NO870630L - Stabilisering av ustabilt nedarvede replikoner. - Google Patents
Stabilisering av ustabilt nedarvede replikoner.Info
- Publication number
- NO870630L NO870630L NO870630A NO870630A NO870630L NO 870630 L NO870630 L NO 870630L NO 870630 A NO870630 A NO 870630A NO 870630 A NO870630 A NO 870630A NO 870630 L NO870630 L NO 870630L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- replicon
- cell
- sequence
- parb
- product
- Prior art date
Links
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title description 34
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 title description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 259
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 233
- 101100278012 Escherichia coli (strain K12) dnaG gene Proteins 0.000 claims description 212
- 101100165173 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) basS gene Proteins 0.000 claims description 212
- 101100421924 Thermus thermophilus (strain ATCC BAA-163 / DSM 7039 / HB27) spo0C gene Proteins 0.000 claims description 212
- 101150004979 flmA gene Proteins 0.000 claims description 212
- 101150048892 parB gene Proteins 0.000 claims description 212
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 158
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 126
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 79
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 76
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 101150072105 hok gene Proteins 0.000 claims description 59
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 55
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 48
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 35
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 34
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 27
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 claims description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 13
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 12
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 12
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 100
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 79
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 68
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 54
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 33
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 22
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 21
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 21
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 18
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 18
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 17
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 14
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 13
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 13
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 101150034459 Parpbp gene Proteins 0.000 description 8
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 8
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 8
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 108091033454 Hok/sok system Proteins 0.000 description 7
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 101100135641 Caenorhabditis elegans par-3 gene Proteins 0.000 description 6
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 6
- 101100524295 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) relB3 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 6
- 101150023313 relB gene Proteins 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 101100398597 Botryotinia fuckeliana lcc1 gene Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100068374 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) GIP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000006143 Gilbert reaction Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 3
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000004124 hock Anatomy 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 2
- 101100301559 Bacillus anthracis repS gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100247969 Clostridium saccharobutylicum regA gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 101100412434 Escherichia coli (strain K12) repB gene Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150073872 ORF3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101100114425 Streptococcus agalactiae copG gene Proteins 0.000 description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 101150001899 lacY gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002231 macronucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 101150044854 repA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100437895 Alternaria brassicicola bsc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 1
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000761389 Copa Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102100030796 E3 ubiquitin-protein ligase rififylin Human genes 0.000 description 1
- 101710128004 E3 ubiquitin-protein ligase rififylin Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101100126085 Escherichia coli incB gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100281686 Mus musculus Fstl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 101100226891 Phomopsis amygdali PaP450-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010033711 Telomeric Repeat Binding Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036497 Telomeric repeat-binding factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150118463 argG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 101150023807 copB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 101150013644 deoC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000027832 depurination Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000011070 membrane recovery Methods 0.000 description 1
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000021616 negative regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Electrophonic Musical Instruments (AREA)
- Circuit For Audible Band Transducer (AREA)
- Executing Machine-Instructions (AREA)
Description
Teknisk introduksjon
Genetisk stabilitet, på nivået av cellepopulasjoner, samt på nivået av den enkelte celle, er et universalt trekk i cellebio-logi .
Et større sett av overveiende ukjente kontrollmekanismer styrer den like fordeling av de cellulære kromosomer til datterceller ved celledeling, da ulik fordeling av kromosomene vil føre til celledød, eller i det minste hva eukaryote celler angår, til en øket mulighet for alvorlige celleforstyrrelser.
Det er imidlertid ikke bare fordelingen av cellulære kromosomer som synes å være strengt regulert, da ekstrakromosomale genetiske elementer (som hovedsakelig kan betraktes som minikromosomer) av prokaryote, såvel som eukaryote, celler kan opprettholdes stabilt i cellepopulasjoner. Utviklingen av plasmider gjennom utvekslingen av genetisk informasjon med vertscellegeno-mer kan tyde på en kromosomal opprinnelse av den genetiske informasjon som styrer den like fordeling av fritt replikerende molekyler, særlig de molekyler som foreligger i svært få kopier pr. celle eller pr. seksjon (organell). Slike formodede kromosomale forfedre behøver ikke tjene et lignende formål med hensyn til problemet med kromosomfordeling, skjønt dette er en tanta-lisk mulighet.
Det skal bemerkes at de naturlig forekommende bakterielle plasmider (f.eks. R1) som foreligger i 1-2 kopier pr. bakterielt genom, står overfor et fordelingsproblem av samme størrelses-orden som det bakterielle kromosom. Dette innebærer at strin-gente kontrollmekanismer må foreligge for å sikre den stabile opprettholdelse av slike plasmider i populasjonen, selv i fravær av et ytre seleksjonstrykk som begunstiger overlevelsen av de celler som bærer plasmidet.
Kontrollmekanismer for plasmidreplikasjon styrer plasmidkonsen-trasjonen i voksende celler, men uten en ordnet fordeling av plasmidmolekylene blant dattercellene ved celledeling vil muligheten for at celledeling skal føre til en plasmidfri celle være svært stor, særlig for plasmider som foreligger i bare 1-2 kopier pr. bakteriegenom. Opprettholdelsesfunksjoner som styrer den ordnede fordeling av replikoner er blitt betegnet forde-lingsfunksj oner.
En alternativ replikonstabiliserende funksjon som kodes for av ccd-lokuset av plasmid F (Ogura og Hiraga, Proe. Nati. Acad. Sei., 80, 1983, 4784-4788) ble vist å innbefatte hindring av celledeling i en situasjon hvor bare én kopi av F-plasmidet forelå på tidspunktet for celledelingen.
I eukaryote celler kan lignende stabilitetsfunksjoner som påvirker fritt replikerende molekyler påtreffes i tre forskjellige situasjoner. For det første har genomene av flere naturlig forekommende vira som er istand til å infisere eukaryote celler potensialet for å eksistere i en plasmid tilstand, skjønt det naturlige forløp for virusinfeksjonen kan hindre at dette finner sted. Plasmide genomer kan finnes i celler infisert med f.eks. Epstein-Barr virus, SV40 og polyomavira, papillomvira og visse retrovira, særlig HTLVTII, som forbindes med det tilegnede immundefektsyndrom og Visnavirus, som skriver seg fra sauer. Flere av disse vira kan brukes som genvektorer i eukaryote celler.
For det andre kan spesifikke områder fra eukaryote kromosomer, f.eks. av menneskelig opprinnelse, finnes som naturlig forekommende ekstrakromosomait replikerende mikrokromosomer ("double minutes") som opprettholdes stabilt under vekst, idet antall kopier ligger i området fra noen ganske få til flere hundre. Ved bruk av et gjærplasmid som ikke kunne replikere i Saccharomyces cerevisiae, ble autonomt replikerende sekvenser (ars) identifisert ved innsetting i plasmidet av fragmenter av kromosomalt DNA fra forskjellige kilder, f.eks. gjær, Drosophila og Zea mays (Stinchcomb, D.T. et al, Proe. Nati. Sei., 77. 1930, pp. 4559-4563), og slike autonomt replikerende sekvenser kan brukes til å skape nye replikoner for en rekke forskjellige celler, men det kritiske punkt er graden i hvilken slike replikoner kan opprettholdes stabilt i cellepopulasjonen uten ytre seleksjonstrykk. For det tredje er to typer organeller, mitokondria og plantekloroplaster, stort sett selvfornyende organeller som inneholder sitt eget strengt adskilte genom, og ved organell deling må hver nydannet organell forsynes med minst én kopi av organellgenomet for å fungere. De fleste mitokondriale arter inneholder fra 5-20 genomer, hvilket følgelig representerer et genomfordelingsprob-lem lignende det for bakterielle plasmider med lavt eller mellomliggende kopitall, og tilsynekomsten av genomfrie organeller kan ventes å finne sted ved høy hyppighet, hvilket fører til tilsynekomsten av ikke-funksjonelle organeller dersom fordelingen ikke er strengt regulert. Dette forventede tap av mitokondria ved ulik genomfordeling kan kompenseres for ved det faktum at de fleste celletyper inneholder et stort antall mitokondria. En mekanisme som sikrer den stabile opprettholdelse i populasjonen av mitokondria av genetisk informasjon innført i mitokondria ved en genvektor kan vise seg nyttig i forsøk på å manipulere genetisk visse planteceller (Levings III, C.S. og Fring, D.R., i Genetic Engineering, 1, ed., J.K. Setlow og A. Hollaender, Plenum Press, 1979, pp. 205-222). I plantekloroplaster varierer antallet kloroplastgenomer fra 20-80, det vil si en situasjon som ligner på den for det høye kopiantall plasmider i bakterier, og videre, i de fleste planteceller er antallet kloroplaster høyt. I Chlamydomonas foreligger imidlertid bare to kloroplaster pr. celle, og til tross for nærværet av 80 kopier av kloroplastgenomer i hver, er en høy grad stabilitet nødvendig for å sikre den stabile opprettholdelse av kloroplastgenomet. Genetiske manipulasjoner i høyere planter kan være mulig ved bruk av plantekloroplaster (Bogorad, L., i Genetic Engineering, 1, ed. J.K. Setlow og A. Hollaender, Plenum Press, 1979, pp. 181-204).
Den økende interesse for vektorer konstruert for å tillate ekspresjon av fremmede gener i eukaryote celler gjør kontroll-mekanismene som inngår i genomopprettholdelse i eukaryote cellepopulasjoner et viktig forskningsmål.
Den strategi som er utviklet av oppfinnerene har gått ut på å trekke ut den utstrakte kunnskap om de konsepter som inngår i plasmidstabilisering fra et veldefinert system i E. coli, R1-plasmidet og å forsøke ekstrapolering til 1 ) andre replikoner,
2) andre ubeslektede bakterier og 3) eukaryote systemer.
Den nåværende interesse for replikonfordelingsfunksjoner har oppstått fra ustabilitetsproblemer som man ofte støter på når rekombinant DNA-teknikker benyttes i industriell målestokk.
I prokaryote systemer har konstruksjonen av kloningsvektorer fra naturlig forekommende plasmider først og fremst fokusert på oppnåelse av et høyt kopitall som, i en viss utstrekning, også tjener til å opprettholde plasmidet stabilt i en populasjon, da muligheten for at en plasmidfri celle skal dukke opp på grunn av tilfeldig fordeling av plasmidmolekyler er redusert. Det er godt dokumentert i prokaryote, såvel som eukaryote systemer, at innsettingen av fremmed DNA inn i mange ellers stabile kloningsvektorer kan omdanne disse til svært ustabile rekombinante plasmider. Dette kan skyldes en reduksjon i kopitallet, eller vekstinhiberende virkninger av det eller de produkter som kodes for ved det innsatte DNA. Da muligheten for å anvende ytre seleksjonstrykk, det vil si på positiv måte velge plasmidbærende celler, er temmelig begrenset under dyrking i industriell målestokksynes det å være påkrevet å kunne manipulere stabili-tetsfenotypen av vektoren.
Et skritt videre i retning av en forbedret forståelse av den stabile opprettholdelse av plasmider i vertsceller var den oppdagelse at parB-området av plasmidet R1 kan omdanne ustabile rekombinante plasmider som ikke er beslektet med RI til stabilt arvede plasmider som opprettholdes i E. coli-populasjonen i hundrevis av generasjoner uten noe ytre seleksjonstrykk (se internasjonal patentsøknad PCT/DK83/00086, publikasjonsnummer WO84/01172). Stabiliseringen av plasmider ved hjelp av parB-regionen antydet en anvendelighet av de resulterende vektorer i produksjon i stor målestokk som anvender genetisk manipulerte bakterier, da ikke noe ytre seleksjonstrykk er nødvendig for å sikre opprettholdelsen av plasmidet under dyrkingen i stor målestokk.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse angår blant annet replikoner som bærer genetisk informasjon som er ansvarlig for den stabile opprettholdelse av replikonet i en cellepopulasjon, hvilken informasjon er enten nativ for et gitt replikon eller bæres på et innsatt fragment eller fragmenter av nukleinsyre, idet replikonene dessuten kan bære ett eller flere innsatte gener som ikke er naturlig beslektet med replikonene.
parB-stabiliseringen er en meget virksom replikonstabiliserings-mekanisme som har den fordel at hele mekanismen uttrykkes fra en sekvens som foreligger på ett og samme replikon. Oppfinnerne har derfor søkt etter parB-lignende stabiliserende funksjoner blant plasmider med de samme stabilitetsproblerner som R1 , og for formodede forfedre til R1-plasmidstabilitetssystemene i det kromosomale DNA av S. coli og av andre prokaryote samt eukaryote organismer, idet det endelige mål er å velge eller konstruere fra slik genetisk informasjon, stabilitetsregulerende systemer som er operative i en gitt organisme. Som vist ved de opprinnelige resultater av dette forskningsarbeid som er beskrevet nedenunder, er stabilisering ved parB funnet å være en indika-sjon på en generell og meget effektiv replikonstabiliserings-mekanisme som det kan være mulig å etablere i en rekke forskjellige levende celler.
Oppfinnelsen er basert på disse oppdagelser og angår i ett henseende et replikon som, når det inneholdes i en celle, uttrykker et produkt som kan drepe cellen eller dets avkom (eller en forløper for produktet) og som videre uttrykker en antagonist for det drepende produkt (eller en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for det drepende produkt) i celler som inneholder replikonet, mens aritagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellene, slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at det celledrepende produkt såvel som antagonisten for dette ikke kodes for ved R1 parB-området når replikonet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier.
Selve parB-området er tidligere beskrevet i f.eks. internasjonal patentsøknad nummer PCT/DK83/00086, publikasjonsnummer W084/- 01172, i forbindelse med påvisning av den stabile opprettholdelse av en rekke forskjellige plasmider som replikerer i gramnegative bakterier. Som vist i denne patentsøknad antok man at den stabiliserende virkning kunne tilskrives en fordelingsfunksjon uttrykt fra parB-området. Denne fordelingsfunksjon virket tilsynelatende ved en mekanisme som sikret den ordnede fordeling av plasmidmolekylene mellom dattercellene ved celledeling. Nyere forskning har vist at par3-området er meget effektivt med hensyn til å stabilisere mange forskjellige typer ustabilt arvede plasmider som da svært sjelden går tapt fra populasjonen i fravær av seleksjonstrykk. Den stabiliserende virkning ble videre vist å være uavhengig av plasmidreplikasjon, av grunnene for ustabiliteten og, i stor utstrekning, av bakterieverten.
Ytterligere forskning på strukturen og molekylmekanismen av parB har imidlertid overraskende vist et nytt stabiliseringsprinsipp som, slik det er angitt ovenfor, omfatter en celledrepende funksjon og en antagonist for dette. På basis av hybridiserings-forsøk som beskrevet nedenunder, antas det at det nye stabiliseringsprinsipp er aktivt i de fleste, om ikke alle typer celler, og har den fordel at det er meget allsidig, hvilket betyr at det kan anvendes til å stabilisere mange forskjellige typer replikon som kan være ustabilt opprettholdt av mange forskjellige grunner.
I den foreliggende sammenheng betegner uttrykket "replikon" et segment av nukleinsyre (DNA eller RNA) som kan replikere autonomt i en gitt vertscelle eller et gitt område av vertsceller. Således kan replikonet f.eks. være et bakterielt plasmid, et bakterielt virus, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid (RNA eller DNA), et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted (origin of replication), et eukaryot mitokondrisk
DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplast DNA-molekyl.
For de fleste praktiske formål i den tekniske utnyttelse av oppfinnelsen vil replikonet ikke være et nativt replikon, men vil være et replikon som inneholder én eller flere innsatte nukleotidsekvenser som ikke er naturlig beslektet med replikonet, og som er blitt satt inn i replikonet ved en hvilken som helst rekombinant DNA-teknikk som er nødvendig for det aktuelle replikon og den type nukleotidsekvens som skal innsettes (uttrykket "innsatt" orn et gen eller et fragment av nukleinsyre angir at genet eller fragmentet av nukleinsyre er blitt innført i replikonet på et trinn under konstruksjonen av det endelige replikon). Den innsatte nukleotidsekvens eller -sekvenser kan f.eks. være en DNA-sekvens inneholdende et gen som uttrykket et produkt som det er ønskelig å produsere ved en cellekultur, f.eks. bakterier inneholdende replikonet, f.eks. et plasmid. Slike produkter omfatter en rekke forskjellige produkter for medisinske eller tekniske formål, særlig polypeptider og proteiner eller fragmenter derav, enzymer og ikke-proteinholdige produkter fra reaksjoner av enzymer med en forbindelse i næringsmediet, hormoner og andre lavmolekylære produkter. Produkter av eukaryote gener, særlig pattedyrgener, er av særlig interesse. Replikonet kan imidlertid også være et ikke tidligere isolert replikon i sin naturlige tilstand, forutsatt at replikonet er nyttig enten som en vektor (inn i hvilken et ikke-nativt gen kan være innsatt med henblikk på å høste det aktuelle genprodukt fra en cellekultur som inneholder replikonet inneholdende det innsatte gen), eller som et produksjonsreplikon dersom replikonet selv uttrykket et verdifullt produkt.
En søking etter områder analoge med par3 i andre systemer har overraskende bragt på det rene at det eksisterer sekvenser homologe med parB i mange forskjellige plasmider, bakterielle genomer og til og med i eukaryote celler, og den molekylære mekanisme bak den stabiliserende virkning som beskrevet nedenunder danner et solid grunnlag for den antagelse at et sentralt cellulært mål muligens bevart i alle celler, reagerer med et genprodukt fra disse homologe sekvenser (muligens bevart i alle celler) ifølge det samme eller et lignende prinsipp, slik at de parB homologe sekvenser kan benyttes direkte eller etter forholdsvis enkle genetiske manipulasjoner som fører til konstruksjonen av parB-lignende stabiliserende områder, for å stabilisere en hvilken som helst gitt type replikon i mange forskjellige organismer. I de angitte arbeidseksempler er beviset for dette resonnement gitt.
I den foreliggende sammenheng angir uttrykket "forløper" et produkt som, under de betingelser som råder i cellen ved det aktuelle tidspunkt, enten direkte eller indirekte gir opphav til det produkt hvis nærvær fører til den aktuelle funksjon (enten drepefunksjonen eller antagonistfunksjonen).
Den giftige substans kan være et-protein eller en forløper for dette, slik som et pre-protein som må modifiseres enten ved proteolytisk kløyving eller ved tilføyelse av en funksjonell gruppe (innbefattet en fettsyrerest) for å bli giftig, eller et mRNA hvis translasjon fører til et giftig protein.
Antagonisten kan være et genprodukt, enten RNA eller protein,
som undertrykker aktiviteten av den giftige substans ved direkte kombinasjon med denne eller ved å virke forstyrrende inn på dets mål i cellen, eller den kan være en som undertrykker omsettingen av forløpere for det giftige produkt, det vil si pre-protein,
eller translasjonen av mRNA i det egentlige giftige produkt.
I de fleste eller alle levende celler er der gener hvis produkter, når de blir betydelig overuttrykt, vil være dødelige eller veksthindrende for cellen, og som derfor kan anvendes til replikonstabilisering på den måte som er beskrevet ovenfor.
Den mekanisme som nå er funnet å utøves ved R1 parB-området er en drepe/antagonist-mekanisme av den ovenfor angitte type. Således er mekanismen basert på produkter som uttrykkes fra to gener som foreligger inne i R1 parB-området, et gen (R1 parB hok-genet, som beskrevet nedenunder) uttrykker et produkt som er i stand til å drepe cellen, og et andre gen (R1 parB sok-genet, som beskrevet nedenunder) uttrykker et produkt som motvirker hok-genproduktet i celler som inneholder et replikon fra hvilket R1 par3-genene uttrykkes, mens på den annen side i fravær av fortsatt ekspresjon av antagonisten, f.eks. forårsaket ved tap av replikonet, avtar antagonistaktiviteten slik at det drepende produkt (som har en lengre halveringstid i cellen enn antagonisten) ikke lenger undertrykkes av antagonisten (dvs. translasjonen av det mRNA som koder for det drepende produkt blir ikke lenger hindret). Det er åpenbart at denne type mekanisme fører til død for celler som har tapt det replikon fra hvilket antagonistfunksjonen uttrykkes for å sikre at populasjonen av cellene ikke inneholder formerende celler som ikke har replikonet, hvilket i sin tur medfører at de levende og formerende celler av populasjonen vil være celler som inneholder replikonet; på denne måte sikres den stabile opprettholdelse av replikonet i populasjonen.
