BR112021011044A2 - Sistemas ativos dinâmicos acromossômicos - Google Patents

Abstract

sistemas ativos dinâmicos acromossômicos. a presente invenção refere-se a sistemas ativos dinâmicos acromossômicos (adas) isolados, incluindo adas altamente ativos. estes adas fornecidos pela invenção podem ser obtidos por uma variedade de meios. são fornecidos vários métodos associados de fazer e usar esses adas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “SISTEMAS ATIVOS DINÂMICOS ACROMOSSÔMICOS”.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 10 de dezembro de 2019, é denominada 51296-033WO2_Sequence_Listing_12.10.19_ST25 e tem 51.393 bytes em tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] São fornecidos aqui sistemas ativos dinâmicos acromossômicos e métodos para fazer e usar os mesmos.

ANTECEDENTES

[0003] Existe uma necessidade de vetores de entrega capazes de direcionar para células e entregar agentes biológicos, composições contendo tais vetores de entrega e métodos associados de entrega dos referidos vetores às células, modulando assim sistemas biológicos incluindo células de animais, plantas e de insetos, tecidos e organismos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] A invenção fornece, inter alia, sistemas ativos dinâmicos acromossômicos (ADAS), por exemplo, ADAS compreendendo uma carga heteróloga, métodos de prepará-los, composições que os contêm e métodos associados de distribuição de ADAS e/ou cargas e de modular sistemas biológicos. A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos (ADAS) pelo Requerente possuindo, em certas modalidades, a atividade aumentada (ou seja, ADAS altamente ativos). Esses ADAS altamente ativos têm uma elevada capacidade de trabalho, tal como trabalho químico, produção de proteínas ou entrega de uma carga.

[0005] Em um aspecto, a divulgação apresenta um método para fabricar uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS,

sendo a composição substancialmente livre de células bacterianas viáveis, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fazer, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de uma minicélula, produzindo assim o ADAS; e (c) separar o ADAS da bactéria parental, produzindo assim uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS que está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0006] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0007] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica da divisão celular é um polipeptídeo minE.

[0008] Em algumas modalidades a bactéria parental é E. coli e o polipeptídeo minE é minE de E. coli. Em outras modalidades a bactéria parental é Salmonella typhimurium e o polipeptídeo minE é minE de S. typhimurium.

[0009] Em algumas modalidades, a bactéria parental tem uma redução no nível ou atividade de uma proteína de inibição do anel Z. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

[0010] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[0011] Em algumas modalidades do aspecto acima, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo minC ou um polipeptídeo minD.

[0012] Em algumas modalidades do aspecto acima, o ADAS tem uma redução na expressão de pelo menos duas proteínas de inibição do anel Z, por exemplo, uma redução na expressão de um polipeptídeo minC e um polipeptídeo minD.

[0013] Em algumas modalidades, o ADAS tem uma redução na expressão de um polipeptídeo minC, um polipeptídeo minD e um polipeptídeo minE.

[0014] Em outras modalidades do aspecto acima, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 4, por exemplo, pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo DivIVA.

[0015] Em algumas modalidades, as bactérias parentais são Bacillus subtilis e o fator de especificidade topológica de divisão celular é DivIVA de B. subtilis.

[0016] Em algumas modalidades do aspecto acima, a redução no nível ou atividade é causada por uma mutação de perda de função. Em algumas modalidades, a mutação de perda de função é uma deleção do operon minCDE ou deleção de DiVIVA.

[0017] Em algumas modalidades do aspecto acima, o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1 mM, 1,2 nM, 1,3 nM,

1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM ou 50 mM.

[0018] Em algumas modalidades do aspecto acima, as bactérias parantais são qualquer uma de Escherichia, Acinetobacter, Agrobacterium, Anabaena, Aquifex, Azoarcus, Azotobacter, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Buchnera, Burkholderia, Candidatus, Chromobacterium, Crocosphaera, Dechloromonas, Desulfitobacterium, Desulfotalea, Erwinia, Francisella, Fusobacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Helicobacter, Legionella, Magnetospirillum, Mesorhizobium, Methylococcus, Neisseria, Nitrosomonas, Nostoc, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Prochlorococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rubrivivax, Salmonella, Shewanella, Shigella, Sinorhizobium, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermus, Thiobacillus, Trichodesmium, Vibrio, Wigglesworthia, Wolinella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Deinococcus, Exiguobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Moorella, Oceanobacillus, Symbiobacterium, ou Thermoanaerobacter e o fator de especificidade topológica de divisão celular é o minE ou DivIVA endógeno da bactéria parental.

[0019] Em algumas modalidades do aspecto acima, a composição da etapa (c) compreende menos de 100 unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de células bacterianas viáveis, por exemplo, menos de 10 UFC/mL, menos de 1 UFC/mL, ou menos de 0,1 UFC/mL de células bacterianas viáveis.

[0020] Em algumas modalidades do aspecto acima, o ADAS compreende uma carga.

[0021] Em algumas modalidades do aspecto acima, a composição é formulada para entrega a um animal; formulado para entrega a uma planta; formulado para entrega a um inseto e/ou formulado como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

[0022] Em outro aspecto, a divulgação apresenta uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis. Em algumas modalidades, o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,2 nM, 1,3 nM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 2 mM ou 2,5 mM.

[0023] Em ainda outro aspecto, a divulgação apresenta uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS altamente ativos, em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 3 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0024] Em algumas modalidades, a composição de ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM ou 50 mM.

[0025] Em algumas modalidades da composição, a concentração de ATP do ADAS é aumentada em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150% ou pelo menos 200% após a incubação a 37 °C por 12 horas.

[0026] Em algumas modalidades da composição, os ADAS são derivados de bactérias parentais com uma redução em um nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular.

[0027] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS não compreende um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0028] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, sendo a composição substancialmente livre de células bacterianas viáveis e sendo produzida por um processo que compreende: (a) fazer, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de uma minicélula, produzindo assim o ADAS altamente ativo; e (c) separar o ADAS da bactéria parental, produzindo assim uma composição que está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0029] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0030] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0031] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica da divisão celular é um polipeptídeo minE.

[0032] Em algumas modalidades a bactéria parental é E. coli e o polipeptídeo minE é minE de E. coli.

[0033] Em algumas modalidades a bactéria parental é Salmonella typhimurium e o polipeptídeo minE é minE de S. typhimurium.

[0034] Em algumas modalidades, as bactérias parentais são Escherichia, Acinetobacter, Agrobacterium, Anabaena, Aquifex, Azoarcus, Azotobacter, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Buchnera, Burkholderia, Candidatus, Chromobacterium, Crocosphaera, Dechloromonas, Desulfitobacterium, Desulfotalea, Erwinia, Francisella,

Fusobacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Helicobacter, Legionella, Magnetospirillum, Mesorhizobium, Methylococcus, Neisseria, Nitrosomonas, Nostoc, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Prochlorococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rubrivivax, Salmonella, Shewanella, Shigella, Sinorhizobium, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermus, Thiobacillus, Trichodesmium, Vibrio, Wigglesworthia, Wolinella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Deinococcus, Exiguobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Moorella, Oceanobacillus, Symbiobacterium, ou Thermoanaerobacter e um e o fator de especificidade topológica de divisão celular é minE ou DivIVA endógeno da bactéria parental.

[0035] Em algumas modalidades, o ADAS tem uma redução no nível de uma proteína de inibição do anel Z.

[0036] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

[0037] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[0038] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo minC.

[0039] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo minD.

[0040] Em algumas modalidades, o ADAS tem uma redução na expressão de pelo menos duas proteínas de inibição do anel Z.

[0041] Em algumas modalidades, o ADAS tem uma redução na expressão de um polipeptídeo minC e um polipeptídeo minD.

[0042] Em algumas modalidades, o ADAS tem uma redução na expressão de um polipeptídeo minC, um polipeptídeo minD e um polipeptídeo minE.

[0043] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 40% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

[0044] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

[0045] Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo DivIVA.

[0046] Em algumas modalidades, as bactérias parentais são Bacillus subtilis e o fator de especificidade topológica de divisão celular é DivIVA de B. subtilis.

[0047] Em algumas modalidades, a redução no nível ou atividade é causada por uma mutação de perda de função.

[0048] Em algumas modalidades, a mutação de perda de função é uma deleção de gene.

[0049] Em algumas modalidades, a mutação de perda de função é uma mutação de perda de função induzível e em que a perda de função é induzida pela exposição da célula parental uma condição de indução.

[0050] Em algumas modalidades, a mutação de perda de função induzível é uma mutação sensível à temperatura e em que a condição de indução é uma condição de temperatura.

[0051] Em algumas modalidades, a célula parental tem uma deleção do operon minCDE.

[0052] Em algumas modalidades, o ADAS compreende um sistema de transcrição funcional e um sistema de tradução funcional.

[0053] Em algumas modalidades, o ADAS produz uma proteína heteróloga.

[0054] Em algumas modalidades, o ADAS compreende um plasmídeo, o plasmídeo compreendendo um promotor induzível e uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga, e em que o contato do ADAS com um indutor do promotor induzível em condições apropriadas resulta na produção da proteína heteróloga.

[0055] Em algumas modalidades, a produção da proteína heteróloga é aumentada em pelo menos 1,6 vezes em um ADAS que foi contatado com o indutor em relação a um ADAS que não foi contatado com o indutor.

[0056] Em algumas modalidades, a taxa de produção da proteína heteróloga atinge um nível alvo dentro de 3 horas do contato do ADAS com o indutor.

[0057] Em algumas modalidades, a proteína heteróloga é produzida a uma taxa de pelo menos 0,1 femtogramas por hora por ADAS.

[0058] Em algumas modalidades, a proteína heteróloga é produzida por um período de pelo menos 8 horas.

[0059] Em algumas modalidades, a composição compreende menos de 100 unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de células bacterianas viáveis.

[0060] Em algumas modalidades, a composição compreende menos de 10 UFC/mL, menos de 1 UFC/mL ou menos de 0,1 UFC/mL de células bacterianas viáveis.

[0061] Em algumas modalidades, o ADAS compreende uma carga.

[0062] Em algumas modalidades, a carga é um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma pequena molécula, um sistema de edição de gene, um hormônio, um modulador imunológico, um carboidrato, um lipídeo, um partícula orgânica, uma partícula inorgânica ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).

[0063] Em algumas modalidades, a carga é encapsulada pelo

ADAS.

[0064] Em algumas modalidades, a carga é fixada à superfície do ADAS.

[0065] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um DNA, um RNA ou um plasmídeo.

[0066] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma proteína.

[0067] Em algumas modalidades, a enzima altera um substrato para produzir um produto alvo.

[0068] Em algumas modalidades, o substrato está presente no ADAS e em que o produto alvo é produzido no ADAS.

[0069] Em algumas modalidades, o substrato está presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é entregue.

[0070] Em algumas modalidades, o ADAS compreende um sistema de secreção bacteriana heterólogo.

[0071] Em algumas modalidades, o sistema de secreção bacteriana heterólogo é um sistema de secreção tipo 3 (T3SS).

[0072] Em algumas modalidades, a carga compreende uma porção que direciona a exportação pelo sistema de secreção bacteriana.

[0073] Em algumas modalidades, o ADAS compreende uma porção de direcionamento.

[0074] Em algumas modalidades, a porção de direcionamento é um nanocorpo, uma proteína de ligação a carboidratos ou um peptídeo direcionado a tumor.

[0075] Em algumas modalidades, o ADAS tem um nível ou atividade de protease reduzido em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria parental de tipo selvagem.

[0076] Em algumas modalidades, os ADAS são produzidos a partir de bactérias parentais que foram modificadas para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma protease.

[0077] Em algumas modalidades, o ADAS tem um nível ou atividade de RNase reduzido em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria parental de tipo selvagem.

[0078] Em algumas modalidades, o ADAS é produzido a partir de bactérias parentais que foram modificadas para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma RNase.

[0079] Em algumas modalidades, a RNase é uma endoribonuclease ou uma exoribonuclease.

[0080] Em algumas modalidades, o ADAS foi modificado para ter lipopolissacarídeo reduzido (LPS).

[0081] Em algumas modalidades, o ADAS é produzido a partir de bactérias progenitoras que foram modificadas para ter LPS reduzido.

[0082] Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação na biossíntese de Lipídeo A miristoiltransferase (msbB).

[0083] Em algumas modalidades, os ADAS são derivados de bactérias parentais que são patógenos de mamíferos ou de bactérias parentais que são comensais aos mamíferos.

[0084] Em algumas modalidades, as bactérias comensais de mamíferos são espécies de Staphylococcus, Bifidobacterium, Micrococcus, Lactobacillus ou espécies de Actinomyces ou as bactérias patogênicas de mamíferos são Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC), Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica ou Helicobacter pylori.

[0085] Em algumas modalidades, os ADAS são derivados de bactérias parentais que são patógenos de plantas ou de bactérias parentais que são comensais às plantas.

[0086] Em algumas modalidades, as bactérias comensais de plantas são Bacillus subtilis ou Psuedomonas putida ou as bactérias patogênicas de plantas são espécies de Xanthomonas ou Pseudomonas syringae.

[0087] Em algumas modalidades, os ADAS são derivados de bactérias parentais auxotróficas.

[0088] Em algumas modalidades, o ADAS é liofilizado e reconstituído, e em que o ADAS reconstituído tem uma concentração de ATP que é pelo menos 95% da concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado.

[0089] Em algumas modalidades, o ADAS reconstituído tem uma concentração de ATP que é pelo menos igual à concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado.

[0090] Em algumas modalidades, a composição é formulada para entrega a um animal.

[0091] Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, oral, tópica, aerossol ou nebulizada.

[0092] Em algumas modalidades, a composição é formulada para entrega a uma planta.

[0093] Em algumas modalidades, a composição é formulada para entrega a um inseto.

[0094] Em algumas modalidades, a composição é formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

[0095] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar um ADAS altamente ativo a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS altamente ativo, em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0096] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar um ADAS a uma célula alvo, o método compreendendo:

(a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0097] Em algumas modalidades a respeito do método de entrega de tal pluralidade de ADAS, a célula alvo é uma célula animal, uma célula de planta ou uma célula de inseto.

[0098] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar uma carga a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM, o ADAS compreende uma carga e a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0099] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar uma carga a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular, o ADAS compreende uma carga e a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0100] Em modalidades relacionadas à entrega de uma carga, a célula alvo é uma célula animal, uma célula de planta ou uma célula de inseto.

[0101] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula animal, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

[0102] Em ainda outro aspecto, o método apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de planta, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

[0103] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de inseto, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de inseto com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

[0104] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula animal, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

[0105] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de planta, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

[0106] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de inseto, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de inseto com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

[0107] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um animal em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

[0108] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um animal em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

[0109] Em algumas modalidades de tratamento do animal, o animal tem um câncer.

[0110] Em algumas modalidades, o ADAS transporta uma carga de quimioterapia (por exemplo, uma carga de imunoterapia).

[0111] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de uma planta em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga da mesma com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

[0112] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de uma planta em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma pluralidade de bactérias parentais com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga da mesma com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

[0113] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS compreende uma enzima e em que a enzima altera um substrato para produzir um produto alvo.

[0114] Em algumas modalidades desta composição, o substrato está presente no ADAS e em que o produto alvo é produzido no ADAS.

[0115] Em algumas modalidades, o substrato está presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é entregue.

[0116] Em algumas modalidades, a enzima é diadenilato ciclase A, o substrato é ATP e o produto alvo é di-AMP cíclico.

[0117] Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte Descrição Detalhada e das Reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0118] Figura 1A é um conjunto de micrografias eletrônicas de varredura mostrando células bacterianas parentais de E. coli e células ativas dinâmicas acromossômicas (ADAS) delas derivadas. A coluna da esquerda mostra as células bacterianas da cepa MACH009 de E. coli, que não foi modificada para produzir ADAS. A coluna central mostra as células bacterianas da cepa MACH060 de E. coli (ΔminCDE), que foi modificada para produzir ADAS. ADAS e células parentais que sofrem eventos anormais de septação são visíveis. A coluna da direita mostra ADAS purificado da cultura MACH060 (ΔminCDE).

[0119] Figura 1B é um conjunto de fotomicrografias mostrando ADAS derivado de MACH060 (ΔminCDE). O painel esquerdo é uma imagem de contraste de fase mostrando a localização das partículas. O painel central é uma imagem de imunofluorescência que mostra a localização da coloração de DNA DAPI. O painel direito é uma imagem de imunofluorescência mostrando a localização de uma mancha para lipopolissacarídeo (LPS). Setas brancas indicam ADAS, que são identificados pela presença da coloração LPS e ausência da coloração DAPI. As barras de escala são de 10 µm.

[0120] Figura 1C é um gráfico que mostra a concentração (em partículas/mL) de partículas de um determinado diâmetro em uma população purificada de ADAS da cepa MACH124 de E. coli produtora de ADAS (ΔminCDE), conforme medido usando um Analisador de Nanopartícula Spectradyne® nCS1.

[0121] Figura 1D é um gráfico de barras que mostra o volume agregado de partículas entre 200 e 2000 nm de diâmetro na preparação de ADAS purificado.

[0122] Figura 1E é um gráfico de barras que mostra a concentração em unidades formadoras de colônia (UFC) por mL de células bacterianas viáveis presentes em uma cultura MACH124 (ΔminCDE) e em uma preparação ADAS purificada da cultura.

[0123] Figura 1F é uma imagem de uma imunotransferência para DnaK e GroEL em culturas das cepas MACH060 e MACH200 de E. coli produtoras de ADAS (ambas ΔminCDE) e em preparações de ADAS purificadas de cada cultura. 10 ng de DnaK e GroEL purificados são fornecidos como controles (Recomb. Prot.).

[0124] Figura 2A é um gráfico de barras que mostra a concentração média de ATP em mMol em uma população purificada de ADAS da cepa de E. coli MACH060 (ΔminCDE), conforme medido usando o Ensaio de Viabilidade Celular Microbiana BacTiter-GloTM. A concentração de ATP gerada pela bactéria original foi subtraída como base.

[0125] Figura 2B é um gráfico de barras que mostra a luminescência em uma alíquota de uma população purificada de ADAS da cepa de E. coli MACH060 (ΔminCDE) em 0 horas ou após 2 horas de incubação com agitação a 37 °C na presença de excesso de nutrientes, conforme medido usando o Ensaio de Viabilidade Celular Microbial BacTiter-GloTM.

[0126] Figura 2C é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) ao longo do tempo na cultura MACH124 (ΔminCDE) e em preparações de ADAS purificadas da cultura que foram incubadas na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano. A concentração da bactéria parental foi equivalente ao número de UFC detectado na preparação ADAS (100 UFC/mL).

[0127] Figura 2D é um gráfico que mostra os dados de fluorescência de GFP da Figura 2C normalizados para o número de ADAS na preparação, conforme medido usando um Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1. Os dados são mostrados no gráfico como n´º de vezes de indução por 108 partículas de ADAS.

[0128] Figura 2E é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 2C. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0129] Figura 2F é um conjunto de imagens de uma imunotransferência para GFP em 250 alíquotas a partir de uma preparação ADAS purificada a partir de MACH124 (ΔminCDE) e cultivada na presença do anidrotetraciclina indutora para 0, 2, 4, 17, ou 24 horas (painel superior). Cada linha corresponde a aproximadamente 5,2x107 ADAS conforme determinado pela análise de nCS1. A intensidade de GFP foi quantificada por densitometria, normalizada para a intensidade do controle de carregamento GroEL e convertida em massa de GFP (em ng) por comparação com um padrão molecular de GFP recombinante purificado processado na mesma mancha (painel inferior).

[0130] Figura 3A é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) por 108 partículas de ADAS ao longo do tempo em preparações purificadas de cepas bacterianas parentais de E. coli MACH124 (ΔminCDE), MACH556 (ΔminC), e MACH557 (ΔminD). Os ADAS foram incubados na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. A fluorescência de GFP foi calculada subtraindo o valor médio dos replicados não induzidos de cada replicado induzido. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano.

[0131] Figura 3B é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 3A. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0132] Figura 3C é uma imagem de uma imunotransferência para GFP em ADAS purificado a partir de MACH124 (ΔminCDE), MACH556 (ΔminC) e MACH557 (ΔminD) e cultivado na presença (+) ou ausência (-) do indutor anidrotetraciclina.

[0133] Figura 3D é um gráfico de barras que mostra a correção de base para a imunotransferência da Figura 3C.

[0134] Figura 3E é um gráfico de barras que mostra a densidade GFP normalizada para a imunotransferência da Figura 3C. A intensidade da GFP foi quantificada por densitometria e normalizada para a intensidade do controle de carregamento GroEL.

[0135] Figura 3F é um gráfico de barras que mostra a produção total de GFP em unidades de fluorescência (au) em ADAS purificado de MACH124 (ΔminCDE), MACH556 (ΔminC) e MACH557 (ΔminD) conforme medido usando um leitor de microplacas BioTek ®. ** indica um valor de p de 0,0021. *** indica um valor de p de 0,0006.

[0136] Figura 3G é um gráfico de barras que mostra a produção de GFP por hora em ADAS purificado a partir de MACH124 (ΔminCDE), MACH556 (ΔminC), e MACH557 (ΔminD).

[0137] Figura 3H é um gráfico de barras que mostra a percentagem da produção de GFP em ADAS purificado a partir de MACH556 (ΔminC) e MACH557 (ΔminD) em relação ao ADAS produzido a partir de MACH124 (ΔminCDE). O nível de produção de proteína de MACH124 foi definido para 100% e a produção relativa de proteína para MACH556 e MACH557 foi normalizada para MACH124.

[0138] Figura 4 é um gráfico de barras que mostra a fluorescência de um fluoróforo DyLight™ 550 para ADAS purificado de MACH060 e MACH284 normalizado para densidade ótica da cultura (DO600). MACH284 expressa uma proteína de fusão Neae-NB2 (nanocorpo) detectável por um anticorpo conjugado com o fluoróforo DyLight™ 550.

[0139] Figura 5A é um gráfico de barras que mostra a leitura de luminescência do sistemaTHP1-DualTM em monócitos THP1-DualTM contactadoos com ADAS purificado a partir de MACH060, ADAS não induzido purificado a partir de MACH198, e ADAS purificado a partir de MACH198 que foram induzidos com anidrotetraciclina para produzir a enzima deadenilato ciclase A (DacA).

[0140] Figura 5B é um conjunto de micrografias que mostra o fenótipo de monócitos THP1-DualTM em contato com ADAS purificado de MACH060, ADAS não induzido purificado de MACH198 e ADAS purificado de MACH198 que foram induzidos com anidrotetraciclina para produzir a enzima DacA.

[0141] Figura 5C é um gráfico de barras que mostra a concentração de interferon beta (IFN-B1) em pg/mL secretado em cultura por monócitos TTHP1-DualTM em contato com ADAS purificado de MACH060, ADAS não induzido purificado de MACH198 e ADAS purificado de MACH198 que foram induzidos com anidrotetraciclina para produzir a enzima DacA, medido usando um ensaio ELISA.

[0142] Figura 6 é um conjunto de fotomicrografias que mostra a fluorescência de ADAS marcado com éster DyLight™ 800 NHS derivado de MACH301 em larvas da broca do milho europeia (ECB). Os painéis A e B mostram a fluorescência de DyLight™ 800. Os painéis C e D mostram autofluorescência larval a 700 nm. Os painéis A e C mostram larvas de controle alimentadas com PBS e os painéis B e D mostram larvas alimentadas com ADAS marcado com éster DyLight™ 800 NHS.

[0143] Figura 7A é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) por 108 partículas de ADAS ao longo do tempo em preparações de ADAS purificadas de uma cepa bacteriana parental MACH124 (ΔminCDE) de E. coli, em que a preparação de ADAS foi armazenada a 4 °C durante 0 dias de 3 dias. Os ADAS foram incubados na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. A fluorescência de GFP foi calculada subtraindo o valor médio dos replicados não induzidos de cada replicado induzido. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano.

[0144] Figura 7B é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) por 108 partículas de ADAS ao longo do tempo em preparações de ADAS purificadas de uma cepa bacteriana parental MACH556 (ΔminC) de E. coli, em que a preparação de ADAS foi armazenada a 4 °C durante 0 dias de 3 dias. Os ADAS foram incubados na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. A fluorescência de GFP foi calculada subtraindo o valor médio dos replicados não induzidos de cada replicado induzido. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano.

[0145] Figura 7C é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) por 108 partículas de ADAS ao longo do tempo em preparações de

ADAS purificadas de uma cepa bacteriana parental MACH557 (ΔminD) de E. coli, em que a preparação de ADAS foi armazenada a 4 °C durante 0 dias de 3 dias. Os ADAS foram incubados na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. A fluorescência de GFP foi calculada subtraindo o valor médio dos replicados não induzidos de cada replicado induzido. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano.

[0146] Figura 7D é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 7A. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0147] Figura 7E é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 7B. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0148] Figura 7F é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 7C. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0149] Figura 7G é um gráfico que mostra a fluorescência de GFP (au) por 108 partículas de ADAS ao longo do tempo em preparações de ADAS purificadas de uma cepa bacteriana parental MACH124 (ΔminCDE) de E. coli, em que a preparação de ADAS foi liofilizada, armazenada durante 6 semanas, e reidratada. Os ADAS foram incubados na presença ou ausência do indutor anidrotetraciclina (100 ng/mL), que ativa a expressão de GFP. A fluorescência de GFP foi calculada subtraindo o valor médio dos replicados não induzidos de cada replicado induzido. Todas as amostras foram cultivadas na presença de antibiótico para prevenir qualquer crescimento bacteriano.

[0150] Figura 7H é um gráfico que mostra o número de vezes de alteração na fluorescência de GFP entre as preparações ADAS induzidas e não induzidas da Figura 7G. O número de vezes de alteração foi calculado dividindo o valor médio do replicado induzido pelo valor médio do replicado não induzido.

[0151] Figura 8A é um gráfico de barras que mostra o número de células bacterianas parentais (em UFC/mL) em preparações de ADAS purificadas a partir da linha de células bacterianas parentais de E. coli de controle MACH060 ou da linha de células bacterianas parentais auxotróficas de E. coli MACH002 armazenada em meio livre de histidina e livre de metionina.

[0152] Figura 8B é um gráfico de barras que mostra o número de células bacterianas parentais (em UFC/mL) em preparações de ADAS purificadas a partir da linha de células bacterianas parentais de E. coli de controle MACH178 ou da linha de células bacterianas parentais auxotróficas de E. coli MACH151 armazenada em meio livre de leucina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES

[0153] Tal como aqui utilizado, o termo "sistema dinâmico acromossômico" ou "ADAS" se refere a um sistema de membrana fechado sem genoma, não replicável, compreendendo pelo menos uma membrana e possuindo um volume interno adequado para conter uma carga (por exemplo, um ou mais de um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma molécula pequena, um sistema de edição de genes, um hormônio, um modulador imunológico, um carboidrato, um lipídeo, uma partícula orgânica, uma partícula inorgânica, ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP)). Em algumas modalidades, os ADAS são minicélulas ou minicélulas modificadas derivadas de uma célula bacteriana parental (por exemplo, uma célula bacteriana gram-negativa ou gram-positiva). O ADAS pode ser derivado de bactérias parentais usando qualquer método adequado, por exemplo, manipulação genética da célula parental ou exposição a uma cultura ou condição que aumenta a probabilidade de formação de minicélulas bacterianas. Métodos exemplificativos para a preparação de ADAS são aqueles que interrompem a maquinaria de divisão celular da célula parental. Em algumas modalidades, o ADAS pode compreender uma ou mais características endógenas ou heterólogas da superfície da célula parental, por exemplo, paredes celulares, modificações da parede celular, flagelos ou pilus e/ou uma ou mais características endógenas ou heterólogas do volume interior da célula parental, por exemplo, ácidos nucléicos, plasmídeos, proteínas, pequenas moléculas, maquinaria de transcrição ou maquinaria de tradução. Em outras modalidades, o ADAS pode não ter uma ou mais características da célula parental. Em ainda outras modalidades, o ADAS pode ser carregado ou modificado com um recurso não compreendido pela célula parental.

[0154] Tal como aqui utilizado, o termo "ADAS altamente ativo" se refere a um ADAS com elevado potencial de trabalho, por exemplo, um ADAS com a capacidade de realizar uma quantidade significativa de trabalho útil. O trabalho pode ser metabólico, incluindo síntese química (por exemplo, de proteínas, ácidos nucléicos, lipídeos, carboidratos, polímeros ou pequenas moléculas), modificação química (por exemplo, de proteínas, ácidos nucléicos, lipídeos, carboidratos, polímeros ou moléculas pequenas), ou transporte (por exemplo, importação, exportação ou secreção) em condições adequadas. Em certas modalidades, o ADAS altamente ativo começa com uma grande reserva de energia, por exemplo, energia na forma de ATP. Em outras modalidades, o ADAS tem a capacidade de absorver ou gerar energia/ATP de outra fonte. ADAS altamente ativo pode ser identificado, por exemplo, por ter aumento da concentração de ATP, aumento da capacidade de gerar ATP, aumento da capacidade de produzir uma proteína, aumento da taxa ou quantidade de produção de uma proteína e/ou aumento da capacidade de resposta a um sinal biológico, por exemplo, indução de um promotor.

[0155] Tal como aqui utilizado, o termo "célula bacteriana parental" se refere a uma célula (por exemplo, uma bactéria gram-negativa ou uma célula bacteriana gram-positiva) a partir da qual um ADAS é derivada. As células bacterianas parentais são normalmente células bacterianas viáveis. O termo "célula bacteriana viável" se refere a uma célula bacteriana que contém um genoma e é capaz de divisão celular. As células bacterianas parentais preferidas são derivadas de qualquer uma das cepas na Tabela 4.

[0156] Uma composição ou preparação de ADAS que é "substancialmente livre de" células bacterianas parentais e/ou células bacterianas viáveis é definida aqui como uma composição possuindo não mais do que 500, por exemplo, 400, 300, 200, 150, 100 ou menos unidades formadoras de colônia (UFC) por mL. Uma composição de ADAS que é substancialmente livre de células bacterianas parentais ou células bacterianas viáveis pode incluir menos de 50, menos de 25, menos de 10, menos de 5, menos de 1, menos de 0,1 ou menos de 0,001 UFC/mL. incluindo nenhuma célula bacteriana.

[0157] O termo "fator de especificidade topológica de divisão celular" se refere a um componente da maquinaria de divisão celular em uma espécie bacteriana que está envolvida na determinação do sítio do septo e funciona ao restringir a localização de outros componentes da maquinaria de divisão celular, por exemplo, restringir a localização de uma ou mais proteínas de inibição do anel Z. Fatores de especificidade topológica de divisão celular exemplificativos incluem minE, que foi descoberto pela primeira vez em E. coli e desde então foi identificado em uma ampla gama de espécies bacterianas gram-negativas e espécies bacterianas gram-positivas (Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005). minE funciona restringindo as proteínas de inibição do anel Z minC e minD aos pólos da célula. Um segundo fator de especificidade topológica de divisão celular exemplificativo é DivIVA, que foi descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis (Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959- 968, 2005).

[0158] O termo "proteína de inibição do anel Z" se refere a um componente da maquinaria de divisão celular em uma espécie bacteriana que está envolvida na determinação do sítio do septo e funciona inibindo a formação de um anel FtsZ estável ou ancorando tal um componente a uma membrana. A localização das proteínas de inibição do anel Z pode ser modulada por fatores de especificidade topológica de divisão celular, por exemplo, MinE e DivIVA. Proteínas de inibição do anel A exemplificativas incluem minC e minD, que foram descobertas pela primeira vez em E. coli e têm sido identificadas em uma ampla gama de espécies de bactérias gram-negativas e espécies de bactérias gram-positivas (Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005). Em E. coli e em outras espécies, minC, minD e minE ocorrem no mesmo locus genético, que pode ser referido como o "operon min", o operon minCDE ou o locus genético min ou minCDE.

[0159] Tal como aqui utilizado, o termo "redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica celular" se refere a uma redução geral de qualquer um de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,ou mais, no nível ou atividade do fator de especificidade topológica celular (por exemplo, proteína ou ácido nucleico (por exemplo, gene ou mRNA)), detectado por métodos padrão, em comparação com o nível em uma amostra de referência (por exemplo, um ADAS produzido a partir de uma célula de tipo selvagem ou uma célula com um operon minCDE de tipo selvagem ou gene divIVA tipo selvagem), uma célula de referência (por exemplo, uma célula de tipo selvagem ou uma célula com um gene ou operon minC, minD, minE, divIVA ou minCDE de tipo selvagem), uma amostra de controle ou uma célula de controle. Em algumas modalidades, um nível ou atividade reduzida se refere a uma diminuição no nível ou atividade na amostra que é pelo menos cerca de 0,9x, 0,8x, 0,7x, 0,6x, 0,5x, 0,4x, 0,3x, 0,2x, 0,1x, 0,05x ou 0,01x o nível ou atividade do fator de especificidade topológica celular em uma amostra de referência, célula de referência, amostra de controle ou célula de controle.

[0160] Tal como aqui utilizado, o termo "percentagem de identidade" se refere à percentagem (%) de identidade de sequência em relação a um polinucleótido de referência ou sequência de polipéptido após alinhamento por técnicas padrão. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de ácido nucleico ou identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro das capacidades de um perito na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, tal como BLAST, BLAST-2, PSI- BLAST ou software Megalign. Os peritos na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Por exemplo, os valores percentuais de identidade de sequência podem ser gerados usando o programa de computador de comparação de sequência BLAST. A título de ilustração, a percentagem de identidade de sequência de um determinado ácido nucleico ou sequência de aminoácidos, A, para, com ou contra um determinado ácido nucleico ou sequência de aminoácidos, B, (que pode ser alternativamente expresso como um determinado ácido nucleico ou sequência de aminoácido, A que tem uma certa identidade de sequência percentual com, ou contra um determinado ácido nucleico ou sequência de aminoácidos, B) é calculada da seguinte forma:

[0161] 100 multiplicado por (a porção X/Y)

[0162] em que X é o número de nucleotídeos ou de aminoácidos marcados como registos idênticos pelo programa de alinhamento de sequências (por exemplo, BLAST) nesse alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de nucleótidos ou aminoácidos em B. Em algumas modalidades, identidade de sequência, por exemplo, em homólogos de proteínas MinE ou DivIVA terá pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou mesmo 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácido ou ácido nucleico, alternativamente, pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%ou mais de identidade de sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico, para uma sequência de MinE (ou minE) ou sequência de DivIVA (ou divIVA) nativas como aqui divulgado.

[0163] As frases "modulando um estado de uma célula", tal como aqui utilizadas, se referem a uma mudança observável no estado (por exemplo, o transcriptoma, proteoma, epigenoma, efeito biológico ou estado de saúde ou doença) da célula (por exemplo, um animal, planta ou célula de inseto) conforme medido usando técnicas e métodos conhecidos na técnica para tal medição, por exemplo, métodos para medir o nível ou expressão de uma proteína, um transcrito, uma marca epigenética ou para medir o aumento ou redução da atividade de uma via biológica. A modulação do estado da célula pode resultar em uma mudança de pelo menos 1% em relação a antes da administração (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% ou mais em relação a antes da administração; por exemplo, até 100% em relação a antes da administração). Em algumas modalidades, a modulação do estado da célula envolve o aumento de um parâmetro (por exemplo, o nível ou a expressão de uma proteína, um transcrito ou a atividade de uma via biológica) da célula. O aumento do estado da célula pode resultar em um aumento do parâmetro em pelo menos 1% em relação a antes da administração (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%ou pelo menos 98% ou mais em relação a antes da administração; por exemplo, até 100% em relação a antes da administração). Em outras modalidades, a modulação do estado envolve a diminuição de um parâmetro (por exemplo, o nível ou a expressão de uma proteína, um transcrito ou a atividade de uma via biológica) da célula. A diminuição do estado da célula pode resultar em uma diminuição do parâmetro em pelo menos 1% em relação a antes da administração (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%ou pelo menos 98% ou mais em relação a antes da administração; por exemplo, até 100% em relação a antes da administração).

[0164] Tal como aqui utilizado, o termo "heterólogo" significa não nativo de uma célula ou composição no seu estado de ocorrência natural. Em algumas modalidades, "heterólogo" se refere a uma molécula; por exemplo, uma carga ou carga útil (por exemplo, um polipeptídeo, um ácido nucleico, tal como um RNA ou tRNA que codifica uma proteína, ou pequenas moléculas) ou uma estrutura (por exemplo, um plasmídeo ou sistema de edição de gene) que não é encontrada naturalmente em um ADAS ou na bactéria parental a partir da qual é produzido (por exemplo, uma célula bacteriana gram-negativa ou gram- positiva). II. COMPOSIÇÕES A. ADAS e ADAS altamente ativo

[0165] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta do Requerente de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos (ADAS), incluindo ADAS altamente ativos, que são capazes de fornecer uma grande variedade de funções em um grande número de ambientes. Um "ADAS" é um sistema de membrana fechado sem genoma, não replicável, compreendendo pelo menos uma membrana (em algumas modalidades, duas membranas, onde as duas membranas não se cruzam) e possuindo um volume interno adequado para conter uma carga (por exemplo, um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma pequena molécula, um sistema de edição de genes, um hormônio, um modulador imunológico, um carboidrato, um lipídeo, uma partícula orgânica, uma partícula inorgânica, ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP)).

[0166] Em algumas modalidades, os ADAS são minicélulas ou minicélulas modificadas derivadas de uma célula bacteriana parental (por exemplo, uma célula bacteriana gram-negativa ou gram-positiva). O ADAS pode ser derivado de bactérias parentais usando qualquer método adequado, por exemplo, manipulação genética da célula parental ou exposição a uma cultura ou condição que aumenta a probabilidade de formação de minicélulas bacterianas.

[0167] Em algumas modalidades, um ADAS tem uma seção transversal do eixo principal entre cerca de 100 nm-500 µm (por exemplo, em certas modalidades, cerca de: 100-600 nm, tal como 100- 400 nm; ou entre cerca de 0,5-10 µm e 10-500 µm). Em certas modalidades, um ADAS tem uma seção de eixo cruzado menor entre cerca de: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, até 100% do eixo maior. Em certas modalidades, um ADAS tem um volume interno entre cerca de: 0,001-1 µm3, 0,3-5 µm3, 5-4000 µm3, ou 4000-50x107 µm3.

[0168] Em algumas modalidades, a invenção fornece ADAS altamente ativo. Um ADAS "altamente ativo" é um ADAS com elevado potencial de trabalho, por exemplo, um ADAS com a capacidade de realizar uma quantidade significativa de trabalho útil. O trabalho pode ser definido como, por exemplo, trabalho metabólico, incluindo síntese química (por exemplo, síntese de proteínas, ácidos nucléicos, lipídeos, carboidratos, polímeros ou pequenas moléculas), modificação química (por exemplo, modificação de proteínas, ácidos nucléicos, lipídeos, carboidratos, polímeros ou pequenas moléculas), ou transporte (por exemplo, importação, exportação ou secreção) em condições adequadas. Em algumas modalidades, o ADAS altamente ativo começa com uma grande reserva de energia, por exemplo, energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP). Em outras modalidades, o ADAS tem a capacidade de absorver ou gerar energia (por exemplo, ATP) de outra fonte. O termo "ADAS fornecido pela invenção" abrange todas as modalidades de ADAS aqui descritas, incluindo, em modalidades particulares, ADAS altamente ativo, cujo conjunto pode ser referido como "ADAS altamente ativo fornecido pela invenção", que é um subconjunto de o ADAS fornecido pela invenção.

[0169] Em um aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0170] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 3 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0171] Em algumas modalidades, um ADAS altamente ativo tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1 nM, 1,1 nM, 1,2 nM, 1,3 nM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 nM, 3,5 nM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM ou 50 mM. A concentração de ATP pode ser avaliada por uma variedade de meios incluindo, em certas modalidades, um ensaio BacTiter-GloTM (Promega) em ADAS lisados.

[0172] A elevada atividade pode ser avaliada adicional ou alternativamente como a taxa ou quantidade de aumento na concentração de ATP em um ADAS ao longo do tempo. Em algumas modalidades, a concentração de ATP de um ADAS é aumentada em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200% ou mais do que 200% após a incubação sob condições adequadas, por exemplo, incubação a 37 °C durante 12 horas. Em certas modalidades, um ADAS altamente ativo tem uma taxa de geração de ATP maior do que cerca de: 0,000001, 0,00001, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 500, 1000, 10000 ATP/sec/nm2 por pelo menos cerca de: 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias, 1 semana ou duas semanas.

