JP2022513709A - 非染色体性動的活性システム - Google Patents

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Abstract

本発明は、高活性ＡＤＡＳを含めた、単離された非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を提供する。本発明により提供されるこれらのＡＤＡＳは、様々な手段によって入手することができる。これらのＡＤＡＳを作成及び使用する種々の関連する方法が提供される。【選択図】図１Ａ

Description

配列表
本願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。２０１９年１２月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、５１２９６－０３３ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１２．１０．１９＿ＳＴ２５との名称で、サイズが５１，３９３バイトである。
本明細書には、非染色体性動的活性システム並びにその作成及び使用方法が提供される。
細胞を標的化し、及び生物学的薬剤を送達する能力を有する送達ベクター、かかる送達ベクターを含有する組成物、並びに前記ベクターを細胞に送達し、それによって動物、植物、及び昆虫細胞、組織、及び生物を含めた生物学的システムを調節する関連する方法が必要とされている。
本発明は、とりわけ、非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）、例えば、異種カーゴを含むＡＤＡＳ、その作成方法、それを含有する組成物、並びにＡＤＡＳ及び／又はカーゴを送達し及び生物学的システムを調節する関連する方法を提供する。本発明は、少なくとも一部には、特定の実施形態において亢進した活性を有する非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）（即ち、高活性ＡＤＡＳ）の本出願人による発見に基づく。こうした高活性ＡＤＡＳは、化学的働きなどの働き、タンパク質産生、又はカーゴ送達について高い能力を有する。
一態様において、本開示は、複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない組成物の製造方法を特徴とし、この方法は、（ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；（ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に親細菌を曝露することであって、それによりＡＤＡＳを作製すること；及び（ｃ）ＡＤＡＳを親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない複数のＡＤＡＳを含む組成物を作製することを含む。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号１と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチドである。
一部の実施形態において、親細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥである。他の実施形態において、親細菌はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｉｎＥである。
一部の実施形態において、親細菌は、Ｚリング阻害タンパク質のレベル又は活性の低下を呈する。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号２と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号３と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
上記の態様の一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチド又はｍｉｎＤポリペプチドである。
上記の態様の一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、少なくとも２つのＺリング阻害タンパク質の発現の低下、例えば、ｍｉｎＣポリペプチド及びｍｉｎＤポリペプチドの発現の低下を呈する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの発現の低下を呈する。
上記の態様の他の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号４と少なくとも４０％の同一性、例えば、配列番号４と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はＤｉｖＩＶＡポリペプチドである。
一部の実施形態において、親細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、細胞分裂トポロジー特異性因子は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡである。
上記の態様の一部の実施形態において、レベル又は活性の低下は機能喪失型突然変異によって起こる。一部の実施形態において、機能喪失型突然変異はｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失又はＤｉＶＩＶＡが欠失することである。
上記の態様の一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、少なくとも１ｍＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は５０ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する。
上記の態様の一部の実施形態において、親細菌は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブクネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンディダトゥス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロコスフェエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、デクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、デスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルフォタレア属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マグネトスピリルム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ルブリビバックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シンビオバクテリウム属（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はサーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）のいずれか１つであり、細胞分裂トポロジー特異性因子はその親細菌の内因性ｍｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡである。
上記の態様の一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の組成物は、１００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）未満の生存細菌細胞、例えば、１０ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は０．１ＣＦＵ／ｍＬ未満の生存細菌細胞を含む。
上記の態様の一部の実施形態において、ＡＤＡＳはカーゴを含む。
上記の態様の一部の実施形態において、本組成物は動物への送達用に製剤化され；植物への送達用に製剤化され；昆虫への送達用に製剤化され、及び／又は液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル、又は気体組成物として製剤化される。
別の態様において、本開示は、複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を特徴とし、このＡＤＡＳは少なくとも１ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、少なくとも１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、２ｍＭ、又は２．５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する。
更に別の態様において、本開示は、複数の高活性ＡＤＡＳを含む組成物を特徴とし、このＡＤＡＳは少なくとも３ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。
一部の実施形態において、本ＡＤＡＳ組成物は、少なくとも４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は５０ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する。
本組成物の一部の実施形態において、ＡＤＡＳのＡＴＰ濃度は、３７℃で１２時間インキュベートした後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％増加する。
本組成物の一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来する。
なおも他の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物を特徴とし、このＡＤＡＳは細胞分裂トポロジー特異性因子を含まず、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。
更に別の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない、且つ（ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；（ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に親細菌を曝露することであって、それにより高活性ＡＤＡＳを作製すること；及び（ｃ）ＡＤＡＳを親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない組成物を作製することを含む方法によって作製される組成物を特徴とする。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号１と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチドである。
一部の実施形態において、親細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥである。
一部の実施形態において、親細菌はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｉｎＥである。
一部の実施形態において、親細菌は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブクネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンディダトゥス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロコスフェエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、デクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、デスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルフォタレア属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マグネトスピリルム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ルブリビバックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シンビオバクテリウム属（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はサーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）であり、細胞分裂トポロジー特異性因子はその親細菌の内因性ｍｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳはＺリング阻害タンパク質のレベルの低下を呈する。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号２と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、配列番号３と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＤポリペプチドである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは少なくとも２つのＺリング阻害タンパク質の発現の低下を呈する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、ｍｉｎＣポリペプチド及びｍｉｎＤポリペプチドの発現の低下を呈する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの発現の低下を呈する。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号４と少なくとも４０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、配列番号４と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はＤｉｖＩＶＡポリペプチドである。
一部の実施形態において、親細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、細胞分裂トポロジー特異性因子は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡである。
一部の実施形態において、レベル又は活性の低下は機能喪失型突然変異によって起こる。
一部の実施形態において、機能喪失型突然変異は遺伝子欠失である。
一部の実施形態において、機能喪失型突然変異は誘導性機能喪失型突然変異であり、機能喪失は、親細胞を誘導条件に曝露することによって誘導される。
一部の実施形態において、誘導性機能喪失型突然変異は温度感受性突然変異であり、誘導条件は温度条件である。
一部の実施形態において、親細胞はｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失を有する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは機能性転写システムと機能性翻訳システムとを含む。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは異種タンパク質を産生する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、プラスミドであって、誘導性プロモーターと異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを含み、ＡＤＡＳを適切な条件下で誘導性プロモーターの誘導物質と接触させると、異種タンパク質が産生されることになる。
一部の実施形態において、異種タンパク質の産生は、誘導物質と接触させていないＡＤＡＳと比べて誘導物質と接触させたＡＤＡＳにおいて少なくとも１．６倍に増加する。
一部の実施形態において、異種タンパク質の産生速度は、ＡＤＡＳを誘導物質と接触させてから３時間以内に目標レベルに達する。
一部の実施形態において、異種タンパク質は少なくとも各ＡＤＡＳにつき毎時０．１フェムトグラムの速度で産生される。
一部の実施形態において、異種タンパク質は、少なくとも８時間の持続期間にわたって産生される。
一部の実施形態において、本組成物は、１００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）未満の生存細菌細胞を含む。
一部の実施形態において、本組成物は、１０ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は０．１ＣＦＵ／ｍＬ未満の生存細菌細胞を含む。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳはカーゴを含む。
一部の実施形態において、カーゴは、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）である。
一部の実施形態において、カーゴはＡＤＡＳに封入される。
一部の実施形態において、カーゴはＡＤＡＳの表面に取り付けられる。
一部の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミドである。
一部の実施形態において、核酸はタンパク質をコードする。
一部の実施形態において、酵素は、標的産物が産生されるように基質を変化させる。
一部の実施形態において、基質はＡＤＡＳに存在し、標的産物はＡＤＡＳにおいて産生される。
一部の実施形態において、基質は、ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは異種細菌分泌装置を含む。
一部の実施形態において、異種細菌分泌装置は３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）である。
一部の実施形態において、カーゴは、細菌分泌装置による細胞外移行を仕向ける部分を含む。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳはターゲティング部分を含む。
一部の実施形態において、ターゲティング部分は、ナノボディ、糖質結合タンパク質、又は腫瘍ターゲティングペプチドである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、野生型親細菌から作製されたＡＤＡＳと比べてプロテアーゼレベル又は活性の低下を呈する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、少なくとも１つのプロテアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、野生型親（ｐａｔｅｎｔ）細菌から作製されたＡＤＡＳと比べてＲＮアーゼレベル又は活性の低下を呈する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、少なくとも１つのＲＮアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される。
一部の実施形態において、ＲＮアーゼはエンドリボヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、低下したリポ多糖（ＬＰＳ）を呈するように修飾されている。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、低下したＬＰＳを呈するように修飾されている親細菌から作製される。
一部の実施形態において、この修飾は、リピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼ（ｍｓｂＢ）の突然変異である。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、哺乳類の病原体である親細菌又は哺乳類にとって片利共生性の親細菌に由来する。
一部の実施形態において、哺乳類片利共生細菌は、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、又はアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種であり、又は哺乳類病原性細菌は、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、又はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）である。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、植物病原体である親細菌又は植物にとって片利共生性の親細菌に由来する。
一部の実施形態において、植物片利共生細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）であり、又は植物病原性細菌はキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種又はシリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）である。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは栄養要求性親細菌に由来する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは凍結乾燥及び再構成され、ここで再構成されたＡＤＡＳは、凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度の少なくとも９５％であるＡＴＰ濃度を有する。
一部の実施形態において、再構成されたＡＤＡＳは、凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度と少なくとも等しいＡＴＰ濃度を有する。
一部の実施形態において、本組成物は動物への送達用に製剤化される。
一部の実施形態において、本組成物は、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口、局所、エアロゾル、又は噴霧投与用に製剤化される。
一部の実施形態において、本組成物は植物への送達用に製剤化される。
一部の実施形態において、本組成物は昆虫への送達用に製剤化される。
一部の実施形態において、本組成物は、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル、又は気体組成物として製剤化される。
別の態様において、本発明は、標的細胞への高活性ＡＤＡＳの送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性ＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
更に別の態様において、本発明は、標的細胞へのＡＤＡＳの送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
かかる複数のＡＤＡＳを送達する方法に関する一部の実施形態において、標的細胞は、動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞である。
更に別の態様において、本発明は、標的細胞へのカーゴの送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
更に別の態様において、本発明は、標的細胞へのカーゴの送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
カーゴを送達することに関する実施形態において、標的細胞は、動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞である。
別の態様において、本発明は、動物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって動物細胞の状態が調節されることを含む。
更に別の態様において、本方法は、植物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって植物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、昆虫細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）昆虫細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって昆虫細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、動物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって動物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、植物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって植物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、昆虫細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）昆虫細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって昆虫細胞の状態が調節されることを含む。
更に別の態様において、本発明は、それを必要としている動物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより動物を処置することを含む。
更に別の態様において、本発明は、それを必要としている動物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより動物を処置することを含む。
動物を処置する一部の実施形態において、動物は癌を有する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは化学療法カーゴ（例えば、免疫療法カーゴ）を担持する。
更に別の態様において、本発明は、それを必要としている植物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物又はその有害生物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより植物を処置することを含む。
更に別の態様において、本発明は、それを必要としている植物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物又はその有害生物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより植物を処置することを含む。
別の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物を特徴とし、このＡＤＡＳは酵素を含み、及びこの酵素は、標的産物が産生されるように基質を変化させる。
この組成物の一部の実施形態において、基質はＡＤＡＳに存在し、標的産物はＡＤＡＳにおいて産生される。
一部の実施形態において、基質は、ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する。
一部の実施形態において、酵素はジアデニル酸シクラーゼＡであり、基質はＡＴＰであり、及び標的産物は環状ジ－ＡＭＰである。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞及びそれに由来する非染色体性動的活性細胞（ＡＤＡＳ）を示す一組の走査型電子顕微鏡写真である。左の列は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ００９の細菌細胞を示し、これはＡＤＡＳを産生するように修飾されていない。中央の列は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ０６０（ΔｍｉｎＣＤＥ）の細菌細胞を示し、これはＡＤＡＳを産生するように修飾されている。ＡＤＡＳ及び異常な隔壁形成イベントを起こしている親細胞が見える。右の列は、ＭＡＣＨ０６０（ΔｍｉｎＣＤＥ）培養物から精製したＡＤＡＳを示す。 ＭＡＣＨ０６０（ΔｍｉｎＣＤＥ）に由来するＡＤＡＳを示す一組の顕微鏡写真である。左のパネルは、粒子の位置を示す位相差画像である。中央のパネルは、ＤＮＡ染色ＤＡＰＩの局在を示す免疫蛍光画像である。右のパネルは、リポ多糖（ＬＰＳ）の染色の局在を示す免疫蛍光画像である。白色の矢印がＡＤＡＳを指し、これは、ＬＰＳ染色があって、且つＤＡＰＩ染色がないことにより同定される。スケールバーは１０μｍである。 Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１ナノ粒子アナライザーを用いて測定したときの、ＡＤＡＳ産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）からの精製ＡＤＡＳ集団中における所与の直径を有する粒子の濃度（粒子／ｍＬ単位）を示すグラフである。 精製ＡＤＡＳ調製物中の直径２００～２０００ｎｍの粒子の凝集体体積を示す棒グラフである。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）培養物及びこの培養物から精製したＡＤＡＳ調製物に存在する生存細菌細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ単位での濃度を示す棒グラフである。 ＡＤＡＳ産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ２００（両方ともにΔｍｉｎＣＤＥ）の培養物並びに各培養物から精製したＡＤＡＳ調製物のＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬに関するイムノブロットの画像である。１０ｎｇの精製ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬを対照として提供する（Ｒｅｃｏｍｂ．Ｐｒｏｔ．）。 ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）微生物細胞生存能力アッセイを用いて測定したときの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ０６０（ΔｍｉｎＣＤＥ）からの精製ＡＤＡＳ集団中におけるｍＭｏｌ単位での平均ＡＴＰ濃度を示す棒グラフである。親細菌によって生じたＡＴＰ濃度をバックグラウンドとして差し引いた。 ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）微生物細胞生存能力アッセイを用いて測定したときの、０時間又は過剰量の栄養素の存在下３７℃で２時間の振盪インキュベーション後における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＡＣＨ０６０（ΔｍｉｎＣＤＥ）からの精製ＡＤＡＳ集団のアリコートの発光を示す棒グラフである。 ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートしたＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）培養物及びこの培養物から精製したＡＤＡＳ調製物の時間の経過に伴うＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフである。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。親細菌の濃度は、ＡＤＡＳ調製物に検出されるＣＦＵ数に相当するものであった（１００ＣＦＵ／ｍＬ）。 Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１ナノ粒子アナライザーを用いて測定したときの、調製物中のＡＤＡＳ数で正規化した図２ＣのＧＦＰ蛍光データを示すグラフである。このグラフ中、データは１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりの誘導倍数として示される。 図２Ｃの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）から精製して誘導物質アンヒドロテトラサイクリンの存在下で０、２、４、１７、又は２４時間成長させた精製ＡＤＡＳ調製物からの２５０μＬアリコートにおけるＧＦＰのイムノブロットの一組の画像である（上のパネル）。各レーンが、ｎＣＳ１分析により決定したときの約５．２×１０７個のＡＤＡＳに対応する。ＧＦＰ強度はデンシトメトリーにより定量化し、ローディング対照ＧｒｏＥＬの強度で正規化し、同じブロットで処理した精製組換えＧＦＰの分子標準との比較によってＧＦＰの質量（ｎｇ単位）に変換した（下のパネル）。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）、ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）、及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌株から精製したＡＤＡＳ調製物の時間の経過に伴う１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりのＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフである。ＡＤＡＳは、ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、各誘導したレプリケートから非誘導レプリケートの平均値を差し引くことにより計算した。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。 図３Ａの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）、ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）、及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）から精製して誘導物質アンヒドロテトラサイクリンの存在下（＋）又は非存在下（－）で成長させたＡＤＡＳにおけるＧＦＰのイムノブロットの画像である。 図３Ｃのイムノブロットのバックグラウンド補正を示す棒グラフである。 図３Ｃのイムノブロットの正規化ＧＦＰ密度を示す棒グラフである。ＧＦＰ強度はデンシトメトリーにより定量化し、ローディング対照ＧｒｏＥＬの強度で正規化した。 ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）マイクロプレートリーダーを用いて測定したときの、ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）、ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）、及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）から精製したＡＤＡＳにおける蛍光単位（ａｕ）での総ＧＦＰ産生量を示す棒グラフである。＊＊は０．００２１のｐ値を示す。＊＊＊は０．０００６のｐ値を示す。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）、ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）、及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）から精製したＡＤＡＳの毎時ＧＦＰ産生量を示す棒グラフである。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）から作製したＡＤＡＳに対するＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）から精製したＡＤＡＳのＧＦＰ産生の相対的な割合を示す棒グラフである。ＭＡＣＨ１２４のタンパク質産生レベルを１００％に設定し、ＭＡＣＨ５５６及びＭＡＣＨ５５７についての相対的なタンパク質産生量をＭＡＣＨ１２４で正規化した。 培養物の光学濃度（ＯＤ６００）で正規化した、ＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ２８４から精製したＡＤＡＳのＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０フルオロフォアの蛍光を示す棒グラフである。ＭＡＣＨ２８４は、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０フルオロフォアにコンジュゲートした抗体によって検出可能なＮｅａｅ－ＮＢ２（ナノボディ）融合タンパク質を発現する。 