIONNC_000913.2GI:49175990)登录在NCBI数据库中的基因组序列中的第2865636-2866775位序列的互补序列。大肠杆菌K12MG1655菌株的nlpD基因与ECK2737或JW2712同义。
由于编码金属肽酶的基因的核苷酸序列可能因细菌所述属、种或菌株的不同而改变，所以编码金属肽酶的基因可以是上述核苷酸序列的变异体，只要该基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，则多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加”的性质的蛋白质即可。Cgl0858基因、nlpD基因以及ale-1基因的变异体包括这些基因的同源物。Cgl0858基因、nlpD基因以及ale-1基因的同源物可以通过BLAST检索或FASTA检索，使用前述谷氨酸棒状杆菌的野生型Cgl0858基因、大肠杆菌的野生型nlpD基因或头状葡萄球菌的野生型ale-1基因作为查询序列从公共数据库容易地获得，还可以通过使用属于肠杆菌科的细菌或棒状杆菌型细菌的染色体作为模板，以根据已知基因序列(例如上述的那些)制备的寡核苷酸作为引物进行PCR而获得。
编码金属肽酶的基因可以是编码具有在一个或多个位置上包含一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的前述氨基酸序列的蛋白质的基因，只要该基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加”的性质的蛋白质即可。在这种情况下，与没有导入一个或数个氨基酸残基取代、缺失、插入或添加的蛋白质相比，“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加”的性质通常保持70％或者更多，优选地80％或者更多，更优选地90％或更多。尽管“一个或数个”氨基酸残基的数目可以根据在蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而改变，但具体地，其数目优选地为1-20个，更优选地1-10个，再更优选地1-5个。
前述一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加是保持蛋白质的正常功能的保守突变。保守突变的典型实例是保守取代。保守取代是指如下的突变，其中如果取代位点为芳香族氨基酸，则取代发生于Phe、Trp和Tyr之间；如果其是疏水氨基酸，则发生于Leu、Ile和Val之间；如果其是极性氨基酸，则发生于Gln和Asn之间；如果其是碱性氨基酸，则发生于Lys、Arg和His之间；如果其是酸性氨基酸，则发生于Asp和Glu之间；如果其是具有羟基的氨基酸，则发生于Ser和Thr之间。具体地，视为保守取代的取代实例包括，Ser或Thr取代Ala，Gln、His或Lys取代Arg，Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，Asn、Glu或Gln取代Asp，Ser或Ala取代Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His、Leu、Met、Val或Phe取代Ile，Ile、Met、Val,或Phe取代Leu，Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，Ile、Leu、Val或Phe取代Met，Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，Thr或Ala取代Ser，Ser或Ala取代Thr，Phe或Tyr取代Trp，His、Phe或Trp取代Tyr，和Met、Ile或Leu取代Val。进一步，上述这些氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位等包括由于该基因所由来的细菌的个体差异或物种差异而导致的自然发生的突变(突变异体或变异体)。
进一步，具有上述这些保守突变的基因可以是编码如下蛋白质的基因，该蛋白质与总编码氨基酸序列显示80％或更高，优选地90％或更高，更优选地95％或更高，再更优选地97％或更高，特别优选地99％或更高的同源性，并具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加”的性质。此外，在本专利说明书中，“同源性”可以意味着“同一性”。
而且，编码金属肽酶的基因可以是这样的DNA，其能够在严格条件下与从已知基因序列(例如与上述核苷酸序列的一部分或全部互补的序列)制备的探针相杂交，并编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加”的性质的蛋白质。“严格条件”是指这样的条件，该条件下形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性的杂交体。严格条件的实例包括如下的条件，在该条件下，高度同源的DNA彼此杂交，例如不低于80％同源，优选地不低于90％同源，更优选地不低于95％同源，更加优选地不低于97％同源，特别优选地不低于99％同源的DNA彼此杂交，而同源性低于上述的DNA不会彼此杂交，或者在典型的Southern杂交洗涤条件下，即在对应于1xSSC、0.1％SDS60℃、优选地0.1xSSC、0.1％SDS60℃、更优选地0.1xSSC、0.1％SDS68℃的盐浓度和温度下，清洗1次，优选地2或3次。
如前所述，用于杂交的探针可以是与上述基因互补的序列的一部分。这样的探针可以使用根据已知基因序列制备的寡核苷酸作为引物、以含有该核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR来加以制备。例如，当使用长度为大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的清洗条件可以是，例如50℃、2xSSC和0.1％SDS。
此外，尽管编码金属肽酶的基因可以照原样使用天然存在的基因，但也可以使用其中任意密码子被等价密码子替换的编码金属肽酶的基因。例如，编码金属肽酶的基因可经修饰而具有根据要使用的宿主中的密码子频率的最优密码子。
前述关于基因和蛋白质变异体的记载也可以在经过适当的变化后应用于任意蛋白质，例如本发明的细胞表层蛋白质、青霉素结合蛋白和作为分泌产生的对象的多聚体蛋白质，以及编码它们的基因。
下面将对提高基因的表达的方法进行描述。
在本发明中，短语“基因的表达得到提高”是指与未修饰的菌株(例如野生菌株或亲本菌株)中观察到的表达量相比，目标基因的表达量提高。对于基因的表达量的提高没有具体的限制，只要表达量与未修饰菌株中观察到的相比有所提高即可，但优选提高至未修饰菌株中观察到的表达量的1.5倍或更多，更优选2倍或更多，还更优选3倍或更多。另外，短语“基因的表达得到提高”不仅包括在原本就表达目标基因的菌株中提高目标基因的表达量的情况，还包括在原本不表达该基因的菌株中表达该目标基因的情况。即，短语“基因的表达得到提高”包括例如将目标基因导入到不具有该基因的菌株中，并在该菌株中表达该目标基因的情况。
可以通过例如增加基因的拷贝数来提高基因的表达。
可以通过将基因导入宿主微生物的染色体中来增加目标基因的拷贝数。可以通过如下方法将基因导入到染色体中：使用转座子或Mini-Mu随机将基因导入染色体的方法(日本专利申请特开平2-109985、US5,882,888、EP805867B1)；或通过使用在染色体DNA上以多拷贝数存在的序列作为目标的同源重组的方法。作为在染色体DNA上以多拷贝数存在的序列，可以使用重复DNA、位于转座子两个末端的反向重复序列。或者，可以通过使用Red驱动整合方法(Reddrivenintegrationmethod)(WO2005/010175)将基因导入到染色体中。另外，可以通过使用噬菌体的转导或通过使用接合转移载体将基因导入到染色体中。进一步，如WO03/040373所述，可以将对于异源蛋白质的产生而言不是必须的基因作为靶标来导入基因。可以通过上述这些方法将基因的一个或多个拷贝导入到目标序列中。
目标基因向染色体中的导入可以如下来确定：使用具有与该基因的全部或部分互补的序列的探针通过Southern杂交；使用基于该基因的序列制备的引物的PCR等。
另外，还可以通过向宿主细菌中导入含有该基因的载体来增加目标基因的拷贝数。例如，可以通过将包含该目标基因的DNA片段与在宿主细菌中发挥作用的载体连接以构建该基因的表达载体，并用该表达载体转化宿主细菌，来增加该目标基因的拷贝数。作为载体，可以使用在宿主细菌的细胞中可自动复制的载体。该载体优选为多拷贝载体。另外，为了选择转化子，该载体优选包括标记物，例如抗生素抗性基因。载体可以是，例如，来自细菌质粒的载体，来自酵母质粒的载体，来自噬菌体的载体，粘粒，噬菌粒等。作为载体，例如，来自棒状杆菌型细菌的质粒是优选的。能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的载体的具体实例包括pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))；通过改良它们获得的、具有药物抗性基因的质粒；日本专利申请特开平3-210184中描述的质粒pCRY30；日本专利申请特开平2-72876和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和pCRY3KX；日本专利申请特开平1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；日本专利申请特开昭58-67679中描述的质粒pAM330；日本专利申请特开昭58-77895中描述的质粒pHM1519；日本专利申请特开昭58-192900中描述的质粒pAJ655、pAJ611、和pAJ1844；日本专利申请特开昭57-134500中描述的pCG1；日本专利申请特开昭58-35197中描述的pCG2；日本专利申请特开昭57-183799中描述的pCG4和pCG11；日本专利申请特开平10-215883中描述的pVK7；日本专利申请特开平9-070291中描述的pVC7；等等。
进一步，可以通过改善基因的转录效率来提高基因的表达。例如可以通过将染色体上的基因的启动子替换为更强的启动子来改善基因的转录效率。“更强的启动子”是指与天然存在的野生型启动子相比提供改善了的基因的转录的启动子。作为更强的启动子，可以使用例如已知的高表达启动子，诸如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子和PL启动子。另外，作为更强的启动子，也可以利用多种报告基因来获得现有启动子的高活性型。例如，通过使启动子区的-35和-10区接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际专利公开WO00/18935)。用于评估启动子强度的方法以及强启动子实例在Goldstein等的论文(Prokaryoticpromotersinbiotechnology、Biotechnol.Annu.Rev.、1、105-128(1995))等中有描述。