[0173] Em outros aspectos, a elevada atividade é avaliada como uma taxa de diminuição na concentração de ATP ao longo do tempo. Em algumas modalidades, a concentração de ATP pode diminuir menos rapidamente em ADAS que são altamente ativos do que em ADAS que não são altamente ativos. Em algumas modalidades, a queda na concentração de ATP em um ADAS ou em uma composição de ADAS 24 horas após a preparação é inferior a cerca de 50% (por exemplo, inferior a cerca de: 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, ou 5%) em comparação com a concentração inicial de ATP (por exemplo, ATP pelo volume das células), por exemplo, como medido utilizando um ensaio BacTiter- GloTM (Promega).

[0174] A elevada atividade pode ser avaliada adicional ou alternativamente como índice de vida de um ADAS. O índice de vida útil é calculado como a razão da taxa de produção de GFP em 24 horas versus 30 minutos. Em algumas modalidades, um ADAS altamente ativo tem um índice de vida útil maior do que cerca de: 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,18, 0,2, 0,25, 0,3,0,35, 0,45, 0,5, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 1,0 ou mais. Em modalidades mais particulares, o índice de vida é medido em um ADAS contendo um plasmídeo GFP funcional com um promotor apropriado para a espécie em que a concentração de GFP é medida em relação ao número de ADAS, número médio de plasmídeos por ADAS e volume de solução com um leitor de placa em 30 minutos e 24 horas.

[0175] Em alguns aspectos, o ADAS produz uma proteína, por exemplo, uma proteína heteróloga. Em alguns aspectos, a elevada atividade é avaliada como uma taxa, quantidade ou duração da produção de uma proteína ou uma taxa de indução da expressão da proteína (por exemplo, responsividade de um ADAS a um sinal). Por exemplo, o ADAS pode compreender um plasmídeo, o plasmídeo compreendendo um promotor induzível e uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga, em que o contato do ADAS com um indutor do promotor induzível sob condições apropriadas resulta na produção da proteína heteróloga. Em alguns aspectos, a produção da proteína heteróloga é aumentada em pelo menos 1,6 vezes em um ADAS, por exemplo, um ADAS altamente ativo, que foi contatado com o indutor em relação a um ADAS que não foi contatado com o indutor. Por exemplo, em algumas modalidades, a produção da proteína heteróloga é aumentada em pelo menos 1,5 vezes, 1,75 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes ou mais de 10 vezes em um ADAS, por exemplo, um ADAS altamente ativo, que foi contatado com o indutor.

Em algumas modalidades, a taxa de produção da proteína heteróloga por um ADAS altamente ativo atinge um nível alvo dentro de uma duração particular após o contato do ADAS com o indutor, por exemplo, dentro de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas ou mais de 3 horas. Em algumas modalidades, uma proteína (por exemplo, uma proteína heteróloga) é produzida a uma taxa de pelo menos 0,1 femtogramas por hora por ADAS altamente ativo, por exemplo, pelo menos 0,2 0,4, 0,6, 0,8, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, ou 3500fg/hora por ADAS. Em algumas modalidades, a alta atividade de um ADAS é avaliada como uma duração para a qual uma proteína é produzida. Um ADAS altamente ativo pode produzir uma proteína (por exemplo, uma proteína heteróloga) por um período de pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas ou mais de 48 horas. B. ADAS e ADAS altamente ativo derivados de bactérias parentais deficientes em um fator de especificidade topológica de divisão celular

[0176] O ADAS pode ser derivado de células bacterianas parentais, conforme descrito neste documento.

[0177] Em alguns aspectos, a invenção fornece um ADAS e/ou uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS derivados de uma bactéria parental com uma redução em um nível, atividade ou expressão de um fator de especificidade topológica de divisão celular.

[0178] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS não compreende um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0179] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, a composição sendo substancialmente livre de células bacterianas viáveis e sendo produzida por um processo que compreende: (a) produzir, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de uma minicélula, produzindo assim o ADAS altamente ativo; e (c) separar o ADAS da bactéria original, produzindo assim uma composição que é substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

[0180] Em algumas modalidades dos aspectos acima, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 20% de identidade com um polipeptídeo minE de E. coli (SEQ ID NO: 1), por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica da divisão celular é um polipeptídeo minE. Espécies exemplificativas que têm polipeptídeos minE são fornecidos na Tabela 4 e em Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005.

[0181] Em algumas modalidades, a bactéria parental é E. coli e o polipeptídeo minE é minE de E. coli. Em outras modalidades a bactéria parental é Salmonella typhimurium e o polipeptídeo minE é minE de S. typhimurium. Ainda em outras modalidades, a bactéria parental é uma bactéria Escherichia, Acinetobacter, Agrobacterium, Anabaena, Aquifex, Azoarcus, Azotobacter, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Buchnera, Burkholderia, Candidatus, Chromobacterium, Crocosphaera, Dechloromonas, Desulfitobacterium, Desulfotalea, Erwinia, Francisella, Fusobacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Helicobacter, Legionella, Magnetospirillum, Mesorhizobium, Methylococcus, Neisseria,

Nitrosomonas, Nostoc, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Prochlorococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rubrivivax, Salmonella, Shewanella, Shigella, Sinorhizobium, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermus, Thiobacillus, Trichodesmium, Vibrio, Wigglesworthia, Wolinella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Deinococcus, Exiguobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Moorella, Oceanobacillus, Symbiobacterium, ou Thermoanaerobacter e um e o fator de especificidade topológica de divisão celular é minE ou DivIVA endógeno da bactéria parental.

[0182] Em algumas modalidades dos aspectos acima, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 20% de identidade com um polipeptídeo DivIVA de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 4), por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o fator de especificidade topológica de divisão celular é um polipeptídeo DivIVA. Espécies exemplificativas que têm polipeptídeos DivIVA são fornecidos na Tabela 4 e em Rothfield et al., Nature Reviews Microbiology, 3: 959-968, 2005. Em algumas modalidades, a bactéria parental é Bacillus subtilis e o fator de especificidade topológica de divisão celular é DivIVA de B. subtilis.

[0183] Em algumas modalidades, o ADAS ou bactéria parental possuindo a redução em um nível ou atividade do fator de especificidade topológica de divisão celular também tem uma redução em um nível de uma ou mais proteínas de inibição do anel Z.

[0184] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos

20% de identidade com um polipeptídeo minC de E. coli (SEQ ID NO: 2), por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo minC.

[0185] Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 20% de identidade com um polipeptídeo minD de E. coli (SEQ ID NO: 3), por exemplo, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a proteína de inibição do anel Z é um polipeptídeo minD.

[0186] Em algumas modalidades, o ADAS ou bactéria parental tem uma redução no nível, atividade, ou expressão de pelo menos duas proteínas de inibição do anel Z. Em algumas modalidades, o ADAS ou bactéria parental tem uma redução na expressão de um polipeptídeo minC e um polipeptídeo minD. Em algumas modalidades, o ADAS ou bactéria parental tem uma redução na expressão de um polipeptídeo minC, um polipeptídeo minD, e um polipeptídeo minE, por exemplo, uma deleção do operon minCDE (ΔminCDE).

[0187] Uma redução no nível, atividade ou expressão de um fator de especificidade topológica de divisão celular ou uma proteína de inibição de anel Z, por exemplo, uma redução em um ADAS ou uma redução em uma célula bacteriana parental, pode ser alcançada usando qualquer método adequado. Por exemplo, em algumas modalidades, a redução no nível ou atividade é causada por uma mutação de perda de função, por exemplo, uma deleção de gene. Em algumas modalidades, a mutação de perda de função é uma mutação de perda de função induzível e a perda de função é induzida pela exposição da célula parental a uma condição de indução, por exemplo, a mutação de perda de função induzível é uma mutação sensível a temperatura e em que a condição indutora é uma condição de temperatura.

[0188] Em algumas modalidades, a célula parental tem uma deleção do operon minCDE (ΔminCDE) ou operon homólogo. C. ADAS compreendendo uma carga

[0189] Em algumas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção inclui uma carga contida no interior do ADAS. Uma carga pode ser qualquer porção disposta no interior de um ADAS (por exemplo, encapsulada pelo ADAS) ou conjugada à superfície do ADAS. Em algumas modalidades, a carga compreende um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma pequena molécula, um sistema de edição de gene, um hormônio, um modulador imunológico, um carboidrato, um lipídeo, um partícula orgânica, uma partícula inorgânica ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP) ou uma combinação dos anteriores.

[0190] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um DNA, um RNA ou um plasmídeo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA ou plasmídeo) codifica uma proteína. Em algumas modalidades, a proteína é transcrita e/ou traduzida no ADAS.

[0191] Em algumas modalidades, a carga é uma enzima. Em algumas modalidades, a enzima altera um substrato para produzir um produto alvo. Em algumas modalidades, o substrato está presente no ADAS e o produto alvo é produzido no ADAS. Em outras modalidades, o substrato está presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é entregue.

[0192] Em certas modalidades, a carga é modificada para melhorar a estabilidade em comparação com uma versão não modificada da carga. A "estabilidade" de uma carga é uma relação sem unidade da meia-vida da carga não modificada e da meia-vida da carga modificada, medida nas mesmas condições ambientais. Em algumas modalidades, o ambiente é controlado experimentalmente, por exemplo, um fluido corporal simulado, água livre de RNAse, citoplasma celular, espaço extracelular ou "plasma ADAS" (ou seja, o conteúdo do volume interior de um ADAS, por exemplo, após a lise). Em algumas aplicações, é um ambiente agrícola, por exemplo, solo de campo variável, água de rio ou água do oceano. Em outras modalidades, o ambiente é real ou simulado: intestino animal, pele animal, trato reprodutivo animal, trato respiratório animal, corrente sanguínea animal ou espaço extracelular animal. Em certas modalidades, o ADAS não degrada substancialmente a carga.

[0193] Em certas modalidades, a carga compreende uma proteína. Em certas modalidades, a proteína tem estabilidade maior do que cerca de: 1,01, 1,1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 no citoplasma celular ou outros ambientes. A proteína pode ser qualquer proteína, incluindo fatores de crescimento; enzimas; hormônios; proteínas imunomoduladoras; proteínas antibióticas, tais como antibacterianas, antifúngicas, inseticidas, proteínas, etc.; agentes de direcionamento, tais como anticorpos ou nanocorpos, etc. Em algumas modalidades, a proteína é um hormônio, por exemplo, parácrino, endócrino, autócrino.

[0194] Em algumas modalidades, a carga compreende um hormônio vegetal, tal como ácido abscísico, auxina, citocinina, etileno, giberelina ou uma combinação dos mesmos.

[0195] Em certas modalidades, a carga é um modulador imunológico, tal como um estimulador imunológico, inibidores de ponto de verificação (por exemplo, de PD-1, PD-L1, CTLA-4), agente quimioterápico, supressores, superantígenos, molécula pequena (ciclosporina A, dinucleotídeos cíclicos (CDNs) ou agonista STING (por exemplo, MK-1454)).

[0196] Para ADAS que compreende carga, em algumas modalidades, a carga é um RNA, tal como RNA circular, mRNA, siRNA, shRNA, ASO, tRNA, dsRNA ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o RNA tem estabilidade maior do que cerca de: 1,01, 1,1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000, por exemplo, no plasma ADAS. A carga de RNA pode ser estabilizada, em certas modalidades, por exemplo, com uma estrutura de alça em degrau anexada, tal como um molde de tRNA. Por exemplo, tRNALys3 não- humano e tRNAMet de E. coli (Nat. Methods, Ponchon 2007). Ambos foram bem caracterizados e expressos de forma recombinante. No entanto, uma variedade de outros tipos podem ser usados, bem como, tais como aptâmeros, lncRNA, ribozimas, etc. RNA também pode ser estabilizado, onde o ADAS é obtido a partir de uma cepa nula parental (ou hipomórfico) para um ou mais ribonucleases.

[0197] Em algumas modalidades particulares, o RNA é um mRNA que codifica uma proteína. Em modalidades mais específicas, o mRNA que codifica a proteína codifica uma enzima (por exemplo, e enzima que confere atividade enzimática hepática, tal como PBGD humano (hPBGD) mRNA) ou um antígeno, por exemplo, que induz uma resposta imune (tal como eliciar um potente e título de anticorpo neutralizante durável), tal como mRNA que codifica glicoproteínas gB de CMV e/ou complexo pentamérico (PC)). Em certas modalidades particulares, o RNA é um pequeno RNA não codificante, tal como shRNA, ASO, tRNA, dsRNA ou uma combinação dos mesmos.

[0198] Em certas modalidades, o ADAS fornecido pela invenção inclui carga que compreende um sistema de edição de genes. Um "sistema de edição de genes" inclui (ou codifica) proteínas que podem, com ácidos nucleicos associados adequados, modificar uma sequência de DNA de interesse, tal como uma sequência de DNA genômico, seja por inserção ou deleção de uma sequência de interesse, bem como um estado de metilação alterado. Sistemas de edição de genes exemplificativos incluem aqueles baseados em um sistema Cas, tal como Cas9, Cpf1 ou outros sistemas direcionados a RNA com seu RNA companheiro, bem como nucleases de dedo de zinco e efetores de TAL conjugados a nucleases.

[0199] Outras modalidades de ADAS fornecidas pela invenção incluem DNA como carga, incluindo como um plasmídeo, opcionalmente em que o DNA compreende uma sequência de codificação de proteína. A carga de DNA exemplificativa inclui, em certas modalidades, um plasmídeo que codifica uma sequência de RNA de interesse (ver exemplos acima), por exemplo, que pode ser flanqueado em cada lado por uma inserção de tRNA. Várias cargas de DNA são abrangidas pela invenção, incluindo: produção de ADAS (por exemplo, condução da sobre-expressão de FTZ, exonucleases degradantes do genoma); plasmídeos de longevidade (expressando ATP sintase, expressando rodopsina); aqueles que expressam RNA não codificante estabilizado, tRNA, lncRNA; expressão de proteínas de cauda de sistema de secreção, domínio efetor NleE2 e cauda de localização; sistemas de secreção T3/4SS, T5SS, T6SS; circuitos lógicos, sistemas de secreção expressos condicionalmente; e suas combinações. Em algumas modalidades, um circuito lógico inclui cassetes de expressão ou supressão induzíveis, tal como o promotor Plac indutível por IPTG e a porção hrpR da porta AND e, por exemplo, o promotor induzido pelo calor pL (do fago lambda, que geralmente é suprimido por uma proteína termolábil) e a porção hrpS da porta AND. Para manipular uma porta OR, pode ser usado um sistema descrito por Rosado et al., PLoS Genetics, 2018. Resumidamente, pode ser usado um mRNA cis-reprimido que codifica para RFP sob um promotor constitutivo. A repressão pode então ser removida na presença de

RAJ11 sRNA. Os plasmídeos contendo o promotor PLac indutível por IPTG e o promotor pL induzido por calor, ambos os quais induzem a expressão de sRNA RAJ11, podem então ser usados. A saída seria então a expressão RFP, que é vista em resposta a qualquer uma das entradas. Estes sistemas podem ser adaptados a uma variedade de funções do tipo sensor.

[0200] O ADAS fornecido pela invenção, em algumas modalidades, inclui um transportador na membrana. Em certas modalidades, o transportador é específico para glicose, sódio, potássio, um íon metálico, um soluto aniônico, um soluto catiônico ou água.

[0201] Em algumas modalidades, a membrana de um ADAS fornecido pela invenção compreende uma enzima. Em modalidades particulares, a enzima é uma protease, oxidorredutase ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a enzima é conjugada quimicamente à membrana ADAS, opcionalmente por meio de um ligante à membrana externa. D. ADAS compreendendo um sistema de secreção

[0202] Em certas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção compreende um sistema de secreção bacteriana (por exemplo, um sistema de secreção bacteriana endógeno ou um sistema de secreção heterólogo). Um "sistema de secreção bacteriana" é uma proteína, ou complexo proteico, que pode exportar uma carga do citoplasma de uma célula bacteriana (ou, por exemplo, um ADAS derivado dela) para: o espaço extracelular, o espaço periplasmático de uma bactéria gram- negativa ou o espaço intracelular de outra célula. Em algumas modalidades, o sistema de secreção bacteriana funciona por um processo ativo (por exemplo, dependente de ATP ou dependente de PMF) e, em certas modalidades, o sistema de secreção bacteriana compreende um tubo ou um pico que atravessa a célula hospedeira (ou ADAS) para um alvo célula. Em outras modalidades, o sistema de secreção bacteriana é um canal transmembranar. Os sistemas de secreção bacteriana exemplificativos incluem T3SS e T4SS (e T3/T4SS, conforme definido abaixo), que são estruturas contendo tubos onde a carga atravessa o interior de um tubo de proteína e T6SS, que transporta a carga no final de um pico. Outros sistemas de secreção bacteriana exemplificativos incluem T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec e Tat, que são transmembranares.

[0203] Em algumas modalidades, o sistema de secreção heterólogo é um T3SS.

[0204] Em algumas modalidades, o ADAS compreende uma carga, em que a carga compreende uma porção que direciona a exportação pelo sistema de secreção bacteriana, por exemplo, em algumas modalidades a porção é Pho/D, Tat ou um sinal de peptídeo sintético.

[0205] Em certas modalidades, o ADAS fornecido pela invenção são ADAS de duas membranas. Em modalidades mais particulares, o ADAS de duas membranas compreende ainda um sistema de secreção bacteriana. Em modalidades ainda mais particulares, o sistema de secreção bacteriana é selecionado de T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS, opcionalmente em que T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS têm um efetor atenuado ou não funcional que não afeta a aptidão de uma célula alvo.

[0206] O ADAS fornecido pela invenção, em algumas modalidades, inclui um sistema de secreção bacteriana.

[0207] Em algumas modalidades, o sistema de secreção bacteriana é capaz de exportar uma carga através da membrana externa do ADAS para uma célula alvo, tal como uma célula animal, fúngica, bacteriana ou vegetal, tal como T3SS, T4SS, T3/T4SS ou T6SS.

[0208] Em modalidades mais particulares, o sistema de secreção bacteriana é T3/4SS. Um "T3/4SS" é um sistema de secreção baseado em T3SS ou T4SS, incluindo sistemas híbridos, bem como versões não modificadas, que forma um tubo de proteína entre uma bactéria (ou

ADAS) e uma célula alvo, conectando os dois e entregando um ou mais efetores. A célula alvo pode ser um animal, planta, fungo ou bactéria. Em algumas modalidades, um T3/4SS inclui um efetor, que pode ser um efetor modificado. Exemplos de sistemas T3SS incluem o sistema Salmonella SPI-1, o sistema EHEC coli ETT1, o sistema Xanthamonas Citri/Campestri T3SS e o sistema Pseudomonas syringae T3SS. Exemplos de sistemas T4SS incluem o sistema de plasmídeo Agrobacterium Ti, Helicobacter pylori T4SS. Em certas modalidades, o T3/4SS tem função efetora modificada, por exemplo, um efetor selecionado de SopD2, SopE, Bop, Map, Tir, EspB, EspF, NleC, NleH2 ou NleE2. Em modalidades mais específicas, a função efetora modificada é para direcionamento intracelular, tal como translocação para o núcleo, golgi, mitocôndria, actina, microvilosidades, ZO-1, microtúbulos ou citoplasma. Em modalidades ainda mais particulares, a função efetora modificada é o direcionamento nuclear com base em NleE2 derivado de E. Coli. Em outras modalidades particulares, a função efetora modificada é para a formação de filopódios, interrupção da junção estanque, apagamento de microvilosidades ou inativação de SGLT-1.

[0209] Em outras modalidades, um ADAS fornecido pela invenção compreendendo um sistema de secreção bacteriana compreende um T6SS. Em algumas modalidades, o T6SS, em seu hospedeiro natural, tem como alvo uma bactéria e contém um efetor que mata a bactéria. Em certas modalidades particulares, o T6SS é derivado de P. putida K1- T6SS e, opcionalmente, em que o efetor compreende a sequência de aminoácidos de Tke2 (Acesso AUZ59427.1) ou um fragmento funcional do mesmo. Em outras modalidades, o T6SS, no seu hospedeiro natural, tem como alvo um fungo e contém um efetor que mata fungos, por exemplo, o T6SS é derivado de Serratia Marcescens e os efetores compreendem as sequências de aminoácidos de: Tfe1 (Genbank:

SMDB11_RS05530) ou Tfe2 (Genbank: SMDB11_RS05390).

[0210] Em outras modalidades de um ADAS fornecido pela invenção que contém um sistema de secreção bacteriana, o sistema de secreção bacteriana é capaz de exportar uma carga extracelularmente. Em certas modalidades mais particulares, o sistema de secreção bacteriana é T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec ou Tat. E. ADAS sem proteases, RNases e/ou LPS

[0211] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativo), em que o ADAS tem um nível de protease reduzido ou atividade em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria original de tipo selvagem. Em alguns aspectos, o ADAS é produzido a partir de uma bactéria parental que foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma protease.

[0212] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativo), em que o ADAS tem um nível ou atividade de RNAse reduzido em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria parental de tipo selvagem. Em alguns aspectos, o ADAS é produzido a partir de uma bactéria parental que foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma RNAse. Em algumas modalidades, a RNase é uma endoribonuclease ou uma exoribonuclease.

[0213] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS foi modificado para ter lipopolissacarídeo reduzido (LPS). Em algumas modalidades, a modificação é uma mutação na biossíntese de Lipídeo A miristoiltransferase (msbB).

[0214] Em certas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção carece de uma ou mais proteínas metabolicamente não essenciais. Uma "proteína metabolicamente não essencial" inclui de forma não exaustiva: fímbrias, flagelos, sistemas de secreção indesejados, transposases, efetores, elementos de fago ou seus elementos reguladores, tais como flhC ou OmpA. Em algumas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção carece de um ou mais de uma RNAse, uma protease, ou uma combinação dos mesmos, e, em modalidades particulares, carece de um ou mais endoribonucleases (tal como RNAse A, RNAse h, RNAse III, RNAse L, RNAse PhyM) ou exoribonucleases (tais como RNAse R, RNAse PH, RNAse D); ou serina, cisteína, treonina, aspártico, glutâmico e metaloproteases; ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. E. ADAS compreendendo uma porção de direcionamento

[0215] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativo), em que o ADAS compreende uma porção de direcionamento. Em algumas modalidades, a porção de direcionamento é um nanocorpo, uma proteína de ligação a carboidratos ou um peptídeo direcionado a tumor.

[0216] Em certas modalidades, o nanocorpo é um nanocorpo direcionado a um antígeno tumoral, tal como HER2, PSMA ou VEGF-R. Em outras modalidades, a proteína de ligação de carboidrato é uma lectina, por exemplo, Lectina de Ligação a Manose (MBL). Em ainda outras modalidades, o peptídeo direcionado ao tumor é um motivo RGD ou peptídeo CendR. F. ADAS derivado de cepas parentais comensais ou patogênicas

[0217] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativo), em que o ADAS é derivado de uma bactéria parental que é um patógeno de mamífero ou uma bactéria comensal de mamífero. Em alguns casos, a bactéria comensal de mamífero é uma espécie deStaphylococcus, Bifidobacterium, Micrococcus,

Lactobacillus, ou Actinomyces ou a bactéria patogênica de mamífero é Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC), Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica, ou Helicobacter pylori.

[0218] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativo), em que o ADAS é derivado de uma bactéria de plantas que é um patógeno de plantas ou uma bactéria comensal de plantas. Em alguns casos, a bactéria comensal de plantas é Bacillus subtilis ou Psuedomonas putida ou a bactéria patogênica de plantas é uma espécie de Xanthomonas ou Pseudomonas syringae. G. ADAS derivado de cepas parentais auxotróficas

[0219] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS (por exemplo, ADAS altamente ativa), em que o ADAS é derivado de uma bactéria parental auxotrófica, ou seja, um uma bactéria parental que é incapaz de sintetizar um composto orgânico necessário para o crescimento. Essas bactérias são capazes de crescer apenas quando o composto orgânico é fornecido. H. ADAS compreendendo porções adicionais

[0220] Um ADAS, em certas modalidades, inclui uma ATP sintase funcional e, em algumas modalidades, uma bomba de prótons embutida na membrana. ADAS pode ser derivado de diferentes fontes, incluindo: uma cepa bacteriana parental ("cepa parental") manipulada ou induzida para produzir sistemas de membrana fechados sem genoma, uma bactéria excisada por genoma, um extrato de preparação de célula bacteriana (por exemplo, por meios mecânicos ou outros), ou uma síntese total, opcionalmente incluindo frações de uma preparação de células bacterianas. Em algumas modalidades, um ADAS altamente ativo tem uma concentração de ATP sintase de pelo menos: 1 por 10000 nm2, 1 por 5000 nm2, 1 por 3500 nm2, 1 por 1000 nm2.

[0221] ADAS fornecido pela invenção pode incluir uma variedade de componentes adicionais, incluindo, por exemplo, bombas fotovoltaicas, retinais e cassetes de produção de retinal, enzimas metabólicas, agentes de direcionamento, carga, sistemas de secreção bacteriana e transportadores, incluindo combinações dos anteriores, incluindo certas modalidades particulares descritas abaixo. Em certas modalidades, o ADAS carece de outros elementos, tal como genes metabolicamente não essenciais e/ou certas nucleases ou proteases.

[0222] Em certas modalidades, o ADAS fornecido pela invenção compreende uma ATP sintase, opcionalmente sem um domínio regulatório, tal como sem um domínio épsilon. A deleção pode ser realizada por vários meios. Em certas modalidades, a deleção é por deleção induzível do domínio épsilon nativo. Em certas modalidades, a deleção pode ser realizada por flanqueamento com sítios LoxP e expressão de Cre induzível ou nocaute CRISPR, ou ser induzível (em lugar do plasmídeo sob um transactivador tTa tet numa cepa de nocaute ATP sintase).

[0223] Um ADAS, em algumas modalidades, pode incluir uma bomba de prótons fotovoltaica. Em certas modalidades, a bomba de prótons fotovoltaica é uma proteorrodopsina. Em modalidades mais particulares, a proteorrodopsina compreende a sequência de aminoácidos da proteorodopsina do clado de bactérias marinhas não cultivadas SAR86, Acesso do GenBank: AAS73014.1. Em outras modalidades, a bomba de prótons fotovoltaica é uma rodopsina de gloeobacter. Em certas modalidades, a bomba de prótons fotovoltaica é uma bacteriorodopsina, deltarodopsina ou halorodopsina de Halobium salinarum Natronomonas pharaonis, Exiguobacterium sibiricum, Haloterrigena turkmenica ou Haloarcula marismortui.

[0224] Em algumas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção compreende ainda retinal. Em certas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção compreende ainda uma proteína de síntese retinal (ou sistema de proteína) ou um ácido nucleico que codifica a mesma.

[0225] Em certas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção compreende ainda uma ou mais proteínas da via de glicólise. Em algumas modalidades, a proteína da via da glicólise é uma fosfofrutocinase (Pfk-A), por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos do acesso UniProt P0A796 ou um fragmento funcional do mesmo. Em outras modalidades, a proteína da via da glicólise é triosefosfato isomerase (tpi), por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos do acesso UniProt P0A858, ou um fragmento funcional do mesmo. I. Composições e formulações de ADAS

[0226] A presente invenção fornece composições ou preparações que contêm um ADAS fornecido pela invenção, incluindo, inter alia, uma preparação de ADAS altamente ativa fornecida pela invenção ou uma preparação de ADAS em que uma pluralidade de ADAS individuais carece de um fator de especificidade topológica de divisão celular, por exemplo, falta um produto do gene minE e, opcionalmente, em que a preparação de ADAS está substancialmente livre de células viáveis. Coletivamente, estas são "composições fornecidas pela invenção" ou "uma composição fornecida pela invenção" ou semelhantes e podem conter qualquer ADAS fornecido pela invenção e qualquer combinação de ADAS fornecido pela invenção.

[0227] Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição fornecida pela invenção contém pelo menos cerca de: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 %, ou mais ADAS que contêm um sistema de secreção bacteriana. Em modalidades particulares, o sistema de secreção bacteriana é um de T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS.

[0228] Em algumas modalidades, uma composição fornecida pela invenção contém ADAS que contém um T3SS, em que o ADAS compreende uma densidade de membrana T3SS média maior do que 1 em cerca de: 40000, 35000,30000, 25000, 19600, 15000, 10000 ou 5000 nm2. Em certas modalidades particulares, o ADAS é derivado de uma cepa parental de S. typhimurium ou E. coli.

[0229] Certas modalidades das composições fornecidas pela invenção contêm ADAS que contêm um T3SS, onde o ADAS compreende uma densidade de membrana T3SS média maior do que 1 em cerca de: 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 20000, 10000, 5000 nm2. Em certas modalidades particulares, o ADAS é derivado de uma cepa parental de Agrobacterium tumefaciens.

[0230] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição de ADAS, em que pelo menos cerca de: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 %, ou mais dos ADAS contêm um sistema de secreção bacteriana, incluindo T3, T4, T3/4SS, T6SS, e opcionalmente incluindo um ou mais dentre: carboidratos exógenos, sintases produtoras de fosfato, proteínas responsivas à luz, proteínas de importação, enzimas, carga funcional, efetores específicos do organismo, proteínas de fusão.

[0231] Como será prontamente aparente, as composições e preparações fornecidas pela invenção podem conter qualquer ADAS fornecido pela invenção, tal como ADAS altamente ativo ou ADAS que não possui um produto do gene minE.

[0232] As composições fornecidas pela invenção podem ser preparadas em qualquer formulação adequada. Por exemplo, a formulação pode ser adequada para administração IP, IV, IM, oral, tópica (creme, gel, pomada, adesivo transdérmico), aerossol ou nebulização. Em algumas modalidades, uma formulação é uma formulação líquida. Em outras modalidades, a formulação é uma formulação liofilizada.

[0233] Em algumas modalidades, uma composição de ADAS aqui descrita compreende menos de 100 unidades formadoras de colônia (UFC/mL) de células bacterianas viáveis, por exemplo, menos de 50 UFC/mL, menos de 20 UFC/mL, menos de 10 UFC/mL, menos de 1 UFC/mL, ou menos de 0,1 UFC/mL de células bacterianas viáveis.

[0234] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição de ADAS em que o ADAS é liofilizado e reconstituído, e em que o ADAS reconstituído tem uma concentração de ATP que é pelo menos 90% da concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado, por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou pelo menos igual à concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado.

[0235] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição de ADAS em que os ADAS são armazenados, por exemplo, armazenados a 4 °C, em que após o armazenamento, o ADAS tem uma concentração de ATP que é pelo menos 90% da concentração de ATP de um ADAS que não foi armazenado, por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou pelo menos igual à concentração de ATP de um ADAS que não foi armazenado. Em algumas modalidades, o armazenamento é de pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos seis meses ou pelo menos um ano.

[0236] Em algumas modalidades, o ADAS pode ser conservado ou de outra forma mantido em um estado "repouso” e, em seguida, rapidamente tornar-se ativado.

[0237] Em algumas modalidades, a composição de ADAS é formulada para entrega a um animal, por exemplo, formulada para administração intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, oral, tópica, aerossolizada ou nebulizada.

[0238] Em algumas modalidades, a composição de ADAS é formulada para entrega a uma planta.

[0239] Em algumas modalidades, a composição de ADAS é formulada para entrega a um inseto.

[0240] Em algumas modalidades, a composição é formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa. J. ADAS compreendendo uma enzima

[0241] Em um aspecto, a invenção apresenta uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS compreende uma enzima e em que a enzima altera um substrato para produzir um produto alvo. Em algumas modalidades, o substrato está presente no ADAS e o produto alvo é produzido no ADAS. Em outras modalidades, o substrato está presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é entregue. Em algumas modalidades, a enzima é diadenilato ciclase A, o substrato é ATP e o produto alvo é di-AMP cíclico. III. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE ADAS A. Produzindo ADAS e ADAS altamente ativo

[0242] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método para fabricar uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, a composição sendo substancialmente livre de células bacterianas viáveis, o método compreendendo (a) produzir, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de uma minicélula, produzindo assim o ADAS altamente ativo; e (c) separar a ADAS altamente ativos a partir da bactéria parental, produzindo assim uma composição que é substancialmente isenta de células bacterianas viáveis.

[0243] As bactérias parentais incluem qualquer espécie bacteriana adequada a partir da qual um ADAS pode ser gerado (por exemplo,

espécies que podem ser modificadas usando métodos aqui descritos para produzir ADAS). A Tabela 4 fornece uma lista não limitativa de gêneros adequados dos quais o ADAS pode ser derivado.

Tabela 4. Espécies bacterianas para produção de ADAS Bactérias gram negativas Escherichia Acinetobacter Agrobacterium Anabaena Aquifex Azoarcus Azotobacter Bordetella Bradyrhizobium Brucella Buchnera Burkholderia Candidatus Chromobacterium Crocosphaera Dechloromonas Desulfitobacterium Desulfotalea Erwinia Francisella Fusobacterium Gloeobacter Gluconobacter Helicobacter

Bactérias gram negativas Legionella Magnetospirillum Mesorhizobium Methylococcus Neisseria Nitrosomonas Nostoc Photobacterium Photorhabdus Polaromonas Prochlorococcus Pseudomonas Psychrobacter Ralstonia Rubrivivax Salmonella Shewanella Shigella Sinorhizobium Synechococcus Synechocystis Thermosynechococcus Thermotoga Thermus Thiobacillus Trichodesmium Vibrio Wigglesworthia

Bactérias gram negativas Wolinella Xanthomonas Xylella Yersinia Bactérias gram positivas Bacillus Clostridium Deinococcus Exiguobacterium Geobacillus Lactobacillus Listeria Moorella Oceanobacillus Symbiobacterium Thermoanaerobacter

[0244] Em alguns aspectos, a invenção apresenta métodos para a fabricação de qualquer uma das composições de ADAS, por exemplo, composições de ADAS altamente ativo, descrito na Seção I deste documento. Por exemplo, são fornecidos neste documento métodos para fazer ADAS altamente ativo; métodos para fazer ADAS sem um fator de especificidade topológica de divisão celular e, opcionalmente, sem uma proteína de inibição do anel Z (por exemplo, métodos para fazer ADAS a partir de bactérias parentais ΔminCDE) e métodos para fazer qualquer um dos ADAS mencionados neste documento, em que o ADAS compreende uma carga.

[0245] O ADAS altamente ativo de qualquer uma das reivindicações anteriores pode ser feito a partir de uma célula bacteriana, em que em que a cepa parental é selecionada a partir de uma bactéria vegetal, tal como uma planta comensal (por exemplo, B. Subtilis ou Pseudomonas putida) ou uma bactéria patogênica de planta (por exemplo, Xanthomonas sp. ou Pseudomonas syringae) ou uma bactéria humana, tal como uma bactéria comensal humana (por exemplo, E. coli, Staphylococcus sp., Bifidobacterium sp., Micrococcus sp., Lactobacillus sp., ou Actinomyces sp.) ou uma bactéria humana patogênica (por exemplo, Escherichia coli EHEC, Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica, Helicobacter pylori), ou um extremófilo, incluindo derivados funcionalizados de qualquer um dos anteriores, por exemplo, incluindo uma cassete funcional, tal como uma cassete funcional que induz a bactéria a fazer um ou mais dos seguintes: secretar antimicrobianos, digerir plástico, secretar inseticidas, sobreviver a ambientes extremos, fazer nanopartículas, integrar-se em outros organismos, responder ao ambiente e criar sinais de repórter.

[0246] As bactérias parentais podem incluir derivados funcionalizados de qualquer um dos anteriores, por exemplo, incluindo uma cassete funcional, tal como uma cassete funcional que induz a bactéria a fazer um ou mais dos seguintes: secretar antimicrobianos, digerir plástico, secretar inseticidas, sobreviver a ambientes extremos, produzir nanopartículas, integrar com outros organismos, responder ao ambiente e criar sinais repórter.

[0247] Em algumas modalidades, um ADAS é derivado de uma cepa parental manipulada ou induzida para sobre-expressar ATP sintase. Em algumas modalidades mais particulares, a ATP sintase é heteróloga à cepa parental. Em certas modalidades particulares, a cepa parental é modificada para expressar uma FoF1 ATP sintase funcional.

[0248] Em certas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção é obtido a partir de uma cepa parental cultivada sob uma condição selecionada de: voltagem aplicada (por exemplo, 37 mV), concentração de oxigênio não atmosférico (por exemplo, 1-5% O2, 5-10% O2, 10-15%

O2, 25-30% O2), baixo pH (cerca de: 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5) ou uma combinação dos mesmos.

[0249] ADAS altamente ativo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é feito a partir de um extremófilo, incluindo derivados funcionalizados de qualquer um dos anteriores, por exemplo, incluindo uma cassete funcional, tal como um cassete funcional que induz a bactéria a fazer um ou mais de: secretar antimicrobianos, digerir plástico, secretar inseticidas, sobreviver a ambientes extremos, produzir nanopartículas, integrar com outros organismos, responder ao ambiente e criar sinais repórter.

[0250] Devido à diversidade de bactérias, o ADAS pode ser feito com membranas modificadas, por exemplo, para melhorar a biodistribuição do ADAS após a administração a uma célula alvo. Em certas modalidades, a membrana é modificada para ser menos imunogênica ou imunoestimulante em plantas ou animais. Por exemplo, em certas modalidades, o ADAS é obtido a partir de uma cepa parental, em que as capacidades imunoestimulatórias da cepa parental são reduzidas ou eliminadas por meio de tratamento pós-produção com detergentes, enzimas ou funcionalizadas com PEG. Em certas modalidades, o ADAS é feito a partir de uma cepa parental e a membrana é modificada por meio de nocaute das vias de síntese de LPS na cepa parental, por exemplo, por nocaute de msbB. Em outras modalidades particulares, o ADAS é feito a partir de uma cepa parental que produz partículas deficientes na parede celular por meio da exposição a condições hiperosmóticas.

[0251] Em algumas modalidades, os métodos incluem a transformação de uma cepa parental com um sistema DNAse induzível, tal como as nucleases exoI (NCBI GeneID: 946529) & sbcD (NCBI GeneID: 945049), ou a nuclease I-CeuI (por exemplo, Swissprot: P32761.1). Em modalidades mais particulares, os métodos incluem o uso de uma cepa auxotrófica única, dupla, tripla ou quádrupla e possuindo os genes complementares no plasmídeo que codificam as nucleases induzíveis.

[0252] Em algumas modalidades, os métodos dos métodos fornecidos pela invenção, a cepa parental é cultivada sob uma condição selecionada de: voltagem aplicada (por exemplo, 37 mV), concentração de oxigênio não atmosférico (por exemplo, 1-5% O2, 5-10% O2, 10-15% O2, 25-30% O2), pH baixo (4,5-6,5), ou uma combinação dos mesmos.

[0253] Em certas modalidades, os métodos dos métodos fornecidos pela invenção, a cepa parental carece de flagelos e sistemas de secreção indesejados, opcionalmente onde os flagelos e os sistemas de secreção indesejados são removidos usando recombinação de vermelho lambda.

[0254] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos pela invenção, os componentes de controle de flagelos são excisados do genoma da cepa parental por meio, por exemplo, da inserção de um plasmídeo contendo um domínio CRISPR que é direcionado para genes de controle de flagelos, tais como flhD e flhC.

[0255] Em certas modalidades, os métodos fornecidos pela invenção são para a produção de um ADAS altamente ativo, em que um ADAS compreendendo um plasmídeo contendo um gene que codifica a rodopsina é cultivado na presença de luz. Em modalidades mais particulares, a rodopsina é a proteorodopsina de bactérias não cultivadas SAR86, possuindo a sequência de aminoácidos de acesso GenBank: AAS73014.1 ou um fragmento funcional desta. Em modalidades ainda mais particulares, a cultura é suplementada com retinal. Em outras modalidades mais particulares, a rodopsina é proteorodopsina e o plasmídeo contém adicionalmente genes que sintetizam retinal (tal plasmídeo é o plasmídeo pACYC- RDS de Kim et al., Microb Cell Fact, 2012).

[0256] Em certas modalidades particulares, a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um nanocorpo que é então expresso na membrana do ADAS.

[0257] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos pela invenção, a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais operons do sistema de secreção bacteriana. Plasmídeos exemplificativos incluem o plasmídeo Salmonella SPI-1 T3SS, Shigella flexneri T3SS, o Agro Ti e o sistema de P. putida K1- T6SS.

[0258] Em certas modalidades, a cepa parental compreende uma carga. Em algumas modalidades, a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um conjunto de genes que sintetizam uma carga de molécula pequena. IV. PURIFICAÇÃO DE ADAS E COMPOSIÇÕES DE ADAS

[0259] Em algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos, os ADAS são purificados a partir de composições (por exemplo, culturas) compreendendo bactérias viáveis, por exemplo, bactérias parentais. Por exemplo, a invenção apresenta um método para fabricar uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, a composição sendo substancialmente livre de células bacterianas viáveis, o método compreendendo (a) produzir, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de uma minicélula, produzindo assim o ADAS altamente ativo; e (c) separar a ADAS altamente ativos a partir da bactéria parental, produzindo assim uma composição que é substancialmente isenta de células bacterianas viáveis.