ＭＡＣＨ０６０から精製したＡＤＡＳ、ＭＡＣＨ１９８から精製した非誘導ＡＤＡＳ、及び酵素ジアデニル酸シクラーゼＡ（ｄｅａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ Ａ）（ＤａｃＡ）を産生するようにアンヒドロテトラサイクリンで誘導したＭＡＣＨ１９８から精製したＡＤＡＳと接触させたＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）単球におけるＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）システムの発光リードアウトを示す棒グラフである。 ＭＡＣＨ０６０から精製したＡＤＡＳ、ＭＡＣＨ１９８から精製した非誘導ＡＤＡＳ、及び酵素ＤａｃＡを産生するようにアンヒドロテトラサイクリンで誘導したＭＡＣＨ１９８から精製したＡＤＡＳと接触させたＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）単球の表現型を示す一組の顕微鏡写真である。 ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定したときの、ＭＡＣＨ０６０から精製したＡＤＡＳ、ＭＡＣＨ１９８から精製した非誘導ＡＤＡＳ、及び酵素ＤａｃＡを産生するようにアンヒドロテトラサイクリンで誘導したＭＡＣＨ１９８から精製したＡＤＡＳと接触させたＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）単球によって培養物中に分泌されたｐｇ／ｍＬ単位でのインターフェロンβ（ＩＦＮ－Ｂ１）の濃度を示す棒グラフである。 ヨーロッパアワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ：ＥＣＢ）幼虫におけるＭＡＣＨ３０１に由来するＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル標識ＡＤＡＳの蛍光を示す一組の顕微鏡写真である。パネルＡ及びＢはＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００の蛍光を示す。パネルＣ及びＤは、７００ｎｍでの幼虫の自己蛍光を示す。パネルＡ及びＣは、ＰＢＳを与えた対照幼虫を示し、パネルＢ及びＤは、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル標識ＡＤＡＳを与えた幼虫を示す。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌株から精製したＡＤＡＳ調製物における時間の経過に伴う１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりのＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフであり、ここでＡＤＡＳ調製物は４℃で０日間又は３日間貯蔵した。ＡＤＡＳは、ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、各誘導したレプリケートから非誘導レプリケートの平均値を差し引くことにより計算した。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。 ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌株から精製したＡＤＡＳ調製物における時間の経過に伴う１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりのＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフであり、ここでＡＤＡＳ調製物は４℃で０日間又は３日間貯蔵した。ＡＤＡＳは、ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、各誘導したレプリケートから非誘導レプリケートの平均値を差し引くことにより計算した。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。 ＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌株から精製したＡＤＡＳ調製物における時間の経過に伴う１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりのＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフであり、ここでＡＤＡＳ調製物は４℃で０日間又は３日間貯蔵した。ＡＤＡＳは、ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、各誘導したレプリケートから非誘導レプリケートの平均値を差し引くことにより計算した。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。 図７Ａの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 図７Ｂの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 図７Ｃの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌株から精製したＡＤＡＳ調製物における時間の経過に伴う１０８個のＡＤＡＳ粒子当たりのＧＦＰ蛍光（ａｕ）を示すグラフであり、ここでＡＤＡＳ調製物は凍結乾燥し、６週間貯蔵し、再水和した。ＡＤＡＳは、ＧＦＰの発現を活性化させる誘導物質アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、各誘導したレプリケートから非誘導レプリケートの平均値を差し引くことにより計算した。試料は全て、いかなる細菌成長も防ぐため抗生物質の存在下で成長させた。 図７Ｇの誘導したＡＤＡＳ調製物と非誘導ＡＤＡＳ調製物との間でのＧＦＰ蛍光の変化倍数を示すグラフである。変化倍数は、誘導したレプリケートの平均値を非誘導レプリケートの平均値で除すことにより計算した。 ヒスチジン不含及びメチオニン不含培地に貯蔵した対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞株ＭＡＣＨ０６０又は栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞株ＭＡＣＨ００２から精製したＡＤＡＳ調製物中の親細菌細胞の数（ＣＦＵ／ｍＬ単位）を示す棒グラフである。 ロイシン不含培地に貯蔵した対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞株ＭＡＣＨ１７８又は栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞株ＭＡＣＨ１５１から精製したＡＤＡＳ調製物中の親細菌細胞の数（ＣＦＵ／ｍＬ単位）を示す棒グラフである。
Ｉ．定義
本明細書で使用されるとき、用語「非染色体性動的システム」又は「ＡＤＡＳ」は、少なくとも１つの膜を含む、且つカーゴ（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のうちの１つ以上）を収容するのに好適な内部容積を有する、ゲノムフリーの複製しない閉じた膜系を指す。一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、親細菌細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）に由来するミニ細胞又は修飾されたミニ細胞である。ＡＤＡＳは、任意の好適な方法、例えば、親細胞の遺伝子操作又は細菌性ミニ細胞の形成可能性を増加させる培養液若しくは条件への曝露を用いて親細菌から得られてもよい。ＡＤＡＳの例示的な作成方法は、親細胞の細胞分裂機構を破壊するものである。一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、親細胞表面の１つ以上の内因性又は異種性の特徴、例えば、細胞壁、細胞壁修飾、鞭毛、又は線毛、及び／又は親細胞の内部容積の１つ以上の内因性又は異種性の特徴、例えば、核酸、プラスミド、タンパク質、小分子、転写機構、又は翻訳機構を含み得る。他の実施形態において、ＡＤＡＳは、親細胞の１つ以上の特徴を欠いていてもよい。なおも他の実施形態において、ＡＤＡＳは、親細胞に含まれない特徴が負荷されるか、又は別様にそれで修飾されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「高活性ＡＤＡＳ」は、働きの潜在力が高いＡＤＡＳ、例えば、多量の有用な働きを行う能力を有するＡＤＡＳを指す。働きとは、好適な条件下での化学合成（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、ポリマー、又は小分子の合成）、化学修飾（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、ポリマー又は小分子の修飾）、又は輸送（例えば、細胞内移行、細胞外移行、又は分泌）を含めた代謝的働きであり得る。特定の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、エネルギー、例えばＡＴＰの形態のエネルギーの大きいプールから始まる。他の実施形態において、ＡＤＡＳは、別の供給源からエネルギー／ＡＴＰを取り込む又は生成する能力を有する。高活性ＡＤＡＳは、例えば、ＡＴＰ濃度の増加、ＡＴＰの生成能力の増加、タンパク質の産生能力の増加、又はタンパク質産生速度又は産生量の増加、及び／又は生物学的シグナル、例えばプロモーターの誘導に対する応答性の増加を呈することによって同定されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「親細菌細胞」は、ＡＤＡＳの由来元である細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）を指す。親細菌細胞は、典型的には生存細菌細胞である。用語「生存細菌細胞」は、ゲノムを含有していて細胞分裂能を有する細菌細胞を指す。好ましい親細菌細胞は、表４の株のいずれかに由来する。
親細菌細胞及び／又は生存細菌細胞を「実質的に含まない」ＡＤＡＳ組成物又は調製物とは、本明細書では、１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）が５００以下、例えば、４００、３００、２００、１５０、１００又はそれより少ない組成物として定義される。親細菌細胞又は生存細菌細胞を実質的に含まないＡＤＡＳ組成物は、細菌細胞不含を含め、５０ＣＦＵ／ｍＬより少ない、２５ＣＦＵ／ｍＬより少ない、１０ＣＦＵ／ｍＬより少ない、５ＣＦＵ／ｍＬより少ない、１ＣＦＵ／ｍＬより少ない、０．１ＣＦＵ／ｍＬより少ない、又は０．００１ＣＦＵ／ｍＬより少ない細菌細胞を含み得る。
用語「細胞分裂トポロジー特異性因子」は、隔壁部位の決定に関わる、且つ細胞分裂機構の他の成分の位置を制限することによって機能する、例えば、１つ以上のＺリング阻害タンパク質の位置を制限することによって機能する細菌種における細胞分裂機構の一成分を指す。例示的細胞分裂トポロジー特異性因子にはｍｉｎＥが含まれ、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において最初に発見されたもので、以来、幅広い種類のグラム陰性細菌種及びグラム陽性細菌種に同定されている（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。ｍｉｎＥは、Ｚリング阻害タンパク質ｍｉｎＣ及びｍｉｎＤを細胞極に制限することによって機能する。第２の例示的細胞分裂トポロジー特異性因子はＤｉｖＩＶＡであり、これは最初に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において最初に発見されたものである（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。
用語「Ｚリング阻害タンパク質」は、隔壁部位の決定に関わる、且つ安定ＦｔｓＺリングの形成を阻害するか又はかかる成分を膜に係留することによって機能する細菌種における細胞分裂機構の一成分を指す。Ｚリング阻害タンパク質の局在性は、細胞分裂トポロジー特異性因子、例えばＭｉｎＥ及びＤｉｖＩＶＡによって調節され得る。例示的Ｚリング阻害タンパク質にはｍｉｎＣ及びｍｉｎＤが含まれ、これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において最初に発見されたもので、以来、幅広い種類のグラム陰性細菌種及びグラム陽性細菌種に同定されている（Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、及び他の種では、ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、及びｍｉｎＥは同じ遺伝子座に現れ、これらは「ｍｉｎオペロン」、ｍｉｎＣＤＥオペロン、又はｍｉｎ若しくはｍｉｎＣＤＥ遺伝子座と称されることもある。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下」は、参照試料（例えば、野生型細胞又は野生型ｍｉｎＣＤＥオペロン若しくは野生型ｄｉｖＩＶＡ遺伝子を有する細胞から作製されたＡＤＡＳ）、参照細胞（例えば、野生型細胞又は野生型ｍｉｎＣ、ｍｉｎＤ、ｍｉｎＥ、ｄｉｖＩＶＡ、又はｍｉｎＣＤＥ遺伝子若しくはオペロンを有する細胞）、対照試料、又は対照細胞のレベルと比較したときの、標準方法により検出される細胞トポロジー特異性因子（例えば、タンパク質又は核酸（例えば、遺伝子又はｍＲＮＡ））のレベル又は活性の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のいずれか、又はそれ以上の全体的低下を指す。一部の実施形態において、低下したレベル又は活性とは、参照試料、参照細胞、対照試料、又は対照細胞における細胞トポロジー特異性因子のレベル又は活性の少なくとも約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、又は０．０１倍である試料中のレベル又は活性の減少を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「パーセント同一性」は、標準的な技法によるアラインメント後の参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対するパーセント（％）配列同一性を指す。パーセント核酸又はアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当業者の能力の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、又はＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて実現することができる。当業者は、比較下の配列の全長にわたって最大限のアラインメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。例えば、パーセント配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成されてもよい。例示として、所与の核酸又はアミノ酸配列Ａの、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、又はそれと比べたパーセント配列同一性（これは或いは、所与の核酸又はアミノ酸配列Ｂに対して、それと、又はそれと比べてある特定のパーセント配列同一性を有する所与の核酸又はアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のとおり計算される：
１００×（比Ｘ／Ｙ）
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によりＡ及びＢの当該プログラムのアラインメントにおいて完全な一致と評価されたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、及び式中、Ｙは、Ｂのヌクレオチド又はアミノ酸の総数である）。一部の実施形態において、配列同一性、例えばＭｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡタンパク質の相同体の配列同一性は、本明細書に開示されるとおりの天然配列ＭｉｎＥ（又はｍｉｎＥ）又はＤｉｖＩＶＡ（又はｄｉｖＩＶＡ）配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は更には９５％又はそれ以上のアミノ酸又は核酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はそれ以上のアミノ酸配列又は核酸同一性を有することになる。
表現「細胞の状態を調節する」は、本明細書で使用されるとき、当該技術分野においてかかる測定に関して公知の技法及び方法、例えば、タンパク質、転写物、エピジェネティック標識のレベル若しくは発現を測定する方法、又は生物学的経路の活性の増加若しくは低下を測定する方法を用いて測定したときの、細胞（例えば、動物、植物、又は昆虫細胞）の状態（例えば、トランスクリプトーム、プロテオーム、エピゲノム、生物学的効果、又は健康若しくは疾患状態）の観測可能な変化を指す。細胞の状態を調節すると、投与前と比べて少なくとも１％（例えば、投与前と比べて少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも９８％又はそれ以上；例えば、投与前と比べて最大１００％）の変化が生じ得る。一部の実施形態において、細胞の状態を調節することには、細胞のパラメータ（例えば、タンパク質、転写物のレベル若しくは発現、又は生物学的経路の活性）を増加させることが関わる。細胞の状態を増加させると、投与前と比べて少なくとも１％（例えば、投与前と比べて少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも９８％又はそれ以上；例えば、投与前と比べて最大１００％）のパラメータの増加が生じ得る。他の実施形態において、の状態を調節することには、細胞のパラメータ（例えば、タンパク質、転写物のレベル若しくは発現、又は生物学的経路の活性）を減少させることが関わる。細胞の状態を減少させると、投与前と比べて少なくとも１％（例えば、投与前と比べて少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも９８％又はそれ以上；例えば、投与前と比べて最大１００％）のパラメータの減少が生じ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「異種」は、その天然に存在する状態にある細胞又は組成物にとって自然ではないことを意味する。一部の実施形態において、「異種」は、ＡＤＡＳ又はそれが作製される元となる親細菌（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）に天然に見出されない分子；例えば、カーゴ又はペイロード（例えば、ポリペプチド、タンパク質をコードするＲＮＡ又はｔＲＮＡなどの核酸、又は小分子）又は構造（例えば、プラスミド又は遺伝子編集システム）を指す。
ＩＩ．組成物
Ａ．ＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳ
本発明は、少なくとも一部には、数多くの環境で幅広い機能を提供することが可能な、高活性ＡＤＡＳを含めた非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）の本出願人による発見に基づく。「ＡＤＡＳ」は、少なくとも１つの膜（一部の実施形態では２つの膜、これらの２つの膜は交わらない）を含む、且つカーゴ（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ））を収容するのに好適な内部容積を有する、ゲノムフリーの複製しない閉じた膜系である。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、親細菌細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞）に由来するミニ細胞又は修飾されたミニ細胞である。ＡＤＡＳは、任意の好適な方法、例えば、親細胞の遺伝子操作又は細菌性ミニ細胞の形成可能性を増加させる培養液若しくは条件への曝露を用いて親細菌から得られてもよい。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、約１００ｎｍ～５００μｍ（例えば、特定の実施形態において、約：１００～６００ｎｍ、例えば１００～４００ｎｍ；又は約０．５～１０μｍ、及び１０～５００μｍ）の長軸断面を有する。特定の実施形態において、ＡＤＡＳは、長軸の約：０．００１、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、最大１００％の短軸断面を有する。特定の実施形態において、ＡＤＡＳは、約：０．００１～１μｍ３、０．３～５μｍ３、５～４０００μｍ３、又は４０００～５０×１０７μｍ３の内部容積を有する。
一部の実施形態において、本発明は高活性ＡＤＡＳを提供する。「高活性」ＡＤＡＳは、働きの潜在力が高いＡＤＡＳ、例えば、多量の有用な働きを行う能力を有するＡＤＡＳである。働きとは、好適な条件下での、例えば、化学合成（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、ポリマー、又は小分子の合成）、化学修飾（例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、ポリマー又は小分子の修飾）、又は輸送（例えば、細胞内移行、細胞外移行、又は分泌）を含めた代謝的働きとして定義することができる。一部の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、エネルギー、例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態のエネルギーの大きいプールから始まる。他の実施形態において、ＡＤＡＳは、別の供給源からエネルギー（例えば、ＡＴＰ）を取り込む又は生成する能力を有する。用語「本発明により提供されるＡＤＡＳ」は、本発明により提供されるＡＤＡＳの一部である、詳細な実施形態ではその一組を「本発明により提供される高活性ＡＤＡＳ」と称することができる高活性ＡＤＡＳを含め、本明細書に記載されるＡＤＡＳの全ての実施形態を包含する。
一態様において、本発明は、複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは少なくとも１ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。
別の態様において、本発明は、複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは少なくとも３ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。
一部の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、少なくとも１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｎＭ、３．５ｎＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は５０ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する。ＡＴＰ濃度は、特定の実施形態では溶解したＡＤＡＳに対するＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含め、種々の手段によって評価することができる。
それに加えて又は代えて、高活性は、時間の経過に伴うＡＤＡＳ中のＡＴＰ濃度の増加速度又は増加量として判定されてもよい。一部の実施形態において、ＡＤＡＳのＡＴＰ濃度は、好適な条件下でのインキュベーション後、例えば、３７℃で１２時間のインキュベーション後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又は２００％超増加する。特定の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、約：０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、５００、１０００、１００００ＡＴＰ／秒／ｎｍ２より高いＡＴＰ生成速度を少なくとも約：１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、４日間、１週間、又は２週間有する。
他の態様において、高活性は、時間の経過に伴うＡＴＰ濃度の減少速度として判定される。一部の実施形態において、高活性のＡＤＡＳのＡＴＰ濃度は、高活性でないＡＤＡＳほど急速には減少しないものであってよい。一部の実施形態において、調製後２４時間におけるＡＤＡＳ又はＡＤＡＳ組成物中のＡＴＰ濃度の降下は、例えばＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定したとき、初期ＡＴＰ濃度（例えば、細胞容積当たりのＡＴＰ）と比較して約５０％未満（例えば、約：４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５％未満）である。
それに加えて又は代えて、高活性はＡＤＡＳの寿命指数として判定されてもよい。寿命指数は、３０分時点に対する２４時間時点のＧＦＰ産生速度の比として計算される。一部の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、約：０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１８、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４５、０．５、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０、１．０又はそれ以上より高い寿命指数を有する。より詳細な実施形態において、寿命指数は、機能性ＧＦＰプラスミドを種に適切なプロモーターと共に含有するＡＤＡＳで測定され、ここでＧＦＰ濃度は、３０分及び２４時間の時点でプレートリーダーにより、ＡＤＡＳ数、各ＡＤＡＳの平均プラスミド数、及び溶液体積に対して測定される。
一部の態様において、ＡＤＡＳはタンパク質、例えば異種タンパク質を産生する。一部の態様において、高活性は、タンパク質の産生速度、産生量、若しくは産生期間又はタンパク質の発現誘導速度（例えば、シグナルに対するＡＤＡＳの応答性）として判定される。例えば、ＡＤＡＳは、プラスミドであって、誘導性プロモーターと異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを含んでもよく、ここでＡＤＡＳを適切な条件下で誘導性プロモーターの誘導物質と接触させると、異種タンパク質が産生されることになる。一部の態様において、異種タンパク質の産生は、誘導物質と接触させたＡＤＡＳ、例えば高活性ＡＤＡＳにおいて、誘導物質と接触させていないＡＤＡＳと比べて少なくとも１．６倍に増加する。例えば、一部の実施形態において、異種タンパク質の産生は、誘導物質と接触させたＡＤＡＳ、例えば高活性ＡＤＡＳにおいて少なくとも１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、又は１０倍超に増加する。一部の実施形態において、高活性ＡＤＡＳによる異種タンパク質の産生速度は、ＡＤＡＳを誘導物質と接触させた後、特定の期間内、例えば、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、又は３時間超以内に目標レベルに達する。一部の実施形態において、タンパク質（例えば、異種タンパク質）は、各高活性ＡＤＡＳにつき少なくとも毎時０．１フェムトグラム、例えば、各ＡＤＡＳにつき少なくとも０．２ ０．４、０．６、０．８、１、２、４、６、８、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、３０００、又は３５００ｆｇ／時間の速度で産生される。一部の実施形態において、ＡＤＡＳの高活性は、タンパク質が産生されている期間として判定される。高活性ＡＤＡＳは、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、又は４８時間超の期間にわたってタンパク質（例えば異種タンパク質）を産生し得る。
Ｂ．細胞分裂トポロジー特異性因子が欠損している親細菌に由来するＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳ
ＡＤＡＳは、本明細書に記載されるとおりの細菌親細胞に由来し得る。
一部の態様において、本発明は、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル、活性、又は発現の低下を呈する親細菌に由来するＡＤＡＳ及び／又は複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供する。
一部の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは細胞分裂トポロジー特異性因子を含まず、及びこの組成物は生存細菌細胞を実質的に含まない。
一部の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない、且つ（ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；（ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に親細菌を曝露することであって、それにより高活性ＡＤＡＳを作製すること；及び（ｃ）ＡＤＡＳを親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない組成物を作製することを含む方法によって作製される組成物を提供する。
上記の態様の一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥポリペプチド（配列番号１）と少なくとも２０％の同一性、例えば、配列番号１と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はｍｉｎＥポリペプチドである。ｍｉｎＥポリペプチドを有する例示的種は、表４及びＲｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５に提供される。
一部の実施形態において、親細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥである。他の実施形態において、親細菌はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であり、ｍｉｎＥポリペプチドはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｉｎＥである。更に他の実施形態において、親細菌は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブクネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンディダトゥス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロコスフェエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、デクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、デスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルフォタレア属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マグネトスピリルム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ルブリビバックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シンビオバクテリウム属（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はサーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）細菌であり、細胞分裂トポロジー特異性因子はその親細菌の内因性ｍｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡである。
上記の態様の一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡポリペプチド（配列番号４）と少なくとも２０％の同一性、例えば、配列番号４と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子は配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子はＤｉｖＩＶＡポリペプチドである。ＤｉｖＩＶＡポリペプチドを有する例示的種は、表４及びＲｏｔｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３：９５９－９６８，２００５に提供される。一部の実施形態において、親細菌は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、細胞分裂トポロジー特異性因子は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡである。
一部の実施形態において、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈するＡＤＡＳ又は親細菌はまた、１つ以上のＺリング阻害タンパク質のレベルの低下も呈する。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＣポリペプチド（配列番号２）と少なくとも２０％の同一性、例えば、配列番号２と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＣポリペプチドである。
一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＤポリペプチド（配列番号３）と少なくとも２０％の同一性、例えば、配列番号３と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｚリング阻害タンパク質はｍｉｎＤポリペプチドである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳ又は親細菌は、少なくとも２つのＺリング阻害タンパク質のレベル、活性、又は発現の低下を呈する。一部の実施形態において、ＡＤＡＳ又は親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド及びｍｉｎＤポリペプチドの発現の低下を呈する。一部の実施形態において、ＡＤＡＳ又は親細菌は、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの発現の低下、例えば、ｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失（ΔｍｉｎＣＤＥ）を呈する。
細胞分裂トポロジー特異性因子又はＺリング阻害タンパク質のレベル、活性、又は発現の低下、例えば、ＡＤＡＳにおける低下又は親細菌細胞における低下は、任意の好適な方法を用いて実現されてもよい。例えば、一部の実施形態において、レベル又は活性の低下は機能喪失型突然変異、例えば遺伝子欠失によって起こる。一部の実施形態において、機能喪失型突然変異は誘導性機能喪失型突然変異であり、及び機能喪失は、親細胞を誘導条件に曝露することによって誘導され、例えば、誘導性機能喪失型突然変異は温度感受性突然変異であり、誘導条件は温度条件である。
一部の実施形態において、親細胞はｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失（ΔｍｉｎＣＤＥ）又は相同オペロンの欠失を有する。
Ｃ．カーゴを含むＡＤＡＳ
一部の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、ＡＤＡＳの内部に収容されたカーゴを含む。カーゴは、ＡＤＡＳの内部に配置された（例えば、ＡＤＡＳに封入された）、又はＡＤＡＳの表面にコンジュゲートされた任意の部分であってよい。一部の実施形態において、カーゴは、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）又は前述の組み合わせを含む。
一部の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミドである。一部の実施形態において、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミド）はタンパク質をコードする。一部の実施形態において、タンパク質はＡＤＡＳにおいて転写及び／又は翻訳される。
一部の実施形態において、カーゴは酵素である。一部の実施形態において、酵素は、標的産物が産生されるように基質を変化させる。一部の実施形態において、基質はＡＤＡＳに存在し、標的産物はＡＤＡＳにおいて産生される。他の実施形態において、基質は、ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する。