另外，可以通过改善基因的翻译效率来提高基因的表达。可以通过例如将染色体上的基因的Shine-Dargarno(SD)序列(也称作核糖体结合位点(RBS))替换为更强的SD序列来改善基因的翻译效率。“更强的SD序列”是指与原始存在的野生型SD序列相比提供更高的mRNA翻译的SD序列。更强的SD序列的实例包括，例如来自噬菌体T7的基因10的RBS(OlinsP.O.etal,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子之间的间隔区域中，特别是在起始密码子直接上游的序列(5'-UTR)内取代、插入或缺失数个核苷酸，会大大影响mRNA的稳定性和mRNA的翻译效率，因此可以对该序列进行修饰来提高记忆的翻译效率。
在本发明中，影响基因表达的位点，例如启动子、SD序列、RBS和启示密码子之间的间隔区域也统称为“表达控制区域”。可以通过使用启动子搜寻载体或基因分析软件(例如GENETYX)来确定表达控制序列。例如可以通过使用温度敏感载体的方法或Red驱动整合方法(WO2005/010175)来修饰这样的表达控制区域。
另外，还可以通过增强增加基因表达的调节物、或删除或减弱降低基因表达的调节物来增加目标基因的表达。
上述这些提高基因的表达的方法可以单独使用或以任意组合使用。
对于转化的方法没有具体地限定，可以使用常规的方法。可以使用例如如下方法：针对大肠杆菌K-12菌株报道的、利用氯化钙来处理感受态细胞以增加其对DNA的渗透性的方法(Mandel,M.和Higa,A.,J.Mol.Biol.,1970,53,159-162)；针对枯草芽孢杆菌报道的、利用处于生长期的细胞制备感受态细胞，随后用DNA转化的方法(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.E.,Gene,1977,1:153-167)。或者，还可以使用如下方法：如已知可用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母的，使DNA受体细胞变成可容易吸收重组DNA的原生质体或原生质球，并然后将重组DNA导入受体细胞的方法(Chang,S.和Choen,S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.,168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.和Hopwood,O.A.,1978,Nature,274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.和Fink,G.R.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933)。另外，可以通过电脉冲方法来转化棒状杆菌型细菌(日本专利申请特开平2-207791)。
目标基因表达的提高可以通过例如确认由该基因表达的目标蛋白质的活性来确认。目标蛋白质的活性的增加可以通过检测蛋白质的活性来确认。蛋白质的活性优选增加至未修饰菌株中观察到的蛋白质活性的1.5倍或更多，更优选2倍或更多，还更优选3倍或更多。可以通过本领域技术人员已知的方法来检测金属肽酶的活性。具体地，可以使用例如金属蛋白酶分析试剂盒(OxfordBiomedicalResearch)等来检测金属肽酶活性。
可以通过确认基因的转录量的提高，或通过确认由该基因表达的目标蛋白质的量的提高，来确认目标基因表达的提高。
目标基因转录量的提高可以通过比较由该基因转录的mRNA的量与未修饰菌株(诸如野生菌株或亲本菌株)的该基因转录的mRNA的量来确认。评价mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Sambrook,J.等，MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition,ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。mRNA的量优选增加至例如未修饰菌株的mRNA量的1.5倍或更多，2倍或更多，或3倍或更多。
目标蛋白质量的提高可以通过使用抗体的Western印迹来确认(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。蛋白质的量优选提高至未修饰菌株的蛋白质量的例如1.5倍或更多，2倍或更多，或3倍或更多。
本发明的细菌还具有改善异源蛋白质分泌产生能力的性质。例如，本发明的细菌修饰而降低了青霉素结合蛋白的活性。另外，本发明的细菌可以是例如其中细胞表层蛋白的活性已被降低的细菌。
下面，将对青霉素结合蛋白和其编码基因进行说明。
一般地，青霉素结合蛋白质(PBP)是指这样的蛋白质，其与β-内酰胺型抗生素结合，其酶功能通过与β-内酰胺型抗生素结合而被抑制。青霉素结合蛋白质包括高分子量PBP(HMW-PBP)和低分子量PBP(LMW-PBP)。高分子量PBP包括A类高分子量PBP(A类HMW-PBP)和B类高分子量PBP(B类HMW-PBP)。A类HMW-PBP具有一个转肽酶活性域，该活性域具有对构成细胞壁的肽聚糖部分形成交联的转肽酶活性；和一个转糖基酶活性域，该活性域具有从二糖形成多糖链的转糖基酶活性。B类HMW-PBP具有一个转肽酶活性域。例如，对于谷氨酸棒状杆菌，PBP1a和PBP1b可以认为是A类HMW-PBP。对于谷氨酸棒状杆菌，FtsI、PBP2a和PBP2b可以认为是B类HMW-PBP。
在本发明中，当青霉素结合蛋白质的活性被降低时，具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质的青霉素结合蛋白质的活性被降低。关于这样的青霉素结合蛋白质，例如，选自PBP1a、B类HMW-PBP和LMW-PBP者是优选的，选自PBP1a和B类HMW-PBP者是更优选的，PBP1a是特别优选的。
“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加的性质”是指如下的性质，如果该蛋白质的活性在棒状杆菌型细菌中被降低，则该棒状杆菌型细菌被赋予如下的能力：与未修饰的菌株例如野生型菌株或亲本菌株中观察到的分泌产生量相比，分泌产生更大量的异源蛋白质。表述“与未修饰的菌株中观察到的分泌产生量相比分泌产生更大量的异源蛋白质”没有特别限制，只要分泌产生的异源蛋白质的量比未修饰菌株的量更大即可，例如，以在培养基和/或细胞表层中积累的量计，分泌产生的异源蛋白质的量比未修饰的菌株中观察到的量大优选地10％或者更多，更优选地20％或更多，特别优选地30％或更多，进一步优选地100％或更多。此外，“分泌产生的异源蛋白质的量比在未修饰的菌株中观察到的量更大”可以表示：当对未修饰的菌株的未浓缩培养上清液进行SDS-PAGE并用CBB染色时，不能检测到异源蛋白质，而当对经过修饰的菌株的未浓缩培养液上清进行SDS-PAGE并用CBB染色时，则能够检测到异源蛋白质。
蛋白质是否具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质，可以通过如下方法进行确认：从属于棒状杆菌型细菌的菌株出发，通过修饰降低该基因的表达来制备菌株，测定当在培养基中培养该经过修饰的菌株时观察到的异源蛋白质的分泌产生量，并将该量与当在培养基中培养未修饰的菌株(未修饰菌株)时异源蛋白质的分泌产生量进行比较。
编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032PBP1a蛋白质的Cgl0278基因对应于以GenBank登录号BA000036(VERSIONBA000036.3GI:42602314)登录于NCBI数据库中的基因组序列中第294001-296388位序列的互补序列。另外，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的PBP1a蛋白质的GenBank登录号为NP_599531(versionNP_599531.1GI:19551529，locus_tag＝"NCgl0274")。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Cgl0278基因的核苷酸序列和由该基因编码的PBP1a蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:99和100所示。
由于编码青霉素结合蛋白质的基因的核苷酸序列可以因棒状杆菌型细菌所属的种和菌株的不同而改变，所以编码青霉素结合蛋白质的基因可以是前述核苷酸序列的变异体，只要该基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质的蛋白质即可。例如，编码青霉素结合蛋白质的基因可以是编码具有在一个或多个位置上包含一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的前述氨基酸序列的蛋白质的基因，只要该基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质的蛋白质即可。上述涉及金属肽酶的变异体和其编码基因的描述可以通过适当的变化后用于青霉素结合蛋白的变异体和其编码基因。
下面，将对细胞表层蛋白和其编码基因进行说明。
细胞表层蛋白质是构成细菌和古细菌的细胞表层(S-层)的蛋白质。棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的实例包括谷氨酸棒状杆菌的PS1和PS2(也称作CspB)和谷氨酸棒状杆菌的SlpA(也称作CspA)。在它们之中，优选PS2的活性降低。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13869cspB基因的核苷酸序列和由该基因编码的PS2蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:114和115所示。
另外，例如，关于28种谷氨酸棒状杆菌菌株的CspB同源物的氨基酸序列已有报道(JBiotechnol.、112、177-193(2004))。下面列出这28种谷氨酸棒状杆菌菌株和这些cspB基因同源物在NCBI数据库中的GenBank登录号(GenBank登录号在括号中显示)。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13058(AY524990)
谷氨酸棒状杆菌ATCC13744(AY524991)
谷氨酸棒状杆菌ATCC13745(AY524992)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14017(AY524993)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14020(AY525009)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14067(AY524994)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14068(AY525010)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14747(AY525011)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14751(AY524995)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14752(AY524996)