[0260] A purificação separa o ADAS das células bacterianas parentais viáveis, que são maiores e contêm um genoma. A separação do ADAS altamente ativo das bactérias parentais pode ser realizada usando uma série de métodos, conforme descrito neste documento. Métodos exemplificativos para purificação aqui descritos incluem centrifugação, crescimento seletivo e processos de troca/concentração de tampão.

[0261] Em alguns aspectos, são aqui fornecidas composições ADAS, e métodos de comparação de tais composições, em que as composições são substancialmente livres de células bacterianas parentais e/ou células bacterianas viáveis, por exemplo, não têm mais do que 500, por exemplo, 400, 300, 200, 150 ou 100 ou menos do que 50, menos do que 25, menos do que 10, menos do que 5, menos do que 1, menos do que 0,1 unidades formadoras de colônia (UFC) por mL. Em algumas modalidades, uma composição de ADAS que é substancialmente livre de células bacterianas parentais pode não incluir células bacterianas.

[0262] As cepas parentais auxotrófica podem ser usadas para fazer ADAS fornecidos pela invenção. Conforme descrito em mais detalhes abaixo, tais métodos de fabricação são úteis para a purificação do ADAS. Por exemplo, após a geração de ADAS, as células bacterianas parentais podem ser removidas por crescimento em meio sem o nutriente (por exemplo, aminoácido) necessário para a viabilidade da bactéria original. Em algumas modalidades, um ADAS fornecido pela invenção é derivado de uma cepa parental auxotrófica para pelo menos 1, 2, 3, 4 ou mais de: arginina (por exemplo, nocaute em argA, tal como cepas JW2786- 1 e NK5992), nocaute de cisteína em cysE (tal como as cepas JW3582-2 e JM15), glutamina, por exemplo, nocaute em glnA (tal como as cepas JW3841-1 e M5004), glicina, por exemplo, nocaute em glyA (tal como as cepas JW2535-1 e AT2457), Histidina, por exemplo, nocaute em hisB (tal como as cepas JW2004-1 e SB3930), isoleucina, por exemplo, nocaute em ilvA (tal como as cepas JW3745-2 e AB1255),

leucina, por exemplo, nocaute em leuB (tal como as cepas JW5807- 2 e CV514), lisina, por exemplo, nocaute em lysA (tal como as cepas JW2806-1 e KL334), metionina, por exemplo, nocaute em metA (tal como as cepas JW3973-1 e DL41), fenilalanina, por exemplo, nocaute em pheA (tal como as cepas JW2580 -1 e KA197), prolina, por exemplo, nocaute em proA (tal como as cepas JW0233-2 e NK5525), Serina, por exemplo, nocaute em serA (tal como as cepas JW2880-1 e JC158), treonina, por exemplo, nocaute em thrC (tal como as cepas JW0003-2 e Gif 41), triptofano, por exemplo, nocaute em trpC (tal como as cepas JW1254-2 e CAG18455), Tirosina, por exemplo, nocaute em tyrA (tal como as cepas JW2581-1 e N3087), Valina/Isoleucina/Leucina, por exemplo, nocaute em ilvd (tal como as cepas JW5605-1 e CAG18431).

[0263] Em certas modalidades, os métodos incluem o uso de uma cepa parental auxotrófica única, dupla, tripla ou quádrupla, opcionalmente em que a referida cepa parental inclui ainda um plasmídeo que expressa um ftsZ. V. ÉTODOS DE USAR ADAS A. Métodos de entrega de um ADAS

[0264] Em um aspecto, a invenção apresenta um método para entregar um ADAS altamente ativo a uma célula alvo, o método compreendendo (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS altamente ativo, em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0265] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar um ADAS (por exemplo, um ADAS altamente ativo) a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0266] A célula alvo pode ser, por exemplo, uma célula animal, uma célula de plantas ou uma célula de inseto. B. Métodos de entrega de carga

[0267] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar uma carga (por exemplo, um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma pequena molécula, um sistema de edição de gene, um hormônio, um sistema imunológico modulador, um carboidrato, um lipídeo, uma partícula orgânica, uma partícula inorgânica ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP)) a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM, o ADAS compreende uma carga e a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0268] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para entregar uma carga (por exemplo, um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma pequena molécula, um sistema de edição de gene, um hormônio, um sistema imunológico modulador, um carboidrato, um lipídeo, uma partícula orgânica, uma partícula inorgânica ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP)) a uma célula alvo, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular, o ADAS compreende uma carga e a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

[0269] A célula alvo para a qual a carga é entregue pode ser, por exemplo, uma célula animal, uma célula de plantas ou uma célula de inseto. C. Métodos de modulação de um estado de uma célula

[0270] Em um aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula animal, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

[0271] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de planta, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

[0272] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de inseto, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de inseto com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

[0273] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula animal, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

[0274] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de planta, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

[0275] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de modulação de um estado de uma célula de inseto, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

[0276] A modulação pode ser qualquer mudança observável no estado (por exemplo, o transcriptoma, proteoma, epigenoma, efeito biológico ou estado de saúde ou doença) da célula (por exemplo, um animal, planta ou célula de inseto) conforme medido usando técnicas e métodos conhecidos na técnica para tal medição, por exemplo, métodos para medir o nível ou expressão de uma proteína, um transcrito, uma marca epigenética ou para medir o aumento ou redução da atividade de uma via biológica. Em algumas modalidades, a modulação do estado da célula envolve o aumento de um parâmetro (por exemplo, o nível ou a expressão de uma proteína, um transcrito ou a atividade de uma via biológica) da célula. Em outras modalidades, a modulação do estado envolve a diminuição de um parâmetro (por exemplo, o nível ou a expressão de uma proteína, um transcrito ou a atividade de uma via biológica) da célula. D. Métodos de tratamento de um animal, planta ou inseto

[0277] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de um animal em necessidade, o método compreendendo (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de em pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

[0278] Em outros aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de um animal em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

[0279] O animal que necessita de tratamento pode ter uma doença, por exemplo, um câncer. Em algumas modalidades, o ADAS transporta uma carga de quimioterapia ou uma carga de imunoterapia.

[0280] Em alguns aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma planta em necessidade, o método compreendendo (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de em pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga (por exemplo, uma praga de inseto) com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

[0281] Em outros aspectos, a invenção apresenta um método de tratamento de uma planta em necessidade, o método compreendendo: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de uma bactéria parental com uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga (por exemplo, uma praga de inseto) com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

[0282] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos de modulação de uma célula alvo. A célula alvo pode ser qualquer célula, incluindo uma célula animal (por exemplo, incluindo humanos e animais não humanos, incluindo animais de quinta ou animais domésticos, pragas), uma célula de plantas (incluindo de uma colheita ou uma praga), uma célula fúngica, ou uma célula bacteriana. A célula pode ser isolada, por exemplo, in vitro ou, em outras modalidades, dentro de um organismo, in vivo. Estes métodos implicam fornecer um ADAS fornecido pela invenção ou uma composição fornecida pela invenção com acesso à célula alvo, em uma quantidade eficaz. O acesso à célula alvo pode ser direto, por exemplo, onde a célula alvo é modulada diretamente pelo ADAS, tal como por secreção próxima de algum agente próximo à célula alvo ou injeção do agente na célula alvo, ou indireto. A modulação indireta da célula alvo pode ser por alvejamento de uma célula diferente, por exemplo, pela modulação de uma célula adjacente à célula alvo, cuja célula adjacente pode ser comensal ou patogênica para a célula alvo. A célula adjacente, como a célula alvo, pode ser in vitro ou in vivo - isto é, em um organismo, que pode ser comensal ou patogênico. Estes métodos são coletivamente "métodos de uso fornecidos pela invenção" e semelhantes. Em um aspecto relacionado, a invenção fornece usos alvo do ADAS e composições fornecidas pela invenção, em consonância com os métodos de uso fornecidos pela invenção.

[0283] Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um método de modulação de um estado de uma célula animal, fornecendo uma quantidade eficaz de um ADAS fornecido pela invenção ou composição fornecida pela invenção para acessar a célula animal. Em certas modalidades, o ADAS ou composição é fornecido acesso à célula animal in vivo, em um animal, tal como um mamífero, tal como um ser humano. Em algumas modalidades, a célula animal é exposta a bactérias em um animal saudável. Em modalidades mais particulares, a célula animal é o epitélio pulmonar, uma célula imune, célula da pele, célula epitelial oral, célula epitelial intestinal, célula epitelial do trato reprodutivo ou célula do trato urinário. Em modalidades ainda mais particulares, a célula animal é uma célula epitelial do intestino, tal como uma célula epitelial do intestino de um sujeito humano com uma doença inflamatória do intestino, tal como a doença de Crohn ou colite. Em modalidades ainda mais particulares, a célula animal é uma célula epitelial do intestino de um sujeito com uma doença inflamatória intestinal e o ADAS compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga que compreende um agente anti-inflamatório.

[0284] Em outras modalidades, a célula animal é exposta a bactérias em um estado de doença. Em certas modalidades, a célula animal é patogênica, tal como um tumor. Em outras modalidades, a célula animal é exposta a bactérias em um estado de doença, tal como uma ferida, uma úlcera, um tumor ou um distúrbio inflamatório.

[0285] Em certas modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental comensal animal. Em outras modalidades, o ADAS é derivado de cepa parental patogênica animal.

[0286] Em certas modalidades particulares, a célula animal é colocada em contato com uma quantidade eficaz de um ADAS compreendendo um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula animal. Em algumas modalidades particulares, a célula animal tem acesso a uma quantidade eficaz de um ADAS que compreende uma carga e um sistema de secreção, em que a carga é secretada extracelularmente e contata a célula animal.

[0287] Em algumas modalidades, o estado da célula animal é modulado ao fornecer uma quantidade eficaz de um ADAS fornecido pela invenção ou uma composição fornecida pela invenção com acesso a uma célula bacteriana ou fúngica na vizinhança da célula animal. Ou seja, esses métodos implicam em modular indiretamente o estado da célula animal. Em certas modalidades, a célula bacteriana ou fúngica é patogênica. Em modalidades mais particulares, a aptidão da célula bacteriana ou fúngica patogênica é reduzida. Em outras modalidades, a célula bacteriana ou fúngica é comensal. Em modalidades mais particulares, a aptidão da célula bacteriana ou fúngica comensal é aumentada. Em modalidades ainda mais particulares, a adequação da cepa bacteriana ou fúngica comensal é aumentada por meio da redução na adequação do número de bactérias ou fungos concorrentes, que podem ser neutros, comensais ou patogênicos.

[0288] Em certas modalidades particulares, a célula bacteriana ou fúngica na vizinhança da célula animal é colocada em contato com uma quantidade eficaz de ADAS compreendendo um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula bacteriana ou fúngica. Em outras modalidades particulares, a célula bacteriana ou fúngica na vizinhança da célula animal tem acesso a uma quantidade eficaz de carga secretora de ADAS extracelularmente que contata a célula bacteriana ou fúngica.

[0289] Em certas modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental que é um competidor da célula bacteriana ou fúngica. Em outras modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental que é uma bactéria mutualística da célula bacteriana ou fúngica.

[0290] Como será apreciado, os vários métodos de uso fornecidos pela invenção que modulam o estado de uma célula animal podem ser prontamente adaptados aos métodos correspondentes para modular o estado de uma célula de planta, fúngica ou bacteriana. Para fins ilustrativos, serão citados mais particularmente métodos para modular a célula de uma planta ou célula fúngica.

[0291] Por conseguinte, em um aspecto relacionado, a invenção fornece métodos de modulação de um estado de uma célula de planta ou célula fúngica, fornecendo acesso a uma quantidade eficaz de um ADAS fornecido pela invenção ou composição fornecida pela invenção: a) a célula de planta ou célula fúngica, b) uma célula bacteriana ou fúngica adjacente na vizinhança da célula de planta ou célula fúngica, ou c) uma célula de inseto ou nematoide na vizinhança da célula de planta ou célula fúngica.

[0292] Em certas modalidades, o ADAS é fornecido acesso à célula de planta in planta, por exemplo, em uma planta de cultura, tal como safras em linha, incluindo milho, trigo, soja e arroz, e vegetais, incluindo solanáceas, tal como tomates e pimentões; cucurbitáceas, tal como melões e pepinos; brássicas, tal como repolhos e brócolis; folhas verdes, tal como couve e alface; raízes e tubérculos, tal como batatas e cenouras; grandes vegetais com sementes, tal como feijão e milho; e cogumelos. Em algumas modalidades, a célula de planta ou célula fúngica é exposta a bactérias em uma planta ou fungo saudável. Em outras modalidades, a célula de planta ou célula fúngica é exposta a bactérias em um estado de doença.

[0293] Em certas modalidades, a célula de planta ou fúngica está se dividindo, tal como uma célula de meristema, ou é patogênica, tal como um tumor. Em algumas modalidades, a célula de planta ou célula fúngica é exposta a bactérias em um estado de doença, tal como uma ferida, ou em que a célula de planta ou célula fúngica não faz parte de um alimento para humanos.

[0294] Para certas modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental comensal. Em outras modalidades, o ADAS é derivado de uma planta ou cepa parental patogênica de fungo.

[0295] Em algumas modalidades, o ADAS compreende um T3/4SS ou T6SS e uma carga, e a carga é entregue na célula de planta ou célula fúngica. Em outras modalidades, a célula de planta ou célula fúngica tem acesso a uma quantidade eficaz de um ADAS compreendendo um sistema de secreção bacteriana e uma carga, em que o sistema de secreção bacteriana secreta a carga extracelularmente, contactando assim a célula de planta ou célula fúngica com a carga.

[0296] Em algumas modalidades, o método envolve o fornecimento de uma quantidade eficaz de um ADAS ou de uma composição de acesso à célula bacteriana ou fúngica adjacente na vizinhança da célula de planta ou fúngica. Em modalidades mais particulares, a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é patogênica, opcionalmente em que a aptidão da bactéria adjacente patogênica ou célula fúngica adjacente é reduzida. Em outras modalidades mais particulares, a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é comensal, opcionalmente em que a aptidão da célula bacteriana adjacente comensal ou fúngica adjacente é aumentada. Ainda em modalidades mais particulares, a aptidão é aumentada por meio da redução de uma bactéria ou fungo competidor, que pode ser neutro, comensal ou patogênico.

[0297] Em algumas modalidades, a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é colocada em contato com uma quantidade eficaz de ADAS que compreende um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula bacteriana adjacente ou na célula fúngica adjacente.

[0298] Em outras modalidades, a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente tem acesso a uma quantidade eficaz de ADAS que compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga, em que o sistema de secreção bacteriana secreta a carga extracelularmente, contactando assim a bactéria adjacente ou célula fúngica adjacente com a carga.

[0299] Em algumas modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental que é um competidor da célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente. Em outras modalidades, o ADAS é derivado de uma cepa parental que é uma bactéria mutualística da célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente

[0300] Em certas modalidades, os métodos incluem fornecer uma quantidade eficaz do ADAS ou acesso à composição a um inseto ou célula de nematoide na vizinhança da planta ou fungo. Em modalidades mais particulares, o inseto ou nematoide é patogênico. Em modalidades ainda mais particulares, a aptidão da célula de inseto ou célula nematoide patogênica é reduzida. Em modalidades ainda mais particulares, a aptidão do inseto patogênico ou célula nematoide é reduzida por meio da modulação de simbiotes na célula de inseto ou célula nematoide. Em outras modalidades particulares, o inseto ou nematoide é comensal. Em modalidades mais particulares, a aptidão da célula de inseto ou célula nematoide comensal é aumentada. Em modalidades ainda mais particulares, a aptidão é aumentada por meio da redução de uma bactéria ou fungo competidor, que pode ser neutro, comensal ou patogênico.

[0301] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece métodos de remoção de um ou mais materiais indesejáveis de um ambiente compreendendo o contato do ambiente com uma quantidade eficaz de um ADAS fornecido pela invenção ou composição fornecida pela invenção, em que o ADAS compreende uma ou mais moléculas (tais como proteínas, polímeros, nanopartículas, agentes de ligação ou uma combinação dos mesmos) que absorvem, quelam ou degradam um ou mais materiais indesejáveis. "Ambientes" são definidos como alvos que não são células, tais como o oceano, solo, sítios muito fundos, pele, lagoas, lúmen intestinal e comida em um recipiente.

[0302] Em certas modalidades, o material indesejável inclui um metal pesado, tal como mercúrio, e o ADAS inclui uma ou mais moléculas (tal como proteínas, polímeros, nanopartículas, agentes de ligação ou uma combinação dos mesmos) que se ligam a metais pesados, tal como MerR para mercúrio. Em algumas modalidades, o material indesejável inclui um plástico, tal como PET, e o ADAS inclui uma ou mais enzimas degradantes de plástico, tal como PETase. Em certas modalidades, o material de indesejável compreende uma ou mais pequenas moléculas orgânicas e o ADAS compreende uma ou mais enzimas capazes de metabolizar as referidas uma ou mais pequenas moléculas orgânicas. E. Métodos de entrega de RNA

[0303] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição contendo uma bactéria ou ADAS fornecido pela invenção, em que a bactéria ou ADAS inclui um T4SS, uma carga de proteína de ligação de RNA e uma carga de RNA que é ligada pela proteína de ligação de RNA e é adequada para entrega em uma célula alvo por meio do T4SS. Em certas modalidades, a proteína de ligação a RNA é um Cas9 fundido a VirE2 e VirF, a carga de RNA é um RNA guia e, opcionalmente, o T4SS é o sistema Ti de Agrobacterium. Em outras modalidades, a proteína de ligação a RNA é p19 do Vírus Carnation Italian Ringspot fundido a VirE2 ou VirF, a carga de RNA é um siRNA e, opcionalmente, em que o T4SS é o sistema Ti de Agrobacterium.

[0304] Num aspecto relacionado, a invenção fornece métodos para a preparação destas composições particulares, tais métodos implicam a transfecção de um plasmídeo contendo o Cas9 fundido com VirE2 e VirF e RNA de carga em uma célula de Agrobacterium.

[0305] Em um outro aspecto relacionado, a invenção fornece métodos para entregar RNA a uma célula de planta ou célula animal compreendendo o contato da referida célula de planta ou célula animal com uma bactéria ou ADAS, em que a bactéria ou ADAS compreende um T4SS, uma carga de proteína de ligação de RNA, e uma carga de RNA, em que o RNA é entregue à célula de planta ou célula animal. Em modalidades mais particulares, a carga de proteína de ligação a RNA também é entregue à célula de planta ou célula animal.

EXEMPLOS Tabela de Conteúdos Exemplo 1 Produção de ADAS por manipulação genética Exemplo 2 Purificação de ADAS Exemplo 3 Caracterização de ADAS Exemplo 4 Medindo a atividade de ADAS Exemplo 5 ADAS gerados a partir de ∆minCDE parental são altamente ativos Exemplo 6 ADAS com proteínas exibidas na membrana Exemplo 7 Produção e Entrega de Carga por ADAS

Exemplo 8 Carregamento de ADAS de E. coli com carga de RNA Exemplo 9 Entrega de ADAS de E. coli a Lepidópteros Exemplo 10 Armazenamento de ADAS Exemplo 11 Métodos suplementares para caracterização de ADAS Exemplo 12 Métodos suplementares para produção de ADAS de E. coli Exemplo 13 Métodos suplementares para a purificação de ADAS derivado de E. coli e medição de eficiência Exemplo 14 Preparação de ADAS de E. coli grande Exemplo 15 Métodos suplementares para a produção de cepas bacterianas auxotróficas produtoras de ADAS para aumentar a pureza Exemplo 16 Métodos suplementares para medir a atividade de ADAS Exemplo 17 Métodos suplementares para armazenamento de ADAS derivado de E. coli Exemplo 18 Avaliação da similaridade de grandes ADAS com as bactérias parentais Exemplo 19 Métodos suplementares para demonstrar maior pureza de ADAS auxotrófico Exemplo 20 Métodos suplementares para determinar se ADAS com ATP sintase expressa são altamente ativos Exemplo 21 Ensaios para aumento da atividade em ADAS com supressão de componentes ATP sintase ε Exemplo 22 ADAS altamente ativo com vias de glicólise modificadas Exemplo 23 Ensaios para aumento da atividade em ADAS sintetizado em condições de cultura especializadas Exemplo 24 Ensaios para aumento da atividade em ADAS com flagelos removidos e outras características não essenciais Exemplo 25 Ensaios para aumento da atividade em ADAS com capacidades fotossintéticas Exemplo 26 Métodos suplementares para a criação de ADAS de E. coli com ácido nucleico estável e cargas úteis de proteína Exemplo 27 Aumentar a estabilidade da carga por meio da remoção de ribonucleases de ADAS de E. coli Exemplo 28 Síntese de um ADAS de B. subtilis com um peptídeo sinal Tat Exemplo 29 ADAS imunomodulador para supressão tumoral Exemplo 30 Síntese de ADAS e ADAS altamente ativo de Pseudomonas putida Exemplo 31 ADAS que expressa T6SS como um antimicrobiano e um protetor de planta Exemplo 32 ADAS de Serratia marcescens como modelo antifúngico ADAS Exemplo 33 Entrega de proteínas às células epiteliais do intestino humano através de T3SS sobre-expresso Exemplo 34 Métodos suplementares para entrega direcionada de ADAS de E. coli com sistemas T3SS Exemplo 35 Síntese de ADAS de Xanthomonas citri para entrega de T3SS às plantas Exemplo 36 Síntese de ADAS de Agrobacterium como agente de transformação de plantas usando T4SS Exemplo 37 Medindo a eficiência da secreção de ADAS Exemplo 38 ADAS contendo nanopartículas não em forma de haste (Magnetospirillum magneticum) Exemplo 39 ADAS ambientalmente responsivo Exemplo 40 ADAS eliminador de metais pesados de E. coli e extremófilos Exemplo 41 Captação e metabolismo de lactose por ADAS de E. coli Exemplo 42 ADAS de E. coli expressando PETase para degradação de plástico Exemplo 43 Secreção de RNA via um sistema de secreção T4 Exemplo 1: Produção de ADAS por manipulação genética

[0306] O ADAS pode ser produzido a partir de células bacterianas parentais por vários meios. Neste exemplo, os ADAS são produzidos pela interrupção de um ou mais genes envolvidos na regulação das funções de partição da célula parental, ou seja, interrupção de uma proteína de inibição do anel z (por exemplo, ΔminC ou ΔminD) ou interrupção das proteínas de inibição do anel z e um fator de especificidade topológica de divisão celular (por exemplo, ΔminCDE). Este exemplo detalha os meios genéticos de criação de cepas produtoras de ADAS por meio da interrupção do operon min ou sobre- expressão do componente FtsZ da maquinaria do septo. A. Produção de ADAS via mutações min

[0307] Para interromper o operon min, a metodologia de recombinação Lambda-Vermelho foi adotada de acordo com os protocolos estabelecidos em Datsenko e Wanner, PNAS, 97(12): 6640- 6645, 2000. As cepas para engenharia e contendo os plasmídeos para o sistema Lambda-Vermelho foram adquiridas do Coli Genetic Stock Center (CGSC) da Universidade de Yale. Resumidamente, os iniciadores foram projetados para excluir não polarmente as sequências de codificação de E. coli minC (gerando a cepa bacteriana parental MACH061), minD (gerando a cepa bacteriana parental MACH062) ou todo o operon minCDE (gerando a cepa bacteriana parental MACH060) pela codificação de aproximadamente 40 pares de bases de homologia genômica nas extremidades 5’ dos iniciadores.

As extremidades 3’ desses iniciadores são homólogas aos plasmídeos pKD3 e pKD4 do sistema Lambda-RED, que fornecem marcadores de antibióticos que foram usados para selecionar cepas bacterianas parentais que herdam as mutações alvo.

As sequências de iniciador utilizadas para a deleção são fornecidas na Tabela 1. Após realizar PCR padrão usando os iniciadores com pKD3 como um modelo de DNA, o amplicon purificado foi transformado por eletroporação em bactérias preparadas com pKD46, o plasmídeo contendo o sistema de recombinação homóloga Lambda-Vermelho derivada do fago, de acordo com os métodos de Datsenko e Wanner, PNAS, 97(12): 6640-6645, 2000. Os transformantes foram selecionados em ágar LB com 35 µg/mL de cloranfenicol.

Foi confirmado que estas colônias resultantes têm a disrupção genética (isto é, ΔminC, ΔminD, ou ΔminCDE) usando PCR padrão específico de alelo.

Os genótipos de cepas são fornecidos na Tabela 2. Tabela 1: Iniciadores Nome do Iniciador Descrição Sequência oAF75 KO MinCDE FWD SEQ ID NO: 10 oAF76 KO MinCDE REV SEQ ID NO: 11 oAF77 KO MinC FWD SEQ ID NO: 12 oAF78 KO MinC REV SEQ ID NO: 13 oAF79 KO MinD FWD SEQ ID NO: 14 oAF80 KO MinD REV SEQ ID NO: 15 oAF167 KO SalTy MinCDE FWD SEQ ID NO: 16 oAF168 KO SalTy MinCDE REV SEQ ID NO: 17

Tabela 2: Cepas Nome Descrição Genótipo Alias F-, purE41, glnV42(AS), λ-, Coli Genetic Stock Center serC53, minB-2, his-53, xyl-14, MACH002 χ1488 pGreenTIR (CGSC) da Universidade de metB65, cycA1, hsdR2, tte-1, Yale 14165 cycB2, ilv-277 ∆(araD-araB)567, MACH009 BW25113 ∆lacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, CGSC 7636 ∆(rhaD-rhaB)568, hsdR514 MACH009 MACH060 BW25113 ∆minCDE::CamR Este trabalho ∆minCDE::CamR MACH061 MACH009 ∆minC::CamR BW25113 ∆minC::CamR Este trabalho MACH062 MACH009 ∆minD::CamR BW25113 ∆minD::CamR Este trabalho MACH065 MG1655 F-, λ-, rph-1 CGSC 7740 BW25113 ∆minCDE::CamR MACH124 MACH060 pGFP Este trabalho pGFP MACH151 TOP10 pFtsZ TOP10 pFtsZ Este trabalho MACH178 MACH009 pFtsZ BW25113 pFtsZ Este trabalho BW25113 ∆minCDE::CamR MACH198 MACH060 pSTING Este trabalho pSTING Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus EB101 American Type Culture MACH199 pFtsZ pFtsZ Collection (ATCC) 17802 MACH065 MACH200 MG1655 ∆minCDE::CamR Este trabalho ∆minCDE::CamR SalTy ∆minCDE pHilA- Salmonella typhimurium LT2 MACH269 ATCC 23564 KanR ∆minCDE::CamR pHilA-KanR SalTy ∆minCDE pHilA- Salmonella typhimurium LT2 MACH270 Este trabalho AmpR ∆minCDE::CamR pHilA-AmpR BW25113 ∆minCDE::CamR MACH284 MACH060 pNeae-NB2 Este trabalho pNeae-NB2 F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lisogênio: MACH300 HT115(DE3) CGSC HT115(DE3) promotor lacUV5 - polimerase T7 MACH301 MACH300 pRNAi MACH300 ∆minCDE::CamR Este trabalho BW25113 ∆minCDE::CamR MACH320 MACH060 pT3SS pVirB Este trabalho pT3SS pVirB MACH434 MACH060 pOspB-TEM1 BW25113 ∆minCDE::CamR Este trabalho

Nome Descrição Genótipo Alias pOspB-TEM1 MACH060 pT3SS pVirB BW25113 ∆minCDE::CamR MACH435 Este trabalho pOspB-TEM1 pT3SS pVirB pOspB-TEM1 MACH556 MACH061 pGFP BW25113 ∆minC::CamR pGFP Este trabalho MACH557 MACH062 pGFP BW25113 ∆minD::CamR pGFP Este trabalho B. Produção de ADAS por sobre-expressão de ftsZ

[0308] Para criar ADAS a partir da sobre-expressão da maquinaria do septo, construímos um plasmídeo que dirige a expressão da proteína FtsZ do anel Z de E. coli de tipo selvagem. Em resumo, um forte sítio de ligação ao ribossomo e a sequência de codificação para a proteína FtsZ de E. coli foram otimizados de novo usando ferramentas computacionais do De Novo DNA. Esta unidade de tradução foi solicitada para a síntese de novo de DNA da Integrated DNA Technologies (IDTTM) e clonada em uma estrutura usando técnicas de clonagem padrão. O plasmídeo resultante, pFtsZ (Tabela 3), apresenta um repressor TetR, um promotor TetA que é reprimido pela proteína TetR, um marcador de resistência à canamicina e uma origem de replicação pMB1. Quando transformado em uma bactéria compatível, o pFtsz pode ser induzido a produzir em excesso a proteína FtsZ por meio da adição de anidrotetraciclina à cultura. Essa proteína é então capaz de formar protofilamentos espontâneos, que causam a divisão assimétrica das células bacterianas parentais e, portanto, a produção de ADAS. Tabela 3: Plasmídeos Nome do Descrição Sequência Referência Plasmídeo pFtsZ pMB1 KanR TetR-PtetA-FtsZ SEQ ID NO: 18 Este trabalho pGFP pMB1 KanR TetR-PtetA-sfGFP SEQ ID NO: 19 Este trabalho Miller e Lindow, Gene, pGreen TIR pUC AmpR GFP 191(2): 149-53, 1997. pHilA-CloDF CloDF13 AmpR TetR-PtetA-HilA SEQ ID NO: 20 Este trabalho pHilA-pMB1 pMB1 AmpR TetR-PtetA-HilA SEQ ID NO: 21 Este trabalho pNeae-NB2 CloDF13 KanR TetR-PtetA-Neae-NB2 SEQ ID NO: 22 Este trabalho

Nome do Descrição Sequência Referência Plasmídeo Reeves et. al., ACS Syn Bio, pOspB-TEM1 ColE1 AmpR Plac-OspB-TEM1 4; 644-654, 2015 pMB1 AmpR T7-P. xylostella chy1- pRNAi SEQ ID NO: 23 Este trabalho T7rev pSTING pMB1 AmpR TetR-PtetA-DacA SEQ ID NO: 24 Este trabalho Sistema de secreção tipo 3 minimo Mou et al., PNAS, 115(25), pT3SS RK2 KanR de Shigella flexneri 6452-6457, 2018 Reeves et. al., ACS Syn Bio, pVirB pSC101 SpecR Plac-VirB 4; 644-654, 2015 Exemplo 2: Purificação de ADAS

[0309] Este exemplo descreve métodos de purificação de populações de ADAS de uma cultura de uma cepa bacteriana parental produtora de ADAS. Este método pode ser aplicado para purificar qualquer uma das cepas produtoras de ADAS aqui descritas, incluindo as cepas do Exemplo 1 ou Tabela 3. A purificação separa o ADAS das células bacterianas parentais viáveis, que são maiores e contêm um genoma. Os ADAS foram purificados a partir de culturas de alta densidade celular de cepas produtoras de ADAS por meio de combinações de 1) centrifugação de baixa velocidade, 2) crescimento seletivo e 3) troca/concentração de tampão. Os procedimentos de centrifugação de baixa velocidade foram usados para esgotar seletivamente as células bacterianas parentais viáveis e grandes detritos celulares, enquanto enriquecia o ADAS em uma suspensão mista. Procedimentos de crescimento seletivo foram usados para reduzir o número de células bacterianas parentais viáveis presentes na amostra por meio da adição de compostos que são diretamente antimicrobianos (ou seja, tóxicos para células com um genoma microbiano) e/ou compostos que aumentam a sedimentação de células viáveis por meio de centrifugação de baixa velocidade. Os procedimentos de troca/concentração de tampão foram usados para fazer a transição do ADAS de grandes volumes de meio de cultura bacteriana para volumes menores de 1x PBS, enquanto os aditivos de cultura e resíduos celulares são removidos. A. Purificação de ADAS

[0310] As cepas produtoras de ADAS foram geradas usando os procedimentos de clonagem molecular descritos no Exemplo 1, em seguida, cultivadas em alta densidade celular em meio de cultura. As culturas podem ser aumentadas, por exemplo, de 1 mL a 1000 mL ou mais meio de cultura.

[0311] As culturas foram transferidas para tubos de centrifugação e submetidas a um procedimento de centrifugação de baixa velocidade com o objetivo de peletizar células intactas e resíduos de células grandes, mantendo o ADAS no sobrenadante. Os procedimentos de centrifugação em baixa velocidade foram realizados a 4 ˚C ou à temperatura ambiente. Em alguns casos, o procedimento de centrifugação de baixa velocidade foi uma sequência de rotações sequenciais de 10 minutos a 1.000xg, 2.000xg, 3.000xg e 4.000xg realizada em uma centrífuga de bancada Allegra® X14R (Beckman

TM Coulter) ou uma Eppendorf 5424 R centrífuga de bancada (Fisher Scientific). Em alguns casos, o procedimento de centrifugação de baixa velocidade consistiu em rotações sequenciais de 2.000xg por 20 minutos a 4 °C em que o sobrenadante da primeira rotação foi decantado em uma garrafa de centrífuga esterilizada antes da segunda rotação. Em alguns casos, o procedimento de centrifugação de baixa velocidade foi uma única rotação de 40 minutos a 4.000xg em uma

TM TM centrífuga Sorvall Lynx 6000 Superspeed (Thermo Scientific ) em que a taxa de aceleração do rotor foi definida para a configuração mais baixa possível.

[0312] Após centrifugação a baixa velocidade, os sobrenadantes da cultura foram decantados para tubos de cultura esterilizados e submetidos a um processo de crescimento seletivo. Em alguns casos,

soluções antibióticas concentradas (por exemplo, ceftriaxona, canamicina, carbenicilina, gentamicina e/ou ciprofloxacina) ou outras soluções químicas concentradas (por exemplo, cloreto de sódio, hidróxido de sódio, ácido clorídrico M, glicose, cas-aminoácidos e/ou D- aminoácidos) foram adicionados diretamente aos sobrenadantes da cultura. Em outros casos, os sobrenadantes da cultura foram sedimentados por centrifugação de alta velocidade por 5 a 60 minutos a 10.000xg a 20.000xg e os sedimentos foram ressuspensos em meio de cultura fresco contendo concentrações de antibióticos ou outras soluções químicas que eram inibidoras para células viáveis. O crescimento seletivo foi realizado incubando o ADAS de 4 °C a 42 °C por 1 a 3 horas com agitação a 250 rpm. Os ADAS foram então transferidos para tubos de centrífuga esterilizados e submetidos a uma rodada adicional de centrifugação de baixa velocidade por 15 minutos a 4 ˚C, 4.000xg.

[0313] Após crescimento seletivo e centrifugação de baixa velocidade, os sobrenadantes foram submetidos a procedimentos de troca/concentração de tampão. Em alguns casos, isso foi realizado passando os sobrenadantes sobre um filtro de membrana de polietersulfona assimétrica (aPES) de 0,2 µm (Thermo Fisher) seguido por 1 a 9 volumes de 1x PBS. Em outros casos, os ADAS foram sedimentados por centrifugação a 10.000xg a 20.000xg por 5 a 60 minutos, lavados em 1 a 9 volumes de 1x PBS, sedimentados novamente e ressuspensos em 1x PBS a 1 a 100.000x de concentração do volume de cultura inicial. B. Purificação de ADAS a partir de cepas parentais auxotróficas produtoras de ADAS

[0314] As cepas parentais produtoras de ADAS que são auxotróficas, isto é, são incapazes de sintetizar um composto orgânico necessário para o crescimento, são úteis para a fabricação de ADAS.