特定の実施形態において、カーゴは、非修飾バージョンのカーゴと比較して安定性が向上するように修飾される。カーゴの「安定性」は、同じ環境条件で測定したときの非修飾カーゴの半減期と修飾カーゴ半減期との単位のない比である。一部の実施形態において、環境は実験的に制御され、例えば、疑似体液、ＲＮアーゼフリー水、細胞質、細胞外空間、又は「ＡＤＡＳプラズム」（即ち、ＡＤＡＳの例えば溶解後の内部容積の内容物）である。一部の適用において、それは農業環境、例えば、様々な畑土壌、河川水、又は海洋水である。他の実施形態において、環境は、実際の又は疑似的な：動物の腸、動物の皮膚、動物の生殖器系、動物の気道、動物の血流、又は動物の細胞外空間である。特定の実施形態において、ＡＤＡＳはカーゴを実質的に分解しない。
特定の実施形態において、カーゴはタンパク質を含む。特定の実施形態において、タンパク質は、細胞質又は他の環境において約：１．０１、１．１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１０００００、１０００００００より高い安定性を有する。タンパク質は、成長因子；酵素；ホルモン；免疫調節タンパク質；抗細菌薬、抗真菌薬、殺虫薬タンパク質等などの抗生物質タンパク質；抗体又はナノボディ等などのターゲティング薬剤を含めた任意のタンパク質であってよい。一部の実施形態において、タンパク質は、ホルモン、例えば、パラクリン、エンドクリン、オートクリンである。
一部の実施形態において、カーゴは、アブシジン酸、オーキシン、サイトカイニン、エチレン、ジベレリン、又はこれらの組み合わせなど、植物ホルモンを含む。
特定の実施形態において、カーゴは、免疫賦活薬、チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４の阻害薬）、化学療法剤、抑制薬、スーパー抗原、小分子（シクロスポリンＡ、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、又はＳＴＩＮＧ作動薬（例えば、ＭＫ－１４５４））など、免疫調節薬である。
カーゴを含むＡＤＡＳについて、一部の実施形態では、カーゴは、環状ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はこれらの組み合わせなど、ＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡは、例えばＡＤＡＳプラズムにおいて、約：１．０１、１．１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１０００００、１０００００００より高い安定性を有する。ＲＮＡカーゴは、特定の実施形態では、ｔＲＮＡ足場など、例えばステムループ（ｓｔｅｐ－ｌｏｏｐ）構造の付加によって安定化させることができる。例えば、非ヒトｔＲＮＡＬｙｓ３及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡＭｅｔ（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｏｎｃｈｏｎ ２００７）。両方とも十分に特徴付けられており、組換え発現が行われている。しかしながら、アプタマー、ｌｎｃＲＮＡ、リボザイム等、種々の他のタイプも同様に用いられる可能性がある。ＲＮＡはまた、１つ以上のリボヌクレアーゼがヌルの（又はハイポモルフの）親株からＡＤＡＳを入手する場合にも安定化させることができる。
一部の詳細な実施形態において、ＲＮＡはタンパク質コードｍＲＮＡである。より詳細な実施形態において、タンパク質コードｍＲＮＡは、酵素（例えば、及びヒトＰＢＧＤ（ｈＰＢＧＤ）ｍＲＮＡなど、肝酵素活性を付与する酵素）をコードするか、又は抗原をコードする、例えば、ＣＭＶ糖タンパク質ｇＢ及び／又は五量体複合体（ＰＣ））をコードするｍＲＮＡなど、免疫応答を引き出す抗原（強力で且つ持続性のある中和抗体力価を引き出すなど）をコードする。特定の詳細な実施形態において、ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、又はこれらの組み合わせなど、低分子非コードＲＮＡである。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、遺伝子編集システムを含むカーゴを含む。「遺伝子編集システム」は、好適な関連する核酸と共に、ゲノムＤＮＡ配列などの目的のＤＮＡ配列を目的の配列の挿入によるか欠失によるかに関わらず修飾するとともに、メチル化状態の変化も修飾することができるタンパク質を含む（又はそれをコードする）。例示的遺伝子編集システムとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１又はその他のＲＮＡによって標的化するそのコンパニオンＲＮＡを伴うシステムなどのＣａｓシステム、並びにジンクフィンガーヌクレアーゼ及びヌクレアーゼにコンジュゲートしたＴＡＬエフェクターをベースとするものが挙げられる。
本発明により提供されるＡＤＡＳの他の実施形態は、プラスミドを含め、カーゴとしてＤＮＡを含み、任意選択でこのＤＮＡはタンパク質コード配列を含む。例示的ＤＮＡカーゴとしては、特定の実施形態では、目的のＲＮＡ配列をコードするプラスミド（上記の例を参照のこと）が挙げられ、例えばこれは、両側にｔＲＮＡインサートが隣接しているものであってもよい。様々なＤＮＡカーゴが、ＡＤＡＳを産生する（例えば、ＦＴＺ過剰発現をドライブする、ゲノムを分解するエキソヌクレアーゼ）；長寿命プラスミド（ＡＴＰ合成酵素発現、ロドプシン発現）；安定化非コードＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡを発現するもの；分泌装置タグタンパク質、ＮｌｅＥ２エフェクタードメイン及び局在性タグを発現する；分泌装置Ｔ３／４ＳＳ、Ｔ５ＳＳ、Ｔ６ＳＳ；論理回路、条件的に発現する分泌装置；及びこれらの組み合わせを含め、本発明に包含される。一部の実施形態において、論理回路には、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｌａｃプロモーター及びＡＮＤゲートのｈｒｐＲ部分、並びに、例えば、熱誘導型プロモーターｐＬ（λファージ由来、これは通常は熱不安定性タンパク質によって抑制される）及びＡＮＤゲートのｈｒｐＳ部分など、誘導性発現又は抑制カセットが含まれる。ＯＲゲートを操作するには、Ｒｏｓａｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１８によって記載されるシステム（ｓｙｔｅｍ）を使用することができる。簡潔に言えば、構成的プロモーター下でＲＦＰをコードするシス抑制されたｍＲＮＡを使用することができる。次に、この抑制をＲＡＪ１１ ｓＲＮＡの存在下で取り除くことができる。次に、両方ともにＲＡＪ１１ ｓＲＮＡの発現を誘導するＩＰＴＧ誘導性プロモーターＰＬａｃ及び熱誘導型プロモーターｐＬを含むプラスミドを使用することができる。次に出力はＲＦＰ発現であるものと思われ、これはいずれかの入力に応答して見られるものである。これらのシステムは、種々のセンサー型機能に適合させることができる。
本発明により提供されるＡＤＡＳは、一部の実施形態では、膜に輸送体を含む。特定の実施形態において、輸送体は、グルコース、ナトリウム、カリウム、金属イオン、アニオン性溶質、カチオン性溶質、又は水に特異的である。
一部の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳの膜は、酵素を含む。詳細な実施形態において、酵素は、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はこれらの組み合わせである。一部の実施形態において、酵素はＡＤＡＳ膜に化学的に、任意選択でリンカーを介して外膜にコンジュゲートされる。
Ｄ．分泌装置を含むＡＤＡＳ
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは細菌分泌装置（例えば、内因性細菌分泌装置又は異種分泌装置）を含む。「細菌分泌装置」は、細菌細胞（又は、例えば、それに由来するＡＤＡＳ）の細胞質から細胞外空間、グラム陰性細菌のペリプラズム空間、又は別の細胞の細胞内空間へとカーゴを移行させることができるタンパク質、又はタンパク質複合体である。一部の実施形態において、細菌分泌装置は能動的（例えば、ＡＴＰ依存的又はＰＭＦ依存的）過程によって働き、特定の実施形態では細菌分泌装置は、宿主細胞（又はＡＤＡＳ）から標的細胞に架かるチューブ又はスパイクを含む。他の実施形態において、細菌分泌装置は膜貫通チャネルである。例示的細菌分泌装置としては、カーゴがタンパク質チューブの中を通って横断するチューブ含有構造であるＴ３ＳＳ及びＴ４ＳＳ（及びＴ３／Ｔ４ＳＳ、以下、定義されるとおり）、及びスパイクの末端にカーゴを担持するＴ６ＳＳが挙げられる。他の例示的細菌分泌装置としては、膜貫通型であるＴ１ＳＳ、Ｔ２ＳＳ、Ｔ５ＳＳ、Ｔ７ＳＳ、Ｓｅｃ、及びＴａｔが挙げられる。
一部の実施形態において、異種分泌装置はＴ３ＳＳである。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳはカーゴを含み、ここでカーゴは、細菌分泌装置による細胞外移行を仕向ける部分を含み、例えば、一部の実施形態においてこの部分は、Ｐｈｏ／Ｄ、Ｔａｔ、又は合成ペプチドシグナルである。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは二重膜ＡＤＡＳである。より詳細な実施形態において、二重膜ＡＤＡＳは細菌分泌装置を更に含む。なおもより詳細な実施形態において、細菌分泌装置は、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳから選択され、任意選択でこのＴ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳは、標的細胞の適応度に影響を与えない弱毒化された又は非機能的なエフェクターを有する。
本発明により提供されるＡＤＡＳは、一部の実施形態では、細菌分泌装置を含む。
一部の実施形態において、細菌分泌装置は、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／Ｔ４ＳＳ、又はＴ６ＳＳなど、動物、真菌、細菌、又は植物細胞などの標的細胞へとＡＤＡＳ外膜を越えてカーゴを移行させる能力を有する。
より詳細な実施形態において、細菌分泌装置はＴ３／４ＳＳである。「Ｔ３／４ＳＳ」は、ハイブリッド装置並びに非修飾バージョンを含めた、Ｔ３ＳＳ又はＴ４ＳＳをベースとする分泌装置で、細菌（又はＡＤＡＳ）と標的細胞との間にこれら２つをつないで１つ以上のエフェクターを送達するタンパク質チューブを形成するものである。標的細胞は、動物、植物、真菌、又は細菌であり得る。一部の実施形態において、Ｔ３／４ＳＳはエフェクターを含み、これは修飾されたエフェクターであってもよい。Ｔ３ＳＳ装置の例としては、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＰＩ－１装置、大腸菌（ＥＨＥＣ ｃｏｌｉ）ＥＴＴ１装置、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ Ｃｉｔｒｉ／Ｃａｍｐｅｓｔｒｉ）Ｔ３ＳＳ装置、及びシリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｔ３ＳＳ装置が挙げられる。Ｔ４ＳＳ装置の例としては、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプラスミド装置、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）Ｔ４ＳＳが挙げられる。特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｎｅｔｓ）において、Ｔ３／４ＳＳは、修飾されたエフェクター機能、例えば、ＳｏｐＤ２、ＳｏｐＥ、Ｂｏｐ、Ｍａｐ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＦ、ＮｌｅＣ、ＮｌｅＨ２、又はＮｌｅＥ２から選択されるエフェクターを有する。より詳細な実施形態において、修飾されたエフェクター機能は、核、ゴルジ、ミトコンドリア、アクチン、微絨毛、ＺＯ－１、微小管、又は細胞質の中への移行など、細胞内ターゲティングの機能である。なおもより詳細な実施形態において、修飾されたエフェクター機能は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＮｌｅＥ２に基づく核ターゲティングである。他の詳細な実施形態において、修飾されたエフェクター機能は、糸状仮足形成、タイトジャンクションの破壊、微絨毛の消失、又はＳＧＬＴ－１不活性化の機能である。
他の実施形態において、細菌分泌装置を含む本発明により提供されるＡＤＡＳは、Ｔ６ＳＳを含む。一部の実施形態において、Ｔ６ＳＳは、その天然宿主において、細菌を標的化し、且つその細菌を死滅させるエフェクターを含む。特定の詳細な実施形態において、Ｔ６ＳＳはプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｋ１－Ｔ６ＳＳに由来し、任意選択で、ここでエフェクターはＴｋｅ２のアミノ酸配列（受託番号ＡＵＺ５９４２７．１）、又はその機能性断片を含む。他の実施形態において、Ｔ６ＳＳは、その天然宿主において、真菌を標的化し、且つ真菌を死滅させるエフェクターを含み、例えば、Ｔ６ＳＳは霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ Ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に由来し、エフェクターはＴｆｅ１（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＳＭＤＢ１１＿ＲＳ０５５３０）又はＴｆｅ２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＳＭＤＢ１１＿ＲＳ０５３９０）のアミノ酸配列を含む。
細菌分泌装置を含む本発明により提供されるＡＤＡＳの他の実施形態において、細菌分泌装置はカーゴを細胞外に移行させる能力を有する。特定のより詳細な実施形態において、細菌分泌装置は、Ｔ１ＳＳ、Ｔ２ＳＳ、Ｔ５ＳＳ、Ｔ７ＳＳ、Ｓｅｃ、又はＴａｔである。
Ｅ．プロテアーゼ、ＲＮアーゼ、及び／又はＬＰＳを欠いているＡＤＡＳ
別の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、野生型親細菌から作製されたＡＤＡＳと比べて低下したプロテアーゼレベル又は活性を有する。一部の態様において、ＡＤＡＳは、少なくとも１つのプロテアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される。
別の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、野生型親細菌から作製されたＡＤＡＳと比べて低下したＲＮアーゼレベル又は活性を有する。一部の態様において、ＡＤＡＳは、少なくとも１つのＲＮアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される。一部の実施形態において、ＲＮアーゼはエンドリボヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである。
別の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、低下したリポ多糖（ＬＰＳ）を有するように修飾されている。一部の実施形態において、この修飾は、リピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼ（ｍｓｂＢ）の突然変異である。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、１つ以上の代謝的に非必須のタンパク質を欠いている。「代謝的に非必須のタンパク質」には、網羅的ではないが、線毛、鞭毛、望ましくない分泌装置、トランスポザーゼ、エフェクター、ファージエレメント、又はｆｌｈＣ若しくはＯｍｐＡなどのこれらの調節エレメントが含まれる。一部の実施形態では、本発明により提供されるＡＤＡＳは、ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、又はこれらの組み合わせのうちの１つ以上を欠いており、及び、詳細な実施形態では、１つ以上のエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼｈ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、ＲＮアーゼＰｈｙＭなど）又はエキソリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＰＨ、ＲＮアーゼＤなど）；又はセリン、システイン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びメタロプロテアーゼ；又は前述のいずれかの組み合わせを欠いている。
Ｅ．ターゲティング部分を含むＡＤＡＳ
別の実施形態において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳはターゲティング部分を含む。一部の実施形態において、ターゲティング部分は、ナノボディ、糖質結合タンパク質、又は腫瘍ターゲティングペプチドである。
特定の実施形態において、ナノボディは、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、又はＶＥＧＦ－Ｒなどの腫瘍抗原に向けられるナノボディである。他の実施形態において、糖質結合タンパク質は、レクチン、例えばマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）である。なおも他の実施形態において、腫瘍ターゲティングペプチドは、ＲＧＤモチーフ又はＣｅｎｄＲペプチドである。
Ｆ．片利共生性又は病原性親株に由来するＡＤＡＳ
別の実施形態において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、哺乳類病原体又は哺乳類片利共生細菌である親細菌に由来する。一部の例では、哺乳類片利共生細菌は、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、又はアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種であるか、又は哺乳類病原性細菌は、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、又はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）である。
別の実施形態において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、植物病原体又は植物片利共生細菌である親細菌に由来する。一部の例では、植物片利共生細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）であり、又は植物病原性細菌はキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種又はシリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）である。
Ｇ．栄養要求性親株に由来するＡＤＡＳ
別の実施形態において、本発明は、複数のＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供し、このＡＤＡＳは、栄養要求性親細菌、即ち、成長に必要な有機化合物を合成する能力がない親細菌に由来する。かかる細菌は、当該の有機化合物が供給されるときに限り成長することができる。
Ｈ．追加的な部分を含むＡＤＡＳ
ＡＤＡＳは、特定の実施形態において、機能性ＡＴＰ合成酵素、及び一部の実施形態では、膜に埋め込まれたプロトンポンプを含む。ＡＤＡＳは、ゲノムフリーの閉じた膜系を産生するように操作又は誘導された親細菌株（「親株」）、ゲノムが切り出された細菌、細菌細胞調製物抽出物（例えば、機械的手段又は他の手段による）、又は任意選択で細菌細胞調製物の画分を含む全合成を含め、様々な供給源に由来することができる。一部の実施形態において、高活性ＡＤＡＳは、少なくとも：１００００ｎｍ２当たり１個、５０００ｎｍ２当たり１個、３５００ｎｍ２当たり１個、１０００ｎｍ２当たり１個のＡＴＰ合成酵素濃度を有する。
本発明により提供されるＡＤＡＳは、例えば、光起電性ポンプ、レチナール類及びレチナール産生カセット、代謝酵素、ターゲティング薬剤、カーゴ、細菌分泌装置、及び輸送体を含め、前述の組み合わせを含め、下記の特定の詳細な実施形態を含め、種々の追加的な成分を含むことができる。特定の実施形態において、ＡＤＡＳは、代謝的に非必須の遺伝子及び／又はある種のヌクレアーゼ又はプロテアーゼなど、他のエレメントを欠いている。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、εドメインを欠いているなど、調節ドメインを任意選択で欠いているＡＴＰ合成酵素を含む。欠失は、種々の手段によって達成することができる。特定の実施形態において、欠失は、天然εドメインの誘導性欠失による。特定の実施形態において、欠失は、ＬｏｘＰ部位の隣接及び誘導性Ｃｒｅ発現又はＣＲＩＳＰＲノックアウトにより達成されてもよく、又は誘導性であってもよい（ＡＴＰ合成酵素ノックアウト株においてプラスミド上でｔＴａ ｔｅｔトランス活性化因子下に置く）。
ＡＤＡＳは、一部の実施形態において、光起電性プロトンポンプを含むことができる。特定の実施形態において、光起電性プロトンポンプはプロテオロドプシンである。より詳細な実施形態において、プロテオロドプシンは、未培養海洋細菌クレードＳＡＲ８６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ７３０１４．１からのプロテオロドプシンのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、光起電性プロトンポンプはグロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）ロドプシンである。特定の実施形態において、光起電性プロトンポンプは、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ） ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ハロテリゲナ・トゥルクメニカ（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ ｔｕｒｋｍｅｎｉｃａ）、又はハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）からのバクテリオロドプシン、デルタロドプシン、又はハロロドプシンである。
一部の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳはレチナールを更に含む。特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、レチナール合成タンパク質（又はタンパク質装置）、又はそれをコードする核酸を更に含む。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、１つ以上の解糖経路タンパク質を更に含む。一部の実施形態において、解糖経路タンパク質は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ７９６のアミノ酸配列又はその機能性断片を含むホスホフルクトキナーゼ（Ｐｆｋ－Ａ）である。他の実施形態において、解糖経路タンパク質は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ８５８のアミノ酸配列、又はその機能性断片を含むトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）である。
Ｉ．ＡＤＡＳ組成物及び製剤
本発明は、とりわけ、本発明により提供される高活性ＡＤＡＳ調製物又は複数の個々のＡＤＡＳが細胞分裂トポロジー特異性因子を欠いている、例えば、ｍｉｎＥ遺伝子産物を欠いているＡＤＡＳ調製物であって、任意選択で生存細胞を実質的に含まないＡＤＡＳ調製物を含め、本発明により提供されるＡＤＡＳを含有する組成物又は調製物を提供する。まとめて、これらは「本発明により提供される複数の組成物」又は「本発明により提供される１つの組成物」などであり、本発明により提供される任意のＡＤＡＳ及び本発明により提供されるＡＤＡＳの任意の組み合わせを含有することができる。
例えば、一部の実施形態において、本発明により提供される組成物は、細菌分泌装置を含むＡＤＡＳを少なくとも約：８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％、又はそれ以上含有する。詳細な実施形態において、細菌分泌装置は、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳのうちの１つである。
一部の実施形態において、本発明により提供される組成物は、Ｔ３ＳＳを含むＡＤＡＳを含有し、このＡＤＡＳは、約：４００００、３５０００、３００００、２５０００、１９６００、１５０００、１００００、又は５０００ｎｍ２に１個より高い平均Ｔ３ＳＳ膜密度を含む。特定の詳細な実施形態において、ＡＤＡＳはネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株に由来する。
本発明により提供される組成物の特定の実施形態は、Ｔ３ＳＳを含有するＡＤＡＳを含有し、このＡＤＡＳは、約：３０００００、２５００００、２０００００、１５００００、１０００００、５００００、２００００、１００００、５０００ｎｍ２に１個より高い平均Ｔ３ＳＳ膜密度を含む。特定の詳細な実施形態において、ＡＤＡＳは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）親株に由来する。
別の態様において、本発明は、ＡＤＡＳ組成物を提供し、ここで少なくとも約：８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％、又はそれ以上のＡＤＡＳが、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３／４ＳＳ、Ｔ６ＳＳを含めた細菌分泌装置であって、及び任意選択で、外因性糖質、リン酸産生合成酵素、光応答性タンパク質、細胞内移行タンパク質、酵素、機能性カーゴ、生物特異的エフェクター、融合タンパク質のうちの１つ以上を含む細菌分泌装置を含有する。
容易に明らかになるとおり、本発明により提供される組成物及び調製物は、高活性ＡＤＡＳ又はｍｉｎＥ遺伝子産物を欠いているＡＤＡＳなど、本発明により提供される任意のＡＤＡＳを含有することができる。
本発明により提供される組成物は、任意の好適な製剤に調製することができる。例えば、製剤は、ＩＰ、ＩＶ、ＩＭ、経口、局所（クリーム、ゲル、軟膏、経皮パッチ）、エアロゾル、又は噴霧投与に好適であってもよい。一部の実施形態において、製剤は液体製剤である。他の実施形態において、製剤は凍結乾燥製剤である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＡＤＡＳ組成物は、１００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）未満の生存細菌細胞、例えば、５０ＣＦＵ／ｍＬ未満、２０ＣＦＬ／ｍＬ未満、１０ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は０．１ＣＦＵ／ｍＬ未満の生存細菌細胞を含む。
一部の実施形態において、本発明はＡＤＡＳ組成物を提供し、このＡＤＡＳは凍結乾燥及び再構成され、再構成されたＡＤＡＳは、凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％であるか、又は凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度と少なくとも等しいＡＴＰ濃度を有する。
一部の実施形態において、本発明はＡＤＡＳ組成物を提供し、このＡＤＡＳは貯蔵され、例えば４℃で貯蔵され、貯蔵後、ＡＤＡＳは、貯蔵されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％であるか、又は貯蔵されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度と少なくとも等しいＡＴＰ濃度を有する。一部の実施形態において、貯蔵は、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、又は少なくとも１年間にわたる。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは維持されているか、又は何らかの「静止」状態にあってもよく、次に急速に活性化し得る。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳ組成物は動物への送達用に製剤化され、例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口、局所、エアロゾル、又は噴霧投与用に製剤化される。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳ組成物は植物への送達用に製剤化される。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳ組成物は昆虫への送達用に製剤化される。
一部の実施形態において、本組成物は、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル、又は気体組成物として製剤化される。
Ｊ．酵素を含むＡＤＡＳ
一態様において、本発明は複数のＡＤＡＳを含む組成物を特徴とし、このＡＤＡＳは酵素を含み、この酵素は、標的産物が産生されるように基質を変化させる。一部の実施形態において、基質はＡＤＡＳ中に存在し、標的産物はＡＤＡＳにおいて産生される。他の実施形態において、基質は、ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する。一部の実施形態において、酵素はジアデニル酸シクラーゼＡであり、基質はＡＴＰであり、及び標的産物は環状ジ－ＡＭＰである。
ＩＩＩ．ＡＤＡＳの製造方法
Ａ．ＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳの作成
一部の態様において、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない組成物の製造方法を特徴とし、この方法は、（ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；（ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に親細菌を曝露することであって、それにより高活性ＡＤＡＳを作製すること；及び（ｃ）高活性ＡＤＡＳを親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない組成物を作製することを含む。
親細菌には、それからＡＤＡＳを生成し得る任意の好適な細菌種（例えば、本明細書に記載される方法を用いてＡＤＡＳを産生するように修飾されてもよい種）が含まれる。表４は、ＡＤＡＳが由来することのできる好適な属の非限定的な一覧を提供する。
Figure 2022513709000002
Figure 2022513709000003
Figure 2022513709000004
一部の態様において、本発明は、本明細書のセクションＩに記載されるＡＤＡＳ組成物のいずれか、例えば高活性ＡＤＡＳ組成物の製造方法を特徴とする。例えば、本明細書には、高活性ＡＤＡＳの作成方法；細胞分裂トポロジー特異性因子を欠いている、且つ任意選択でＺリング阻害タンパク質を欠いているＡＤＡＳの作成方法（例えば、ΔｍｉｎＣＤＥ親細菌からのＡＤＡＳの作成方法）、及び本明細書において言及されるＡＤＡＳのいずれかの作成方法が提供され、ここでＡＤＡＳはカーゴを含む。
前出の請求項のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳは細菌細胞から作成されてもよく、ここで親株は、植物片利共生菌（例えば、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））又は植物病原菌（例えば、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）又はシリンゲ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ））などの植物細菌又は片利共生ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、又はアクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．））又は病原性ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＨＥＣ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））などのヒト細菌、又は極限環境微生物、前述のいずれかの機能化派生株を含めたもの、例えば、抗微生物薬を分泌する、プラスチックを消化する、殺虫薬を分泌する、極限環境を生き延びる、ナノ粒子を作る、他の生物の中に組み込まれる、環境に応答する、及びレポーターシグナルを生じる、のうちの１つ以上を行うように細菌を誘導する機能性カセットなど、機能性カセットを含めたものから選択される。
親細菌には、前述のいずれかの機能化派生株、例えば、抗微生物薬を分泌する、プラスチックを消化する、殺虫薬を分泌する、極限環境を生き延びる、ナノ粒子を作る、他の生物の中に組み込まれる、環境に応答する、及びレポーターシグナルを生じる、のうちの１つ以上を行うように細菌を誘導する機能性カセットなど、機能性カセットを含めたものが含まれ得る。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、ＡＴＰ合成酵素を過剰発現するように操作又は誘導された親株に由来する。一部のより詳細な実施形態において、ＡＴＰ合成酵素は親株にとって異種である。特定の詳細な実施形態において、親株は、機能性ＦｏＦ１ ＡＴＰ合成酵素を発現するように修飾される。
特定の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、印加電圧（例えば、３７ｍＶ）、非大気中酸素濃度（例えば、１～５％Ｏ２、５～１０％Ｏ２、１０～１５％Ｏ２、２５～３０％Ｏ２）、低ｐＨ（約：４．５、５．０、５．５、６．０、６．５）、又はこれらの組み合わせから選択される条件下で培養された親株から入手される。
前出の請求項のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ、これは、極限環境微生物、前述のいずれかの機能化派生株を含めたもの、例えば、抗微生物薬を分泌する、プラスチックを消化する、殺虫薬を分泌する、極限環境を生き延びる、ナノ粒子を作る、他の生物の中に組み込まれる、環境に応答する、及びレポーターシグナルを生じる、のうちの１つ以上を行うように細菌を誘導する機能性カセットなど、機能性カセットを含めたものから作成される。
細菌の多様性のおかげで、ＡＤＡＳは、例えば標的細胞への投与時におけるＡＤＡＳの体内分布が改善されるように修飾された膜で作成することができる。特定の実施形態において、膜は、植物又は動物での免疫原性又は免疫刺激性が低くなるように修飾される。例えば、特定の実施形態において、ＡＤＡＳは親株から入手され、ここで親株の免疫刺激能力は、洗浄剤、酵素による産生後処理、又はＰＥＧによる官能化によって低下又は消失している。特定の実施形態において、ＡＤＡＳは親株から作成され、膜は、例えばｍｓｂＢをノックアウトすることによる、親株におけるＬＰＳ合成経路のノックアウトで修飾される。他の詳細な実施形態において、ＡＤＡＳは、高浸透圧条件への曝露によって細胞壁欠損粒子を産生する親株から作成される。
一部の実施形態において、本方法は、ｅｘｏＩ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：９４６５２９）及びｓｂｃＤ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：９４５０４９）ヌクレアーゼ、又はＩ－ＣｅｕＩ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ３２７６１．１）ヌクレアーゼなどの誘導性ＤＮアーゼシステムで親株を形質転換することを含む。より詳細な実施形態において、本方法は、単一、二重、三重、又は四重栄養要求株を使用すること、及び誘導性ヌクレアーゼをコードするプラスミド上に補足遺伝子を有することを含む。
一部の実施形態において、本発明により提供される方法の方法、親株は、印加電圧（例えば、３７ｍＶ）、非大気中酸素濃度（例えば、１～５％Ｏ２、５～１０％Ｏ２、１０～１５％Ｏ２、２５～３０％Ｏ２）、低ｐＨ（４．５～６．５）、又はこれらの組み合わせから選択される条件下で培養される。
特定の実施形態において、本発明により提供される方法の方法、親株は鞭毛及び望ましくない分泌装置を欠いており、任意選択で鞭毛及び望ましくない分泌装置はλＲｅｄリコンビニアリングを用いて除去される。
一部の実施形態において、本発明により提供される方法、親株ゲノムから、例えば、ｆｌｈＤ及びｆｌｈＣなどの鞭毛制御遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲドメインを含有するプラスミドの挿入によって鞭毛制御成分が切り出される。