Som et resultat av ytterligere forskning inn i parB-formidlet stabilisering, ble det overraskende funnet at mekanismen som styrer den stabile opprettholdelse av et replikon i en cellepopulasjon innebærer den styrte ekspresjon av en vertscelledrepende funksjon. Stabiliseringsmekanismer som omfatter den styrte ekspresjon av en vertscelledrepende funksjon er blitt beskrevet tidligere, men i alle kjente tilfeller har de omfattet en separasjon av det gen som koder for antagonisten (f.eks. på et plasmid) fra det gen som koder for det giftige produkt (f.eks. på kromosomet), og drepefunksjonen er blitt begrenset til en eller noen meget få organismer (se f.eks. Europapatent-søknad nr. 82306207.0, publikasjonsnr. 0.080.848).
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det ovenfor angitte prinsipp som ligger til grunn for f.eks. R1 parB-plasmidstabiliseringsfunksjonen anvendelig på et vidt område replikoner og følgelig i et vidt område vertsceller, prokaryote såvel som eukaryote, som en metode til å oppnå stabil opprettholdelse av det aktuelle replikon i en gitt cellepopulasjon.
To sider ved parB-systemet er svært viktige for 1) den generelle anvendelighet av denne type stabiliseringssystem i levende celler og 2) muligheten for å konstruere stabiliseringssystemer svarende til parB-systemet som kan fungere i et vidt spektrum
organismer:
1 . Den uventede oppdagelse av homologe sekvenser i de fleste/- alie bakterier, samt i forskjellige eukaryote organismer, som stemmer overens med den antagelse at målet for den dødelige funksjon av hok-produktet er fundamentalt for de fleste, om ikke alle, levende celler. 2. Den unike beskaffenhet av styringsmekanismen som sikrer overlevelsen av alle plasmidbærende celler, og den hurtige dreping av eventuelle plasmidfrie celler som forekommer. Basert på genetisk bevismateriale antas det at den faktiske sok-kodede regulatorsubstans er et RNA-molekyl som hindrer translasjon av hok-kodet mRNA. Dersom man antar at det sok-kodede RNA er mer ustabilt enn hok-kodet mRNA vil inhibi-sjonen av translasjonen av det hok-kodede mRNA gradvis avta i en celle som har tapt parB<+->plasmidet, og det hok-kodede protein vil til slutt drepe cellen.
På grunnlag av disse antagelser tenker man seg at
i) parB-området, eller et hvilket som helst meget likt område som fås fra replikon andre enn R1, som innbefatter både hok- og sok-gener, eller analoger av disse, bør stabilisere opprettholdelsen i alle typer bakterier av alle typer plasmider som det settes inn i. Dette er blitt bekreftet, da mange forskjellige plasmider er blitt stabilisert mer enn hundre ganger i E. coli etter innsettingen av parB, og i en bakterie som fylogenetisk er meget langt fra E. coli, såsom Pseudomonas putida, ble parB-området funnet å være like virkningsfullt som i E. coli.
ii) Plasmider andre enn R1 fra bakterier andre enn E. coli kan bære sekvenser som er stort sett homologe med parB. Det er sannsynlig at slike sekvenser kan benyttes på samme måte for plasmidstabiliseringsformål. Tankegangen bak dette er at hok-genet er homologt med et kromosomalt RelB-orf3-gen som uttrykker et produkt hvis aktivitet er identisk med den for hok-genet, noe som understøtter den teori at genet har
flyttet over (transposed) fra kromosomet til plasmidet, hvor det til slutt utviklet seg til parB-systemet. Dette gjør det rimelig å anta at den samme prosess også kan ha funnet sted i andre replikon. Hybridiseringsforsøkene tyder sterkt på at dette i virkeligheten er tilfellet, da forskjellige plasmider ubeslektet med R1, samt kromosomalt DNA fra bakterier andre enn E. coli bærer parB-homologe sekvenser.
Det skal bemerkes at en kromosomal sekvens fra E. coli som er 55 prosent homolog med parB innenfor det hok-kodende område, men likevel upåviselig ved hybridisering med den parB-probe som ble brukt, gir en Hok-fenotype som bekrefter de ovenfor angitte påstander.
iii) Det vil være mulig å konstruere et parB-lignende system ved at man først isolerer hok-gen-analogen fra enten et plasmid eller et kromosom, fulgt av overlegning (superimposing) av en styringsløkke lignende den som er representert ved sok i parB; konstruksjonen kan utføres ved innsetting av en kort syntetisk DNA-sekvens (innbefattende en promotor) som, når den transkriberes, uttrykker en liten antisans-RNA (antisense-RNA) som er komplementær til den del av hok-mRNA eller hok-analogt mRNA som inneholder ribosombindingssetet. Paring av antisans-RNA til mRNA hindrer translasjon av mRNA og følgelig celledød. Flere forskjellige slike naturlige reguleringssystemer (hvor et antisans-RNA hindrer translasjonen av et mRNA) er tidligere blitt beskrevet f.eks. av Light og Molin, The EMBO Journal 2, nr. 1, 1983, pp. 93-98, og kunstige systemer som ligner på det som er foreslått ovenfor er også blitt benyttet med hell. Således er den foreslåtte strategi logisk og realistisk og kan anvendes på f.eks. alle kjente bakterier.
I henhold til den forklaring som er gitt ovenfor kan replikonene ifølge oppfinnelsen være replikoner som vedrører mange forskjellige typer celler, såsom et bakterielt plasmid, et bakterielt virus, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid (RNA eller DNA), et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eurkaryot mitokondrisk DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplast DNA-molekyl. På samme måte kan sekvensen i replikonet som spesifiserer det drepende produkt passende være en sekvens fra et tilsvarende system, såsom fra et bakterielt plasmid, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid, et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eukaryot mitokondrisk DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplast DNA-molekyl.
På samme måte kan sekvensen som koder for antagonisten for det drepende produkt fås fra et bakterielt plasmid, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid, et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eukaryot mitokondrisk DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplastmolekyl, eller den kan være en syntetisk sekvens.
Interessante replikoner i henhold til oppfinnelsen er replikoner som bærer sekvenser som opererer analogt med R1 parB-systemet, slik at når de inneholdes i en celle uttrykker de et messenger-RNA som koder for et produkt som kan drepe cellen eller dens avkom og videre uttrykke en antagonist som hindrer translasjonen av messenger-RNA i celler som inneholder replikoner. Når replikonene tapes fra cellen, blir antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger kontinuerlig uttrykt, og dens aktivitet avtar, slik at translasjonen av messenger-RNA som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger hindres av antagonisten. Blant disse interessante replikoner er replikoner som uttrykker et antisans-RNA-molekyl som virker som antagonisten, hvilket gjennom baseparing til i det minste en del av det messenger-RNA som koder for det celledrepende produkt hindrer translasjon av dette messenger-RNA.
I henhold til hva som er angitt ovenfor, er spesielt interessante utførelsesformer for oppfinnelsen replikoner som er DNA-molekyler omfattende en sekvens som koder for et produkt (eller en forløper for produktet) som er i stand til å drepe cellen eller dets avkom på en måte som er identisk med eller analog med den for produktet (eller forløperen) uttrykt ved R1 parB hok-genet. Slike replikon omfatter videre en sekvens som koder for en antagonist som fungerer på en måte som er identisk med eller analog med den antagonist som uttrykkes ved R1 parB sok-genet. Således, i noen replikon i henhold til oppfinnelsen, særlig bakterielle plasmider, kan R1 parB-området anvendes som sådant for å sikre opprettholdelsen av replikonet, eller det kan på passende måte modifiseres for å sikre riktig ekspresjon av dets hok- og sok-gener i den aktuelle vertsbakterie, f.eks. ved passende forandringer i promotorene, fra hvilke disse gener transkriberes.
Alternativt kan et fragment av nukleinsyre som uttrykker en mekanisme som sikrer replikonopprettholdelse i en populasjon på en måte som er identisk med eller analog med den ovenfor angitte mekanisme delvis eller fullstendig fås fra DNA eller RNA som er mer nært beslektet med den aktuelle vertscelle. En anbefalt strategi er å velge fra genomet av en gitt vertscelle eller fra DNA eller RNA av replikoner som inneholdes i vertscellen, slike nukleinsyresekvenser som er homologe med R1 hok-genet, eller med et hvilket som helst gen homologt med R1 hok, som når det uttrykkes kan drepe vertscellen fra hvilken genet er blitt isolert. Slike sekvenser kan benyttes i forsøk konstruert for å teste for nærværet av hok- og sok-lignende aktiviteter i den aktuelle vertscelle. Dersom begge aktiviteter blir funnet, antyder dette nærværet av et nyttig replikonstabiliserende område innenfor de isolerte sekvenser, mens dersom bare en hokgen-lignende aktivitet blir funnet, er det mulig å konstruere den nødvendige reguleringsløkke (det vil si antagonisten) i henhold til den strategi som er antydet ovenfor, hvorved en potensiell celledrepende funksjon omdannes til en potensielt nyttig replikonstabiliserende funksjon.
Den sekvens som uttrykker det produkt som er istand til å drepe cellen eller dets avkom, kan innsettes separat fra den sekvens som uttrykker antagonisten, eller de to sekvenser kan foreligge på ett nukleinsyrefragment, hvilket er tilfelle med f.eks. et DNA-fragment omfattende R1 parB-området. Nukleinsyrefragmentet kan innsettes i replikonet ved en hvilken som helst rekombinant DNA-teknikk som er egnet for den aktuelle type replikon og for den type nukleinsyre som omfatter stabiliseringsfunksjonen.
En side ved oppfinnelsen angår således et DNA-fragment omfattende en sekvens som koder for et produkt som kan drepe en celle eller avkommet av en celle som inneholder et replikon som bærer det nevnte fragment (eller koder for en forløper for produktet), og en sekvens som koder for en antagonist for det drepende produkt (eller koder for en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for det drepende produkt) i celler som inneholder replikonet, mens antagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellen, slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at DNA-fragmentet ikke omfatter R1 parB-området når replikonet som bærer fragmentet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier. En interessant utførelsesform av denne side utgjøres ved et DNA-fragment som omfatter en sekvens som koder for et messenger-RNA for et produkt som kan drepe cellen eller avkommet av cellen inneholdende det replikon som bærer det nevnte fragment (eller koder for en forløper for produktet), og en sekvens som koder for en antagonist som hindrer translasjonen av messenger-RNA i celler som inneholder replikonet. Når -replikonet tapes fra cellen, blir antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger kontinuerlig uttrykt, og dens aktivitet avtar, slik at translasjonen av messenger-RNA som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten.
Oppfinnelsen angår også en levende celle inneholdende et replikon som angitt ovenfor, og en cellekultur inneholdende en slik levende celle. Cellen kan være en bakterie, en éncellet eukaryot organisme, en dyrecelle eller en plantecelle.
Skjønt det i henhold til oppfinnelsen er mest fordelaktig å skaffe drepefunksjonen og antagonisten for denne på det samme replikon, da dette sikrer en lettere anvendelse av stabilise- ringsprinsippet ifølge oppfinnelsen, kan det videre tenkes at de sekvenser som koder for henholdsvis Hok- og Sok-genproduktene eller sekvenser homologe med disse kan innsettes på separate replikon på en slik måte at den stabiliserende funksjon ifølge oppfinnelsen uttrykkes når replikonene innføres i en vertscelle. For å få riktig ekspresjon kan det være nødvendig å modifisere på egnet måte promotorsekvensene av det ene eller begge genene. Således angår en annen side ved oppfinnelsen en levende celle som inneholder et replikon som omfatter R1 parB hok-genet eller en sekvens som er homolog med dette, og et annet replikon som omfatter R1 parB sok-genet eller en sekvens som er homolog med dette. Det skal bemerkes at i den foreliggende sammenheng skal man med uttrykket "sekvens homolog med dette" forstå en sekvens som er enten homolog med et av parB-genene selv eller homolog med en hvilken som helst sekvens som er homolog med et av parB-genene.
I prinsipp kan hok- og sok-genene eller de homologe sekvenser foreligge på hvilke som helst to forskjellige replikon, forutsatt at disse kan eksistere sammen i forenlighet i den samme celle. Hok-genet eller det hok-homologe gen foreligger imidlertid fortrinnsvis på et replikon som i seg selv opprettholdes stabilt i cellen, såsom et kromosom, mens sok-genet eller det sok-homologe gen mest fordelaktig innsettes på det replikon, hvis stabile opprettholdelse ønskes, det vil si typisk det replikon som uttrykker det ønskede genprodukt. Det replikon som bærer sok-genet eller det sok-homologe gen er derfor vanligvis en ekstrakromosomal autonomt replikerende nukleotidsekvens, f.eks. et plasmid. Tap av replikonet som bærer sok-genet eller det sok-homologe gen fra cellen, slik at sok-genprodukteL ikke lenger kontinuerlig uttrykkes, bevirker celledød i henhold til de prinsipper som er beskrevet ovenfor, hvilket betyr at bare celler som inneholder dette replikon er levedyktige.
Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte til fremstilling av et stabilisert replikon som angitt ovenfor, hvilken fremgangsmåte omfatter å innsette i et replikon en sekvens som koder for et produkt som kan drepe en celle som inneholder replikonet eller avkommet av cellen (eller koder for en forløper for det drepende produkt), og en sekvens som koder for en antagonist for det drepende produkt (eller som koder for en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for produktet) i celler som inneholder replikonet, mens antagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellen, slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at det celledrepende produkt, såvel som antagonisten for dette, ikke er kodet for ved R1 parB-området når replikonet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier.
I henhold til den ovenfor angitte forklaring, kan sekvensen eller sekvensene som innsettes være sekvens eller sekvenser av DNA (eller, der hvor det er aktuelt, RNA) som har sin opprinnelse fra en celle som er beslektet med replikonet, særlig en sekvens eller sekvenser som er homologe med R1 parB-området, eller sekvensen eller sekvensene kan ha sin opprinnelse fra R1 parB-området, muligens med modifiserte promotorfunksjoner for å tilpasse sekvensen den spesielle celletype hvor replikonet skal inneholdes.
Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte til fremstilling av et genprodukt som er kodet for ved en nukleinsyresekvens, hvilken fremgangsmåte omfatter å dyrke celler som inneholder et replikon som angitt ovenfor, og høsting av et genprodukt uttrykt fra replikonet. Dyrkingen bør utføres i et næringsmedium som er egnet for den aktuelle celletype, det vil si et medium inneholdende de nødvendige næringsstoffer for denne celletype. Dyringen vil normalt utføres for et stort antall generasjoner, f.eks. mer enn 100, for å oppnå en tilstrekkelig produksjon av det verdi-fulle produkt som kodes for av nukleinsyresekvensen, og under denne dyrking vil tapet av replikonet avta dramatisk på grunn av den replikonstabiliserende funksjon som her er angitt sammenlignet med det tap som finner sted dersom ikke noen replikonstabiliserende mekanisme anvendes. Således er det realistisk å ha et tap av det stabiliserte replikon på mindre enn 10~<4>celler/gene rasjon, normalt mindre enn 10~<5>celler/generasjon, og ofte mindre enn 10~<6>celler/generasjon.
I alle de ovenfor angitte tilfeller er oppfinnelsen basert på evnen til nukleotidsekvenser, såsom parB eller parB-lignende sekvenser, til å formidle en fenotype med stabil opprettholdelse i en cellepopulasjon av et replikon som bærer sekvensene. De stabiliseringsformidlende sekvenser bør settes inn i replikonet på en slik måte at drepefunksjonen og antagonistfunksjonen som kodes for ved f.eks. hok- eller hoklignende og sok- eller soklignende gener uttrykkes. For at de skal være virksomme, kan det være en fordel å velge sekvensene i henhold til den type vertscelle som er involvert, f.eks. bakterier, gjær, mugg, dyreceller eller planteceller, og det kan være nødvendig å modifisere eller på kunstig måte gjenskape den riktige regule-ringsløkke, f.eks. sok-reguleringsløkken eller den soklignende reguleringsløkke. Den resulterende stabiliseringsmekanisme vil operere i henhold til de prinsipper som er beskrevet ovenfor, særlig på en måte som er analog med den mekanisme som er forklart for R1 parB. Da det sentrale punkt i replikonstabili-seringsmekanismen er at celler som har mistet replikonet blir drept av det drepende produkt, det vil si hok-genproduktet, har den foreliggende oppfinnelse den viktige industrielle nytte på grunn av den beskrevne replikonstabiliserende mekanismes uavhengighet overfor noe som helst ytre seleksjonstrykk, det vil si tilsetningen av spesielle næringsmidler, antibiotika eller andre forandringer i celleomgivelsene under dyrking i stor målestokk av celler som omfatter flere generasjoner av cellefor-mering.
En annen viktig fordel ved den foreliggende oppfinnelse er uavhengigheten av den beskrevne replikonstabiliserende mekanisme overfor hvilke som helst spesielle kombinasjoner av vertscelle og replikonvektor som er nødvendig i det system som er beskrevet i Europapatentsøknad nr. 82306207.0, publikasjonsnr. 0.080.848. I den tekniske utnyttelse av den foreliggende oppfinnelse kan derfor et vidt spektrum av replikon/vertscellesystemer betraktes. Den generelle strategi for dannelse av et replikonopprett-holdende system, f.eks. et system som er identisk med eller analogt med R1 parB-systemet, er blitt beskrevet ovenfor og skal eksemplifiseres som følger.
1. Gramnegative og grampositive bakterier
Egnede replikon i bakterielle vertsceller kan f.eks. være plasmider som kan replikere i Enterobacteriaceae, f.eks. pBR322 eller R1 løpske (runaway) replikasjonsplasmider (Europapatent-søknad nr. 83305438.0, publikasjonsnr. 0.109.150), eller som er istand til å replikere i gramnegative bakterier generelt, det vil si plasmider avledet fra RSF1010 (Bagdasarian et al, Gene 16, 1981, pp. 237-242), eller plasmider som kan replikere i grampositive bakterier, såsom B. subtilis, f.eks. pC194 og pUB110 (Lovett and Keggins, Meth. in Enzymol. 68, 1979, pp. 342-357), som alle kan være ustabilt nedarvet når de benyttes som kloningsvektorer. For å stabilisere slike bakterielle plasmider ved en parB-lignende mekanisme, kan et DNA-fragment eller DNA-fragmenter omfattende R1 parB-området innsettes i replikonet på en slik måte at R1 hok- og -sok-ekspresjonen transkriberes fra de native promotorer for R1 parB. Dersom R1 hok- og -sok-genene ikke transkriberes fra disse native promotorer i den aktuelle vertscelle, f.eks. på grunn av forskjeller i promotorsekvens-behov mellom E. coli og andre bakterier, kan de native promotor-sekvenser av R1 parB erstattes av promotorer som er kjent for å kunne gjenkjennes i den aktuelle vertscelle, slike promotorer er enten naturlige promotorer eller syntetiske promotorer, såsom 3P02-fagpromotoren som er aktiv i B. subtilis (Williams et al, Gene 16, 1981, pp. 199-206). Dersom R1 hok-genproduktet ikke er dødelig for den aktuelle vertscelle - et absolutt krav for å etablere replikonstabilisasjonsfunksjonen for R1 parB - kan en R1 hok analog sekvens isoleres fra enten genomet av den aktuelle vertscelle (eller en nær beslektet bakterieart), eller fra et plasmid som forekommer naturlig i den aktuelle vertscelle (eller en nær beslektet bakterieart) og deretter testes for celledrepende aktivitet på en måte lignende den som er beskrevet i eksemplene for en E. coli kromosomal homolog av R1 parB, fulgt av konstruksjonen av en styringsløkke som regulerer ekspresjonen av den nylig isolerte parB-homolog for å danne et replikonstabiliserende system som er spesielt tilpasset den vertscelle som er involvert når det konstruerte stykke (construct) settes inn i det aktuelle replikon.
Bruken av hok/sok-systemet eller et system analogt med hok/sok-systemet i bakterier omfatter således: en egnet utvelgelse av replikon og vertscelle, innsetting i replikonet av den riktige sekvens omfattende et hok/sok-system eller et system analogt med hok/sok-systemet som uttrykkes i den valgte vertscelle, innsetting i det stabiliserte replikon av et gen eller gener som koder for et eller flere nyttige produkter som skal produseres i stor målestokk, innføring av det stabiliserte rekombinante replikon i den bakterielle vertscelle ved standardteknikker for bakteriell transformasjon, dyrking av de replikonholdige vertsceller i et dyrkingsmedium supplert med de nødvendige næringsstoffer for flere generasjoner, f.eks. mer enn 100 som er nødvendig for oppnåelse av den ønskede celletetthet, og til slutt høsting av cellene og mediet, fra hvilke som helst det resulterende produkt kan isoleres. Det skal understrekes at den mekanisme for replikonstabiliserina som den foreliggende oppfinnelse angår, ikke krever noen manipulering av kulturen under dyrking for å sikre opprettholdelsen av det stabiliserte replikon i populasjonen, da celler fra hvilke replikonet går tapt blir drept av det hok eller hok-lignende produkt uttrykt i den replikonfrie celle.