Essas cepas são capazes de crescer apenas quando o composto orgânico é fornecido. As cepas parentais auxotróficas podem, assim, ser selecionadas pelo armazenamento ou incubação de uma preparação de ADAS em meio sem o composto orgânico, proporcionando assim um método adicional para reduzir a carga parental na preparação de ADAS. Preparação de bactérias parentais de E. coli auxotróficas

[0315] Uma cepa parental produtora de ADAS auxotrófica foi adquirida e uma segunda cepa foi gerada. MACH002 (Tabela 2) foi adquirida do Coli Genetic Stock Center (CGSC) da Universidade de Yale (cepa CGSC14165). MACH002 é uma cepa auxotrófica dupla de histidina (his-53) e metionina (metB65) com uma interrupção minB que produz ADAS. Para construir a segunda cepa parental auxotrófica produtora de ADAS, o plasmídeo pFtsZ descrito no Exemplo 1 e na Tabela 3 foi transformado na cepa de E. coli auxotrófica de leucina (leu- ) Top10 e selecionada para com Canamicina 50 µg/mL para criar MACH151 (ver Tabela 2 para genótipo completo). Quando a anidrotetraciclina é adicionada ao sobrenadante da cultura, a repressão TetR do promotor TetA é aliviada, a proteína FtsZ é expressa e as bactérias parentais produzem ADAS (Exemplo 1). Os ADAS de E. coli foram produzidos de acordo com os métodos do Exemplo 2, mas com histidina e metionina incluídas no meio para MACH002 ou leucina e anidrotetraciclina no meio para MACH151. Os ADAS foram purificados usando os métodos do Exemplo 2 e, em seguida, armazenados em meio sem histidina e sem metionina para MACH002 ou meio sem leucina para MACH151. ADAS de cepas parentais auxotróficas aumentaram a pureza

[0316] ADAS foram gerados a partir de cepas parentais auxotróficas e não auxotróficas. Foram preparados ADAS MACH060 (não auxotrófico) e MACH002 (auxotrófico para histidina e metionina) e purificados pelo processo descrito no Exemplo 2. Foram preparados ADAS MACH178 (linha não-auxotrófica sobreexpressando FtsZ) e MACH151 (linha auxotrófica para leucina sobreexpressando FtsZ) e purificados pelo processo descrito no Exemplo 2, com uma ligeira modificação com os protocolos de crescimento: foi adicionado anidrotetraciclina às culturas para uma concentração final de 50 ng/mL durante o crescimento para induzir a produção de ADAS devido à expressão de FtsZ. Para medir a pureza das preparações de ADAS, amostras de 1 mL de sobrenadantes foram coletadas após a etapa inicial de centrifugação sequencial de 4000 xg do processo de purificação no Exemplo 2. Estas amostras continham ADAS e quaisquer células bacterianas parentais que não foram removidas por centrifugação sequencial. Alíquotas de 100 µL foram então semeadas em meio não permissivo (M9 + glicose 0,2%) e incubadas a 37 ºC durante a noite. No dia seguinte, a carga parental foi enumerada contando o número de UFC por placa (Figs. 8A e 8B). Enquanto as preparações de ADAS produzidas a partir de MACH060 e MACH178 de tipo selvagem continham uma carga parental significativa, as preparações de ADAS tanto do MACH002 quanto do MACH151 auxotrófica demonstraram níveis indetectáveis de bactérias parentais. Assim, as preparações de ADAS auxotróficas produzidas por dois métodos diferentes, cada uma tem pureza mais alta do que as preparações de ADAS de ADAS não auxotróficas. Em algumas modalidades não exaustivas, MACH002 mostra pelo menos 106 menos carga parental do que MACH060; MACH151 mostra, pelo menos, 10 4 menos carga parental do que MACH178. Exemplo 3: Caracterização de ADAS

[0317] Este exemplo descreve métodos de caracterização de populações purificadas de ADAS e/ou culturas de bactérias produtoras de ADAS não purificadas usando uma variedade de abordagens,

incluindo microscopia eletrônica, microscopia de luz e imunofluorescência, caracterização de nanopartículas, revestimento de células viáveis, imunotransferência e citometria de fluxo. Microscopia eletrônica de varredura (SEM)

[0318] SEM foi usada para visualizar o processo de septação e confirmar a existência de uma população de ADAS em várias cepas bacterianas de interesse. Para preparar as amostras de SEM, lamínulas de vidro foram colocadas em uma placa de 24 poços e revestidas com 0,01% de poli-lisina e secas. Em seguida, as cepas de interesse foram geradas usando os procedimentos de clonagem molecular descritos no Exemplo 1, cultivadas em alta densidade celular e, em alguns casos, submetidas aos procedimentos de purificação de ADAS descritos no Exemplo 2. As cepas ou ADAS de interesse purificado foram suspensos em PBS e transferidos para a placa de 24 poços com lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e deixadas em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. A solução foi cuidadosamente aspirada e substituída por fixador SEM (formaldeído-glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (sod cac). No dia seguinte, o fixador foi removido, as amostras foram lavadas com água e as lamínulas foram removidas da placa de 24 poços e secas usando a secagem de ponto crítico. Após a secagem, as lamínulas foram montadas em fita de carbono em montagens Hitachi SEM, pulverização catódica revestida com um filme de 10 nm de platina e fotografadas usando um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo Hitachi S- 4700 (FE-SEM). A Figura 1A mostra imagens representativas de MACH009 (de tipo selvagem de E. coli), MACH060 (E. coli com uma deleção minCDE para permitir a produção ADAS), e purificado a partir de ADAS MACH060 (ver Tabela 2). A cepa MACH009 de E. coli de tipo selvagem exibe o fenótipo normal de E. coli, em que todas as células- filhas têm o mesmo tamanho (Figura 1A, painel esquerdo). A cepa

MACH060 não purificada mostra uma população com polidispersidade aumentada em tamanho e presença de partículas ADAS, que são menores e esféricas (Figura 1A, painel central). A MACH060 purifica mostra apenas a população ADAS (Figura 1A, painel direito). Usando SEM como descrito acima, ADAS produzido a partir de espécies bacterianas nos gêneros Vibrio e Salmonella usando diferentes técnicas de produção de ADAS (sobre-expressão de ftsZ e deleção de minCDE, respetivamente) também podem ser visualizados em populações não purificadas (dados não mostrados). Além disso, em imagens não purificadas, eventos de septação aberrante são proeminentes; septação aberrante é o evento que precede a produção de ADAS. Microscopia de luz e imunofluorescência

[0319] A cepa MACH060 de E. coli foi gerada usando os procedimentos de clonagem molecular descritos no Exemplo 1, depois cultivada em alta densidade celular durante a noite. Separadamente, placas de 35 mm com fundo de lamínula de vidro da ibidi® foram revestidas com uma solução de poli-lisina 0,01% por 5 min; a solução foi aspirada e os pratos foram deixados secar. Uma suspensão densa de MACH060 foi colocada no fundo da lamínula em gotas de 1 µL e deixada quase secar. Em seguida, foi adicionado 1 mL de paraformaldeído a 2,8%/fixador de glutaraldeído a 0,04% por 30 min. As amostras foram lavadas 3x em PBS, permeabilizadas com 0,1% de

TM Triton X-100 (Sigma-Aldrich), lavadas 2x com PBS, adicionalmente permeabilizadas com 10 μg/mL de lisozima, lavadas 2x com PBS, bloqueadas com soro de burro a 1%, lavadas 2x com PBS, coradas com anticorpo primário (anti-E. coli LPS), lavadas e coradas com um anticorpo secundário ligado a Alexa Fluor® 555 (Thermo Fisher). As placas foram contra-coradas com DAPI por 10 min e lavadas 3x com PBS. Os pratos finais foram fotografados usando uma lente objetiva de imersão em óleo 100X em um microscópio invertido Olympus IX83

(Olympus). As imagens foram renderizadas usando o pacote de software disponível publicamente Fiji. A Figura 1B mostra imagens representativas de microscopia de fase (painel esquerdo) e fluorescência (painéis central e direito) em 100X, mostrando que, dentro da população parental, há ADAS que têm a coloração de membrana LPS, mas falta um genoma (sem coloração DAPI positiva). Caracterização de nanopartículas

[0320] Uma cepa produtora de ADAS de E. coli BW25113, MACH124, foi gerada usando os procedimentos de clonagem molecular descritos no Exemplo 1, depois cultivada até alta densidade celular em 1 L de meio de cultura e submetida aos procedimentos de purificação de ADAS descritos no Exemplo 2. A população purificada de ADAS foi suspensa em 1x PBS, diluída a uma concentração entre 107 e 109 partículas por mL, e TWEEN® 20 (Sigma Aldrich) foi adicionado a uma concentração final de 0,1% (v/v) para minimizar a agregação de partícula. Esta suspensão de ADAS foi diluída 20 vezes e carregada em um cartucho TS2000 (Technology® Supplies Ltd.) e analisada em um Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1 TM. O nCS1TM mede o tamanho e a concentração de partículas individuais em uma suspensão aplicando uma tensão de polarização através de uma constrição de tamanho definido e monitorando as mudanças na resistência elétrica em função do tempo (Fraikin et al., Nature Nanotechnology, 6(5): 308-313, 2011). Foram medidas 24.392 partículas no intervalo de 200 a 2.000 nm. Em outros exemplos, o número de partículas medido está entre 10-100.000 partículas. Os dados resultantes foram representados graficamente como uma distribuição de tamanho cumulativa (Figura 1C), que revela a concentração de partículas entre 200 e 2.000 nm de diâmetro na suspensão de ADAS purificado da MACH124. A concentração mais elevada de ADAS purificado a partir de MACH124 encontra-se no intervalo de tamanho de 400 a 800 nm. Além disso, os dados foram exportados como um relatório de intervalo de integração, que enumera o volume agregado de 200 a 2.000 nm de partículas na suspensão de ADAS purificado (Figura 1D). Coletivamente, estes dados demonstram que a concentração e a distribuição de tamanho de ADAS purificado podem ser quantificados por meio de métodos de caracterização de nanopartículas. Além disso, a quantificação de pequenas moléculas (por exemplo, ATP - Exemplos 4 e 5), ácidos nucleicos ou proteínas (por exemplo, GFP - Exemplos 4 e 5) observada dentro de uma população purificada de ADAS pode ser dividida pelo volume agregado de ADAS ou o número de partículas presentes no ensaio, permitindo o cálculo da concentração média de pequenas moléculas, ácidos nucleicos ou proteínas de interesse em uma população purificada de ADAS. Plaqueamento de células viáveis

[0321] Para determinar a concentração de células bacterianas parentais viáveis presentes antes e após a purificação, a cultura produtora de ADAS e a população de ADAS purificada descrita no Exemplo 3C foram testadas via plaqueamento de células viáveis. As diluições em série foram preparadas transferindo repetidamente 100 µL da cultura produtora de ADAS ou da população purificada de ADAS em 900 µL de 1x PBS. Em seguida, 10 µL de cada diluição foram colocados em meio seletivo e incubados a 37 ˚C para permitir o crescimento de células viáveis. Após 24 horas, diluições contendo 1-100 colônias foram contadas, e essa contagem de colônias foi multiplicada pelo fator de diluição apropriado para enumerar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mL de amostra (ou seja, a concentração de células viáveis presentes em cada amostra) (Figura 1E). A cultura MACH124 tinha >108 UFC/mL, consistente com uma cultura de alta densidade de Escherichia coli; no entanto, o número de células viáveis presentes na população de ADAS purificado foi inferior a 100 UFC/mL,

o limite de deteçcão para este ensaio. Assim, a concentração de células viáveis presentes em uma amostra pode ser enumerada via plaqueamento de células viáveis, e os procedimentos de purificação de ADAS descritos no Exemplo 2 são suficientes para reduzir o número de células viáveis presentes em ADAS purificado pelo menos abaixo de 100 UFC/mL em algumas modalidades. Imunotransferência

[0322] Para avaliar a capacidade de medir a composição da proteína ADAS, caracterizamos a presença no ADAS de duas proteínas de manutenção, DnaK e GroEL, que são conhecidas por estarem presentes nas células bacterianas de E. coli. As cepas produtoras de ADAS de Escherichia coli BW25113 (MACH060) e MG1655 (MACH200) foram geradas usando os procedimentos de clonagem molecular descritos no Exemplo 1, depois cultivadas em alta densidade celular em 100 mL de meio de cultura e submetidas aos procedimentos de purificação de ADAS descritos no Exemplo 2. Em paralelo, alíquotas de 5mL das culturas produtoras de ADAS foram sedimentadas a 20.000xg e ressuspensas em 5mL de 1x PBS, depois diluídas 100 vezes em 1x PBS. Tampão Amostra LDS 4x NuPAGETM (Thermo Fisher) foi adicionado a alíquotas de 100 µL das culturas diluídas e ao ADAS purificado de modo a lisar as amostras. Os vários lisados foram incubados a 85 ˚C por 2 minutos, em seguida, 40 µL de cada amostra foram resolvidos em um gel de SDS-poliacrilamida. Um controle positivo, compreendendo 10 ng de proteína E. coli GroEL recombinante purificada (Abcam, ab51307) ou proteína DnaK recombinante (Abcam, ab51121), também foi desnaturado em tampão de amostra LDS 1x a 85°C por 2 minutos e resolvido no gel. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose que foi bloqueada por 1 hora à temperatura ambiente em Tampão de Bloqueio Intercept® (PBS) (LI- COR®) e incubadas com uma diluição 1:1.000 de um anticorpo direcionado a GroEL (Abcam, ab90522) ou DnaK (Abcam, ab69617) à temperatura ambiente durante a noite. As manchas foram então lavadas em volumes excessivos de PBS + 0,05% TWEEN® 20, incubadas com anticorpos anti-camundongo (LI-COR®, 926-68070) e anticorpos anti- coelho (LI-COR®, 926-32211) conjugados com corantes fluorescentes por 1 hora à temperatura ambiente, lavadas novamente em volumes excessivos de PBS + 0,05% TWEEN® 20 e fotografadas em um InvitrogenTM iBrightTM Imager (Thermo Fisher). Bandas específicas correspondentes a GroEL e DnaK estavam presentes nas linhas contendo lisados de culturas produtoras de ADAS e nas linhas contendo lisados de ADAS purificado (Figura 1F); assim, o conteúdo de proteína de ADAS pode ser detectado por meio de imunotransferência. Exemplo 4: Medindo a atividade de ADAS

[0323] Testamos a capacidade do ADAS de realizar trabalho celular e nossa capacidade de medir esse trabalho. Medimos a capacidade de trabalho examinando o nível de adenosina trifosfase (ATP) no ADAS e avaliando a capacidade do ADAS de transcrever e traduzir uma proteína alvo. A capacidade de uma célula de realizar trabalho está diretamente relacionada ao seu nível de ATP. O ATP é o principal transportador de energia de organismos procarióticos e eucarióticos, transportando energia química dentro das ligações entre seus três grupos de fosfato, que é liberada quando eles são quebrados. O ATP é necessário para processos celulares essenciais, como transcrição, tradução, transporte e metabolismo. A. Medição de ATP

[0324] ADAS derivado de bactérias parentais MACH060 (BW25113 ∆minCDE; Tabela 2) foram purificados como descrito no Exemplo 2 usando crescimento seletivo de um sobrenadante de cultura concentrado. Os ADAS purificados foram submetidos a caracterização de nanopartículas e procedimentos de plaqueamento de células viáveis,

conforme descrito no Exemplo 3. A concentração de ADAS na preparação de ADAS purificado foi de 5x108 ADAS/mL, e o volume total de partículas presentes foi de 3,2x1016 nm3/mL. O plaqueamento de UFC revelou que a concentração de células viáveis (por exemplo, células parentais) presentes na população purificada de ADAS estava em ou abaixo do limite de detecção (100 UFC/mL).

[0325] A concentração de ATP presente na população purificada de ADAS foi medida em triplicado usando o Ensaio de Viabilidade Celular Microbial BacTiter-GloTM (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 100 µL de tampão de ensaio reidratado foi adicionado aos poços contendo 100 µL de ADAS purificado ou uma massa definida de ATP, que serviu como um padrão molecular. O sinal de luminescência de cada poço foi registrado em um leitor de placas. O sinal de luminescência transformado em log para as massas definidas de ATP foram traçadas contra as massas transformadas em log de ATP, e uma linha foi ajustada a esses dados para gerar uma curva padrão. Posteriormente, o sinal de luminescência observado em poços contendo ADAS purificado foi ajustado a esta curva padrão para calcular uma massa de ATP presente no poço (Figura 2A). Os níveis de ATP gerados por contaminantes de células viáveis estavam abaixo do limite de detecção para o ensaio e foram subtraídos do total de ADAS como base. A massa de ATP presente em cada poço de ADAS purificado foi dividida pelo volume de partículas agregadas de ADAS presente no poço: esta razão representa a concentração de ATP presente em uma população de ADAS purificado para <100 UFC/mL. B. Geração de ATP

[0326] Para determinar a capacidade do ADAS de gerar ATP na ausência de um genoma, a concentração de ATP do ADAS purificado foi medida ao longo do tempo. ADAS derivados de MACH124 (BW25113 ∆minCDE; Tabela 2) foram purificados como indicado no

Exemplo 2 usando crescimento seletivo de um sobrenadante de cultura concentrado. ADAS purificados foram suplementados com meios ricos em nutrientes (10% caldo de Luria), juntamente com 50 μg/mL de antibiótico carbenicilina. ADAS foram divididos em duas alíquotas e testados em paralelo; uma alíquota foi imediatamente armazenada a 4°C, e a outra alíquota foi incubada em um Eppendorf ThermoMixer® a 37 ˚C, 800rpm por duas horas. Após a incubação de duas horas, as concentrações de ATP de ambas as alíquotas foram medidas como descrito acima. A incubação por duas horas resultou em um aumento de 54,9% na quantidade de ATP, indicando que o ADAS pode gerar ATP na ausência de um genoma (Figura 2B). C. Transcrição e tradução de uma proteína alvo: GFP

[0327] Para medir a capacidade do ADAS de transcrever e traduzir um gene alvo, MACH060 (BW25113 ∆minCDE (Tabela 2)) foi transformada com pGFP, um plasmídeo que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). Esta sequência foi otimizada por códons para expressão em E. coli e clonada em um plasmídeo contendo o promotor TetA, o repressor TetR (que reprime o promotor TetA), uma origem de replicação pMB1 e um gene de resistência à canamicina para seleção de antibióticos. Os ADAS foram então derivados desta cepa (MACH124) e purificados como indicado no Exemplo 2, usando crescimento seletivo de um sobrenadante de cultura concentrado. A carga parental foi determinada como estando no limite de detecção pelo plaqueamento de UFC (<100 UFC/mL). Para examinar a expressão da proteína em ADAS, dois métodos foram aplicados: (1) medição da fluorescência de GFP ao longo do tempo usando um leitor de placas e (2) imunotransferência. (1) Método de leitor de placa

[0328] ADAS purificado ou bactérias parentais foram incubados em meio de crescimento mínimo (meio de sais mínimos (M9) com 0,2% de casaminoácidos, 0,2% de glicose e ceftriaxona a 100 µg/mL). As amostras de ADAS purificado foram suplementadas com um antibiótico para prevenir o crescimento de qualquer bactéria parental contendo o genoma. Além disso, para as amostras induzidas, o indutor, anidrotetraciclina, foi adicionado ao meio para uma concentração final de 100 ng/mL. Após a adição de anidrotetraciclina, a repressão TetR do promotor TetA foi aliviada e a proteína GFP foi expressa. A detecção do sinal GFP foi medida usando comprimentos de onda de 479 nm e 520 nm para emissão e excitação, respetivamente. As Figs. 2C-2E demonstram um aumento dependente do indutor na transcrição e tradução de GFP, conforme medido por fluorescência de GFP, em MACH124 ADAS ao longo de 12 horas. Na ausência do indutor (não induzido) não houve aumento no sinal de GFP. Esta descoberta mostra que ∆minCDE ADAS são capazes de transcrever e traduzir um gene alvo de uma maneira dependente do indutor. Além disso, a Figura 2C mostra que o sinal de GFP gerado por ADAS purificado não é devido à contaminação parental, já que o sinal de GFP de 100 UFC/mL da bactéria parental foi significativamente menor do que o do ADAS e não aumentou ao longo do tempo. (2) Método de imunotransferência

[0329] ADAS purificado de MACH124 e um volume igual de caldo de Luria suplementado com carbenicilina a 100 μg/mL e indutor anidrotetraciclina (1000 ng/mL) foram divididos em alíquotas para tubos de centrífuga esterilizados. As amostras foram incubadas em Eppendorf ThermoMixer® a 37 ˚C, 800 rpm por 24 horas. Após 24 horas, os ADAS foram centrifugados a 20000xg durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o ADAS peletizado foi ressuspenso em tampão de lise (1x Reagente de Extração de Porteínas BugBusterTM (MilliporeSigmaTM) com Tampão Amostra LDS NuPAGETM (Thermo Fisher)) e aquecido a 85 °C por 2 minutos. Um volume igual de ADAS lisado foi então carregado em um gel de poliacrilamida BisTris 4-12%. As proteínas do gel foram resolvidas, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas em Tampão de Bloqueio Intercept® (PBS) (LI-COR®) por 60 minutos à temperatura ambiente. A membrana foi então incubada com anticorpo primário (anti-GroEL de camundongo (Abcam, ab90522) em uma diluição de 1:500 e anti-GFP de coelho (Abcam, ab6556) em uma diluição de 1:500) por 60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos foram ressuspensos em Tampão de Bloqueio Intercept® PBS suplementado com 0,2% de TWEEN® 20. A membrana foi subsequentemente lavada três vezes em 1x PBS + 0,05% TWEEN® 20, seguido por incubação em Tampão de Bloqueio Intercept® PBS com 0,2% TWEEN® 20 suplementado com anticorpos secundários relevantes (anti-Camundongo de Cabra 800 (Abcam, ab216772) e anti-Coelho de Cabra 680 (Abcam, ab175773) ambos a uma diluição de 1:5000). A membrana foi lavada três vezes em 1x PBS + 0,05% TWEEN® 20 e fotografada em um InvitrogenTM iBrightTM Imager (Thermo Fisher). A intensidade da banda foi quantificada por meio de densitometria e a intensidade de GFP foi expressa normalizada em relação ao controle de carregamento, GroEL. A Figura 2 F demonstra um aumento dependente do tempo na quantidade de proteína GFP detectada no ADAS induzido. Exemplo 5: ADAS gerados a partir de ∆minCDE parental são altamente ativos

[0330] ADAS purificados a partir de células parentais compreendendo as mutações ∆minC, ∆minD, ou ∆minCDE foram testados através de leitor de placas e imunotransferência para comparar suas habilidades para transcrever e traduzir um gene repórter GFP. Inesperadamente, ADAS derivado de células parentais ΔminCDE foram encontrados ter uma maior atividade do que ADAS derivado de células parentais ∆minC ou ∆minD.

A. Purificação da ADAS de culturas ∆minCDE, ∆minC, ou ∆minD

[0331] As cepas produtoras de ADAS MACH124 (BW25113 ∆minCDE + pGFP), MACH556 (BW25113 ∆minC + pGFP), e MACH557 (BW25113 ∆minD + pGFP) (ver Tabela 2) foram cultivadas a alta densidade celular em 1 L de meio de cultura e submetidas aos procedimentos de purificação de ADAS descritos no Exemplo 2. O plasmídeo pGFP transportado por todas as 3 dessas cepas é descrito em mais detalhes na Tabela 3. Os ADAS purificados foram submetidos à caracterização de nanopartículas e procedimentos de plaqueamento de células viáveis descritos no Exemplo 3. A concentração de ADAS era: MACH124 = 2,4x109 ADAS/mL, MACH556 = 1,86x109 ADAS/mL, e MACH557 = 1,98x109 ADAS/mL. A carga de células bacterianas parentais viáveis presente no ADAS purificado foi considerada inferior ao limite de detecção por plaqueamento de UFC (<100 UFC/mL). B. Cinética de expressão de GFP testada através de leitor de placa

[0332] A capacidade do ADAS para expressar GFP de uma maneira dependente do indutor foi avaliada como descrito no Exemplo 4C. As Figs. 3A e 3B mostram um aumento dependente de indutor na transcrição e tradução de GFP em ADAS de MACH124, MACH556 e MACH557 que persistiu por mais de 12 horas. Na ausência do indutor (não induzido), o ADAS não produziu GFP. Os dados nas Figs. 3A e 3B são normalizados conforme descrito no Exemplo 4C. Enquanto ADAS derivado de todas as três cepas de deleção de locus min foram capazes de expressar GFP após indução, ADAS derivado de MACH124 (BW25113 ∆minCDE) produziu um sinal de GFP mais alto ao longo do tempo. Às 12 horas, o sinal do MACH124 ADAS GFP era ~ 119% maior do que o do MACH557 ADAS e ~ 186% maior do que o do MACH556 ADAS. Os ADAS gerados a partir de parentais ∆minCDE expressam, assim, níveis mais elevados de GFP na indução do que aqueles gerados a partir de parentais ∆minC, ou ∆minD

[0333] As curvas de produção de GFP em bruto observadas para MACH124, MACH556 e MACH557 foram usadas para comparar a produção total de proteína e a taxa média de produção de proteína para ADAS purificado de cada cepa e incubado na presença de indutor. Uma linha de regressão foi ajustada para cada conjunto de dados, e a área sob a curva, que reflete a produção total de GFP ao longo de 12 horas, foi calculada usando GraphPad Prism. MACH124 ADAS produziu significativamente mais GFP do que MACH556 ou MACH557 ADAS (Figura 3D). Para avaliar a taxa média de produção de GFP ao longo da experiência, a área sob cada curva foi dividida pela duração da experiência. A taxa média de produção de GFP ao longo de 12 horas foi significativamente maior para MACH124 ADAS do que MACH556 ou MACH557 ADAS (Figura 3E). Finalmente, a quantidade total de GFP produzida por MACH556 e MACH 557 ADAS foi expressa como uma percentagem da GFP produzida por MACH124 ADAS, que foi normalizada para 100%. Esses dados são plotados na (Figura 3F). ADAS de MACH124 (∆minCDE) produziu uma maior quantidade total de GFP do que de MACH556 (∆minC) e MACH557 (∆minD). C. Expressão de GFP testada por imunotransferência

[0334] Os ADAS de MACH124, MACH556 e MACH557 foram incubados em meio de cultura 50% LB com 50 µg/mL de carbeniclina e na presença ou ausência de anidrotetraciclina (1µg/mL) em um Eppendorf ThermoMixer® a 37 ˚C, 800rpm por 24 horas. A imunotransferência foi realizada conforme descrito no Exemplo 3. Após 24 horas, os ADAS foram centrifugados a 20000xg durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o ADAS peletizado foi ressuspenso em tampão de lise (1x Reagente de Extração de Porteínas BugBusterTM (MilliporeSigmaTM) com Tampão Amostra LDS NuPAGETM (Thermo Fisher)) e aquecido a 85 °C por 2 minutos. Um volume igual de ADAS lisado foi então carregado em um gel de poliacrilamida BisTris 4-

12%. As proteínas do gel foram resolvidas, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas em Tampão de Bloqueio Intercept® PBS por 60 minutos à temperatura ambiente. A membrana foi incubada com anticorpo primário (anti-GroEL de camundongo em uma diluição de 1:500 e anti-GFP de coelho em uma diluição de 1:500) por 60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos foram ressuspensos em Tampão de Bloqueio Intercept® PBS suplementado com 0,2% de TWEEN® 20. A membrana foi subsequentemente lavada três vezes em 1x PBS + 0,05% TWEEN® 20, seguido por incubação em tampão de bloqueio PBS Intercept + TWEEN® 20 suplementado com anticorpos secundários relevantes (anti-Camundongo de Cabra 800 e anti-Coelho de Cabra 680 ambos a uma diluição de 1:5.000). A membrana foi lavada três vezes em 1x PBS + 0,05% TWEEN® 20 e fotografada em um InvitrogenTM iBrightTM Imager (Thermo Fisher) (Figura 3C). A intensidade da banda foi quantificada por meio de densitometria (Figura 3C, painel central) e a intensidade de GFP foi expressa normalizada em relação ao controle de carregamento, GroEL (Figura 3C, painel inferior). MACH124 ADAS demonstrou produção aumentada de GFP em comparação com ADAS de MACH556 e MACH557, indicando que MACH124 (∆minCDE) mostra maior atividade em termos de produção de proteína. Exemplo 6: ADAS com proteínas exibidas na membrana

[0335] Este exemplo demonstra a exibição da membrana de nanocorpos como um agente de direcionamento modelo para ADAS. Os nanocorpos são os menores fragmentos de anticorpos funcionais conhecidos e trabalhos recentes mostraram que eles podem ser expressos na superfície das células de E. coli (Salema e Fernandez, Microb Biotechnol, 10(6), 2017). Os nanocorpos de superfície podem se ligar com eficiência às proteínas alvo e podem ser usados para aumentar a afinidade de ligação específica da célula. Este exemplo demonstra que os agentes de direcionamento (neste caso, nanocorpos) podem ser expressos na superfície do ADAS. A. Produção de cepas de E. coli contendo um nanocorpo direcionado a HER2

[0336] Para construir ADAS capaz de direcionar o receptor HER2 (associado ao câncer de mama), os plasmídeos (pNeae-NB2) (Tabela 3) foram sintetizados com sequências de nanocorpo fundidas ao gene da intimina de EHEC O157:cepa H7 EDL933stx-. Especificamente, 583 aminoácidos da porção N-terminal do gene da intimina (Neae) foram fundidos a um E-cauda(SEQ ID NO: 5), um ligante glicina-glicina-serina, a sequência de nanocorpo NB2 (SEQ ID NO: 6), um ligante serina- glicina e uma cauda FLAG C-terminal (SEQ ID NO: 7). Esta sequência foi otimizada por códons para expressão em E. coli e clonada em um plasmídeo contendo o promotor TetA, o repressor TetR (que reprime o promotor TetA), uma origem de replicação CloDF13 e um gene de resistência à canamicina para seleção de antibióticos para criar pNeae- NB2 (ver Tabela 3). Quando a anidrotetraciclina foi adicionada ao sobrenadante da cultura, a repressão TetR do promotor TetA foi aliviada e a proteína de fusão Neae-NB2 foi expressa. A proteína de fusão Neae- NB2 monta-se na membrana externa da célula bacteriana parental de E. coli que carrega o plasmídeo, com o nanocorpo NB2 exibido para fora. O plasmídeo pNeae-NB2 foi transformado em uma cepa de E. coli BW25113 carregando uma deleção do locus minCDE com uma cassete de resistência ao cloranfenicol e selecionado com adição de 50 µg/mL de Kanamicina e 35 µg/mL de cloranfenicol no meio de crescimento para criar MACH284 (ver Tabela 2). B. Produção de ADAS com expressão de nanocorpo HER2

[0337] ADAS de MACH060 (não modificado, ADAS de controle negativo) e MACH284 com anticorpos de direcionamento em sua superfície foram preparados e purificados pelo processo descrito no

Exemplo 2, com uma ligeira modificação no meio de crescimento. Aqui, a anidrotetraciclina foi adicionada à cultura para uma concentração final de 50 ng/mL durante o crescimento de modo que, como os ADAS foram produzidos a partir dos parentais, eles expressaram a proteína de fusão Neae-NB2 direcionada do plasmídeo. C. Confirmação da exibição do nanocorpo HER2 na superfície ADAS

[0338] Para confirmar a expressão de Neae-NB2 na superfície do ADAS, realizamos marcação imunofluorescente. ADAS de MACH060 e MACH284 foram diluídos para uma concentração de ~5x108 partículas/mL em PBS conforme determinado por análise usando um

TM Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1 . Um anticorpo direcionado à característica E-cauda na fusão Neae-NB2 (Abcam, ab3397) foi adicionado às amostras para uma concentração final de 5 µg/mL em 1 mL das amostras. Essas amostras foram misturadas suavemente e deixadas para incubar por 2,5 horas em gelo. Após a incubação, os ADAS foram recolhidos por centrifugação a 15,000xg durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi suavemente ressuspenso em 800 µL de PBS + 0,05% v/v TWEEN® 20. Esta lavagem foi repetida duas vezes e o sedimento final foi ressuspenso em 0,5 mL de PBS + 0,05% de TWEEN® 20. 2,5 µL de anti-Coelho Donkey conjugado com fluoróforo DyLight ® 550 (Abcam, ab98489) foram adicionados à amostra, misturados suavemente e incubados em gelo por 1 hora. Após esta incubação, os ADAS foram recolhidos por centrifugação a 15,000xg durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 500 µL de PBS + 0,05% de TWEEN® 20. Esta lavagem foi repetida três vezes no total e o sedimento final foi ressuspenso em 250 µL do tampão. 200 µL da amostra foram removidos para uma placa de polipropileno de 96 poços de fundo transparente e de paredes pretas. Esta placa foi então lida para densidade ótica a 600 nm e fluorescência DyLight ® 550

(excitação: 487 nm, emissão: 528 nm) usando uma varredura de área do poço. A Figura 4 mostra os resultados da experiência de marcação usando fluorescência DyLight ® 550 normalizada para densidade ótica. Enquanto o ADAS de MACH060 de tipo selvagem mostrou fluorescência insignificante, o ADAS de MACH284 exibindo nanocorpo Neae-NB2 mostrou um aumento estatisticamente significativo, de quase 10 vezes na fluorescência. Assim, o nanocorpo de direcionamento foi efetivamente expresso e exibido na membrana externa do ADAS. Exemplo 7: Produção e Entrega de Carga por ADAS

[0339] Este exemplo demonstra que os ADAS da invenção são capazes de produzir e entregar uma carga que tem um efeito específico em uma célula ou organismo alvo. Como modelo, criamos ADAS de E. coli que geram dinucleotídeos cíclicos específicos (CDNs). Em particular, os ADAS foram induzidos a produzir nucleotídeos bacterianos c-di-AMP que envolvem a via do Estimulador de Genes de Interferon (STING) através do RECON (REdutase CONtrolling NF- κB) de células de mamíferos (Witte et al., Mol Cell, 30(2): 167-178, 2008), por meio da expressão de uma enzima heteróloga. Este exemplo demonstra ainda que um ADAS pode expressar uma enzima que catalisa a produção de uma carga, cuja carga pode então ser entregue a uma célula alvo. A. Construção do ADAS de E. coli agonista STING

[0340] Para criar ADAS capaz de ativar a via STING, uma diadenilato ciclase foi expressa em uma cepa BW25113 E. coli ∆minCDE::CamR (MACH060), conforme preparado no Exemplo 1. Para fazer isso, a sequência de aminoácidos da proteína diadenilato ciclase A (DACA) de Listeria monocytogenes (número de acesso: Q8Y5E4) foi optimizada para códon para a expressão em E. coli, sintetizada de novo por Integrated DNA Technologies, e clonada num plasmídeo contendo o promotor TetA (pTet), o repressor TetR (que reprime o promotor TetA),

uma origem de replicação pMB1 e um gene de beta-lactamase para seleção de antibiótico, produzindo o plasmídeo pSTING (Tabela 3). Este plasmídeo foi transformado em MACH060 (BW25113 E. coli ∆minCDE::CamR) e selecionado para usar 100 µg/mL de carbenicilina e 35 µg/mL de Cloranfenicol no meio de crescimento para produzir a cepa MACH198 (Tabela 2). Quando induzido com anidrotetraciclina adicionada ao meio de crescimento, o MACH198 produziu DacA, que catalisa a condensação de duas moléculas de ATP no potente ativador STING cíclico-di-AMP. B. Purificação de ADAS de MACH060 e MACH198

[0341] Para os ensaios de ativação STING, MACH060 e MACH198 foram preparados usando os métodos descritos no Exemplo 2 com pequenas modificações. Resumidamente, duas culturas de MACH198 foram usadas: uma cultivada normalmente (não induzida) e uma com 200 ng/mL de anidrotetraciclina adicionada (induzida). Os ADAS foram concentrados e recolhidos utilizando um filtro de topo de garrafa de 0,2 µm e ressuspensos em meio de crescimento THP1-DualTM(Invivogen) para uma concentração final de cerca de 109 partículas/mL. A carga residual de origem, conforme avaliada pelo método de plaqueamento de UFC delineado no Exemplo 2, mostrou menos de 200 UFC/mL de células bacterianas parentais. C. Avaliação da função usando ensaios de células de mamíferos

[0342] A linha celular de monócitos THP1-DualTM (Invivogen) foi usada para avaliar a ativação da via STING usando uma leitura de luminescência. As células THP1-DualTM apresentam o gene Lucia, um gene repórter de luciferase secretado, sob o controle de um promotor mínimo ISG54 em conjunto com cinco elementos de resposta estimulados por IFN. Quando os elementos de resposta estimulados por IFN são ativados, por exemplo, por exposição a c-di-AMP (por exemplo, por fagocitose de ADAS compreendendo c-di-AMP (por exemplo,

MACH198 ADAS)), o promotor mínimo ISG54 é ativado e a luciferase é transcrita, traduzida e secretada de luciferase para o meio celular. Para quantificar a luciferase, o substrato QUANTI-LucTM (InvivoGen) é adicionado ao meio celular. QUANTI-LucTM contém o substrato de luciferase coelenterazina, que produz um sinal de luz quando hidrolisado pela luciferase que pode ser quantificado usando um leitor de placas.

[0343] Para avaliar se ADAS ativa a via STING em células THP1- DualTM, as células THP1-DualTM foram cultivadas segundo as especificações de InvivoGen's e foram semeadas numa placa de 96 poços a uma concentração de 5x105 células/mL a 125 µL por poço. ADAS de MACH060, MACH198 não induzido e MACH198 induzido (Tabela 2) foram adicionados ~4x107 ADAS/mL a um volume de 100 µL por poço. Após incubação a 37 °C durante 42 horas, a placa foi centrifugada a 300xg durante 5 minutos. Finalmente, 20 µL de meio foram removidos de cada poço e colocados em uma placa de parede branca contendo 50 µL por poço de QUANTI-LucTM. A luminescência foi imediatamente lida com um leitor de placas. A Figura 5A mostra a luminescência média de amostras de cada condição experimental normalizada para o volume de ADAS adicionado, conforme determinado usando um Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1TM, conforme descrito no Exemplo 1. Cada condição ADAS incluiu 6 repetições biológicas. Pouco ou nenhum sinal de luminescência foi obtido do MACH060 ADAS, que não continha o gene DacA e em grande parte não desencadeou elementos de resposta estimulados por IFN nas células THP1-DualTM. No entanto, MACH198 ADAS, que continha o gene DacA sob o controle de pTet, estimulou as células THP1-Dual. A maior estimulação foi observada nas amostras em que a expressão de DacA foi induzida por cultura com anidrotetraciclina. Além disso, quando os monócitos experimentam estimulação de genes IFN, as células assumem um fenótipo ativado e transição de monócitos não aderentes em suspensão para macrófagos aderentes ativados. Observamos essa transição nas amostras expostas a várias populações de ADAS. A Figura 5B mostra que o fenótipo aderente ativado é mais evidente nas amostras em que células THP1-DualTM foram tratadas com MACH198 ADAS induzido com anidrotetraciclina.

[0344] A elicitação da resposta do interferon Tipo I a jusante é essencial para a função da via STING. A assinatura dessa resposta é a secreção de interferons do tipo I, tal como o interferon beta (IFNB1). Para elucidar ainda mais a capacidade do ADAS de induzir uma resposta STING funcional, o IFNB1 foi quantificado para cada amostra usando um kit humano IFN-beta Quantikine ELISA (DIFNB0, R&D Systems®). Os sobrenadantes celulares foram aspirados dos poços ensaiados acima e diluídos na gama linear do ELISA. O ELISA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 5C mostra os resultados do ELISA. Enquanto MACH060 ADAS e o agonista STING de molécula pequena (fornecido como um controle) mostraram níveis de IFNB1 abaixo do limite de detecção do ensaio ELISA (<5 pg/mL), o MACH198 ADAS não induzido mostrou vestígios de quantidades de IFNB1 (~ 7 ng/mL)) e o MACH198 induzido mostrou um aumento de mais de 40X no IFNB1 secretado no sobrenadante celular (~300 ng/mL). O ADAS, portanto, demonstrou a capacidade de fazer uma carga por meio da expressão de uma enzima heteróloga, cuja carga foi entregue a uma célula alvo e induziu uma resposta funcional (neste caso imunomoduladora). Exemplo 8: Carregamento de ADAS de E. coli com carga de RNA

[0345] Este exemplo descreve a expressão e empacotamento de carga de RNA, neste caso dsRNA direcionado ao gene para quimiotripsina (chy1) de Plutella xylostella em ADAS. A. Construção de linhas parentais de E. coli contendo um dsRNA

[0346] Para construir ADAS empacotado com dsRNA, uma sequência de 412 pb (SEQ ID NO: 8) correspondente a uma porção da região codificadora do gene Plutella xylostella chy1 para quimiotripsina foi clonada no plasmídeo L4440 (Fire et al., Nature, 391(6669): 806-811, 1999), contendo promotores T7 duplos, uma origem de replicação pMB1 e um gene de resistência à ampicilina para seleção de antibióticos produzindo pRNAi (ver Tabela 3). Este plasmídeo foi transformado em MACH300 (Tabela 2), uma cepa de E. coli HT115 (DE3) ∆minCDE contendo uma cassete de resistência ao cloranfenicol e selecionada com a adição de 50 µg/mL de carbenicilina e 35 µg/mL de cloranfenicol no meio de crescimento para criar MACH301 (Tabela 2). O MACH301 também carrega uma interrupção no gene rnc, que codifica a RNase III, que degrada o dsRNA, com uma cassete de resistência à tetraciclina. Esta cepa adicionalmente carrega o profago DE3, que codifica uma cópia do gene da RNA polimerase T7 por trás do promotor lac. Quando β-d-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) é adicionado ao meio, a RNA polimerase T7 é expressa. A RNA polimerase T7 depois transcreve a sequência chy1 inserida de ambos os promotores T7, criando um dsRNA correspondente. B. Produção de ADAS com dsRNA

[0347] MACH301 ADAS carregado com dsRNA foi preparado e purificado pelo processo descrito no Exemplo 2, com modificações nas condições de crescimento. Resumidamente, as culturas crescidas durante a noite de MACH301 foram diluídas 1:200 em LB com 50 µg/mL de carbenicilina e cultivadas a DO600 = 0,4. O IPTG foi subsequentemente adicionado à cultura para uma concentração final de 1 mM e o crescimento continuou durante 4 horas de modo que, à medida que os ADAS eram produzidos a partir dos parentais, eles expressavam o construto de dsRNA a partir do plasmídeo. C. Quantificação da carga de dsRNA em ADAS

[0348] Para quantificar os níveis de dsRNA no ADAS, analisamos o conteúdo de ácido nucleico por eletroforese em gel. ADAS, a uma concentração de cerca de 3,3x1010 partículas/mL em PBS, como determinado por análise com Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1TM como descrito no Exemplo 3, foram lisadas através de tratamento com calor a 80 °C durante 20 minutos. Este tratamento levou à liberação dos ácidos nucléicos e fácil visualização através da eletroforese em gel de agarose. 20 µL de lisado de ADAS tratado termicamente foram corridos ao lado de uma curva padrão criada pela série de diluição de um transcrito dsRNA in vitro a 125 ng/mL em um 2% de agarose E-GelTM EX (Thermo Fisher) seguindo as configurações recomendadas pelo fabricante. A imagem do gel foi obtida usando um InvitrogenTM iBrightTM Imager (Thermo Fisher) na configuração de gel de ácido nucleico. Intensidades de banda foram quantificadas com ImageJ. A quantidade de dsRNA carregado foi calculada em 97 ng por 109 ADAS. Este exemplo demonstra que o ADAS pode ser efetivamente carregado com carga de RNA. Exemplo 9: Entrega de ADAS de E. coli a Lepidópteros

[0349] Este exemplo descreve a marcação fluorescente e a visualização de ADAS dentro de um inseto lepidóptero, especificamente a broca do milho europeia, após a adição de ADAS a uma dieta artificial. A. Marcação fluorescente de ADAS para visualização

[0350] Para visualizar o ADAS na broca europeia do milho, marcamos o ADAS por fluorescência com um corante fluorescente de éster de NHS. MACH301 ADAS foi preparado e purificado pelo processo descrito no Exemplo 8. 30 µL de 0,5 M de borato de sódio foi adicionado a 1 mL de ADAS a uma concentração de 1x1011 como medido por análise em Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1TM. Éster de NHS DyLight™ 800 (ThermoFisher), que reagiu com moléculas contendo amina na superfície da membrana externa do ADAS (por exemplo, aminas primárias de proteínas), foi dissolvido em dimetilformamida anidra a uma concentração de 10 mg/mL. 20 µL de estoque éster de NHS DyLight™ 800 foram adicionados ao ADAS em um tubo de 1,5 mL e brevemente agitado em vórtex. A mistura de reação subsequente foi envolvida em papel alumínio e colocada em uma braço oscilante por uma hora à temperatura ambiente. Para remover o excesso de corante, o ADAS foi sedimentado a 20.000xg por 10 minutos à temperatura ambiente e ressuspenso em 1 mL de PBS. Esta lavagem foi repetida 3 vezes e os ADAS foram ressuspensos em um volume final de 1 mL de PBS. B. Alimentação marcada com ADAS para a Broca Europeia do Milho (ECB)

[0351] Ovos da Broca Europeia do Milho (Ostrinia nubilalis) foram obtidos da Benzon Research Inc. e foram criados com uma dieta artificial (dieta noctuida geral) adquirida da Benzon Research Inc. A dieta foi preparada como se segue: 162 g da dieta em pó geral noctuida foram adicionados a água fervente; o conteúdo foi bem misturado por 15 minutos, mantendo a temperatura entre 80 °C e 90 °C; a mistura foi resfriada até 70 °C, e 5 mL de óleo de linhaça foram adicionados e bem misturados; e a comida foi colocada em recipientes de criação e deixaram-se arrefecer e solidificar.