特定の実施形態において、本発明により提供される方法は、高活性ＡＤＡＳの作成方法であり、ここではロドプシンコード遺伝子を含有するプラスミドを含むＡＤＡＳが光の存在下で培養される。より詳細な実施形態において、ロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ７３０１４．１のアミノ酸配列を有するＳＡＲ８６未培養細菌からのプロテオロドプシン、又はその機能性断片である。なおもより詳細な実施形態において、培養物にはレチナールが補足される。他のより詳細な実施形態において、ロドプシンはプロテオロドプシンであり、プラスミドは、レチナールを合成する遺伝子を更に含有する（かかるプラスミドは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１２からのｐＡＣＹＣ－ＲＤＳプラスミドである）。
特定の詳細な実施形態において、親株は、次にはＡＤＡＳの膜上に発現するナノボディをコードする核酸配列を含有する。
本発明により提供される方法の一部の実施形態において、親株は、１つ以上の細菌分泌装置オペロンをコードする核酸配列を含有する。例示的プラスミドには、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳ、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｔ３ＳＳ、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏ）Ｔｉプラスミド、及びプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｋ１－Ｔ６ＳＳ装置が含まれる。
特定の実施形態において、親株はカーゴを含む。一部の実施形態において、親株は、小分子カーゴを合成する一組の遺伝子をコードする核酸配列を含有する。
ＩＶ．ＡＤＡＳ及びＡＤＡＳ組成物の精製
本明細書に提供される方法及び組成物の一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、生存細菌、例えば親細菌を含む組成物（例えば、培養物）から精製される。例えば、本発明は、複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない組成物の製造方法を特徴とし、この方法は、（ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；（ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に親細菌を曝露することであって、それにより高活性ＡＤＡＳを作製すること；及び（ｃ）高活性ＡＤＡＳを親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない組成物を作製することを含む。
精製は、より大きい、且つゲノムを含有する生存親細菌細胞からＡＤＡＳを分離する。親細菌からの高活性ＡＤＡＳの分離は、本明細書に記載されるとおりの幾つもの方法を用いて実施することができる。本明細書に記載される例示的精製方法には、遠心、選択的増殖、及び緩衝液交換／濃縮プロセスが含まれる。
一部の態様において、本明細書には、ＡＤＡＳ組成物、及びかかる組成物を比較する方法が提供され、この組成物は親細菌細胞及び／又は生存細菌細胞を実質的に含まず、例えば、１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）が５００以下、例えば、４００、３００、２００、１５０、又は１００であり、又は５０より少ない、２５より少ない、１０より少ない、５より少ない、１より少ない、０．１より少ない。一部の実施形態において、親細菌細胞を実質的に含まないＡＤＡＳ組成物は細菌細胞を全く含まなくてもよい。
本発明により提供されるＡＤＡＳの作成には、栄養要求性親株を使用することができる。以下に更に詳細に記載するとおり、かかる製造方法はＡＤＡＳの精製に有用である。例えば、ＡＤＡＳの生成後、親細菌の生存能力に必須の栄養素（例えば、アミノ酸）を欠いている培地で成長させることにより親細菌細胞を除去してもよい。一部の実施形態において、本発明により提供されるＡＤＡＳは、アルギニン（例えば、ａｒｇＡのノックアウト、株ＪＷ２７８６－１及びＮＫ５９９２など）、システイン ｃｙｓＥのノックアウト（株ＪＷ３５８２－２及びＪＭ１５など）、グルタミン、例えばｇｌｎＡのノックアウト（株ＪＷ３８４１－１及びＭ５００４など）、グリシン、例えばｇｌｙＡのノックアウト（株ＪＷ２５３５－１及びＡＴ２４５７など）、ヒスチジン、例えばｈｉｓＢのノックアウト（株ＪＷ２００４－１及びＳＢ３９３０など）、イソロイシン、例えばｉｌｖＡのノックアウト（株ＪＷ３７４５－２及びＡＢ１２５５など）、ロイシン、例えばｌｅｕＢのノックアウト（株ＪＷ５８０７－２及びＣＶ５１４など）、リジン、例えばｌｙｓＡのノックアウト（株ＪＷ２８０６－１及びＫＬ３３４など）、メチオニン、例えばｍｅｔＡのノックアウト（株ＪＷ３９７３－１及びＤＬ４１など）、フェニルアラニン、例えばｐｈｅＡのノックアウト（株ＪＷ２５８０－１及びＫＡ１９７など）、プロリン、例えばｐｒｏＡのノックアウト（株ＪＷ０２３３－２及びＮＫ５５２５など）、セリン、例えばｓｅｒＡのノックアウト（株ＪＷ２８８０－１及びＪＣ１５８など）、スレオニン、例えばｔｈｒＣのノックアウト（株ＪＷ０００３－２及びＧｉｆ ４１など）、トリプトファン、例えばｔｒｐＣのノックアウト（株ＪＷ１２５４－２及びＣＡＧ１８４５５など）、チロシン、例えばｔｙｒＡのノックアウト（株ＪＷ２５８１－１及びＮ３０８７など）、バリン／イソロイシン／ロイシン、例えばｉｌｖｄのノックアウト（株ＪＷ５６０５－１及びＣＡＧ１８４３１など）のうちの少なくとも１、２、３、４つ、又はそれ以上に関して栄養要求性の親株に由来する。
特定の実施形態において、本方法は、単一、二重、三重、又は四重栄養要求性親株を使用することを含み、任意選択で前記親株は、ｆｔｓＺを発現するプラスミドを更に含む。
Ｖ．ＡＤＡＳの使用方法
Ａ．ＡＤＡＳの送達方法
一態様において、本発明は、標的細胞への高活性ＡＤＡＳの送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性ＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
別の態様において、本発明は、標的細胞へのＡＤＡＳ（例えば、高活性ＡＤＡＳ）の送達方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
標的細胞は、例えば、動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞であってもよい。
Ｂ．カーゴの送達方法
別の態様において、本発明は、カーゴ（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ））を標的細胞に送達する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
別の態様において、本発明は、カーゴ（例えば、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ））を標的細胞に送達する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）標的細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることを含む。
カーゴが送達される標的細胞は、例えば、動物細胞、植物細胞、又は昆虫細胞であってもよい。
Ｃ．細胞の状態の調節方法
一態様において、本発明は、動物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって動物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、植物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって植物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、昆虫細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）昆虫細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって昆虫細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、動物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって動物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、植物細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって植物細胞の状態が調節されることを含む。
別の態様において、本発明は、昆虫細胞の状態を調節する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）昆虫細胞をステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それによって昆虫細胞の状態が調節されることを含む。
調節は、当該技術分野においてかかる測定について公知の技法及び方法、例えば、タンパク質、転写物、エピジェネティック標識のレベル又は発現を測定するための方法、又は生物学的経路の活性の増加又は低下を測定するための方法を用いて測定したときの、細胞（例えば、動物、植物、又は昆虫細胞）の状態（例えば、トランスクリプトーム、プロテオーム、エピゲノム、生物学的効果、又は健康若しくは疾患状態）の任意の観測可能な変化であってもよい。一部の実施形態において、細胞の状態を調節することには、細胞のパラメータ（例えば、タンパク質、転写物のレベル若しくは発現、又は生物学的経路の活性）を増加させることが関わる。他の実施形態において、の状態を調節することには、細胞のパラメータ（例えば、タンパク質、転写物のレベル若しくは発現、又は生物学的経路の活性）を減少させることが関わる。
Ｄ．動物、植物、又は昆虫の処置方法
一部の態様において、本発明は、それを必要としている動物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより動物を処置することを含む。
他の態様において、本発明は、それを必要としている動物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）動物を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより動物を処置することを含む。
処置を必要としている動物は、疾患、例えば癌を有し得る。一部の実施形態において、ＡＤＡＳは化学療法カーゴ又は免疫療法カーゴを担持する。
一部の態様において、本発明は、それを必要としている植物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物又はその有害生物（例えば、害虫）を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより植物を処置することを含む。
他の態様において、本発明は、それを必要としている植物を処置する方法を特徴とし、この方法は、（ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び（ｂ）植物又はその有害生物（例えば、害虫）を有効量のステップ（ａ）の組成物と接触させることであって、それにより植物を処置することを含む。
更なる態様において、本発明は、標的細胞を調節する方法を提供する。標的細胞は、動物細胞（例えば、ヒト及び畜産動物又は家畜動物を含めた非ヒト動物、有害生物を含む）、植物細胞（作物又は有害生物由来を含む）、真菌細胞、又は細菌細胞を含め、任意の細胞であってよい。細胞は単離されていて、例えばインビトロであってもよく、又は他の実施形態では生物体内にあって、インビボであってもよい。これらの方法は、本発明により提供されるＡＤＡＳ又は本発明により提供される組成物に有効量で標的細胞への到達手段を提供することを伴う。標的細胞への到達手段は、直接であっても（例えば、標的細胞に近接した何らかの薬剤の近接した分泌又は標的細胞への薬剤の注入によるなど、標的細胞がＡＤＡＳによって直接調節される）、又は間接的であっても、いずれであってもよい。標的細胞の間接的な調節は、別の細胞を標的化すること、例えば、標的細胞に隣接する細胞であって、標的細胞にとって片利共生性又は病原性であり得る隣接細胞を調節することによってもよい。隣接細胞は、標的細胞と同様に、インビトロ又はインビボ－即ち、片利共生性若しくは病原性であり得る生物体内のいずれであってもよい。これらの方法は、まとめて、「本発明により提供される使用方法」などである。関連する態様において、本発明は、本発明により提供される使用方法に従う本発明により提供されるＡＤＡＳ及び組成物の標的使用を提供する。
例えば、一部の実施形態において、本発明は、有効量の本発明により提供されるＡＤＡＳ又は本発明により提供される組成物に動物細胞への到達手段を提供することにより、動物細胞の状態を調節する方法を提供する。特定の実施形態において、ＡＤＡＳ又は組成物には、ヒトなどの哺乳類など、動物体内においてインビボで動物細胞への到達手段が提供される。一部の実施形態において、動物細胞は健常動物体内で細菌に曝露される。より詳細な実施形態において、動物細胞は、肺上皮、免疫細胞、皮膚細胞、口腔上皮細胞、腸上皮細胞、生殖器上皮細胞、又は尿路細胞である。なおもより詳細な実施形態において、動物細胞は、クローン病又は大腸炎などの炎症性腸疾患を有するヒト対象からの腸上皮細胞など、腸上皮細胞である。更により詳細な実施形態において、動物細胞は、炎症性腸疾患を有する対象からの腸上皮細胞であり、ＡＤＡＳは、細菌分泌装置と抗炎症剤を含むカーゴとを含む。
他の実施形態において、動物細胞は罹患状態で細菌に曝露される。特定の実施形態において、動物細胞は、腫瘍など、病原性である。他の実施形態において、動物細胞は、創傷、潰瘍、腫瘍、又は炎症性障害など、罹患状態で細菌に曝露される。
特定の実施形態において、ＡＤＡＳは動物片利共生親株に由来する。他の実施形態において、ＡＤＡＳは動物病原性親株に由来する。
特定の詳細な実施形態では、動物細胞をＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳに接触させ、ここでカーゴは動物細胞に送達される。一部の詳細な実施形態では、動物細胞に、カーゴと分泌装置とを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、ここでカーゴは細胞外に分泌されて動物細胞と接触する。
一部の実施形態において、動物細胞の状態は、有効量の本発明により提供されるＡＤＡＳ又は本発明により提供される組成物に、動物細胞の近傍にある細菌又は真菌細胞への到達手段を提供することにより調節される。即ち、これらの方法は、動物細胞の状態を間接的に調節することを伴う。特定の実施形態において、細菌又は真菌細胞は病原性である。より詳細な実施形態において、病原性細菌又は真菌細胞の適応度は低下する。他の特定の実施形態において、細菌又は真菌細胞は片利共生性である。より詳細な実施形態において、片利共生細菌又は真菌細胞の適応度は増加する。なおもより詳細な実施形態において、片利共生細菌又は真菌株の適応度は、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は真菌数の適応度の低下により増加する。
特定の詳細な実施形態では、動物細胞の近傍にある細菌又は真菌細胞をＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳに接触させ、ここでカーゴは細菌又は真菌細胞に送達される。他の詳細な実施形態では、動物細胞の近傍にある細菌又は真菌細胞に、細菌又は真菌細胞に接触するカーゴを細胞外に分泌する有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供される。
特定の実施形態において、ＡＤＡＳは、細菌又は真菌細胞の競合者である親株に由来する。他の実施形態において、ＡＤＡＳは、細菌又は真菌細胞の相利共生細菌である親株に由来する。
理解されるであろうとおり、動物細胞の状態を調節する本発明により提供される様々な使用方法は、植物、真菌、又は細菌細胞の状態を調節するための対応する方法に容易に適合させることができる。例示を目的として、植物の細胞又は真菌細胞の調節方法を更に詳細に記載する。
従って、関連する態様において、本発明は、有効量の本発明により提供されるＡＤＡＳ又は本発明により提供される組成物に、ａ）植物又は真菌細胞、ｂ）植物又は真菌細胞の近傍にある隣接細菌又は隣接真菌細胞、又はｃ）植物又は真菌細胞の近傍にある昆虫又は線虫細胞への到達手段を提供することにより植物又は真菌細胞の状態を調節する方法を提供する。
特定の実施形態において、ＡＤＡＳに、例えば、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、及びコメを含めた条植え作物、並びにトマト及びトウガラシなどのナス科植物；メロン及びキュウリなどのウリ科植物；キャベツ及びブロッコリーなどのアブラナ科植物；ケール及びレタスなどの葉物野菜；ジャガイモ及びニンジンなどの塊根及び塊茎；マメ類及びトウモロコシなどの大型種子野菜；及びキノコ類を含めた野菜作物など、作物植物体内においてインプランタで植物細胞への到達手段が提供される。一部の実施形態において、植物又は真菌細胞は健常植物又は真菌体内で細菌に曝露される。他の実施形態において、植物又は真菌細胞は罹患状態で細菌に曝露される。
特定の実施形態において、植物又は真菌細胞は、分裂組織細胞などの分裂細胞であるか、又は腫瘍などの病原性細胞である。一部の実施形態において、植物又は真菌細胞は創傷などの罹患状態で細菌に曝露されるか、或いは植物又は真菌細胞はヒトの食物の一部ではない。
特定の実施形態については、ＡＤＡＳは片利共生親株に由来する。他の実施形態において、ＡＤＡＳは植物又は真菌病原性親株に由来する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳはＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含み、カーゴは植物又は真菌細胞に送達される。他の実施形態において、植物又は真菌細胞に細菌分泌装置とカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、ここで細菌分泌装置はカーゴを細胞外に分泌し、それによって植物又は真菌細胞がカーゴと接触する。
一部の実施形態において、本方法は、有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、植物又は真菌細胞の近傍にある隣接細菌又は隣接真菌細胞への到達手段を提供することを伴う。より詳細な実施形態において、隣接細菌又は隣接真菌細胞は病原性であり、任意選択で病原性隣接細菌又は隣接真菌細胞の適応度は低下する。他のより詳細な実施形態において、隣接細菌又は隣接真菌細胞は片利共生性であり、任意選択で片利共生隣接細菌又は隣接真菌細胞の適応度は増加する。なおもより詳細な実施形態において、適応度は、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は競合真菌の低下によって増加する。
一部の実施形態では、隣接細菌又は隣接真菌細胞をＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳと接触させ、ここでカーゴは隣接細菌又は隣接真菌細胞に送達される。
他の実施形態では、隣接細菌又は隣接真菌細胞に、細菌分泌装置とカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、ここで細菌分泌装置はカーゴを細胞外に分泌し、それによって隣接細菌又は隣接真菌細胞がカーゴと接触する。
一部の実施形態において、ＡＤＡＳは、隣接細菌又は隣接真菌細胞の競合者である親株に由来する。他の実施形態において、ＡＤＡＳは、隣接細菌又は隣接真菌細胞の相利共生細菌である親株に由来する。
特定の実施形態において、本方法は、有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、植物又は真菌の近傍にある昆虫又は線虫細胞への到達手段を提供することを含む。より詳細な実施形態において、昆虫又は線虫は病原性である。なおもより詳細な実施形態において、病原性昆虫又は線虫細胞の適応度は低下する。更により詳細な実施形態において、病原性昆虫又は線虫細胞の適応度は、昆虫又は線虫細胞の共生者の調節によって低下する。他の詳細な実施形態において、昆虫又は線虫は片利共生性である。より詳細な実施形態において、片利共生昆虫又は線虫細胞の適応度は増加する。なおもより詳細な実施形態において、適応度は、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は真菌の低下によって増加する。
更に別の態様において、本発明は、有効量の本発明により提供されるＡＤＡＳ又は本発明により提供される組成物を環境に接触させることを含む、環境から１つ以上の望ましくない材料を除去する方法を提供し、ここでＡＤＡＳは、１つ以上の望ましくない材料を取り込む、キレート化する、又は分解する１つ以上の分子（タンパク質、ポリマー、ナノ粒子、結合剤、又はこれらの組み合わせなど）を含む。「環境」とは、海洋、土壌、スーパーファンド用地、皮膚、池、腸管内腔、及び容器内の食物など、細胞ではない標的として定義される。
特定の実施形態において、望ましくない材料には水銀などの重金属が含まれ、ＡＤＡＳは、水銀に対するＭｅｒＲなど、重金属と結合する１つ以上の分子（タンパク質、ポリマー、ナノ粒子、結合剤、又はこれらの組み合わせなど）を含む。一部の実施形態において、望ましくない材料には、ＰＥＴなどのプラスチックが含まれ、ＡＤＡＳは、ＰＥＴアーゼなど、１つ以上のプラスチック分解酵素を含む。特定の実施形態において、望ましくない材料は１つ以上の有機小分子を含み、ＡＤＡＳは、前記１つ以上の有機小分子の代謝能を有する１つ以上の酵素を含む。
Ｅ．ＲＮＡ送達方法
別の態様において、本発明は、本発明により提供される細菌又はＡＤＡＳを含有する組成物を提供し、この細菌又はＡＤＡＳは、Ｔ４ＳＳと、ＲＮＡ結合タンパク質カーゴと、ＲＮＡ結合タンパク質が結合する、且つＴ４ＳＳを通じた標的細胞への送達に好適なＲＮＡカーゴとを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＶｉｒＥ２及びＶｉｒＦに融合したＣａｓ９であり、ＲＮＡカーゴはガイドＲＮＡであり、及び任意選択で、Ｔ４ＳＳはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ装置である。他の実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＶｉｒＥ２又はＶｉｒＦに融合したカーネーションイタリア輪紋ウイルスのｐ１９であり、ＲＮＡカーゴはｓｉＲＮＡであり、任意選択でＴ４ＳＳはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ装置である。
関連する態様において、本発明は、これらの特定の組成物を作成する方法を提供し、かかる方法は、ＶｉｒＥ２及びＶｉｒＦに融合したＣａｓ９とＲＮＡカーゴとを含むプラスミドをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞にトランスフェクトすることを伴う。
更なる関連する態様において、本発明は、前記植物細胞又は動物細胞に細菌又はＡＤＡＳを接触させることを含む、植物細胞又は動物細胞へのＲＮＡの送達方法を提供し、この細菌又はＡＤＡＳは、Ｔ４ＳＳとＲＮＡ結合タンパク質カーゴとＲＮＡカーゴとを含み、ここではＲＮＡが植物細胞又は動物細胞に送達される。より詳細な実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質カーゴもまた植物細胞又は動物細胞に送達される。
Figure 2022513709000005
Figure 2022513709000006
実施例１：遺伝子操作によるＡＤＡＳの作製
ＡＤＡＳは、親細菌細胞から幾つかの手段によって作製し得る。本例では、親細胞分割機能の調節に関わる１つ以上の遺伝子の破壊、即ち、ｚリング阻害タンパク質の破壊（例えば、ΔｍｉｎＣ又はΔｍｉｎＤ）又はｚリング阻害タンパク質及び細胞分裂トポロジー特異性因子の破壊（例えば、ΔｍｉｎＣＤＥ）によりＡＤＡＳを作製する。本例は、ｍｉｎオペロンの破壊又は隔壁機構成分ＦｔｓＺの過剰発現によってＡＤＡＳ産生株を作出する遺伝的手段について詳述する。
Ａ．ｍｉｎ突然変異によるＡＤＡＳの作製
ｍｉｎオペロンの破壊には、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，９７（１２）：６６４０－６６４５，２０００に説明されるプロトコルに従いλ－ＲＥＤリコンビニアリング方法論を採用した。λ－ＲＥＤシステムのプラスミドをエンジニアリングしてそれを収容するための株は、エール大学（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から入手した。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＣ（親細菌株ＭＡＣＨ０６１を生成する）、ｍｉｎＤ（親細菌株ＭＡＣＨ０６２を生成する）、又はｍｉｎＣＤＥオペロン全体（親細菌株ＭＡＣＨ０６０を生成する）のコード配列が非極性的に欠失するように、プライマーの５’末端に約４０塩基対のゲノム相同性をコードすることによりプライマーを設計した。これらのプライマーの３’末端はλ－ＲＥＤシステムのプラスミドｐＫＤ３及びｐＫＤ４と相同であり、これらは抗生物質マーカーを提供するもので、標的突然変異を遺伝的に受け継いだ親細菌株の選択に使用した。欠失に使用したプライマー配列を表１に提供する。ＤＮＡ鋳型としてｐＫＤ３を有するプライマーを使用した標準的なＰＣＲの実施後、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，９７（１２）：６６４０－６６４５，２０００の方法により、ファージ由来λ－ＲＥＤ相同組換えシステムを収容するプラスミドであるｐＫＤ４６と共に調製した細菌に、精製したアンプリコンを電気穿孔によって形質転換した。３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で形質転換体を選択した。標準的なアレル特異的ＰＣＲを用いて、これらの得られたコロニーが遺伝子破壊（即ち、ΔｍｉｎＣ、ΔｍｉｎＤ、又はΔｍｉｎＣＤＥ）を有することを確認した。株遺伝子型を表２に提供する。
Figure 2022513709000007
Figure 2022513709000008
Ｂ．ｆｔｓＺの過剰発現によるＡＤＡＳの作製
隔壁機構の過剰発現からＡＤＡＳを作出するため、本発明者らは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＦｔｓＺ Ｚリングタンパク質の発現をドライブするプラスミドを構築した。端的には、強力なリボソーム結合部位及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦｔｓＺタンパク質のコード配列をＤｅ Ｎｏｖｏ ＤＮＡの計算ツールを用いてデノボで最適化した。デノボＤＮＡ合成のためＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ（商標））からこの翻訳単位を注文し、標準的なクローン技術を用いて骨格にクローニングした。得られたプラスミド、ｐＦｔｓＺ（表３）は、ＴｅｔＲリプレッサー、ＴｅｔＲタンパク質によって抑制されるＴｅｔＡプロモーター、カナマイシン耐性マーカー、及びｐＭＢ１複製起点を特徴とする。適合性のある細菌に形質転換すると、培養物へのアンヒドロテトラサイクリンの添加によってｐＦｔｓｚを誘導し、ＦｔｓＺタンパク質を過剰産生させることができる。次にはこのタンパク質が自発的なプロトフィラメント形成能を有し、それが親細菌細胞の非対称分裂、及びそれによるＡＤＡＳ産生を引き起こす。
Figure 2022513709000009
実施例２：ＡＤＡＳの精製
本例は、ＡＤＡＳ産生細菌親株の培養物からＡＤＡＳ集団を精製する方法について記載する。この方法は、実施例１又は表３の株を含め、本明細書に記載されるいずれのＡＤＡＳ産生株の精製にも用いることができる。精製は、より大きい、且つゲノムを含有する生存親細菌細胞からＡＤＡＳを分離する。ＡＤＡＳは、ＡＤＡＳ産生株の高密度細胞培養物から、１）低速遠心、２）選択的増殖、及び３）緩衝液交換／濃縮の組み合わせによって精製した。低速遠心手順は、生存親細菌細胞及び大型細胞破片を選択的に枯渇させる一方で混合懸濁液中のＡＤＡＳを濃縮するために用いた。選択的増殖手順は、直接的に抗微生物性である（即ち、微生物ゲノムを有する細胞にとって毒性のある）化合物及び／又は低速遠心による生存細胞の沈降を亢進させる化合物の添加によって試料中に存在する生存親細菌細胞の数を減少させるために用いた。緩衝液交換／濃縮手順は、培養添加剤及び細胞破片を除去しつつＡＤＡＳを大容量の細菌培養培地から小容量の１×ＰＢＳに移し替えるために用いた。
Ａ．ＡＤＡＳ精製
実施例１に記載する分子クローニング手順を用いてＡＤＡＳ産生株を生成し、次に培養培地で高細胞密度になるまで培養した。培養物は、例えば１ｍＬから１０００ｍＬ又はそれ以上の培養培地へとスケールアップしてもよい。
培養物を遠心管に移し、ＡＤＡＳを上清中に維持しながらインタクトな細胞及び大型細胞デブリをペレット化することを目的とした低速遠心手順に供した。低速遠心手順は４℃又は室温のいずれかで実施した。一部の例では、この低速遠心手順は、Ａｌｌｅｇｒａ（登録商標）Ｘ１４Ｒ卓上遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）５４２４ Ｒ卓上遠心機（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における１，０００×ｇ、２，０００×ｇ、３，０００×ｇ、及び４，０００×ｇでの一連の１０分間スピンを順次行うものであった。一部の例では、この低速遠心手順は４℃で２０分間の２，０００×ｇスピンを順次行うものからなり、ここでは１回目のスピンの上清を２回目のスピンの前に滅菌遠心ボトルにデカントした。一部の例では、この低速遠心手順は、ローター加速度を可能な限り低いセッティングに設定したＳｏｒｖａｌｌ（商標）Ｌｙｎｘ ６０００ Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ遠心機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））における４，０００×ｇでの単回４０分間スピンであった。
低速遠心後、培養上清を滅菌培養管にデカントし、選択的増殖プロセスに供した。一部の例では、培養上清に濃縮抗生物質溶液（例えば、セフトリアキソン、カナマイシン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、及び／又はシプロフロキサシン）又は他の濃縮化学溶液（例えば、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、Ｍ塩酸、グルコース、ｃａｓ－アミノ酸、及び／又はＤ－アミノ酸）を直接加えた。他の場合には、１０，０００×ｇ～２０，０００×ｇで５～６０分間の高速遠心によって培養上清をペレット化し、生存細胞にとって阻害性の抗生物質又は他の化学溶液の濃縮物を含有する新鮮な培養培地中にペレットを再懸濁した。選択的増殖は、ＡＤＡＳを２５０ｒｐｍで撹拌しながら４℃～４２℃で１～３時間インキュベートすることにより実施した。次にＡＤＡＳを滅菌遠心管に移し、４℃、４，０００×ｇで１５分間の更なる低速遠心ラウンドに供した。
選択的増殖及び低速遠心の後、上清を緩衝液交換／濃縮手順に供した。一部の例では、これは、上清を０．２μｍ不斉ポリエーテルスルホン（ａＰＥＳ）メンブランフィルタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に通した後、続いて１～９容量の１×ＰＢＳに通すことにより行った。他の場合には、１０，０００×ｇ～２０，０００×ｇで５～６０分間遠心することによりＡＤＡＳをペレット化し、１～９容量の１×ＰＢＳで洗浄し、再びペレット化し、１×ＰＢＳに出発培養容積から１～１００，０００倍の濃度で再懸濁した。
Ｂ．栄養要求性ＡＤＡＳ産生親株からのＡＤＡＳ精製
栄養要求性の、即ち、成長に必要な有機化合物を合成する能力がないＡＤＡＳ産生親株は、ＡＤＡＳの製造に有用である。かかる株は、当該の有機化合物が供給されるときに限り成長することができる。従って、有機化合物を欠いている培地中にＡＤＡＳ調製物を貯蔵又はインキュベートすることにより栄養要求性親株を対抗選択し得るため、従ってＡＤＡＳ調製物中の親の負荷を低下させる更なる方法が提供される。
栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌の調製
１つの栄養要求性ＡＤＡＳ産生親株は入手し、第２の株は生成した。ＭＡＣＨ００２（表２）はエール大学（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）から入手した（株ＣＧＳＣ１４１６５）。ＭＡＣＨ００２は、ＡＤＡＳを産生するｍｉｎＢ破壊を有するヒスチジン（ｈｉｓ－５３）及びメチオニン（ｍｅｔＢ６５）二重栄養要求株である。第２の栄養要求性ＡＤＡＳ産生親株を構築するため、実施例１及び表３に記載されるｐＦｔｓＺプラスミドをロイシン栄養要求体（ｌｅｕ－）Ｔｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬで選択することによりＭＡＣＨ１５１を作出した（完全長遺伝子型については表２を参照のこと）。培養上清にアンヒドロテトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＡプロモーターのＴｅｔＲ抑制が解除され、ＦｔｓＺタンパク質が発現し、親細菌がＡＤＡＳを産生する（実施例１）。実施例２の方法により、但しＭＡＣＨ００２については培地中にヒスチジン及びメチオニンを含め、又はＭＡＣＨ１５１については培地中にロイシン及びアンヒドロテトラサイクリンを含めて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを作製した。実施例２にある方法を用いてＡＤＡＳを精製し、次にＭＡＣＨ００２についてはヒスチジン不含及びメチオニン不含培地に、又はＭＡＣＨ１５１についてはロイシン不含培地に貯蔵した。
栄養要求性親株からのＡＤＡＳは純度の増加を呈する
栄養要求性及び非栄養要求性親株からＡＤＡＳを生成した。ＭＡＣＨ０６０（非栄養要求性）及びＭＡＣＨ００２（ヒスチジン・メチオニン栄養要求体）ＡＤＡＳを調製し、実施例２に概説するプロセスにより精製した。ＭＡＣＨ１７８（非栄養要求性ＦｔｓＺ過剰発現株）及びＭＡＣＨ１５１（ロイシン栄養要求体ＦｔｓＺ過剰発現株）ＡＤＡＳを調製し、実施例２に概説するプロセスに、成長プロトコルについて少し変更を加えたものにより精製した：ＦｔｓＺ発現に起因したＡＤＡＳ産生を誘導するため、アンヒドロテトラサイクリンは成長中に５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように培養物に添加した。ＡＤＡＳ調製物の純度を測定するため、実施例２における精製プロセスの初回４０００×ｇ順次遠心ステップ後に１ｍＬの上清試料を回収した。これらの試料はＡＤＡＳ及び順次の遠心によって除去されなかった任意の親細菌細胞の両方を含んでいた。次に非許容培地（Ｍ９＋０．２％グルコース）に１００μｌアリコートをプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プレート毎のＣＦＵ数をカウントすることにより親の負荷量を数えた（図８Ａ及び図８Ｂ）。野生型ＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ１７８から作製したＡＤＡＳ調製物は大きい親の負荷量を抱えていたが、ＭＡＣＨ００２及びＭＡＣＨ１５１は、いずれの栄養要求体からのＡＤＡＳ調製物も、検出不能なレベルの親細菌を実証した。従って、２つの異なる方法によって作製した栄養要求性ＡＤＡＳ調製物が、各々、非栄養要求性ＡＤＡＳからのＡＤＡＳ調製物よりも高い純度を有する。一部の網羅的でない実施形態において、ＭＡＣＨ００２はＭＡＣＨ０６０と比べて少なくとも１０６個少ない親の負荷量を示し；ＭＡＣＨ１５１はＭＡＣＨ１７８と比べて少なくとも１０４個少ない親の負荷量を示す。
実施例３：ＡＤＡＳの特性評価
本例は、電子顕微鏡法、光学顕微鏡法及び免疫蛍光法、ナノ粒子特性評価、生存細胞平板培養法、イムノブロッティング、及びフローサイトメトリーを含めた種々の手法を用いて精製ＡＤＡＳ集団及び／又は未精製ＡＤＡＳ産生細菌培養物を特性評価する方法について記載する。
走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