谷氨酸棒状杆菌ATCC14915(AY524997)
谷氨酸棒状杆菌ATCC15243(AY524998)
谷氨酸棒状杆菌ATCC15354(AY524999)
谷氨酸棒状杆菌ATCC17965(AY525000)
谷氨酸棒状杆菌ATCC17966(AY525001)
谷氨酸棒状杆菌ATCC19223(AY525002)
谷氨酸棒状杆菌ATCC19240(AY525012)
谷氨酸棒状杆菌ATCC21341(AY525003)
谷氨酸棒状杆菌ATCC21645(AY525004)
谷氨酸棒状杆菌ATCC31808(AY525013)
谷氨酸棒状杆菌ATCC31830(AY525007)
谷氨酸棒状杆菌ATCC31832(AY525008)
谷氨酸棒状杆菌LP-6(AY525014)
谷氨酸棒状杆菌DSM20137(AY525015)
谷氨酸棒状杆菌DSM20598(AY525016)
谷氨酸棒状杆菌DSM46307(AY525017)
谷氨酸棒状杆菌22220(AY525005)
谷氨酸棒状杆菌22243(AY525006)
因为编码细胞表层蛋白质的基因的核苷酸序列可能会随着棒状杆菌型细菌所属的种或菌株的不同而变化，所以编码细胞表层蛋白质的基因可以是前述核苷酸序列的变异体，只要基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质的蛋白质即可。例如，编码细胞表层蛋白质的基因可以是编码具有在一个或数个位置上包含一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质的基因，只要基因编码具有“当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的活性被降低时，异源蛋白质的分泌产生量相比于未修饰的菌株中所见的分泌产生量增加”的性质的蛋白质即可。前述关于金属肽酶和其编码基因的解释也可以在经过适当的变化后应用于细胞表层蛋白质及其编码基因。
在本发明中，表述“细胞表层蛋白质的活性被降低”包括棒状杆菌型细菌已经过修饰从而降低了细胞表层蛋白质的活性的情况，以及在棒状杆菌型细菌中细胞表层蛋白质的活性固有地已被降低的情况。“在棒状杆菌型细菌中细胞表层蛋白质的活性固有地已被降低的情况”包括棒状杆菌型细菌固有地缺少细胞表层蛋白质的情况。也就是说，细胞表层蛋白质活性被降低的棒状杆菌型细菌的实例包括固有地缺少细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌。“棒状杆菌型细菌固有地缺少细胞表层蛋白质的情况”的例子包括棒状杆菌型细菌固有地缺少编码细胞表层蛋白质的基因的情况。表述“棒状杆菌型细菌固有地缺少细胞表层蛋白质”可以表示该棒状杆菌型细菌固有地缺少一种或多种选自在该棒状杆菌型细菌所属的种的其它菌株中发现的细胞表层蛋白质的蛋白质。例如，“谷氨酸棒状杆菌固有地缺少细胞表层蛋白质”可以表示该谷氨酸棒状杆菌菌株固有地缺少一种或多种选自在其它谷氨酸棒状杆菌菌株中发现的细胞表层蛋白质的蛋白质，即，例如，缺少PS1和/或PS2(CspB)。固有地缺少细胞表层蛋白质的棒状杆菌型细菌的实例包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其本身是cspB基因缺陷型的。
下文中，将对降低蛋白质活性的方法进行说明。
表述“蛋白质活性被降低”意味着，与未修饰的菌株例如野生型菌株和亲本菌株相比目标蛋白质的活性降低，包括活性完全消失的情况。具体地，表述“蛋白质活性被降低”意味着，与未修饰的菌株相比，每个细胞的蛋白质的分子数减少和/或每个蛋白质分子的功能降低。也就是说，关于表述“蛋白质的活性被降低”，术语“活性”可以表示编码该蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或该蛋白质的量，以及蛋白质的催化活性。此外，“每个细胞的蛋白质的分子数减少”的情况包括蛋白质根本不存在的情况。进一步，“每个蛋白质分子的功能降低”的情况包括每个蛋白质分子的功能完全消失的情况。
降低蛋白质活性的修饰可以通过，例如，减少蛋白质编码基因的表达来实现。“减少基因表达”也称作“弱化基因表达”。减少基因表达可以通过，例如，降低转录效率、降低翻译效率、或其组合来实现。基因表达的减少可以通过修饰基因的表达调控序列，例如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列，来实现。当修饰表达调控序列时，优选修饰表达调控序列的一个或更多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。而且，可以缺失表达调控序列的一部分或全部。减少基因表达还可以通过例如操纵负责表达调控的因子来实现。负责表达调控的因子的实例包括，负责转录或翻译控制的小分子(诱导剂、抑制剂等)、负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等)等。
降低蛋白质活性的修饰还可以通过例如破坏蛋白质编码基因加以实现。基因的破坏可以通过例如缺失染色体上该基因的编码区的一部分或全部来实现。而且，可以缺失包括染色体上基因的上游和下游序列在内的整个基因。要缺失的区域可以是任何区域，例如N-端区域、内部区域、或C端区域，只要能实现蛋白质活性的降低即可。缺失区域越长通常能够越切实地使基因失活。而且，优选地，要缺失区域的上游和下游序列的阅读框不同。
基因的破坏还可以通过例如引入氨基酸取代的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)、向染色体上基因的编码区添加或缺失一个或多个核苷酸的移框突变，或类似方法(JournalofBiologicalChemistry、272:8611-8617(1997)；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences、USA、955511-5515(1998)；JournalofBiologicalChemistry、26116、20833-20839(1991))来实现。
基因的破坏还可以通过例如在染色体上的基因编码区中插入其他序列加以实现。插入的位点可以是基因的任何区域，并且插入的区域越长通常能越切实地使基因失活。优选地，插入位点上游和下游序列的阅读框是不同的。所述的其他序列并没有特殊限制，只要选用可以降低或消除所述编码蛋白质的活性的序列即可，实例包括，例如，标记基因如抗生素抗性基因、对产生异源蛋白质有用的基因，等。
如上所述的对染色体上基因的修饰可以通过例如如下的方法实现：制备缺陷型基因，其中基因的部分序列被缺失，从而使它不能产生正常发挥功能的蛋白质，用含有该缺陷型基因的重组DNA转化细菌，使缺陷型基因和染色体上基因之间发生同源重组，从而以该缺陷型基因取代染色体上的基因。在这种情况下，若在重组DNA中包含根据宿主特征(如营养缺陷型)选择的标记基因，则操作会变得容易。由缺陷型基因编码的蛋白质即使被产生，也具有与野生型蛋白质不同的构象，因此其功能被降低或消除。这种基于利用同源重组的基因取代的基因破坏已经确立，并且有称作“Red驱动整合”的方法(Datsenko、K.A、andWanner、B.L.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97:6640-6645(2000))，使用线性DNA的方法，例如利用Red驱动整合法与来自λ噬菌体的切出系统的组合的方法(Cho、E.H.、Gumport、R.I.、Gardner、J.F.、J.Bacteriol.、184:5200-5203(2002))，使用含有温度敏感型复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中发挥功能的起点原点的自杀载体的方法(美国专利No.6,303,383、日本专利申请特开平5-007491)，等。
为了降低蛋白质活性的修饰还可以通过例如诱变处理来实现。诱变处理的实例包括通常的诱变处理，例如X-射线照射或紫外辐射，和使用诱变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、和甲磺酸甲酯(MMS)的诱变处理。
目标蛋白质活性的降低可以通过测量蛋白质的活性进行确认。在青霉素结合蛋白质的情况下，蛋白质活性是否已降低可以通过，例如，测量转肽酶活性和/或转糖基酶活性进行确认，依该蛋白质所属的类型而定。转肽酶和/或转糖基酶活性可以通过例如本领域技术人员众所周知的方法进行测量。具体地，例如，PBP1a的转肽酶和转糖基酶活性可以通过测量脂质II寡聚化为聚糖链并形成肽交联的反应来测量(BornP，etal.，JBiolChem.2006Sep15；281(37):26985-93)。具体地，蛋白质的活性降低到例如在未经修饰菌株中观察到的活性的50％或更低，优选地20％或更低，更优选地10％或更低，再更优选地5％或更低，或者特别优选地0％。具体地，蛋白质的活性降低到例如在未经修饰菌株中观察到的活性的50％或更低，优选地20％或更低，更优选地10％或更低，再更优选地5％或更低，或者特别优选地0％。
目标基因表达的降低可以通过确认基因转录量的减少或从基因表达的目标蛋白质量的减少来确认。
目标基因转录量的减少可以通过将由基因转录的mRNA量与在未修饰的菌株中观察到的进行比较来确认。用于测量mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(MolecularCloning，ColdspringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(USA)，2001)。mRNA的量优选地降低到未经修饰菌株中所观察量的50％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。
目标蛋白质量的降低可以通过Western印迹使用结合该蛋白质的抗体进行确认(MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(USA)2001)。蛋白质的量优选地降低到，例如，未经修饰菌株中所观察到的量的50％或更低，20％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％。
取决于用于破坏的手段，目标基因的破坏可以通过确定基因的部分或全部的碱基序列、限制酶图谱、全长等来确定。
上述用于降低蛋白质活性的方法，除了用于降低青霉素结合蛋白质的活性和降低细胞表层蛋白质的活性之外，还可以在经过适当的变化后应用于任何蛋白质和其编码基因。
下面，将对“用于表达多聚体蛋白质的基因构建体”和其导入方法进行说明。该基因构建体也称作“用于本发明的基因构建体”。