[0352] Os ovos de ECB foram colocados na dieta e incubados e alimentados. Todos os recipientes de criação foram mantidos a 25 °C, 16 horas: 8 horas de ciclo luz:escuro e 50-60% de umidade. Uma vez que as larvas atingiram o estágio de 2º ínstar, elas foram utilizadas para o ensaio de alimentação. Para preparar a configuração para alimentação, 25 mL da dieta geral noctuida foram preparados e colocados (enquanto quente, 70 °C) na tampa de um recipiente de 0,4 litros ((Sistema 1543 Klip It box), e imediatamente colocada uma placa de PCR de 48 poços com os fundos cortados (removidos cerca de 2 mm do fundo) na comida enquanto solidifica: isto criou poços individuais com a quantidade certa de dieta para este ensaio de alimentação para larvas de 2º ínstar. Para administrar o ADAS marcado com Éster de NHS DyLight™ 800 ou PBS como um controle, 2 µL do ADAS ou PBS marcado foram adicionados a 5 poços separadamente e deixados secar. Larvas individuais de 2º instar foram então adicionadas a cada poço e deixadas a alimentar por 1 hora. C. Visualização de ADAS fluorescente na Broca Europeia do Milho

[0353] Para visualizar ADAS em larvas de ECB, as larvas alimentadas com PBS ou ADAS marcado com Éster de NHS DyLight™ 800 foram removidas do poço, colocadas em uma fita adesiva para imobilizá-las e, em seguida, colocadas na superfície de imagem. Ambos os canais de 700 nm e 800 nm foram usados para escanear as larvas. As larvas se autofluorescem no canal de 700 nm; portanto, este canal foi usado para localizar as larvas no imager. O canal de 800 nm foi usado para detectar ADAS marcado nas larvas.

[0354] A Figura 6 mostra os resultados da experiência de alimentação, com muito pouco sinal no canal de 800 nm nas larvas alimentadas com PBS e um forte sinal fluorescente presente em larvas alimentadas com ADAS marcado com Éster de NHS DyLight™ 800. Assim, os ADAS são comidos e presentes na Broca Europeia do Milho quando adicionados à dieta. Exemplo 10: Armazenamento de ADAS

[0355] Neste exemplo, demonstramos métodos para formular e armazenar ADAS usando E. coli como um modelo de bactéria produtora de ADAs. ADAS de E. coli com plasmídeos GFP induzíveis foram sintetizados e purificados de acordo com os métodos fornecidos nos Exemplos 1-3. Eles foram então armazenados em várias condições para avaliar sua capacidade de serem reconstituídos e sobreviver. A. Armazenamento longitudinal de ADAS em condições frias

[0356] Neste exemplo, a capacidade do ADAS de expressar GFP de uma maneira induzível após armazenamento a 4 °C por 0 e 3 dias foi avaliada.

Os ADAS foram derivados de três cepas que contêm o plasmídeo pGFP (Tabela 3) conduzindo a expressão de GFP sob o controle de um promotor induzível por tetraciclina: MACH124 (BW25113 ∆minCDE), MACH556 (BW25113 ∆minC), e MACH557 (BW25113 ∆minD): ver Tabela 2 para informações de genótipo.

Os ADAS foram purificados como indicado no Exemplo 2, usando crescimento seletivo de um sobrenadante de cultura concentrado.

Para a preparação de MACH124 purificado, a concentração de ADAS foi determinada como 2,4x109 ADAS/mL imediatamente após a purificação e 2,18x109 ADAS/mL após 3 dias de armazenamento.

Para a preparação de MACH556 purificada, a concentração de ADAS foi determinada como sendo 1,86x109 ADAS/mL imediatamente após a purificação e 2,2x109 ADAS/mL após 3 dias de armazenamento.

Para a preparação de MACH557 purificado, a concentração de ADAS foi determinada como 1,98x109 ADAS/mL imediatamente após a purificação e 2,08x109 ADAS/mL após 3 dias de armazenamento.

Todas as medições de concentração de ADAS foram feitas usando o Analisador de Nanopartículas Spectradyne® nCS1TM (descrito no Exemplo 3). As preparações de ADAS purificadas foram submetidas à caracterização de nanopartículas e procedimentos de plaqueamento de células viáveis descritos no Exemplo 3. Para cada preparação, a carga celular viável foi determinada como sendo igual ou abaixo do limite de detecção (100 UFC/mL) por plaqueamento de UFC, conforme descrito no Exemplo 3. A capacidade do ADAS armazenado para expressar GFP de uma maneira dependente do indutor foi avaliada como descrito no Exemplo 4C.

No dia 0 (sem dias de armazenamento), um sinal de GFP indutor- dependente foi observado que aumentou ao longo de 12 horas em todas as três cepas.

Após 3 dias de armazenamento, observamos um aumento dependente do indutor na transcrição e tradução de GFP em MACH124 e MACH557 ADAS que persistiu por 12 horas (Figs. 7A-7F). O MACH556 mostrou um aumento dependente do indutor no sinal de GFP até ~6 horas e, em seguida, o sinal diminuiu de volta para níveis não induzidos por 12 horas. Na ausência do indutor (não induzido), não houve aumento no sinal de GFP para qualquer cepa testada. Dados nas Figs. 7A-7F são normalizados conforme descrito no Exemplo 4C. B. Liofilização e reconstituição de ADAS

[0357] Para examinar a capacidade do ADAS de realizar trabalho após a liofilização, os níveis de ATP foram medidos em ADAS reidratado 1, 2 ou 6 semanas após a liofilização. Além disso, a capacidade do ADAS liofilizado de transcrever e traduzir o gene alvo GFP após a reidratação também foi avaliada. ADAS de MACH124 foram purificados como indicado no Exemplo 2. Para liofilizar o ADAS, o ADAS purificado foi sedimentado a 21.000xg por 20 minutos e ressuspenso em Tampão de Liofilização Microbiano (OPS Diagnostics). Os ADAS foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizados por 18 horas no ajuste automático de um Liofilizador LabconcoTM FreeZone ajustado para um vácuo de 0,3 mbarr. ADAS liofilizados foram armazenados no escuro em um saco Ziploc à temperatura ambiente até a reidratação. Para determinar os níveis de ATP de ADAS pós-liofilização, ADAS foram reidratados 1, 2, e 6 semanas após a liofilização, e os níveis de ATP foram medidos usando o Kit de Ensaio de Viabilidade Celular Microbiana BacTiter-GloTM(Promega), seguindo as instruções do fabricante. O ensaio mostrou que ADAS liofilizado e reidratado preservam ATP em níveis semelhantes após 1, 2 ou 6 semanas de armazenamento, com níveis de ATP em 2 e 6 semanas aumentando ligeiramente (1,49 e 1,48 vezes, respetivamente) em relação aos níveis de ATP medidos em 1 semana. Esses dados demonstram que os níveis de ATP são mantidos pelos processos de liofilização, armazenamento ou reidratação.

[0358] Além disso, a capacidade do ADAS reidratado de transcrever e traduzir GFP de uma maneira dependente do indutor foi testada usando o protocolo descrito no Exemplo 4C. Figs. 7G e 7H mostram um aumento dependente de indutor no sinal GFP em MACH124 ADAS reidratado que persistiu por mais de 15 horas. Na ausência do indutor (não induzido), não houve aumento no sinal de GFP. Os dados nas Figs. 7G e 7H são normalizados conforme descrito no Exemplo 4C.

[0359] A atividade observada no ADAS reidratado indica que a integridade do ADAS é mantida pelo processo de liofilização. Exemplo 11. Métodos suplementares para caracterização de ADAS

[0360] Este exemplo descreve vários métodos analíticos suplementares que são usados para caracterizar a composição do ADAS e da célula parental. A. Microscopia Eletrônica

[0361] ADAS são purificados a partir de bactérias parentais, detritos celulares e endotoxinas, conforme descrito no Exemplo 12. Para estruturas periplasmáticas visuais, incluindo flagelos e sistemas de secreção, os ADAS são submetidos a choque osmótico de maneira semelhante aos métodos anteriores (HC Neu e LA Heppel. 240:3685– 3692, 1965) após a separação. As estruturas periplasmáticas separadas são então visualizadas no microscópio eletrônico de transmissão (JEOL, Tóquio) seguindo o protocolo de Wu et al., Analyst,

2015. B. Microscopia de Fluorescência e Ótica

[0362] ADAS e bactérias parentais são visualizados usando um microscópio vertical de equipamento de fluorescência (Leica, Zeiss, câmera CCD e fonte de luz de amplo espetro). As amostras são fotografadas ao vivo dentro de múltiplos poços de cultura de tecidos de formato de 6, 12, 24 ou 96 poços (Thermo Fisher), inserções de transpoço (Corning) ou placas de petri de poliestireno revestidas com ágar (Thermo Fisher). Além disso, as amostras podem ser fixadas nesses recipientes ou em lamínulas de vidro para análise posterior. C. Medição de DO600 de concentração

[0363] Para quantificar o número de ADAS ou bactérias parentais presentes em um determinado volume de meio, a densidade ótica é medida em DO600 e a seguinte equação é aplicada: Número de ADAS/ml = DO600 x A x B onde A é o tamanho relativo de ADAS em comparação com as células parentais e B é o fator da curva de calibração relacionado a DO600 de ADAS versus seu conteúdo de LPS. Isso é derivado da medição AD600 padrão para células bacterianas. D. Análise de rastreamento de nanopartículas de ADAS e bactérias parentais

[0364] A análise de rastreamento de nanopartículas é normalmente usada para medir a pureza das vesículas e é modificada para medir a pureza do ADAS. Resumidamente, o rastreamento de nanopartículas é feito usando o sistema NanoSight LM10 (NanoSight Ltd, Amesbury, Reino Unido) configurado com um laser e uma câmera digital de alta sensibilidade. Os vídeos são coletados e analisados usando um software padrão, usando o tamanho de partícula esperado como entrada. Cada amostra é diluída para uma concentração conhecida na gama de 108 partículas/mL (usando quantificação espectrofotométrica) e administrada e registrada sob fluxo controlado usando o sistema de bomba em NanoSight. A câmera é operada com resolução e taxa de quadro máximos. O número de partículas na gama de tamanho correta é quantificado, junto com uma percentagem do total de partículas (por exemplo, células parentais) fora da gama de tamanho. E. Espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta

[0365] ADAS e distribuições de tamanho de população de bactérias parentais são medidas usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Zetasizer Nano S de Malvern Instruments Ltd.). Ao expor as suspensões ADAS à luz, o raio hidrodinâmico é medido relacionando a intensidade da luz espalhada ao coeficiente de difusão do objeto em solução usando protocolos publicados (Jorge Stetefield, Biophys Rev (2016) 8:409–427). Esses estudos foram realizados anteriormente com nanopartículas, bactérias, proteínas e ácidos nucléicos de maneira semelhante. As cuvetes descartáveis são normalmente usadas para medições de tamanho de ADAS para manter a esterilidade e evitar a contaminação cruzada de amostras. Para algumas aplicações que requerem solventes orgânicos, as cuvetes de vidro reutilizáveis são usadas com protocolos de limpeza cuidadosos que incluem limpezas sequenciais de detergente (Alconox), ácido acético a 5%, água DI e etanol a 70% seguido por um processo de secagem completo. F. Coloração por imunofluorescência:

[0366] ADAS são isolados de bactérias parentais usando métodos descritos no Exemplo 12. ADAS são diluídos e centrifugados a 500g em lamelas de vidro limpas e fixados em paraformaldeído a 4% em solução de PBS por 20 minutos. As amostras são lavadas, incubadas em solução de coloração de anticorpos de acordo com as instruções do fabricante, colocadas sobre uma lâmina com antifade para montagem de acordo com as instruções do fabricante, secas, e fotografadas sob um microscópio confocal. ImageJ é usado para processar as imagens. G. Citometria de fluxo:

[0367] Bactérias parentais e ADAS são analisados utilizando citometria de fluxo em um NanoFCM (NanoFCM, China) de acordo com as instruções do fabricante. Usando fluorescência ADAS, o NanoFCM é usado em modo de uma ou duas cores (exposição em comprimentos de onda de 488 nm e 555 nm) para confirmar várias propriedades do ADAS, incluindo a captação de plasmídeo, expressão de proteína e pureza. Por exemplo, um corante lipofílico fluorescente, tal como DiOC6 (ICN Biomedical) é incorporado em membranas ADAS, conforme descrito pelo fabricante. ADAS são classificados e purificados tal como explicado no Exemplo 12 e, em seguida, lavados em solução salina fria tamponada com fosfato (pH = 7), sedimentados (40.000, 5 min, 4 ºC), e diluídos para (1E5, 1E6, 1E7) ADAS/mL e a intensidade de fluorescência DiOC6 é medida a 488 nm de excitação e 535 de emissão. H. PCR

[0368] Os ADAS purificados são lisados e o DNA é purificado usando um kit de purificação QIAquick PCR de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Os iniciadores de oligonucleotídeo 23S-senso (59 GAA AGG CGC GCG ATA CAG 39) e 23S-antisenso (59 GTC CCG CCC TAC TCA TCG A 39) são usados para amplificar um fragmento de 70 pb do gene 23S do RNA ribossômico, presente em sete cópias no genoma de E. coli como descrito por Vilalta et al., Anal Biochem, 2001. As reações de amplificação são realizadas usando reagentes TaqMan (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. I. SEQ de RNA

[0369] A análise de todo o transcriptoma é feita usando RNAseq, conforme descrito por Giannoukos et al., Genome Biol, 2012. Resumidamente, os ADAS são purificados para uma DO600 de ~ 0,5 em caldo LB e colhidos por centrifugação a 4.000 × g por 10 minutos à temperatura ambiente. Os sedimentos são ressuspensos em 25 mL de RNAlater (Ambion, Carlsbad, CA, EUA). Os tubos são agitados em um rotador a 4 °C durante a noite, centrifugados a 4.000 × g por 10 minutos, colocados em um banho de etanol/gelo seco para congelar rapidamente o sedimento e armazenado a -80 °C.

[0370] A extração de RNA é feita usando o Kit Ion Total RNA-seq v2 (ThermoFisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante.

As reações enzimáticas usando o kit de isolamento de mRNA Procariótico mRNA-ONLY (Epicentro) são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. O Sistema RNA-Seq Ovation Procariótico (NuGEN Technologies, Inc., San Carlos, CA, EUA) é usado como segue. O RNA intacto é DNase tratado como descrito acima e sintetizado em cDNA de acordo com o protocolo do fabricante.

[0371] Os produtos purificados são selecionados por tamanho em um gel (aproximadamente 300 a 450 pb). As amostras são enriquecidas com iniciadores Illumina PE1.0 e PE2.0 (1 μM cada), 1 × de tampão AccuPrime PCR I (10 ×), 0,5 U de polimerase Taq de alta fidelidade AccuPrime (5 U/μL; Invitrogen) em um final volume de 25 μL As reações enriquecidas são purificadas usando esferas Agencourt AMPure XP (0,8 × o volume da reação). As bibliotecas são sequenciadas em instrumentos Illumina GAII ou Hi-Seq. As leituras em bruto de dados de RNA-seq são processadas usando o pipeline de Picard. Resumidamente, as leituras são alinhadas e atribuídas aos genomas de referência usando o programa HISAT2. Os dados de sequência para E. coli são alinhados às respetivas sequências do genoma. As leituras alinhadas ao HISAT2 são então analisadas e atribuídas a genes individuais de acordo com as anotações do genoma fornecidas pelo GenBank. J. SEQ de DNA

[0372] DNA residual a partir de linhas parentais é medido usando o kit de DNA E. coli Quantitativo resDNASEQ (ThermoFisher Scientific) usando plataformas de automação de 96 poços KingFisher Flex Express para automatizar a extração de hospedeiro - linha celular de DNA residual de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, duas placas de lavagem e uma de eluição são preparadas e as amostras são carregadas. As amostras são então lisadas e processadas no KingFisher Flex usando o script PrepSEQ_resDNA_v1. As curvas padrão são geradas usando linhas parentais de E. coli, e as amostras são amplificadas usando uma master mix e os resultados são lidos e analisados usando o software SDS. K. Géis

[0373] O DNA das linhas parentais de E. coli e ADAS é extraído usando protocolos padrão e carregado em géis de agarose para análise de tamanho seguindo as instruções do fabricante. O DNA genômico é de ~4,5 Mb, enquanto o DNA de plasmídeo é de ~3-5 kb. I. ELISA

[0374] O kit de ensaio E. coli FluoroSELECT (Sigma-Aldrich) é usado para a detecção de ELISA de células parentais. O sistema de detecção utiliza um substrato fluorogênico que, quando hidrolisado por uma enzima específica (durante a hidrólise do peptídeo), produz um sinal fluorescente. Resumidamente, as amostras são preparadas de acordo com as instruções do fabricante e lidas com um fluorímetro. Após a calibração, se P1 medido > 30.000, a amostra é positiva para as células da linha parental. Se P1 < 30.000, medido o P2. Se o valor numérico (P2-P1) <(3%xP1), a amostra é negativa. Exemplo 12. Métodos suplementares para produção de ADAS de E. coli

[0375] Este exemplo descreve métodos suplementares para a produção e caracterização de ADAS de Escherichia coli. A. Produção de ADAS de E. coli

[0376] Para criar ADAS, E. coli é transfectada com um plasmídeo que sobre-expressa a proteína ftsZ sob o promotor T7. Alternativamente, mutantes de E. coli são criados com genes MIN interrompidos por transfecção de E. coli com os plasmídeos que integram. Os plasmídeos são sintetizados comercialmente pela Thermo Fisher. A transfecção é realizada usando processos de transfecção de bactérias padrão (Thermo Fisher Molecular Biology Handbook). Em suma, as células competentes são semeadas em placas de ágar à temperatura ambiente. 0,5-2 ng/mL de DNA são adicionados às células competentes em um frasco e incubados por 20-30 minutos. Cada tubo é então submetido a choque térmico, colocando o tubo em banho-maria a 42 ˚C por 30-60 segundos para criar poros transitórios na superfície da célula. As células são então semeadas em géis de ágar que foram pré-carregados com antibiótico seletivo e cultivadas durante a noite para que apenas as bactérias que foram transfectadas com o plasmídeo sobrevivam. Uma única colônia é colhida e cultivada a 37 ˚C com agitação contínua a 120 rpm em meio LB contendo 50-100 µg/mL de ampicilina. Com o tempo, as colônias selecionadas proliferam e produzem ADAS continuamente. Exemplo 13. Métodos suplementares para a purificação de ADAS derivado de E. coli e medição de eficiência

[0377] Este exemplo descreve métodos suplementares para purificar ADAS de Escherichia coli de uma preparação em bruto, bem como métodos para caracterizar a quantidade de bactérias vivas contaminantes. A. Purificação de ADAS de E. coli

[0378] Para separar o ADAS das bactérias parentais para produção de elevada pureza, é usada uma combinação de lavagem, centrifugação, filtração esterilizada e tratamento com antibióticos. Utilizando protocolos adotados de métodos publicados anteriormente (Reeve, J 1979, Jivrajani 2013, Rampley et al 2017) com várias modificações. Resumidamente, para purificar a solução, uma mistura de bactérias parentais e solução ADAS é coletada e centrifugada a 4 ˚C (Beckman Coulter) em velocidades crescentes em incrementos de 1000g a 4000g por 10 minutos em cada etapa em que uma porção crescente das células parentais da suspensão é removida. Para assegurar ainda mais que a bactéria parental foi removida, 100 µg/mL de antibiótico potente (ceftriaxona) são adicionados e a amostra é incubada com solução sobrenadante final a 4 ºC durante a noite. No dia seguinte, a solução é centrifugada a 400g a 4 ˚C para sedimentar qualquer resíduo celular, o sobrenadante rico em ADAS é coletado e, em seguida, centrifugado a 4000g por 5 minutos a 4 ˚C. Finalmente, a solução é esterilizada por filtração usando um filtro de membrana de 0,2 µm e o ADAS é então ressuspenso em PBS esterilizado com Ca2+ e Mg2+ na concentração desejada. B. Medindo a eficiência de purificação de ADAS

[0379] Em cada etapa da produção de ADAS, o sobrenadante ou sedimento é coletado e semeado em placas de ágar e incubado a 37 ˚C para confirmar visualmente que as células parentais estão sendo removidas da solução. Em paralelo, usando um hemocitômetro, o número de ADAS e bactérias parentais são contados usando microscopia ótica. Além disso, para assegurar que ADAS não contêm DNA residual, é realizado um ensaio baseado em fluorescência utilizando Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Invitrogen, R37605), o qual vai tornar-se fluorescente UV se os ADAS são positivos para DNA residual. O reagente é adicionado conforme indicado pelo fabricante (2 gotas por mL de amostra) e incubado por 15-30 minutos e lavado com solução PBS antes da imagem para remover o excesso de reagente. Após a exposição à luz de comprimento de onda de 405 nm, o corante excitará no espetro azul se tiver sido acoplado a qualquer DNA remanescente. Como contracoloração, os corantes FM 4-64 com fluorescência vermelha (Invitrogen) são usados como um corante intercalado à base de membrana lipofílica que mancha o folheto externo do ADAS e da bactéria parental. Os espetros de excitação e emissão são separados das manchas nucleares para garantir que um sinal único possa ser coletado. A pureza da amostra é calculada como uma percentagem de ADAS na população restante = 100x (# vermelho - # de azul)/(# vermelho). Além disso, usando o método de espalhamento dinâmico de luz (DLS) (Zeta Sizer Malvern), a pureza é avaliada comparando a magnitude dos picos associados com ~1 µm (células parentais) e ~500 nm (ADAS) e mostrando que o pico da célula parental se aproxima de zero em amostras de pureza crescente.

[0380] Alternativamente, o DNA residual de ADAS é determinado usando o kit de ensaio DNAQuant-iT™ PicoGreen™ (Invitrogen, Cat# P11496) usando protocolos estabelecidos pelo vendedor. ADAS são coletados em PBS e lisados usando tampão de lise. Os reagentes PicoGreen são misturados e a reação é observada nas amostras usando medições de fluorescência.

[0381] Alternativamente, os ADAS são concentrados e propagados a 2,5x1011 ADAS/mL em meios de cultura apropriados, e 4 mL são colocados sobre uma placa de 60 mm com agar de crescimento adequado e colocados em cultura em condições adequadas. As colônias são contadas após 2 dias para determinar o número de bactérias vivas por 1012 ADAS.

[0382] Alternativamente, o rastreamento de nanopartículas, Zetasizer e outros métodos de rastreamento de distribuição de tamanho são aplicados para determinar a distribuição de tamanho e verificar a presença de um pico de partículas grandes indicando bactérias vivas seguindo os protocolos no Exemplo 11. Alternativamente, as amostras são testadas em um qNano Gold (Izon Science Ltd.), que usa sensor de pulso resistivo ajustável para medir o tamanho, a concentração e a carga das partículas à medida que passam por um nanoporo. Exemplo 14. Preparação de ADAS de E. coli grande

[0383] Os ADAS no Exemplo 12 são preparados através da interrupção dos genes de septação que levam à divisão celular assimétrica e à produção de ADAS a partir de uma cepa de células bacterianas parentais. Este exemplo demonstra a produção de ADAS usando exonucleases que degradam seletivamente o genoma da bactéria parental diretamente, o que oferece várias vantagens sobre a preparação de ADAS descrita no Exemplo 12, por exemplo, composição citoplasmática de controle melhorada, carga de número de cópias aumentada e ATP aumentado. A. Produção de grande ADAS de E. coli

[0384] Dois plasmídeos foram construídos, (1) que contém um promotor da arabinose para sobre-expressar os genes sbcB ou sbcCD, que codificam as exonucleases que degradam DNAs em muitas conformações e permitir que nativamente expressem RecBCD para digerir o genoma, e (2) um plasmídeo contendo uma cassete que inativa o gene recA sob o controle de um promotor lac induzido por IPTG. Os plasmídeos são sintetizados comercialmente e (1), (2) ou ambos são transfectados em células de E. coli seguindo protocolos padrão, tal como o do Exemplo 12. B. Purificação de grande ADAS de E. coli

[0385] Após a cultura bacteriana atingir 600 D.O., o gene Exo1 é ativado usando arabinose 0,1% e meio sem glicose ou IPTG ou ambos. Após 15 minutos, 1 hora, 2 horas e 6 horas, as células são coletadas e centrifugadas a 4 °C por 5 minutos e ressuspensas em PBS. Conforme descrito no Exemplo 15, ADAS auxotróficos são usados para aumentar a pureza da solução que é determinada usando as medidas nos Exemplos 2 ou 12. Exemplo 15. Métodos suplementares para a produção de cepas bacterianas auxotróficas produtoras de ADAS para aumentar a pureza

[0386] Este exemplo descreve a síntese de ADAS de cepas parentais que são auxotróficas como um mecanismo para reduzir o número de bactérias viáveis que contaminam as preparações de ADAS. A. Preparação de bactérias E. coli parentais auxotróficas

[0387] ADAS com um número reduzido de contaminantes de bactérias parentais são criados usando cepas auxotróficas de E. coli, tal como a cepa JW2786-1 de nocaute da síntese de arginina (argA). Os ADAS de E. coli são produzidos de acordo com os métodos do Exemplo 12, mas com arginina adicionada ao meio. Os ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 13 e, em seguida, armazenados em meio livre de arginina. B. Preparação de grande ADAS de E. coli a partir de cepas auxotróficas

[0388] ADAS grandes de cepas parentais auxotróficas são criadas usando uma cepa auxotrófica de E. coli, tal como a cepa JW2786-1 de nocaute da síntese de arginina (argA). Os ADAS grandes de E. coli são produzidos de acordo com os métodos do Exemplo 14, mas cultivados em meio contendo arginina. Os ADAS são então purificados usando os métodos do Exemplo 14. C. Demonstrando a pureza aumentada de ADAS grandes e regulares auxotróficos

[0389] ADAS grandes e regulares são preparados usando os métodos acima. ADAS de cepas parentais não auxotróficas e ADAS grandes e não auxotróficos também são preparados usando os métodos no Exemplo 12, Exemplo 13 e Exemplo 14. A pureza de ADAS é medida usando os métodos do Exemplo 15. Exemplo 16. Métodos suplementares para medir a atividade de

ADAS

[0390] Este exemplo descreve métodos suplementares para medir a atividade de ADAS. A. Medição de ATP

[0391] Uma amostra de ADAS é dividida em duas. O ATP de metade da amostra é medido através do ensaio BacTiter Glo (Promega) seguindo as instruções do fabricante. O tamanho e a concentração da outra metade são medidos através de rastreamento de nanopartículas ou NanoFCM, usando protocolos do Exemplo 11. A área total da superfície da membrana do ADAS é calculada usando as fórmulas apropriadas, e a quantidade de ATP do ensaio BacTiter Glo é dividida pela área para produzir o ATP por unidade de área de superfície do ADAS. B. Medição de queda de ATP

[0392] Os ADAS são incubados a 37 ˚C para aqueles que são relevantes para os mamíferos e 30 ˚C para aqueles que não são, e a razão da concentração de ATP entre as medições feitas na preparação e após 24 horas é medida usando os métodos na parte a). C. Medição do índice de vida útil

[0393] ADAS são sintetizados com um plasmídeo GFP funcional com promotores apropriados para a espécie. A concentração de GFP é medida em relação ao número de ADAS, o número médio de plasmídeos por ADAS e o volume da solução com um leitor de placas em 30 minutos e 24 horas. O índice de vida útil é calculado como a razão da taxa de produção de GFP de 24 horas a 30 minutos. D. Medição de consumo de ATP

[0394] Para avaliar a atividade da bactéria parental e do ADAS, a taxa de produção de ATP é medida. A taxa de produção de ATP é medida usando um Seahorse XF (Agilent) seguindo as instruções do fabricante.

[0395] Alternativamente, uma amostra de ADAS é dividida ao meio. Metade da amostra é tratada com um inibidor da síntese de ATP, tal como a diciclo-hexilcarbodiimida. Ambas as metades são então testadas com BacTiter -Glo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A diferença nas duas amostras é considerada a taxa de geração de ATP. Exemplo 17. Métodos suplementares para armazenamento de ADAS derivado de E. coli

[0396] Este exemplo descreve métodos suplementares para armazenar e formular ADAS usando E. coli como modelo ADAS. ADAS de E. coli com plasmídeos pBAD GFP são sintetizados de acordo com os métodos do Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13. Eles são então armazenados em várias condições para demonstrar sua capacidade de se reconstituir e sobreviver. A. Armazenamento longitudinal de ADAS de E. coli

[0397] ADAS são armazenados a 4 ˚C em tampão isotônico para manter a integridade estrutural e atividade química. Imediatamente antes do uso, os ADAS são reaquecidos a 37 ˚C. B. Armazenamento longitudinal de ADAS no frio

[0398] ADAS são armazenados a 4 ˚C em tampão isotônico por 0, 30, 60, 90 ou 180 dias. C. Liofilização e reconstituição de ADAS

[0399] Os ADAS são centrifugados e ressuspensos nas seguintes soluções: 20% p/vol de leite desnatado em meio de crescimento, 20% p/vol de leite desnatado em água, 12% p/vol de sacarose em uma mistura 50:50 de água e meio de crescimento, Reagente 18: Caldo de Soja Trypticase, 1,5 g; Sacarose, 10 g; Porção V de Albumina de Soro Bovino, 5 g; Água destilada, 100 mL, e reagente 20: sacarose, 20 g; Porção V de Albumina de Soro Bovino, 10 g; Água destilada, 100 mL. Todas as soluções são esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 µm. O ADAS é então congelado rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizado. O pó é armazenado por 0, 30, 60, 90, 180 dias a 0 ˚C, -20˚C e 25 ˚C. No final do período de teste, o pó é reconstituído com água ou caldo LB.

[0400] A atividade de ADAS pós-reconstituição é avaliada usando os métodos para avaliar no Exemplo 16. D. Congelamento e reconstituição de ADAS

[0401] Os ADAS são centrifugados e ressuspensos em 10%, 20%

e 30% vol/vol de glicerol e meio de crescimento. Os ADAS são congelados rapidamente em nitrogênio líquido ou lentamente congelados em um Nalgene Mr. Frosty. Os ADAS são armazenados a –20 ˚C e -80 ˚C por 0, 30, 60, 90, 180 dias. No final do período de teste, o pó é reconstituído com água ou caldo LB.

[0402] A atividade de ADAS pós-armazenamento é avaliada usando os métodos para avaliar no Exemplo 16. E. Secagem por pulverização e reconstituição de ADAS

[0403] Os ADAS são centrifugados e ressuspensos em 20% p/vol de leite desnatado em meio de crescimento, 20% p/vol de leite desnatado em água ou 12% p/vol de sacarose em uma mistura 50:50 de água e meio de crescimento. O ADAS é então liofilizado em uma unidade de escala de laboratório e coletado. O pó é armazenado por 0, 30, 60, 90, 180 dias a 0 ˚C, -20 ˚C e 25 ˚C. No final do período de teste, o pó é reconstituído com água ou caldo LB.

[0404] A atividade de ADAS pós-liofilização é avaliada usando os métodos para avaliar no Exemplo 16. Exemplo 18. Avaliação da similaridade de grandes ADAS com as bactérias parentais

[0405] Este exemplo descreve ADAS grandes que são mais semelhantes às bactérias parentais do que o ADAS normal. A. Comparação de ADAS grande de E. coli com outro ADAS

[0406] Os ADAS de E. coli são sintetizados de acordo com os métodos do Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13. Amostras de ADAS, ADAS grandes e bactérias parentais são semeadas em placas de poços e os ensaios são realizados dentro de 30 minutos após o plaqueamento inicial. A composição citoplasmática é caracterizada usando RNAseq (descrito no Exemplo 14) para caracterizar os diferentes transcritos de RNA presentes nas diferentes amostras. O número de cópias das diferentes amostras é avaliada usando qPCR para quantificar o sinal de plasmídeos individuais aos de um padrão de plasmídeo com número de cópias conhecido usando um método baseado em protocolos existentes (Anindyajati et al., "Plasmid Copy Number Determination by Quantitative Polymerase Chain Reaction" Scientia pharmaceutica vol. 84,1 89-101. 14 Feb. 2016). Além disso, a longevidade das três condições é comparada usando o ensaio de atividade de ATP descrito no Exemplo 11.

[0407] Amostras de ADAS, ADAS grandes e bactérias parentais são todas preparadas e purificadas usando métodos previamente descritos no Exemplo 12-15. A análise do transcriptoma completo é realizada usando RNAseq conforme descrito no Exemplo 12 e as diferenças nas magnitudes da transcrição são anotadas. Exemplo 19. Métodos suplementares para demonstrar maior pureza de ADAS auxotrófico

[0408] Este exemplo descreve ADAS feito de parentais auxotróficos que são mais puros após o isolamento do que aqueles feitos de parentais não auxotróficos. A. Preparação de bactérias E. coli parentais auxotróficas

[0409] ADAS com reduzidos contaminantes de bactérias parentais são criados usando cepas auxotróficas de E. coli, tal como a cepa JW2786-1 de nocaute da síntese de arginina (argA). Os ADAS de E. coli são produzidos de acordo com os métodos do Exemplo 12, mas com arginina adicionada ao meio. Os ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 13 e, em seguida, armazenados em meio livre de arginina. B. Preparação de grande ADAS de E. coli auxotrófico

[0410] Para criar um grande ADAS auxotrófico, uma cepa auxotrófica de E. coli, tal como a cepa JW2786-1 de E. coli de nocaute de síntese de arginina (argA), é usada. ADAS grandes são produzidos de acordo com os métodos do Exemplo 14, com a modificação do plasmídeo sbcB aumentada com a expressão da proteína argA, permitindo que apenas o ADAS com sbcB sobreviva no meio. Os ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 14. C. Demonstrando a pureza aumentada de ADAS grandes e regulares

[0411] Os ADAS auxotróficos grandes e regulares são preparados usando os métodos acima. Os ADAS não auxotróficos e ADAS grandes também são preparados usando os métodos do Exemplo 12, Exemplo 13 e Exemplo 14. A pureza de ADAS é medida usando os métodos do Exemplo 13. Exemplo 20. Métodos suplementares para determinar se ADAS com ATP sintase expressa são altamente ativos

[0412] A expressão e montagem da ATP sintase são processos rigidamente regulados em todos os organismos. A E. coli resiste à transcrição com plasmídeos contendo ATP sintase, pois a sobre- expressão pode ser letal para a célula. Este exemplo descreve duas estratégias para sintetizar ADAS com sobre-expressão de ATP sintase. A. Geração de ADAS de E. coli com sobre-expressão de atpI

[0413] As linhas de E. coli K12 são cultivadas em condições de cultura normais, o RNA total é purificado usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e tratado com 2 U de DNase livre de RNase por 1 h. O RT-PCR é realizado em atpI, que é um gene envolvido na geração de energia pela ATP sintase, utilizando os seguintes iniciadores: 5'-TCAGGCAGTCAGGCGGCTT-3', atpI-F; 5'- TTACCCTTTGTTGTTAATTACAGC-3', atpI-R como descrito por Chen et al., Adv Mat Res, 2014. As condições de PCR incluem uma desnaturação inicial por 5 min a 96 ºC, seguida por 15 ciclos por 1 min a 96 ºC, 1 min a 55 ºC e 1 min a 72 ºC com uma extensão final de 7 min a 72 ºC. Os produtos de PCR são resolvidos em um gel de agarose a 1,2%. A intensidade das bandas esperadas é analisada e comparada pelo software Bio-Rad. Para sobre-expressar os genes do metabolismo de energia, o vetor de expressão pET15b é aplicado. O produto de PCR do gene atpI é introduzido nos plasmídeos pET15b para obter o vetor de expressão, pAtpI. O vetor de expressão é eletroporado em E. coli BL21(DE3) e induzido pela adição de IPTG em DO550 0,4~0,5.

[0414] Os ADAS de E. coli são gerados a partir desta linha conforme descrito no Exemplo 12 e purificados conforme descrito no Exemplo 13. B. Geração de ADAS de E. coli com plasmídeos contendo ATP sintase

[0415] O plasmídeo pBAD33.atp contendo a cassete ATP sintase, conforme descrito em Brockmann et al., J Bacteriol, 2013, é sintetizado comercialmente e transfectado em E. coli BL21(DE3) utilizando os métodos descritos no artigo. ADAS são então produzidos a partir dessas células seguindo o Exemplo 12 com a remoção de glicose e adição de 0,03% p/vol de arabinose ao meio. Os ADAS são então purificados usando os métodos do Exemplo 13. C. Comparação da atividade de ADAS de E. coli e ADAS de E. coli com ATP sintase

[0416] ADAS de E. coli feito a partir dos métodos acima e ADAS de E. coli sem adição de ATP sintase são sintetizados e caracterizados usando os métodos no Exemplo 15. Exemplo 21. Ensaios para aumento da atividade em ADAS com supressão de componentes ATP sintase ε

[0417] A subunidade ε (atpC) da FoF1 ATP sintase bacteriana é um inibidor intrínseco da atividade de síntese/hidrólise de ATP. Os mutantes defeituosos neste domínio regulatório não exibiram nenhuma diferença significativa na taxa de crescimento, rendimento de crescimento molar, potencial de membrana ou concentração de ATP intracelular sob uma ampla gama de condições de crescimento e estressores em comparação com as células do tipo selvagem (Klionsky et al., J Bacteriol, 1984). Neste exemplo, as células de E. coli são sintetizadas com excisão induzível da subunidade ε ou feitas a partir de uma cepa nocaute. A. Geração de linhas parentais de E. coli com excisão induzível da subunidade ε de ATP sintase

[0418] É obtida a cepa de E. coli JW3709 ou outra cepa com nocaute atpC. Um plasmídeo é construído usando um transativador controlado por tetraciclina (tTA) para expressar indutivelmente atpC na ausência de tetraciclina (tet) por um serviço comercial. O construto é eletroporado na cepa de nocaute atpC para permitir a expressão de atpC na ausência de tet e cultivada em meio sem tet. ADAS são sintetizados a partir dessas células usando os protocolos descritos no Exemplo 12 e purificados com os métodos no Exemplo 13.

[0419] ADAS de E. coli feito a partir dos métodos acima na presença e ausência de tet, ADAS de E. coli feito a partir da cepa JW3709 e ADAS de E. coli regular são caracterizados usando os métodos no Exemplo 15. Exemplo 22. ADAS altamente ativo com vias de glicólise modificadas

[0420] Uma vez que a via da glicólise é uma das maneiras pelas quais o ATP é sintetizado, a regulação positiva de enzimas-chave pode levar a mais ATP na célula. Este exemplo descreve a criação de ADAS altamente ativo de E. coli contendo um plasmídeo que expressa pfkA e tpi que foi mostrado para produzir mais ATP (ver Shimosaka et al, Ag. Bio. Chem, 1981). A. Síntese de ADAS expressando pfkA e tpi

[0421] A cepa de E. coli pLC16-4 do E. coli Genetic Stock Center é cultivada e o plasmídeo pLC16-4 é extraído usando um kit comercial de purificação de plasmídeo. As células eletrocompetentes de E. coli C600 são preparadas e eletroporadas com o plasmídeo pLC16-4 seguindo o protocolo no Eppendorf #4308 915.511. Resumidamente, as células são cultivadas a partir de uma cultura fresca durante a noite de E. coli a 37 ˚C em meio LB a uma densidade de DO600 de 0,5-0,6. As células são então colocadas em gelo, centrifugadas resfriadas, ressuspensas em água 0 ˚C, lavadas em água gelada e diluídas para uma concentração de 2x1011 células/mL. 40 µL de células são então misturados com 10 pg de plasmídeo em água e eletroporados. As células são então imediatamente cultivadas por 30-60 minutos a 37 ˚C em meio SOC, semeadas e, em seguida, cultivadas em condições de cultura padrão. ADAS de E. coli de E. coli C600 contendo e não contendo o plasmídeo pLC16-4 são então preparados de acordo com os protocolos no Exemplo 12 e purificados de acordo com o Exemplo 13. B. Comparação de ADAS sobre-expressando pfkA e tpi com ADAS regular

[0422] A atividade de E. coli C600 contendo e não contendo o plasmídeo pLC16-4 é medida usando os protocolos no Exemplo 15. Exemplo 23. Ensaios para aumento da atividade em ADAS sintetizado em condições de cultura especializadas

[0423] As condições de cultura podem mudar dramaticamente o crescimento, maturação, sobrevivência das células in vitro (Wang D, Yu X, Gongyuan W. Pullulan production and physiological characteristics of Aureobasidium pullulans under acid stress. Appl Microbiol Biotechnol. 2013; 97:8069–77). Este exemplo descreve o rastreio de compostos e condições que aumentam o ATP intracelular. De forma não exaustiva, as E. coli são usadas com ênfase inicial no pH, concentração de oxigênio e voltagem aplicada. Isso representa um método suplementar para identificar novos aditivos de meio para ajustar os níveis de ATP celular.