ＳＥＭを用いて隔壁形成過程を可視化し、様々な目的細菌株にＡＤＡＳ集団が存在することを確認した。ＳＥＭ試料を調製するため、２４ウェルプレートにカバーガラスを置き、０．０１％ポリリジンでコートし、乾燥させた。次に、実施例１に記載する分子クローニング手順を用いて目的の株を生成し、高細胞密度になるまで培養し、場合によっては、実施例２に記載するＡＤＡＳ精製手順に供した。目的の株又は精製ＡＤＡＳをＰＢＳに懸濁し、ポリリジンコートしたカバーガラスが入った２４ウェルプレートに移し、室温で３０分間沈殿させた。この溶液を慎重に吸い取り、ＳＥＭ固定液（０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｓｏｄ ｃａｃ）緩衝液中ホルムアルデヒド－グルタルアルデヒド２．５％を補充した。翌日、固定液を除去し、試料を水で洗浄し、２４ウェルプレートからカバーガラスを取り出し、臨界点乾燥法を用いて乾燥させた。乾燥後、Ｈｉｔａｃｈｉ ＳＥＭマウント上の炭素テープにカバーガラスをマウントし、１０ｎｍ白金薄膜でスパッタコーティングし、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４７００電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）を使用してイメージングした。図１Ａは、ＭＡＣＨ００９（野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＭＡＣＨ０６０（ＡＤＡＳ産生が可能となるようにｍｉｎＣＤＥ欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、及びＭＡＣＨ０６０からの精製ＡＤＡＳ（表２を参照のこと）の代表的な画像を示す。ＭＡＣＨ００９野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の正常な表現型を呈し、ここでは全ての娘細胞が等しいサイズである（図１Ａ、左側のパネル）。未精製ＭＡＣＨ０６０株は、より小さく球状であるＡＤＡＳ粒子の粒度及び存在の点で多分散性が亢進した集団を示す（図１Ａ、中央のパネル）。精製したＭＡＣＨ０６０はＡＤＡＳ集団のみを示す（図１Ａ、右側のパネル）。上記に記載したとおりのＳＥＭを用いると、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌種から異なるＡＤＡＳ産生技法（それぞれ、ｆｔｓＺの過剰発現及びｍｉｎＣＤＥの欠失）を用いて作製したＡＤＡＳもまた、未精製集団において可視化することができる（データは示さず）。更に、未精製画像では、異常な隔壁形成イベントが顕著である；異常な隔壁形成は、ＡＤＡＳ産生に先行するイベントである。
光学顕微鏡法及び免疫蛍光法
実施例１に記載する分子クローニング手順を用いてＭＡＣＨ０６０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を生成し、次に高細胞密度になるまで一晩培養した。別途、ｉｂｉｄｉ（登録商標）からのカバーガラス底３５ｍｍディッシュを０．０１％ポリリジン溶液で５分間コートした；溶液を吸い取り、ディッシュを乾燥させた。ＭＡＣＨ０６０の高密度懸濁液の１μＬ液滴をカバーガラス底に置き、ほぼ乾燥させた。次に１ｍＬの２．８％パラホルムアルデヒド／０．０４％グルタルアルデヒド固定液を３０分間加えた。試料をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬリゾチームで更に透過処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ロバ血清でブロッキングし、ＰＢＳで２回洗浄し、一次抗体（抗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ）で染色し、洗浄し、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合した二次抗体で染色した。ディッシュをＤＡＰＩで１０分間対比染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。最終的なディッシュをＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で１００倍油浸対物レンズを使用してイメージングした。公的に利用可能なソフトウェアパッケージＦｉｊｉを使用して画像をレンダリングした。図１Ｂは、１００倍の位相差顕微鏡法（左側のパネル）及び蛍光（中央及び右側のパネル）の代表的な画像を示し、これらは、親集団内に、ＬＰＳ膜染色を有するがゲノムを欠いている（ＤＡＰＩ陽性染色なし）ＡＤＡＳがあることを示している。
ナノ粒子特性評価
実施例１に記載する分子クローニング手順を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３のＡＤＡＳ産生株、ＭＡＣＨ１２４を生成し、次に１Ｌの培養培地中で高細胞密度になるまで培養し、実施例２に記載するＡＤＡＳ精製手順に供した。精製ＡＤＡＳ集団を１×ＰＢＳに懸濁し、１０７～１０９粒子／ｍＬの濃度に希釈し、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度となるように加えて粒子凝集を最小限に抑えた。このＡＤＡＳ懸濁液を２０倍希釈し、ＴＳ２０００カートリッジ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）Ｓｕｐｐｌｉｅｓ Ｌｔｄ．）にロードし、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザーで分析した。ｎＣＳ１（商標）は、規定サイズの狭窄部にわたってバイアス電圧を印加すること及び電気抵抗の変化を時間の関数としてモニタすることにより、懸濁液中にある個々の粒子の粒度及び濃度の両方を測定する（Ｆｒａｉｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６（５）：３０８－３１３，２０１１）。２００～２，０００ｎｍの範囲内にある２４，３９２個の粒子を測定した。他の例では、測定される粒子の数は１０～１００，０００個の粒子である。得られたデータはまた、累積粒度分布としてもプロットしており（図１Ｃ）、これにより、ＭＡＣＨ１２４から精製したＡＤＡＳの懸濁液中にある直径２００～２，０００ｎｍの粒子の濃度が明らかになる。ＭＡＣＨ１２４から精製したＡＤＡＳの最も高い濃度は４００～８００ｎｍの粒度範囲内にある。加えて、このデータを積分範囲報告値としてエクスポートしており、これは精製ＡＤＡＳの懸濁液中にある２００～２，０００ｎｍ粒子の凝集体体積を数えるものである（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ナノ粒子特性評価方法を通じて精製ＡＤＡＳの濃度及び粒度分布を定量化し得ることを実証している。加えて、精製ＡＤＡＳ集団内で観察された小分子（例えば、ＡＴＰ－実施例４及び５）、核酸、又はタンパク質（例えば、ＧＦＰ－実施例４及び５）の定量をＡＤＡＳの凝集体体積又はアッセイ中に存在する粒子の数で除すことができ、精製ＡＤＡＳ集団内での目的の小分子、核酸、又はタンパク質の平均濃度の計算が実現し得る。
生存細胞平板培養法
精製前及び精製後に存在する生存親細菌細胞の濃度を決定するため、実施例３Ｃに記載されるＡＤＡＳ産生培養物及び精製ＡＤＡＳ集団を生存細胞平板培養法によってアッセイした。１００μＬのＡＤＡＳ産生培養物又は精製ＡＤＡＳ集団のいずれかを９００μＬの１×ＰＢＳに繰り返し移すことにより段階希釈物を調製した。次に、１０μＬの各希釈物を選択培地にスポッティングし、３７℃でインキュベートして生存細胞を成長させた。２４時間後、１～１００コロニーを含む希釈物をカウントし、このコロニー数に適切な希釈係数を乗じて、試料１ｍＬ当たりのコロニー形成単位数（ＣＦＵ）（即ち、各試料中に存在する生存細胞の濃度）を数えた（図１Ｅ）。ＭＡＣＨ１２４培養物は＞１０８ＣＦＵ／ｍＬであり、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の高密度培養物と一致した；しかしながら、精製ＡＤＡＳ集団中に存在する生存細胞数は、このアッセイの検出限界である１００ＣＦＵ／ｍＬ未満であった。従って、試料中に存在する生存細胞の濃度は生存細胞平板培養法によって数え上げることができ、精製ＡＤＡＳ中に存在する生存細胞の数を一部の実施形態では少なくとも１００ＣＦＵ／ｍＬを下回るまで減少させるには、実施例２に記載するＡＤＡＳ精製手順で十分である。
イムノブロッティング
ＡＤＡＳタンパク質組成物を測定する能力を評価するため、本発明者らは、親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌細胞に存在することが公知である２つのハウスキーピングタンパク質、ＤｎａＫ及びＧｒｏＥＬのＡＤＡＳ中における存在を特徴付けた。実施例１に記載する分子クローニング手順を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３（ＭＡＣＨ０６０）及びＭＧ１６５５（ＭＡＣＨ２００）のＡＤＡＳ産生株を生成し、次に１００ｍＬの培養培地で高細胞密度になるまで培養し、実施例２に記載するＡＤＡＳ精製手順に供した。並行して、ＡＤＡＳ産生培養物の５ｍＬアリコートを２０，０００×ｇでペレット化し、５ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、次に１×ＰＢＳに１００倍希釈した。４×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を希釈培養物の１００μＬアリコート及び精製ＡＤＡＳに加えることにより試料を溶解させた。様々なライセートを８５℃で２分間インキュベートし、次に４０μＬの各試料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル上で分離させた。１０ｎｇの精製組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｒｏＥＬタンパク質（Ａｂｃａｍ、ａｂ５１３０７）又は組換えＤｎａＫタンパク質（Ａｂｃａｍ、ａｂ５１１２１）を含む陽性対照もまた、１×ＬＤＳ試料緩衝液中、８５℃で２分間変性させて、ゲル上で分離させた。Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標））に室温で１時間ブロッキングしたニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、１：１，０００希釈のＧｒｏＥＬ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０５２２）又はＤｎａＫ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６９６１７）を標的とする抗体と共に室温で一晩インキュベートした。次にブロットを過剰量のＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で洗浄し、蛍光色素にコンジュゲートした抗マウス（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）、９２６－６８０７０）及び抗ウサギ（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）、９２６－３２２１１）抗体と共に室温で１時間インキュベートし、過剰量のＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で再び洗浄し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＢｒｉｇｈｔ（商標）イメージャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でイメージングした。ＡＤＡＳ産生培養物からのライセートを含むレーン及び精製ＡＤＡＳからのライセートを含むレーンに、ＧｒｏＥＬ及びＤｎａＫに対応する特異的バンドが存在した（図１Ｆ）；従って、ＡＤＡＳのタンパク質含量はイムノブロッティングによって検出することができる。
実施例４：ＡＤＡＳ活性の測定
本発明者らは、ＡＤＡＳが細胞の働きを果たす潜在力及び本発明者らがこの働きを測定する能力を試験した。本発明者らは、ＡＤＡＳ中のアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｓｅ）（ＡＴＰ）レベルを調べること、及びＡＤＡＳが標的タンパク質を転写及び翻訳する能力を判定することにより、働きの潜在力を測定した。細胞が働きを果たす潜在力は、そのＡＴＰレベルと直接関係している。ＡＴＰは、原核及び真核生物の主要なエネルギー担体であり、その３つのリン酸基間の結合中に化学エネルギーを担持し、結合が壊れるとエネルギーが放出される。ＡＴＰは、転写、翻訳、輸送、及び代謝など、必須細胞過程に必要である。
Ａ．ＡＴＰ測定
ＭＡＣＨ０６０（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ；表２）親細菌に由来するＡＤＡＳを実施例２に記載のとおり培養上清濃縮物からの選択的増殖を用いて精製した。精製ＡＤＡＳを実施例３に記載のとおりのナノ粒子特性評価及び生存細胞平板培養手順に供した。精製ＡＤＡＳ調製物のＡＤＡＳ濃度は５×１０８ＡＤＡＳ／ｍＬであり、存在する粒子の総容積は３．２×１０１６ｎｍ３／ｍＬであった。ＣＦＵ平板培養法により、精製ＡＤＡＳ集団中に存在する生存細胞（例えば、親細胞）の濃度が検出限界（１００ＣＦＵ／ｍＬ）以下であったことが明らかになった。
ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）微生物細胞生存能力アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い用いて、精製ＡＤＡＳ集団に存在するＡＴＰの濃度をトリプリケートで測定した。簡潔に言えば、１００μＬの精製ＡＤＡＳ又は規定質量のＡＴＰが入ったウェルに１００μＬの再水和アッセイ緩衝液を加え、これが分子標準となった。各ウェルからの発光シグナルをプレートリーダーに記録した。規定質量のＡＴＰの対数変換後発光シグナルを対数変換後ＡＴＰ質量に対してプロットし、これらのデータに直線を当てはめて検量線を作成した。続いて、精製ＡＤＡＳが入ったウェルで観察された発光シグナルをこの検量線に当てはめて、ウェルに存在するＡＴＰの質量を計算した（図２Ａ）。生存細胞の混入によって生じたＡＴＰレベルは本アッセイの検出限界未満であり、バックグラウンドとしてＡＤＡＳ総量から差し引いた。精製ＡＤＡＳの各ウェル内に存在するＡＴＰの質量をウェル内に存在するＡＤＡＳの凝集粒子体積で除した：この比率が、１００ＣＦＵ／ｍＬ未満に精製したＡＤＡＳ集団中に存在するＡＴＰの濃度に相当する。
Ｂ．ＡＴＰ生成
ＡＤＡＳがゲノムの非存在下でＡＴＰを生成する能力を決定するため、精製ＡＤＡＳからのＡＴＰ濃度を経時的に測定した。ＭＡＣＨ１２４（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ；表２）に由来するＡＤＡＳを実施例２に指示されるとおり培養上清濃縮物からの選択的増殖を用いて精製した。精製ＡＤＡＳに、富栄養培地（１０％ルリアブロス）を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベニシリンと共に補足した。ＡＤＡＳを２つのアリコートに分割し、並行して試験した；一方のアリコートは直ちに４℃での貯蔵下に置き、他方のアリコートは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において３７℃、８００ｒｐｍで２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、両方のアリコートのＡＴＰ濃度を上記に記載されるとおり測定した。２時間インキュベートすると、ＡＴＰ量が５４．９％増加したことから、ＡＤＡＳはゲノムの非存在下でＡＴＰを生成できることが指摘される（図２Ｂ）。
Ｃ．標的タンパク質の転写及び翻訳：ＧＦＰ
ＡＤＡＳが標的遺伝子を転写及び翻訳する潜在力を測定するため、ＭＡＣＨ０６０（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ（表２））に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドであるｐＧＦＰを形質転換した。この配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドン最適化し、ＴｅｔＡプロモーター、ＴｅｔＲリプレッサー（ＴｅｔＡプロモーターを抑制する）、ｐＭＢ１複製起点、及び抗生物質選択用のカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドにクローニングした。ひいてはＡＤＡＳはこの株（ＭＡＣＨ１２４）に由来し、実施例２に指示されるとおり培養上清濃縮物からの選択的増殖を用いて精製した。親の負荷量は、ＣＦＵ平板培養法による検出限界（＜１００ＣＦＵ／ｍＬ）であることが決定された。ＡＤＡＳのタンパク質発現を調べるため、２つの方法：（１）プレートリーダーを使用したＧＦＰ蛍光の経時的測定、及び（２）イムノブロッティングを用いた。
（１）プレートリーダー法
最少成長培地（０．２％カザミノ酸、０．２％グルコース、及び１００ｕｇ／ｍＬのセフトリアキソンを含有する最少塩（Ｍ９）培地）で精製ＡＤＡＳ又は親細菌をインキュベートした。精製ＡＤＡＳ試料には、いかなるゲノム含有親細菌の成長も防ぐため抗生物質を補足した。加えて、誘導する試料については、培地に１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように誘導物質アンヒドロテトラサイクリンを添加した。アンヒドロテトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＡプロモーターのＴｅｔＲ抑制が解除され、ＧＦＰタンパク質が発現した。ＧＦＰシグナル検出は、発光及び励起にそれぞれ４７９ｎｍ及び５２０ｎｍの波長を用いて測定した。図２Ｃ～図２Ｅは、ＧＦＰ蛍光によって測定したときの、ＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳにおける１２時間にわたるＧＦＰの転写及び翻訳の誘導物質依存的増加を実証する。誘導物質の非存在下では（非誘導）、ＧＦＰシグナルの増加はなかった。この知見は、ΔｍｉｎＣＤＥ ＡＤＡＳが誘導物質依存的な標的遺伝子の転写及び翻訳能を有することを示している。更に、図２Ｃによれば、１００ＣＦＵ／ｍＬの親細菌からのＧＦＰシグナルはＡＤＡＳよりも有意に低く、時間が経っても増加しなかったため、精製ＡＤＡＳによって生成されたＧＦＰシグナルは親の混入に起因するのではないことが示される。
（２）イムノブロッティング法
１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン及びアンヒドロテトラサイクリン（１０００ｎｇ／ｍＬ）誘導物質を補足したＭＡＣＨ１２４精製ＡＤＡＳ及び等容積のルリアブロスを滅菌遠心管にアリコートに分けた。試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において３７℃、８００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２４時間後、ＡＤＡＳを４℃において２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、１×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を含有する溶解緩衝液（１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標））にペレット化したＡＤＡＳを再懸濁し、８５℃で２分間加熱した。次に等容積の溶解したＡＤＡＳを４～１２％ＢｉｓＴｒｉｓポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲル上のタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写し、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標））中、室温で６０分間インキュベートした。次に膜を一次抗体（１：５００希釈のマウス抗ＧｒｏＥＬ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０５２２）及び１：５００希釈のウサギ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６５５６））と共に室温で６０分間インキュベートした。０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を補足したＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）ＰＢＳブロッキング緩衝液に抗体を再懸濁した。続いて膜を１×ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で３回洗浄した後、関連性のある二次抗体（ヤギ抗マウス８００（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１６７７２）及びヤギ抗ウサギ６８０（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７５７７３）、両方とも１：５，０００希釈）を補足した０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）ＰＢＳブロッキング緩衝液中でインキュベートした。膜を１×ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で３回洗浄し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＢｒｉｇｈｔ（商標）イメージャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でイメージングした。バンド強度をデンシトメトリーで定量化し、ＧＦＰ強度をローディング対照ＧｒｏＥＬで正規化して表した。図２Ｆは、誘導したＡＤＡＳに検出されたＧＦＰタンパク質の量の時間依存的増加を実証する。
実施例５：ΔｍｉｎＣＤＥ親から生成されたＡＤＡＳは高活性である
突然変異ΔｍｉｎＣ、ΔｍｉｎＤ、又はΔｍｉｎＣＤＥを含む親細胞から精製したＡＤＡＳをプレートリーダー及びイムノブロッティングでアッセイして、これらがＧＦＰレポーター遺伝子を転写及び翻訳する能力を比較した。予想外にも、ΔｍｉｎＣＤＥ親細胞に由来するＡＤＡＳが、ΔｍｉｎＣ又はΔｍｉｎＤのいずれの親細菌細胞に由来するＡＤＡＳよりも高い活性を有することが見出された。
Ａ．ΔｍｉｎＣＤＥ、ΔｍｉｎＣ、又はΔｍｉｎＤ培養物からのＡＤＡＳの精製
ＡＤＡＳ産生株ＭＡＣＨ１２４（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ＋ｐＧＦＰ）、ＭＡＣＨ５５６（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣ＋ｐＧＦＰ）、及びＭＡＣＨ５５７（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＤ＋ｐＧＦＰ）（表２を参照のこと）を１Ｌの培養培地で高細胞密度になるまで培養し、実施例２に記載するＡＤＡＳ精製手順に供した。これらの株の３つ全てが担持するｐＧＦＰプラスミドについては、表３に更に詳細に記載する。精製ＡＤＡＳを、実施例３に記載するナノ粒子特性評価及び生存細胞平板培養手順に供した。ＡＤＡＳの濃度は、ＭＡＣＨ１２４＝２．４×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬ、ＭＡＣＨ５５６＝１．８６×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬ、及びＭＡＣＨ５５７＝１．９８×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬであった。精製ＡＤＡＳ中に存在する生存親細菌細胞の負荷量は、ＣＦＵ平板培養法による検出限界よりも低いことが見出された（＜１００ＣＦＵ／ｍＬ）。
Ｂ．プレートリーダーでアッセイしたＧＦＰ発現反応速度
ＡＤＡＳがＧＦＰを誘導物質依存的に発現する能力を実施例４Ｃに記載のとおり判定した。図３Ａ及び図３Ｂは、１２時間にわたって持続したＭＡＣＨ１２４、ＭＡＣＨ５５６、及びＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳにおけるＧＦＰの転写及び翻訳の誘導物質依存的増加を示す。誘導物質の非存在下では（非誘導）、ＡＤＡＳはＧＦＰを生じなかった。図３Ａ及び図３Ｂのデータは、実施例４Ｃに記載のとおり正規化している。３つ全てのｍｉｎ遺伝子座欠失株に由来するＡＤＡＳが、誘導時にＧＦＰを発現可能であったが、ＭＡＣＨ１２４（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ）に由来するＡＤＡＳが、時間の経過に伴い一層高いＧＦＰシグナルを生じた。１２時間の時点で、ＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳ ＧＦＰシグナルはＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳよりも約１１９％高く、ＭＡＣＨ５５６ ＡＤＡＳよりも約１８６％高かった。従ってΔｍｉｎＣＤＥ親から生成されたＡＤＡＳは、ΔｍｉｎＣ、又はΔｍｉｎＤ親から生成されたものよりも誘導時に高レベルのＧＦＰを発現する。
ＭＡＣＨ１２４、ＭＡＣＨ５５６、及びＭＡＣＨ５５７について観察された未補正のＧＦＰ産生量曲線を用いることにより、各株から精製して誘導物質の存在下でインキュベートしたＡＤＡＳの総タンパク質産生量及び平均タンパク質産生速度を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して各データセットに回帰直線を当てはめ、１２時間での総ＧＦＰ産生量を反映する曲線下面積を計算した。ＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳがＭＡＣＨ５５６又はＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳよりも有意に多いＧＦＰを産生した（図３Ｄ）。実験の経過中の平均ＧＦＰ産生速度を判定するため、各曲線下面積を実験の継続期間で除した。１２時間の平均ＧＦＰ産生速度は、ＭＡＣＨ５５６又はＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳと比べてＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳについて有意に高かった（図３Ｅ）。最後に、ＭＡＣＨ５５６及びＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳによるＧＦＰ産生総量を、１００％に正規化したＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳによるＧＦＰ産生量に対する割合として表した。これらのデータは（図３Ｆ）にプロットしている。ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）ＡＤＡＳは、ＭＡＣＨ５５６（ΔｍｉｎＣ）及びＭＡＣＨ５５７（ΔｍｉｎＤ）のいずれと比べても高いＧＦＰ総量を産生した。
Ｃ．イムノブロッティングでアッセイしたＧＦＰ発現
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｌｌｉｎ）を含有する５０％ＬＢ培養培地中、アンヒドロテトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でＭＡＣＨ１２４、ＭＡＣＨ５５６、及びＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳを３７℃、８００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。実施例３に記載のとおりイムノブロッティングを実施した。２４時間後、ＡＤＡＳを４℃において２０，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を取り除き、ペレット化したＡＤＡＳを、１×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を含有する溶解緩衝液（１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標））に再懸濁し、８５℃で２分間加熱した。次に等容積の溶解したＡＤＡＳを４～１２％ＢｉｓＴｒｉｓポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲル上のタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写し、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）ＰＢＳブロッキング緩衝液中、室温で６０分間インキュベートした。膜を一次抗体（１：５００希釈のマウス抗ＧｒｏＥＬ及び１：５００希釈のウサギ抗ＧＦＰ）と共に室温で６０分間インキュベートした。０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を補足したＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（登録商標）ＰＢＳブロッキング緩衝液に抗体を再懸濁した。続いて膜を１×ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で３回洗浄した後、関連性のある二次抗体（ヤギ抗マウス８００及びヤギ抗ウサギ６８０、両方ともに１：５，０００希釈）を補足したＩｎｔｅｒｃｅｐｔＰＢＳブロッキング緩衝液＋ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中でインキュベートした。膜を１×ＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で３回洗浄し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＢｒｉｇｈｔ（商標）イメージャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でイメージングした（図３Ｃ）。バンド強度をデンシトメトリーで定量化し（図３Ｃ、中央のパネル）、ＧＦＰ強度はローディング対照ＧｒｏＥＬで正規化して表した（図３Ｃ、下のパネル）。ＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳはＭＡＣＨ５５６及びＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳと比較してＧＦＰ産生の増加を実証したことから、ＭＡＣＨ１２４（ΔｍｉｎＣＤＥ）がタンパク質産生の点でより高い活性を示すことが指摘される。
実施例６：膜提示タンパク質を有するＡＤＡＳ
本例は、ＡＤＡＳのモデルターゲティング薬剤としてのナノボディの膜提示を実証する。ナノボディは公知の最小の機能性抗体断片であり、最近の研究では、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の表面に発現できることが示されている（Ｓａｌｅｍａ ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０（６），２０１７）。表面ナノボディは標的タンパク質に効率的に結合することができ、細胞特異的結合親和性の増強に用いることができる。本例は、ターゲティング薬剤（この場合ナノボディ）がＡＤＡＳの表面に発現できることを実証する。
Ａ．ＨＥＲ２ターゲティングナノボディを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の作製
ＨＥＲ２受容体（乳癌に関連する）のターゲティング能を有するＡＤＡＳを構築するため、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ｓｔｘ－のインチミン遺伝子に融合したナノボディ配列でプラスミド（ｐＮｅａｅ－ＮＢ２）（表３）を合成した。具体的には、インチミン遺伝子のＮ末端部分の５８３アミノ酸（Ｎｅａｅ）をＥタグ（配列番号５）、グリシン－グリシン－セリンリンカー、ＮＢ２ナノボディ配列（配列番号６）、セリン－グリシンリンカー、及びＣ末端ＦＬＡＧタグ（配列番号７）に融合した。この配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドン最適化し、ＴｅｔＡプロモーター、ＴｅｔＲリプレッサー（ＴｅｔＡプロモーターを抑制する）、ＣｌｏＤＦ１３複製起点、及び抗生物質選択用のカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドにクローニングしてｐＮｅａｅ－ＮＢ２を作出した（表３を参照のこと）。培養上清にアンヒドロテトラサイクリンを添加すると、ＴｅｔＡプロモーターのＴｅｔＲ抑制が解除され、Ｎｅａｅ－ＮＢ２融合タンパク質が発現した。このＮｅａｅ－ＮＢ２融合タンパク質は、プラスミドを担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌細胞の外膜に集合し、ＮＢ２ナノボディを外部に提示する。ｍｉｎＣＤＥ遺伝子座の欠失を保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＷ２５１１３株にｐＮｅａｅ－ＮＢ２プラスミドをクロラムフェニコール耐性カセットと共に形質転換し、成長培地に５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加して選択することにより、ＭＡＣＨ２８４を作出した（表２を参照のこと）。
Ｂ．ＨＥＲ２ナノボディ発現を有するＡＤＡＳの作製
その表面にターゲティング抗体を有するＭＡＣＨ０６０（非修飾、陰性対照ＡＤＡＳ）及びＭＡＣＨ２８４ ＡＤＡＳを調製し、実施例２に概説するプロセスに、成長培地について少し変更を加えたものにより精製した。ここでは、培養物には成長中にアンヒドロテトラサイクリンを５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度となるように添加して、プラスミドからのターゲティングＮｅａｅ－ＮＢ２融合タンパク質を発現した親からＡＤＡＳが産生されるようにした。
Ｃ．ＡＤＡＳ表面におけるＨＥＲ２ナノボディの提示の確認
ＡＤＡＳの表面におけるＮｅａｅ－ＮＢ２の発現を確認するため、免疫蛍光標識法を実施した。ＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ２８４からのＡＤＡＳをＰＢＳ中に、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザーを使用した分析により決定したとき約５×１０８粒子／ｍＬの濃度となるように希釈した。この試料に、Ｎｅａｅ－ＮＢ２融合体中のＥタグ特徴を標的化する抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３９７）を試料１ｍＬ中５μｇ／ｍＬの最終濃度となるように加えた。これらの試料を穏やかに混合し、氷上で２．５時間インキュベートさせておいた。インキュベーション後、４℃において１５，０００×ｇで１０分間遠心することによりＡＤＡＳを収集した。上清を廃棄し、ペレットを８００μＬのＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖ ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に穏やかに再懸濁した。この洗浄を２回繰り返し、最終的なペレットを０．５ｍＬのＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に再懸濁した。この試料に、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０フルオロフォアにコンジュゲートした２．５μＬのロバ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９８４８９）を加え、穏やかに混合し、氷上で１時間インキュベートした。このインキュベーション後、４℃において１５，０００×ｇで１０分間遠心することによりＡＤＡＳを収集した。上清を廃棄し、ペレットを５００μＬのＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０に再懸濁した。この洗浄を合計３回繰り返し、最終的なペレットを２５０μＬの緩衝液に再懸濁した。２００μＬの試料を取り出し、黒色壁、透明底の９６ウェルポリプロピレンプレートに入れた。次にこのプレートについて、ウェルの面走査を用いて６００ｎｍの光学濃度でＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０蛍光（励起：４８７ｎｍ、発光：５２８ｎｍ）を読み取った。図４は、光学濃度で正規化したＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０蛍光を使用したこの標識実験の結果を示す。野生型ＭＡＣＨ０６０ ＡＤＡＳは無視できるほどの蛍光しか示さなかったが、Ｎｅａｅ－ＮＢ２ナノボディ提示ＭＡＣＨ２８４ ＡＤＡＳは、統計的に有意な、ほぼ１０倍の蛍光の増加を示した。従って、ターゲティングナノボディは有効に発現し、ＡＤＡＳの外膜に提示された。
実施例７：ＡＤＡＳによるカーゴの産生及び送達
本例は、本発明のＡＤＡＳが、標的細胞又は生物に特異的効果を及ぼすカーゴを産生し及び送達する能力を有することを実証する。モデルとして、本発明者らは、特定の環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を生成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを作出した。詳細には、哺乳類細胞のＲＥＣＯＮ（ＲＥｄｕｃｔａｓｅ ＣＯＮｔｒｏｌｌｉｎｇ ＮＦ－κＢ（レダクターゼ制御ＮＦ－κＢ））を介してインターフェロン遺伝子刺激因子（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ：ＳＴＩＮＧ）経路に関与する細菌ヌクレオチドｃ－ジ－ＡＭＰ（Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，３０（２）：１６７－１７８，２００８）を産生するように、異種酵素の発現によってＡＤＡＳを誘導した。本例は更に、カーゴの産生を触媒する酵素をＡＤＡＳが発現でき、次にはそのカーゴを標的細胞に送達できることを実証する。