已知，分泌蛋白质一般被翻译为前蛋白质(也称作前肽)或前原蛋白质(也称作前原肽)，然后通过加工成为成熟蛋白质。具体地，分泌蛋白质一般被翻译为前蛋白质或前原蛋白质，然后由蛋白酶(一般称作信号肽酶)切除作为前部分(pre-part)的信号肽，由此分泌蛋白质转变为成熟蛋白质或原蛋白质。至于原蛋白质，其原部分被蛋白酶进一步切割，从而原蛋白质变为成熟蛋白质。因此，在本发明的方法中，优选使用信号肽用于分泌产生多聚体蛋白质。在本发明中，分泌蛋白质的前蛋白质和前原蛋白质可以总称为“分泌蛋白质前体”。在本发明中，“信号肽”(也称作“信号序列”)是指存在于分泌蛋白质前体N-端，并且通常不存在于天然的成熟蛋白质内的氨基酸序列。
尽管用于本发明的基因构建体并没有特殊限制，只要可以实现多聚体蛋白质的分泌产生即可，但是其优选地包含：在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在该启动子序列的下游的、编码在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，和连接在该编码信号肽的核酸序列的下游的、编码多聚体蛋白质的核酸序列。编码信号肽的核酸序列可以连接在启动子序列的下游，使得信号肽在该启动子的控制下表达。编码多聚体蛋白质的核酸序列可以被连接在编码信号肽的核酸序列的下游，使得该多聚体蛋白质被表达为与该信号肽的融合蛋白质。用于本发明的基因构建体还可以包含用于在棒状杆菌型细菌中高效表达多聚体蛋白质基因的调控序列(操纵基因、终止子等)，所述调控序列处于发挥功能的合适位置。
本发明所用的启动子并没有特殊限制，只要选择能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子即可，它可以是源自棒状杆菌型细菌的启动子或异源启动子。“在棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子”是指在棒状杆菌型细菌中显示启动子活性的启动子。异源启动子的具体实例包括，例如，来自大肠杆菌的启动子例如tac启动子、lac启动子、trp启动子、和araBAD启动子。它们之中，强启动子如tac启动子是优选的，可诱导的启动子如araBAD启动子也是优选的。
来自棒状杆菌型细菌的启动子的实例包括，例如，编码细胞表层蛋白质PS1、PS2(也称作CspB)和SlpA(也称作CspA)的基因启动子，和各种氨基酸生物合成系统基因的启动子。各种氨基酸生物合成系统基因的启动子的具体实例包括，例如下述基因的启动子：谷氨酸生物合成系统的谷氨酸脱氢酶基因，谷氨酰胺合成系统的谷氨酰胺合成酶基因，赖氨酸生物合成系统的天冬氨酸激酶基因，苏氨酸生物合成系统的高丝氨酸脱氢酶基因，异亮氨酸和缬氨酸生物合成系统的乙酰羟酸合酶基因，亮氨酸生物合成系统的2-异丙基苹果酸合成酶基因，脯氨酸和精氨酸生物合成系统的谷氨酸激酶基因，组氨酸生物合成系统的磷酸核糖基-ATP焦磷酸化酶基因，芳香族氨基酸生物合成系统(如色氨酸、酪氨酸、和苯丙氨酸的生物合成系统)的脱氧阿糖庚酮醛酸磷酸(DAHP)合成酶基因，核酸生物合成系统如肌苷酸和鸟苷酸的磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)酰基转移酶基因，肌苷酸脱氢酶基因，和鸟苷酸合成酶基因。
关于启动子，可以利用各种报告基因获得现有启动子的高活性型并加以使用。例如，通过使启动子区的-35和-10区接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际专利公开WO00/18935)。用于评估启动子强度的方法以及强启动子实例在Goldstein等的论文(Prokaryoticpromotersinbiotechnology，Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128(1995))等中有描述。进一步，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区域中，特别是在起始密码子直接上游的序列(5'-UTR)内取代、插入或缺失数个核苷酸，会显著影响mRNA的稳定性和mRNA的翻译效率，并可以对该序列进行修饰。
本发明所用的信号肽没有特殊限制，只要选择能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽即可，并且它可以是来自棒状杆菌型细菌的信号肽或者是异源信号肽。“能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽”是指如下的肽，当其被连接在目标蛋白质的N端时，允许棒状杆菌型细菌分泌该蛋白质。信号肽优选地是作为宿主的棒状杆菌型细菌的分泌性蛋白质的信号肽，更优选地是棒状杆菌型细菌细胞表层蛋白质的信号肽。棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质的实例包括源自谷氨酸棒状杆菌的PS1和PS2(CspB)(日本专利申请特表平6-502548)和来自产氨棒状杆菌(C.stationis)的SlpA(CspA)(日本专利申请特开平10-108675)。PS1信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:101所示，PS2(CspB)信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:102所示，SlpA(CspA)信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:103所示。而且，美国专利No.4,965,197描述了存在来自棒状杆菌型细菌DNA酶的信号肽，这些信号肽也可以用于本发明。
尽管信号肽在生物物种间具有某些相同的序列特征，但是在某些生物物种中显示分泌功能的信号肽并不一定在另一生物物种中显示分泌功能。因此，当使用异源信号肽时，可以合适地选择能够在棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽。某个信号肽是否在棒状杆菌型细菌中发挥功能可以通过，例如，将目标蛋白质和该信号肽表达成融合蛋白质，并确认该蛋白质是否被分泌来予以确认。
信号肽可以包括该信号肽来源的分泌蛋白质的部分N-端氨基酸序列。当翻译产物被分泌出细胞时，信号序列一般被信号肽酶切掉。作为信号肽的编码基因，尽管天然出现的基因可以按原样使用，但也可以对其进行修饰，从而使其具有适应所用宿主的密码子使用频率的最优密码子。
通过本发明方法分泌产生的多聚体蛋白质的实例包括，例如，生理活性蛋白质、受体蛋白质、用作疫苗的抗原蛋白质、和为多聚体蛋白质的酶。生理活性蛋白质的实例包括例如生长因子、激素、细胞因子和抗体相关分子。
抗体相关分子是指这样的蛋白质，其包含由单个域或两个或多个域的组合构成的分子种类，所述域是从构成完整抗体的域中选择的。所述的构成完整抗体的域的实例包括重链的域VH、CH1、CH2、和CH3；和轻链的域VL和CL。抗体相关分子可以是单体蛋白质或多聚体蛋白质，只要其包含上述分子种类即可。在抗体相关分子是多聚体蛋白质的情况下，抗体相关分子可以是由单一一种亚单位构成的同多聚体，或者是由两种或多种亚单位构成的异源多聚体。抗体相关分子的具体实例包括，例如，完整抗体、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fc、由重链(H链)和轻链(L链)构成的二聚体、Fc-融合蛋白质、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键连接的Fv(sdFv)和双抗体。
是多聚体蛋白质的抗体相关分子的实例包括，例如完整抗体、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fc、由重链(H链)和轻链(L链)构成的二聚体、Fc-融合蛋白质、sc(Fv)2、和二价抗体。在它们之中，Fab、F(ab')2、和Fc-融合蛋白质是优选的。
Fab(片段，抗体结合)是完整抗体的除H链Fc区之外的部分，它是一种仅由抗原结合区构成的抗体片段。Fab是由一个分子的H链Fab部分和一个分子的L链构成的二聚体，它们通过C端的二硫键连接。相对于是H2L2四聚体，并具有大约150kDa的巨大分子量的完整抗体，Fab的分子量更小，大约50kDa，因此Fab被认为对目标组织具有优秀的渗透性。因为Fab不具有Fc区，所以它既没有补体活性，也没有结晶能力，但是因为它具有抗原结合能力，所以它主要用于中和抗原的目的。在抗体药物中，Fab在近些年引人关注。
F(ab')是完整抗体除Fc'区和H链之外的部分。F(ab')是由H链F(ab')部分的一个分子和L链的一个分子构成的二聚体，它们通过C端的二硫键连接。F(ab')中H链的剩余部分比Fab中H链的剩余部分更长，因此在F(ab')中，保留了连接H链的二硫键部分。因此，F(ab')的两个分子能够通过二硫键形成F(ab')2。F(ab')和F(ab')2也可以用作抗体药物，与Fab片段相似。
Fc(片段，可结晶)是仅由Fc区构成的抗体片段，Fc区对补体活性或结晶能力负责。由H链的Fc区与另一种功能蛋白质融合而构成的蛋白质称作Fc-融合蛋白质。
是多聚体蛋白质的生长因子的具体实例包括例如，血管内皮生长因子(VEGF)。
是多聚体蛋白质的激素的具体实例包括例如，胰岛素。
为多聚体蛋白质的细胞因子的具体实例包括例如，白细胞介素5、干扰素γ、以及肿瘤坏死因子(TNFs)。
生长因子、激素和细胞因子可以彼此没有严格区分。例如，生理学活性蛋白质可以是属于从生长因子、激素和细胞因子中选出的单一类群的蛋白质，或者可以是属于从上面选出的多个类群的蛋白质。
受体蛋白质没有特殊限制，只要它们是多聚体蛋白质即可。受体蛋白质可以是，例如，任何生理学活性蛋白质和其它生理学活性物质的受体蛋白质。其它生理学活性物质的实例包括，例如，神经递质，例如多巴胺。进一步，受体蛋白质还可以是相关配体尚不知的孤儿受体。
可用作疫苗的抗原蛋白质没有特殊的限制，只要它是能够诱发免疫响应的多聚体蛋白质即可。抗原蛋白质可以根据免疫响应的意图目的合适地进行选择。
为多聚体蛋白质的酶的具体实例包括例如，逆转录酶。
这些蛋白质的编码基因可以根据待使用的宿主进行修饰，以获得期望的活性。例如，可以修饰这些蛋白质的编码基因，从而使蛋白质包含一个或数个氨基酸残基的添加、缺失、取代等。上述关于金属肽酶和编码它们的基因的解释也可以在经过适当的变化后应用于通过本发明方法分泌产生的多聚体蛋白质及其编码基因。进一步，在这些蛋白质的编码基因中，任何密码子均可以用其等价密码子代替。例如，在这些蛋白质的编码基因中，可以根据宿主中观察到的密码子频率，按需要对密码子进行优化。
通过本发明方法最终获得的多聚体蛋白质的N端区域可以和天然蛋白质相同，或者可以和天然蛋白质不同。例如，最终获得的多聚体蛋白质的N端区域可以是包含一个或数个氨基酸残基的添加或缺失的天然蛋白质的N端区域。尽管“一个或数个”氨基酸残基的数目可以根据目标多聚体蛋白质的全长或结构而改变，具体地，其优选为1-20个，更优选1-10个，再更优选1-5个。