[0424] ADAS são sintetizados e isolados usando métodos descritos no Exemplo 12. Após o isolamento, ADAS são cultivadas sob várias condições de meios e a taxa de produção de ATP é medida utilizando cavalo marinho (Agilent, kit de ensaio ATP) de acordo com as instruções do fabricante. 0,1 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 1 mM ou 10mM de glicose é usada como linha de base. A. Síntese de ADAS em pH baixo

[0425] O pH do meio de crescimento ADAS é ajustado usando a adição gota a gota de ácido cítrico e NaOH. Meio de pH 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 usado e o ATP intracelular é medido imediatamente e após 1, 4, 6, 10 horas usando o ensaio Seahorse ATP.

[0426] O nosso resultado mostra um fornecimento elevado de ATP em condições de pH mais baixo, tal como 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5.

[0427] B. Síntese de ADAS em um ambiente hipóxico

[0428] Para imitar as condições do meio hipóxico, o meio é incubado em várias misturas de gases (1, 5, 7,5, 10,15, 20,95% de O2) por 24 horas antes da exposição ao ADAS. Os ADAS de E. Coli são então cultivados em meio pré-condicionado e o ATP intracelular é medido imediatamente e após 2 horas usando o ensaio Seahorse ATP.

[0429] O nosso resultado mostra que meios com concentração de oxigênio de 1, 5, 7,5, 10, 15, 20,95% levam ao aumento do ATP intracelular após 2 horas. C. Síntese de ADAS com campos elétricos alternados aplicados

[0430] Um campo elétrico alternado externamente aplicado com uma amplitude de intensidades entre 1-100 V/cm é aplicado ao ADAS cultivado em meio LB padrão dentro de uma célula de estimulação de acordo com o protocolo previamente definido desenvolvido para cultura de E. Coli (Zrimec et al, CELL. MOL. BIOL. LETT. Vol. 7. No. 1. 2002). Em resumo, a voltagem é estabelecida entre dois eletrodos de platina paralelos (área ativa de 0,75 cm2, 2 mm de distância) e um gerador de frequência (Metex MS-9150) é usado para aplicar campos elétricos. A amostra é mantida em baixas temperaturas (<5 ˚C durante a estimulação) e a amplitude da tensão do eletrodo varia de 0 V a 100 V sem componente DC e frequência variando de 50 Hz a 1000 kHz.

[0431] O resultado indica que a produção de ATP de novo em ADAS é aumentada em amostras na voltagem mais alta medida pelo ATP intracelular usando um ensaio BacTiter Glo (Promega), conforme prescrito pelo fabricante. Exemplo 24. Ensaios para aumento da atividade em ADAS com flagelos removidos e outras características não essenciais

[0432] Para minimizar a presença de características estruturais não essenciais em ADAS de E. coli, as linhas parentais são sintetizadas com um genoma simplificado contendo genes essenciais para crescimento, divisão e metabolismo. Estudos têm demonstrado que a E. coli sintetizada com tais genomas "essenciais” não só sobrevive e se divide, mas pode ainda proporcionar algumas propriedades úteis. Posfai et al., Science, 2006 mostraram que essas cepas mostram alta eficiência de eletroporação e propagação precisa de genes recombinantes e plasmídeos que são instáveis em outras cepas não modificadas. Essas cepas modificadas, portanto, não apenas resultam em ADAS de E. coli desprovido de estruturas desnecessárias, mas também têm atividade melhorada em comparação com aquelas de linhas parentais não modificadas.

[0433] Abordagens baseadas em genoma são usadas para identificar genes essenciais no genoma de E. coli, conforme descrito em Arigoni et al., Nature Biotech., 1998 e outros. Resumidamente, uma comparação do genoma de E. coli com o de outras bactérias permite que genes-chave envolvidos no crescimento, maturação e divisão sejam identificados. As interrupções sistemáticas de genes confirmam os genes-chave envolvidos na sobrevivência e divisão. Além disso, a arquitetura do genoma é analisada usando métodos in silico para estabilizar os genomas mínimos. A deleção de grandes regiões do genoma é feita usando CRISPR-Cas9 e deleção mediada por fago. Para criar deleções livres de cicatrizes, é usado o protocolo adaptado de Tear et al., Applied Biochem Biotech, 2015. Além disso, o meio de crescimento pode mascarar ou aumentar os efeitos de tais exclusões de genes, e essas cepas precisarão ser cultivadas em uma variedade de meios para testar totalmente os efeitos (Ish-Am et al., PLoS One, 2015). É gerada uma biblioteca de cepas com vários números de genes não essenciais que são necessários para funções específicas (por exemplo, transportadores, estrutura). A. Geração de ADAS de E. coli com deleção de flagelos

[0434] E. coli MG1655 (CGSC 6300) é obtida a partir de E. coli Genetic Stock Center e é uma cepa de tipo selvagem que não possui o elemento IS1 no promotor flhDC. Esses mutantes são não móveis e têm deleções de vários comprimentos começando imediatamente a jusante de um elemento IS1 localizado dentro da região reguladora do operon flhDC, que codifica o regulador mestre da biossíntese do flagelo, FlhD4C2. ADAS são sintetizados a partir dessas células usando os protocolos descritos no Exemplo 12 e purificados com os métodos no Exemplo 13. B. Geração de linhas parentais de E. coli com deleção de Fimbriae e

TXSS

[0435] Múltiplas linhas parentais de E. coli com interrupção em genes que codificam para proteínas fimbriais e TXSS são geradas usando o Kit de Deleção de Genes E. coli Quick and Easy (Gene Bridges). Este kit usa Recombinação Red/ET, para direcionar moléculas de DNA que são precisamente alteradas por recombinação homóloga em E. coli que expressam os pares de proteínas derivadas de fago, tanto RecE/RecT ou Redα/Redβ. RecE e Redα são 5'-3 'exonucleases, e RecT e Redβ são proteínas de anelamento de DNA. Resumidamente, os produtos de PCR direcionados ao gene de interesse são inseridos no plasmídeo de expressão pRedET, e a cepa de E. coli a ser modificada é transformada de acordo com as instruções do fabricante. A expressão de Red/ET é induzida pela adição de L-arabinose e uma mudança de temperatura. A recombinação mediada por Red/ET interrompe o locus alvo pela inserção de uma cassete de repetição e os resultados são verificados usando PCR. ADAS são sintetizados a partir dessas células usando os protocolos descritos no Exemplo 12 e purificados com os métodos no Exemplo 13. C. Comparação de ADAS de E. coli com e sem flagelos, fímbrias e TXSS

[0436] ADAS são gerados a partir das linhas parentais acima e a atividade é medida usando os métodos do Exemplo 15. Exemplo 25. Ensaios para aumento da atividade em ADAS com capacidades fotossintéticas

[0437] Este exemplo descreve a síntese de ADAS altamente ativo com a capacidade de converter luz em PMF ou ATP por meio da adição de um plasmídeo que expressa proteínas que podem coletar energia de luz, com várias rodopsinas como proteína modelo. A. Síntese de proteorodopsina expressando ADAS de E. coli

[0438] As linhas de E. coli que expressam proteorodopsina (PR) são criadas usando o protocolo descrito por Walter et al., PNAS, 2007. Resumidamente, um plasmídeo contendo a variante de PR proteobacteriana-γ de SAR86 em células de E. coli é expresso sob um promotor T7. As células são cultivadas em caldo T e a expressão de PR é induzida com isopropil β-D-tiogalactosídeo 1 mM. Os ADAS são sintetizados a partir de células E. coli contendo PR e células E. coli não contendo PR usando os métodos do Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13, com algum do ADAS purificado sob exposição a fótons de 70 μmol/(m^2 s) luz e alguns purificados no escuro.

[0439] As células de E. coli que expressam PR e genes necessários para a retinal são criadas seguindo uma adaptação do protocolo em Kim et al, Microb Cell Fact, 2012. Resumidamente, o plasmídeo pACYC- RDS no papel é sintetizado comercialmente e transfectado para E. coli quimicamente competentes BL21 (DE3) de acordo com as instruções do fabricante (NEB, protocolo C2527). Resumidamente, as células são descongeladas em gelo lentamente, 1 pg-100 ng de DNA de plasmídeo é adicionado ao tubo de células, as células são agitadas 4-5 vezes, colocadas em gelo por 30 minutos, submetidas a choque térmico a 42˚C por 10 s, colocado em gelo por 5 minutos, SOC é adicionado à mistura e as células são cultivadas por 60 minutos a 37 ˚C. Os ADAS são sintetizados a partir de células E. coli contendo PR e células E. coli não contendo PR usando os métodos do Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13, com algum do ADAS purificado sob exposição a fótons de 70 μmol/(m^2 s) luz e alguns purificados no escuro. B. Comparação de ADAS contendo proteorodopsina e ADAS não contendo proteorodopsina

[0440] A atividade de E. coli contendo e não contendo o PR e cultivada no escuro ou luz é medida usando os protocolos no Exemplo 15. C. Comparação de ADAS contendo proteorodopsina e ADAS contendo proteorodopsina e retinal

[0441] A atividade de E. coli contendo PR com ou sem a retinal e cultivada no escuro ou luz é medida usando os protocolos no Exemplo 15. Exemplo 26. Métodos suplementares para a criação de ADAS de E. coli com ácido nucleico estável e cargas úteis de proteína

[0442] O RNA intracelular estável (por exemplo, miRNAs, siRNAs e aptâmeros de RNA) dentro do ADAS é um passo importante para a criação de novas tecnologias de entrega de RNA, pois os ácidos nucléicos podem ser prontamente degradados por endonucleases no citoplasma. Além disso, ao entrar na célula hospedeira, os moldes de tRNA-RNA são então precisamente separados em um 5 'tRNA e um 3' pré-miRNA após clivagem por tRNase Z celular, que funciona para definir a extremidade 3 'dos tRNAs celulares. Utilizando protocolos desenvolvidos recentemente (RNA. Set 2015; 21(9): 1683–1689.) A TRNase Z pode ser usada para clivar as fusões de RNA-tRNA guiadas. Este exemplo descreve um molde de RNA não codificante derivado de tRNA é expresso em E. Coli como um exemplo ilustrativo, no entanto, outros ácidos nucleicos, proteínas e moléculas também podem ser estabilizados dentro de ADAS usando abordagens baseadas em moldes semelhantes. A. ADAS de E. coli com cargas úteis de RNA recombinante estabilizadas com tRNA

[0443] Resumidamente, ADAS de E. coli são produzidos e purificados usando métodos descritos nos Exemplos 12 e 13. Com base em protocolos desenvolvidos anteriormente, dois tipos de tRNA são usados: humantRNALys3 e E. coli tRNAMet (Nat. Methods, Ponchon 2007). Ambos foram bem caracterizados e expressos de forma recombinante. Em princípio, qualquer RNA estruturado terminado com um motivo de haste pode ser incluído. Estes incluem aptâmeros, lncRNA e ribozimas. Em resumo, é criado um plasmídeo contendo uma sequência de RNA de interesse flanqueada em cada lado por uma inserção de tRNA. Neste exemplo, a codificação de mRNA para GFP é usada.

[0444] Após a síntese de ADAS contendo o construto tRNA-mRNA, mede-se a meia-vida do RNA e da proteína. Resumidamente, as células são transferidas para placas de poços e lisadas usando um tampão de lise em diferentes pontos de tempo e SEQ de RNA é realizada em vários pontos de tempo, incluindo 1 min, 10 min, 50 min, 100 min, 200 min, 500 min, 1000 min, 2000 min e até 1000000 min, e a abundância relativa é usada para avaliar a estabilidade. Além disso, a expressão de GFP é observada nos mesmos pontos de tempo por lise de um número definido de células e medição de fluorescência através de um leitor de placas. Exemplo 27. Aumentar a estabilidade da carga por meio da remoção de ribonucleases de ADAS de E. coli

[0445] RNase E é o iniciador universal de degradação de RNA, e a deleção cromossómica em E. coli interrompe a capacidade de formação de colônias (CFA) de cepa de E. coli. Este exemplo mostra que, ao colocar a RNAse E sob controle de um promotor condicional, pode-se obter estabilidade melhorada da proteína e do RNA. A. Síntese de linhas parentais de E. coli com deleção de RNase E

[0446] A linha parental de E. coli com uma deleção cromossômica de Eco-rne, que codifica para RNase E é gerada pela inserção de um gene Eco-rne transmitido por plasmídeo sob o controle de um promotor araBAD, é usada para permitir que E. coli sintetize RNase E na presença de arabinose. Um método de integração de plasmídeo em E. coli é derivado de protocolos anteriores (Tamura et al. PLoS One, 2017). B. Síntese de ADAS sem de RNase

[0447] ADAS são gerados a partir de linhas de E. coli sem cromossomo Eco-rne. Antes da síntese e purificação de ADAS, conforme descrito nos Exemplos 12 e 13, as linhas parentais são cultivadas em meio livre de arabinose por 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48 horas ou 3, 4, 5, 10, 14 dias para permitir a degradação de RNase E. residual C. Atividade metabólica e índice de estabilidade do mRNA

[0448] ADAS livre de RNase e não modificado são cultivados em caldo LB, e a produção de ATP é medida usando um Seahorse XF (Agilent, ensaio ATP Rate) às 2 h, 12 h, 1d, 7 d e 30 d. ADAS livres de RNase mostram níveis comparáveis de metabolismo aos ADAS não modificados. Ambas as linhas ADAS expressam GFP após a transformação com um plasmídeo contendo GFP. A expressão de GFP é medida usando imagens de fluorescência e os níveis de mRNA são medidos usando RNAseq. D. Inibição de ribonucleases de ADAS de E. coli

[0449] Para inibir a degradação do RNA, que é essencial para a geração e manutenção da função dentro do ADAS de E. coli, as ribonucleases existentes podem ser inibidas. Por isso, inibidores de moléculas pequenas de RNase E são usados. A RNAse E é considerada o iniciador global do decaimento do RNA em E. coli e forma a plataforma para o complexo degradassoma. O terminal N forma a porção catalítica desta enzima e, como tal, pode ser inibido por uma pequena molécula.

[0450] Métodos de rastreio de moléculas pequenas desenvolvidos anteriormente para E. coli intacta (Kime et al., Sci. Rep., 2015) são adaptados para avaliar a inibição de RNAse E em ADAS de E. coli e os melhores candidatos para inibição são testados in vitro. Os métodos de amostra descritos acima, onde o GFP é quantificado ao longo do tempo, são usados para calcular o índice de estabilidade. Exemplo 28. Síntese de um ADAS de B. subtilis com um peptídeo sinal Tat

[0451] Este exemplo descreve ADAS que podem ser usados para secretar peptídeos através de sistemas de secreção semelhantes a canais e ADAS de B. subtilis altamente ativos que são capazes de secretar mais proteínas por longos períodos de tempo. A. Síntese de ADAS de B. subtilis secretando GFP

[0452] ADAS de B. subtilis são sintetizados utilizando métodos modificados (Feucht et al. Microbiology. Jun 2005;151(Pt 6):2053-64.) com "carga" que está marcada para a exportação para o espaço citoplasmático. Alternativamente, ADAS de B. subtilis são criados através de uma mutação divIVA1 direcionada (JH Cha, GC Stewart - Journal of bacteriology, 1997 - Am Soc Microbiology), mas de outra forma coletados, purificados e caracterizados como descrito anteriormente no Exemplo 12 e Exemplo 13. O sinal do sistema de secreção Tat é fundido em uma proteína alvo para induzir a produção e exportação do citoplasma ADAS para o espaço extracelular. Um peptídeo sinal TAT é incorporado em uma proteína fluorescente verde (GFP) é fundido ao peptídeo sinal PhoD Tat e excretado de B. Subtilus usando protocolos modificados descritos anteriormente (Wickner et al. Science 2005, BC Berks, Mol. Microbiol. 22, 393, 1996). O GFP extracelular é medido usando microscopia de fluorescência. B. Síntese de ADAS de B. subtilis altamente ativo

[0453] Os ADAS de B. subtilis altamente ativos são sintetizados por adaptação dos métodos dos Exemplos 20-25, para B. subtilis através do uso de versões de B. subtilis dos genes, promotores e plasmídeos identificados. O plasmídeo GFP fundido com o sinal TAT da parte a) também é transfectado em B. subtilis, levando à secreção de GFP. Os ADAS sintetizados da parte a) e da parte b) são testados quanto à secreção de proteínas em 1, 2,4, 8, 12, 24, 48, 36 e 72 horas. Exemplo 29. ADAS imunomodulador para supressão tumoral

[0454] Este exemplo descreve ADAS altamente ativos que são capazes de conter e entregar cargas que têm um efeito específico no sistema imunológico do hospedeiro. Como um modelo que não é uma modalidade única ou limitante deste conceito, um ADAS de B. Subtilis altamente ativo que secreta dinucleotídeos cíclicos (CDNs) específicos é criado. Em particular, o ADAS secreta especificamente nucleotídeos c-di-AMP bacterianos que envolvem a via STING através do RECON (Controle de REdutase NF-κB) de células de mamíferos (Mol Cell. 2008; 30:167-78).

[0455] Os ADAS de B. subtilis são sintetizados conforme descrito anteriormente no Exemplo 28. Resumidamente, usando ensaios modificados descritos em (MacFarland et al: Immunity. 21 de março de 2017; 46(3): 433-445.), as células mononucleares do sangue periférico humano são expostas a (1E6, 1E7, 1E8, 1E9, 1E10) ADAS de B. Subtilis por concentração de mL por (10, 20, 30, 60, 120, 1200 min). Em seguida, as células são lisadas e o PCR é utilizado para determinar o aumento em genes imunoestimuladores, tal como genes dependentes de IRF3-, IFN- e NF- κB em hPBMCs. Exemplo 30. Síntese de ADAS e ADAS altamente ativo de Pseudomonas putida

[0456] Este exemplo descreve a síntese de ADAS e ADAS altamente ativo de uma expressão de T6SS e bactérias comensais de planta, usando P. putida como um organismo modelo. A. Síntese de ADAS de Pseudomonas putida

[0457] Pseudomonas putida KT2440 é obtido na ATCC e cultivado de acordo com as instruções do fabricante. Um plasmídeo que sobre- expressa P. putida ftsZ sob um promotor pLac-1k-J23107 induzível (Cook et al., J. Ind. Microb. Biotech., 2018) é construído a partir da estrutura pBBR1MCS-2 por uma empresa comercial de geração de vetores. As linhas parentais de ADAS de P. putida são sintetizadas por eletroporação do DNA de plasmídeo nas bactérias seguindo o protocolo descrito em Chen et al, Chin. J. Appl. Env. Bio., 2010. Resumidamente, P. putida KT2440 é cultivado até DO600 de 0,6-0,75, sedimentado a 4˚C, lavado em 3 mmol/L HEPES, eletroporado em um Bio-Rad Gene Pulser ou máquina equivalente, reconstituído com meio SOC e incubado a 30 ˚C. As células são então semeadas em ágar LB canamicina para seleção e cultivadas de acordo com as instruções do fabricante com a adição de IPTG para induzir a formação de ADAS. ADAS são então purificados usando os métodos do Exemplo 13. B. Síntese de ADAS de Pseudomonas putida altamente ativos através da remoção de flagelos e T3SS

[0458] P. putida EM42 e EM383 são obtidos ou outro derivado livre de flagelos de P. putida KT2440 é sintetizado seguindo o procedimento em Martinez-Garcia et al, Microb. Cell. Fact., 2014 e Martinez-Garcia et al, Environ. Microbiol., 2013. Resumidamente, a região 750-bp a montante (TS1) e 816-bp a jusante (TS2) dos genes PP4329 e PP4297 é amplificada por PCR e os fragmentos TS1 e TS2 são ligados por PCR de sobreposição (ver Horton et al., Gene, 1989). O fragmento TS1-TS2 completo foi digerido com EcoRI e BamHI e ligado ao plasmídeo pEMG (GenBank: JF965437.1) para gerar o plasmídeo pEMG- flagelo. O plasmídeo é transformado em E. coli DH5α λpir e eletroporado em P. putida KT2440 preparado com a meganuclease I- SceI sob o promotor 3-metilbenzoato como descrito em Martinez-Garcia e de Lorenzo, Meth. Mol. Bio., 2012. Os co-integrados positivos são selecionados através da amplificação por PCR do fragmento TS1-TS2 e resolvidos através da indução da enzima I-SceI, derivada do plasmídeo pSW-I usando 3- metilbenzoato 15 mM. A cultura é semeada em placas de ágar LB- Ap500 e a deleção é confirmada por PCR.

[0459] ADAS são produzidos a partir da cepa resultante usando os métodos descritos na parte a). C. ADAS expressando elevado T6SS

[0460] O K1 T6SS conforme indicado em Bernal et al, ISME J., 2017 é clonado em um vetor de origem pBBR1 com resistência a amp através da síntese de gene comercial com seu promotor natural e com o promotor natural substituído por um promotor pLac-1k-J23107 (Cook et al., J. Ind. Microb. Biotech., 2018). O plasmídeo é então transfectado em uma linha de P. putida produtora de ADAS usando os métodos descritos acima e cultivado em meio LB contendo ampicilina e canamicina e ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 13. D. Determinando o número de T6SS no ADAS

[0461] Um anticorpo marcado com pontos quânticos contra o trímero VgrG é usado para marcar os sistemas de secreção de T6SS ativos na superfície do ADAS. A imagem é obtida por microscopia confocal e os T6SS ativos são contados manualmente pela presença de pontos pontilhados. A distância média entre T6SS na membrana é calculada e é tratada como a área de superfície coberta por T6SS.

Exemplo 31. ADAS que expressa T6SS como um antimicrobiano e um protetor de planta

[0462] Pseudomonas putida é uma bactéria encontrada em plantas que demonstrou ter atividades protetoras de plantas devido ao ataque de T6SS de potenciais patógenos vegetais. Este exemplo descreve ADAS de P. putida que são capazes de lisar bactérias usando sistemas T6SS usando E. coli como uma bactéria modelo e X. campestris como um patógeno de planta modelo. A. Usando ADAS de Pseudomonas putida para matar Escherichia coli

[0463] ADAS de Pseudomonas putida e ADAS altamente ativo são sintetizados usando os métodos do Exemplo 30. Os ADAS são usados para lisar células de E. coli usando o protocolo adaptado de Bernal et al., ISME J., 2017. Resumidamente, os ensaios de competição são realizados em placas LB. E. coli são cultivadas a uma DO600 de 1 em PBS e misturadas em uma proporção de 1:1 com ADAS de P. putida nas placas. As placas também são cultivadas sem qualquer ADAS de P. putida. As placas são incubadas a 30 °C durante 5 h e as unidades formadoras de colônias são contadas na seleção de antibióticos. B. Usando ADAS de Pseudomonas putida para matar Xanthomonas campestris.

[0464] Os ADAS de Pseudomonas putida são usados para lisar células X. campestris usando o mesmo ensaio como descrito na parte b), com a exceção de que as células X. campestris são cultivadas por 24 horas na placa. O mesmo ensaio é executado para demonstrar que ADAS de P. putida reduz o número de colônias de X. campestris e ADAS altamente ativo reduz mais o número. C. Usando ADAS Pseudomonas putida como um protetor de planta

[0465] ADAS de P. putida são usados para proteger as plantas de danos seguindo o protocolo adaptado de Bernal et al., ISME J., 2017. Resumidamente, os ensaios de competição in planta são realizados por infiltração de bactérias nas folhas de Nicotiana benthamiana. As culturas durante a noite de Xanthomonas campestris são ajustadas para DO600 de 0,1 em PBS. Os ADAS de P. putida são misturados com as bactérias na razão de 1:1. Aproximadamente 100 μL de volume são infiltrados no reverso de uma folha com 1 mês de idade e a área de infiltração é marcada. Após 24 h de incubação em uma câmara de planta (23 °C, 16 h de luz), as unidades formadoras de colônia são determinadas. Uma seção da folha da área de infiltração é cortada, homogeneizada em PBS e subsequentemente diluída em série. As folhas são visualizadas por microscopia de fluorescência. A avaliação da necrose é baseada na coloração das folhas seguindo Katzen et al., J. Bacteriol, 1998 usando mudanças visíveis na cor do tecido da folha, que pode mudar de verde para amarelado (clorose), amarelado para amarronzado e escurecimento da folha (necrose), até o apodrecimento completo da folha em estágios posteriores. Exemplo 32. ADAS de Serratia marcescens como modelo antifúngico ADAS

[0466] S. marcescens é uma bactéria Gram negativa em forma de bastonete que recentemente demonstrou matar células fúngicas por meio da entrega de T6SS dos efetores Tfe1 e Tfe2 (Trunk et al., Nat Microb, 2018). Este exemplo descreve o uso de ADAS de S. marcescens para reduzir a aptidão de fungos. A. Síntese e purificação de ADAS de S. marcescens

[0467] Um plasmídeo contendo um promotor ampR de Pseudomonas rPMP e o gene ftsZ de S. marcescens é introduzido na estrutura de pUC19 com um RBS sintético de uma maneira semelhante à do plasmídeo PQY38 em Yan e Fong, Appl. Microbiol. Biotech., 2017. O plasmídeo é introduzido em S. marcescens Db10 do Caenorhabditis Genetics Center usando eletroporação seguindo os métodos em Yan e Fong, Appl. Microbiol. Biotech., 2017. Resumidamente, as células são lavadas em água fria através de uma centrífuga gelada, ressuspensas em água fria, DNA de plasmídeo é adicionado e a mistura é eletroporada. Em seguida, as células são cultivadas em 1 mL de meio SOC a 30 ˚C por 60 minutos e, em seguida, semeadas em placas de ágar LB amp. As células de S. marcescens com ftsZ são então cultivadas em meio M9, extrato de levedura a 0,1%, glicose a 2% e ampicilina 200 mg/L a 30 °C. ADAS são então purificados usando os métodos no Exemplo 13. B. Demonstrando a capacidade de ADAS de S. marcescens para matar fungos

[0468] A atividade antifúngica é medida usando um ensaio de co- cultura semelhante a um de Trunk et al., Nat Microb, 2018. As linhas parentais, ADAS e células alvo são normalizadas usando densidade ótica. As células alvo e as linhas parentais, ADAS ou E. coli de controle são misturadas em uma razão de volume de 1:1 e 12,5 µL da mistura são colocados em meio SC sólido + glicose a 2%. As culturas são incubadas por 2, 7 e 24 horas, e as células fúngicas sobreviventes são quantificadas por diluição em série e contagens viáveis em meio YPDA suplementado com estreptomicina para remover bactérias e ADAS. As células fúngicas também são visualizadas usando DIC em tempo real para medir o crescimento e a divisão celular. E. coli são usados em co- culturas como um controle negativo. Ambas as linhas parentais de S. marcescens e ADAS são capazes de matar células fúngicas após 7 horas de co-cultura. Exemplo 33. Entrega de proteínas às células epiteliais do intestino humano através de T3SS sobre-expresso

[0469] A capacidade de entregar proteínas intracelulares às células de mamíferos pode permitir uma variedade de aplicações, na terapêutica humana. Este exemplo descreve que a proteína heteróloga pode ser entregue às células epiteliais do intestino humano usando sistemas de secreção ADAS T3. Esta modalidade modelo pode ser aplicada a qualquer número de aplicações em animais e plantas nas quais a proteína intracelular pode ter um efeito marcante no organismo alvo.

[0470] Nesta experiência, as células epiteliais do intestino humano são expostas a várias concentrações de ADAS (1E6, 1E7, 1E8, 1E9, 1E10 ADAS por mL) e o GFP intracelular é medido nas células epiteliais usando microscopia de fluorescência. O número de células positivas para GFP é dividido pelo número total de células para várias condições para calcular a entrega e a eficiência de dosagem.

[0471] As linhas de células de mamíferos Caco-2 são cultivadas de acordo com ATCC. As células são modificadas para expressar GFP truncado (tGFP), conforme descrito por Huang e Bystroff, Biochemistry,

2009. Esta forma truncada de GFP é expressa e dobrada corretamente, mas não é fluorescente até que a fita β ausente seja fornecida. E. Coli e ADAS são produzidos e purificados conforme descrito nos Exemplos 12 e 13, respetivamente. Resumidamente, são cultivados a 37 ˚C em frascos de cultura de tecidos Corning® (T-25, 75, T-150, ou T255, catálogo #430641) com Meio Essencial Minimo Eagles Padrão ATCC (Catálogo No. 30-2003) contendo aminoácidos não essenciais, L- glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM e bicarbonato de sódio 1500 mg/L suplementado com soro fetal bovino a 20%. Para colher células Caco-2 para o ensaio de entrega, as células são lavadas com PBS sem cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e 2-3mL de 0,25% (p/v) de tripsina e soluções de EDTA 0,05 mM são adicionadas à superfície celular por 10 -15 minutos e a atividade enzimática é extinta com 6-8 mL de meio de crescimento completo. Após a colheita, as células são contadas usando um contador de células automatizado (Condessa II, Thermo Fisher) e corantes live/dead (Calceína-live, homodímero de etídio-dead). A. Preparação e purificação de ADAS de E. coli com T3SS de Shigella

SPI-1

[0472] ADAS de E. coli são preparados usando métodos descritos no Exemplo 12. Para aumentar a abundância de T3SS na superfície do ADAS, um plasmídeo que codifica para HilA é introduzido. HilA regula SPI-1 T3SS que é adotado de um protocolo existente (Bajaj et al. Molecular Microbiology (1995) 18(4), 715-727). ADAS são preparados usando métodos descritos no Exemplo 13. T3SS são inspecionados visualmente e contados usando microscopia de imunofluorescência e TEM. Após comparação de ADAS expressando T3SS altamente puro isolado com ADAS expressando T3SS não purificado. B. Fusão de cauda do sistema de secreção de proteína

[0473] Para permitir a secreção de proteínas usando um T3SS funcional, a fita β de GFP é fundida aos primeiros 104 aminoácidos da cauda de secreção T3SS, SopE, usando uma metodologia de projeto de plasmídeo previamente descrita (Evans, et. al. J. Virol., Feb. 2003, p. 2400–2409). O plasmídeo é expresso em E. coli parental e ADAS subsequentes contêm o híbrido SopE-GFP truncado. C. Ensaio de entrega de proteína

[0474] Antes da exposição ao ADAS, as células são cultivadas 1 ou 3 ou 5 dias após a confluência para garantir a maturidade celular reprodutível e polarização. Para cada amostra, ADAS são adicionados à amostra epitelial confluente e incubados a 37 °C por 2 horas. A eficiência da entrega de ADAS é calculada dividindo o número total de células de fluorescência pelo número total de células em cultura e comparada entre as várias condições. Exemplo 34. Métodos suplementares para entrega direcionada de ADAS de E. coli com sistemas T3SS

[0475] A entrega direcionada é importante na entrega de fármacos. Este exemplo descreve o uso de nanocorpos como um agente de direcionamento modelo para ADAS. Os nanocorpos são os menores fragmentos de anticorpos funcionais conhecidos e trabalhos recentes mostraram que estes podem ser expressos na superfície de E. coli (Salema e Fernandez, Microb Biotechnol, 2017). Os nanocorpos de superfície podem se ligar com eficiência às proteínas alvo e podem ser usados para gerar especificidade para tipos de células individuais. A. Síntese de linhas parentais de E. coli contendo nanocorpos EGFR

[0476] As linhas parentais de E. coli são sintetizadas expressando nanocorpos de superfície para o fator de crescimento epidérmico (EGFR), conforme descrito por Salema et al., MAbs, 2016. Resumidamente, a sequência que codifica o nanocorpo para EGFR (TYNPYSRDHYFPRMTTEYDY) é clonada nos sítios do vetor de exibição de E. coli pNeae2, que funde o nanocorpo ao C-terminal do polipeptídeo de intimina Neae permitindo a expressão de superfície. O plasmídeo pNeae2 (CmR) é um derivado do vetor pNeae, codificando os resíduos de Intimina 1-659 (da cepa EHEC O157:H7 EDL933stx-) seguido por E-cauda, o epítopo hexa-histidina (His) e um C-terminal myc-cauda (EQKLISEED).

[0477] As bactérias que transportam plasmídeos com nanocorpo são cultivadas a 30 °C em caldo LB em placas de ágar com o antibiótico melhorado para a seleção de plasmídeo. As placas LB e o meio pré- inóculo antes da indução continham 2% (p/v) de glicose para repressão do promotor lac. As culturas de pré-inoculação são iniciadas a partir de colônias individuais (para clones únicos) ou de uma mistura de clones (no caso de bibliotecas), recém-cultivadas e colhidas de placas, diluídas para uma DO600 inicial de 0,5 e cultivadas durante a noite em condições estáticas. Para indução, as bactérias (correspondendo a uma DO600 de 0,5) são colhidas por centrifugação (4000xg, 5 min) e cultivadas no mesmo meio com 0,05 mM de isopropiltio-β-D- galactosídeo (IPTG), mas sem glicose por 3 h com agitação (160 rpm), a menos que indicado de outra forma.

B. Síntese de ADAS com expressão de nanocorpo EGFR

[0478] Os ADAS são sintetizados a partir dessas linhas parentais conforme descrito no Exemplo 12 e carregados com carga (entrega de proteína e gene para GFP) conforme descrito acima. C. Ensaio de especificidade para ADAS com nanocorpo EGFR

[0479] As linhas de células Caco-2 (adenocarcinoma epitelial colorretal humano) e A-431 (carcinoma epidermoide) são co-cultivadas de acordo com protocolos de cultura de células padrão fornecidos pelo fabricante. As co-culturas são então incubadas com linhas parentais modificadas ou ADAS carregando carga (GFP), conforme descrito acima. FACS é usado para separar células A-431 e Caco-2 e para quantificar a percentagem de células alvo que expressam GFP. A microscopia fluorescente também é usada para quantificar os níveis de fluorescência em células individuais para medir o número de subunidades de proteína injetadas ou a quantidade de expressão de proteína devido à transfecção. A microscopia também é usada para quantificar a expressão de GFP no tipo de célula com base na morfologia celular para diferenciar entre as células Caco-2 e A-431, juntamente com a imunocitoquímica para marcar marcadores específicos de células. Exemplo 35. Síntese de ADAS de Xanthomonas citri para entrega de T3SS às plantas

[0480] Este exemplo descreve a criação de ADAS a partir de bactérias patogênicas de plantas e o uso de suas funções de entrega natural com Xanthomonas citri como organismo modelo. T3SS encontrado em patógenos de plantas constitui a base para um sistema eficiente de entrega de proteínas às células de planta. Uma vez que os efetores de T3SS de X. citri não são bem caracterizados, um ensaio para medir a formação de biofilme é usado para avaliar a capacidade de T3SS em ADAS de X. citri. Os efetores podem então ser substituídos por proteínas repórter (por exemplo, GFP) para avaliar a capacidade de transferir proteínas expressas de forma heteróloga via T3SS. A. Síntese de X. citri deficiente em T3SS

[0481] T3SS é necessário em X. citri para a formação de biofilme durante a infeção e aumenta a virulência. Um X. citri deficiente em T3SS é criado pela criação de um mutante com deficiência no operon hrpB que codifica as proteínas principais T3SS (descritas por Dunger et al, Plant Pathol, 2005). Os iniciadores usados são 5′‐ GAACTGGGCGGGAAGAACGACGAG‐3′ e 5′‐ GCCGCCGCCGAAGAAGTGATG‐3′. O DNA genômico (100 ng) é utilizado como molde numa mistura de reação de 50‐µL. O PCR é realizado em termociclador Eppendorf, com desnaturação a 94 °C por 5 min, seguida de 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 62 °C por 40 s e 72 °C por 1 min, com um final extensão a 72 °C por 5 min. Os produtos de PCR amplificados são analisados em géis de agarose a 0,9%. As hibridações Southern blot são realizadas utilizando fragmentos de DNA mutantes para Xachrp produzidos por digestão com BamHI, fracionados por electroforese e depois transferidos para membranas Hybond-N. Os protocolos de hibridização e detecção são realizados usando produtos de PCR amplificados hrp840bp marcados com [α-32P]dATP.

[0482] O mutante hrpB é construído por integração de plasmídeo. O produto amplificado é clonado no vetor suicida pK19mobGII digerido com SmaI, rendendo pKmobB e pKmobF, respetivamente. Os plasmídeos são transferidos para X. axonopodis pv. citri por acasalamento entre cepa de E.coli S17-1 de mobilização da gama de hospedeiro ampla. As misturas bacterianas são colocadas sobre membranas Hybond-C, colocadas em nutriente de agar e incubadas durante 48 h a 28 °C. As membranas são então lavadas e as bactérias transferidas para meio seletivo. Cepas mutantes de Xanthomonas axonopodis pv. citri são selecionadas pelo vetor que codifica a resistência a antibióticos (Km) e verificadas por hibridação de Southern. B. Síntese de ADAS de X. citri

[0483] Para criar ADAS de X. citri, X. citri (mutantes hrpB e não transformados) são transfectados com um plasmídeo que sobre- expressa a proteína ftsZ sob o promotor de arabinose (Lacerda et al, Plasmid, 2017), semelhante ao Exemplo 12. A sequência do gene ftsZ é de Kopacz et al., MicrobiologyOpen, 2018. As sequências de iniciadores utilizadas são: direto‐

GAGCCCATGGCACATTTCGAACTGATTGAAAAAATGGCTCCCAAC GCGGTCATCAAGG; reverso‐ AGTTCATATGCGACGCAGCCGACGCTCCTCAG. Os plasmídeos são sintetizados comercialmente pela Thermo Fisher. A transfecção é realizada usando o processo descrito acima. Com o tempo, as colônias selecionadas proliferam e produzem ADAS continuamente. C. Capacidade de ADAS de X. citri de formar biofilme em Citrus sinensis

[0484] T3SS é essencial para a formação de biofilme por ADAS de X. citri. de mutante hrpB e cepas normais são usados em um ensaio de infeção em plantas C. sinensis. Todas as plantas são cultivadas em uma câmara de crescimento com luz incandescente a 28 °C com fotoperíodo de 16 h. Os ADAS são purificados para uma DO600 de 1 e ressuspensos em MgCl2 10 mM a 104 a 107 ufc/mL. Estes são infiltrados nas folhas com seringas sem agulha. Cancros são contados a partir de 20 folhas de laranja inoculadas com as diferentes cepas e as áreas das folhas contadas são medidas a partir de imagens digitalizadas usando o software Adobe Photoshop. ADAS de X. citri que expressa T3SS mostram significativamente mais formação de cancro do que aqueles de linhas parentais deficientes em T3SS. Exemplo 36. Síntese de ADAS de Agrobacterium como agente de transformação de plantas usando T4SS

[0485] Este exemplo descreve a criação de ADAS que podem entregar cargas úteis, tal como um plasmídeo de DNA modelo, com T4SS. Agrobacterium tumefaciens são usados como uma forma de transformar plantas usando seus sistemas T4SS nativos. Isso permite que a agrobacterium não replicativa seja implantada em uma modalidade de pulverização em grandes campos sem risco de fuga. A. Transfecção de Agrobacterium com um plasmídeo

[0486] Para a transfecção de Nicotiana Benthamiana, plasmídeos com genes de resistência a antibióticos são introduzidos na cepa de Agrobacterium GV3101 usando o método de congelamento- descongelamento e materiais conforme descrito no Agrobacterium Transformation Kit (MPbio). Resumidamente, Agrobacterium é cultivada até um DO600 de 1,0 a 2,0, ressuspensa em uma solução de transformação, misturada com o DNA de plasmídeo, submersa em nitrogênio líquido por 1 minuto, submersa em banho-maria a 30 °C por 5 minutos e regenerada em meio Luria-Bertani com o marcador de seleção no plasmídeo.

[0487] Para transfecção de tomate, os plasmídeos com genes de resistência a antibióticos são introduzidos nas células da cepa de Agrobacterium LBA4404 ElectroMAX (Thermo Fisher) usando os métodos descritos de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o agrobacterium é descongelado em gelo úmido e misturado com DNA de plasmídeo purificado livre de sais, etanol e outros contaminantes. A mistura é eletroporada, imediatamente misturada com meio à temperatura ambiente e colocado a crescer novamente por 3 horas.