2. Gjærceller
Den tekniske utnyttelse av rekombinante DNA-teknikker i eukaryote systemer kan være ønskelig for oppnåelse av slike post-translasjonelle modifikasjoner (spesifikke proteolytiske kløyvinger, glykosylering etc.) av primære (eukaryote) genpro-dukter, hvilke modifikasjoner enten ikke gjøres i bakterier i det hele tatt eller i beste fall bare gjøres på en suboptimal måte. En meget benyttet eukaryot organisme er gjæren Saccharomyces cerevisiae, hvor et naturlig forekommende plasmid, 2 \ ±-replikonet, er blitt tilpasset som en vektor for ekspresjonen av gener som ikke er naturlig beslektet med 2n-replikonet i Saccharomyces cerevisiae. Rekombinante DNA-molekyler omfattende 2u-replikonet med et eller flere innskudd av ikke-beslektede DNA-fragmenter er ofte funnet å være ustabilt nedarvet i gjærcellene. I henhold til de ovenfor skisserte prinsipper er det mulig å isolere eller konstruere en sekvens som skal innsettes i et gjærreplikon, f.eks. 2y.-replikonet, hvilken sekvens benytter prinsippet for replikonstabilisering ved hjelp av R1 parB for å stabilisere gjærplasmidet.
Skjønt det ikke er sannsynlig at de native promotorer av R1 hok-og -sok-genene vil være virkningsfulle i Saccharomyces cerevisiae-celler, gjør bevaringen av hok-lignende sekvenser over store utviklingsavstander, hvilket er antydet ved oppdagelsen av hok-homologe sekvenser i en rekke forskjellige organismer, at det er realistisk å utprøve produktet av R1 hok-genet og gener beslektet med R1 hok (f.eks. rel3-orf3 eller pari, eller andre gener som har sin opprinnelse fra bakterielle genomer og oppviser en homologi ved sekvensen og det funksjonelle nivå til R1 hok eller lignende gener isolert fra bakterielle plasmider) for dets evne til å drepe gjærceller, såsom Saccharomyces cerevisiae. I praksis vil dette medføre isolering av det kodende område av hok-genet eller hok-lignende gen og kobling (linking) av det kodende område til en egnet gjærcellepromotor, såsom TRF1-promotoren (Dobson et al, Nucleic Acids Res. 11, 1983, pp. 2287-2302), idet det resulterende replikon til slutt innføres i gjærceller i henhold til standardmetoder, og virkningen av ekspresjonen av hok eller hoklignende gen undersøkes. Dersom celledød resulterer, er et nyttig hok eller hok-lignende gen blitt identifisert.
Alternativt kan sekvenser identifisert i gjær-DNA fra gjær og homologe med parB eller reiB-orf3 isoleres, kobles til en passende gjærcellepromotor, innsettes i 2n-replikonet og, etter at det rekombinante replikon er blitt innført i Saccharomyces cerevisiae, utprøves for deres evne til å drepe cellen. Fra et hok-gen eller et hok-lignende gen som er vist å være giftig for gjær, som f.eks. Saccharomyces cerevisiae når det uttrykkes, kan et replikonstabiliserende system som er identisk eller analogt med R1 parB-systemet genereres, ved påleggelse av en regulerende løkke (f.eks. et sok-gen eller sok-lignende gen styrt av en passende gjærpromotor) som tidligere beskrevet i diskusjonen av den generelle strategi. Den resulterende gjær-hok/sok-sekvens eller hok/sok-lignende sekvens kan innsettes i et hvilket som helst gjærreplikon, f.eks. 2u-replikonet eller derivater derav, inn i hvilke gener som ikke er naturlig beslektet med 2n er blitt innsatt for det formål å oppnå ekspresjon av de innsatte gener for å sikre den stabile opprettholdelse av replikonet eller derivatene derav under dyrking. Det således stabiliserte replikon kan innføres i gjærceller, f.eks. Saccharomyces cerevisiae-celler, ved transformasjon eller protoplastfusjon, og etter seleksjon kan de celler som bærer det stabiliserte replikon dyrkes videre til en kultur i stor målestokk i et passende dyrkingsmedium supplert med de nødvendige næringsmidler. Ikke noe ytre seleksjonstrykk er nødvendig for å sikre replikonstabilisering, da celler fra hvilke replikonet går tapt drepes ved hok-produktet eller det hok-lignende produkt som uttrykkes i den replikonfrie celle. Kulturen som består bare av celler som inneholder replikonet blir deretter høstet, og et eventuelt nyttig produkt uttrykt fra replikonet kan isoleres fra enten gjærcellene eller dyrkingsmediet, avhengig av beskaffen-heten av genet og det aktuelle genprodukt.
3. Pattedyrceller
Behovet for spesielle post-translasjonelle modifikasjoner kan nødvendiggjøre ekspresjonen av visse eukaryote gener i pattedyrceller, det vil si av menneskelig eller animalsk opprinnelse, snarere enn i bakterier eller i éncellede eukaryote organismer. Replikoner som kan benyttes som kloningsvektorer i eukaryote celler fås fra kromosomer (ars-replikoner), fra DNA-vira, f.eks. SV40 og papillomavirus fra storfe, eller fra RNA-vira, f.eks. retrovira. De to DNA-vira som er nevnt kan opprettholdes i en plasmid tilstand i infiserte celler, mens de fleste retrovira (RNA-holdige vira) trenger å bli genetisk modifisert for å eksistere som fritt replikerende DNA-molekyler snarere enn kromosomalt integrerte kopier av det virale RNA-genom. Det kan ventes at de samme problemer med stabil opprettholdelse av det replikon som er involvert, slik det er beskrevet ovenfor, vil inntreffe under dyrking i stor målestokk av celler inneholdende de ovenfor nevnte replikoner inn i hvilke gener som ikke er naturlig beslektet med replikonet er blitt innsatt for å oppnå ekspresjon av et nyttig produkt.
En sekvens inneholdende et hok/sok-system eller et system analogt med hok/sok kan konstrueres på lignende måte som det som er beskrevet for gjærcellesystemet, straks et gen som utøver en hok- eller hoklignende virkning i den valgte vertscelle er blitt identifisert. Et første trinn ville således være å innsette kodingssekvensen av kjente hok- eller hoklignende gener uansett deres opprinnelse fra bakterielle genomer eller gjærcellegenomer i et replikon som kan replikere i vertscellen på en slik måte at ekspresjonen av hok-genet fås ved induksjon av ekspresjon. Dette betyr at sekvensene som koder for hok-produktet eller det hok-lignende produkt bør suppleres med alle nødvendige regulerende sekvenser som er nødvendig for ekspresjon av et gen i vertscellen. En promotorsekvens som er egnet til innsetting på oversiden av hok-genet eller det hok-lignende gen kan være svulstvirus LTR (long terminal repeat sequence) fra melkekjertel hos mus, som er induserbart med steoride hormoner. Dersom celledød finner sted når transkripsjonen induseres, er et hok-gen eller et hok-lignende gen blitt identifisert for den aktuelle vertscelle, og fra dette hok-gen eller hok-lignende gen kan et replikonstabiliserende system konstrueres ved pålegging av en reguleringsløkke, f.eks. sok-løkken eller den sok-lignende løkke som beskrevet ovenfor.
Dersom ingen av de tilgjengelige hok-gen eller hok-lignende gener av bakterie- eller gjæropprinnelse utøver en giftig virkning i de aktuelle pattedyrceller, kan nye hok-lignende sekvenser isoleres fra et pattedyrgenom (f.eks. de sekvenser som er oppdaget i Tetrahymena mitokondrisk DNA og i menneskelig cellulært DNA) og deretter utprøves for hok-lignende aktivitet når de er riktig uttrykt. Den anbefalte strategi for oppdagelse av nye hok-lignende sekvenser er blitt antydet ovenfor.
Bruken av den hok/sok-lignende stabiliseringsmekanisme i pattedyrceller omfatter således: valg av et egnet replikon, f.eks. en retrovirusvektor som kan eksistere som et fritt replikerende molekyl, slik det er blitt beskrevet for visse retrovira, og valg av vertsceller avhengig av de faktiske sekvenser som styrer ekspresjonen av de innsatte hok/sok-lignende gener; innsetting i det stabiliserte replikon av slike fremmede gener som koder for ett eller flere ønskede produkter som skal produseres inn i replikonet; innføring av det stabiliserte rekombinante replikon i den valgte pattedyr-cellelinje ved standardteknikker for DNA-transfeksjon eller mikroinjeksjon; seleksjon av celler inneholdende replikonet, dyrking av cellene i et dyrkningsmedium tilpasset cellelinjen som er involvert ved tilsetning av nødvendige næringsmidler og vekstfaktorer med henblikk på oppnåelse av en cellekultur i stor målestokk som uttrykker det gen som koder for det nyttige produkt; og til slutt høsting av kulturen og isolering av det ønskede produkt.
Det skal bemerkes at for et hvilket som helst gitt fragment som er vist å uttrykke en stabiliserende funksjon når det innsettes i et replikon, er det mulig å teste hvorvidt den resulterende stabile opprettholdelse av replikonet kan tilskrives en stabiliseringsmekanisme i henhold til den foreliggende oppfinnelse på følgende måte: Innsetting av fragmentet som uttrykker den stabiliserende funksjon som skal testes i en på visse betingelser (conditionally) replikerende vektor, såsom en rep(ts) vektor som kan replikere i en gitt type vertscelle, dyrking av cellene som inneholder vektoren under betingelser hvor vektoren ikke lenger replikerer, men hvor celledyrking fortsatt finner sted, slik at vektoren til slutt blir fortynnet ut av cellene, og bestemmelse av antallet levedyktige celler sammenlignet med en kontrollprøve som inneholder den samme vektor, men som imidlertid ikke bærer fragmentet. Dersom levedyktighetstallet er betydelig lavere enn for kontrollprøven, som et resultat av den gradvise avtagning av antagonisten i de vektorfrie celler, er en stabiliseringsmekanisme i henhold til oppfinnelsen blitt identifisert. Et eksempel på denne testfremgangsmåte er beskrevet i Gerdes et al, "Unique type of plasmid maintenance function: Postsegregational killing of plasmid-free cells", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 1986, pp. 3116-3120.
I forbindelse med utførelsen av denne test kan det også være mulig å utføre en hybridiseringstest for en mulig homologi av fragmentet til R1 parB eller en parB-homolog.
Skjønt spesielle typer replikon tilpasset til spesielle celletyper er blitt beskrevet i detalj ovenfor, er det generelle prinsipp for anvendelse av den stabiliserende mekanisme ifølge oppfinnelsen den samme, uansett typen replikon og celle som inneholder replikonet: opprettelsen på det samme replikon av en vertsdrepende funksjon og en antagonistfunksjon balansert slik at den undertrykker den vertsdrepende funksjon i celler som inneholder replikonet, som således sikrer stabiliseringen av replikonet i cellepopulasjonen.
Beskrivelse av tegningen
Oppfinnelsen er ytterligere beskrevet med henvisning til tegningen, hvor
fig. 1 viser et utslettelseskart for parB-området. Plasseringen av parA-området og parB-området innenfor EcoRI-A-fragmentet av plasmid R1 er vist som sorte striper. Restriksjonsenzymseter i EcoRI-A-fragmentet er beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172. parB-området er anordnet inne i 1,9 kb Pstl-fragmentet avgrenset av koordinater 15,0 til 16,9. parB-området ble videre kartlagt til høyre for 580 bp av et 880 bp Rsal-fragment. Det skraverte område angir det minste parB-område. Posisjonen av hok- og sok-genene innenfor det 580 bp parB-område er også vist. Et Bglll-Sall-fragment inneholdende / pR-promotoren og d857-allelen av A. - undertrykningsgenet ble innsatt i pBR322-derivatene bærende forskjellige deler av parB-fragmentet. Posisjonen av de innsatte fragmenter og retningen av transkripsjonen fra ApR er vist nedenfor kartet av parB-området (piler). pR-promotorene i pKG633, pKG634 og pKG341 leser fra venstre til høyre inn i parB-området, mens A. pR-promotoren i pKG171 leser fra høyre til venstre. Restriksjonsenzymseter er vist som E (EcoRI), B (Ball), B2(Bglll), S (Sali), R (Rsal) og P (Fstl).
Fig. 2 viser et kart av plasmid pPR95 (13 kb). copA, copB representerer replikasjonskontrollgener av plasmid R1, repA representerer et gen som er nødvendig for R1-replikasjon, ori er replikasjonsopprinnelsesstedet, bla angir et gen som meddeler ampicillinmotstand på plasmidbærende celler, parB representerer det R1-avledede område som omfatter hok- og sok-genene som uttrykker en opprettholdelsesfunksjon, deo-lacZ' angir en translasjonen fusjon mellom deoC-genet og lacZ-genet. lacZ,Y,A representerer lac-operonen, c1857 representerer et gen som koder for en temperaturfølsom A-undertrykker som styrer Apr-promotoraktivitet. Filer angir retningen for transkripsjon. De sorte striper angir utstrekningen av de forskjellige gener. Restriksj onsenzymseter er vist som S (Sali), B2(Bglll), B (BamHI) og E (EcoRI).
Fig. 3a og 3b viser nukleotidsekvensen av parB-området. 5<1->enden av den øvre DNA-tråd er anordnet til høyre. Nummereringen av basene er i henhold til koordinatene for parB-området på fig. 1. Ter angir stoppkodonet av den åpne leseramme som foreligger i nukleotidsekvensen bestående av mer enn 50 kodoner. fMet svarer til startkodonet av den åpne leseramme. Aminosyresekvensen av hok-genproduktet som starter ved posisjon +304, er vist nedenfor DNA-sekvensen - aminosyreforkortelsene er standard nomenklatur. Sekvensene betegnet "-10" og "-35" er promotorstrukturene av hok- og sok-genene. phok og psok angir henholdsvis hok- og sok-promotoren. Romertall angir stammeløkkestrukturer (stem-loop structures), idet de horisontale piler på hver side angir sekvensen av stamineløkkestrukturene. Vertikale piler angir avslutningen av hok-mRNA. Fig. 4 viser vertscelledreping etter X. pR-indusert aktivering av hok-genet. Stamme JC411 inneholdende enten pKG634 (igjenfylte symboler) eller pKG171 (åpne symboler) ble dyrket eksponentielt i A+3 minimalt medium supplert med casaminosyrer ved 30°C. Ved 0-tidspunktet ble temperaturen forandret til 42°C og dyrking av kulturene ble fulgt som OD450og levedyktige tellinger på selektivt medium (LB-plater inneholdende 50 ug/ml ampicillin). Fig. 5 er et fotografi av celler tatt ved prøve 1 time etter ombyttingen av stamme JC411 (pKG634) til 42°C. Filene peker på celler med en klart forandret morfologi. Celler med en normal morfologi ble også sett. Forstørrelse 2000 x. Fig. 6 viser undertrykkelsen av vertscelledreping. Stamme JC411 inneholdende enten pF634 alene (igjenfylte symboler) eller pF634 pluss pPR633 (åpne symboler) ble dyrket eksponentielt i A+B minimalt medium supplert med casaminosyrer ved 30°C. Ved 0-tidspunktet ble temperaturen forandret til 42°C, og dyrkning av kulturene ble fulgt ved måling av den optiske densitet (OD450) og levedyktige tellinger på selektivt medium (LB-plater inneholdende 100 y.g/kanamycin) . Fig. 7a er en sammenligning av aminosyresekvensene av hok-genproduktet og relB-orf3-genproduktet. Bevarte aminosyrer er vist ved halvfete skrifttyper, aminosyrer som representerer konservative forandringer er understreket. Fig. 7b viser oppstillingen av nukleotidsekvensene av parB og orf3 av E. coli relB-operonen (Bech et al, The EMBO Journal 4, 1985, pp. 1059-1066). parB-sekvensen er den øvre tråd, relB-orf3 den lavere, koordinater som på fig. 3. Vertikale linjer angir bevarte nukleotider. Tallene i parenteser er koordinatene av relB-nukleotidsekvensen som gitt av Bech et al. De to sekvenser er rettet inn slik at startkodonene av de to leserammene er i samme stilling - dette er angitt med Met ved posisjon +304. Avslutningskodonene av de to leseramrner er angitt med Ter ved posisjon +460. Fig. 8a viser 0,75 ug EcoRI-begrenset samlet DNA fra stammer av E. coli analysert ved filterhybridisering ved bruk av R1 parB-sonden. Felt 1: R1drd-19, felt 2: R100, felt 3: R386. Disse felter ble eksponert i 30 minutter. Felt 4: RP1 , felt 5: R6-K, felt 6: plasmidfritt E. coli. Disse felter ble eksponert i 5 timer. Størrelsen for relevante fragmenter er angitt i kilobaser. Fig. 8b viser 0,75 ug EcoRI-begrenset samlet DNA fra stammer av E. coli analysert ved filterhybridisering ved bruk av relB-orf3-sonden. Felt 1: R100, felt 2: R386, felt 3: plasmidfritt E. coli. Tiden for eksponering: 3,5 timer. Størrelsen av relevante fragmenter er angitt i kilobaser. Fig. 9 viser 0,5-0,75 ug Eco-RI-begrenset samlet DNA fra forskjellige bakterier analysert ved filterhybridisering ved bruk av R1 parB-sonden. Autoradiogrammet ble eksponert i 17 timer. To forskjellige fotografiske eksponeringer av det samme autoradiogram er vist. Felt 1: Salmonella typhimurium (ikke omtalt i teksten), felt 2: Serratia marcescens, felt 3: Pseudomonas fluorescens, felt 4: Pseudomonas putida, felt 5: Proteus vulgaris (ikke omtalt i teksten), felt 6: Escherichia coli, felt 7: Bacillus subtilis, felt 8: Bacillus circulans PL236. Stør-relser av radioaktivt merket markør (/-begrenset med Hindlll) er angitt i kilobaser. Fig. 10 viser 0,5-0,75 ug EcoRI-begrenset samlet DNA fra forskjellige bakterier analysert ved filterhybridisering ved bruk av relB-orf3-sonden. Autoradiogrammet ble eksponert i 17 timer (felt 19) og 72 timer (felter 2-7). Felt 1: Serratia marcescens, felt 2: Pseudomonas fluorescens, felt 3: Pseudomonas putida, felt 4: Bacillus subtilis, felt 5: Bacillus circulans PL236, felter 6, 7: Lactobacillus. Størrelser av radioaktivt merket markør (X-begrenset med Hindlll) er angitt i kilobaser. Fig. 11 viser filterhybridiseringsanalyser av DNA fra eukaryote celler ved bruk av relB-orf3-sonden (felt 1-4), samt R1 parB-sonden (felt 5-6). DNA ble kløyvet med EcoRI (felt 1-3 og 5-6) eller med Pstl (felt 4). Felt 1: 5 ug makronukleært DNA fra Tetrahymena thermophila, felt 2: 5 ug samlet DNA fra Tetrahymena thermophila, felt 3: 0,25 ug kloroplast-DNA fra Pisurn sativum, felt 5: 5 ug samlet cellulært DNA fra neuroblastoma, felt 6: 10 ug samlet cellulært DNA fra embryonisk lever. Størrelser av fragmenter er angitt i kilobaser. Fig. 12 viser et kart av det vide vertsområde plasmid pFNl3 parB<+>. ori angir opprinnelsesstedet for replikasjonen, mob angir den sekvens som tillater plasmidet å overføres ved konjugasjon til de fleste andre gramnegative arter når et konjugativt (det vil si mobiliserende) plasmid foreligger i den samme celle, aphA representerer et gen som meddeler kanamycin-motstand, lacZ er det gen som koder for G-galaktosidase, p symboliserer repA-promotoren fra plasmid R1, parB representerer den R1-avledede plasmidopprettholdelsesfunksjon som koder for hok- og sok-genene. Restriksjonsseter er vist som P (Pstl), E (EcoRI), H (Hindlll), B-| (BarnHI) og B2(Bglll). Fig. 13 er en modell av reguleringen av hok-genet. Ved celledeling mottar en av dattercellene alle de parB<+->plasmider som foreligger. A. Delingssyklus for en celle som bærer et parB<+->plasmid (hok<+>, sok<+>). Både hok- og sok-genproduktene produseres kontinuerlig fra plasmidet. Sok-produktet motvirker hok-produktet, og ingen virkning på cellelevedyktighet observeres (1a+2a). B. Delingssyklus av en plasmidfri celle. I den plasmidfrie celle foreligger hok- og sok-produktene. Sok-produktet nedbrytes hurtigere enn hok-produktet, hvilket fører til aktivering av hok-produktet (3b). Denne aktivering fører til skade av en livsviktig cellefunksjon og celledød (4b). Fig. 14 viser restriksjonskart av translasjonene og transkripsjonene fusjonsvektorer basert på pJEL124 (A) og pJEL126 (B), hvor c1857 angir genet for en temperaturfølsom undertrykker som styrer XpR-promotoraktivitet, oriR1 angir opprinnelsesstedet for replikasjon, bla angir et gen som meddeler ampicillinmotstand på plasmidbærende celler, lacZ,Y,A angir laz-operonen, pilene viser retningen for transkripsjonen, de sorte striper angir utstrekningen av innskuddet fra parB-området, de skraverte områder angir hok-genet eller en del derav, de åpne uskraverte områder angir sok-genet eller en del derav, sokT angir målet for Sok-genproduktet og restriksj onsenzymseter er vist som E-| (EcoRI), B-| (BarnHI) og S (Sali).