进一步，要分泌产生的多聚体蛋白质可以是包含原结构部分的蛋白质(原蛋白质)。当要分泌产生的多聚体蛋白质是原蛋白质时，最终获得的多聚体蛋白质可以是原蛋白质，也可以不是原蛋白质。也就是说，原蛋白质可以通过切除原结构部分而被加工成为成熟蛋白质。切割可以通过用例如蛋白酶来实现。当使用蛋白酶时，考虑到最终要获得的蛋白质的活性，一般优选在与天然蛋白质基本上相同的位置切割原蛋白质，或者更优选地，在与天然蛋白质完全相同的位置切割原蛋白质，从而获得与天然成熟蛋白质相同的成熟蛋白质。因此，最优选的是这样的特异性蛋白酶，其在一定的切割原蛋白质位置而产生与天然存在的成熟蛋白质相同的蛋白质。然而，最终要获得的多聚体蛋白质的N-端区域可能与上述天然存在的蛋白质不同。例如，取决于要产生的多聚体蛋白质的类型、用途等，与天然存在的蛋白质相比，在N端增长或缩短一个到数个氨基酸残基的蛋白质可能具有更合适的活性。本发明中可用的蛋白酶包括，例如，商业上可得的蛋白酶，例如Dispase(由BoehringerMannheim生产)，以及可以从微生物培养液，例如放线菌的培养液中获得的那些。这些蛋白酶可以在非纯化状态下使用，或者也可以在根据需要纯化到合适纯度之后使用。
用于将本发明所用的基因构建体引入到棒状杆菌型细菌中的方法没有特殊限制。在本发明的细菌中，用于本发明的基因构建体可以存在于在染色体外自主复制的载体(例如质粒)上，或者可以组入到染色体中。此外，如上所述，为了构建本发明的细菌，可以按照任意次序进行修饰，例如导入用于本发明的基因构建体、赋予或者提高通过分泌生产蛋白质的能力、提高编码金属肽酶的基因的表达、降低青霉素结合蛋白质的活性、降低细胞表层蛋白质的活性。
对于用于本发明的基因构建体，可以使用例如包含该基因构建体的载体将其导入到宿主内。所述载体没有特别限制，只要选用能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的载体即可，载体可以是，例如，来自细菌质粒的载体，来自酵母质粒的载体，来自噬菌体的载体，粘粒，噬菌粒等。作为载体，例如，来自棒状杆菌型细菌的质粒是优选的。能够在棒状杆菌型细菌中自主复制的载体的具体实例包括pHM1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))；通过改良它们获得的、具有药物抗性基因的质粒；日本专利申请特开平3-210184中描述的质粒pCRY30；日本专利申请特开平2-72876和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和pCRY3KX；日本专利申请特开平1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；日本专利申请特开昭58-192900中描述的质粒pAJ655、pAJ611、和pAJ1844；日本专利申请特开昭57-134500中描述的pCG1；日本专利申请特开昭58-35197中描述的pCG2；日本专利申请特开昭57-183799中描述的pCG4和pCG11；日本专利申请特开平10-215883中描述的pVK7；日本专利申请特开平9-070291中描述的pVC7；等等。
进一步，还可以使用人工转座子等。当使用转座子时，通过同源重组或转座子自身的转位能力将多聚体蛋白质引入到染色体中。利用同源重组的其它引入方法实例包括，例如：利用线性DNA、具有温度敏感复制原点的质粒、能够接合转移的质粒、不具有在宿主中能够发挥功能的复制原点的自杀载体的方法，等等。此外，当多聚体蛋白质基因被引入到染色体上时，只要在染色体上能构成用于本发明的基因构建体，基因构建体中包含的启动子序列和编码信号肽的核酸序列中的任何一个或者两个可以是宿主染色体中原本存在的。具体地说，例如，通过照原样使用在宿主染色体中原来存在的启动子序列和连接于该启动子序列下游的编码按照原样使用在宿主染色体中原始存在的信号肽的核酸序列，而仅将连接在编码信号肽的核酸序列下游的基因替换为目标多聚体蛋白质基因，也可以在染色体上构建本发明所用的基因构建体，由此构建本发明的细菌。
另外，当表达两种或更多种亚单位时，只要本发明的细菌以能够实现目标多聚体蛋白质的分泌表达的方式携带用于分泌表达各亚单位的各基因构建体即可。具体地，例如，所有用于分泌表达亚单位的基因构建体可以携带在单一表达载体上，或者可以携带在染色体上。或者，用于分泌表达各亚单位的多个基因构建体可以携带在两个或多个表达载体上，或者可以分别携带在单个或多个表达载体和染色体上。“表达两种或更多种亚单位的情况”包括例如分泌生产两种或多种多聚体蛋白质的情况，或者分泌生产异源多聚体蛋白质的情况。
用于将本发明所用的基因构建体导入到棒状杆菌型细菌中的方法没有特殊限制，并且可以使用通用方法，例如原生质体法(Gene，39，281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))，等。
<2>用于产生本发明多聚体蛋白质的方法
本发明提供了一种用于产生多聚体蛋白质的方法，其包括培养本发明的细菌和收集分泌产生的多聚体蛋白质(下文也称作“本发明的方法”或“用于产生本发明多聚体蛋白质的方法”)。也就是说，通过培养如上所述得到的本发明的细菌来表达多聚体蛋白质，得到了大量分泌到细胞外的多聚体蛋白质。
本发明的细菌可以根据通常使用的方法和条件进行培养。例如，本发明的细菌可以在含有碳源、氮源和无机离子的通常培养基中培养。为了获得更高的扩增，可以根据需要添加有机微量营养素，例如维生素和氨基酸。
作为碳源，可以使用碳水化合物例如葡萄糖和蔗糖，有机酸例如乙酸、醇、及其它。作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐和其它。作为无机离子，可以根据需要合适地使用钙离子、镁离子、磷酸盐离子、钾离子、铁离子等。培养在pH5.0-8.5和15-37℃的合适范围内、在有氧条件下进行1-7天。进一步，可以使用用于通过棒状杆菌型细菌生产L-氨基酸的培养条件，和在使用Sec型或Tat型信号肽生产蛋白质的方法中描述的其它条件(参考WO01/23591和WO2005/103278)。进一步，当使用可诱导启动子用于表达多聚体蛋白质时，培养还可以通过向培养基中添加启动子诱导剂进行。通过在这些条件下培养本发明的细菌，在细胞中产生大量的目标蛋白质，并高效分泌到细胞外。此外，根据本发明的方法，所产生的多聚体蛋白质被分泌到细胞外面，因此即使是在一般情况下若大量积累在微生物细胞内会致死的蛋白质，也可以连续产生而无致死效应。
根据本发明方法分泌在培养基中的蛋白质可以在使用本领域技术人员众所周知的方法培养之后，从培养基中分离和纯化。例如，在通过离心等除去细胞之后，可以通过已知的合适方法，例如盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤色谱、离子交换柱色谱、亲和色谱、中压或高压液相色谱、反相色谱、和疏水色谱、或这些组合，对蛋白质进行分离和纯化。进一步，在某些情况下，可以依原样使用培养物或培养上清液。对于根据本发明方法分泌在细胞表层中的蛋白质，在通过本领域技术人员公知的方法(例如提高盐浓缩和使用表面活性剂)溶解之后，也可以通过与蛋白质分泌到培养基中的情况相同的方式加以分离和纯化。进一步，在某些情况下，分泌在细胞表层中的蛋白质可以作为例如固定化酶使用，而无需溶解。
目标多聚体蛋白质的分泌产生可以通过使用培养物上清和/或含有细胞表层的级分作为样品进行SDS-PAGE，并确认分离蛋白质条带的分子量来加以确认。目标多聚体蛋白质的分泌产生还可以通过使用培养物上清和/或含有细胞表层的级分作为样品，使用抗体进行Western印迹(MolecularCloning，ColdspringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(USA)，2001)来加以确认。目标多聚体蛋白质的分泌产生可以通过利用蛋白质测序仪测定N端氨基酸序列来加以确认。进一步，目标多聚体蛋白质的分泌产生可以通过使用质谱仪测量其质量来加以确认。此外，当目标多聚体蛋白质是酶或具有某种可以测量的生理学活性的蛋白质时，目标多聚体蛋白质的分泌产生可以通过使用培养物上清和/或含有细胞表层的级分作为样品，测量酶活性或目标多聚体蛋白质的生理学活性来加以确认。
实施例
本发明将进一步参考下面的实施例进一步进行具体的解释。然而，不应认为这些实施例在任何方面对本发明的范围造成限制。
参考实施例1：缺乏青霉素结合蛋白质PBP1a的谷氨酸棒状杆菌的构建
(1)用于缺失PBP1a编码基因Cgl0278的载体pBSΔCgl0278的构建
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列和编码青霉素结合蛋白质PBP1a的Cgl0278基因的序列已经得以确定(Genbank登录号No.BA000036，NCBI基因条目NCgl0274)。参考该序列，合成了如SEQIDNO:26、27、28、和29所示的引物。使用按照常规方式(Saito和Miura的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制备的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，分别使用引物SEQIDNO:26和27、以及引物SEQIDNO:28和29，通过PCR分别扩增了编码PBP1a的Cgl0278基因的5'侧上游大约1kbp区域和3'侧下游大约1kbp的区域。然后，通过使用这两个扩增的DNA片段作为模板、以如SEQIDNO:26和29所示的DNA作为引物进行PCR，获得了由这两个片段彼此融合在一起而组成的大约2kbp的DNA片段。在引物SEQIDNO:26和29中，分别设计有限制酶BamHI和XbaI的识别序列。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio生产)，反应条件依照制造商推荐的规程。用限制酶BamHI和XbaI处理该DNA片段，并插入如WO2005/113744所述的pBS4的BamHI-XbaI位点中，获得了用于缺失Cgl0278基因的载体pBSΔCgl0278。连接反应使用DNA连接试剂盒Ver.2.1(TakaraBio生产)，反应条件依照制造商推荐的规程。
(2)PBP1a缺陷菌株的构建
然后，用构建的pBSΔCgl0278转化在WO2004/029254中描述的谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株。谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株是谷氨酸棒状杆菌AJ12036(FERMBP-734)的细胞表层蛋白质PS2缺陷菌株(WO2004/029254)。根据WO2005/113744和WO2006/057450描述的方法从所得的转化子中筛选菌株，获得Cgl0278基因缺陷的YDK010ΔPBP1a菌株。
实施例1：衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的金属内肽酶样基因Cgl0858同源物的克隆
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列和编码金属内肽酶样蛋白质的Cgl0858基因的核苷酸序列已经得到确定(Genbank登录号No.BA000036,NCBIgeneentryNCgl0824)。参考该序列，合成了如SEQIDNO:01和02所示的引物。使用利用常规方法(Saito和Miura的方法[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)])制备的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA作为模板，SEQIDNO:01和02的引物，通过PCR扩增了包括编码金属内肽酶样蛋白质的Cgl0858同源物的约1.1kbp的区域。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(由TakaraBio生产)，并且反应条件根据制造商推荐的方案。