[0488] As células de qualquer protocolo são então diluídas e semeadas em ágar com os antibióticos necessários para selecionar. No dia seguinte, ou quando as colônias são visíveis, elas são selecionadas para sequenciamento. Após a confirmação da identidade do plasmídeo, as colônias adequadas são crescidas durante a noite com agitação em meio de cultura (indicado pelas instruções do fabricante) contendo os marcadores de seleção necessários. B. Síntese de ADAS de Agrobacterium

[0489] Um plasmídeo contendo o agrobacterium ftsZ em uma estrutura pSRKGm (Khan et al, Appl. Environ. Microbiol., 2008) é sintetizado comercialmente. É então transfectado em agrobacterium usando os métodos descritos na parte a) para formar linhas parentais ADAS de A. tumefaciens. A linha parental é então cultivada de acordo com as instruções do fabricante com a adição de IPTG e ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 15. C. Síntese de ADAS grandes de Agrobacterium

[0490] Um plasmídeo contendo a exonuclease V em uma estrutura pSRKGm (Khan et al, Appl. Environ. Microbiol., 2008) é sintetizado comercialmente. É então transfectado em agrobacterium usando os métodos descritos na parte a) para formar linhas parentais ADAS de A. tumefaciens. A linha parental é então cultivada de acordo com as instruções do fabricante com a adição de IPTG e ADAS são purificados usando os métodos do Exemplo 13. D. Síntese de ADAS de A. tumefaciens com carga útil de GFP

[0491] O plasmídeo pLSLGFP.R referenciado em Baltes et al., The Plant Cell, 2014 é usado. O plasmídeo pLSLGFP.R é transfectado usando os métodos mostrados na parte a). ADAS de A. tumefaciens são sintetizados usando os métodos na parte b) ou c). E. Transfecção de plantas com ADAS de agrobacterium com carga útil de GFP

[0492] Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var Xanthi) são cultivadas a 21 °C com 60% de umidade sob um ciclo de 16 h de luz e 8 h de escuridão. As folhas (folhas superiores totalmente expandidas) de plantas de tabaco com 4 a 6 semanas de idade são usadas para a transformação de ADAS. Uma folha por planta é infiltrada. Folhas de plantas de tabaco são infiltradas com Agrobacterium usando uma seringa de 1 mL. Imediatamente após a infiltração, as plantas são regadas e cobertas com uma cúpula de plástico para manter a umidade elevada. As cúpulas de plástico são removidas ∼ 24 horas após a infiltração. As plantas são fotografadas com um leitor fluorescente e a percentagem de folha com GFP visível é medida. Exemplo 37. Medindo a eficiência da secreção de ADAS

[0493] Para medir a eficiência da secreção de ADAS, mede-se a capacidade de sintetizar e secretar proteínas expressas de forma endógena e heteróloga. A. Linhas parentais de E. coli que sintetizam GFP

[0494] As linhas de E. coli contendo vetores portadores de GFP e resistência à ampicilina são encomendadas à ATCC (ATCC® 25922GFP™) e cultivadas de acordo com as instruções do fabricante. B. Capacidade do ADAS de sintetizar moléculas

[0495] ADAS são gerados a partir de linhas parentais de E. coli que expressam GFP, bem como de E. coli nativa. As medições fluorescentes são feitas a partir de linhas parentais de E. coli que expressam GFP como um controle positivo e usadas como linha de base para medir a intensidade de GFP de ADAS. Os ADAS são sintetizados de acordo com o Exemplo 12, plaqueados em uma placa de 96 poços e a fluorescência é medida usando um leitor de placas. Uma vez que o ADAS não precisa sintetizar proteínas necessárias para o crescimento ou divisão, ambos os ADAS gerados são mais eficientes na síntese de proteínas e exibem maior intensidade de GFP em comparação com as linhas parentais. Para medir a intensidade em um nível celular, linhas parentais de E. coli e ADAS são fixados e montados em lâminas de vidro usando protocolos de preparação de células padrão. Estas são fotografadas usando um microscópio confocal com imagens de fluorescência. Essas imagens são usadas para medir a intensidade fluorescente por unidade quadrada de área e são usadas para comparação direta com as linhas principais. C. Capacidade do ADAS de secretar moléculas

[0496] E. coli usa secreção de lipase mediada por T1SS para facilitar a infeção. T1SS contém transportadores ABC que reconhecem sequências C-terminais específicas na proteína secretada. As linhas parentais de E. coli são geradas expressando T1SS nativa juntamente com lipases endógenas, bem como outra linha transfectada com um plasmídeo contendo GFP fundido com a sequência C-terminal para transporte, conforme descrito por Chung et al., Microb Cell Fact, 2009.

[0497] Resumidamente, os domínios do transportador ABC da lipase (LARDs) são projetados para a secreção de proteínas de fusão. Os LARDs incluíram quatro repetições ricas em glicina compreendendo uma estrutura de rolo β e são adicionados ao terminal C das proteínas de teste. Um ligante Pro-Gly ou um sítio Fator Xa é adicionado entre as proteínas de fusão e LARDs. Antes que a secreção da proteína de fusão GFP seja analisada, a expressão das proteínas de fusão GFP é verificada. Estas proteínas são expressas em E. coli e seus tamanhos esperados são confirmados por Western blotting (Rockland Inc., PA, catálogo #KCA215). Além disso, a fluorescência de GFP é demonstrada. Colônias representativas de E. coli expressando essas proteínas são vistas sob luz ultravioleta (UV). O fenótipo secretor pode ser rastreado por meio da atividade da lipase. E. coli é cultivada em agar de tributilestanho para detectar a secreção de proteínas de fusão TliA. Quando as proteínas de fusão GFP também são detectadas com anticorpo contra GFP, as mesmas bandas detectadas pelo anticorpo contra LARD são detectadas na célula e no sobrenadante.

[0498] Métodos adaptados de Chung et al. também são usados para medir a secreção e são descritos abaixo. ADAS são gerados a partir de linhas parentais de E. coli delineadas no Exemplo 12.

[0499] Para medir a secreção de lipase por ADAS, os ADAS são semeados em um meio sólido (LAT: caldo LB, 1,5% Bacto Agar, 0,5% tributilestanho). A lipase secretada faz com que um halo se desenvolva ao redor da colônia como um fenótipo típico. ADAS desenvolve halos mais rápido do que as linhas parentais. Além disso, a atividade da lipase é medida espectrofotometricamente pela adição de palmitato de p- nitrofenil (pNPP) como substrato dissolvido em etanol e Tris-HCL. 50 μL de sobrenadante de ADAS e culturas de linha parental são adicionados a 200 μL do substrato e a absorbância de 420 nm é medida usando um leitor de placas. A atividade é medida pelo aumento da densidade ótica.

[0500] Uma vez que as lipases são proteínas expressas endogenamente, a GFP é usada para medir a secreção de proteínas expressas de forma heteróloga. ADAS e linhas parentais são cultivadas em caldo LB e o sobrenadante do caldo é coletado para medir a expressão de GFP. A imunotransferência padrão (Rockland Inc., PA, catálogo #KCA215) é usada de acordo com as instruções do fabricante com um anticorpo específico de GFP para medir a secreção de GFP. Exemplo 38. ADAS contendo nanopartículas não em forma de haste (Magnetospirillum magneticum)

[0501] Este exemplo descreve que o ADAS pode ser sintetizado a partir de bactérias não em forma de bastonete e pode conter estruturas maiores, como nanopartículas. A. Preparação de ADAS de M. magneticum

[0502] Para criar ADAS, M. Magneticum são transfectadas com um plasmídeo que sobre-expressa proteína FtsZ (Q2W8K6_MAGSA) sob o promotor de T7. Os plasmídeos são sintetizados comercialmente pela Thermo Fisher. A transfecção é realizada usando processos de transfecção de bactérias padrão (ver Thermo Fisher Molecular Biology Handbook). Em suma, as células competentes são semeadas em placas de ágar à temperatura ambiente. 0,5-2 ng/mL de DNA são adicionados às células competentes em um frasco e incubados por 20- 30 minutos. Cada tubo é então submetido a choque térmico, colocando o tubo em banho-maria a 42 ˚C por 30-60 segundos para criar poros transitórios na superfície da célula. As células são então plaqueadas em géis de ágar que foram pré-carregados com antibiótico seletivo e cultivadas durante a noite. Apenas as bactérias que foram transfectadas com o plasmídeo sobrevivem. Uma única colônia é colhida e cultivada a 37 ˚C com agitação contínua a 120 rpm em meio LB contendo 50-100 µg/mL de ampicilina. Com o tempo, as colônias selecionadas proliferam e produzem ADAS continuamente. Alternativamente, um protocolo semelhante ao usado no Exemplo 14 é usado para preparar ADAS grande.

[0503] Além disso, a deleção de um gene semelhante a ftsZ resulta na produção de magnetossomos de magnetita superparamagnética nessas bactérias (Ding et al., J Bacteriol., 2010). B. Caracterização da retenção de morfologia por ADAS de M. Magneticum

[0504] A morfologia dos magnetossomos de ADAS é analisada usando TEM conforme descrito por Wang et al., Front Microbiol., 2013. Resumidamente, 20 μL de células são colocadas em uma grade TEM de cobre coberta com filme formvar revestido de carbono por 2 h, em seguida, lavadas duas vezes com água destilada esterilizada e secas ao ar. Os tamanhos do magnetossomo são definidos como (comprimento + largura)/2, e os fatores de forma como largura/comprimento medindo micrografias TEM. C. Demonstração do magnetismo de ADAS de M. Magneticum

[0505] Para caracterizar as propriedades magnéticas de ADAS de M. Magneticum, um protocolo modificado a partir de Ding et al., J Bacteriol., 2010 é usado. Resumidamente, as amostras são liofilizadas e as medições magnéticas de baixa temperatura são feitas usando um magnetômetro Quantum Design MPMS XL-5 (sensibilidade, 5,0 × 10−10 Am2). Desmagnetização térmica de remanência adquirido em um campo de 2.5 T a 5 K (daqui em diante chamado SIRM5K_2.5T) após dois pré-tratamentos é medido a partir de 5 K a 300 K. O primeiro pré-tratamento é o resfriamento da amostra de 300 K a 5 K em um campo zero (campo zero resfriado [ZFC]), e o segundo é o resfriamento de 300 K a 5 K em um campo 2,5-T (campo resfriado [FC]). A temperatura de transição de Verwey (Tv) é definida como a temperatura correspondente à derivada máxima de primeira ordem dM/dT da curva FC. As curvas de reversão de primeira ordem de temperatura ambiente (FORCs) são medidas em um magnetômetro de gradiente alternado (sensibilidade, 1,0 × 10-11 Am2; MicroMag modelo 2900). Os diagramas FORC são calculados usando o software FORCinel versão 1.05, com um fator de suavização (SF) de 2. Os diagramas FORC fornecem informações sobre o estado do domínio, coercividade e interação magnetostática de cristais magnéticos. Exemplo 39. ADAS ambientalmente responsivo

[0506] As operações lógicas baseadas em portas lógicas booleanas podem ser codificadas em redes reguladoras de genes para permitir que as células integrem ou diferenciem entre diferentes sinais ambientais e celulares e respondam de acordo. Circuitos lógicos genéticos personalizados podem ser projetados para conectar vários sensores e atuadores celulares que não são encontrados nas células nativas. Essas células modificadas podem ser programadas para gerar os resultados desejados em resposta a entradas específicas, intra ou extracelularmente. Apesar de algumas desvantagens, como a não modularidade dos circuitos genéticos e as limitações do chassi do hospedeiro, eles são extremamente úteis em organismos projetados e a biblioteca de circuitos lógicos genéticos está atualmente sendo expandida. Vários desses circuitos foram descritos em E. coli, que são incorporados em ADAS de E. coli.

[0507] Esses circuitos formam a base para o ADAS ambientalmente responsivo, que pode produzir uma saída ajustável em resposta à entrada (por exemplo, metabólitos, pH, calor, luz, ligantes externos). Eles são projetados com portas AND para responder à presença de várias entradas ou com portas OR para responder a qualquer uma das entradas codificadas. Este repertório pode ser expandido para incluir outras portas lógicas como NOR, NAND, XOR etc. A. Síntese de ADAS de E. coli com portas AND/OR

[0508] P. Syringae contém um sistema regulador para a secreção do Tipo III, denominado sistema hrpR/hrpS, que forma uma porta AND que regula rigidamente a expressão de T3SS. A expressão de ambas as proteínas é necessária para a produção do sistema T3SS. A construção do plasmídeo e a manipulação do DNA são realizadas usando técnicas de biologia molecular padrão, e a construção da porta AND é modificada a partir do protocolo descrito por Wang et al., Nat Commun., 2011. Resumidamente, os plasmídeos são construídos contendo a) o promotor Plac indutível por IPTG e a porção hrpR da porta AND, e b) o promotor pL induzido por calor (do fago lambda que é geralmente suprimido por uma proteína termolábil) e a porção hrpS da porta AND. A saída é a expressão da proteína GFP, que contém o promotor T3SS e é expressa quando hrpR e hrpR são expressos.

[0509] A construção de plasmídeo e as manipulações de DNA são realizadas seguindo técnicas padrão de biologia molecular. Os genes HRPR e hrpS promotores são sintetizados por GENEART seguindo a BioBrick padrão. O plasmídeo pAPT110 (p15A ori, Kanr) contendo Plac induzível por IPTG é usado para caracterização e abrigar hrpR (XbaI/KpnI) da porta AND. Obtém-se o plasmídeo pBAD18-Cm (pBR322 ori, Cmr) contendo o promotor pL indutível por calor que abriga hrpS da porta AND. pSB3K3 (p15A ori, Kanr) é usado para clonar e caracterizar o promotor Plux induzível por AHL sintético (BBa_F2620) que é usado posteriormente para conduzir hrpR (XbaI/PstI). As várias sequências para cada construto de gene são introduzidas por amplificação por PCR (usando PfuTurbo DNA polimerase de Stratagene e um termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler) com iniciadores contendo o RBS correspondente e sítios de restrição apropriados. Alternativamente, todas os construtos são sintetizados comercialmente. Todas os construtos são verificados por sequenciamento de DNA (Eurofins MWG Operon) antes de seu uso em cepas de células alvo.

[0510] Todas as experiências de caracterização são feitas em meio mínimo M9 (11,28 g de sais de M9/l, cloridrato de tiamina 1 mM, 0,2% (p/v) de casaminoácidos, MgSO4 2 mM, CaCl2 0,1 mM), suplementado com fonte de carbono apropriada. São usados dois meios M9 com diferentes fontes de carbono: M9-glicerol (0,4% (v/v) de glicerol) e M9- glicose (0,01% (v/v) de glicose). As concentrações de antibióticos usadas são 25 μg/mL para canamicina, 25 μg mL−1 para cloranfenicol e 25 μg/mL para ampicilina. As células inoculadas de colônias únicas em placas recentemente semeadas são cultivadas durante a noite em 4 mL de M9 em tubos Falcon de 14 mL a 37 °C com agitação (200 rpm). As culturas durante a noite são diluídas em meio M9 pré-aquecido a DO600 = 0,05 para as culturas do dia, que são induzidas e cultivadas por 5 h a 30 °C antes da análise, a menos que indicado de outra forma. Para o ensaio de fluorescência por fluorometria, as culturas diluídas são carregadas em uma microplaca de 96 poços (Bio-Greiner, chaminé preta, fundo plano transparente) e induzidas com 5 μL (para indução de entrada única) ou 10 μL (para indução de entrada dupla) de indutores de concentrações variáveis para um volume final de 200 μL por poço por uma pipeta multicanal.

[0511] Para manipular uma porta OR, é usado o sistema descrito por Rosado et al., PLoS Genetics, 2018. Em primeiro lugar, é construído um mRNA cis-reprimido que codifica para RFP sob um promotor constitutivo. A repressão é removida na presença de sRNA RAJ11. Os plasmídeos são sintetizados contendo o promotor PLac indutível por IPTG e o promotor pL induzido por calor, sendo que ambos induzem a expressão de RAJ11 sRNA. A saída é a expressão RFP, que é vista em resposta a qualquer uma das entradas.

[0512] Promotores sintéticos baseados em PL regulados pelos fatores de transcrição LacI e pL são usados como elementos para detectar os sinais de entrada (IPTG e calor). As sequências riborregulatórias (sRNAs e 5 UTRs) dos sistemas RAJ11 são obtidas em trabalhos anteriores (Rodrigo et al., PNAS, 2012). As várias sequências para cada construto de gene são introduzidas por amplificação por PCR (usando PfuTurbo DNA polimerase de Stratagene e um termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler) com iniciadores contendo o RBS correspondente e sítios de restrição apropriados. Todas os construtos são verificados por sequenciamento de DNA (Eurofins MWG Operon) antes de seu uso em cepas de células alvo.

[0513] O meio LB é usado para culturas durante a noite, enquanto o meio mínimo M9 (1x sais M9, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,4% de glicose, 0,05% de casaminoácidos e 0,05% de tiamina) para culturas de caracterização. A ampicilina e a canamicina são utilizadas como antibióticos na concentração de 50 μg/mL.

[0514] As culturas de GFP e RFP são testadas em um fluorômetro (Perkin Elmer Victor X5) para medir a absorbância (filtro de absorbância de 600 nm), fluorescência verde (filtro de excitação 485/14 nm, filtro de emissão 535/25 nm) e fluorescência vermelha (filtro de excitação 570/8 nm, filtro de emissão 610/10 nm). Os valores médios de base de absorbância e fluorescência, correspondendo ao meio mínimo M9, são subtraídos para corrigir as leituras. A fluorescência normalizada é calculada como a razão de fluorescência e absorbância. O valor médio da fluorescência normalizada correspondente às células transformadas com plasmídeos de controle é então subtraído para obter uma estimativa final de expressão.

[0515] Essas portas são sistemas modelo e podem ser modificadas para serem ativadas com qualquer entrada, incluindo outros produtos químicos, contato celular, pH e luz. B. Geração de ADAS com portas AND/OR

[0516] ADAS são gerados de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13. C. As portas lógicas são funcionais no ADAS

[0517] Conforme descrito anteriormente, o hrpR/hrpS requer ambas as entradas para gerar o produto efetivamente criando uma porta lógica AND. Os ADAS de E. coli estão sujeitos a quatro condições: 1. Sem IPTG/sem calor, 2. ITPG/ sem calor, 3. Sem IPTG/calor, e 4. ITPG/calor. Apenas a condição 4, em que calor e IPTG estão presentes, causará a expressão de hrpR/hrpS, o que leva à expressão de GFP.

[0518] A expressão de GFP pode ser potencialmente modulada alterando a concentração de IPTG e a duração da exposição ao estímulo. ADAS de E. coli expostos a diferentes condições são carregados em uma placa de 96 poços, e um leitor de placa fluorescente é usado para quantificar a expressão de GFP em relação a diferentes condições. Experiências duplo-cego confirmam que a presença de GFP indica a presença de IPTG e calor, formando a base para um sistema que responde a estímulos. Exemplo 40. ADAS eliminador de metais pesados de E. coli e extremófilos

[0519] Os metais pesados representam um risco ambiental e para a saúde e muitas vezes são difíceis de remover de uma forma eficiente e não invasiva. As bactérias podem ser manipuladas para eliminar metais pesados, tal como o mercúrio, usando a expressão de proteínas como MerR, que é uma proteína metalorreguladora com alta afinidade e seletividade para o mercúrio. A. Síntese de linhas parentais de E. coli expressando MerR

[0520] As linhas parentais de E. coli são sintetizadas usando métodos descritos por Bae et al., App Environ Microbiol, 2003. Resumidamente, MerR é fundido com uma proteína de nucleação de gelo (INP) para expressão de superfície. Uma cauda de hexa-histidina é adicionada ao terminal C da proteína de fusão para confirmar a expressão.

[0521] Resumidamente, a fusão INP-MerR é construída da seguinte forma. O fragmento merR é amplificado por PCR a partir do plasmídeo pT7KB com os iniciadores merR1(5′ CCGGGATCCTATGGAAAACAATTTGGAGA 3′) e merR2 (5′ CAGCTGCAGCCCTAAGGCATAGCCGAACC 3′). O fragmento amplificado é digerido com BamHI e PstI, purificado em gel e subclonado em um pUNI digerido de forma semelhante, que contém um fragmento EcoRI-BamHI INP inserido em pUC18Not, para gerar pUNIM. O construto resultante permite a expressão de MerR na superfície de E. coli.

[0522] Para investigar a localização na superfície de Merr, uma cauda de hexa-histidina é adicionada à parte do terminal C da fusão INP-MerR. O merR fragmento foi reamplificado com um novo iniciador inverso, merR3 (5′

ATTCTGCAGCTAATGATGATGGTGGTGGTGATAAGGCATAGCCGAA CCTGCCAAGCTT 3′), que codifica para seis histidinas no terminal C. O plasmídeo resultante, pUNIMH, que codifica para a fusão INP-MerR-H6, é preparado.

[0523] A eliminação de mercúrio é medida pelo crescimento dos clones bacterianos junto com E. coli não transformada como um controle em caldo LB na presença de HgCl2 nas concentrações de 0, 5, 10, 20,

40, 80, 100, 120, 140 e 160 μM. A absorbância é medida a 600 nm para cada clone bacteriano após 16 e 120 horas de incubação para determinar o crescimento e sua resistência relativa ao mercúrio. B. Síntese e purificação de ADAS de E. coli

[0524] ADAS são gerados de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 12 e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 13. C. Eliminação de mercúrio por ADAS de E. coli

[0525] ADAS de E. coli são incubados por 16 e 120 horas em caldo LB contendo HgCl2 nas concentrações de 0, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140 e 160 μM. Os níveis residuais de mercúrio são testados usando ensaios projetados para detectar mercúrio em níveis extremamente baixos (por exemplo, tira quelante projetada por Brummer et al., Bioorg. Med. Chem., 2001) Exemplo 41. Captação e metabolismo de lactose por ADAS de E. coli

[0526] A absorção de lactose pela E. coli ocorre por meio da proteína beta-galactosídeo permease ligada à membrana, que permite o transporte de lactose e outros beta-galactosídeos para o interior da célula. O transporte da molécula de açúcar é acompanhado pelo co- transporte de um próton, que permite o ensaio de captação usando corantes sensíveis ao pH. A. Síntese de linhas parentais de E. coli expressando beta- galactosidase permease

[0527] As linhas parentais de E. coli são sintetizadas usando um caldo contendo apenas lactose como fonte de açúcar. E. coli contém o sistema operon lac para captação e utilização de lactose como uma fonte de açúcar na ausência de açúcares preferidos. A remoção dos açúcares preferidos induz a expressão das proteínas envolvidas na absorção e metabolismo da lactose. Uma vez que a captação é através de um transportador ligado à membrana, a indução desse sistema é necessária para aumentar a expressão do transportador na linha parental´, o que determina parcialmente a expressão no ADAS. Adicionalmente, plasmídeos contendo o sistema operon lac são introduzidos em ADAS de E. coli para expressão do transportador. B. Absorção de lactose por ADAS de E. coli

[0528] Os ADAS de E. coli são sintetizados e purificados conforme descrito no Exemplo 12 e 13. A absorção de lactose por ADAS de E. coli é medida usando um ensaio sensível ao pH. Conforme descrito por Prabhala et al., FEBS Letters, 2014, o corante piranina sensível ao pH é usado para medir a absorção de lactose. Resumidamente, ADAS de E. coli são peletizados e lavados pelo menos três vezes com solução de Krebs não tamponada contendo 140 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mM de MgSO4, 0,3 mM de piranina e concentrações variáveis de lactose (1 mM - 5 mM), e ressuspensos. O pH da suspensão é cuidadosamente ajustado para 6,5 enquanto o nitrogênio é borbulhado através da suspensão por 5 min e 30 mL de parafina líquida são adicionados acima da suspensão de células para evitar mudanças no pH como resultado da dissolução do dióxido de carbono. A suspensão de células é transferida diretamente para as placas de ensaio para medições de fluorescência (usando um fluorímetro em um comprimento de onda de excitação de 455 nm e comprimento de onda de emissão de 509 nm). as experiências de controle são realizadas usando células de E. coli transformadas vazias como controles negativos e as linhas parentais como controles positivos. C. ADAS de E. coli que convertem lactose em glicose e galactose

[0529] Na ausência de glicose, a E. coli usa o operon bacteriano lac para usar a lactose como fonte de açúcar. Os operons bacterianos são transcritos policistrônicos que são capazes de produzir proteínas múltiplas a partir de um transcrito de mRNA, que são lacZ, lacY e lacA no caso do operon lac. Os produtos gênicos de lacZ, lacY e lacA são beta-galactosidase, que cliva a lactose em glicose e galactose, beta- galactosídeo permease, que permite o transporte de lactose para a célula, e galactosídeo acetiltransferase, que é uma enzima que transfere um grupo acetil de acetil-CoA para galactosídeos, glicosídeos e lactosídeos, respetivamente. A conversão da lactose em glicose e galactose é mediada pela enzima beta-galactosidase, a função desta enzima pode ser medida diretamente usando ensaios de atividade enzimática. D. Síntese e purificação de ADAS de E. coli

[0530] Os ADAS de E. coli são sintetizados e purificados conforme descrito no Exemplo 12 e 13. A captação de lactose é avaliada em ADAS de E. Coli na ausência de glicose. E. Conversão de lactose em glicose e galactose por ADAS de E. coli

[0531] Para avaliar a atividade da enzima beta-galactosídeo permease, ADAS de E. coli são coletados e primeiro lisados usando um tampão de lise com inibidores de protease para prevenir a degradação de proteínas, por exemplo, conforme descrito pelo protocolo EMBL.

[0532] A atividade desta enzima é medida utilizando um kit disponível comercialmente a partir de ThermoFisher (Catálogo # K145501) usando as instruções do fabricante. Resumidamente, a beta-galactosidase catalisa a hidrólise de β-galactosídeos, como orto-nitrofenil-D-galactopiranosídeo (ONPG). A hidrólise do ONPG no ânion ONP produz uma cor amarela brilhante. A atividade β-galactosidase da solução é quantificada usando um espectrofotômetro ou um leitor de microplaca para determinar a quantidade de substrato convertido a 420 nm.

[0533] As linhas parentais de E. coli são usadas como controle positivo. A capacidade de ADAS de E. coli para quebrar a lactose será determinada pelo índice de conversão de lactose (L), onde L = (atividade da enzima em ADAS de E. coli)/(atividade da enzima na linha parental) x100

Exemplo 42. ADAS de E. coli expressando PETase para degradação de plástico

[0534] Ideonella sakaiensis é uma bactéria isolada de fora de uma instalação de reciclagem de garrafas que pode quebrar e metabolizar um plástico comum, poli-(teraftalato de etileno) ou PET (Yoshida et al., Science, 2016). Ela secreta a enzima PETase para quebrar o polímero em monômero. ADAS de E. Coli expressando PETase de I. sakaiensis são capazes de degradar o PET de plástico amplamente usado (~ 3500 milhões de libras de garrafas PET sozinhas acabam como aterro sanitário nos EUA anualmente). A. Transformação de E. coli para expressar PETase

[0535] As linhas parentais de E. coli ADAS que sintetizam PETase são sintetizadas usando o protocolo descrito por Han et al., Nat. Commun., 2017. Resumidamente, a PETase de Ideonella sakaiensis (número de acesso do GenBank: GAP38373.1) sem os 29 aminoácidos do terminal N é clonada e ligada ao vetor pET32a comercialmente. O plasmídeo pET32a-PETase, de tipo selvagem ou variantes, é transformado em células de E. coli BL21trxB (DE3) que são cultivadas em meio LB a 37 °C para uma DO600 de ~0,8 e, em seguida, induzido por 0,6 mM de isopropil β-d-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a 16 °C por 24 h. As linhagens parentais são incubadas com filmes PET (descritos abaixo em c) para confirmar a atividade da PETase. B. Síntese e purificação de ADAS de E. coli

[0536] Os ADAS de E. coli são sintetizados e purificados conforme descrito no Exemplo 12 e 13. A captação de lactose é avaliada em ADAS de E. Coli na ausência de glicose. C. Usando PETase expressando ADAS de E. coli para degradar PET

[0537] Ideonella sakaiensis 201-F6 é obtida da BCRC e cultivada de acordo com as instruções do fabricante. Isso serve como um controle positivo para medir a atividade de E. coli expressando PETase.

[0538] A capacidade de degradar PET é medida usando o protocolo descrito por Yoshida et al., Science, 2016. Resumidamente, amostras cultivadas de I. sakaiensis e E. coli ADAS são suspensas em tampão de fosfato 10 mM (pH 7,0) com película fina de PET de baixa cristalinidade (Filme PET) (ca. 60 mg, 20 × 15 × 0,2 mm, PM: 45 × 103, PM/Mn: 1,9, Tg: 77 °C, Tm: 255 °C, cristalinidade: 1,9%, densidade: 1,3378 g/cm3). O filme PET é esterilizado em etanol 70% e seco em ar esterilizado antes de ser colocado no tubo de ensaio. O tubo é agitado a 300 golpes/min a 30 °C.

[0539] A quantificação da geração de CO2 é usada como uma medida de decomposição do PET. O CO2 gerado é aprisionado no Ascarite e o peso é medido para calcular o CO2 absorvido. Os materiais semelhantes a biofilme e filmes PET tratados são separados do meio para determinar o peso de carbono do filme degradado. A taxa de conversão de PET em CO2 (R) é calculada como segue. R% = CO2 (PET+) x CO2 (PET−) x 100 _____________________________________ Peso do carbono do filme degradado

[0540] onde CO2 (PET+) e CO2 (PET−) indicam o peso de carbono do CO2 gerado cultivado na presença e ausência de PET, respetivamente.

[0541] A eficiência de degradação de plástico de E. coli ADAS é medida usando o índice PETase (Y), que é calculado da seguinte forma:

[0542] Y = R (E. coli ADAS) / R (I. sakaiensis)

[0543] onde R indica a taxa de conversão mostrada acima.

[0544] O ADAS pode ser ainda otimizado para expressar enzimas PETase mutadas que demonstraram ter maior atividade e aumentar a gama de plásticos degradados, conforme descrito por Austin et al., PNAS, 2018. Exemplo 43. Secreção de RNA via um sistema de secreção T4

[0545] Foi demonstrado que os T4SS são capazes de secretar DNA, mas ainda não foi demonstrado que os T4SSs são capazes de secretar RNA. Este exemplo descreve a secreção de RNA por meio do acoplamento de uma proteína de ligação ao RNA para o RNA. A. Síntese de agrobacterium com sistema de secreção de T4 secretor de RNA

[0546] Cas9 otimizado para S. cerevisiae (de Generoso et al, J. Microbiol. Meth., 2016) e sequências de tombusvirus p19 (Uniprot Q66104) são fundidas ao terminal N de VirE2 e VirF sob o promotor virF. Uma sequência de sgRNA ou siRNA também é colocada nesta sequência sob o controle do promotor virF. A sequência de sgRNA contra ILV1 é descrita em Generoso et al, J. Microbiol. Meth., 2016. O protocolo é conforme descrito em Vergunst et al, PNAS, 2005 e Vergunst et al, Science, 2000 com algumas modificações. Resumidamente, os plasmídeos são sintetizados comercialmente e eletroporados em Agrobacterium contendo sistemas T4SS e agrobacterium sem sistemas T4SS. A agrobacterium é então cultivada em placas LB e, em seguida, cultivada de acordo com os protocolos padrão. A presença da proteína de fusão é verificada por Western blot. Além disso, a sequência de sgRNA ou siRNA é verificada por meio do ensaio Quantigene após o isolamento de RNA com pequenos kits comerciais de isolamento de RNA da Thermo Fisher. B. Demonstrando a entrega de T4SS de RNA para levedura

[0547] O protocolo para entrega de T4SS à levedura é descrito em Schrammeijer et al., Nucl. Acids Res., 2003. Resumidamente, as cepas de agrobacterium são cultivadas durante a noite em meio mínimo com antibiótico, colhidas e diluídas em meio de indução e, em seguida, cultivadas por 5 h antes do uso. As cepas de S. cerevisiae são cultivadas durante a noite em meio padrão, diluído 1:10 e crescem novamente por mais 5 h. As culturas da agrobacterium e da levedura são misturadas 1:1 e cultivadas em filtros de nitrato de celulose. Após 6 dias de co-cultura, a mistura é analisada por plaqueamento em meio de levedura com cefotaxim e as colônias de levedura são cultivadas e analisadas por ensaios Quantigene quanto à presença do RNA entregue após o isolamento do RNA com pequenos kits comerciais de isolamento de RNA da Thermo Fisher. C. Demonstrando a edição mediada por T4SS de DNA em levedura

[0548] Seguindo o protocolo mencionado acima, as colônias de levedura são cultivadas em meio sem isoleucina e as colônias são medidas para aquelas co-cultivadas com Agrobacterium com e sem T4SS e com e sem a cassete sgRNA/Cas9.

OUTRAS MODALIDADES

[0549] Algumas modalidades da invenção estão dentro dos seguintes parágrafos numerados.

[0550] 1. Um sistema ativo dinâmico acromossômico altamente ativo (ADAS) isolado.

[0551] 2. O ADAS altamente ativo do parágrafo 1, compreendendo uma concentração de ATP sintase de pelo menos: 1 por 10000 nm2, 1 por 5000 nm2, 1 por 3500 nm2, 1 por 1000 nm2.

[0552] 3. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o ADAS compreende uma ATP sintase, opcionalmente sem um domínio regulatório, tal como sem um domínio épsilon.

[0553] 4. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo ainda uma bomba de prótons fotovoltaica.

[0554] 5. O ADAS altamente ativo do parágrafo 4, em que a bomba de prótons fotovoltaica é uma proteorodopsina.

[0555] 6. O ADAS altamente ativo do parágrafo 5, em que a proteorodopsina compreende a sequência de aminoácidos da proteorodopsina do clado de bactérias marinhas não cultivadas SAR86,

Acesso GenBank: AAS73014.1.

[0556] 7. O ADAS altamente ativo do parágrafo 4, em que a bomba de prótons fotovoltaica é uma gloeobacter rodopsina.

[0557] 8. O ADAS altamente ativo do parágrafo 4, em que a bomba de prótons fotovoltaica é uma bacteriorodopsina, deltarodopsina ou halorodopsina de Halobium salinarum Natronomonas pharaonis, Exiguobacterium sibiricum, Haloterrigena turkmenica ou Haloarcula marismortui.

[0558] 9. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo ainda a retinal.

[0559] 10. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo ainda uma proteína de síntese retinal (ou sistema de proteína) ou um ácido nucleico que codifica a mesma.

[0560] 11. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo ainda uma ou mais proteínas da via de glicólise.

[0561] 12. O ADAS altamente ativo do parágrafo 11, em que a proteína da via da glicólise é uma fosfofrutocinase (Pfk-A).

[0562] 13. O ADAS altamente ativo do parágrafo 12, em que a Pfk- A compreende a sequência de aminoácidos do acesso UniProt P0A796.

[0563] 14. O ADAS altamente ativo do parágrafo 12, em que a proteína da via da glicólise é triosefosfato isomerase (tpi).

[0564] 15. O ADAS altamente ativo do parágrafo 14, em que a tpi compreende a sequência de aminoácidos do acesso UniProt P0A858.

[0565] 16. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que carece de uma ou mais proteínas metabolicamente não essenciais.

[0566] 17. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que carece de um ou mais de uma RNAse, uma protease ou uma combinação das mesmas e, em modalidades particulares, carece de uma ou mais endoribossucleases (tal como RNAse A, RNAse h, RNAse III, RNAse L, RNAse PhyM) ou exoribonucleases (tais como RNAse R, RNAse PH, RNAse D); ou serina, cisteína, treonina, aspártico, glutâmico e metaloproteases; ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

[0567] 18. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo ainda um sistema de secreção bacteriana.

[0568] 19. O ADAS altamente ativo do parágrafo 18, em que o sistema de secreção bacteriana é capaz de exportar uma carga através da membrana externa do ADAS para uma célula alvo, tal como uma célula animal, fúngica, bacteriana ou vegetal.

[0569] 20. O ADAS altamente ativo do parágrafo 18 ou 19, em que o sistema de secreção bacteriana é T3SS, T4SS ou T6SS.

[0570] 21. O ADAS altamente ativo do parágrafo 18 ou 19, em que o sistema de secreção bacteriana é um T3/4SS.

[0571] 22. O ADAS altamente ativo do parágrafo 21, em que o T3/4SS modificou a função efetora, por exemplo, um efetor selecionado de SopD2, SopE, Bop, Map, Tir, EspB, EspF, NleC, NleH2 ou NleE2.

[0572] 23. O ADAS altamente ativo do parágrafo 22, em que a função efetora modificada é para o direcionamento intracelular, tal como translocação para o núcleo, golgi, mitocôndria, actina, microvilosidades, ZO-1, microtúbulos ou citoplasma.

[0573] 24. O ADAS altamente ativo do parágrafo 22, em que a função efetora modificada é o direcionamento nuclear com base em NleE2 derivado de E. Coli.

[0574] 25. O ADAS altamente ativo do parágrafo 22, em que a função efetora modificada é para a formação de filopódios, interrupção da junção estanque, apagamento de microvilosidades ou inativação de SGLT-1.

[0575] 26. O ADAS altamente ativo do parágrafo 18 ou 19, em que o sistema de secreção bacteriana é um T6SS.

[0576] 27. O ADAS altamente ativo do parágrafo 26, em que o T6SS, em seu hospedeiro natural, tem como alvo uma bactéria e contém um efetor que mata a bactéria.

[0577] 28. O ADAS altamente ativo do parágrafo 26 ou parágrafo 27, em que o T6SS é derivado de P. putida K1-T6SS e, opcionalmente, em que o efetor compreende a sequência de aminoácidos de Tke2 (Acesso AUZ59427.1).

[0578] 29. O ADAS altamente ativo do parágrafo 26, em que o T6SS, em seu hospedeiro natural, tem como alvo um fungo e contém um efetor que mata fungos.

[0579] 30. O ADAS altamente ativo do parágrafo 29, em que o T6SS é derivado de Serratia Marcescens e os efetores compreendem as sequências de aminoácidos de: Tfe1 (Genbank: SMDB11_RS05530) ou Tfe2 (Genbank: SMDB11_RS05390).

[0580] 31. O ADAS altamente ativo do parágrafo 18, em que o sistema de secreção bacteriana é capaz de exportar uma carga extracelularmente.

[0581] 32. O ADAS altamente ativo do parágrafo 31, em que o sistema de secreção bacteriana é T1SS, T2SS, T5SS, T7SS, Sec ou Tat.

[0582] 33. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo um transportador na membrana.

[0583] 34. O ADAS altamente ativo do parágrafo 33, onde o transportador é específico para glicose, sódio, potássio, um íon metálico, um soluto aniônico, um soluto catiônico ou água.

[0584] 35. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a membrana compreende um agente de direcionamento.

[0585] 36. O ADAS altamente ativo do parágrafo 35, em que o agente de direcionamento é um nanocorpo, tal como um nanocorpo direcionado a um antígeno tumoral, tal como HER2, PSMA ou VEGF-R.

[0586] 37. O ADAS altamente ativo do parágrafo 35, onde o agente de direcionamento é uma proteína de ligação a carboidratos, tal como uma lectina, por exemplo. Lectina de Ligação a Manose (MBL).

[0587] 38. O ADAS altamente ativo do parágrafo 35, onde o agente de direcionamento é um peptídeo de direcionamento de tumor, tal como motivos RGD ou peptídeo CendR.

[0588] 39. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a membrana ADAS compreende uma enzima.

[0589] 40. O ADAS altamente ativo do parágrafo 39, em que a enzima é uma protease, oxidorredutase ou uma combinação das mesmas.

[0590] 41. O ADAS altamente ativo do parágrafo 39 ou parágrafo 40, em que a enzima é quimicamente conjugada à membrana ADAS, opcionalmente por meio de um ligante à membrana externa.

[0591] 42. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo uma carga dispersa no volume interior do ADAS, em que a carga compreende um ácido nucleico, ribossomo, peptídeo, hormônio, aminoácido, carboidrato, lipídeo, proteína, partícula orgânica, partícula inorgânica, molécula pequena ou uma combinação das mesmas.

[0592] 43. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o ADAS compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga, opcionalmente em que a carga compreende uma porção que direciona a exportação pelo sistema de secreção bacteriana, por exemplo, em algumas modalidades, a porção é Pho/D, Tat ou um sinal de peptídeo sintético.

[0593] 44. O ADAS do parágrafo 42 ou 43, em que a carga é modificada para melhorar a estabilidade em comparação com uma versão não modificada da carga.

[0594] 45. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que a carga compreende uma proteína.

[0595] 46. O ADAS altamente ativo do parágrafo 45, em que a proteína é um hormônio, por exemplo, parácrino, endócrino, autócrino.