Materialer og metoder
Bakteriestammer og plasmider
De følgende E. coli K-12-stammer ble brukt: CSH50 ((lac-pro) rpsL), JC411 (metB leu his argG lacY malA xyl mtl gal rpsL), LE392 (Murray et al, Mol. Gen. Genet. 150, 1S77, p. 53) og HB101 (F. Bolivar og K. Bachman, Methods Enzymol. 68, 1979, p. 245). JC411 ble hovedsakelig brukt i de fysiologiske eksperimenter. CSH50 ble hovedsakelig brukt for de genetiske eksperimenter. Videre ble B. subtilis-stammen BD 224 (trpC2, thr-5, rec-4)
(Dubnan & Cirigliano, J. Bact. 117, 1974, p. 488) brukt for
eksperimenter med grampositive bakterier. De plasmider som ble anvendt er angitt i tabell 1. Bakteriofag X. 47 (W.A.M. Loenen & W.J. Braunner, Gene 8, 1979, pp. 69-80) ble brukt for plaquehybridisering.
De eksperimentelle teknikker som bie brukt var standardteknikker anvendt innen områdene mikrobiell genetikk (J. Miller: Experi-ments in Molecular Genetics, Cold Spring Karbor, New York, 1972) og genetisk manipulering (Davis, Botstein og Roth: A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Karbor, Nev/ York, 1 980, og Maniatis, Fritsch og Sambrook: Molecular Cloning, Cold Spring Harbour, New York, 1982).
Alle celler ble dyrket i LB-medium (Bertani, J. Bact 62, 1951, p. 293) med 0,2 prosent glukose og 1 ug/ml tiamin, eller A+B minimalt medium (Clark og Maaløe, J. Mol. Biol. 23, 1967, p. 99) supplert med 0,2 prosent glukose og 1 prosent casaminosyrer. Platene som ble anvendt var LA-plater inneholdende LB-medium og 1,5 prosent agar.
McConkey laktose-indikatorplater ble fremstilt som anbefalt av fabrikanten (Difco) og X-gal-plater ble fremstilt ved tilsetning av 20-40 ug/ml 5-brom-4-klor-indolyl-S-D-galaktosid til A+B minimalt medium supplert med 0,2 prosent glukose og 1 ug/ml tiamin.
Fysisk- kjemiske metoder
Klare lysater ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Clewell og Helinski, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 62, 1969, pp. 1159-66.
Fremstilling i liten målestokk av plasmid DNA ble utført ved fremgangsmåten ifølge Birnboim et al, Nucl. Acids Res. 7, 1979, pp. 1513-23.
Fremstilling i stor målestokk og analyse av plasmid DNA ble utført ved hjelp av densitetsgradientsentrifugering med suspendert farge (dye buoyant uensity gradient centrifugation) i henhold til Stougaard og Molin, Anal. Biochem. 118, 1981, p.181. Restriksjonsendonukleasene bie brukt i henhold til forskriftene gitt av fabrikanten (Boehringer, Mannheim eller Biolabs, New England) ved 37°C. Doble og tredoble digestionsprodukter (digests) ble utført ved at man begynte med det enzym som krevde den laveste saltkonsentrasjon og deretter justerte med ytterligere buffer før tilsetning av det neste enzym.
Behandling med eksonuklease Bal31 ble utført som følger: 0,1 enhet Bal31 ble satt til 50 ug lineært DNA og prøver ble tatt ut ved 1, 2, 4, 8, 16, 32 og 60 min. til 60 mM EDTA, ekstrahert med fenol, etanolutfelt og resuspendert i 20 ul TE-buffer. Halvpar-ten av de 20 ul ble digestert med det riktige restriksjonsenzym, som var underkastet agarosegelelektroforese for å bestemme den midlere størrelse av de slettete DNA-partier. Til den andre halvpart ble den riktige linker tilsatt og blandingen ligatisert i 48 timer med et overskudd av T4 DNA-ligase.
Ligasjon av begrenset plasmid DNA ble utført som anbefalt av fabrikanten, med unntagelse av butt ende-ligasjon, hvor et overskudd av T4 DNA-ligase og ATP ble tilsatt.
Målinger av S-galaktosidase uttrykt fra fusjonsplasmider ble gjort fra eksponentielt voksende kulturer, stort sett som beskrevet av Miller, op.eit. Aktivitetsenheter ble uttrykt som OD420 pr. minutt OD450 pr. ml kultur. Rifampicin (Ciba-Geigy) ble tilsatt i høye konsentrasjoner (300 ug/ml) til den ikke-permeable stamme CSH50. Induksjon av lac-operonen ved tilsetning av IPTG (1 mM) til en eksponentielt voksende kultur av CSH50 (F'lac) og samtidig tilsetning av rifampicin (300 ug/ml) viste at LacZ-syntese stoppet innen det første minutt etter at antibiotikumet var blitt tilsatt.
For fremstillingen av RNA ble dyrkningsprøver (10 ml) fjernet og hurtig avkjølt til 0°C, spunnet i en Sorvall SS34-rotor og resuspendert i TE-buffer inneholdende 0,2 prosent SDS, fenol-ekstrahert to ganger, kloroform ekstrahert tre ganger, etanolutfelt og resuspendert i 200 ul TE-buffer.
Kartlegging av RNA-endepunkter ved bruk av Sl-nuklease ble utført stort sett som beskrevet av Maniatis et al, op.eit. DNA-RNA-hybrider ble behandlet med et overskudd av S1-enzym (100 enheter) ved 20°C over natten. Endemerking av DNA ble utført ved standardmetoder (Maniatis et al. op.eit.)
Beregningen av mRNA-halveringstider fra rifampicin-induksjons-kurvene ble utført i henhold til M.L. Pato, P. Bennett, K. von Meyenburg, J. Bact. 116, 1973, pp. 710-718. Den resterende kapasitet av proteinsyntese (uttrykt i B-galaktosidaseenheter) som er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av mRNA, (det vil si hok-lacZ hybrid mNRA) i cellen, ble bestemt som avstanden fra induksjonskurven til endeplatået (som ble nådd etter uendelig lang tid). Disse proteinsyntese-kapasitetsverdier ble plottet på en halvlogaritmisk skale mot tiden. Denne type plotting ga alltid rette linjer, fra hvilke halveringstiden av mRNA kunne avleses.
Konstruksjon av induserbare parB- derivater ( se også talbell 1) pKG633: SalI-BglII-fragmentet av pGU82 inneholdende den cl 857 temperaturføisomme allele av A. -repressorgenet og X pR-promotoren ble innsatt i pPR633 foran parB-området, slik at ApR-promotoren leser inn i området fra venstre mot høyre (fig. 1). På en analog måte ble SalI-BglII-fragmentet av pOU82 innsatt i pPR634 og pPR341, som er Bal31 utslettelsesderivater av pPR633, hvilket førte til pKG634 og pKG341. pKGI71: I pPR171 ble Sall-Bglll-fragmentet av pOU82 innsatt i den motsatte orientering, hvilket førte til pKG171. Posisjonene og orienteringene av de innsatte ApR-promotorer i forhold til hok- og sok-genene er vist på fig. 1. pF634: EcoRI-Sall-fragmentet av pKG634 inneholdende de høyre 390 bp av par3-området og det Xd857-pR induserbare promotorsystem ble innsatt i det unike Sall-sete i kanamycin-motstandsfragmentet (aphA<+>) av pML31 (D.R. Helinski, J. Bact. 127, 1976, pp. 982-937) ved butt ende-ligasjon (S1-nuklease ble brukt til å gjøre endene av de begrensede DNA-fragmenter butte).
Den R1-avledede translasjonelle fusjonsvektor pJEL124 (vist på fig. 14) som inneholder en polylinker foran lacZ-genet som mangler det første 7 1/3 kodon (lacZ') ble brukt for alle translasjonelle fusjoner mellom hok-genet og lacZ-genet. Kopitallet for de R1-baserte transkripsjonene og translasjonelle fusjonsvektorer som her er brukt er tilnærmet 1 pr. E. coli-genom.
Plasmider pKG733 og pKG732: pKG733 ble konstruert ved innsetting av BamHI-Sau3A-restriksjonsfragmentet av pPR633 (+1 til +342) i BamHI-setet av pJEL124. Sau3A-setet ved +342 er anordnet inne i hok-genet og plassert slik at fusjonen av lacZ til dette sete danner en hybrid leseramme som består av de første 14 aminosyrer av hok-genet, fulgt av det lacZ'-kodende område. Således styres ekspresjonen av fi-galaktosidaseaktivitet fra det translasjonelle fusjonsplasmid pKG733 av signaler som normalt styrer ekspresjonen av hok-genet. Plasmid pKG732 ble konstruert ved innsetting av et 190 bp EcoRI-BamHI-fragment av pSKS106 inneholdende lacUV5-promotoren foran det parB-avledede innskudd av pKG733.
Plasmider pKH734 og pKG735: pKG734 ble konstruert ved innsetting av 3amHI-Sau3A-fragmentet av pPR634 (+194 til +342) inn i BamHI-setet av pJELl24. Plasmid pKG735 ble konstruert ved innsetting av det 190 bp EcoRI-BamHI-fragment av pSK3106 inneholdende lacUVo-promotoren foran det parB-avledede innskudd av pKG734.
Plasmider pKG741 og pKG742: pKG741 ble konstruert ved innsetting av BamHI-Sau3A-fragmentet av pPR341 (+268 til +342) inn i BamHI-setet av pJEL124. Plasmid pKG742 ble konstruert ved innsetting av det 190 bp EcoRI-BamHI-fragment av pSKS106 foran det parB-avledede innskudd av pKG741.
Plasmider pKG780 og pKG782: Et BamHI-BclI-restriksjonsfragment av pKG733 som koder for sok-genet og hok'-genet sammenføyet i ramme til lacZ'-genet ble innsatt i de to mulige orienteringer inn i BamHI-setet av pPR345, et pBR322-plasmidderivat inneholdende parB-området som strekker seg fra +350 til +580 på BamHI-EcoRI-restriksjonsfragmentet (fig. 7).
Promotor-fusjonsplasmider: I alle de promotor-fusjonskonstruerte stykker mellom hok- og sok-promotorene og lacZ-genet ble den R1-baserte transkripsjonene f usj onsvektor pJELl26 (se fig. 14), som inneholder EcoRI- og BamHI-restriksjonsseter foran det intakte lacZ-gen benyttet.
Plasmider pKG730 og pKG736: EcoRI-restriksjonsfragmentene av pKG732 og pKG735 ble innsatt i EcoRI-setet av pJEL126, hvilket førte til henholdsvis pKG730 og pKG736.
Plasmid pUC341: BamHI-EcoRI-restriksjonsfragmentet +268 til +580) av pPR341 ble erstattet med det lille EcoRI-BamHI-restriksjonsfragment foran lacZ-genet av pJEL126, hvilket førte til pUC341 .
Mikrobiologiske metoder
Fordelingsforsøk I: Konstruksjonen av Lac<+->vektorer gjorde det mulig å bestemme Par<+->fenotypen av et plasmid ganske enkelt ved utstrykning på ikke-selektive McConkey-laktoseplater eller X-Gal-plater. Bakterier (Alac) som inneholder disse plasmider gir en Lac<+->fenotype som lett kan telles som fargede kolonier på indikatorplatene, mens plasmidfrie celler har en Lac~-fenotype og viser seg som fargeløse kolonier.
Fordelingsforsøk II: (Brukt for Lac~-plasmider): En koloni fra en selekterbar plate (en plate inneholdende et antibiotikum) ble strøket ut på en annen selektiv plate. Fra denne plate ble en koloni strøket ut på en LA-plate for å danne enkeltkolonier. Fra LA-platen ble ca. 10 kolonier suspendert i 1 ml 0,9 prosent NaCl til en fortynning på henholdsvis 10~<4>og 10~<5>. o,1 ml av de fortynnede blandinger på 10~<4>og 10"" 5 bie spredt på LA-plater. Fra disse plater ble motstandsmønsteret av 50 kolonier (200 kolonier dersom svak ustabilitet ventes) utprøvet på de riktige selektive plater. Tapshyppigheten (LF-verdien) blir deretter beregnet på grunnlag av formelen
LF=1-( )<<1>/<27>>
hvor v er frekvensen av plasmidbærende celler under antagelse av at én koloni dyrkes i 27 generasjoner. I denne fremgangsmåte ligger en stor statistisk svingning.
Fordelingsforsøk III: Kvantitative målinger av stabiliteten av Lac<+->og Lac~-plasmider. Én fullstendig koloni ble tatt fra en selektiv plate og resuspendert i 1 ml 0,9 prosent NaCl til en konsentrasjon på 10^ celler/ml. 2 x 0,1 ml av 10~<3->fortynningen ble brukt til å pode 2 x 10 ml LB-medium, og podingen ble utført ved 30°C under risting. Ved en celletetthet på ca. 5x10^ celler/ml ble kulturene fortynnet 10^ og 10^ ganger. 0,1 ml av 10<4->fortynningen (5 x 10<3>celler) ble brukt til å pode 10 ml nytt LB-medium og 0,4 ml av 10^-fortynningen ble spredt på McConkey-laktoseplater, og platene ble podet ved 30°C over natten. Fortynningen fra 5 x 10^/ml til 5 x 10<2>/ml svarer til 20 generasjoners dyrking (2^0), slik at forandringen i hyppigheten av plasmidbærende celler fra én fortynning til den neste svarer til den som finner sted i løpet av 20 generasjoners dyrking. Mer generelt kan LF-verdien beregnes som følger:
1 = (1 - LF)91 og2= C"LF)<g>2
hvor1og2er frekvensen av plasmidbærende celler etter henholdsvis g-| og g2generasjoner, og LF er frekvensen av tapet pr. celle pr. generasjon. Følgelig blir
-]/20 (1 - LF)S1-92
og
LF = 1 - (v-i/v2) (1/(g1~92) )
Ved bruk av denne formel unngås feil på grunn av svingninger i tallet podende celler ved tiden null. En mer egnet forenkling av formelen er
LF<=><in>( yl 2)/(<g>2-<g>i)
Inkompatibilitetsforsøk
Plasmider som ble formodet å bære et innskutt par-område ble underkastet sortering ved anvendelse av den observasjon at to ellers forenlige replikon som bærer det samme par-område er uforenlige med hverandre, hvilket fører til tapet av den ene eller den andre av de to i fravær av seleksjonstrykk. Forsøket utføres ved transformasjon av det plasmid som skal undersøkes til en bakteriestamme som bærer et annet plasmid, idet man selekterer for begge plasmider på dobbelt-selektive plater. Etter utstrykning på en dobbelt-selektiv plate (en plate inneholdende to forskjellige antibiotika) ble inkompatibiliteten målt enten kvalitativt eller kvantitativt.
For det kvalitative inkompatibilitetsforsøk ble en koloni fra den dobbelt-selektive plate strøket ut på en LA-plate for å danne enkeltkolonier. Ca. 10 kolonier fra denne plate ble resuspendert i 1 ml 0,9 prosent NaCl og fortynnet til henholdsvis 10-<4>og 10-<5>. 0,1 ml av 10-<4->og 10_<5->fortynningene ble spredt på LA-plater. Fra disse plater ble 50 kolonier (eller 200 kolonier dersom en svak inkompatibilitet var ventet) testet på de riktige selektive plater. Dersom et Lac<+->plasmid ble innlem-met i forsøket, ble McConkey-laktoseindikatorplater brukt istedenfor replikatplating på selektive plater. I tilfellet for Lac<+->plasmider ble sorteringen således utført ved transformasjon av mistenkte Par<+->plasmider til en stamme som allerede inneholdt et Par<+->hybrid plasmid som ga en Lac<+->fenotype. Plasmidinkompa-tibilitet og følgelig bevis for en spesiell Par<+->fenotype av det innkommende plasmid er lett påviselig ved sortering for Lac~-kolonier på McConkey-plater, noe som viser at det hjemmehørende (resident) Par+-plasmid var blitt destabilisert. Et eksempel på denne sorteringsmåte er beskrevet i eksempel 4.
Kvantitative inkompatibilitetsmålinger ble utført ved måling av tapsfrekvensene av Lac<+->plasmider etter opprettelse av hetero-plasmid-populasjoner som beskrevet ovenfor. LF-verdiene ble målt som beskrevet under "Fordelingsprøve III".
Rensing av kromosomalt DNA
Samlet DNA ble ekstrahert fra bakterier som følger. Celler ble høstet ved sentrifugering, vasket to ganger i 1 x TEN-buffer (TEN = 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) og resuspendert i 1/10 volum av TEN inneholdende 1 mg/ml lysozym. Etter inkubasjon ved 37°C i 30 minutter ble protoplastene lysert ved tilsetning av natriumdodecylsulfat til en endelig konsentrasjon på 1 prosent, og proteinase K ble tilsatt til 0,25 mg/ml. Lysatet ble inkubert ved 37°C i 2 timer og deretter ekstrahert to ganger med buffret fenol og tre ganger med kloroform. Natriumacetat ble tilsatt til 0,3 M, og DNA ble utfelt ved tilsetning av 1 volum isopropanol. Utfellingen ble vasket flere ganger i 96 prosent og 80 prosent etanol. Til slutt ble DNA oppløst i 1 mM Tris, 1 mM EDTA.
Samlet DNa fra Tetrahymena thermophila BVII ble fremstilt i henhold til Nielsen, H. og Engberg, J.: Biochem. Biophys. Acta 825, 1985, pp. 30-33. Makrokjerner fra Tetrahymena thermophila BVII ble isolert (Cech, T.R. et al: Cell 27, 1981, pp. 478-496) og DNA ekstrahert (Maniatis et al, 1932, op.eit., pp. 280-231). rDNA fra Tetrahymena thermophila BVII ble fremstilt som beskrevet av Engberg, J. et al: J. Mol. Biol. 104, 1976, pp. 455-470.
Kloroplast DNA fra Pisum sativum ble isolert i henhold til Bookjans, G. et al: Anaiyt. Biochem. 141, 1984, pp. 244-247.
Embryonisk levervev fra en 7 ukers legal abort ble malt opp i fysiologisk saline, og DNA ble fremstilt i henhold til Maniatis et al, 1982, op.eit., pp. 280-231. På lignende måte ble DNA isolert fra tumorbiopsy fra et tilfelle av neuroblastoma, det isolerte DNA ble funnet å inneholde et flere hundre ganger forstørret kromosomalt område, og tilsvarende ble tumorcellene funnet å inneholde en rekke ekstrakromosomale minikromosomer ved mikroskopi av miotiske celler.
Isolering av DNA- fragmenter for radioaktiv merking
100 mikrogram pPR35 og pBD2724 DNA ble digestert med henholdsvis EcoRI og EcoRI og Hindlll. Fragmentene ble separert ved elektroforese gjennom en 1 prosent agarosegel i Tris-borat-buffer ved 5 volt pr. cm i 3 timer. De ønskede fragmenter ble isolert ved
elektroeluering oppå en NA45-membran (Schleicher & Schull) i henhold til fabrikantens retningslinjer. Etter utvinning av fragmentene ved eluering av filteret i 1,5 M NaCl ved 65°C ble fragmentene igjen underkastet rensing ved agarosegelelektroforese og NA45-membrangjenvinning fra gelen.
Agaroseqelelektroforese
DNA ble kløyvet med de passende restriksjonsendonukleaser i henhold til retningslinjer gitt av fabrikantene. For cellulært DNA ble 10 enheter pr. mikrogram DNA benyttet. Inkubasjonstiden var 3 timer ved 37°C. De genererte DNA-fragmenter ble separert ved elektroforese gjennom 0,7 prosent eller 1 prosent agarosegeler i en Tris-acetat-buffer ved 0,8 volt pr. cm i 18 timer og gjort synlige ved farging med etidiumbromid.