Ａ．ＳＴＩＮＧ作動薬大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの構築
ＳＴＩＮＧ経路を活性化させる能力を有するＡＤＡＳを作出するため、実施例１で調製したとおりのＢＷ２５１１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ΔｍｉｎＣＤＥ：：ＣａｍＲ（ＭＡＣＨ０６０）株でジアデニル酸シクラーゼを発現させた。そのため、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のジアデニル酸シクラーゼＡ（ＤａｃＡ）タンパク質のアミノ酸配列（受託番号Ｑ８Ｙ５Ｅ４）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドン最適化し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓがデノボ合成し、ＴｅｔＡプロモーター（ｐＴｅｔ）、ＴｅｔＲリプレッサー（これはＴｅｔＡプロモーターを抑制する）、ｐＭＢ１複製起点、及び抗生物質選択用のβ－ラクタマーゼ遺伝子を含むプラスミドにクローニングすることにより、ｐＳＴＩＮＧプラスミドを得た（表３）。このプラスミドをＭＡＣＨ０６０（ＢＷ２５１１３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ΔｍｉｎＣＤＥ：：ＣａｍＲ）に形質転換し、成長培地中の１００μｇ／ｍＬカルベニシリン及び３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを用いて選択することにより、株ＭＡＣＨ１９８を得た（表２）。成長培地にアンヒドロテトラサイクリンを加えて誘導したとき、ＭＡＣＨ１９８は、２つのＡＴＰ分子の縮合を触媒して強力なＳＴＩＮＧ活性化因子である環状ジ－ＡＭＰにするＤａｃＡを産生した。
Ｂ．ＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ１９８ ＡＤＡＳの精製
ＳＴＩＮＧ活性化アッセイのため、実施例２に概説する方法に軽微な変更を加えたものを用いてＭＡＣＨ０６０及びＭＡＣＨ１９８を調製した。簡潔に言えば、ＭＡＣＨ１９８の２つの培養物、１つは通常どおり成長させるもの（非誘導）、及び１つは２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリンを加えて成長させるもの（誘導）を使用した。ＡＤＡＳを０．２μｍボトルトップフィルタを用いて濃縮及び回収し、約１０９粒子／ｍＬの最終濃度となるようにＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）成長培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に再懸濁した。実施例２に概説するＣＦＵ平板培養法により判定したときの残留親負荷量は、２００ＣＦＵ／ｍＬ未満の親細菌細胞であることを示した。
Ｃ．哺乳類細胞アッセイを用いた機能の判定
ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）単球細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、発光リードアウトを用いたＳＴＩＮＧ経路の活性化を判定した。ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞は、５つのＩＦＮ刺激応答エレメントと併せてＩＳＧ５４ミニマルプロモーターの制御下にある、分泌型ルシフェラーゼレポーター遺伝子であるＬｕｃｉａ遺伝子を特徴とする。ＩＦＮ刺激応答エレメントが、例えばｃ－ジ－ＡＭＰへの曝露によって（例えば、ｃ－ジ－ＡＭＰを含むＡＤＡＳ（例えば、ＭＡＣＨ１９８ ＡＤＡＳ）のファゴサイトーシスによって）活性化すると、ＩＳＧ５４ミニマルプロモーターが活性化し、ルシフェラーゼが転写、翻訳され、細胞培地中にルシフェラーゼが分泌される。ルシフェラーゼを定量化するため、細胞培地に基質ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加える。ＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）はルシフェラーゼ基質セレンテラジンを含有し、これはルシフェラーゼによる加水分解時に光シグナルを生じるため、それをプレートリーダーを用いて定量化し得る。
ＡＤＡＳがＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞においてＳＴＩＮＧ経路を活性化させるかどうかを判定するため、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎの仕様に従いＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞を培養し、５×１０５細胞／ｍＬの濃度で各ウェルにつき１２５μＬとして９６ウェルプレートに播種した。ＭＡＣＨ０６０、非誘導ＭＡＣＨ１９８、及び誘導したＭＡＣＨ１９８からのＡＤＡＳ（表２）を約４×１０７ＡＤＡＳ／ｍＬで各ウェルにつき１００μＬの容積として加えた。３７℃で４２時間インキュベートした後、プレートを３００×ｇで５分間遠心した。最後に、各ウェルから２０μＬの培地を取り出し、各ウェルにつき５０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）が入った白色壁のプレートに置いた。直ちにプレートリーダーで発光を読み取った。図５Ａは、実施例１に記載されるとおりＳｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザーを使用して決定したときの、加えたＡＤＡＳの容積で正規化した各実験条件からの試料の発光平均値を示す。各ＡＤＡＳ条件に６つのバイオロジカルレプリケートが含まれた。ＤａｃＡ遺伝子を含まないＭＡＣＨ０６０ ＡＤＡＳからは発光シグナルはほとんど乃至全く得られず、大部分はＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞のＩＦＮ刺激応答エレメントを惹起しなかった。しかしながら、ｐＴｅｔの制御下にＤａｃＡ遺伝子を含んだＭＡＣＨ１９８ ＡＤＡＳは、実にＴＨＰ１－Ｄｕａｌ細胞を刺激した。アンヒドロテトラサイクリンと共に培養することによりＤａｃＡ発現を誘導した試料中で最も強い刺激が観察された。更に、単球がＩＦＮ遺伝子の刺激を受けると、細胞は活性化表現型を取り、懸濁液中の非接着性単球から活性化した接着性マクロファージへと変化する。本発明者らは、様々なＡＤＡＳ集団に曝露した試料でこの変化を観察した。図５Ｂは、ＴＨＰ１－Ｄｕａｌ（商標）細胞をアンヒドロテトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ）誘導性ＭＡＣＨ１９８ ＡＤＡＳで処理した試料において、活性化した接着性の表現型が最も明らかであることを示している。
ＳＴＩＮＧ経路の機能には、下流Ｉ型インターフェロン応答を引き出すことが不可欠である。この応答のシグネチャーは、インターフェロンβ（ＩＦＮＢ１）などのＩ型インターフェロンの分泌である。ＡＤＡＳが機能性ＳＴＩＮＧ応答を誘導する能力を更に解明するため、ヒトＩＦＮ－β Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（ＤＩＦＮＢ０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標））を使用して各試料のＩＦＮＢ１を定量化した。上記のアッセイしたウェルから細胞上清を吸い取り、ＥＬＩＳＡの直線範囲になるまで希釈した。製造者の指示に従いＥＬＩＳＡを実施した。図５ＣはＥＬＩＳＡの結果を示す。ＭＡＣＨ０６０ ＡＤＡＳ及び小分子ＳＴＩＮＧ作動薬（対照として提供した）はＥＬＩＳＡアッセイの検出限界を下回るＩＦＮＢ１レベルを示した一方（＜５ｐｇ／ｍＬ）、非誘導ＭＡＣＨ１９８ ＡＤＡＳは微量のＩＦＮＢ１を示し（約７ｎｇ／ｍＬ）、誘導したＭＡＣＨ１９８は、細胞上清中に分泌されたＩＦＮＢ１の４０倍を超える増加を示した（約３００ｎｇ／ｍＬ）。このようにＡＤＡＳは異種酵素の発現を通じてカーゴを作り出す能力を実証し、このカーゴは標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃａｌｌ）に送達され、機能性の（この場合には免疫調節性の）応答を誘導した。
実施例８：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳへのＲＮＡカーゴの負荷
本例は、ＲＮＡカーゴ、この場合にはコナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）からのキモトリプシン（ｃｈｙ１）の遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡの発現及びＡＤＡＳへのパッケージングについて記載する。
Ａ．ｄｓＲＮＡを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の構築
ｄｓＲＮＡと共にパッケージングされたＡＤＡＳを構築するため、デュアルＴ７プロモーター、ｐＭＢ１複製起点、及び抗生物質選択用のアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドＬ４４４０（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６９）：８０６－８１１，１９９９）に、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）ｃｈｙ１キモトリプシン遺伝子のコード領域の一部分に対応する４１２ｂｐ配列（配列番号８）をクローニングして、ｐＲＮＡｉを得た（表３を参照のこと）。このプラスミドを、クロラムフェニコール耐性カセットを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＴ１１５（ＤＥ３）ΔｍｉｎＣＤＥ株であるＭＡＣＨ３００（表２）に形質転換し、成長培地に５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えて選択することにより、ＭＡＣＨ３０１を作出した（表２）。ＭＡＣＨ３０１はまた、ｄｓＲＮＡを分解するＲＮアーゼＩＩＩをコードするｒｎｃ遺伝子の破壊も、テトラサイクリン耐性カセットと共に保有する。この株は、加えて、ｌａｃプロモーターの後ろにあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のコピーをコードするＤＥ３プロファージを保有する。培地にイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えると、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが発現する。次にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが両方のＴ７プロモーターからｃｈｙ１挿入配列を転写すると、対応するｄｓＲＮＡが作り出される。
Ｂ．ｄｓＲＮＡを含むＡＤＡＳの作製
ｄｓＲＮＡを負荷したＭＡＣＨ３０１ ＡＤＡＳを調製し、実施例２に概説するプロセスに成長条件について変更を加えたものによって精製した。簡潔に言えば、ＭＡＣＨ３０１の一晩培養物を５０μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢで１：２００希釈し、ＯＤ６００＝０．４まで成長させた。続いて培養物に１ｍＭの最終濃度となるようにＩＰＴＧを加え、プラスミドからのｄｓＲＮＡコンストラクトを発現した親からＡＤＡＳが産生されるように成長を４時間継続した。
Ｃ．ＡＤＡＳにおけるｄｓＲＮＡ負荷量の定量化
ＡＤＡＳ中のｄｓＲＮＡレベルを定量化するため、本発明者らは、核酸含量をゲル電気泳動により分析した。実施例３に記載されるとおりＳｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザー分析により決定したときＰＢＳ中約３．３×１０１０粒子／ｍＬの濃度のＡＤＡＳを８０℃で２０分間の熱処理によって溶解させた。この処理が、核酸の放出及びアガロースゲル電気泳動による容易な可視化につながった。２０μＬの熱処理したＡＤＡＳライセートを、製造者の推奨するセッティングに従い、１２５ｎｇ／μＬのインビトロ転写ｄｓＲＮＡの希釈系列によって作成した検量線と並んで２％アガロースＥ－Ｇｅｌ（商標）ＥＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に泳動させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｉＢｒｉｇｈｔ（商標）イメージャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を核酸ゲルセッティングで使用してこのゲルをイメージングした。バンド強度をＩｍａｇｅＪで定量化した。負荷されたｄｓＲＮＡの量は、１０９個のＡＤＡＳ当たり９７ｎｇであると計算された。本例は、ＡＤＡＳにＲＮＡカーゴを有効に負荷できることを実証している。
実施例９：鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）への大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの送達
本例は、人工飼料にＡＤＡＳを加えた後の鱗翅類の昆虫、具体的にはヨーロッパアワノメイガの体内でのＡＤＡＳの蛍光標識及び可視化について記載する。
Ａ．可視化のためのＡＤＡＳの蛍光標識
ヨーロッパアワノメイガのＡＤＡＳを可視化するため、本発明者らは、ＡＤＡＳをＮＨＳエステル蛍光色素で蛍光標識した。実施例８に概説するプロセスによりＭＡＣＨ３０１ ＡＤＡＳを調製し、精製した。Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザー分析により測定したとき１×１０１１の濃度の１ｍＬのＡＤＡＳに３０μＬの０．５Ｍホウ酸ナトリウムを加えた。ＡＤＡＳの外膜表面上のアミン含有分子（例えばタンパク質の第一級アミン）と反応するＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を無水ジメチルホルムアミドに１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。１．５ｍＬチューブ内にあるＡＤＡＳに２０μＬのＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステルストックを加え、短時間ボルテックスした。続いて反応混合物をフォイルに包み、室温で１時間揺動機に置いた。過剰量の色素を除去するため、ＡＤＡＳを室温にて２０，０００×ｇで１０分間ペレット化し、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。この洗浄を３回繰り返し、１ｍＬの最終容積のＰＢＳにＡＤＡＳを再懸濁した。
Ｂ．ヨーロッパアワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｒｎ Ｂｏｒｅｒ：ＥＣＢ）への標識ＡＤＡＳの給餌
Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．からヨーロッパアワノメイガ（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））の卵を入手し、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．から購入した人工飼料（一般的な夜蛾用飼料）で飼育した。飼料は以下のとおり調製した：１６２ｇの一般的な夜蛾用飼料粉末を沸騰水に加えた；温度を８０℃～９０℃に保ちながら内容物を１５分間十分に混合した；この混合物を７０℃まで冷却し、５ｍＬの亜麻仁油を加え、十分に混合した；及びこの餌を飼育容器に分注し、放冷して固化させた。
飼料上にＥＣＢ卵を置き、孵化させて、給餌した。飼育容器は全て、２５℃、１６時間：８時間の明期：暗期サイクル、５０～６０％湿度で維持した。幼虫が２齢期に達したところで、それらを給餌アッセイに使用した。給餌セットアップを調製するため、２５ｍＬの一般的な夜蛾用飼料を調製し、０．４リットル容器（Ｓｉｓｔｅｍａ １５４３ Ｋｌｉｐ Ｉｔボックス）の蓋に（熱いうちに、７０℃）注ぎ入れ、直ちに固化しつつあるその餌の中に、底を切り取った（底から約２ｍｍを取り除いた）４８ウェルＰＣＲプレートを置いた：この作り出された個々のウェルが、この２齢幼虫給餌アッセイに適正な量の飼料を含んだ。ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル標識ＡＤＡＳ又は対照としてのＰＢＳを投与するため、２μＬの標識ＡＤＡＳ又はＰＢＳを個別に５ウェルに加え、乾燥させた。次に各ウェルに個々の２齢幼虫を加え、１時間摂食させた。
Ｃ．ヨーロッパアワノメイガにおける蛍光ＡＤＡＳの可視化
ＥＣＢ幼虫におけるＡＤＡＳを可視化するため、ＰＢＳ又はＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル標識ＡＤＡＳを給餌した幼虫をウェルから取り出し、粘着テープの上に置いてそれらを固定化し、次に撮像面に置いた。７００ｎｍ及び８００ｎｍの両方のチャネルを用いて幼虫を走査した。７００ｎｍチャネルにおける幼虫の自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ）；ひいては、このチャネルを使用して、イメージャー上での幼虫の位置を特定した。８００ｎｍチャネルを使用して幼虫体内の標識ＡＤＡＳを検出した。
図６は給餌実験の結果を示し、ＰＢＳ給餌幼虫の８００ｎｍチャネルのシグナルは極めて低く、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）８００ ＮＨＳエステル標識ＭＡＣＨ３０１ ＡＤＡＳを給餌した幼虫に存在する蛍光シグナルは強力であった。従って、ＡＤＡＳは飼料に加えたときヨーロッパアワノメイガによって食され、その体内に存在する。
実施例１０：ＡＤＡＳの貯蔵
この例では、本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をモデルＡＤＡｓ産生細菌として使用してＡＤＡＳを製剤化し、貯蔵するための方法を実証した。実施例１～３に提供する方法により誘導性ＧＦＰプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを合成し、精製した。次にそれらを様々な条件で貯蔵することにより、その再構成される能力及び生存能力について評価した。
Ａ．低温条件における縦断的ＡＤＡＳ貯蔵
この例では、４℃で０及び３日間貯蔵した後にＡＤＡＳがＧＦＰを誘導的に発現する能力を判定した。ＡＤＡＳは、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＧＦＰ発現をドライブするｐＧＦＰプラスミド（表３）を含む３つの株に由来した：ＭＡＣＨ１２４（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣＤＥ）、ＭＡＣＨ５５６（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＣ）、及びＭＡＣＨ５５７（ＢＷ２５１１３ ΔｍｉｎＤ）：遺伝子型情報については表２を参照のこと。ＡＤＡＳを実施例２に指示されるとおり培養上清濃縮物からの選択的増殖を用いて精製した。精製したＭＡＣＨ１２４調製物については、ＡＤＡＳ濃度は精製直後に２．４×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬ及び貯蔵３日後に２．１８×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬと決定された。精製したＭＡＣＨ５５６調製物については、ＡＤＡＳ濃度は精製直後に１．８６×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬ及び貯蔵３日後に２．２×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬと決定された。精製したＭＡＣＨ５５７調製物については、ＡＤＡＳ濃度は精製直後に１．９８×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬ及び貯蔵３日後に２．０８×１０９ＡＤＡＳ／ｍＬと決定された。ＡＤＡＳ濃度測定値は全て、Ｓｐｅｃｔｒａｄｙｎｅ（登録商標）ｎＣＳ１（商標）ナノ粒子アナライザーを使用して取った（実施例３に概説する）。精製ＡＤＡＳ調製物を実施例３に記載されるナノ粒子特性評価及び生存細胞平板培養手順に供した。各調製物について、生存細胞負荷量は、実施例３に記載されるとおりのＣＦＵ平板培養法により、検出限界（１００ＣＦＵ／ｍＬ）以下であることが決定された。貯蔵したＡＤＡＳがＧＦＰを誘導物質依存的に発現する能力を実施例４Ｃに記載されるとおり判定した。０日目（貯蔵下にあった日はない）、３つ全ての株で１２時間にわたって増加した誘導物質依存的ＧＦＰシグナルが観察された。貯蔵３日後、本発明者らは、ＭＡＣＨ１２４及びＭＡＣＨ５５７ ＡＤＡＳにおいて、１２時間にわたって持続するＧＦＰの転写及び翻訳の誘導物質依存的増加を観察した（図７Ａ～図７Ｆ）。ＭＡＣＨ５５６は、約６時間までＧＦＰシグナルの誘導物質依存的増加を示し、次にシグナルは減退し、１２時間までに非誘導レベルに戻った。誘導物質の非存在下では（非誘導）、試験したいずれ株についてもＧＦＰシグナルの増加はなかった。図７Ａ～図７Ｆのデータは実施例４Ｃに記載されるとおり正規化している。
Ｂ．ＡＤＡＳの凍結乾燥及び再構成
ＡＤＡＳが凍結乾燥後に働きを果たす潜在力を調べるため、凍結乾燥後１、２又は６週間の再水和したＡＤＡＳのＡＴＰレベルを測定した。更に、凍結乾燥したＡＤＡＳが再水和後に標的遺伝子ＧＦＰを転写及び翻訳する能力もまた判定した。ＭＡＣＨ１２４からのＡＤＡＳを実施例２に指示されるとおり精製した。ＡＤＡＳを凍結乾燥するため、精製ＡＤＡＳを２１，０００×ｇで２０分間ペレット化し、微生物凍結乾燥緩衝液（ＯＰＳ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に再懸濁した。ＡＤＡＳを液体窒素で急速凍結し、０．３ミリバールの真空に設定したＬａｂｃｏｎｃｏ（商標）ＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥器の自動設定で１８時間フリーズドライした。フリーズドライしたＡＤＡＳをＺｉｐｌｏｃバッグに入れて再水和時まで室温で暗所下に貯蔵した。凍結乾燥後のＡＤＡＳのＡＴＰレベルを決定するため、凍結乾燥後１、２、及び６週間でＡＤＡＳを再水和し、ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）微生物細胞生存能力アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い使用してＡＴＰレベルを測定した。このアッセイにより、凍結乾燥して再水和したＡＤＡＳが１、２、又は６週間の貯蔵後にもＡＴＰを同程度に保っており、２及び６週間の時点でのＡＴＰレベルは、１週間の時点で測定されたＡＴＰレベルと比べてやや（それぞれ、１．４９倍及び１．４８倍に）増加していることが示された。このデータは、凍結乾燥、貯蔵、又は再水和過程によってもＡＴＰレベルが維持されたことを実証している。
加えて、再水和したＡＤＡＳがＧＦＰを誘導物質依存的に転写及び翻訳する能力について、実施例４Ｃに概説するプロトコルを用いて試験した。図７Ｇ及び図７Ｈは、１５時間にわたって持続した再水和したＭＡＣＨ１２４ ＡＤＡＳにおけるＧＦＰシグナルの誘導物質依存的増加を示す。誘導物質の非存在下では（非誘導）、ＧＦＰシグナルの増加はなかった。図７Ｇ及び図７Ｈのデータは、実施例４Ｃに記載されるとおり正規化している。
再水和したＡＤＡＳで観察される活性は、凍結乾燥過程によってもＡＤＡＳの完全性が維持されることを示している。
実施例１１．ＡＤＡＳの特性評価についての補足方法
本例は、ＡＤＡＳ及び親細胞の組成物の特性評価に用いられる様々な補足的分析方法について記載する。
Ａ．電子顕微鏡法
ＡＤＡＳは、実施例１２に記載されるとおり親細菌、細胞デブリ、及びエンドトキシンから精製する。鞭毛と分泌装置とを含むペリプラズム構造を可視化するため、分離後に先行方法と同じようにＡＤＡＳに浸透圧ショックを与える（Ｈ Ｃ Ｎｅｕ ａｎｄ Ｌ Ａ Ｈｅｐｐｅｌ．２４０：３６８５－３６９２，１９６５）。次に分離したペリプラズム構造をＷｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ，２０１５からのプロトコルに従い透過型電子顕微鏡（日本電子株式会社、東京）で可視化する。
Ｂ．蛍光及び光学顕微鏡法
蛍光装置付き正立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｚｅｉｓｓ、ＣＣＤカメラ、及び広域スペクトル光源）を使用してＡＤＡＳ及び親細菌を可視化する。試料は、６、１２、２４、又は９６ウェルフォーマットの組織培養マルチウェル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、トランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、又は寒天コートポリスチレンペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）においてライブイメージングする。加えて、試料は、更なる分析のため、これらの容器内又はカバーガラス上に固定することができる。
Ｃ．ＯＤ６００濃度測定
所与の培地容積中に存在するＡＤＡＳ又は親細菌の数を定量化するため、ＯＤ６００で光学濃度を測定し、以下の式を用いる：
ＡＤＡＳ数／ｍｌ＝ＯＤ６００×Ａ×Ｂ
式中、Ａは、親細胞と比較したＡＤＡＳの相対的なサイズであり、Ｂは、そのＬＰＳ含有量に対するＡＤＡＳのＯＤ６００に関する検量線係数である。これは、細菌細胞についての標準ＡＤ６００測定から導き出される。
Ｄ．ＡＤＡＳ及び親細菌のナノ粒子トラッキング解析
ナノ粒子トラッキング解析は、典型的には小胞の純度の測定に用いられ、ＡＤＡＳ純度の測定用に修正される。簡潔に言えば、ナノ粒子トラッキングは、レーザー及び高感度デジタルカメラと共に構成されたＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０システム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｌｔｄ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を使用して行われる。標準ソフトウェアを用いて映像を収集し、予想粒度を入力として使用して分析する。各試料を１０８粒子／ｍｌの範囲の既知の濃度に（分光光度定量化を用いて）希釈し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔのポンプシステムを使用して制御されたフロー下で投与及び記録する。カメラは最大限のフレームレート及び解像度で操作する。正しいサイズ範囲にある粒子の数を、サイズ範囲外の粒子（例えば親細胞）の総数に対する割合と共に定量化する。
Ｅ．動的光散乱法及びゼータ電位
動的光散乱法（ＤＬＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）を用いてＡＤＡＳ及び親細菌集団粒度分布を測定する。ＡＤＡＳ懸濁液に光を照射することにより、既発表のプロトコル（Ｊｏｒｇｅ Ｓｔｅｔｅｆｉｅｌｄ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｖ（２０１６）８：４０９－４２７）を用いて散乱光強度を溶液中の物体の拡散係数と関係付けることによって流体力学半径を測定する。これらの研究は、以前に同じような方式によりナノ粒子、細菌、タンパク質、及び核酸で実施されている。ＡＤＡＳサイズ測定には、無菌性を維持し、且つ交差試料汚染を回避するため、典型的には使い捨てキュベットが使用される。有機溶媒を必要とする適用については、洗浄剤（Ａｌｃｏｎｏｘ）、５％酢酸、ＤＩ水、及び７０％エタノールによる連続洗浄と、続く徹底した乾燥工程を含む注意深い洗浄プロトコルを伴い、再使用可能なガラスキュベットが使用される。
Ｆ．免疫蛍光染色：
実施例１２に記載する方法を用いて親細菌からＡＤＡＳを単離する。ＡＤＡＳを希釈し、清浄なカバーガラス上に載せて５００ｇでスピンし、ＰＢＳ溶液中４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定する。試料を洗浄し、製造者の指示に従い抗体の染色溶液中でインキュベートし、製造者の指示に従い退色防止封入剤でスライドにマウントし、乾燥させ、共焦点顕微鏡下でイメージングする。画像の処理にはＩｍａｇｅＪを使用する。
Ｇ．フローサイトメトリー：
製造者の指示に従いＮａｎｏＦＣＭ（ＮａｎｏＦＣＭ、Ｃｈｉｎａ）でフローサイトメトリーを用いて親細菌及びＡＤＡＳを分析する。蛍光ＡＤＡＳを使用して、ＮａｎｏＦＣＭを１色モード又は２色モード（４８８ｎｍ及び５５５ｎｍ波長での照射）のいずれかで使用することにより、プラスミド取込み、タンパク質発現、及び純度を含めたＡＤＡＳの様々な特性を確認する。例えば、ＤｉＯＣ６（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）などの蛍光親油性色素を製造者が記載するとおりＡＤＡＳ膜に取り込ませる。ＡＤＡＳを実施例１２に説明するとおり分取及び精製し、次に冷リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７）で洗浄し、再びペレット化し（４０，０００ｇ、５分、４℃）、（１Ｅ５、１Ｅ６、１Ｅ７）ＡＤＡＳ／ｍＬに希釈し、４８８ｎｍ励起及び５３５発光でＤｉＯＣ６蛍光強度を測定する。
Ｈ．ＰＣＲ
精製したＡＤＡＳを溶解し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを製造者の指図（Ｑｉａｇｅｎ）に従い使用してＤＮＡを精製する。オリゴヌクレオチドプライマー２３Ｓ－センス（５９ ＧＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＧＣＧ ＡＴＡ ＣＡＧ ３９）及び２３Ｓ－アンチセンス（５９ ＧＴＣ ＣＣＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＣＧ Ａ ３９）を使用して、Ｖｉｌａｌｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１によって記載されるとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの７つのコピーに存在する２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の７０ｂｐ断片を増幅する。ＴａｑＭａｎ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従い使用して増幅反応を行う。
Ｉ．ＲＮＡ ＳＥＱ
Ｇｉａｎｎｏｕｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ，２０１２によって記載されるとおり、ＲＮＡｓｅｑを用いて全トランスクリプトーム解析を行う。簡潔に言えば、ＡＤＡＳをＬＢブロス中で約０．５のＯＤ６００となるまで精製し、室温にて４，０００×ｇで１０分間遠心することにより回収する。ペレットを２５ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に再懸濁する。チューブをローテータ上で４℃で一晩撹拌し、４，０００×ｇで１０分間遠心し、エタノール／ドライアイス浴中に置いてペレットを急速凍結し、－８０℃で貯蔵する。
イオン全ＲＮＡ－ｓｅｑキットｖ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の指示に従い使用してＲＮＡ抽出を行う。ｍＲＮＡ－ＯＮＬＹ原核生物ｍＲＮＡ単離キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用した酵素反応を製造者の仕様に従い実施する。Ｏｖａｔｉｏｎ原核生物ＲＮＡ－Ｓｅｑシステム（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を以下のとおり使用する。インタクトなＲＮＡを上記に記載されるとおりＤＮアーゼ処理し、製造者のプロトコルに従いｃＤＮＡに合成する。
精製した産物をゲル上でサイズ選択する（約３００～４５０ｂｐ）。試料を２５μＬの最終容積中、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＥ１．０及びＰＥ２．０プライマー（各１μＭ）、１×のＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰＣＲ緩衝液Ｉ（１０×）、０．５ＵのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で濃縮する。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（０．８×反応容積）を用いて濃縮反応物を精製する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩ又はＨｉ－Ｓｅｑのいずれかの機器でライブラリをシーケンシングする。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの未処理リードをＰｉｃａｒｄパイプラインを用いて処理する。簡潔に言えば、プログラムＨＩＳＡＴ２を用いてリードをアラインメントし、参照ゲノムに割り当てる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列データをそれぞれのゲノム配列とアラインメントする。次に、ＨＩＳＡＴ２でアラインメントしたリードを分析し、ＧｅｎＢａｎｋによって提供されるゲノムアノテーションに従い個々の遺伝子に割り当てる。
Ｊ．ＤＮＡ ＳＥＱ
ｒｅｓＤＮＡＳＥＱ定量的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ ９６ディープウェル自動化プラットフォームを使用して製造者の指示に従い宿主細胞株残留ＤＮＡの抽出を自動化して、親株からの残留ＤＮＡを測定する。簡潔に言えば、２つの洗浄プレート及び１つの溶出プレートを調製し、試料をロードする。次に試料を溶解させて、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ ＦｌｅｘでＰｒｅｐＳＥＱ＿ｒｅｓＤＮＡ＿ｖ１スクリプトを用いて処理する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株を使用して検量線を生成し、マスターミックスを使用して試料を増幅し、結果を読み取り、ＳＤＳソフトウェアを使用して分析する。
Ｋ．ゲル
ＡＤＡＳ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株からのＤＮＡを標準プロトコルを用いて抽出し、サイズ分析のため製造者の指示に従いアガロースゲルにロードする。ゲノムＤＮＡは約４．５Ｍｂであり、一方、プラスミドＤＮＡは約３～５ｋｂである。
Ｉ．ＥＬＩＳＡ
親細胞のＥＬＩＳＡ検出には、ＦｌｕｏｒｏＳＥＬＥＣＴ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用する。この検出システムは、（ペプチド加水分解中に）特異的酵素によって加水分解されると蛍光シグナルを生じる蛍光発生基質を利用する。簡潔に言えば、製造者の指示に従い試料を調製し、フルオリメーターを使用して読み取る。キャリブレーションの後、Ｐ１＞３０，０００と測定された場合、試料は親株細胞に関して陽性である。Ｐ１＜３０，０００の場合、Ｐ２を測定する。数値（Ｐ２－Ｐ１）＜（３％×Ｐ１）の場合、試料は陰性である。
実施例１２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの作製についての補足方法
本例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＡＤＡＳの作製及び特性評価についての補足方法を記載する。
Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの作製
ＡＤＡＳを作出するため、Ｔ７プロモーター下でｆｔｓＺタンパク質を過剰発現するプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にトランスフェクトする。或いは、組み込みプラスミドによる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスフェクションによってＭＩＮ遺伝子が破壊された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異体を作出する。プラスミドはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒによって商業的に合成される。トランスフェクションは、標準的な細菌トランスフェクション法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）を用いて行う。手短に言えば、コンピテント細胞を室温の寒天プレートに播く。バイアル内にあるこのコンピテント細胞に０．５～２ｎｇ／ｍｌのＤＮＡを加え、２０～３０分間インキュベートする。次にチューブを４２℃の水浴中に３０～６０秒間置くことにより各チューブに熱ショックを与え、細胞表面に一過性の細孔を作り出す。次に選択的抗生物質を予めロードした寒天ゲルに細胞を播き、一晩成長させると、それによりプラスミドをトランスフェクトした細菌のみが生き残る。単一コロニーをピッキングし、５０～１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地において１２０ｒｐｍで継続的に振盪しながら３７℃で培養する。時間が経つと、選択されたコロニーが増殖し、ＡＤＡＳを産生し続ける。