然后，使用Wizard(注册商标)SVGelandPCRClean-UpSystem(Promega)通过琼脂糖凝胶电泳收集了约1.1kbp的扩增的DNA片段。将收集的片段引入到pVC7(在日本专利申请特开平9-070291中描述的、在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌中均可复制的穿梭载体)的SmaI位点中，然后将得到的物质导入到大肠杆菌JM109(TakaraBio)的感受态细胞中以得到携带其中克隆了Cgl0858同源物的质粒。由该菌株收集质粒，并将其命名为pVMEP1。通过使用BigDye(注册商标)Terminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)和3130GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)来进行克隆在pVMEP1的片段的核苷酸测序。作为核苷酸测序的结果，显示了克隆的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物的核苷酸序列部分不同于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858的核苷酸序列。衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物的核苷酸序列显示在SEQIDNO:03中，并且其编码的全部氨基酸序列显示在SEQIDNO:04中。图1显示由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858编码的蛋白质和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物编码的蛋白质的氨基酸序列的比对。由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858编码的蛋白质和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物编码的蛋白质之间的氨基酸序列全长的同源性为97.9％。通过使用Genetyx_Version9(Genetyx)来作成比对和计算同源性。
实施例2：使用Cgl0858同源物的表达提高的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段
(1)用于分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab片段的H链区的质粒的构建
乳腺癌细胞特异性抗体曲妥珠单抗H链可变区的基因序列已经被确定(Genbank登录号No.AY513484)。参考该序列和通用抗体H链非可变区的序列，并考虑谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率，合成了如SEQIDNO:30-63所示的DNA。使用上述DNA作为模板，以另行合成的如SEQIDNO:64和65所示的DNA序列作为引物，通过PCR对曲妥珠单抗的全长H链区域进行扩增，获得如SEQIDNO:66所示的大约1.4kbp的DNA片段。由SEQIDNO:66DNA编码的抗体曲妥珠单抗H链的氨基酸序列如SEQIDNO:104所示。
然后，使用WO01/23591中描述的pPKSPTG1作为模板(pPKSPTG1是用于分泌表达转谷氨酰胺酶原(含有原结构部分的转谷氨酰胺酶)的载体，包含：来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株PS2基因的启动子；可表达地连接于该启动子下游的、编码来自产氨棒状杆菌ATCC6872菌株SlpA的信号肽的DNA；以及来自茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原基因，该基因被连接而使得该转谷氨酰胺酶原作为与上述信号肽的融合蛋白质表达)，以及如SEQIDNO:67和68所示的引物，通过PCR扩增了包含前述启动子区和前述信号肽区的区域，获得大约0.7kbp的DNA片段。
然后，使用这两个扩增的DNA片段(包含曲妥珠单抗全长H链区的片段和包含启动子和信号肽区的片段)作为模板，以如SEQIDNO:65和67所示DNA作为引物，通过PCR获得了由这两个DNA片段彼此融合在一起而构成的大约2.0kbp的DNA片段。
然后，使用该融合DNA片段作为模板，以及如SEQIDNO:67与69、SEQIDNO:67与70、SEQIDNO:67与71、SEQIDNO:67与72、SEQIDNO:67与73、SEQIDNO:67与74、和SEQIDNO:67与75所示的DNA作为引物，分别通过PCR获得了各为大约1.4kbp的DNA片段。在引物SEQIDNO:67中，设计有一个限制酶KpnI的识别序列。在SEQIDNO:69、70、71、72、73、74和75中的每一个引物中，设计有终止密码子和限制酶KpnI的识别序列。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio生产)，反应条件依照制造商推荐的规程。用限制酶KpnI处理这些DNA片段，并将它们各自插入到如日本专利申请特开平9-322774所述的pPK4的KpnI位点中，获得了能够分泌表达曲妥珠单抗Fab部分H链区的质粒，pPKStrast-FabH(1-223C)、pPKStrast-FabH(1-228T)、pPKStrast-FabH(1-229C)、pPKStrast-FabH(1-230P)、pPKStrast-FabH(1-231P)、pPKStrast-FabH(1-232C)、和pPKStrast-FabH(1-233P)。具体地，利用这些质粒中，根据质粒名称中所含的编号，可以分别表达曲妥珠单抗H链中从第1个氨基酸残基到第223、228、229、230、231、232或233个氨基酸残基的氨基酸序列。根据对被插入片段的核苷酸测序的结果，确认预期的基因得到了构建。核苷酸测序使用Terminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，和3130GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)。
(2)用于分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab片段的L链区的质粒的构建
乳腺癌细胞特异性抗体曲妥珠单抗L链可变区的基因序列已经得到确定(Genbank登录号No.AY513485)。参考该序列和通用抗体L链非可变区的序列，考虑谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率，合成了如SEQIDNO:76-91所示的DNA。使用上述DNA作为模板，以另行合成的如SEQIDNO:92和93所示的DNA序列作为引物，通过PCR对曲妥珠单抗的全长L链区域进行扩增，获得一个如SEQIDNO:94所示的大约0.6kbp的DNA片段。由SEQIDNO:94DNA编码的抗体曲妥珠单抗L链的氨基酸序列如SEQIDNO:105所示。然后，使用WO01/23591中描述的pPKSPTG1(其含有来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的启动子和来自产氨棒状杆菌ATCC6872株的信号肽区)作为模板，以及如SEQIDNO:95和96所示的引物，通过PCR扩增了包含前述启动子区和前述信号肽区的区域，获得一个大约0.7kbp的DNA片段。然后，使用这两个扩增的DNA片段(包含曲妥珠单抗L链区的片段和包含启动子和信号肽区的片段)作为模板，以如SEQIDNO:95和97所示的DNA作为引物，通过PCR获得了由彼此融合在一起的这两个DNA片段组成的一个大约1.3kbp的DNA片段。在SEQIDNO:95和97的引物中，设计有限制酶BamHI的识别序列。PCR使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio生产)，反应条件依照制造商推荐的规程。用限制酶BamHI处理该融合DNA片段，并将其插入到如日本专利申请特开平9-322774所述的pPK4的BamHI位点中，获得了能够分泌表达曲妥珠单抗Fab部分L链区的质粒pPKStrast-FabL。根据对插入片段的核苷酸测序的结果，确认了预期的基因得到了构建。核苷酸测序使用Terminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems生产)，和3130GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems生产)进行。
(3)用于分泌表达抗体曲妥珠单抗Fab(H&L)片段的质粒的构建
将实施例2-(1)中构建的抗体曲妥珠单抗Fab片段H链区的各表达质粒用限制酶KpnI消化而获得的DNA片段(每个为大约1.4kb)插入到在实施例2(2)中构建的抗体曲妥珠单抗Fab片段L链区的表达质粒pPKStrast-FabL的KpnI位点中，获得了用于共表达曲妥珠单抗Fab片段的H链区和L链区的质粒：pPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、
pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、
pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、和
pPKStrast-FabH(1-233P)+L。
(4)使用Cgl0858同源物表达提高的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段
通过使用在实施例1中构建的Cgl0858同源物的表达质粒，以及在实施例2(3)中构建的用于分泌表达抗体曲妥珠单抗Fab(H&L)片段的各个质粒，
pPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、
pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、
pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、和