En molekylvektmarkør ble fremstilt som følger: wt ÅDNA ble begrenset med Hindlll og endemerket ved hjelp av Klenow-polyme-rasen fra Boehringer, Mannheim, som anbefalt av fabrikanten i nærvær av a-32P-dCTP pluss ikke-radioaktivt dATP og dGTP. Når den ble brukt som en molekylvektmarkør, ble mengden av Tetrahymena makronukleært DNA tilsatt, svarende til DNA-belastningen av forsøksfeltene.
Overføring av DNA- fragmentene fra gel til nitroceliulosefilter Etter partiell depurinering i 0,25 N HC1 i 15 minutter ved værelsetemperatur ble denaturering av DNA i gelen, nøytralise-ring og etterfølgende overføring av DNA fra gel til et BA35 (Schleicher & Schull) nitrocellulosefilter utført som beskrevet i Maniatis et al, 1982, op.eit., pp. 280-281. Fullstendigheten av overføringen ble sikret ved farging av gelen med etidiumbromid etter overføring.
Fremstilling av radioaktivt merket sonde
0,3 mikrogram av 900 bp parB-fragmentet og 0,3 mikrogram av 300 bp relB-orf3-fragmentet ble radioaktivt merket ved nick-translasjon (Maniatis et al, 1982, op.eit.) ved anvendelse av 0,25 mikromolar a-32P-deoksycytidintrifosfat (3000 Ci pr. mmol). Den ikke-innlemmede radioaktive forløper ble fjernet ved bruk av gjentatte etanolutfellinger.
Til hvert preparat ble der tilsatt 100 mikrogram E. coli tRNA som bærer.
De spesielle aktiviteter av sondene var henholdsvis 2-3 x 10^ og 4-5 x 10^ dprn pr. mikrogram parB og relB-orf3-fragment.
Hybridisering
Filtre inneholdende DNA overført fra agarosegeler ble preinku-bert i plastposer med hybridiseringsoppløsningen (10 ml pr. 120 cm<2>) i 18 timer ved 37°C ved konstant risting. Hybridiserings-oppløsningen ble modifisert fra Wahl et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 76, 1979, pp. 3683-3687 og inneholdt 38 prosent avionisert formamid, 0,75 M NaCl, 50 mM natriumfosfat og 1 0 x Denhardt<1>s oppløsning (50 x Denhardt's oppløsning er 0,2 prosent bovin- serumalbumin, 0,2 prosent polyvinylpyrrolidon og 0,2 prosent Ficoll).
Etter preinkubering ble de denaturerte radioaktivt merkede sonder satt til passende filtre. I forsøk som anvender par3-proben var fragmentkonsentrasjonen under hybridiseringen 3 ng/ml, mens relB-orf3-sonden ble brukt ved en konsentrasjon på 1,3 ng/ml for oppnåelse av ekvimolare konsentrasjoner av komplementære sekvenser i de to situasjoner.
Hybridisering ble utført ved 37°C med forsiktig risting i 19 timer.
De hybridiserte filtre ble vasket én gang i 20 minutter ved værelsetemperatur i 0,4 x vaskebuffer, og tilslutt to ganger i 30 minutter ved 60°C i 4 x vaskebuffer. Vaskebufferen inneholdt 0,6 M NaCl, 0,1 prosent SDS, 0,1 prosent natriumpyrofosfat, 50 mM natriumfosfat, pH 6,5. Autoradiografi ble utført ved bruk av røntgenfilmer og forsterkningsskjermer. Eksponeringstidene er angitt i beskrivelsen av figurene.
Uttrykket "filterhybridiseringsanalyse" anvendes i eksemplene for å angi den følgende operasjonssekvens: agarosegel-elektroforese av DNA-fragmenter, overføring av fragmentene til nitro-cellulosefiltre, hybridisering med den riktige radioaktivt merkede sonde, filtervasking og autoradiografi av filteret etter vasking. Dataene vist i eksemplene representerer autoradiogram-mer oppnådd ved filterhybridiseringsanalyse.
Uttrykket "homologi" er her brukt til å angi nærværet av en hvilken som helst grad av komplementæritet mellom en gitt sonde og de nukleinsyrematerialer som analyseres.
Graden av homologi er uttrykt som fraksjonen av komplementære baser i et dupleks-nukleinsyremolekyl dannet mellom en gitt sonde og det nukleinsyremateriale som analyseres.
Minimumsgraden av homologi som er påvisbar er en funksjon av forsøksbetingelsene som anvendes under hybridiseringen og egenskapene av sonden og nukleinsyrematerialet som analyseres.
Graden av homologi mellom sonde-DNA og et filterbundet DNA-materiale ble bedømt fra intensiteten av det faktiske hybridiseringssignal sammenlignet med signalintensiteten observert for en 100 prosent homolog filterbundet sekvens under de samme betingelser.
Intensiteten av hybridiseringssignalet avhenger hovedsakelig av hybridiseringshastigheten og antallet filterbundne DNA-molekyler som foreligger i det spesielle hybridiseringsbånd. Hybridiseringshastigheten bestemmes stort sett ved konsentrasjonen av de komplementære sekvenser under hybridiseringen, de ioniske betingelser, temperaturen og graden av homologi mellom sonde-DNA og de filterbundne molekyler. Hybridiseringshastigheten øker ved nærværet av ikke-komplementære sekvenser (Bonner, T.I. et al, J.Hol. Biol. 31, 1973, p. 123), hvilket øker den termiske stabilitet av dupleks-DNA, 1 prosent mismatching mellom sonde og filterbundet DNA fører til en reduksjon i termisk stabilitet på 1 grad (Maniatis et al, 1982, op.eit., p. 388). Hybridiserings-betingelsene bestemmer derfor hvilken grad av mismatching som fortsatt vil gi et påvisbart signal. Det skal bemerkes at de betingelser som ble anvendt i det foreliggende arbeid ikke førte til metning av det filterbundne DNA med sonde.
De foreliggende sett betingelser for hybridisering og filter underkaster DNA-duplekser for en temperatur som er 40°C under den midlere smeltetemperatur av perfekt matchet dupleks-DNA i det samme ioniske miljø, det vil si betingelsene tillater påvisning av signaler fra dupiekser som inneholder en høy grad ikke-parende baser. Formelen brukt i disse beregninger er diskutert i Beltz, G.A. et al, Meth. Enzymol. 100, 1983, pp. 266-285.
Det er anslått at de betingelser som anvendes påviser 100 prosent av det maksimale hybridiseringssignal som fås fra dupiekser med fra 100 prosent ned til 80 prosent homologi, mens signalet fra en 60 prosent homolog dupleks er 50 prosent av den ovenfor angitte maksimale, se ovenfor. Dupiekser med lavere
homologi enn 60 prosent gir enda svakere signaler.
For dupiekser med stor mismatching kan et signal være påvisbart dersom eksponeringstiden av autoradiogrammet kan forlenges, eller dersom antall kopier av filterbundne komplementærmolekyler kan økes.
Eksempel 1
Utslettelseskartlegging av parB-området (se fig. 1) Konstruksjon av pPR95 (fig. 2)
Konstruksjonen av pPR95 ble utført på følgende måte: plasmid pOU93 (Gerdes et al, J. Bacteriol. 161, 1985, pp. 292-98) er et pBR322-derivat inneholdende parB Pstl-fragmentet avledet fra EcoRI-A-fragmentet av plasmid RI (fig. 1). Pstl-fragmentet deles passende opp i mindre fragmenter ved restriksjonsenzymet Rsal, som vist på fig. 1. Ved vanlige kloningsmetoder ble det største Rsal-fragment (830 bp) innsatt i Smal-setet av den pBR322-avledede kloningsvektor pKP34 (Prentki et al, Gene 17, 1982, pp. 189-96), hvilket ga pPR13. Smal-setet av pHP34 er flankert av to EcoRI-seter, og derfor ble innskutte 880 bp Rsal-fragmentet omdannet til et 900 bp EcoRI-fragment. Det således genererte 900 bp EcoRI-fragment av pPR13 ble klonet inn i det unike EcoRI-sete på miniRI-derivatet pOU82 (internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172), hvilket ga pPR95. En tegning av pPR95 er vist på fig. 2. Plasmid pOU82 er ustabilt arvet på grunn av mangelen på noen fordelingsfunksjon (internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172), og har en tapsfrekvens av størrelsesorden 10~<2>pr. celle pr. generasjon.
På den annen side går pPR95 svært sjeldent tapt og er kjenneteg-net ved å ha en tapsfrekvens på mindre enn 10~4 pr. celle pr. generasjon (målt som beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00036, publikasjonsnr. WO 84/01172), som er den karakteristiske tapsfrekvens av parB<+>miniRI-derivater. Således kan man trekke den konklusjon at det fullstendige parB-område er anordnet på det 880 bp Rsal-fragment etter fragmentets evne til å stabilisere miniRI-replikoner å dømme.
Den fine kartlegging av parB-området ble utført som følger: pPR95 ble begrenset med BarnHI, behandlet med eksonuklease Bal31 og ligatisert. Før ligasjonen ble BamHI-oligonukleotidlinkere tilsatt. Denne behandling førte til en rekke utslettelsesderivater som dekket den venstre del av parB-området. Forlengelsen av utslettelsene ble bestemt av størrelsefraksjonering av DNA-fragmentene på agarosegeler etter at DNA var blitt behandlet med restriksjonsenzymene EcoRI og BarnHI. Deretter ble den nøyaktige innsetting av BamHI-oligonukleotidlinkerne bestemt ved nukleo-tidsekvensering, som beskrevet av Maxam og Gilbert (Meth. Enzymol. 65, 1980, pp. 499-566). På denne måte ble en meget detaljert kartlegging av området oppnådd. Videre ble parB-fenotypen (bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder) analysert for hvert plasmidderivat. Sletting fra pPR95 av sekvensen som strekker seg fra -320 til 0 (se fig. 1), som fører til pPR311 forandret ikke parB<+->fenotypen. Således må det gjenværende 580 bp BamHI-EcoRI-fragment i pPR311 inneholde det fullstendige parB-område. Sletting fra venstre lengre inn i området opphever fullstendig den stabiliserende aktivitet.
Slettinger inn i den høyre del av 580 bp parB-fragmentet av pPR311 (se fig. 1) førte til tap av parB<+->fenotype, slik at parB-området strekker seg til en posisjon i nærheten av denne ende av fragmentet.
Eksempel 2
Nukleotidsekvens av parB-området (se fig. 3)
Nukleotidsekvensen av det minimale parB-område som er vist på fig. 3, ble oppnådd ved bruk av den kjemiske nedbrytingsmetode som beskrevet av Maxam og Gilbert (Meth. Enzymol. 65, 1980, pp. 499-566). I det følgende er en detaljert beskrivelse gitt av den essensielle biologiske informasjon i nukleotidsekvensen av parB-området .
Sekvensen av det minimale parB-område på 580 bp, som definert i eksempel 1 (se fig. 1), er vist på fig. 3. De sentrale og venstre deler av området er meget rike på dyadsymmetrier. 580 bp inneholder tre åpne leserammer bestående av mer enn 50 kodoner. Start- og stoppkodonene av disse leserammer er angitt på fig. 3. Leserammen som starter ved posisjon +304 og slutter ved +460 kommer etter en DNA-sekvens (5'-AGGA-3') som ligner på E. coli ribosombindingssetet (Shine og Dalgarno, Nature (London) 254, 1975, pp. 34-38), som er kjent for å virke som gjenkjennelses-setet for ribosomer som initierer translasjon av mRNA. Polypep-tidproduktet av denne leseramme er vist nedenfor DNA-sekvensen på fig. 3.
Eksempel 3
Funksjoner uttrykt fra parB-området (se fig. 4 og 5)
En serie plasmider ble konstruert fra hvilken kondisjonal ekspresjon av de formodede gener (som antydet fra sekvensen) i parB-området ble oppnådd ved innsetting av et fragment som bærer X pR-promotoren og Ac1857-genet. Posisjonene av disse innskudd er angitt på fig. 1 . Det ApR-temperaturinduserbare prornotorsys-tem ble valgt fordi det regulerende gen for X. pR-promotoren (d 857-genet) , samt Å.pR er anordnet på et enkelt Bglll-Sall-restriksjonsfragment, videre gjør c1357-allelen av A-repressorgenet den innsatte promotor induserbar ved høy temperatur (42°C), men hvilende (silent) eller nær hvilende ved lav temperatur (30°C). BglII-SalI-fragmentet av pOU82 ble innsatt i plasmider pPR634 og pPR341 ved vanlige kloningsfremgangsmåter, hvilket ga henholdsvis plasmider pKG634 og pKG341 (cf. Materia-
ler og Metoder).
Ved 30°C vokser celler som inneholder pKG634 og pKG341 normalt, men induksjon av ApR (ved 42°C) fører til hurtig dreping av vertscellene.
Fig. 4 viser drapskinetikken (levedyktige tellinger) og vekst målt som OD450 etter et ombytting til 42°C av stamme JC411 (pKG634). Levedyktige tellinger synker hurtig (halveringstid på 2,5 minutter), og økningen av OD450 stopper. Nærværet av enApR-promotor som transkriberer parB-området i motsatt retning (pKG171) har ingen virkning på cellevekst og levedyktighet (fig. 4, sammenligning).
Mikroskopisk undersøkelse (fasekontrast) av cellene (JC411/- pKG634) etter varmeindusering av X pR-promotoren viste at cellene forandret morfologi: Mesteparten av materialet kondenserte tilsynelatende i soner og etterlot resten av cellen gjennomsik-tig. En illustrasjon på dette er vist på fig. 5, hvor både normale og forandrede celler foreligger. Cellene som har det karakteristiske parB-induserte utseende er heretter betegnet som "spøkelsesceller" ("ghost" cells).
Da XpR-promotorfragmentet ble innsatt like ovenfor starten av den 52 aminosyre åpne leseramme (se eksempel 2), tyder dette sterkt på at det 52 aminosyre polypeptid som er kodet for av den åpne leseramme som starter ved posisjon +304 (fig. 3) er ansvarlig for celledrepingen, og følgelig er dette gen kalt hok (host killing) i det etterfølgende.
Eksempel 4
Undertrykkelse av den vertsdrepende virkning uttrykt ved hok (se fig. 6)
Et gen, fra hvilket et meget giftig produkt uttrykkes, må selvsagt reguleres. Det ble derfor antatt at regulatoren for hok også var kodet for ved parB-området. I et første forsøk på å karakterisere denne regulerende løkke, ble fragmentet av pKG634 inneholdende /Cd 857 på oversiden av hok-genet innsatt i et mini- F-plasmid, hvilket ga pF634. Fig. 6 viser induksjonen av dreping av JC411 (pF634) sora viser at drepingen finner sted noe langsom-mere og mindre effektivt enn hva tilfellet er for pKG634 i overensstemmelse med det lave kopitall av F sammenlignet med pBR322.
Et andre parB<+->plasmid (pPR633) ble deretter transformert inn i stamme JC411 (pF634) og induksjonsforsøket gjentatt med denne dobbelplasmid-stamme. Som det kan ses på fig. 6 undertrykker parB-området som foreligger i trans fullstendig den transkripsjonene aktivering av hok-genet. parB-området koder således for en undertrykker av vertsdreping (sok-genet, suppressor of host killing).
Ved anvendelse av denne eksperimentelle konstruksjon som en prøvemetode, ble sok-genet kartlagt på følgende måte: Dobbeltplasmid-stammer inneholdende pF634 og en av utslettelsesderivatene, henholdsvis pPR634, pPR341, pPR154 eller pPR171 ble konstruert og ved å følge vekstmønsteret av disse stammer ved 42°C ble 3ok-fenotypen av utslettelsesderivatene bestemt ved måling av veksten etter temperaturforandringen. Analysen av disse utslettelsesderivater viste at plasmidene pPR634 og pPR154 uttrykker Sok-aktivitet, mens plasmidene pPR341 og pPR171 uttrykker ikke-påvisbare nivåer av Sok-aktivitet.
Plasmidene ble også utprøvet for inkompatibilitetfenotype-karakteristikken for par3<+>(se internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172), og det ble funnet at plasmider som uttrykker Sok-aktivitet også uttrykker parB spesifikk inkompatibilitet, mens plasmider som er Sok~, som beskrevet ovenfor, ikke uttrykker inkompatibilitet. Således representerer parB-inkompatibilitetsreaksjonen en analysemetode for Sok-aktivitet.
På en måte lignende den som er beskrevet for hok-genet, er det område som er nødvendig for sok-genaktivitet blitt snevret inn ytterligere. En av sok~-derivatene brukt i kartleggingsprose-dyren, pPR171, inneholder parB-området som strekker seg fra koordinat -300 til +288 (fig. 1 og 3). Et restriksjonsfragment inneholdende X d 857 ogApR ble innsatt i pPR1 71 på en slik måte at ApR-promotoren leser inn i sok-området av plasmidet, hvilket fører til pKG171 (se Materialer og Metoder).
Plasmid pKG171 ble transformert til stamme CSH50 inneholdende pOU94. Plasmid pOU94 er et lac<+>parB<+>p15-derivat som er fullstendig stabilt arvet på grunn av nærværet av parB-området på plasmidet. Innføring av andre parB<+->plasmider inn i denne stamme fører til destabilisering av pOU94 på grunn av den inkompatibilitet som uttrykkes fra parB. Ved 30°C førte nærværet av pKG171 ikke til destabilisering av pOU94 i noen betydelig grad, mens en klar destabilisering ble påvist ved 42°C. Derfor fører transkripsjonen fra høyre til venstre inn i parB-området av pKG171 til aktivering av incB-området (dvs. sok-genet).
Resultatene som her er beskrevet snevrer ytterligere inn sok-genet, som derfor må være anordnet mellom +194 (pPR634) og +288 (pPR171). Det er også antydet at sok-genpromotoren leser fra høyre til venstre (motsatt av hok-gentranskripsjonen) og er anordnet, i det minste delvis, i området mellom +288 (pPR171) og +336 (pPR154). En formodet -10-sekvens ( TATCCT) er anordnet ved posisjon +262 og en -35-sekvens ( TTGCGG) er anordnet ved posisjon +285 (fig. 3) (Kawley og McClure, Nucleic Acids Res. 11, 1983, pp. 2237-2255). Det antas at disse sekvenser utgjør promotoren for sok-genet.
Eksempel 5
Ytterligere analyse av hok- og sok-genstrukturen og interaksjo-nen mellom hok- og sok-transkriptene
Regulering av hok-genekspresjon på translasjonsnivået ved Sok-genproduktet
For å vinne ytterligere innsikt i reguleringsløkken som styrer ekspresjonen av hok-genet, ble en serie translasjonelle og transkripsjonene fusjoner mellom hok-genet og lacZ-genet konstruert (se fig. 14). Ø-galaktosidaseaktivitetene uttrykt fra de translasjonelle fusjonsplasmider pKG733, pKG734 og pKG741 var meget lave, under én enhet (som definert i Materialer og Meto der). Aktiviteter som er så lave kan ikke måles nøyaktig, og derfor ble et DNA-fragment som koder for den regulerbare iac-promotor innsatt i pKG733, pKG734 og pKG741 på oversiden av de DNA-fragmenter som er avledet fra parB-området, hvilket førte til henholdsvis pKG732, pKG735 og pXG742. Disse plasmider uttrykker lave, men målbare mengder av B-galaktosidase.
Plasmider p3R322 og pPR1 3 (pBR322parB<+>) ble transformert hver for seg til stamme CSH50 inneholdende de translasjonene fusjonsplasmider pKG732 (parB avledet innskudd fra +1 til +342) eller pKG735 (parB-innskudd fra +194 til +342). parB-området som forelå i trans, viste seg å redusere B-galaktosidaseaktiviteten uttrykt fra fusjonsplasmidene fra 6,0 til 3,0 enheter i tilfellet for pKG732, og fra 14,0 til 2,5 enheter i tilfellet for pKG735. Det samme eksperiment ble utført med CSK50, som bar pKG730 og pKG736 som er transkripsjonelle fusjonsplasmider som bærer de samme innskudd som pKG732 og pKG735. Ingen undertrykkelse av det B-galaktosidase som var syntetisert fra disse plasmider ble observert. Man kan derfor trekke den konklusjon at den parB-kodede undertrykker av hok-genekspresjon (sok-genproduktet) virker som et post-transkripsjonelt nivå, sannsynligvis på nivået av translasjon (se nedenunder).