実施例１３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＡＳの精製及び効率測定についての補足方法
本例は、粗製調製物から大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを精製する補足方法並びに混入生菌量について特性評価する方法を記載する。
Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの精製
高純度産生用の親細菌からのＡＤＡＳの分離には、洗浄、遠心、滅菌ろ過、及び抗生物質処理の組み合わせを用いる。既発表の方法（Ｒｅｅｖｅ，Ｊ １９７９，Ｊｉｖｒａｊａｎｉ ２０１３，Ｒａｍｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ ２０１７）から採用したプロトコルに幾つかの変更を加えたものを利用する。簡潔に言えば、溶液を精製するため、親細菌及びＡＤＡＳ溶液の混合物を収集し、遠心を４℃で（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、速度を１０００ｇから４０００ｇまで、懸濁液から親細胞の増加画分を除去する段階毎に１０００ｇの増分ずつ漸増させて１０分間行う。親細菌が取り除かれたことを更に確実にするため、１００μｇ／ｍＬの強力な抗生物質（セフトリアキソン）を加え、試料を最終的な上清溶液と共に４℃で一晩インキュベートする。翌日、溶液を４℃において４００ｇで遠心して任意の細胞破片をペレット化し、ＡＤＡＳに富む上清を収集し、次に４℃において４０００ｇで５分間遠心する。最後に、０．２μｍメンブランフィルタを使用して溶液を滅菌ろ過し、次にＡＤＡＳをＣａ２＋及びＭｇ２＋含有滅菌ＰＢＳに所望の濃度で再懸濁する。
Ｂ．ＡＤＡＳ精製効率を測定する
ＡＤＡＳ作製段階毎に、上清又は沈降物を収集し、寒天プレートに置き、３７℃でインキュベートして、溶液から親細胞が除去されていることを視覚的に確認する。並行して、血球計算器を使用することにより、光学顕微鏡法を用いてＡＤＡＳ及び親細菌の数をカウントする。加えて、ＡＤＡＳが残留ＤＮＡを含有しないことを確実にするため、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ３７６０５）を使用した蛍光ベースのアッセイを実施し、この試薬は、ＡＤＡＳが残留ＤＮＡに関して陽性の場合に紫外蛍光になるものである。製造者によって指図されるとおりこの試薬を加え（２滴／試料１ｍＬ）、１５～３０分間インキュベートし、ＰＢＳ溶液で洗浄した後、イメージングすることにより過剰量の試薬を除去する。４０５ｎｍ波長光に曝露すると、色素がいずれかの残留ＤＮＡにカップリングしている場合には、それが青色スペクトルで励起する。対比染色として、赤色蛍光ＦＭ ４－６４色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＡＤＡＳ及び親細菌の外葉を染色するインターカレーション親油性膜ベースの色素として使用する。励起及び発光スペクトルは核染色と別にして、ユニークなシグナルを収集し得ることを確実にする。試料の純度は、残留集団中のＡＤＡＳの割合＝１００×（赤色数－青色の数）／（赤色数）として計算する。加えて、動的光散乱（ＤＬＳ）法（Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、約１μｍ（親細胞）及び約５００ｎｍ（ＡＤＡＳ）に関連するピークの大きさを比較し、且つ漸増純度の試料で親細胞ピークがゼロに近付くことを示すことにより、純度を評価する。
或いは、残留ＡＤＡＳ ＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ１１４９６）を使用して、供給業者が樹立したプロトコルを用いて決定する。ＡＤＡＳをＰＢＳに収集し、溶解緩衝液を使用して溶解させる。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬を混合し、試料において蛍光測定を用いて反応を観察する。
或いは、ＡＤＡＳを濃縮し、好適な培養培地に２．５×１０１１ＡＤＡＳ／ｍＬとなるように塗り広げ、好適な成長寒天を含む６０ｍｍプレートに４ｍＬを播き、好適な条件で培養する。２日後、１０１２個のＡＤＡＳ当たりの生菌数を決定するため、コロニーをカウントする。
或いは、実施例１１のプロトコルに従い、ナノ粒子トラッキングＺｅｔａｓｉｚｅｒ、及び他の粒度分布トラッキング方法を用いて粒度分布を決定し、生菌を指示する大型粒子のピークの存在を確かめる。或いは、ｑＮａｎｏ Ｇｏｌｄ（Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．）で試料を試験し、これは、調整可能な抵抗性パルスセンシングを用いて粒度、濃度、及びそれがナノポアを通過することに伴う変化を測定するものである。
実施例１４．大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの調製
非対称細胞分裂及び親細菌細胞株からのＡＤＡＳの産生につながる隔壁形成遺伝子の破壊によって実施例１２のＡＤＡＳを調製する。本例は、親細菌のゲノムを直接選択的に分解するエキソヌクレアーゼを使用したＡＤＡＳの作製を実証し、これは実施例１２に記載するＡＤＡＳ調製と比べて幾つかの利点、例えば、細胞質組成の制御の向上、カーゴのコピー数の増加、及びＡＴＰの増加をもたらすものである。
Ａ．大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの作製
２つのプラスミド、（１）アラビノースプロモーターを含有してｓｂｃＢ又はｓｂｃＣＤ遺伝子を過剰発現するプラスミド（この遺伝子は、多くのコンホメーションのＤＮＡを分解し、且つ天然に発現するＲｅｃＢＣＤによるゲノムの消化を可能にするエキソヌクレアーゼをコードする）、及び（２）ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下にｒｅｃＡ遺伝子をノックアウトするカセットを含有するプラスミドを構築する。これらのプラスミドは商業的に合成され、（１）、（２）又は両方とも、実施例１２にあるものなどの標準プロトコルに従い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞にトランスフェクトされる。
Ｂ．大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの精製
細菌培養物が６００Ｏ．Ｄに達した後、０．１％アラビノース及びグルコース不含培地又はＩＰＴＧ又は両方を使用してＥｘｏ１遺伝子を活性化させる。１５分、１時間、２時間、及び６時間経った後、細胞を収集し、４℃で５分間遠心し、ＰＢＳに再懸濁する。実施例１５に記載するとおり、実施例２又は１２にある尺度を用いて決定される溶液純度を増加させるため、栄養要求性ＡＤＡＳが使用される。
実施例１５．栄養要求性ＡＤＡＳ産生細菌株の作製による純度向上についての補足方法
本例は、ＡＤＡＳ調製物に混入する生存細菌数を減少させる機構としての栄養要求性の親株からのＡＤＡＳ合成について記載する。
Ａ．栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌の調製
アルギニン合成ノックアウト（ａｒｇＡ）株ＪＷ２７８６－１など、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の栄養要求株を使用して親細菌混入物数が低下したＡＤＡＳを作出する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを実施例１２の方法により、但し培地にはアルギニンを加えて作製する。ＡＤＡＳを実施例１３にある方法を用いて精製し、次にアルギニン不含培地に貯蔵する。
Ｂ．栄養要求株からの大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの調製
アルギニン合成ノックアウト（ａｒｇＡ）株ＪＷ２７８６－１など、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の栄養要求株を使用して栄養要求性親株からの大型ＡＤＡＳを作出する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）大型ＡＤＡＳを実施例１４の方法により、但しアルギニン含有培地で培養して作製する。次にＡＤＡＳを実施例１４にある方法を用いて精製する。
Ｃ．栄養要求性の大型及び普通サイズＡＤＡＳの純度の増加を実証する
上記の方法を用いて大型及び普通サイズＡＤＡＳを調製する。非栄養要求性親株からのＡＤＡＳ及び非栄養要求性且つ大型のＡＤＡＳもまた、実施例１２、実施例１３及び実施例１４の方法を用いて調製する。実施例１５にある方法を用いてＡＤＡＳ純度を測定する。
実施例１６．ＡＤＡＳ活性の測定についての補足方法
本例は、ＡＤＡＳの活性の測定の補足方法について記載する。
Ａ．ＡＴＰ測定
ＡＤＡＳの試料を２つに分ける。試料の半分のＡＴＰをＢａｃＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造者の指示に従い測定する。残り半分のサイズ及び濃度をナノ粒子トラッキング又はＮａｎｏＦＣＭのいずれかで、実施例１１からのプロトコルを用いて測定する。適切な式を用いてＡＤＡＳの膜総表面積を計算し、ＢａｃＴｉｔｅｒ ＧｌｏアッセイからのＡＴＰ量をこの面積で除すことにより、ＡＤＡＳ表面積単位当たりのＡＴＰを求める。
Ｂ．ＡＴＰ液滴測定
ＡＤＡＳを哺乳類に関連性のあるものについて３７℃及び関連性のないものについて３０℃でインキュベートし、調製時及び２４時間後に取った測定間のＡＴＰ濃度の比をパートａ）の方法を用いて測定する。
Ｃ．寿命指数測定
種に適切なプロモーターを含む機能性ＧＦＰプラスミドと共にＡＤＡＳを合成する。ＡＤＡＳ数、１ＡＤＡＳ当たりの平均プラスミド数、及び溶液容積に対するＧＦＰ濃度を３０分及び２４時間の時点でプレートリーダーによって測定する。寿命指数を、３０分時点に対する２４時間時点のＧＦＰ産生速度の比として計算する。
Ｄ．ＡＴＰ消費量測定
親細菌及びＡＤＡＳの活性を評価するため、ＡＴＰ産生速度を測定する。ＡＴＰ産生速度は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造者の指示に従い使用して測定する。
或いは、ＡＤＡＳの試料を半分に分ける。試料の半分をジシクロヘキシルカルボジイミドなどのＡＴＰ合成阻害薬で処理する。次に両方の半分をＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造者の指示に従いアッセイする。これらの２つの試料の差が、ＡＴＰ生成速度と考えられる。
実施例１７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＡＤＡＳの貯蔵についての補足方法
本例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をモデルＡＤＡＳとして使用したＡＤＡＳの貯蔵及び製剤化の補足方法について記載する。ｐＢＡＤ ＧＦＰプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを実施例１２にある方法により合成し、実施例１３にある方法により精製する。次にそれらのＡＤＡＳを様々な条件で貯蔵して、その再構成及び生存能力を実証する。
Ａ．ＡＤＡＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の縦断的貯蔵
ＡＤＡＳを４℃で等張性緩衝液中に貯蔵して構造的完全性及び化学的活性を維持する。ＡＤＡＳは使用直前に３７℃に再加温する。
Ｂ．低温でのＡＤＡＳの縦断的貯蔵
ＡＤＡＳを４℃で等張性緩衝液中に０、３０、６０、９０、又は１８０日間貯蔵する。
Ｃ．ＡＤＡＳの凍結乾燥及び再構成
ＡＤＡＳを遠心し、以下の溶液：成長培地中２０％ｗ／ｖｏｌ脱脂乳、水中２０％ｗ／ｖｏｌ脱脂乳、水と成長培地との５０：５０混合物中１２％ｗ／ｖｏｌスクロース、試薬１８：トリプチケースソイブロス、１．５ｇ；スクロース、１０ｇ；ウシ血清アルブミン画分Ｖ、５ｇ；蒸留水、１００ｍｌ、及び試薬２０：スクロース、２０ｇ；ウシ血清アルブミン画分Ｖ、１０ｇ；蒸留水、１００ｍｌに再懸濁する。全ての溶液を０．２μｍフィルタでろ過滅菌する。次にＡＤＡＳを液体窒素で急速凍結し、凍結乾燥する。この粉末を０℃、－２０℃、及び２５℃で０、３０、６０、９０、１８０日間貯蔵する。試験期間の終了時に粉末を水又はＬＢブロスで再構成する。
再構成後のＡＤＡＳ活性を実施例１６の評価方法を用いて評価する。
Ｄ．ＡＤＡＳの凍結及び再構成
ＡＤＡＳを遠心し、１０％、２０％、及び３０％ｖｏｌ／ｖｏｌグリセロール及び成長培地に再懸濁する。ＡＤＡＳを液体窒素で急速凍結するか、或いはＮａｌｇｅｎｅ Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙでゆっくりと凍結する。このＡＤＡＳを－２０℃及び－８０℃で０、３０、６０、９０、１８０日間貯蔵する。試験期間の終了時に粉末を水又はＬＢブロスで再構成する。
貯蔵後のＡＤＡＳ活性を実施例１６の評価方法を用いて評価する。
Ｅ．ＡＤＡＳの噴霧乾燥及び再構成
ＡＤＡＳを遠心し、成長培地中２０％ｗ／ｖｏｌ脱脂乳、水中２０％ｗ／ｖｏｌ脱脂乳、又は水と成長培地との５０：５０混合物中１２％ｗ／ｖｏｌスクロースに再懸濁する。次にＡＤＡＳを実験室規模のユニットで噴霧乾燥し、収集する。この粉末を０℃、－２０℃、及び２５℃で０、３０、６０、９０、１８０日間貯蔵する。試験期間の終了時に粉末を水又はＬＢブロスで再構成する。
噴霧乾燥後のＡＤＡＳ活性を実施例１６の評価方法を用いて評価する。
実施例１８．大型ＡＤＡＳの親細菌との類似度の判定
本例は、普通サイズのＡＤＡＳと比べて親細菌との類似性がより高い大型ＡＤＡＳについて記載する。
Ａ．大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳと他のＡＤＡＳとの比較
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを実施例１２にある方法により合成し、実施例１３にある方法により精製する。ＡＤＡＳ、大型ＡＤＡＳ、及び親細菌の試料をウェルプレートに播き、最初に播いてから３０分以内にアッセイを実施する。ＲＮＡｓｅｑ（実施例１４に記載する）を用いて細胞質組成を特性評価することにより、種々の試料中に存在する種々のＲＮＡ転写物を特性評価する。既存のプロトコル（Ａｎｉｎｄｙａｊａｔｉ ｅｔ ａｌ．「定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるプラスミドコピー数の決定（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」 Ｓｃｉｅｎｔｉａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｖｏｌ．８４，１ ８９－１０１．１４ Ｆｅｂ．２０１６）に基づく方法を用いて種々の試料のコピー数をｑＰＣＲを用いて評価することにより、既知のコピー数のプラスミド標準のシグナルに対する単一のプラスミドからのシグナルを定量化する。加えて、実施例１１に記載するＡＴＰ活性アッセイを用いて３つの条件の長寿命性を比較する。
ＡＤＡＳ、大型ＡＤＡＳ、及び親細菌の試料は全て、実施例１２～１５に既に記載した方法を用いて調製及び精製する。全トランスクリプトーム解析を実施例１２に記載するとおりのＲＮＡｓｅｑを用いて実施し、転写規模に違いが認められる。
実施例１９．栄養要求性ＡＤＡＳの純度がより高いことの実証についての補足方法
本例は、栄養要求性親から作成されたＡＤＡＳが非栄養要求性親から作成されたものと比べて単離後の純度が高いことについて記載する。
Ａ．栄養要求性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親細菌の調製
アルギニン合成ノックアウト（ａｒｇＡ）株ＪＷ２７８６－１など、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の栄養要求株を使用して、親細菌混入物が減少したＡＤＡＳを作出する。実施例１２の方法により、但し培地にアルギニンを加えて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを作製する。実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳを精製し、次にアルギニン不含培地に貯蔵する。
Ｂ．栄養要求性大型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの調製
栄養要求性大型ＡＤＡＳを作成するため、アルギニン合成ノックアウト（ａｒｇＡ）株ＪＷ２７８６－１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の栄養要求株を使用する。ａｒｇＡタンパク質の発現によってｓｂｃＢを含むＡＤＡＳのみが培地での生存を許容されることによりｓｂｃＢプラスミドが増大するよう変更を加えた実施例１４の方法により、大型ＡＤＡＳを作製する。実施例１４にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｃ．栄養要求性の大型及び普通サイズのＡＤＡＳの純度の増加を実証する
上記の方法を用いて栄養要求性の大型及び普通サイズのＡＤＡＳを調製する。非栄養要求性ＡＤＡＳ及び大型ＡＤＡＳもまた、実施例１２、実施例１３及び実施例１４にある方法を用いて調製する。実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳ純度を測定する。
実施例２０．ＡＴＰ合成酵素の発現を有するＡＤＡＳが高活性かどうかの決定についての補足方法
ＡＴＰ合成酵素の発現及びアセンブリは、あらゆる生物における厳密に統制された過程である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＡＴＰ合成酵素を含有するプラスミドでは、過剰発現が細胞にとって致死的であり得るため転写に抵抗する。本例は、ＡＴＰ合成酵素の過剰発現を含むＡＤＡＳを合成する２つの戦略を記載する。
Ａ．ａｔｐＩの過剰発現を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの生成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株を通常の培養条件下で成長させて、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して全ＲＮＡを精製し、２ＵのＲＮアーゼフリーＤＮアーゼで１時間処理する。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔ Ｒｅｓ，２０１４によって記載されるとおり、ＡＴＰ合成酵素によるエネルギー生成に関わる遺伝子であるａｔｐＩに関して以下のプライマー：５’－ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴ－３’、ａｔｐＩ－Ｆ；５’－ＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＣ－３’、ａｔｐＩ－Ｒを使用してＲＴ－ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ条件には、９６℃で５分の初期変性、続いて９６℃で１分、５５℃で１分、及び７２℃で１分の１５サイクル、７２℃で７分の最終伸長が含まれる。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で分離させる。予想されるバンドの強度をＢｉｏ－Ｒａｄソフトウェアによって分析及び比較する。エネルギー代謝遺伝子を過剰発現させるには、発現ベクターｐＥＴ１５ｂを用いる。ａｔｐＩ遺伝子のＰＣＲ産物をプラスミドｐＥＴ１５ｂに導入して発現ベクター、ｐＡｔｐＩを得る。この発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に電気穿孔し、ＯＤ５５０ ０．４～０．５でＩＰＴＧを添加することにより誘導する。
この株から実施例１２に記載するとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを生成し、実施例１３に記載するとおり精製する。
Ｂ．ＡＴＰ合成酵素を含有するプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの生成
Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２０１３に記載されるとおりのＡＴＰ合成酵素カセットを含むプラスミドｐＢＡＤ３３．ａｔｐが商業的に合成され、これを当該論文に記載される方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフェクトする。次に、培地からグルコースを除去し、０．０３％ｗｔ／ｖｏｌアラビノースを添加した実施例１２に従い、これらの細胞からＡＤＡＳを作製する。次に実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ及びＡＴＰ合成酵素を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの活性比較
上記の方法で作られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ及びＡＴＰ合成酵素を加えていない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを合成し、実施例１５にある方法を用いて特性評価する。
実施例２１．ＡＴＰ合成酵素ε成分が抑制されたＡＤＡＳの活性増加に関するアッセイ
細菌性ＦｏＦ１ ＡＴＰ合成酵素のεサブユニット（ａｔｐＣ）は、ＡＴＰ合成／加水分解活性の固有の阻害因子である。この調節ドメインが欠損した突然変異体は、幅広い成長条件及びストレッサー下において、成長速度、モル増殖収率、膜電位、又は細胞内ＡＴＰ濃度の点で野生型細胞と比較して有意差を呈しなかった（Ｋｌｉｏｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８４）。この例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、εサブユニットの誘導性の切り出しを伴い合成されるか、又はノックアウト株から作られる。
Ａ．ＡＴＰ合成酵素εサブユニットの誘導性の切り出しを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の生成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＷ３７０９又はａｔｐＣノックアウトを有する他の株を入手する。テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）を用いてテトラサイクリン（ｔｅｔ）の非存在下でａｔｐＣを誘導的に発現するプラスミドを商業的サービスによって構築する。このコンストラクトをａｔｐＣノックアウト株に電気穿孔することによりｔｅｔの非存在下でのａｔｐＣの発現を可能にし、ｔｅｔを含まない培地で成長させる。これらの細胞から実施例１２に記載するプロトコルを用いてＡＤＡＳを合成し、実施例１３にある方法で精製する。
上記の方法からｔｅｔの存在下及び非存在下において作成された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ、株ＪＷ３７０９から作成された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ、及び普通サイズの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを実施例１５にある方法を用いて特性評価する。
実施例２２．修飾された解糖経路を有する高活性ＡＤＡＳ
解糖経路は、ＡＴＰが合成される手順の一つであるため、鍵酵素を上方制御することにより、細胞におけるより多くのＡＴＰにつながり得る。本例は、より多くのＡＴＰを産生することが示されているｐｆｋＡ及びｔｐｉを発現するプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの高活性ＡＤＡＳの作出について記載する（Ｓｈｉｍｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ，Ａｇ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ，１９８１を参照のこと）。
Ａ．ｐｆｋＡ及びｔｐｉを発現するＡＤＡＳの合成
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ｐＬＣ１６－４を成長させ、市販のプラスミド精製キットを使用してプラスミドｐＬＣ１６－４を抽出する。エレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００細胞を調製し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆプロトコル番号４３０８ ９１５．５１１にあるプロトコルに従いプラスミドｐＬＣ１６－４を電気穿孔する。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の新鮮な一晩培養物から細胞を０．５～０．６のＯＤ６００の密度になるまでＬＢ培地において３７℃で成長させる。次に細胞を氷上に置き、遠心し、冷蔵し、０℃の水に再懸濁し、冷水で洗浄し、２×１０１１細胞／ｍＬの濃度に希釈する。次に４０μＬの細胞を水中の１０ｐｇのプラスミドと混合し、電気穿孔する。次に細胞を直ちにＳＯＣ培地において３７℃で３０～６０分間成長させて、播き、次に標準的な培養条件で成長させる。次にｐＬＣ１６－４プラスミドを含む及び含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００から実施例１２にあるプロトコルにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを調製し、実施例１３により精製する。
Ｂ．ｐｆｋＡ及びｔｐｉを過剰発現するＡＤＡＳと普通サイズのＡＤＡＳとの比較
ｐＬＣ１６－４プラスミドを含む及び含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ６００の活性を実施例１５にあるプロトコルを用いて測定する。
実施例２３．特殊培養条件で合成したＡＤＡＳの活性増加に関するアッセイ
細胞のインビトロでの成長、成熟、生存は、培養条件によって劇的に変化し得る（Ｗａｎｇ Ｄ，Ｙｕ Ｘ，Ｇｏｎｇｙｕａｎ Ｗ．「酸ストレス下でのアウレオバシジウム・プルランスのプルラン産生及び生理学的特性評価（Ｐｕｌｌｕｌａｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ ｕｎｄｅｒ ａｃｉｄ ｓｔｒｅｓｓ）」．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；９７：８０６９－７７）。本例は、細胞内ＡＴＰを増加させる化合物及び条件のスクリーニングについて記載する。網羅的ではないが、最初はｐＨ、酸素濃度、及び印加電圧に重点を置いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用する。これは、細胞ＡＴＰレベルを調整する新規培地添加剤を同定するための補足方法に相当する。
実施例１２に記載する方法を用いてＡＤＡＳを合成し、単離する。単離後、様々な培地条件下でＡＤＡＳを培養し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＡＴＰ ＡＳＳＡＹキット）を製造者の指示に従い使用してＡＴＰ産生速度を測定する。０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍ、１ｍＭ、又は１０ｍＭグルコースをベースラインとして使用する。
Ａ．低ｐＨでのＡＤＡＳの合成
クエン酸及びＮａＯＨを滴下して加えることを用いてＡＤＡＳ成長培地のｐＨを調整する。ｐＨ４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５の培地を使用し、直ちに、及び１、４、６、１０時間後にＳｅａｈｏｒｓｅ ＡＴＰアッセイを用いて細胞内ＡＴＰを測定する。
本発明者らの結果は、４．５、５、５．５、６、６．５など、低いｐＨ条件でＡＴＰ供給量の上昇を示す。
Ｂ．低酸素環境でのＡＤＡＳの合成
低酸素培地条件を模擬するため、培地を様々な混合気体（１、５、７．５、１０、１５、２０．９５％Ｏ２）中で２４時間インキュベートした後、ＡＤＡＳに曝露する。次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを前条件付けした培地で培養し、直ちに、及び２時間後にＳｅａｈｏｒｓｅ ＡＴＰアッセイを用いて細胞内のＡＴＰを測定する。
本発明者らの結果は、酸素濃度が１、５、７．５、１０、１５、２０．９５％の培地が２時間後の細胞内ＡＴＰの増加につながることを示している。
Ｃ．印加交流電界を伴うＡＤＡＳの合成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物用に開発された規定のプロトコルにより（Ｚｒｉｍｅｃ ｅｔ ａｌ，ＣＥＬＬ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＬＥＴＴ．Ｖｏｌ．７．Ｎｏ．１．２００２）、刺激セル内において標準ＬＢ培地で成長するＡＤＡＳに１～１００Ｖ／ｃｍの強度振幅の外部印加交流電界を印加する。端的には、２つの平行な白金電極（０．７５ｃｍ２作用面積、２ｍｍ間隔）の間に電圧を確立し、周波数発生器（Ｍｅｔｅｘ ＭＳ－９１５０）を使用して電界を印加する。試料を低温に保ち（刺激中は５℃未満）、直流成分なし及び５０Ｈｚ～１０００ｋＨｚの範囲の周波数で電極電圧振幅を０Ｖから１００Ｖまで変化させる。
この結果は、ＢａｃＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者が規定するとおり用いて細胞内ＡＴＰにより測定したとき、最も高い電圧の試料でＡＤＡＳに対するデノボＡＴＰ産生が増加することを示している。
実施例２４．鞭毛及び他の非必須特徴を除去したＡＤＡＳの活性増加に関するアッセイ
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ中の非必須の構造的特徴の存在を最小限にするため、成長、分裂及び代謝に必須の遺伝子を含む単純化したゲノムを有する親株を合成する。諸研究から、かかる「必須」ゲノムで合成された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、生存及び分裂するのみならず、幾つかの有用な特性をもたらしさえし得ることが示されている。Ｐｏｓｆａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６は、これらの株が、他の非修飾株では不安定な組換え遺伝子及びプラスミドの高い電気穿孔効率及び正確な増殖を示すことを示した。従って、これらの修飾株は、不必要な構造を欠いている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを生じるのみならず、非修飾親株からのものと比較して亢進した活性もまた有する。
Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９８などに記載されるとおり、ゲノムベースの手法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの必須遺伝子を同定する。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムを他の細菌のゲノムと比較することにより、成長、成熟及び分裂に関与する鍵遺伝子を同定することが可能になる。系統的遺伝子破壊により、生存及び分裂に関与する鍵遺伝子を確認する。これに加えて、最小限のゲノムを安定化させるためインシリコ方法を用いてゲノム構成を分析する。ゲノムの大きい領域の欠失は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びファージ媒介性欠失を用いて行う。スカーフリーの欠失を作成するため、Ｔｅａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１５を応用したプロトコルを用いる。加えて、成長培地がかかる遺伝子欠失の効果を隠すことも又は亢進させることもあり、効果を十分に試験するためには、これらの株を種々の培地で成長させることが必要になり得る（Ｉｓｈ－Ａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１５）。特定の機能（例えば、輸送体、構造）に必要な様々な数の非必須遺伝子を含む株のライブラリを生成する。
Ａ．鞭毛欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの生成
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＣＧＳＣ ６３００）を入手し、これはｆｌｈＤＣプロモーターのＩＳ１エレメントを欠く野生型株である。こうした突然変異体は非運動性であり、鞭毛生合成の主要調節因子であるＦｌｈＤ４Ｃ２をコードするｆｌｈＤＣオペロンの調節領域内に位置するＩＳ１エレメントの直ちに下流から始まる様々な長さの欠失を有する。これらの細胞から実施例１２に記載するプロトコルを用いてＡＤＡＳを合成し、実施例１３にある方法で精製する。
Ｂ．線毛及びＴＸＳＳ欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の生成
Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｅａｓｙ大腸菌遺伝子欠失キット（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用して、線毛及びＴＸＳＳタンパク質をコードする遺伝子の破壊を有する複数の親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を生成する。このキットはＲｅｄ／ＥＴ組換えを用いてＤＮＡ分子を標的化し、ＤＮＡ分子は、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、又はＲｅｄα／Ｒｅｄβのいずれかのファージ由来タンパク質対を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において相同組換えにより正確に改変される。ＲｅｃＥ及びＲｅｄαは５’－３’エキソヌクレアーゼであり、ＲｅｃＴ及びＲｅｄβはＤＮＡアニーリングタンパク質である。簡潔に言えば、目的の遺伝子を標的化するＰＣＲ産物をｐＲｅｄＥＴ発現プラスミドに挿入し、修飾しようとする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を製造者の指示に従い形質転換する。Ｌ－アラビノースの添加及び温度シフトによりＲｅｄ／ＥＴ発現を誘導する。Ｒｅｄ／ＥＴ媒介性組換えでは、リピートカセットの挿入によって標的遺伝子座が破壊され、ＰＣＲを用いて結果を確かめる。これらの細胞から実施例１２に記載するプロトコルを用いてＡＤＡＳを合成し、実施例１３にある方法で精製する。
Ｃ．鞭毛、線毛、及びＴＸＳＳを有する及び有しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの比較
上記の親株からＡＤＡＳを生成し、実施例１５にある方法を用いて活性を測定する。
実施例２５．光合成能を有するＡＤＡＳの活性増加に関するアッセイ
本例は、様々なロドプシンをモデルタンパク質とした、光エネルギーを回収することができるタンパク質を発現するプラスミドを加えることによる、光をＰＭＦ又はＡＴＰに変換する能力を有する高活性ＡＤＡＳの合成について記載する。
Ａ．プロテオロドプシン発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの合成
Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００７によって記載されるプロトコルを用いて、プロテオロドプシン（ＰＲ）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を作出する。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中のＳＡＲ８６ γ－プロテオバクテリアＰＲ変異体を含有するプラスミドをＴ７プロモーター下で発現させる。細胞をＴブロスで成長させて、１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシドでＰＲ発現を誘導する。ＰＲ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞及び非ＰＲ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から実施例１２にある方法を用いてＡＤＡＳを合成し、実施例１３にある方法により精製し、ここで一部のＡＤＡＳは７０μｍｏｌ光子／（ｍ２ｓ）の光の照射下で精製し、一部は暗所下で精製する。