pPKStrast-FabH(1-233P)+L，转化WO2004/029254中描述的谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株。将所得的每个转化子培养在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l卡那霉素的MM液体培养基中(120g葡萄糖、3g七水硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g硫酸二氢钾、0.03g七水硫酸铁、0.03g七水硫酸锰、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15gDL-甲硫氨酸、和50g碳酸钙，溶于1L体积水中，调节至pH7.0)，在30℃培养96个小时。在培养结束后，通过对每个培养液进行离心获得培养物上清，并对其进行非还原型SDS-PAGE，然后用宝石橙(SYPROOrange，Invitrogen)染色，并比较抗体曲妥珠单抗Fab(H&L)片段的分泌量。结果，发现当使用任何用于分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的质粒时，与导入了pVC7的对比菌株中观察到的分泌量相比，所有导入了pVMEP1的菌株的抗体曲妥珠单抗的异源二聚体Fab(H&L)片段的分泌量均显著提高(图2)。
(5)使用Cgl0858同源物表达提高的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体曲妥珠单抗的F(ab')2
对在实施例2(4)中获得的每一个培养物上清进行非还原型SDS-PAGE，然后使用iBlot(注册商标)GelTransferStacksPVDF、Mini(Invitrogen)和iBlot(注册商标)凝胶转移系统(Invitrogen)将蛋白质转印到PVDF膜上。使用碱性磷酸酶标记的抗-人IgG[H&L]抗体(ROCKLAND)和碱性磷酸酶缀合底物试剂盒(Bio-Rad)对该PVDF膜进行Western印迹，来检测抗体曲妥珠单抗的F(ab')2。结果，在分别携带用于共表达H链区基因(其含有可形成连接各H链的二硫键的Cys残基)和L链区基因的质粒pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、和pPKStrast-FabH(1-233P)+L的转化子的培养物上清中检测到了与抗体曲妥珠单抗F(ab')2片段分子量相同的蛋白质条带。进一步，当使用任何用于分泌表达的这些质粒时，与导入了pVC7的对照菌株中观察到的结果相比，所有导入了pVMEP1的菌株的异源四聚体F(ab')2的分子量的蛋白质条带显著提高(图3)。
(6)使用Cgl0858同源物表达增强、并缺失了PBP1a的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段
使用在实施例1中构建的Cgl0858同源物的表达质粒pVMEP1以及在实施例2(3)中构建的分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的质粒
pPKStrast-FabH(1-223C)+L、pPKStrast-FabH(1-228T)+L、
pPKStrast-FabH(1-229C)+L、pPKStrast-FabH(1-230P)+L、
pPKStrast-FabH(1-231P)+L、pPKStrast-FabH(1-232C)+L、和
pPKStrast-FabH(1-233P)+L，，转化了参考实施例1中构建的谷氨酸棒状杆菌YDK010ΔPBP1a菌株。将所得的每个转化子培养在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l卡那霉素的MM液体培养基中(120g葡萄糖、3g七水硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g硫酸二氢钾、0.03g七水硫酸铁、0.03g七水硫酸锰、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15gDL-甲硫氨酸、和50g碳酸钙，溶于1L体积水中，调节至pH7.0)，在30℃培养96个小时。在培养结束后，通过对每个培养液进行离心获得了培养物上清。
然后，使用同一凝胶对实施例2(4)和实施例2(6)中得到的培养物的上清样品进行非还原型SDS-PAGE，然后用CBB-R250(Bio-Rad)染色，以比较抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的分泌生产量。结果，确认了与单独增强Cgl0858同源物表达的菌株相比，在Cgl0858同源物的表达增强与PBP1a缺失组合的菌株中，抗体曲妥珠单抗的异源二聚体Fab(H&L)片段的分泌产生量进一步协同地增加(图4)。具体地说，对于单独增强了Cgl0858同源物表达的菌株而言，条带的检测优选使用检测灵敏度高的宝石橙(SYPROOrange)，但是对于Cgl0858同源物的表达增强与PBP1a缺失组合的菌株而言，其表达量的水平使用检测灵敏度低的CBB-R250的染色即可容易地检测到条带。
实施例3：使用Cgl0858同源物表达增强的谷氨酸棒状杆菌分泌表达VEGF-A(1)VEGF-A的分泌表达质粒的构建
血管内皮生长因子A(VEGF-A)的基因序列已经得到确定(Genbank登录号No.NP_001165097)。通过参考该序列并且结合谷氨酸棒状杆菌的密码子频率，合成了SEQIDNO:05-18所示的DNA。使用这些DNA作为模板，以及另行合成的SEQIDNO:19和20所示的DNA作为引物，通过PCR扩增VEGF-A基因序列的全长，得到了如SEQIDNO:21所示的约0.6kbp的DNA片段。然后，使用该DNA片段作为模板，并使用SEQIDNO:22和23所示的DNA作为引物，通过PCR扩增了成熟VEGF-A的基因序列，得到了约0.5kbp的DNA片段。由如SEQIDNO:21所示的DNA编码的全长VEGF-A的氨基酸序列如SEQIDNO:106所示，成熟的VEGF-A的氨基酸序列如SEQIDNO:107所示。然后，使用在WO01/23591中描述的pPKSPTG1(包含：衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的CspB(PS2)的启动子区域和编码衍生自产氨棒状杆菌ATCC6872的CspA(SlpA)信号肽的DNA)作为模板，以及SEQIDNO:24和25中所示的引物，通过PCR扩增了启动子区域和信号肽区域，得到了约0.7kbp的DNA片段。然后，使用扩增的两个DNA片段(即成熟VEGF基因序列的片段和启动子区域与信号肽区域的片段)作为模板，以及SEQIDNO:24和23中所示的DNA作为引物，通过PCR得到了由两个DNA片段融合在一起的约1.2kbp的DNA片段。在SEQIDNO:24和23的引物中，分别设计了限制性酶KpnI和XbaI的识别序列。PCR使用了PrimeSTAR(注册商标)HSDNA聚合酶(TakaraBio)，反应条件根据制造商推荐的规程。该融合的DNA片段用限制性酶KpnI和XbaI处理，然后将其插入到日本专利申请特开平9-322774中描述的pPK4的KpnI-XbaI位点，从而获得表达VEGF-A的质粒pPKSVEGF。根据对插入片段的核苷酸测序的结果，确认预期的基因得到了构建。核苷酸测序使用BigDyeTerminatorv3.1循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，和3130GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems)进行。
(2)使用Cgl0858同源物表达增强的谷氨酸棒状杆菌分泌表达VEGF-A
通过使用在实施例1(1)中构建的Cgl0858同源物的表达质粒pVMEP1和实施例3(1)构建的VEGF-A分泌表达质粒pPKSVEGF，转化了WO2004/029254中描述的谷氨酸棒状杆菌YDK010菌株。将所得的转化子分别在含有5mg/l的氯霉素和25mg/l卡那霉素MM液体培养基中(120g葡萄糖、3g七水硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g硫酸二氢钾、0.03g七水硫酸铁、0.03g七水硫酸锰、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15gDL-甲硫氨酸、和50g碳酸钙，溶于1L体积水中，调节至pH7.0)30℃培养96个小时。在培养结束后，对通过离心每个培养液获得的培养物上清进行非还原型SDS-PAGE，然后用宝石橙(Invitrogen)染色，并比较VEGF-A的分泌量。结果，与导入了pVC7的对照菌株相比，在导入了pVMEP1的菌株中观察到了与目标同源二聚体VEGF-A的分子量相同的蛋白质条带的强度增强(图5)。当使用蛋白质测序仪PPSQ-21A(Shimadzu)确定该蛋白质条带的N段序列时，发现该序列与VEGF-A的N段序列一致，因此可以确认在培养上清中的同源二聚体VEGF-A的分泌表达。如上所述，通过提高Cgl0858同源物的表达可以增加VEGF-A同源二聚体的分泌产生量。
实施例4：使用Cgl0858同源物表达增强的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体阿达木单抗(adalimumab)的Fab(H&L)片段
(1)用于分泌表达抗体阿达木单抗Fab(H&L)片段的质粒的构建
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)特异性抗体阿达木单抗的氨基酸序列已经得到确定(独立管理机构、药品与医疗器械管理局(PharmaceuticalsandMedicalDevicesAgency)，检测报告(2月14日，2008))。参考该序列，完全合成了如SEQIDNO:108所示的DNA片段，该片段包含：来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株PS2基因的启动子；可表达地连接在该启动子下游的、编码来自C.stationisATCC6872菌株的SlpA的信号肽的DNA；以及编码阿达木单抗H链第1位起至第230位半胱氨酸残基止的氨基酸序列的DNA，该DNA的连接而使得该氨基酸序列作为与信号肽的融合蛋白质而被表达；并进一步在其下游包含：来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株PS2基因的启动子；可表达地连接在该启动子下游的、编码来自C.stationisATCC6872菌株的SlpA的信号肽的DNA；和编码阿达木单抗的L链的DNA，该DNA被连接成使得该蛋白质作为与上述信号肽的融合蛋白质而被表达。类似地，完全合成了如SEQIDNO:109所示的DNA片段，该片段包含：来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株PS2基因的启动子；可表达地连接在该启动子下游的、编码来自产氨棒状杆菌(C.stationis)ATCC6872菌株的SlpA的信号肽的DNA；和编码阿达木单抗L链的DNA，该DNA被连接而使得该L链作为与信号肽的融合蛋白质而表达；并进一步在其下游包含：来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株PS2基因的启动子；可表达地连接在该启动子下游的、编码来自产氨棒状杆菌(C.stationis)ATCC6872菌株的SlpA的信号肽的DNA；和编码阿达木单抗H链第1位起至第230位半胱氨酸残基止的氨基酸序列的DNA，该DNA被连接使得该氨基酸序列作为与上述信号肽的融合蛋白质而表达。合成的DNASEQIDNO:108和109各自均在5’端含有限制酶BamHI的识别序列、在3’端含有限制酶XbaI的识别序列。另外，在这些合成DNA中，编码阿达木单抗H链和L链的DNA是考虑谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率而设计的。在这些合成DNA中，编码阿达木单抗H链第1位至第230位氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO:110所示，氨基酸序列如SEQIDNO:111所示。另外，在这些合成DNA中，编码阿达木单抗L链氨基酸序列的DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:112所示，阿达木单抗L链的氨基酸序列如SEQIDNO:113所示。将每一个大约2.7kbp的全合成DNA片段用限制酶BamHI和XbaI消化，并插入到JP9-322774A中描述的pPK4的BamHI-XbaI位点中，获得共表达抗体阿达木单抗的Fab片段的H链(1-230C)和L链的质粒，pPKSada-FabHL和pPKSada-FabLH。各个质粒名称中的“FabHL”和“FabLH”指示了编码阿达木单抗的H链的基因和L链的基因在表达质粒中的携带次序。