Genetisk kartlegging av sok- genet
Derivater av p3R322 som bærer forskjellige segmenter av parB-området ble transformert til CSH50 som bærer pKG735, og virkningen på hok'-lacZ-fusjonsproteinsyntesen ble målt. Plasmider pPR633 (+1 til +580) og pBR634 (+194 til +580) undertrykket hok<1->lacZ-syntesen fra pKG735, mens pPR341 (+268 til +580) ikke gjorde det. På samme måte undertrykket pPR154 (-300 til +366) hok'-lacZ-syntesen fra pKG735, mens pPR171 (-300 til +283) ikke hadde noen slik virkning. Dette antyder at det aktive undertrykkende gen er anordnet fra +194 (pPR634) til +336 (pPR154). Kartleggingen av sok-genet stemmer overens med kartleggingen av det undertrykkende gen ved bruk av en funksjonell analyse av sok-genets aktivitet (beskrevet i eksempel 4).
Ytterligere karakterisering av sok- qen promotoren For å måle styrken og retningen av sok-promotoren ble forskjel lige Bal31-genererte fragmenter avledet fra parB-området (tabell 1) innsatt foran det intakte lacZ-gen på den transkripsjonene fusjonsvektor pJEL126. Plasmider pPR438 (fusjonspunkt +194) uttrykte høye nivåer av S-galaktosidase, mens pPR341 (fusjonspunkt +268) ikke uttrykte betydelige nivåer av aktivitet, hvilket tydet på at sok-gen promotoren ikke er intakt i PR3 41. Disse resultater viser at sok-promotoren er i det minste delvis lokalisert til området mellom +194 og +268. Plasmid pPR437 (fusjonspunkt på +1) uttrykker en tilnærmet 10 ganger lavere aktivitet enn pPR438, og derfor må man trekke den konklusjon at 90 prosent av sok-gentranskriptene terminerer mellom +1 og +194.
Et DNA-fragment som strekker seg fra Fokl-setet ved +226 (merket 5'-ende) til 3au96l-setet ved +482 ble hybridisert til RNA-preparert stamme CSH50 inneholdende pPR633 (pBR322-parB). Etter S1-nukleasebehandling av DNA-RNA-hybridet ble prøven kjørt på en denaturerende sekvenserende gel sammen med Maxam-Gilbert reaksjoner av den samme DNA-sonde. Et svakt bånd kom til syne svarende til et transkript som starter ved +258. Denne kartlegging av 5'-enden av sok-transkriptet stemte overens med den genetiske kartlegging av sok-promotoren beskrevet ovenfor.
Nukleotidsekvensen i området ovenfor +260 inneholder en formodet -10-sekvens (5'- TATCCT-3') anordnet fra +267 til +262, og en - 35-sekvens (5'- TTGCGC-3') anordnet fra +290 til +285 (baser som svarer til E. coli-promotorkonsensussekvenser i henhold til Hawley og McClure (op.cit.), er vist med understrekede boksta-ver). Således bekrefter all den informasjon som for tiden er tilgjengelig, både genetisk og fysisk, den antagelse som er gjort i eksempel 4 at disse sekvenser utgjør sok-gen promotoren. Transkripsjonen av B-galaktosidase fra lac-promotoren (pKG736) gir et utbytte på ca. 300 enheter. S-galaktosidasen transkribert fra sok-promotoren (pPR433) gir et utbytte på 1500 enheter. Således er sok-promotoren en sterk promotor med en aktivitet som er tilnærmet 5 ganger større enn for lac-promotoren.
Målet for sok- genproduktet er anordnet inne i sok- genet
De translasjonelle fusjonsplasmider vist på fig. 14 ble brukt til å kartlegge målet for sok-genproduktet (sok-T). Tilsetning av sok-genet in trans via pPR13 til pKG732 (innskudd fra +1 til +342) og pKG735 (innskudd fra +134 til +342) undertrykket syntesen av hok 1-lacZ-fusjonsproteinene uttrykt ved disse plasmider, mens ingen slik virkning var åpenbar i tilfellet for pKG742 (innskudd fra +268 til +342, fig. 14). Således trekker man den konklusjon at det genetiske mål for sok-RNA kodes for ved det DNA som strekker sey fra +194 til +268 og nøyaktig overlapper det område som koder for sok-RNA selv. Plasmid pKG742 uttrykker ikke sok-RNA, og dette plasmid var ventet å gi høyere mengder hok<1->lacZ-fusjonsprotein enn observert (se nedenunder).
S1- nuklease- kartleqging av 5'- enden og 3'- enden av hok- mRNA
En åpenbar promotorlignende struktur i DNA-sekvensen på oversiden av hok-genets koderamme er antydet på fig. 3. Denne formodede promotor, phok, har -1O-sekvensen (5'- TATGAT-3') og -35-sekvensen (5'-TGGTCA-3') separert ved 18 bp, ingen andre åpenbare promotorlignende sekvenser finnes på oversiden av hok-genets kodingsområde.
5<1->enden av hok-gentranskriptet ble identifisert med den 31-nukleasebaserte teknikk som er beskrevet i Materialer og Metoder. Sonden som ble brukt strakte seg fra Fokl-setet ved +229 (merket 5'-ende) til SfaNI-setet ved +13. Sonden ble hybridisert til RNA fremstilt fra stamme CSH50 inneholdende pPR633 (pBR322-par3<+>), behandlet med nuklease-S1 og kjørt på en polyakrylamidgel sammen med Maxam og Gilbert-reaksjonene av den samme DNA-sonue. Videre ble sonden også hybridisert til RNA fremstilt fra kulturprøver som var blitt tatt ut på forskjellige tidspunkt etter tilsetning av rifampicin til kulturen. Før rifampicintilsetning kommer et meget svakt bånd til syne som svarer til et transkript som starter ved +130, hvilket svarer til et transkript som starter ved +130 nøyaktig i overensstemmelse med den promotorstruktur som er antydet ved DNA-sekvensen. Tilsetningen av rifampicin førte til en tidsavhengig forbedring av hybridiseringen mellom DNA-sonden og RNA som starter ved +130: Ved 25 minutter etter tilsetningen av rifampicin var
hybridiseringen flere størrelsesordener nier effektiv enn før tilsetningen av rifampicin. Det antas derfor at det viktigste hok-gentranskript starter ved posisjonen +130. Den rifampicininduserte tidsavhengige forbedring av hybridisering mellom transkriptet som starter ved +130 og den DNA-sonde som ble brukt, antas å reflektere svekkelsen av en inhibitor av hybridi-seringsreaksjonen mellom hok-mRNA og DNA-sonden. Denne inhibitor er høyst sannsynlig Sok-RNA som er komplementær til den samme del av hok-mRNA som den DNA-sonde som ble brukt. Det skal bemerkes at der ikke var noen hindring av hybridisering mellom hok-mRNA og DNA-sonden komplementær til 3<1->enden av hok-mRNA.
3'-enden av hok-mRNA ble også kartlagt ved 31-nukleaseteknikken. Et DNA-fragment som strekker seg fra +342 (Sau3A-setet) til +580 (EcoRI-setet) ble merket i 3'-enden av Sau3A-setet og hybridisert til RNA fremstilt fra CSH50 (pPR633), behandlet med 31-nuklease og kjørt på en polyakrylamidgel sammen med Maxam-Gilbert-reaksjonene av DNA-sonden. Hoveddelen (80-90 prosent) av hok-gentranskriptene terminerte ved stilling +561, 562 og 563, og mindre transkripsjonsavslutningspunkter på oversiden av disse posisjoner ble også observert. Posisjon +561 følger etter en potensiell stammeløkke-struktur (stem-loop structure) med en GC-rik stamme, fulgt av en serie U'er som ligner på typiske rho-uavhengige transkripsjonsavslutnings-strukturer (Rosenberg og Court, Ann. Rev. Genet. 13, 1979, pp.319-353).
Således begynner det viktigste hok-gentranskript ved +131/132 og slutter rundt +562.
Styrken av hok-promotoren ble bestemt ved det transkripsjonene fusjonsplasmid pKG730 (fig. 14), som inneholder lac-promotoren og hok-promotorene i tandem foran det intakte lacZ-gen. B-galaktosidaseaktiviteten uttrykt fra pKG730 i CSH50 er ca. 300 enheter. For å unngå transkripsjon fra lac-promotoren ble et pBR322-derivat som bærer lacl-genet (pHB4) transformert til CSH50 (pKG730). Denne dobbeltplasmid-stamme uttrykker et B-galaktosidasenivå på 100 enheter (lacl-genet som foreligger i trans på et multikopiplasmid reduserer aktiviteten av lac-promotoren til under 1 prosent av aktiviteten av den ikke- undertrykte tilstand). Således er hok-promotoren forholdsvis svak med en aktivitet på ca. 50 prosent eller mindre i forhold til lac-promotoren. sok-promotoren er ca. 5 ganger sterkere enn lac-promotoren, og sok-promotoren må derfor være minst 10 ganger mer aktiv enn hok-promotoren.
Induksjon av translasjonen av hok- mRNA ved tilsetning av rifampicin
Plasmid pKG780 er et pBR322-derivat som bærer sok-genet, hok<1->lacZ-hybridgenet som fås fra pKG733, en del av lacY-genet og den del av parB-området som koder for hok-mRNA-avslutningen. Plasmid pKG732 er identisk med pKG730, bortsett fra at det på nedsiden anordnede parB-innskudd er erstattet med avslutningsdelen av tetracyklin-genet som fås fra pBR322. Til tross for det høye kopitall av disse plasmider uttrykker de svært lave nivåer av S-galaktosidase (ca. 1 enhet i begge tilfeller), hvilket svarer til svært få 6-galaktosidasemolekyler pr. celle.
Rifampicin ble satt til (300 ug/ml) eksponentielt voksende kulturer av CSK50 inneholdende enten pKG780 eller pKG782, og prøver ble tatt ut for å bestemme B-galaktosidaseaktivitet. Der var ingen økning i aktiviteten i de første 10 minuttene etter tilsetningen av rifampicin, men deretter ble en induksjon av 6-galaktosidaseproduksjon (og følgelig translasjon av hok'-lacZ-mRNA) observert. Syntesen av hok'-lacZ-fusjonsproteinet varer i ca. 80 minutter i begge tilfeller. Halveringstidene for hok'-lacZ-hok<1->og hok'-lacZ-tet'-mRNA ble beregnet til å være henholdsvis ca. 22 og 20 minutter (se Materialer og Metoder).
Således bevirket ikke innsettingen av hok-mRNA-avslutningen på nedsiden av LacZ-genet noen betydelig økning i stabilitet av det hok'-lacZ hybride mRNA.
Konklusj oner
Påvisning av RNA-transkripter syntetisert fra parB-området viser at hok-mRNA begynner ved +131/132 og slutter rundt +562, og at sok-RNA begynner ved +260 og slutter mellom +1 og +194. Følgelig er sok-RNA komplementært til ledersekvensen av hok-mRNA (fig.
3). Analysen av promotor- og gen-fusjoner mellom hok-genet og lacZ-genet viser at sok-genet koder for en undertrykker av hok-genekspresjon, som virker på det post-transkripsjonelle nivå. Området fra +194 til +336 koder for en aktiv undertrykkergen som transkriberes i motsatt retning i forhold til hok-gentranskripsjonen. Ikke noen åpenbar proteinkodende ramme foreligger i sok-genområdet, og man trekker derfor den konklusjon at undertrykke-ren som er kodet for ved sok-genet er et lite antisans-RNA (antisense RNA) som ved hybridisering til det komplementære hok-mRNA hindrer translasjonen av den sistnevnte. Denne observasjon understøttes ved kartleggingen av målet av sok-genproduktet (sok-T), som var lokalisert til området som koder for ledersekvensen av det hok-mRNA som er komplementært til sok-RNA (+194 til +268).
sok-T-ornrådet er anordnet på oversiden av SD-sekvensen av hok-mRNA, og derfor kan unuertrykningen av translasjon ved sok-RNA ved hybridisering til hok-mRNA høyst sannsynlig forklares ved dens langtidsvirkninger (øyensynlig på den sekundære struktur av mRNA). Det område som koder for ledersekvensen av hok-mRNA (og følgelig sok-T) er rik på dyad-symmetrier. hok-mRNA har poten-siale for å danne tre starnmeløkke-strukturer i området fra +194 til +303, vist som henholdsvis I (AG = -16 kcal/mol), II ( G = - 20 kcal/mol) og III (AG = -26 kcal/mol) på fig. 3. sok-mRNA er komplementært til det område som koder for løkke I, deler av løkke II, men ikke løkke III. Shine-Dalgarno-sekvensen av hok-genet vil, dersom løkke III dannes, bli sekvestrert i stammen av denne energirike løkke. Det er derfor sannsynlig at dannelsen av løkke III er en forutsetning for undertrykkelsen av hok-mRNA-translasj onen.
5tammeløkke-strukturene II og III overlapper og kan derfor ikke dannes samtidig. Dersom løkke II dannes, vil SD-sekvensen sannsynligvis ikke bli sekvestrert i den sekundære struktur av mRNA, og SD-sekvensen vil tilegne seg en "åpen tilstand" fritt tilgjengelig for å translateres av ribosomene. Det antas derfor at hybridiseringen av sok-RNA til hok-mRNA forandrer mønsteret av løkkedannelse av mRNA fra en "åpen tilstand" (dannelse av løkke II) til en "lukket tilstand" (dannelse av løkke III), hvilket gir et aiRNA som ikke kan translateres av ribosomene.
S-galaktosidaseaktiviteten uttrykt fra pKG472, hvor hok'-lacZ-genet er transkribert fra lacUV5-promotoren var uventet lav (20 enheter), da dette plasmid ikke inneholder sok-genet. Området på oversiden av SD-sekvensen av pKG742 inneholder en intakt løkke III, men ikke løkke I eller II. Følgelig kan løkke III stadig dannes, uten konkurranse fra løkke I eller løkke II, og dette kan være.grunnen til den lave B-galaktosidaseekspresjon fra dette mRNA.
Tilsetningen av rifampicin til celler inneholdende plasmider pKG780 eller pKG782, induserte syntese av hok'-lacZ hybride mRNA som ble funnet å være meget stabile med en halveringstid på ca. 20 minutter. Det er overraskende at det hybride mNRA inneholdende avslutningen av tetracyklin-gen mRNA (pKG732) er like stabilt som det hybride mRNA som inneholder den native hok-mRNA-avslutning (pKG780). Dette resultat kan ikke lett ekstrapoleres til den ville type hok-mRNA, men man kan trekke den konklusjon at 5'-enden av hok-mRNA ledersekvensen (fra +1 til +342) koder for en determinant som er viktig for stabiliteten av hok-mRNA-molekylet.
Den opprinnelige tidsforsinkelse i S-galaktosidasesyntese kan lettest forklares som en refleksjon av nedbrytningstiden for inhibitoren for hok<1->lacZ-proteinsyntese, det vil si sok-RNA.
Den rifampicininduserte tidsavhengige forbedring av hybridise-ringsreaksjonen mellom hok-mRNA og DNA-sonden som brukes til kartlegging av 5'-enden av hok-mRNA kan lettest forklares som følger: Det er kjent at RNA hybridiserer flere størrelsesordener hurtigere med RNA enn med DNA (Favaloro et al, i Methods in Enzymology 65, 1983, pp. 718-749). Derfor hindrer nærværet av sok-RNA (før rifampicintilsetning) hybridiseringen mellom 5'-enden av hok-mRNA og den komplementære DNA-sonde, fordi hok-mRNA oppviser en hurtigere hybridiseringsreaksjon med sok-RNA enn med DNA-sonden (sok-RNA og DNA-sonden brukt i dette eksperiment er komplementære til den samme del av hok-mRNA). Etter tilsetning av rifampicin, som hindrer dannelse av nye transkripter, øker hybridiseringen mellom hok-mRNA og DNA-sonden komplementær til 5'-enden av hok-mRNA kraftig med tiden. Denne forbedring av hybridisering gjenspeiler svekkelsen av hybridiseringsinhibito-ren, sok-RNA. Det skal bemerkes at der ikke er noen hindring av hybridiseringen mellom hok-mRNA og en DNA-sonde komplementær til 3<1->enden av hok-mRNA. Betydelige mengder hok-mRNA foreligger i cellene selv 25 minutter etter tilsetningen av rifampicin, hvilket tyder på at hok-mRNA er ualminnelig stabilt. Disse fortolkninger er i full overensstemmelse med kinetikken for hok 1-lacZ-fusjonsproteinsyntese som observeres i rifampicin-induksj ons-forsøkene.
?å fig. 13 er en modell som forklarer drepingen av celler som har tapt et parB-bærende plasmid under den tidligere celledeling vist: Nærværet av et parB-bærende plasmid i cellen gir opphav til cytoplasmiske produkter av hok- og sok-genene, hok-mRNA og Sok-RNZ*. hok-mRNA er stabilt med en halveringstid på 20 minutter eller mer, mens Sok-RNA som hindrer translasjon av hok-mRNA er ustabilt, men foreligger i overskudd. Følgelig, i en plasmidbærende celle, hindrer Sok-RNA syntese av Hok-proteinet, og cellen forblir levedyktig. Når på den annen side en plasmidfri celle fremkommer, f.eks. ved ujevn fordeling av plasmidmolekylene ved celledeling, avtar de ustabile Sok-RNA i denne celle, hvilket etterlater hok-mRNA fritt tilgjengelig til å bli translatert av ribosomene, Hok-proteinet blir syntetisert, og dreping av den plasmidfrie celle følger.
En viktig testbar forutsigelse fremkommer fra den post-segrega-sjonelle depresjonsmodell av hok-genekspresjon foreslått ovenfor: Alle ustabilt arvede plasmider kan stabiliseres ved parB-området, da drepemekanismen er uavhengig av den egentlige grunn til tap av plasmidet. Følgelig er det vist at parB-området stabiliserer mange typer replikon som strekker seg fra plasmider med lavt kopitall (f.eks. R1 (se internasjonal patentsøknad nr. PCT/DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172)) til plasmider med høyt kopitall (p15A, pBR322 (se PCT/DK33/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172) og RSF1010) - som alle er blitt ustabile etter genetisk manipulering. oriC-minikromosomer kan også stabiliseres ved parB-området. Overraskende nok stabiliserer parB-området et meget ustabilt RSF1010-lacZ<+->derivat i P. putida (se eksempel 12).
Lignende regulerende systemer omfattende regulering av translasjonen av et mRNA-materiale ved et antisans-RNA-molekyl er blitt beskrevet tidligere (Light og Molin, The EMBO Journal 2, 19S3, pp.93-98, R.W. Simons og N. Kleckner, Cell 34, 1 983,..pp. 683-691, Mizuno et al, Proe. Nati. Acad. Sei., 1984, pp. 1966-1970), og til og med kunstige systemer hvor syntetiske sekvenser er blitt innsatt som koder for antisens-RNA komplementært til lederregionen av et mRNA er blitt beskrevet (Izant og Weintraub, Cell 36, 1984, pp. 1007-1015).
Eksempel 6
Oppdagelse av en E. coli kromosomal homolog av R1 parB (se fig.
8a)
Da plasmidutvikling har omfattet en utstrakt utveksling av genetisk informasjon mellom bakterielle kromosomer og fritt replikerende DNA-molekyler, ble det kromosomale DNA av E. coli analysert for mulige forfedresekvenser for R1 parB-sekvensene.
I felt 6 på fig. 8a ble det samlede EcoRI-begrensede DNA fra plasmidfri E. coli JC411 analysert ved filterhybridisering til en parB-sonde, se Materialer og Metoder. Et fragment på 20 kb kan ses å gi et ganske svakt, men bestemt signal som også kan påvises i andre felter inneholdende E. coli-DNA dersom de er eksponert i den samme tid (felter 4, 5). Den kromosomale sekvens anslås til å være ca. 55 prosent homolog med parB. Den kromosomale sekvens er kalt pari i det etterfølgende.
Et stort spørsmål er selvfølgelig i hvilken utstrekning oppdagelsen av homologi på nivået av nukleotidsekvensen også gjenspeiler likhet med hensyn til funksjon av de produkter som er kodet for ved de homologe oiaråder, en side som skal behandles nærmere i eksempel 7.
Eksempel 7
Genetisk organisasjon av en E. coli kromosoma! homolog av R1 parB og dens funksjonelle forhold til RI parB (se fig. 7) hok-genet av plasmid R1 definert i eksempel 3, koder for et polypeptid av 52 aminosyrer. Aminosyresekvensen av hok-genproduktet ble sammenlignet med et stort antall kjente protein-sekvenser. Det ble overraskende funnet at et polypeptid på 51 aminosyrer kodet for ved relB-orf3-genet av E. coli relB-operonen (Bech et al, The EMBO Journal 4, 1985, pp. 1059-1066) oppviste betydelig homologi med hok-produktet. Aminosyresekvensene av de to homologe proteiner er vist på fig. 7, som viser at 42 prosent (22) av aminosyrene er identiske i de to proteiner. For 17 prosent (9) av aminosyrene er forandringene konservative, hvilket betyr at en aminosyre er blitt erstattet med en aminosyre med lignende kjemiske egenskaper (det vil si hydrofobisi-tet, ladning etc), hvilket fører til en samlet homologi på 61 prosent. Spesielt de ladede aminosyrer er godt bevart i likhet med cysteinrestene i stillinger 16 og 31 (fig. 7).