[0596] 47. O ADAS altamente ativo do parágrafo 60 ou parágrafo 61, em que a proteína tem estabilidade maior do que cerca de: 1,01, 1,1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000 no citoplasma celular ou outros ambientes.

[0597] 48. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que a carga compreende um hormônio vegetal, tal como ácido abscísico, auxina, citocinina, etileno, giberelina ou uma combinação dos mesmos.

[0598] 49. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que a carga é um modulador imunológico, tal como um estimulador imunológico, inibidores de ponto de verificação (por exemplo, de PD-1, PD-L1, CTLA-4), supressores, superantígenos, molécula pequena (ciclosporina A, dinucleotídeos cíclicos (CDNs) ou agonista STING (por exemplo, MK-1454)).

[0599] 50. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que a carga compreende um RNA, tal como RNA circular, mRNA, siRNA, shRNA, ASO, tRNA ou uma combinação dos mesmos.

[0600] 51. O ADAS altamente ativo do parágrafo 50, em que a carga compreende um mRNA que codifica uma proteína.

[0601] 52. O ADAS altamente ativo do parágrafo 51, em que o mRNA que codifica a proteína codifica uma enzima (por exemplo, e enzima que confere atividade enzimática hepática, tal como mRNA de PBGD humano (hPBGD)) ou um antígeno, por exemplo, que induz uma resposta imune (tal como desencadear um título de anticorpo neutralizante potente e durável), tal como mRNA que codifica glicoproteínas gB de CMV e/ou complexo pentamérico (PC)).

[0602] 53. O ADAS altamente ativo do parágrafo 50, em que o RNA é um pequeno RNA não codificador, tal como shRNA, ASO, tRNA ou uma combinação dos mesmos.

[0603] 54. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 50-53, em que o RNA é estabilizado, por exemplo, com uma estrutura de alça em degrau anexada, tal como um molde de tRNA.

[0604] 55. O ADAS de qualquer um dos parágrafos 65-70, em que o RNA tem estabilidade maior do que cerca de: 1,01, 1,1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 100000, 10000000, por exemplo, no plasma ADAS.

[0605] 56. O ASAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o ADAS altamente ativo não degrada uma carga.

[0606] 57. O ADAS altamente ativo do parágrafo 42 ou 43, em que a carga compreende um sistema de edição de gene.

[0607] 58. O ADAS altamente ativo do parágrafo 58, em que a carga é DNA, tal como um plasmídeo, ou um RNA circular, opcionalmente em que o DNA ou RNA circular compreende uma sequência de codificação de proteína.

[0608] 59. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o ADAS é um ADAS de duas membranas.

[0609] 60. O ADAS altamente ativo do parágrafo 59, em que o ADAS de duas membranas compreende ainda um sistema de secreção bacteriana.

[0610] 61. O ADAS altamente ativo do parágrafo 60, em que o sistema de secreção bacteriana é selecionado a partir de T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS, opcionalmente em que T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS tem um efetor atenuado ou não funcional que não afeta a aptidão de uma célula-alvo.

[0611] 62. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos 59-61, que é derivado de uma cepa parental bacteriana, em que a cepa parental é selecionada a partir de uma bactéria vegetal, tal como uma planta comensal (por exemplo, B. Subtilis ou Pseudomonas putida) ou uma bactéria patogênica de planta (por exemplo, Xanthomonas sp. ou Pseudomonas syringae) ou uma bactéria humana, tal como uma bactéria comensal humana (por exemplo, E. coli, Staphylococcus sp., Bifidobacterium sp., Micrococcus sp., Lactobacillus sp., ou Actinomyces sp.) uu uma bactéria humana patogênica (por exemplo, Escherichia coli EHEC, Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica, Helicobacter pylori), ou um extremófilo, incluindo derivados funcionalizados de qualquer um dos anteriores, por exemplo, incluindo uma cassete funcional, tal como uma cassete funcional que induz a bactéria a fazer um ou mais dos seguintes: secretar antimicrobianos, digerir plástico, secretar inseticidas, sobreviver a ambientes extremos, fazer nanopartículas, integrar-se em outros organismos, responder ao ambiente e criar sinais de repórter.

[0612] 63. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que é derivado de uma cepa parental selecionada de E. coli, Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Xanthomonas, Anaplasma, Helicobacter, Serratia, Vibrio, Salmonella ou Shigella.

[0613] 64. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que é derivado de uma cepa parental manipulada ou induzida para sobre-expressar ATP sintase.

[0614] 65. O ADAS altamente ativo do parágrafo 64, em que o ADAS compreende uma ATP sintase heteróloga à cepa parental.

[0615] 66. O ADAS altamente ativo do parágrafo 64 ou 65, em que a cepa parental é modificada para expressar uma FoF1 ATP sintase funcional.

[0616] 67. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que é obtido a partir de uma cepa parental cultivada sob uma condição selecionada a partir de: voltagem aplicada (por exemplo, 37 mV), concentração de oxigênio não atmosférico (por exemplo, 1-5% O2, 5-10% O2, 10-15% O2, 25-30% O2), baixo pH (cerca de: 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5) ou uma combinação dos mesmos.

[0617] 68. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que é derivado de uma cepa parental auxotrófica para pelo menos 1, 2, 3, 4 ou mais de: arginina (por exemplo, nocaute em argA, tal como cepas JW2786- 1 e NK5992), nocaute de cisteína em cysE (tal como as cepas JW3582-2 e JM15), glutamina, por exemplo, nocaute em glnA (tal como as cepas JW3841-1 e M5004), glicina, por exemplo, nocaute em glyA (tal como as cepas JW2535-1 e AT2457), Histidina, por exemplo, nocaute em hisB (tal como as cepas JW2004-1 e SB3930), isoleucina, por exemplo, nocaute em ilvA (tal como as cepas JW3745-2 e AB1255), leucina, por exemplo, nocaute em leuB (tal como as cepas JW5807- 2 e CV514), lisina, por exemplo, nocaute em lysA (tal como as cepas JW2806-1 e KL334), metionina, por exemplo, nocaute em metA (tal como as cepas JW3973-1 e DL41), fenilalanina, por exemplo, nocaute em pheA (tal como as cepas JW2580 -1 e KA197), prolina, por exemplo, nocaute em proA (tal como as cepas JW0233-2 e NK5525), Serina, por exemplo, nocaute em serA (tal como as cepas JW2880-1 e JC158), treonina, por exemplo, nocaute em thrC (tal como as cepas JW0003-2 e Gif 41), triptofano, por exemplo, nocaute em trpC (tal como as cepas JW1254-2 e CAG18455), Tirosina, por exemplo, nocaute em tyrA (tal como as cepas JW2581-1 e N3087), Valina/Isoleucina/Leucina, por exemplo, nocaute em ilvd (tal como as cepas JW5605-1 e CAG18431).

[0618] 69. AS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, que é feito de uma célula bacteriana, em que em que a cepa parental é selecionada a partir de uma bactéria vegetal, tal como uma planta comensal (por exemplo, B. Subtilis ou Pseudomonas putida) ou uma bactéria patogênica de planta (por exemplo, Xanthomonas sp. ou

Pseudomonas syringae) ou uma bactéria humana, tal como uma bactéria comensal humana (por exemplo, E. coli, Staphylococcus sp., Bifidobacterium sp., Micrococcus sp., Lactobacillus sp., ou Actinomyces sp.) uu uma bactéria humana patogênica (por exemplo, Escherichia coli EHEC, Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica, Helicobacter pylori), ou um extremófilo, incluindo derivados funcionalizados de qualquer um dos anteriores, por exemplo, incluindo uma cassete funcional, tal como uma cassete funcional que induz a bactéria a fazer um ou mais dos seguintes: secretar antimicrobianos, digerir plástico, secretar inseticidas, sobreviver a ambientes extremos, fazer nanopartículas, integrar-se em outros organismos, responder ao ambiente e criar sinais de repórter.

[0619] 70. O ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores, compreendendo uma membrana modificada.

[0620] 71. O ADAS altamente ativo do parágrafo 70, onde a membrana é modificada para ser menos imunogênica ou imunoestimulante em plantas ou animais.

[0621] 72. O ADAS altamente ativo do parágrafo 71, que é feito a partir de uma cepa parental, em que as capacidades imunoestimulatórias da cepa parental são reduzidas ou eliminadas por meio de tratamento pós-produção com detergentes, enzimas ou funcionalizadas com PEG.

[0622] 73. O ADAS altamente ativo do parágrafo 71, que é feito de uma cepa parental e a membrana é modificada por meio de nocaute das vias de síntese de LPS na cepa parental, por exemplo, por nocaute de msbB e/ou purI.

[0623] 74. O ADAS altamente ativo do parágrafo 71, que é feito de uma cepa parental que produz partículas deficientes na parede celular por meio da exposição a condições hiperosmóticas.

[0624] 75. Uma composição que compreende o ADAS altamente ativo de qualquer um dos parágrafos anteriores.

[0625] 76. Uma composição que compreende ADAS, em que pelo menos cerca de: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 %, ou mais dos ADAS contêm um sistema de secreção bacteriana.

[0626] 77. A composição do parágrafo 76, em que o sistema de secreção bacteriana é um de T3SS, T4SS, T3/4SS ou T6SS.

[0627] 78. Uma composição de ADAS, compreendendo um T3SS, em que o ADAS compreende uma densidade de membrana T3SS média maior do que 1 em cerca de: 40000, 35000,30000, 25000, 19600, 15000, 10000, ou 5000 nm2.

[0628] 79. A composição do parágrafo 78, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental de S. Typhimurium ou E. coli.

[0629] 80. Uma composição de ADAS que compreende um T3SS, em que o ADAS compreende uma densidade de membrana T3SS média maior do que 1 em cerca de: 300000, 250000, 200000, 150000, 100000, 50000, 20000, 10000, 5000 nm2.

[0630] 81. A composição do parágrafo 80, onde o ADAS é derivado de uma cepa parental de Agrobacterium tumefaciens.

[0631] 82. Uma composição de ADAS, em que pelo menos cerca de: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 %, ou mais dos ADAS contêm um sistema de secreção bacteriana, incluindo T3, T4, T3/4SS, T6SS, e opcionalmente incluindo um ou mais dentre: carboidratos exógenos, sintases produtoras de fosfato, proteínas responsivas à luz, proteínas de importação, enzimas, carga funcional, efetores específicos do organismo, proteínas de fusão.

[0632] 83. A composição de qualquer um dos parágrafos 75-82, em que os ADAS são ADAS altamente ativos.

[0633] 84. A composição de qualquer um dos parágrafos 75-83, que é formulada para administração IP, IV, IM, oral, tópica (creme, gel, pomada, adesivo transdérmico), aerossol ou nebulização.

[0634] 85. A composição de qualquer um dos parágrafos 75-84, que é uma formulação líquida ou uma formulação liofilizada.

[0635] 86. Um método para fazer qualquer um dos ADAS dos parágrafos 1-74, compreendendo a cultura de uma mancha parental sob condições para promover a formação de ADAS e coletar o ADAS, opcionalmente compreendendo ainda uma etapa de isolamento do ADAS de quaisquer células da cepa parental residual ou outros contaminantes.

[0636] 87. O método do parágrafo 86, compreendendo o uso de uma cepa parental auxotrófica única, dupla, tripla ou quádrupla, a referida cepa parental compreendendo ainda um plasmídeo que expressa um ftsZ.

[0637] 88. O método do parágrafo 86, que compreende a transformação de uma cepa parental com um sistema DNAse induzível, tal como o exoI nucleases (NCBI GeneID: 946529) & sbcD (NCBI GeneID: 945049), ou o I- CeuI nuclease (por exemplo, Swissprot: P32761.1).

[0638] 89. O método do parágrafo 88, compreendendo o uso de uma cepa auxotrófica única, dupla, tripla ou quádrupla e possuindo os genes complementares no plasmídeo que codificam as nucleases induzíveis.

[0639] 90. O método do parágrafo 86, em que a cepa parental é cultivada sob uma condição selecionada a partir de: voltagem aplicada (por exemplo, 37 mV), concentração de oxigênio não atmosférico (por exemplo, 1-5% O2, 5-10% O2, 10 -15% O2, 25-30% O2), baixo pH (4,5- 6,5) ou uma combinação dos mesmos.

[0640] 91. O método do parágrafo 86, em que a cepa parental não tem flagelos e sistemas de secreção indesejados, opcionalmente, em que os flagelos e os sistemas de secreção indesejados são removidos usando recombinação de vermelho lambda.

[0641] 92. O método do parágrafo 86, em que os componentes de controle dos flagelos são excisados do genoma da cepa parental através da inserção de um plasmídeo contendo um domínio CRISPR que é direcionado para genes de controle dos flagelos, tais como flhD e flhC.

[0642] 93. Um método de preparação de um ADAS altamente ativo, em que um ADAS compreendendo um plasmídeo contendo um gene que codifica a rodopsina é cultivado na presença de luz.

[0643] 94. O método do parágrafo 93, onde a rodopsina é a proteorodopsina de bactérias não cultivadas SAR86, possuindo a sequência de aminoácidos de acesso ao GenBank: AAS73014.1, e ainda opcionalmente a cultura é suplementada com retinal.

[0644] 95. O método do parágrafo 93 ou 94, em que a rodopsina é proteorodopsina e o plasmídeo contém adicionalmente genes que sintetizam retinal (tal plasmídeo é o plasmídeo pACYC -RDS de Kim et al., Microb Cell Fact, 2012).

[0645] 96. O método de qualquer um dos parágrafos 86-95, em que a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um nanocorpo que é então expresso na membrana do ADAS.

[0646] 97. O método de qualquer um dos parágrafos 86-95, em que a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais operons do sistema de secreção bacteriana.

[0647] 98. O método de qualquer um dos parágrafos 86-97, em que a tensão parental compreende uma carga.

[0648] 99. O método de qualquer um dos parágrafos 86-97, em que a cepa parental contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um conjunto de genes que sintetizam uma carga de molécula pequena.

[0649] 100. Um ADAS feito pelo método de qualquer um dos parágrafos 86-99.

[0650] 101. Um método para modular um estado de uma célula animal, compreendendo o fornecimento de uma quantidade eficaz de um ADAS ou composição de qualquer um dos parágrafos anteriores para acessar a célula animal.

[0651] 102. O método do parágrafo 101, em que o ADAS ou composição é fornecido acesso à célula animal in vivo, em um animal, tal como um mamífero, tal como um ser humano.

[0652] 103. O método do parágrafo 102, em que a célula animal é exposta a bactérias em um animal saudável.

[0653] 104. O método do parágrafo 103, em que a célula animal é o epitélio pulmonar, uma célula imune, célula da pele, célula epitelial oral, célula epitelial intestinal, célula epitelial do trato reprodutivo ou célula do trato urinário.

[0654] 105. O método do parágrafo 104, em que a célula animal é uma célula epitelial do intestino, tal como uma célula epitelial do intestino de um sujeito humano com uma doença inflamatória do intestino, tal como a doença de Crohn ou colite.

[0655] 106. O método do parágrafo 105, em que a célula animal é uma célula epitelial intestinal de um sujeito com uma doença inflamatória intestinal e o ADAS compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga que compreende um agente anti-inflamatório.

[0656] 107. O método do parágrafo 102, em que a célula animal é exposta a bactérias em um estado de doença.

[0657] 108. O método do parágrafo 102, em que a célula animal é patogênica, tal como um tumor.

[0658] 109. O método do parágrafo 102, em que a célula animal é exposta a bactérias em um estado de doença, tal como uma ferida, uma úlcera, um tumor ou um distúrbio inflamatório.

[0659] 110. O método de qualquer um dos parágrafos 102-109, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental comensal animal.

[0660] 111. O método de qualquer um dos parágrafos 102-109, em que o ADAS é derivado de cepa parental patogênica animal.

[0661] 112. O método de qualquer um do parágrafo 102, em que a célula animal é colocada em contato com uma quantidade eficaz de um ADAS que compreende um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula animal.

[0662] 113. O método do parágrafo 102, em que a célula animal tem acesso a uma quantidade eficaz de um ADAS que compreende uma carga e um sistema de secreção, em que a carga é secretada extracelularmente e entra em contato com a célula animal.

[0663] 114. Um método para modular um estado de uma célula animal, compreendendo o fornecimento de uma quantidade eficaz de um ADAS ou composição de qualquer um dos parágrafos 1-85 para acessar uma célula bacteriana ou fúngica na vizinhança da célula animal.

[0664] 115. O método do parágrafo 114, em que a célula bacteriana ou fúngica é patogênica.

[0665] 116. O método do parágrafo 115, em que a aptidão da célula bacteriana ou fúngica patogênica é reduzida.

[0666] 117. O método do parágrafo 114, em que a célula bacteriana ou fúngica é comensal.

[0667] 118. O método do parágrafo 117, em que a aptidão da célula bacteriana ou fúngica comensal é aumentada.

[0668] 119. O método do parágrafo 118, em que a adequação é aumentada por meio da redução na adequação do número de bactérias ou fungos concorrentes, que podem ser neutros, comensais ou patogênicos.

[0669] 120. O método do parágrafo 114, em que a célula bacteriana ou fúngica é colocada em contato com uma quantidade eficaz de ADAS compreendendo um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula bacteriana ou fúngica.

[0670] 121. Um método, de acordo com a reivindicação 120, em que a célula bacteriana ou fúngica tem acesso a uma quantidade eficaz de carga secretora de ADAS extracelularmente que entra em contato com a célula bacteriana ou fúngica.

[0671] 122. O método de qualquer um dos parágrafos 114-121, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental que é um competidor da célula bacteriana ou fúngica.

[0672] 123. O método de qualquer um dos parágrafos 114-121, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental que é uma bactéria mutualística da célula bacteriana ou fúngica.

[0673] 124. Um método de modulação de um estado de uma planta ou célula fúngica, compreendendo o fornecimento de uma quantidade eficaz de um ADAS ou composição de qualquer um dos parágrafos 1- 85 para acessar: a) a célula de planta ou fúngica, b) uma bactéria adjacente ou célula fúngica adjacente na vizinhança da célula de planta ou fúngica, ou c) uma célula de inseto ou nematoide na vizinhança da célula de planta ou fúngica.

[0674] 125. O método do parágrafo 124, em que o ADAS ou composição é fornecido acesso à célula de planta na planta, por exemplo, em uma planta de cultura, tal como safras em linha, incluindo milho, trigo, soja e arroz, e vegetais, incluindo solanáceas, tal como tomates e pimentões; cucurbitáceas, tal como melões e pepinos; brássicas, tal como repolhos e brócolis; folhas verdes, tal como couve e alface; raízes e tubérculos, tal como batatas e cenouras; grandes vegetais com sementes, tal como feijão e milho; e cogumelos.

[0675] 126. O método do parágrafo 125, em que a célula de planta ou fúngica é exposta a bactérias em uma planta ou fungo saudável.

[0676] 127. O método do parágrafo 125, em que a planta ou célula fúngica é exposta a bactérias em um estado de doença.

[0677] 128. O método do parágrafo 125, em que a planta ou célula fúngica está se dividindo, tal como uma célula de meristema, ou é patogênica, tal como um tumor.

[0678] 129. O método do parágrafo 125, em que a planta ou célula fúngica é exposta a bactérias em um estado de doença, tal como uma ferida, ou em que a célula de planta ou fúngica não faz parte de um alimento humano.

[0679] 130. O método de qualquer um dos parágrafos 124-129, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental comensal.

[0680] 131. O método de qualquer um dos parágrafos 124-129, em que o ADAS é derivado de uma planta ou cepa parental patogênica de fungo.

[0681] 132. O método do parágrafo 124, em que o ADAS compreende um T3/4SS ou T6SS e uma carga, e a carga é entregue na planta ou célula fúngica.

[0682] 133. O método da reivindicação 124, em que a célula de planta ou fúngica tem acesso a uma quantidade eficaz de um ADAS que compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga, em que o sistema de secreção bacteriana secreta a carga extracelularmente, contactando assim a célula de planta ou fúngica com a carga.

[0683] 134. O método do parágrafo 124, que compreende o fornecimento de uma quantidade eficaz de um ADAS ou de uma composição de acesso à célula bacteriana ou fúngica adjacente na vizinhança da célula de planta ou fúngica.

[0684] 135. odo da reivindicação 134, em que a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é patogênica, opcionalmente em que a aptidão da bactéria adjacente patogênica ou célula fúngica adjacente é reduzida.

[0685] 136. O método da reivindicação 134, em que a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é comensal, opcionalmente em que a aptidão da célula bacteriana adjacente comensal ou fúngica adjacente é aumentada.

[0686] 137. O método do parágrafo 136, em que a aptidão é aumentada por meio da redução de uma bactéria ou fungo competidor, que pode ser neutro, comensal ou patogênico.

[0687] 138. O método do parágrafo 134, em que a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente é colocada em contato com uma quantidade eficaz de ADAS que compreende um T3/4SS ou T6SS e uma carga, em que a carga é entregue na célula bacteriana adjacente ou na célula fúngica adjacente.

[0688] 139. O método do parágrafo 134, em que a célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente tem acesso a uma quantidade eficaz de ADAS que compreende um sistema de secreção bacteriana e uma carga, em que o sistema de secreção bacteriana secreta a carga extracelularmente, contactando assim a bactéria adjacente ou célula fúngica adjacente com a carga.

[0689] 140. O método de qualquer um dos parágrafos 134-139, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental que é um competidor da bactéria adjacente ou células fúngicas adjacentes.

[0690] 141. O método de qualquer um dos parágrafos 134-139, em que o ADAS é derivado de uma cepa parental que é uma bactéria mutualística da célula bacteriana adjacente ou fúngica adjacente.

[0691] 142. O método do parágrafo 124, compreendendo fornecer uma quantidade eficaz do ADAS ou acesso à composição a um inseto ou célula de nematoide na vizinhança da planta ou fungo.

[0692] 143. O método do parágrafo 142, em que o inseto ou nematoide é patogênico.

[0693] 144. O método do parágrafo 142, em que a aptidão da célula de inseto ou de nematoide patogênica é reduzida.

[0694] 145. O método do parágrafo 144, em que a aptidão da célula de inseto ou de nematoide patogênica é reduzida através da modulação de simbiotes na célula de inseto ou de nematoide.

[0695] 146. O método do parágrafo 142, em que o inseto ou nematoide é comensal.

[0696] 147. O método do parágrafo 146, em que a aptidão da célula de inseto ou de nematoide comensal é aumentada.

[0697] 148. O método do parágrafo 147, em que a aptidão é aumentada por meio da redução de uma bactéria ou fungo competidor, que pode ser neutro, comensal ou patogênico.

[0698] 149. Um método de remoção de um ou mais materiais indesejáveis de um ambiente compreendendo o contato do ambiente com uma quantidade eficaz de um ADAS, tal como um ADAS ou composição de qualquer um dos parágrafos 1-84, em que o ADAS compreende uma ou mais moléculas (tais como proteínas, polímeros, nanopartículas, agentes de ligação ou uma combinação dos mesmos) que absorvem, quelam ou degradam um ou mais materiais indesejáveis.

[0699] 150. O método do parágrafo 149, em que o material indesejável compreende um metal pesado, tal como mercúrio, e o ADAS compreende uma ou mais moléculas (tais como proteínas, polímeros, nanopartículas, agentes de ligação ou uma combinação dos mesmos) que se ligam a metais pesados, tal como MerR para mercúrio.

[0700] 151. O método do parágrafo 149, em que o material indesejável compreende um plástico, tal como PET, e o ADAS compreende uma ou mais enzimas degradantes de plástico, tal como PETase.

[0701] 152. O método do parágrafo 149, em que o material indesejável compreende uma ou mais moléculas orgânicas pequenas e o ADAS compreende uma ou mais enzimas capazes de metabolizar as referidas uma ou mais moléculas orgânicas pequenas.

[0702] 153. Uma composição compreendendo uma bactéria ou ADAS, em que a bactéria ou ADAS compreende um T4SS, uma carga de proteína de ligação de RNA e uma carga de RNA que é ligada pela proteína de ligação de RNA e é adequada para entrega a uma célula alvo através do T4SS.

[0703] 154. A composição do parágrafo 153, em que a proteína de ligação a RNA é um Cas9 fundido a VirE2 e VirF, a carga de RNA é um RNA guia e, opcionalmente, em que o T4SS é o sistema Ti de Agrobacterium.

[0704] 155. A composição do parágrafo 153, em que a proteína de ligação a RNA é p19 do Vírus Carnation Italian Ringspot fundido a VirE2 ou VirF, a carga de RNA é um siRNA e, opcionalmente, em que o T4SS é o sistema Ti de Agrobacterium.

[0705] 156. Um método de preparação da composição do parágrafo 156, em que um plasmídeo contendo o Cas9 fundido com VirE2 e VirF e carga de RNA são transfectados para uma célula de Agrobacterium.

[0706] 157. Um método para entregar RNA a uma célula de planta ou célula animal compreendendo o contato da referida célula de planta ou célula animal com uma bactéria ou ADAS, em que a bactéria ou ADAS compreende um T4SS, uma carga de proteína de ligação de RNA e uma carga de RNA.

[0707] 158. Um método para entregar um RNA e uma proteína a uma célula de planta ou célula animal compreendendo o contato da referida célula de planta ou célula animal com uma bactéria ou ADAS, em que a bactéria ou ADAS compreende um T4SS, uma carga de proteína de ligação de RNA e uma carga de RNA.

Claims (130)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para fabricar uma composição que compreende uma pluralidade de ADAS, sendo a composição substancialmente livre de células bacterianas viáveis, caracterizado por compreender: (a) fazer, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de minicélulas; e (c) separar as minicélulas das bactérias parentais, produzindo assim uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS que é substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo minE.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a bactéria parental ser E. coli e o polipeptídeo minE ser minE de E. coli.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a bactéria parental ser Salmonella typhimurium e o polipeptídeo minE ser minE de S. typhimurium.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a bactéria parental ter uma redução no nível ou atividade de uma proteína de inibição do anel Z.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo minC.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo minD.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por o ADAS ter uma redução na expressão de pelo menos duas proteínas de inibição do anel Z.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o ADAS ter uma redução na expressão de um polipeptídeo minC e um polipeptídeo minD.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o ADAS ter uma redução na expressão de um polipeptídeo minC, um polipeptídeo minD e um polipeptídeo minE.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 15 e 16, caracterizado por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo DivIVA.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as bactérias parentais serem Bacillus subtilis e o fator de especificidade topológica de divisão celular ser DivIVA de B. subtilis.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado por a redução no nível ou atividade ser causada por uma mutação de perda de função.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a mutação de perda de função ser uma deleção do operon minCDE ou uma deleção de DiVIVA.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado por o ADAS ter uma concentração de ATP inicial de pelo menos 1 mM, 1,2 nM, 1,3 nM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM ou 50 mM.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por as bactérias parentais serem bactérias Escherichia, Acinetobacter, Agrobacterium, Anabaena, Aquifex, Azoarcus, Azotobacter, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Buchnera, Burkholderia, Candidatus, Chromobacterium, Crocosphaera, Dechloromonas, Desulfitobacterium, Desulfotalea, Erwinia, Francisella, Fusobacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Helicobacter, Legionella, Magnetospirillum, Mesorhizobium, Methylococcus, Neisseria,

Nitrosomonas, Nostoc, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Prochlorococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rubrivivax, Salmonella, Shewanella, Shigella, Sinorhizobium, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermus, Thiobacillus, Trichodesmium, Vibrio, Wigglesworthia, Wolinella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Deinococcus, Exiguobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Moorella, Oceanobacillus, Symbiobacterium, ou Thermoanaerobacter e o fator de especificidade topológica de divisão celular ser minE ou DivIVA endógeno da bactéria parental.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado por a composição da etapa (c) compreender menos de 100 unidades formadoras de colônia (UFC/mL) de células bacterianas viáveis.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a composição da etapa (c) compreender menos de 10 UFC/mL, menos de 1 UFC/mL ou menos de 0,1 UFC/mL de células bacterianas viáveis.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por o ADAS compreender uma carga.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por a composição ser formulada para entrega a um animal.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por a composição ser formulada para entrega a uma planta.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por a composição ser formulada para entrega a um inseto.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado por a composição ser formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

30. Composição, caracterizada por compreender uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por o ADAS ter uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,2 nM, 1,3 nM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 2 mM ou 2,5 mM.

32. Composição que compreende uma pluralidade de ADAS altamente ativo, caracterizada por o ADAS ter uma concentração inicial de ATP de pelo menos 3 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por o ADAS ter uma concentração inicial de ATP de pelo menos 4 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM ou 50 mM.

34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada por a concentração de ATP do ADAS ser aumentada em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150% ou pelo menos pelo menos 200% após incubação a 37 °C por 12 horas.

35. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada por o ADAS serem derivados de bactérias parentais possuindo uma redução de um nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular.

36. Composição que compreende uma pluralidade de ADAS, caracterizada por o ADAS não compreender um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

37. Composição, caracterizada por compreender uma pluralidade de ADAS, sendo a composição substancialmente livre de células bacterianas viáveis e sendo produzida por um processo que compreende: (a) fazer, fornecer ou obter uma pluralidade de bactérias parentais possuindo uma redução no nível ou atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular; (b) expor a bactéria parental a condições que permitem a formação de minicélulas; e (c) separar as minicélulas das bactérias parentais, produzindo assim uma composição que é substancialmente livre de células bacterianas viáveis.

38. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

39. Composição, de acordo com reivindicação 38, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

40. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo minE.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada por a bactéria parental ser E. coli e o polipeptídeo minE ser minE de E. coli.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada por a bactéria parental ser Salmonella typhimurium e o polipeptídeo minE ser minE de S. typhimurium.

43. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 42, caracterizada por as bactérias parentais serem bactérias Escherichia, Acinetobacter, Agrobacterium, Anabaena, Aquifex, Azoarcus, Azotobacter, Bordetella, Bradyrhizobium, Brucella, Buchnera, Burkholderia, Candidatus, Chromobacterium, Crocosphaera, Dechloromonas, Desulfitobacterium, Desulfotalea, Erwinia, Francisella, Fusobacterium, Gloeobacter, Gluconobacter, Helicobacter, Legionella, Magnetospirillum, Mesorhizobium, Methylococcus, Neisseria, Nitrosomonas, Nostoc, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Prochlorococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rubrivivax, Salmonella, Shewanella, Shigella, Sinorhizobium, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermus, Thiobacillus, Trichodesmium, Vibrio, Wigglesworthia, Wolinella, Xanthomonas, Xylella, Yersinia, Bacillus, Clostridium, Deinococcus, Exiguobacterium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactobacillus, Moorella, Oceanobacillus, Symbiobacterium, ou Thermoanaerobacter e o fator de especificidade topológica de divisão celular ser minE ou DivIVA endógeno da bactéria parental.

44. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 43, caracterizada por o ADAS ter uma redução no nível de uma proteína de inibição do anel Z.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo minC.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por a proteína de inibição do anel Z ser um polipeptídeo minD.

49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizada por o ADAS ter uma redução na expressão de pelo menos duas proteínas de inibição do anel Z.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por o ADAS ter uma redução na expressão de um polipeptídeo minC e um polipeptídeo minD.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada por o ADAS ter uma redução na expressão de um polipeptídeo minC, um polipeptídeo minD e um polipeptídeo minE.

52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 51, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

53. Composição, de acordo com reivindicação 52, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 ou 53, caracterizada por o fator de especificidade topológica de divisão celular ser um polipeptídeo DivIVA.

55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 ou 54, caracterizada por as bactérias parentais serem Bacillus subtilis e o fator de especificidade topológica de divisão celular ser DivIVA de B. subtilis.

56. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 51, caracterizada por a redução no nível ou atividade ser causada por uma mutação de perda de função.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 56, caracterizada por a mutação de perda de função ser uma deleção de gene.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizada por a mutação de perda de função ser uma mutação de perda de função induzível e em que a perda de função é induzida pela exposição da célula parental a uma condição de indução.

59. Composição, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada por a mutação de perda de função induzível ser uma mutação sensível à temperatura e em que a condição de indução é uma condição de temperatura.

60. Composição, de acordo com a reivindicação 59, caracterizada por a célula parental ter uma deleção do operon minCDE.

61. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada por o ADAS compreender um sistema de transcrição funcional e um sistema de tradução funcional.

62. Composição, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada por o ADAS produzir uma proteína heteróloga.

63. Composição, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada por o ADAS compreender um plasmídeo, o plasmídeo compreendendo um promotor induzível e uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína heteróloga, e em que o contato do ADAS com um indutor do promotor induzível sob condições apropriadas resulta na produção do proteína heteróloga.

64. Composição, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada por a produção da proteína heteróloga ser aumentada em pelo menos 1,6 vezes em um ADAS que foi contatado com o indutor em relação a um ADAS que não foi contatado com o indutor.

65. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada por a taxa de produção da proteína heteróloga atingir um nível alvo dentro de 3 horas do contato do ADAS com o indutor.

66. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 64 a 65, caracterizada por a proteína heteróloga ser produzida a uma taxa de pelo menos 0,1 femtogramas por hora por ADAS.

67. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 66, caracterizada por a proteína heteróloga ser produzida por um período de pelo menos 8 horas.

68. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizada por a composição compreender menos de 100 unidades formadoras de colônia (UFC/mL) de células bacterianas viáveis.

69. Composição, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada por a composição compreender menos de 10 UFC/mL, menos de 1 UFC/mL ou menos de 0,1 UFC/mL de células bacterianas viáveis.

70. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizada por o ADAS compreender uma carga.

71. Composição, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada por a carga ser um ácido nucleico, um plasmídeo, um polipeptídeo, uma proteína, uma enzima, um aminoácido, uma molécula pequena, um sistema de edição de gene, um hormônio, um modulador imunológico, um carboidrato, um lipídeo, uma partícula orgânica, uma partícula inorgânica ou um complexo de ribonucleoproteína (RNP).

72. Composição, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por a carga ser encapsulada pelo ADAS.

73. Composição, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por a carga ser fixada na superfície do ADAS.

74. Composição, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por o ácido nucleico ser um DNA, um RNA ou um plasmídeo.

75. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 ou 74, caracterizada por o ácido nucleico codificar uma proteína.

76. Composição, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada por a enzima alterar um substrato para produzir um produto alvo.

77. Composição, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por o substrato estar presente no ADAS e em que o produto alvo é produzido no ADAS.

78. Composição, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada por o substrato estar presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é administrado.

79. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizada por o ADAS compreender um sistema de secreção bacteriana heterólogo.

80. Composição, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada por o sistema de secreção bacteriana heterólogo ser um sistema de secreção tipo 3 (T3SS).

81. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 80, caracterizada por a carga compreender uma porção que direciona a exportação pelo sistema de secreção bacteriana.

82. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 81, caracterizada por o ADAS compreender uma porção de direcionamento.

83. Composição, de acordo com a reivindicação 82, caracterizada por a porção de direcionamento ser um nanocorpo, uma proteína de ligação a carboidrato ou um peptídeo direcionado a tumor.

84. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 83, caracterizada por o ADAS ter um nível ou atividade de protease reduzido em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria parental de tipo selvagem.

85. Composição, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada por o ADAS ser produzido a partir de uma bactéria parental que foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma protease.

86. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizada por o ADAS ter um nível ou atividade de RNase reduzido em relação a um ADAS produzido a partir de uma bactéria parental de tipo selvagem.

87. Composição, de acordo com a reivindicação 86, caracterizada por o ADAS ser produzido a partir de uma bactéria parental que foi modificada para reduzir ou eliminar a expressão de pelo menos uma RNase.

88. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 ou 87, caracterizada por a RNase ser uma endoribonuclease ou uma exoribonuclease.

89. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, caracterizada por o ADAS ter sido modificado para ter lipopolissacarídeo reduzido (LPS).

90. Composição, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada por o ADAS ser produzido a partir de bactérias parentais que foram modificadas para ter LPS reduzido.

91. Composição, de acordo com a reivindicação 89, caracterizada por a modificação ser uma mutação na biossíntese de

Lipídeo A miristoiltransferase (msbB).

92. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 91, caracterizada por o ADAS ser derivado de bactérias parentais que são um agente patogênico de mamífero ou uma bactéria comensal de mamífero.

93. Composição, de acordo com a reivindicação 92, caracterizada por a bactéria comensal de mamífero ser as espécies Staphylococcus, Bifidobacterium, Micrococcus, Lactobacillus ou Actinomycesou, ou a bactéria patogênica de mamífero ser Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC), Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia enterolitica ou Helicobacter pylori.

94. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 91, caracterizada por o ADAS ser derivado de bactéria parental que é um patógeno de planta ou uma bactéria comensal de planta.

95. Composição, de acordo com a reivindicação 94, caracterizada por a bactéria comensal da planta ser Bacillus subtilis ou Psuedomonas putida ou a bactéria patogênica da planta ser uma espécie de Xanthomonas ou Pseudomonas syringae.

96. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 95, caracterizada por o ADAS ser derivado de bactéria parental auxotrófica.

97. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 96, caracterizada por o ADAS ser liofilizado e reconstituído, e em que o ADAS reconstituído tem uma concentração de ATP que é pelo menos 95% da concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado.

98. Composição, de acordo com a reivindicação 97, caracterizada por o ADAS reconstituído ter uma concentração de ATP que é pelo menos igual à concentração de ATP de um ADAS que não foi liofilizado.

99. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 98, caracterizada por a composição ser formulada para entrega a um animal.

100. Composição, de acordo com a reivindicação 99, caracterizada por a composição ser formulada para administração intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, oral, tópica, aerossol ou nebulizada.

101. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 98, caracterizada por a composição ser formulada para entrega a uma planta.

102. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 97, caracterizada por a composição ser formulada para entrega a um inseto.

103. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 99 a 102, caracterizada por a composição ser formulada como um líquido, um sólido, um aerossol, uma pasta, um gel ou uma composição gasosa.

104. Método para entregar um ADAS altamente ativo a uma célula alvo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS altamente ativo, em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

105. Método para entregar um ADAS a uma célula alvo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

106. Método, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracterizado por a célula alvo ser uma célula animal.

107. Método, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracterizado por a célula alvo ser uma célula de planta.

108. Método, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracterizado por a célula alvo ser uma célula de inseto.

109. Método para entregar uma carga a uma célula alvo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição que compreende uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM, o ADAS compreende uma carga e a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

110. Método para entregar uma carga a uma célula alvo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular, o ADAS compreende uma carga, e a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula alvo com a composição da etapa (a).

111. Método, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado por a célula alvo ser uma célula animal.

112. Método, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado por a célula alvo ser uma célula de planta.

113. Método, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado por a célula alvo ser uma célula de inseto.

114. Método para modular um estado de uma célula animal, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

115. Método para modular um estado de uma célula de planta, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

116. Método para modular um estado de uma célula de inseto, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de inseto com a composição da etapa

(a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

117. Método para modular um estado de uma célula animal, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula animal com a composição da etapa (a), em que um estado da célula animal é modulado.

118. Método para modular um estado de uma célula de planta, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de planta com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de planta é modulado.

119. Método para modular um estado de uma célula de inseto, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a célula de inseto com a composição da etapa (a), em que um estado da célula de inseto é modulado.

120. Método de tratamento de um animal em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender:

(a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

121. Método de tratamento de um animal em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar o animal com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim o animal.

122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 ou 121, caracterizado por o animal ter um câncer.

123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 122, caracterizado por o ADAS transportar uma carga de quimioterapia.

124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 122, caracterizado por o ADAS transportar uma carga de imunoterapia.

125. Método de tratamento de uma planta em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de sistemas ativos dinâmicos acromossômicos altamente ativos (ADAS), em que o ADAS tem uma concentração inicial de ATP de pelo menos 1,25 mM e em que a composição está substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga da mesma com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

126. Método de tratamento de uma planta em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma composição compreendendo uma pluralidade de ADAS, em que os ADAS são derivados de bactéria parental possuindo uma redução no nível ou a atividade de um fator de especificidade topológica de divisão celular e em que a composição é substancialmente livre de células bacterianas viáveis; e (b) contatar a planta ou uma praga da mesma com uma quantidade eficaz da composição da etapa (a), tratando assim a planta.

127. Composição, caracterizada por compreender uma pluralidade de ADAS, em que o ADAS compreende uma enzima e em que a enzima altera um substrato para produzir um produto alvo.

128. Composição, de acordo com a reivindicação 127, caracterizada por o substrato estar presente no ADAS e em que o produto alvo é produzido no ADAS.

129. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 ou 128, caracterizada por o substrato estar presente em uma célula ou ambiente alvo ao qual o ADAS é administrado.

130. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 127 a 129, caracterizada por a enzima ser diadenilato ciclase A, o substrato ser ATP e o produto alvo ser di-AMP cíclico.