(2)使用Cgl0858同源物表达增强的谷氨酸棒状杆菌分泌表达抗体阿达木单抗的Fab(H&L)片段
通过使用在实施例1中构建的Cgl0858同源物的表达载体pVMEP1，以及在实施例4(1)中构建的用于分泌表达抗体阿达木单抗Fab(H&L)片段的质粒pPKSada-FabHL和pPKSada-FabLH，转化在参考实施例1中构建的YDK010ΔPBP1a菌株。将所得的每个转化子分别在含有5mg/l氯霉素和25mg/l卡那霉素的MM液体培养基中(120g葡萄糖、3g七水硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g硫酸二氢钾、0.03g七水硫酸铁、0.03g七水硫酸锰、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15gDL-甲硫氨酸、和50g碳酸钙，溶于1L体积水中，调节至pH7.0)30℃培养96小时。在培养结束后，通过对每个培养液进行离心获得培养物上清，并对其进行非还原型SDS-PAGE，然后用CBB-R250(Bio-Rad)染色，并比较抗体阿达木单抗Fab(H&L)片段的分泌量。结果发现，当使用任何这些用于分泌表达的质粒时，与导入了pVC7的对照菌株相比，导入了pVMEP1的各个菌株抗体阿达木单抗的异源二聚体Fab(H&L)片段的分泌量显著增加(图6)。基于这些结果可知，不仅在表达曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的情况下，而且在表达阿达木单抗的Fab(H&L)片段的情况下，通过提高Cgl0858同源物的表达也可增加抗体Fab(H&L)片段的分泌量。
实施例5：在Cgl0858同源物表达增强的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株中分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段
通过使用在实施例1中构建的Cgl0858同源物的表达质粒pVMEP1，以及在实施例2(3)中构建的分泌表达抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的质粒pPKStrast-FabH(1-229C)+L，转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株(其为YDK010菌株(谷氨酸棒状杆菌AJ12036(FERMBP-734)的细胞表层蛋白PS2(CspB)-缺失的菌株(WO2004/029254))的野生菌株)。将所得的转化子在含有25mg/l卡那霉素的MM液体培养基中(120g葡萄糖、3g七水硫酸镁、30g硫酸铵、1.5g硫酸二氢钾、0.03g七水硫酸铁、0.03g七水硫酸锰、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15gDL-甲硫氨酸、和50g碳酸钙，溶于1L体积水中，调节至pH7.0)，30℃培养96小时。在培养结束后，通过对每个培养液进行离心获得培养物上清，并对其进行非还原型SDS-PAGE，然后用宝石橙(Invitrogen)染色，并比较抗体曲妥珠单抗的Fab(H&L)片段的分泌量。结果，发现与导入了pVC7的对照菌株相比，导入了pVMEP1的菌株的抗体曲妥珠单抗的异源二聚体Fab(H&L)片段的分泌量显著增加(图7)。基于这些结果可见，即使当使用野生菌株ATCC13869菌株作为表达宿主时，通过提高Cgl0858同源物的表达，抗体Fab(H&L)片段的分泌量也可以增加。
工业实用性
根据本发明，提供了一种能够高效分泌产生多聚体蛋白质的棒状杆菌型细菌。进一步，通过使用本发明提供的棒状杆菌型细菌作为表达宿主，可以高效分泌产生多聚体蛋白质，例如工业上有用的多聚体蛋白质。
序列表说明
SEQIDNO:1和2：引物
SEQIDNO:3:谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物的核苷酸序列
SEQIDNO:4：谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的Cgl0858同源物编码的蛋白质的氨基酸序列
SEQIDNO:5至18：用于VEGF-A全合成的核苷酸序列
SEQIDNO:19和20：引物
SEQIDNO:21：VEGF-A基因的核苷酸序列
SEQIDNO:22至25：引物
SEQIDNO:26至29：引物
SEQIDNO:30至63：用于曲妥珠单抗H链的完全合成的DNA的核苷酸序列
SEQIDNO:64和65：引物
SEQIDNO:66：曲妥珠单抗H链基因的核苷酸序列
SEQIDNO:67至75：引物
SEQIDNO:76至91：用于曲妥珠单抗L链的完全合成的DNA的核苷酸序列
SEQIDNO:92和93：引物
SEQIDNO:94：曲妥珠单抗L链基因的核苷酸序列
SEQIDNO:95至97：引物
SEQIDNO:98：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0858编码的蛋白质的氨基酸序列
SEQIDNO:99：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0278的核苷酸序列
SEQIDNO:100：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Cgl0278编码的蛋白质的氨基酸序列
SEQIDNO:101：衍生自谷氨酸棒状杆菌的PS1信号肽的氨基酸序列
SEQIDNO:102：衍生自谷氨酸棒状杆菌的PS2(CspB)信号肽的氨基酸序列
SEQIDNO:103：衍生自产氨棒状杆菌SlpA(CspA)信号肽的氨基酸序列
SEQIDNO:104：曲妥珠单抗H链的氨基酸序列
SEQIDNO:105：曲妥珠单抗L链的氨基酸序列
SEQIDNO:106：VEGF-A的氨基酸序列
SEQIDNO:107：成熟VEGF-A的氨基酸序列
SEQIDNO:108和109：表达阿达木单抗Fab(H&L)片段的完全合成的DNA的核苷酸序列
SEQIDNO:110：阿达木单抗H链基因的核苷酸序列(1-230C编码区)
SEQIDNO:111：阿达木单抗H链的氨基酸序列(1-230C)
SEQIDNO:112：阿达木单抗L链基因的核苷酸序列
SEQIDNO:113：阿达木单抗L链的氨基酸序列
SEQIDNO:114：谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的cspB基因的核苷酸序列
SEQIDNO:115：谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的cspB基因编码的蛋白质的氨基酸序列

Claims (9)

1.一种棒状杆菌型细菌，其具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达，
其中所述金属肽酶是由SEQIDNO:4所示的氨基酸组成的蛋白质，
其中所述棒状杆菌型细菌是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
2.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，其中，所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或修饰该基因的表达调控序列而提高。
3.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，其还经过修饰而降低了青霉素结合蛋白的活性。
4.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，其中降低了细胞表层蛋白的活性。
5.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，
其中，所述棒状杆菌型细菌具有用于分泌表达所述多聚体蛋白质的基因构建体，以及
其中，所述基因构建体包括：在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接在该启动子序列下游的、编码在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的信号肽的核酸序列，以及连接在该编码信号肽的核酸序列下游的、编码所述多聚体蛋白质的核酸序列。
6.根据权利要求1～5中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述多聚体蛋白质是抗体相关分子，其中所述抗体相关分子由选自下组的一种或多种蛋白质组成：完整抗体、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fc、由重链和轻链构成的二聚体、Fc-融合蛋白质、sc(Fv)2、和双抗体。
7.根据权利要求6的棒状杆菌型细菌，其中所述抗体相关分子由选自Fab、F(ab')2、和Fc融合蛋白中的一种或多种蛋白质构成。
8.根据权利要求1～5中任一项的棒状杆菌型细菌，其中所述多聚体蛋白质是血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)。
9.产生多聚体蛋白质的方法，其包括：
培养根据权利要求1～8中任一项的棒状杆菌型细菌；以及
收集分泌产生的蛋白质。
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