DNA-sekvensene av hok-genet og av relB-orf3 ble også sammenlignet som vist på fig. 7. Koordinatene som ble brukt i det etterfølgende er parB<+->sekvenskoordinater som på fig. 3. Fra koordinater +290 til +460 er der 55 prosent homologi mellom de to sekvenser. Det fremgår fra fig. 7 at det bevarte område omfatter nukleotider på oversiden og nedsiden av den proteinkodende sekvens som er anordnet fra +304 til +460. Bevaringen av baser utenfor det kodende område antyder at regulerende trekk av de to gener også er blitt i det minste delvis bevart.
For å vise at sekvenshomologien gjenspeiler likhet i funksjon, ble et plasmid som bærer A pR-promotorfragmentet på oversiden av rel3-orf3-genet konstruert (se beskrivelsen av en analog type konstruksjon brukt i kartlegging av hok-genet i eksempel 3).
Når A pR-formidlet transkripsjon inn i relB-orf3 induseres, observeres en hurtig dreping av cellene med en kinetikk som ligner på den som observeres for bakterier inneholdende plasmid pKG341, som beskrevet i eksempel 3. På samme måte ble alle cellene i kulturen transformert inn i de hok-karakteristiske "spøkelsesceller" (se fig. 5).
Der er således en påfallende homologi mellom hok-genet av plasmid R1 og relB-orf3 av E. coli relB-operonen både på det strukturelle og funksjonelle nivå.
Eksempel 8
parB-homologe sekvenser på forskjellige plasmider (se fig. 8a)
Filterhybridiseringsanalyse av samlet EcoRI-begrenset DNA fra et antall stammer E. coli inneholdende forskjellige plasmider ble utført ved bruk av parB-sonden (felter 1-5 på fig. 8a).
Plasmidet R1drd-19 er et medlem av R1-plasmidfamilien, fra hvilken parB-sonden opprinnelig ble klonet. R1drd-19 foreligger i to kopier pr. bakteriegenom. EcoRI-begrenset samlet DNA fra E. coli 1005/R1drd-19 er analysert i felt 1. Et sterkt hybridiserende fragment på 19,5 kb kan ses, hvis størrelse er i overensstemmelse med den genetiske kartlegging av parB-funksjonen til det 19,5 kb R1-plasmid (internasjonal patentsøknad nr. PCT/- DK83/00086, publikasjonsnr. WO 84/01172).
Plasmidet R100 er nær beslektet med RI som bærer et transponer-bart element Tn10 innenfor det område som er ekvivalent med 19,5 kb EcoRI-A-fragmentet av R1. Transposonen inneholder gjenkjen-ningssekvensen for EcoRI, og følgelig blir et ytterligere EcoRI-sete innført i det R1-lignende EcoRI-A-fragment og splitter dette i de to EcoRI-A- og EcoRI-D-fragmenter av R100 (Miki et al, J. Bacteriol. 144, 1930, pp. 87-99). Disse to EcoRI-fragmenter av R100 inneholder begge sekvenser som ved heterodupleks-kartlegging er funnet å være homologe med sekvenser som foreligger av F-faktoren (Sharp et al, J. Mol. Biol. 75, 1973, p. 235). Et sterkt hybridiserende fragment på 12,8 kb ses i felt 2, fig. 8a, som derved kartlegger parB-området av R100 til EcoRI-D-fragmentet av R100, innenfor senteret av området for homologi mellom R1 og R100 og F.
Denne lokalisering av parB innenfor F-homologi-området av R100 førte til leting etter parB-lignende sekvenser på plasmider som hører til inkompatibilitetsgruppen, IncFI.
EcoRI-begrenset samlet DNA fra B210/R386, en E. coli-stamme som inneholder IncFI-plasmidet R386, ble analysert ved filterhybridisering ved bruk av parB-sonden (felt 3, fig. 8a).
Plasmidet R386, som hører til den samme inkompatibilitetsgruppe som F, ble funnet å gi et parB-hybridiseringssignal svarende til et EcoRI-fragment på 19,5 kb. Da dette plasmid foreligger i 0,5-1 kopier pr. genom, antyder oppdagelsen av et signal på ca. en tredjedel av RI 00-signalet (felt 2, fig. 8a) at graden av homologi mellom R1 parB og de R386 par3-lignende sekvenser er 55-60 prosent.
Letingen etter parB-beslektede sekvenser ble utvidet til andre inkompatibilitetsgrupper. Plasmidet RP1, som hører til inkompatibilitetsgruppen IncP, ble analysert.
Med parB-sonden gir det samlede EcoRI-begrensede DNA fra 1005 (RP1) et hybridiseringssignal svarende til det EcoRI-lineæri-serte plasmid (felt 4, fig. 8a). Videre ses et iiybridiserende bånd på 20 kb svarende til pari, hvilket ble diskutert i eksempel 5.
Da RP1 er tilpasset til stabil opprettholdelse i et vidt område gramnegative bakterielle verter, åpner oppdagelsen av parB-beslektede sekvenser på RP1 for muligheten av at oppretthol-delsessystemer analoge med R1 parB-systemet, som er operativt i E. coli såvel som i Pseudomonas putida (eksempel 11), kan fungere i en rekke bakterielle verter.
Nok et plasmid, R6-K (IncX inkompatibilitetsgruppe), ble funnet å bære sekvenser med tilnærmet samme hybridiseringsegenskaper som RP1, hvilket viser seg ved nærværet av et 25 kb EcoRI-fragment av R6-K, som hybridiserer parB-sonden (felt 5, fig. 8a).
Plasmidet F med lavt kopitall er blitt analysert i detalj for å bestemme hvorvidt nærværet av R1 parB hybridiseringssekvenser gjenspeiler tilstedeværelsen av en stabiliseringsmekanisme beslektet med den for R1 parB.
To plasmid-stabiliseringsfunksjoner er blitt identifisert innenfor genomet av F, og de tilsvarende gener (sop (Ogura og Hiraga, Cell 32, 1983, pp. 351-360) og ccd (Ogura og Hiraga, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 30, 1933, pp. 4784-4783)) er blitt lokalisert til EcoRI-fragmentet som spenner over kartposisjonene 40,3 til 49,5.
Filterhybridiseringsanalyse av samlet DNA fra E. coli 1005 inneholdende F viste at R1 parB-beslektede sekvenser forelå på et 10,7 kb EcoRI-fragment av F (kartposisjon 49,5 til 60,2), og ytterligere hybridiseringsanalyser av 1005(F)-DNA digestert med EcoRI og/eller BarnHI kartla disse sekvenser til et 4,5 kb BamHI-EcoRI-fragment som strekker seg fra kartposisjon 55,7 til 60,2. Dette tyder på tilstedeværelsen av en tredje plasmidstabiliserende funksjon innenfor F.
Det område av F som hybridiserer R1 parB-sonden ble deretter klonet inn i en bakteriofag /.-vektor. EcoRI-digestert DNA fra 1005(F) ble størrelsefraksjonert ved preparativ agarosegelelektroforese, og fragmenter på 9,5-12 kb ble utvunnet ved elektroeluering fra gelen. Fragmentene ble ligatisert på EcoRI-setene på de venstre og høyre armer avÅL147 og pakket in vitro for å gi infektiøse fager (se Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 1982, p. 256), som deretter ble brukt til å infisere E. coli LE392. Rekombinante fager som bærer R1 parB-beslektede sekvenser ble identifisert ved plaquehybridisering.
Fra en rekombinant fag som bærer 10,7 kb EcoRI-fragmentet som innbefatter de RI parB-beslektede sekvenser, ble fragmentet isolert og innsatt i pUC8 på EcoRI-setet. I et resulterende plasmid, pNL1, er innskuddet sådant orientert at kløyving av pNLI-DNA iaed BarnHI fører til at der skjæres løs et 4,5 kb fragment som bærer de R1 parB-hybridiserende sekvenser.
4,5 kb BarnHI-fragmentet fra pNL1 ble isolert, og det område som hybridiserer R1 parB-sonden ble kartlagt på et Rsal-fragment på 870 bp ved filterhybridiseringsanalyse. Det 370 bp Rsal-fragment ble isolert og innsatt i Smal-setet på Ml3mp9. Et antall
rekombinante fager som bærer R1 parB-beslektede sekvenser på et 370 bp innskudd ble identifisert ved plaquehybridisering. Nukleotidsekvensen av det innsatte DNA ble analysert i henhold til Sanger et al, Froc. Nati. Acad. Sei. USA 74, pp. 5463-5467.
Nukleotidsekvensen fra en del av en av de rekombinante fager, mpNL12, omfatter 402 baser som strekker seg fra Rsal-setet, og denne sekvens er 90 prosent homolog med området fra +178 til +580 avR1 parB-sekvensen (fig. 3). Alle essensielle trekk av R1 parB-området finnes også i den F-avledede sekvens: (1) en åpen leseramme som koder for et protein på 50 aminosyrer foreligger svarende til R1 hok-genet, (2) ribosombindingssetet av R1-hok er bevart, (3) det område som svarer til den 3'-ikke-translaterte del av R1 parB-mRNA, som antas å være nødvendig for hok-mRNA-stabilitet, er godt bevart (90 prosent homologi), og (4) de formodede -10- og -35-områder av R1 sok er også bevart.
Den åpne leseramme innenfor den F-avledede sekvens koder for et protein av 50 aminosyrer som avviker bare litt fra det R1 spesifiserte hok-protein. For det første er to kodoner i R1-hok blitt slettet, nemlig val-15 og ser-29. For det andre har to konservative substitusjoner funnet sted, nemlig leu-16 til val og his-39 til tyr.
Det er åpenbart at R1 hok-genet og de beslektede sekvenser på F stammer fra en felles forfedresekvens, og videre, bevaringen av et kodende område svarende til R1-hok tyder sterkt på at det kodede protein er involvert i stabiliseringen av F.
For å teste for plasmidstabiliserende egenskaper av den F-avledede sekvens, ble 4,5 kb BamKI-fragmentet fra pNL1, som bærer de F hok-lignende sekvenser, innsatt i pJEL82, et plasmid med lavt kopitall med en tapsfrekvens på 10~<2>pr. generasjon (se PCT/DK83/00084, publikasjonsnr. WO 84/01171). Det resulterende plasmid, pJEL82/F, samt pJEL82, ble transformert inn i E. coli H3101. Kulturer av de to stammer ble dyrket i 16 timer uten seleksjonstrykk, og fraksjonen av plasmidholdige celler (Ap<R>) ble bestemt. Resultatet var som følger:
Man trakk derfor den konklusjon at 4,5 kb BarnHI-fragmentet som bærer R1 parB-beslektede sekvenser utøver en plasmidstabiliserende virkning. Dersom stabiliseringen skyldes nærværet av det hok-lignende gen inne i F-fragmentet, vil tilsynekomsten av spøkelsesceller ventes i kulturer av celler som inneholder pJEL82/F dyrket uten seleksjonstrykk, se eksempel 3. En over natten-kultur av celler inneholdende pJEL82/F ble funnet å inneholde ca. 5 prosent spøkelsesceller som ikke kunne skjelnes fra R1 hok-induserte spøkelsesceller.
Når det gjelder F, gjenspeiler demonstrasjonen av sekvenser beslektet med R1 parB ved filterhybridisering således at der eksisterer en funksjonelt lignende plasmidstabiliseringsmeka-nisme.
Eksempel 9
Trinnvis hybridisering som en strategi for påvisning av replikonstabiliserende sekvenser homologe med parB-beslektede sekvenser (se fig. 8b)
Forholdende for hybridisering bestemmer graden av homologi mellom en sonde og et filterbundet DNA-materiale som er nødven-dig for å gi et påvisbart signal, se diskusjonen i Materialer og Metoder. Følgelig kan filterbundne sekvenser eksistere som forblir upåvisbare med den gitte sonde under det gitte sett hybridiseringsbetingelser, men som ikke desto mindre kan kode for en hok-lignende aktivitet, se diskusjonen om homologi versus funksjon i Materialer og Metoder. Dette er vist i det følgende eksperiment.
Som beskrevet i eksempel 6 representerer relB-orf3 en kromosomal homolog av RI parB basert på sekvenssammenligningsdata og den funksjonelle likhet mellom hok og relB-orf3. relB-orf3- og flankerende sekvenser, slik de foreligger i plasmid pBD2724, ble brukt som sonde i en filterhybridiseringsanalyse av E. coli kromosomalt DNA.
Plasmid pBD2724 er et pER322-derivat inneholdende et KincII-Mlul-fragment fra relB-operonen av E. coli omfattende den relB-orf3-kodende sekvens (koordinater 1070-1350 i henhold til Bech et al, op.cit.).
I felt 3, fig. 3b, blir det samlede EcoRI-begrensede DNA fra plasmidfri E. coli analysert ved filterhybridisering ved bruk av relB-orf3-sonden. Foruten det 20 kb hybridiserende fragment som sannsynligvis representerer den ovenfor identifiserte pari-sekvens (eksempel 6), påvises nok et hybridiserende fragment på 16 kb. Da intensiteten av det sistnevte er større enn intensiteten av 20 kb-signalet, må det 16 kb EcoRI-fragment strekke seg over E. coli relB-orf3-genet brukt som hybridiseringssonde, det vil si intensiteten av 16 kb-signalet skaffer en referanse, fra hvilken grader av homologi kan anslås. Intensiteten av pari-hybridiseringssignalet, som er ca. 3/4 av relB-orf3-signalet, antyder at pari er ca. 65-70 prosent homolog med relB-orf3. Da det 16 kb relB-orf3-bærende fragment ikke påvises med parB-sonden (felt 6, fig. 8a), er RI parB 50 prosent eller mindre homologt med relB-orf3.
I eksempel 5 ble det funnet at parB-sonden påviser den 20 kbp kromosomale homolog, men ikke den 16 kbp homolog som representerer i henhold til de ovenfor angitte data relB-orf3. Da den sistnevnte, som beskrevet i eksempel 6, utøver hok-lignende aktivitet når den uttrykkes, kan det antas at pari også vil uttrykke hok-lignende aktivitet eller sok-lignende aktivitet og/eller begge aktiviteter når den er riktig uttrykt.
relB-orf3-fragmentet ble brukt som en sonde i filterhybridiseringsanalyse av E. coli inneholdende plasmid R100 og R386, som begge inneholder R1 parB-lignende sekvenser (fig. 3a, felt 1 og 2). Under det sett hybriuiseringsbetingelser som rådet, påviste ikke relB-orf3-sonden disse sekvenser (fig. 8b, felt 1 og 2), da bare det 20 kb pari-fragment og det 16 kb relB-orf3-bærende fragment kan ses å hybridisere sonden, hvilket antyder at
fraværet av hybridisering mellom en sonde fra et område som uttrykker hok eller hok-lignende aktivitet og et gitt DNA-materiale ikke utelukker at det aktuelle DNA-materiale kan utøve hok-lignende aktivitet dersom det er riktig uttrykt. Oppdagelsen av homologi mellom det aktuelle DNA-materiale og det område som uttrykker hok eller hok-lignende aktivitet tyder derfor sterkp på at det aktuelle DNA-materiale vil utøve hok- eller hok-lignende aktivitet dersom det uttrykkes riktig.
De ovenfor angitte data avslører derfor en nyttig strategi i søkingen etter områder som utøver hok/sok-lignende aktiviteter: En sonde som representerer et område av nukleinsyre omfattende hok eller hok-lignende gener (f.eks. R1 parB) benyttes til å påvise homologe sekvenser (f.eks. pari) innenfor det aktuelle genom (f.eks; kromosomalt eller plasmid DNA) som deretter testes for hok eller hok-lignende aktivitet (slik det ble gjort for relB-orf3-området) i de riktige eksperimentelle omgivelser, og dersom det viser seg å kode for slik aktivitet eller aktiviteter, blir de i neste omgang selv brukt som sonder i en andre runde hybridiseringer for å definere nye homologe sekvenser som eventuelt er beslektet med de sonder som anvendes i den første runde hybridiseringer (f.eks. R1 parB). Denne trinnvise fremgangsmåte som kombinerer nukleinsyrehybridisering og funksjonelle analyser av de isolerte nukleinsyresekvenser kan tilpasses som en generell strategi for å søke etter gener som uttrykker hok eller hok-lignende aktiviteter i genomer som i økende grad er separert fra E. coli på utviklingsskalaen.
Eksempel 10
Påvisning av parB-beslektede sekvenser i bakterier (se fig. 9 og 10)
I de tidligere eksempler bie det vist 1) at sekvenser beslektet med R1 parB er vidt fordelt blant bakterielle plasmider isolert fra gramnegative bakterier, og 2) at sekvenser beslektet med R1 parB foreligger i det kromosomale DNA av E. coli. Disse oppdagelser ga støtet til en leting etter sekvenser beslektet med enten R1 parB eller en av. de kromosomale motstykker (E. coli relB-orf3) i DNA fra en rekke forskjellige bakterier som- en del av enten deres kromosomale DNA eller av plasmider som naturlig foreligger i disse organismer.
Filterhybridiseringsanalyse av EcoRI-begrenset DNA fra Serratia marcescens med R1 parB-sonden viser intens hybridisering til 3 fragmenter på 4,1, 2,9 og 2,5 kb (felt 2, fig. 9). Bare 4,1 kb-fragmentet hybridiserer også relB-orf3-sonden (felt 1, fig. 10). parB-sonden hybridiserer ytterligere 6 fragmenter. To av disse signaler er sterkere enn parB-signalet som fås fra det reiB-orf3-bærende 16 kb fragment i E. coli-DNA (felt 6, fig. 9). Hybridisering av Serratia marcescens-DNA med E. coli relB-orf3-sonden gir et antall svake hybridiserings signaler.■ Det er mulig at de sterke hybridiseringsbånd på 2,5, 2,9 og 4,1 kb er avledet fra plasmid(er), selv om agarosegelelektroforese ikke avslørte noen plasmider med høyt kopitall.
Pseudomonas fluorescens ble analysert som et plasmidfritt medlem av denne art. Hybridisering av DNA fra Pseudomonas fluorescens med R1 parB (felt 3, fig. 9) viser 8-10 hybridiserende fragmenter, av hvilke 4 oppviser signaler med intensiteter på ca. 33 prosent av det kromosomale motstykke til R1 parB (felt 6, fig. 9). Et enkelt av disse fragmenter, på ca. 13 kb, hybridiserer også sannsynligvis E. coli relB-orf3-sonuen (felt 2, fig. 10). Dessuten identifiserer relB-orf3-sonden 5 fragmenter i særdeles-het, skjønt ved lav signalintensitet. To av disse, på 5,5 og 5,6 kb, ses også i DNA fra Pseudomonas putida når dette DNA analyseres ved bruk av relB-orf3-sonden (felt 3, fig. 10). relB-orf3-sonden hybridiserer til ytterligere 5 fragmenter i Pseudomonas putida-DNA, men ingen av disse fragmenter gjenkjennes av R1 parB-sonden (felt 4, fig. 9). I Pseudomonas putida-DNA oppdager parB-sonden ca. 10 fragmenter med lav signalintensitet og et enkelt ganske sterkt hybridiserende fragment på ca. 7,3 kb.
Blant grampositive bakterier ble B. subtilis, B. circulans PL236 og to stammer av Lactobacilius analysert for nærværet av sekvenser beslektet med enten R1 parB eller E. coli relB-orf3.
I tilfellet for parB-sonden ble et enkelt ganske sterkt hybridiserende fragment på 5.2 kb funnet i DNA fra B. circulans (felt 8, fig. 9). Meget svake signaler ble oppnådd fra noen få
ytterligere fragmenter av B. circulans-DNA. Med relB-orf3-sonden ble et begrenset antall hybridiserende fragmenter sett i DNA fra B. subtilis (felt 4, fig. 10), B. circulans (felt 5, fig. 10) og Lactobacillus (felt 6 og 7, fig. 10). Antallet relB-orf3-hybridiserende fragmenter varierte fra 6-11, og alle har tilnærmet samme signalintensitet. I Lactobacilli har agarosegel-eiektroforese vist nærværet av plasmider, hvilket antyder muligheten av at i det minste noen av de hybridiserende sekvenser er av plasmid opprinnelse. En søking etter plasmider i B. cirkulans PL 236 har vært negativ, hvilket tyder på at sekvensen av B. circulans-DNA som hybridiserer R1 parB-sonden (felt 8, fig. 9) kan være av kromosomal opprinnelse.
De ovenfor anyitte forsøk viser at sekvenser beslektet med R1 parB og/eller E. coli relB-orf3 er vidt fordelt blant bakterie-slekter og ikke bare Enterobacteriaceae, fra hvilken sondene ble avledet, men også de grampositive bakterier.
Eksempel 11
Påvisning av parB-beslektede sekvenser i eukaryote celler (se fig. 11)
En encellet eukaryot organisme ble undersøkt, nemlig ciliat-protozoaet Tetrahymena thermophila, fig. 11. Denne organisme erkarakterisert ved1) et høyt antall mitokondriske DNA-molekyler pr. celle, og 2) ca. 12.000 kopier av ribosomale RNA-gener anordnet på cellereplikerende rDNA-molekyler. Kverken R1 parB-sonden eller E. coli relB-orf3-sonden påviser noen fragmenter i DNA fremstilt fra isolerte makronuklei (felt 1, fig. 11). Keller ikke hybridiserte sondene til de to EcoRI-fragmenter av isolert rDNA (felt 3, fig. 11). Det samlede EcoRI-begrensede DNA fra Tetrahymena thermophila, som omfatter mitokondrisk DNA, oppviste to hybridiserende fragmenter på 6,6 kb og 3,3 kb (felt 2, fig. 11), med relB-orf3-sonden, mens parB-sonden ikke ga noen signaler. De hybridiserende fragmenter ko-migrerte sammen med to EcoRI-fragmenter av mitokondrisk DNA som var lett påvisbare ved etidiumbromid-farging av gelen før DNA-overføring.
Kloroplast DNA fra erter (Pisum sativum) ble kløyvet med restriksjonsendonukleasen Pstl, og 0,125 ug ble analysert ved filterhybridisering ved bruk av parB- og parB-orf3-sondene (felt 4, fig. 11). Den sistnevnte sonde hybridiserer til et fragment på ca. 16 kb.
Til slutt ble to prøver av menneskelig celle-DNA analysert ved filterhybridisering etterfølgende EcoRI-begrensning. R1-parB-sonden ga et (svakt) hybridiseringssignai til neuroblastoma-DNA (felt 5, fig. 11), samt til embryonisk lever-DNA (felt 6, fig. 11). Det høye mitokondriske innhold av levervev kan tyde på at det observerte signal i felt 6, fig. 11 fås fra menneskelig mitokondira.
Neuroblastoma-DNA ble analysert da andre hybridiseringsanalyser hadde antydet selektiv forstørring av et lite kromosomalt område som fører til nærværet av "dobbeltsmå" ekstrakromosomale minikromosomer ("double minutes"), opprinnelsen av hybridiseringssignalet i felt 5, fig. 11 er ukjent.
Eksempel 12
Fullstendig stabilisering av meget ustabile rekombinante plasmider i P. putida og S. marcescens ved parB-området (se fig.
12)
Ved kloning av fremmed DNA inn i Pseudomonas spp. er det funnet at de innførte plasmider ofte blir meget ustabile. Denne plasmid-ustabilitet ble antatt å være forårsaket ved innføringen av en ukjent vertsceliefunksjon som på en eller annen måte gjenkjenner og eliminerer det fremmede DNA (Kim og Meyer, J. Bacteriol. 159, 1984, pp. 678-682). Da Pseudomonas spp. er svært relevant for industrielle formål, ble det ansett som viktig å teste virkningen av parB på slike svært ustabile rekombinante plasmidderivater.
Plasmid pKT230 er et kointegrat-plasmid bestående av den vide vertsområdevektor RSF1010 (som kan opprettholdes stabilt i et vidt område gramnegative bakterier) og pACYC177, et derivat av det naturlige p15 plasmid (Bagdasarian et al, Gene 16, 1981, pp. 237-242). Et Bglll restriksjonsfragment av plasmid pJL217 (Light og Molin, Hol. Gen. Genet. 187, 1982, pp. 486-493), som inneholder lac-genene, ble innsatt i det unike BamHI-restriksjonssete på pXT230, hvilket ga pFNl3. Plasmid pFNl3, som har et høyt kopitall, opprettholdes stabilt i E. coli med en tapsfrekvens på mindre enn 10-<4>pr. celle pr. generasjon. I P. putida har imidlertid det samme plasmidderivat en tapsfrekvens på 30 prosent pr. celle pr. generasjon. I S. marcescens er tapsfrekvensen 5 prosent pr. celle pr. generasjon.
For å undersøke virkningen av parB ble parB EcoRI-fragmentet av pPR95 satt inn i det unike EcoRI-sete på pFN13. Det resulterende plasmid ble betenget pFNl3 parB<+>, og et kart av dette er vist på fig. 12. Plasmid pFNl3 ble mobilisert ved et konjugativt plasmid inn i P. putida og 3. marcescens, selekterende for kanamycinmot-stand i begge tilfeller. Tapsfrekvensen for pFNl 3 parB<+>i både P. putida og S. marcescens var mindre enn 10~° pr. celle pr. generasjon, svarende til en økning i plasmidstabilitet i P. putida på minst 10^ ganger, og i S. marcescens på minst 10<4>ganger.
Således kan det trekkes den konklusjon at parB<+->området er svært effektivt for å sikre stabilitet av meget ustabile rekombinante plasmider selv i bakteriearter som er fjernt beslektet med E. coli.
Eksempel 13
For å analysere om R1 hok-genet utøver en celledrepende virkning i grampositive bakterier, f.eks. Bacillus subtilis, dersom det uttrykkes på riktig måte fra en B. subtilis-promotor, blir parB-området isolert fra pPR95 (fig. 2) som et EcoRI-fragment. EcoRI-setene fylles inn ved bruk av Klenow-polymerase for å danne butte ender, og fragmentet digesteres deretter med Fspl. Det 300 bp Fspl-(EcoRI)-fragment (som strekker seg over kartposisjonen +286 til +580 på fig. 3) som mangler hok-promotoren, isoleres og settes inn i pSI-1 (Yansura & Henner, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 1984, p. 439), som er blitt digestert med Sali og deretter behandlet med mungobønne-nukiease (rnung bean) (Rosenberg et al, Meth. Enzymol. 101, 1983, p. 123) for å fjerne de 5'-enkelctrå-dede overhengende ender. Ligasjonsblandingen transformeres tii E. coli MC1000 (Casabadan å Cohen, J. Holec. Biol. 133. 1980.
pp. 179-207).
Denne konstruksjon plasserer hok-genet innbefattet det hok-ribosomale bindingssete nær et syntetisk B. subtilis ribosomalt bindingssete som foreligger på pSI-1, en B. subtilis/E. coli-skyttelvektor. Ekspresjonen av det innsatte gen styres av SP01 - promotoren på pSI-1 , hvis aktivitet styres via lac-operatoren som foreligger mellom promotoren og det syntetiske ribosomale bindingssete (spac-I-promotor, Yansura & Henner, op.cit.). pSI-1 uttrykker dessuten lacl-genet som koder for lac-undertrykke-ren.
E. coli transformanter analyseres for IPTG (isopropyltiogalakto-sid) indusert veksthindring, da SP01-promotoren er aktiv i E. coli. Sorteringen utføres via replikatplating fra plater inneholdende 8 ug/ml kioramfenikol til plater inneholdende kloramfenikol og IPTG (1 mM). Kolonier som vokser dårlig i nærvær av IPTG analyseres videre i flytende kultur for å bekrefte fenotypen. En rekke transformanter som oppviser dannelse av spøkelsesceller (se eksempel 3) når IPTG settes til 1 mM er identifisert.
Transformanter blir videre dyrket i flytende kultur til OD500= 0,2, på hvilket punkt IPTG settes til 1 mM. Tilsetning av IPTG fører til stans i veksten og dannelse av spøkelsesceller (se eksempel 3) i kulturen.
Plasmid DNA isoleres fra slike IFTG-følsomme E. coii-transformanter og innføres i B. subtilis BD224 ved protoplast transformasjon (Chang & Cohen, Molec. Gen. Genet. 168, 1979, p. 111) med etterfølgende utvelgelse for kloramfenikolresistente transformanter .
For å analysere for en mulig celledrepende virkning av R1 hok i B. subtilis blir de Cm<R->resistente B. subtilis-transformanter platet i fravær eller nærvær av 1 mM IPTG. Dersom ingen vekst
eller sterk veksthindring observeres i nærvær av IPTG er RI hok riktig uttrykt. Det er da mulig å påtvinge en sok-lignende antisans-RNA-regulering på translasjonen av hok-mRNA ved riktige konstruksjoner, som antydet ovenfor.
Claims (35)
1. Replikon som, når det inneholdes i en celle, uttrykker et produkt som kan drepe cellen eller dens avkom (eller en forløper for produktet) og som ytterligere uttrykker en antagonist for det celledrepende produkt (eller en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for det drepende produkt) i celler som inneholder replikonet, mens antagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellen slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at det celledrepende produkt så vel som antagonisten for dette ikke er kodet for ved R1 parB-området når replikonet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier.
2. Replikon som angitt i krav 1, karakterisert ved at den sekvens på replikonet som koder for det drepende produkt (eller dets forløper) fås fra et bakterielt plasmid, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid, et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eukaryot mitokondrisk DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplastmolekyl.
3. Replikon som angitt i krav 1, karakterisert ved at sekvensen og replikonet som koder for antagonisten (eller dens forløper) fås fra et bakterielt plasmid, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid, et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som
bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eukaryot mitokondrisk DNA-molekyl, eller et eukaryot kloroplastmolekyl, eller er en syntetisk sekvens.
4. Replikon som angitt i et av kravene 1-3, karakterisert ved at det inneholder en nukleotidsekvens som ikke er naturlig beslektet med replikonet.
5. Replikon som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det når det inneholdes i en celle, uttrykker et messenger-RNA som koder for et produkt som kan drepe cellen eller dens avkom og som ytterligere uttrykker en antagonist som hindrer translasjonen av messenger-RNA i celler som inneholder replikonet.
6. Replikon som angitt i krav 5,
karakterisert ved at antagonisten er et antisans-RNA-molekyl (antisense RNA molecule) som ved baseparing til i det minste en del av det messenger-RNA som koder for det celledrepende produkt hindrer translasjon av dette messenger-RNA .
7. Replikon som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at det er et DNA-molekyl omfattende en sekvens som koder for et produkt (eller en forløper for produktet) som kan drepe cellen eller dens avkom på en måte som er identisk med eller analog med det produkt som (eller hvis forløper) uttrykkes ved R1 parB hok-genet.
8. Replikon som angitt i krav 7,
karakterisert ved at sekvensen som koder for produktet som kan drepe cellen eller dens avkom (eller en forløper for produktet) omfatter R1 parB hok-genet eller en sekvens som er homolog med dette.
9. Replikon som angit i et av de foregående krav, karakterisert ved at det er et DNA-molekyl omfattende en sekvens som koder for en antagonist som fungerer på en måte som er identisk med eller analog med den antagonist som uttrykkes ved R1 parB sok-genet.
10. Replikon somangitt i krav 9,
karakterisert ved at sekvensen som koder for antagonisten omfatter R1 parB sok-genet eller en sekvens som er homolog med dette.
11. Levende celle,
karakterisert ved at den inneholder ett replikon som omfatter R1 parB hok-genet eller en sekvens som er homolog med dette og et annet replikon som omfatter R1 parB sok-genet eller en sekvens som er homolog med dette.
12. Levende celle som angitt i krav 11, karakterisert ved at replikonet omfatter R1 parB hok-genet eller sekvensen som er homolog med dette er et kromosom.
13. Levende celle som angitt i krav 12, karakterisert ved at replikonet omfattende R1 parB sok-genet eller sekvensen som er homolog med dette er en ekstrakromosomal, autonomt replikerende nukleotidsekvens.
14. Levende celle som angitt i krav 13, karakterisert ved at replikonet er et plasmid.
15. Levende celle,
karakterisert ved at den inneholder et replikon som angitt i et av kravene 1-10.
16. Levende celle som angitt i krav 15, karakterisert ved at den er en bakterie, en encellet eukaryot organisme, en dyrecelle eller en plantecelle.
17. Cellekultur,
karakterisert ved at den inneholder en levende celle som angitt i krav 16.
18. DNA-fragment,
karakterisert ved at det omfatter en sekvens som, når DNA-fragmentet er innsatt i et replikon, koder for et produkt som kan drepe cellen som inneholder replikonet eller avkommet av cellen (eller koder for en forløper av produktet) og en sekvens som koder for en antagonist for det drepende produkt (eller koder for en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for det drepende produkt) i celler som inneholder replikonet, mens antagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellen slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at DNA-fragmentet ikke omfatter R1 parB-området når replikonet som bærer fragmentet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier.
19. DNA-fragment som angitt i krav 13, karakterisert ved at det omfatter en sekvens som, når DNA-fragmentet innsettes i et replikon, koder for et messenger-RNA som koder for et produkt som kan drepe celler som inneholder replikonet eller avkommet av cellen (eller koder for en forløper for produktet) og en sekvens som koder for en antagonist som hindrer translasjonen av messenger-RNA i celler som inneholder replikonet.
20. DNA-fragment som angitt i krav 19, karakterisert ved at antagonisten er et antisans-RNA-molekyl som ved baseparing til i det minste en del av det messenger-RNA som koder for det celledrepende produkt hindrer translasjon av dette messenger-RNA.
21. DNA-fragment som angitt i et av kravene 18-20, karakterisert ved at det omfatter en sekvens som koder for et produkt (eller en forløper for produktet) som kan drepe cellen eller dens avkom på en måte som er identisk med eller analog med det produkt som (eller hvis forløper) uttrykkes ved R1 parB hok-genet.
22. DNA-fragment som angitt i krav 21, karakterisert ved at sekvensen som koder for produktet som kan drepe cellen eller dens avkom (eller en forløper for produktet) omfatter R1 parB hok-genet eller en sekvens som er homolog med dette.
23. DNA-fragment som angitt i et av kravene 18-20, karakterisert ved at det omfatter en sekvens som koder for en antagonist som fungerer på en måte som er identisk med eller analog med den antagonist som uttrykkes ved R1 parB sok-genet.
24. DNA-fragment som angitt i krav 23, karakterisert ved at sekvensen som koder for antagonisten omfatter R1 parB sok-genet eller en sekvens som er homolog med dette.
25. Fremgangsmåte til fremstilling av et replikon som angitt i krav 1,
karakterisert ved at den omfatter å innsette, i et replikon, en sekvens som koder for et produkt som kan drepe en celle som inneholder replikonet eller avkommet av cellen (eller koder for en forløper for produktet) og en sekvens som koder for en antagonist for det drepende produkt (eller koder for en forløper for antagonisten), idet antagonisten er en som undertrykker det drepende produkt (eller en forløper for produktet) i celler som inneholder replikonet, mens antagonistaktiviteten avtar når replikonet tapes fra cellen slik at antagonisten (eller dens forløper) ikke lenger uttrykkes kontinuerlig, hvilket betyr at det drepende produkt (eller dets forløper) som foreligger i den nå replikonfrie celle ikke lenger undertrykkes av antagonisten, hvilket fører til celledød, med det forbehold at det celiedrepende produkt så vel som antagonisten for dette ikke er kodet for ved R1 parB-området når replikonet er et plasmid som kan replikere i gramnegative bakterier.
26. Fremgangsmåte som angitt i krav 25, karakterisert ved at der innsettes et DNA-fragment som angitt i krav 15.
27. Fremgangsmåte som angitt i krav 25 eller 26, karakterisert ved at replikonet er et bakterielt plasmid, et bakterielt kromosom, et eukaryot plasmid, et eukaryot virus, en eukaryot autonomt replikerende sekvens som bærer et kromosomalt replikasjonsopprinnelsessted, et eukaryot mitokondrisk DNA-molekyl eller et eukaryot kloroplastmolekyl.
28. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 25-27, karakterisert ved at sekvensen eller sekvensene som innsettes er en sekvens eller sekvenser av DNA (eller eventuelt RNA) med opprinnelse i en celle som er beslektet med replikonet.
29. Fremgangsmåte som angitt i krav 28, karakterisert ved at sekvensen eller sekvensene er en sekvens som eller sekvenser som er homologe med R1 parB-området.
30. Fremgangsmåte som angitt i krav 28, karakterisert ved at sekvensen eller sekvensene er en sekvens eller sekvenser med opprinnelse i R1 parB-området .
31. Fremgangsmåte til fremstilling a et genprodukt kodet for ved en nukleinsyresekvens,
karakterisert ved at den omfatter å dyrke celler som inneholder et replikon som angitt i et av kravene 1 - 10, og høste et genprodukt uttrykt fra replikonet.
32. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at dyrkingen utføres i minst 100 cellegenerasjoner.
33. Fremgangsmåte som angitt i krav 32, karakterisert ved at tapet av replikonet er mindre enn 10~<4> /celle/generasjon.
34. Fremgangsmåte som angitt i krav 33, karakterisert ved at tapet av replikonet er mindre enn 10~<5> /celle/generasjon.
35. Fremgangsmåte som angitt i krav 34, karakterisert ved at tapet av replikonet er mindre enn 10- <f> Vcelle/generasjon.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK275685A DK275685D0 (da) | 1985-06-18 | 1985-06-18 | Stabilisering af biologiske systemer |
PCT/DK1986/000070 WO1986007608A1 (en) | 1985-06-18 | 1986-06-18 | Stabilization of unstably inherited replicons |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO870630D0 NO870630D0 (no) | 1987-02-17 |
NO870630L true NO870630L (no) | 1987-04-15 |
Family
ID=26066713
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO870630A NO870630L (no) | 1985-06-18 | 1987-02-17 | Stabilisering av ustabilt nedarvede replikoner. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO870630L (no) |
-
1987
- 1987-02-17 NO NO870630A patent/NO870630L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO870630D0 (no) | 1987-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Macrina et al. | A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis | |
Novick et al. | pT181 plasmid replication is regulated by a countertranscript-driven transcriptional attenuator | |
Bravo et al. | Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid | |
Gomelsky et al. | Molecular genetic analysis suggesting interactions between AppA and PpsR in regulation of photosynthesis gene expression in Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1 | |
Hübner et al. | Expression of regulatory nif genes in Rhodobacter capsulatus | |
US5853718A (en) | Method of immunization using biologically contained bacterial cells | |
Yang et al. | Translation of trpG in Bacillus subtilis is regulated by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP) | |
Smith et al. | The poison–antidote stability system of the broad‐host‐range Thiobacillus ferrooxidans plasmid pTF‐FC2 | |
Ma et al. | Analysis of the promoter and regulatory sequences of an oxygen-regulated bch operon in Rhodobacter capsulatus by site-directed mutagenesis | |
Conway et al. | Expression vector for Zymomonas mobilis | |
Goncharoff et al. | Structural, molecular, and genetic analysis of the kilA operon of broad-host-range plasmid RK2 | |
Berman et al. | Selection of lac gene fusions in vivo: ompR-lacZ fusions that define a functional domain of the ompR gene product | |
US5545541A (en) | Stabilization of unstably inherited replicons | |
FI89941C (fi) | Plasmider med villkorligt replikeringsuppfoerande | |
Chen et al. | Transcription and expression of the exotoxin A gene of Pseudomonas aeruginosa | |
Goupil-Feuillerat et al. | Transcriptional and translational regulation of α-acetolactate decarboxylase of Lactococcus lactis subsp. lactis | |
Silva et al. | A basic replicon of virulence-associated plasmids of Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli is homologous with a basic replicon in plasmids of IncF groups | |
Hinton et al. | Cloning, expression and sequencing the molybdenum-pterin binding protein (mop) gene of Clostridium pasteurianum in Escherichia coli | |
Lu et al. | Stimulation of IS1 excision by bacteriophage P1 ref function | |
NO870630L (no) | Stabilisering av ustabilt nedarvede replikoner. | |
EP1244799B1 (en) | Methods and materials relating to gene expression | |
Griggs et al. | Activation of expression of the Escherichia coli cir gene by an iron-independent regulatory mechanism involving cyclic AMP-cyclic AMP receptor protein complex | |
DK171215B1 (da) | Plasmider med betinget ukontrolleret replikationstærskel samt fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt ved dyrkning af en mikroorganisme indeholdende et sådant plasmid | |
JP2009514506A (ja) | E.コリ株dsm6601のプラスミド不含のクローン | |
Brana et al. | Stability of the hybrid plasmid pIM138 and its curing by some eliminating agents |