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１２にあるプロトコルの応用に従い、ＰＲ及びレチナールに必要な遺伝子を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を作出する。簡潔に言えば、この論文にあるｐＡｃｙｃ－ＲＤＳプラスミドを商業的に合成し、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に製造者の指示（ＮＥＢ、プロトコルＣ２５２７）に従いトランスフェクトする。簡潔に言えば、細胞を氷上でゆっくりと解凍し、細胞のチューブに１ｐｇ～１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを加え、細胞を指先で４～５回はじき、氷上に３０分間静置し、４２℃で１０秒間熱ショックを与え、氷上に５分間置き、この混合物にＳＯＣを加え、細胞を３７℃で６０分間培養する。次に細胞を選択用のクロラムフェニコールプレートに置き、クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で成長させる。ＰＲ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞及び非ＰＲ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から実施例１２にある方法を用いてＡＤＡＳを合成し、実施例１３にある方法により精製し、ここで一部のＡＤＡＳは７０μｍｏｌ光子／（ｍ２ｓ）の光の照射下で精製し、一部は暗所下で精製する。
Ｂ．プロテオロドプシン含有ＡＤＡＳと非プロテオロドプシン含有ＡＤＡＳとの比較
ＰＲを含む及び含まない且つ暗所下又は光照射下で培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の活性を実施例１５にあるプロトコルを用いて測定する。
Ｃ．プロテオロドプシン含有ＡＤＡＳとレチナール及びプロテオロドプシン含有ＡＤＡＳとの比較
レチナールを含む又は含まない且つ暗所下又は光照射下で培養したＰＲ含有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の活性を実施例１５にあるプロトコルを用いて測定する。
実施例２６．安定した核酸及びタンパク質ペイロードを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの作出についての補足方法
核酸は細胞質でエンドヌクレアーゼによって容易に分解され得るため、ＡＤＡＳ内で安定している細胞内ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びＲＮＡアプタマー）は、新規ＲＮＡ送達技術の創出に向けた重要な段階である。加えて、宿主細胞に侵入すると、次には、細胞性ｔＲＮＡの３’末端を定義する働きをする細胞性ｔＲＮアーゼＺによる切断を受けて、ｔＲＮＡ－ＲＮＡ足場が５’ｔＲＮＡと３’プレｍｉＲＮＡとに正確に分離する。最近になって開発されたプロトコル（ＲＮＡ．２０１５ Ｓｅｐ；２１（９）：１６８３－１６８９）を利用すると、ｔＲＮアーゼＺを使用してガイドＲＮＡ－ｔＲＮＡ融合体を切断することができる。本例は、説明のための例として、ｔＲＮＡに由来する非コードＲＮＡの足場を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させることについて記載するが、しかしながら、同様の足場ベースの手法を用いて他の核酸、タンパク質、及び分子もまたＡＤＡＳ内で安定化させることができる。
Ａ．ｔＲＮＡ安定化組換えＲＮＡペイロードを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ
簡潔に言えば、実施例１２及び１３によって記載される方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを作製し、精製する。以前に開発されたプロトコルに基づき、２つのタイプのｔＲＮＡ：ヒトｔＲＮＡＬｙｓ３及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡＭｅｔを使用する（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｏｎｃｈｏｎ ２００７）。両方とも十分に特徴付けられており、組換え発現が行われている。原則的に、ステムモチーフを終端とする構造化されたＲＮＡであれば、任意のものを含めることができる。これらには、アプタマー、ｌｎｃＲＮＡ、及びリボザイムが含まれる。端的には、ｔＲＮＡインサートが両側に隣接する目的のＲＮＡ配列を含有するプラスミドを作出する。この例では、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡが使用される。
ｔＲＮＡ－ｍＲＮＡコンストラクトを含有するＡＤＡＳを合成した後、ＲＮＡ及びタンパク質の半減期を測定する。簡潔に言えば、細胞をウェルプレートに移し、種々の時点で溶解緩衝液を用いて溶解させて、１分、１０分、５０分、１００分、２００分、５００分、１０００分、２０００分、及び最長１００００００分を含む様々な時点でＲＮＡ ＳＥＱを実施し、相対的存在量を用いて安定性を評価する。更に、同じ時点で規定数の細胞を溶解させ、プレートリーダーで蛍光を測定することにより、ＧＦＰ発現を観察する。
実施例２７．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳからリボヌクレアーゼを除去することによるカーゴ安定性の増加
ＲＮアーゼＥはＲＮＡ分解の汎用的なイニシエーターであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における染色体欠失は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のコロニー形成能力（ＣＦＡ）を破綻させる。本例は、ＲＮアーゼＥを条件的プロモーターの制御下に置くことにより、タンパク質及びＲＮＡ安定性の増強を実現し得ることを示す。
Ａ．ＲＮアーゼＥ欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の合成
プラスミドによって担持されるＥｃｏ－ｒｎｅ遺伝子をａｒａＢＡＤプロモーターの制御下に挿入することによりＲＮアーゼＥをコードするＥｃｏ－ｒｎｅの染色体欠失を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株を生成し、これを使用すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がアラビノースの存在下でＲＮアーゼＥを合成することが可能になる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのプラスミド組込み方法は、以前のプロトコル（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１７）から導き出される。
Ｂ．ＲＮアーゼフリーＡＤＡＳの合成
染色体Ｅｃｏ－ｒｎｅを欠いている親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株からＡＤＡＳを生成する。実施例１２及び１３に記載されるとおりのＡＤＡＳの合成及び精製前に、親株をアラビノース不含培地で１、２、３、４、８、１２、２４、４８時間又は３、４、５、１０、１４日間成長させて残留ＲＮアーゼＥを分解させる。
Ｃ．代謝活性及びｍＲＮＡ安定性指数
ＲＮアーゼフリーの非修飾ＡＤＡＳをＬＢブロスで成長させて、２時間、１２時間、１日、７日及び３０日の時点でＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＡＴＰ Ｒａｔｅアッセイ）を使用してＡＴＰ産生量を測定する。ＲＮアーゼフリーＡＤＡＳは、非修飾ＡＤＡＳと同程度の代謝を示す。ＡＤＡＳ株は両方とも、ＧＦＰを含有するプラスミドによる形質転換後にＧＦＰを発現する。蛍光イメージングを用いてＧＦＰ発現を測定し、ＲＮＡｓｅｑを用いてｍＲＮＡレベルを測定する。
Ｄ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳからのリボヌクレアーゼの阻害
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ内での機能の生成及び維持に不可欠なＲＮＡの分解を阻害するためには、既存のリボヌクレアーゼを阻害することができる。これには、ＲＮアーゼＥの小分子阻害薬を使用する。ＲＮアーゼＥは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＲＮＡ崩壊の広域的なイニシエーターと考えられ、デグラドソーム（ｄｅｇｒａｄａｓｏｍｅ）複合体のプラットフォームを形成する。Ｎ末端がこの酵素の触媒部分を形成し、そのため小分子による阻害を受け得る。
以前にインタクトな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用に開発された小分子スクリーニング方法（Ｋｉｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１５）を応用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳにおけるＲＮアーゼＥの阻害を判定し、阻害に最良の候補をインビトロで試験する。時間の経過に伴うＧＦＰを定量化する上記に記載する方法例を用いて安定性指数を計算する。
実施例２８．Ｔａｔシグナルペプチドを有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳの合成
本例は、チャネル様分泌装置を通じたペプチドの分泌に使用することのできるＡＤＡＳ、及びより長い時間にわたってより多くのタンパク質を分泌する能力を有する高活性枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳについて記載する。
Ａ．ＧＦＰを分泌する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳの合成
変更を加えた方法（Ｆｅｕｃｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００５ Ｊｕｎ；１５１（Ｐｔ ６）：２０５３－６４．）を用いて、細胞質空間内に移行させるためのタグ付加された「カーゴ」と枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳを合成する。或いは、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｕｓ）ＡＤＡＳは、標的化したｄｉｖＩＶＡ１突然変異（ＪＨ Ｃｈａ，ＧＣ Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９７－Ａｍ Ｓｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）を通じて作出し、しかし他の点では、既に実施例１２及び実施例１３に記載したとおり収集し、精製し、及び特性評価する。Ｔａｔ分泌装置シグナルを標的タンパク質に融合して産生を誘導し、ＡＤＡＳ細胞質から細胞外空間へと移行させる。以前記載されたプロトコルに変更を加えたものを用いて（Ｗｉｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５，Ｂ．Ｃ．Ｂｅｒｋｓ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２，３９３，１９９６）、ＴＡＴシグナルペプチドを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に取り込み、ＰｈｏＤ Ｔａｔシグナルペプチドに融合して、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｕｓ）から排出させる。蛍光顕微鏡法を用いて細胞外ＧＦＰを測定する。
Ｂ．高活性枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳの合成
実施例２０～２５からの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）についての方法を応用することにより、同定された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バージョンの遺伝子、プロモーター及びプラスミドを使用して高活性枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳを合成する。パートａ）からのＴＡＴ－シグナルを融合したＧＦＰプラスミドもまた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にトランスフェクトすることにより、ＧＦＰの分泌につながる。パートａ）及びパートｂ）から合成されたＡＤＡＳについて、１、２，４、８、１２、２４、４８、３６、及び７２時間の時点でタンパク質分泌に関して試験する。
実施例２９．腫瘍抑制のための免疫調節性ＡＤＡＳ
本例は、宿主の免疫系に特異的効果を及ぼすカーゴを収容し及び送達する能力を有する高活性ＡＤＡＳについて記載する。この概念の唯一の又は限定的な実施形態というわけではないモデルとして、特異的環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）を分泌する高活性枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳを作出する。詳細には、このＡＤＡＳは、哺乳類細胞のＲＥＣＯＮ（ＲＥｄｕｃｔａｓｅ ＣＯｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＮＦ－κＢ（レダクターゼ制御ＮＦ－κＢ））を介してＳＴＩＮＧ経路に関与する細菌ヌクレオチドｃ－ジ－ＡＭＰ（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００８；３０：１６７－７８）を特異的に分泌する。
実施例２８に既に記載したとおり枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳを合成する。簡潔に言えば、（ＭａｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１７ Ｍａｒｃｈ ２１；４６（３）：４３３－４４５．）に記載されるアッセイに変更を加えたものを用いて、ヒト末梢血単核球を（１Ｅ６、１Ｅ７、１Ｅ８、１Ｅ９、１Ｅ１０）枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＤＡＳ／ｍＬ濃度に（１０、２０、３０、６０、１２０、１２００分）間にわたって曝露する。次に、細胞を溶解し、ＰＣＲを利用して、ｈＰＢＭＣにおけるＩＲＦ３－、ＩＦＮ－、及びＮＦ－κＢ依存性遺伝子などの免疫刺激遺伝子の増加倍数を決定する。
実施例３０．プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳの合成
本例は、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）をモデル生物として使用した、Ｔ６ＳＳを発現する植物片利共生細菌からのＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳの合成について記載する。
Ａ．プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳの合成
プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０をＡＴＣＣから入手し、製造者の指示に従い培養する。誘導性ｐＬａｃ－１ｋ－Ｊ２３１０７プロモーター（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１８）下でプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｆｔｓＺを過剰発現するプラスミドを商業的なベクター生成会社がｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２骨格から構築する。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｂｉｏ．，２０１０に記載されるプロトコルに従いプラスミドＤＮＡを細菌に電気穿孔することにより、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳ親株を合成する。簡潔に言えば、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０を０．６～０．７５のＯＤ６００になるまで成長させて、４℃でペレット化し、３ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳで洗浄し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ遺伝子パルサー又は同等の機械で電気穿孔し、ＳＯＣ培地で再構成し、３０℃でインキュベートする。次に選択のためＬＢカナマイシン寒天に細胞を播き、製造者の指示に従いＩＰＴＧを添加して成長させることにより、ＡＤＡＳ形成を誘導する。次に実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｂ．鞭毛及びＴ３ＳＳの除去による高活性プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳの合成
プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＥＭ４２及びＥＭ３８３のいずれかを入手するか、又はＭａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．，２０１４及びＭａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３にある手順に従いプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０の別の無鞭毛派生株を合成する。簡潔に言えば、ＰＰ４３２９及びＰＰ４２９７遺伝子の上流７５０ｂｐ（ＴＳ１）及び下流８１６ｂｐ（ＴＳ２）領域をＰＣＲ増幅し、ＴＳ１及びＴＳ２断片をオーバーラップＰＣＲによってライゲートする（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８９を参照のこと）。完全なＴＳ１－ＴＳ２断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、プラスミドｐＥＭＧ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＦ９６５４３７．１）にライゲートして、プラスミドｐＥＭＧ－鞭毛を生成する。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α λｐｉｒに形質転換し、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａ ａｎｄ ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１２に記載されるとおり３－メチル安息香酸プロモーター下にＩ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼで調製したプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０に電気穿孔する。ＴＳ１－ＴＳ２断片のＰＣＲ増幅を通じて陽性の共組込み体を選択し、Ｉ－ＳｃｅＩ酵素の誘導によって分離し、１５ｍＭ ３－メチル安息香酸塩を使用してｐＳＷ－Ｉプラスミドから派生株化する。この培養物をＬＢ－Ａｐ５００寒天プレートに置き、ＰＣＲによって欠失を確認する。
パートａ）に記載される方法を用いて得られた株からＡＤＡＳを作製する。
Ｃ．高Ｔ６ＳＳ発現ＡＤＡＳ
Ｂｅｒｎａｌ ｅｔ ａｌ，ＩＳＭＥ Ｊ．，２０１７に指示されるとおりのＫ１ Ｔ６ＳＳを、商業的な遺伝子合成を通じて、その天然プロモーターを含む、及び天然プロモーターをｐＬａｃ－１ｋ－Ｊ２３１０７プロモーター（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１８）に置き換えた、ａｍｐ耐性を有するｐＢＢＲ１オリジンベクターにクローニングする。次にこのプラスミドを上記に記載される方法を用いてＡＤＡＳ産生プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）株にトランスフェクトし、アンピシリン及びカナマイシン含有ＬＢ培地で成長させて、実施例１３からの方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｄ．ＡＤＡＳ上のＴ６ＳＳ数を決定する
ＶｇｒＧ三量体に対する量子ドット標識抗体を使用して、ＡＤＡＳの表面上にあるＴ６ＳＳ分泌装置を標識する。これを共焦点顕微鏡法によりイメージングし、活性Ｔ６ＳＳを点状のスポットの存在によって手動でカウントする。膜上のＴ６ＳＳ間の平均距離を計算して二乗し、Ｔ６ＳＳによって覆われた表面積として取り扱う。
実施例３１．抗微生物薬及び植物保護剤としてのＴ６ＳＳ発現ＡＤＡＳ
プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）は植物に見られる細菌であり、潜在的な植物病原体のＴ６ＳＳ攻撃に起因して植物防御活性を有することが実証されている。本例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をモデル細菌として使用し、及びＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）をモデル植物病原体として使用して、Ｔ６ＳＳ装置を用いて細菌を溶解させる能力を有するプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳについて記載する。
Ａ．プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳを使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を死滅させる
実施例３０からの方法を用いてプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳ及び高活性ＡＤＡＳを合成する。これらのＡＤＡＳを使用することにより、Ｂｅｒｎａｌ ｅｔ ａｌ．，ＩＳＭＥ Ｊ．，２０１７を応用したプロトコルを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を溶解させる。簡潔に言えば、ＬＢプレートで競合アッセイを実施する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をＰＢＳ中で１のＯＤ６００になるまで培養し、プレート上のプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳと１：１の比で混合する。プレートはまた、一切のプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳなしでも成長させる。プレートを３０℃で５時間インキュベートし、抗生物質選択でコロニー形成単位をカウントする。
Ｂ．プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳを使用してキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）を死滅させる。
プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳを使用することにより、Ｘ．カンペストリス（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）細胞をプレート上で２４時間培養することを除きパートｂ）に記載されるのと同じアッセイを用いてＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）細胞を溶解させる。同じアッセイを実行して、プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳがＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）コロニーの数を減少させ、高活性ＡＤＡＳはその数を更に減少させることを実証する。
Ｃ．プチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳを植物保護剤として使用する
プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳは、Ｂｅｒｎａｌ ｅｔ ａｌ．，ＩＳＭＥ Ｊ．，２０１７を応用したプロトコルに従い植物の損傷保護に使用される。簡潔に言えば、細菌をベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に浸透させることによりインプランタ競合アッセイを行う。キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の一晩培養物をＰＢＳで０．１のＯＤ６００に調整する。プチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＡＤＡＳを細菌と１：１の比で混合する。１ヵ月齢の葉の裏に約１００μＬ容積を浸透させて、浸透範囲に印を付ける。植物チャンバ（２３℃、１６時間明期）内で２４時間インキュベートした後、コロニー形成単位を決定する。浸透範囲から葉の切片を切り出し、ＰＢＳでホモジナイズし、続いて段階希釈する。葉を蛍光顕微鏡法により可視化する。壊死の評価は、Ｋａｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９８に従い、緑色から黄色がかった色に変わり（退緑）、黄色がかった色から茶色がかった色に変わり得る、及び葉の黒変（壊死）、後の段階では葉の完全な腐敗に至るまでの、葉の組織の色の目に見える変化を用いた葉の呈色に基づく。
実施例３２．モデル抗真菌性ＡＤＡＳとしての霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＤＡＳ
霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）は桿状のグラム陰性細菌であり、最近になって、エフェクターＴｆｅ１及びＴｆｅ２のＴ６ＳＳ送達を通じて真菌細胞を死滅させることが実証されている（Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂ，２０１８）。本例は、霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＤＡＳを使用して真菌の適応度を低下させることについて記載する。
Ａ．霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＤＡＳの合成及び精製
Ｙａｎ ａｎｄ Ｆｏｎｇ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１７にあるＰＱＹ３８プラスミドと同じようにして、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ａｍｐＲプロモーターＰａｍｐＲと霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ｆｔｓＺ遺伝子とを含有するプラスミドを合成ＲＢＳと共にｐＵＣ１９骨格に導入する。このプラスミドを、Ｙａｎ ａｎｄ Ｆｏｎｇ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０１７にある方法に従い、線虫遺伝学センター（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）からの霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）Ｄｂ１０に電気穿孔を用いて導入する。簡潔に言えば、細胞を冷却遠心機を用いて冷水で冷洗浄し、冷水に再懸濁し、プラスミドＤＮＡを加え、この混合物を電気穿孔する。その後、１ｍＬ ＳＯＣ培地において細胞を３０℃で６０分間成長させて、次にＬＢ ａｍｐ寒天プレートに播く。次にｆｔｓＺを含む霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）細胞を３０℃でＭ９培地０．１％酵母エキス、２％グルコース、及び２００ｍｇ／Ｌアンピシリンにおいて成長させる。次に実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｂ．霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＤＡＳが真菌を死滅させる能力を実証する
Ｔｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂ，２０１８からのものと同様の共培養アッセイを用いて抗真菌活性を測定する。親株、ＡＤＡＳ及び標的細胞は光学濃度を用いて正規化する。標的細胞と親株、ＡＤＡＳ、又は対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のいずれかとを１：１の容積比で混合し、この混合物の１２．５μｌを固形ＳＣ＋２％グルコース培地にスポッティングする。培養物を２、７、及び２４時間インキュベートし、生き残った真菌細胞を、段階希釈並びに細菌及びＡＤＡＳを除くためのストレプトマイシン補足ＹＰＤＡ培地上での生存カウントにより定量化する。真菌細胞はまた、リアルタイムでＤＩＣを用いて可視化することにより、細胞成長及び分裂を測定する。共培養物中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を陰性対照として使用する。霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）親株及びＡＤＡＳの両方が、７時間の共培養後に真菌細胞を死滅させることが可能である。
実施例３３．過剰発現したＴ３ＳＳを介するヒト腸上皮細胞へのタンパク質送達
細胞内タンパク質を哺乳類細胞に送達可能であれば、ヒト治療学上、種々の適用が実現する可能性がある。本例は、ＡＤＡＳ Ｔ３分泌装置を使用すると、異種タンパク質をヒト腸上皮細胞に送達できることについて記載する。このモデル実施形態は、細胞内タンパク質が標的生物に顕著な効果を及ぼす可能性がある幾つもの動物及び植物適用に適用される可能性がある。
この実験では、ヒト腸上皮細胞を様々な濃度のＡＤＡＳ（１Ｅ６、１Ｅ７、１Ｅ８、１Ｅ９、１Ｅ１０ ＡＤＡＳ／ｍＬ）に曝露し、上皮細胞の細胞内ＧＦＰを蛍光顕微鏡法を用いて測定する。様々な条件についてＧＦＰ陽性細胞の数を細胞総数で除して送達及び投与効率を計算する。
ＡＴＣＣに従いＣａｃｏ－２哺乳類細胞株を培養する。これらの細胞を、Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｂｙｓｔｒｏｆｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９によって記載されるとおり、トランケート型ＧＦＰ（ｔＧＦＰ）が発現するように修飾する。このトランケートされた形態のＧＦＰは発現し、正しく折り畳まれるが、欠けているβ鎖が供給されるまで蛍光は発しない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＡＤＡＳを、それぞれ実施例１２及び１３に記載されるとおり作製及び精製する。端的には、それらをＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）組織培養フラスコ（Ｔ－２５、７５、Ｔ－１５０、又はＴ２５５、カタログ番号４３０６４１）において、ウシ胎仔血清を２０％で補足した、非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１５００ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＡＴＣＣの特別注文のイーグル最小必須培地（カタログ番号３０－２００３）と共に３７℃で培養する。送達アッセイ用のＣａｃｏ－２細胞を回収するため、二価カチオン（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋）不含のＰＢＳで細胞を洗浄し、細胞表面に２～３ｍＬの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン及び０．０５ｍＭ－ＥＤＴＡ溶液を１０～１５分間加え、６～８ｍＬの完全成長培地で酵素活性をクエンチする。回収後、自動化細胞計数器（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び生死判別染色（カルセイン－生細胞、エチジウムホモ二量体－死細胞）を使用して細胞をカウントする。
Ａ．赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ＳＰＩ－１のＴ３ＳＳを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの調製及び精製
実施例１２に記載する方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを調製する。ＡＤＡＳ表面上のＴ３ＳＳの存在量を増加させるため、ＨｉｌＡをコードするプラスミドを導入する。ＨｉｌＡはＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳを調節し、これは既存のプロトコルから採用する（Ｂａｊａｊ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）１８（４），７１５－７２７）。実施例１３に記載する方法を用いてＡＤＡＳを調製する。免疫蛍光顕微鏡法及びＴＥＭを用いてＴ３ＳＳを目視で調べ、カウントする。単離された高純度Ｔ３ＳＳ発現ＡＤＡＳを未精製Ｔ３ＳＳ発現ＡＤＡＳと比較後。
Ｂ．タンパク質－分泌装置タグ融合
機能性Ｔ３ＳＳを用いたタンパク質分泌を可能にするため、以前記載されたプラスミド設計方法論（Ｅｖａｎｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｆｅｂ．２００３，ｐ．２４００－２４０９）を用いてＧＦＰ β鎖をＴ３ＳＳ分泌タグＳｏｐＥの最初の１０４アミノ酸に融合する。プラスミドが親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現し、続いてＡＤＡＳがトランケート型ＳｏｐＥ－ＧＦＰハイブリッドを含有する。
Ｃ．タンパク質送達アッセイ
ＡＤＡＳに曝露する前に、細胞はコンフルエント後１又は３又は５日間培養して、再現性のある細胞成熟度及び極性化を確実にする。各試料について、コンフルエントな上皮試料にＡＤＡＳを加え、３７℃で２時間インキュベートする。蛍光細胞総数を培養下の細胞総数で除すことによりＡＤＡＳ送達効率を計算し、様々な条件間で比較する。
実施例３４．Ｔ３ＳＳ装置を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの標的化した送達についての補足方法
薬物送達では、標的化した送達が重要である。本例は、ナノボディをＡＤＡＳのモデルターゲティング薬剤として使用することについて記載する。ナノボディは公知の最小の機能性抗体断片であり、最近の研究では、それが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面に発現できることが示されている（Ｓａｌｅｍａ ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７）。表面ナノボディは標的タンパク質に効率的に結合することができ、個々の細胞型に対する特異性を生み出すのに使用することができる。
Ａ．ＥＧＦＲナノボディを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の合成
Ｓａｌｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１６によって記載されるとおり上皮成長因子（ＥＧＦＲ）に対する表面ナノボディを発現する親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を合成する。簡潔に言えば、ＥＧＦＲに対するナノボディをコードする配列（ＴＹＮＰＹＳＲＤＨＹＦＰＲＭＴＴＥＹＤＹ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイベクターｐＮｅａｅ２の各部位にクローニングし、このベクターはナノボディをインチミンポリペプチドＮｅａｅのＣ末端に融合して表面発現を可能にする。プラスミドｐＮｅａｅ２（ＣｍＲ）は、ｐＮｅａｅベクターの誘導体であり、インチミン残基１～６５９（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３ｓｔｘ－由来）と、それに続くＥタグ、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）エピトープ、及びＣ末端ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤ）をコードする。
ナノボディを有するプラスミドを担持する細菌を、プラスミド選択に適切な抗生物質を含む寒天プレート上のＬＢブロス中３０℃で成長させる。誘導前のＬＢプレート及び接種前培地は、ｌａｃプロモーターの抑制のため２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有した。接種前培養物は個々のコロニーから（単一クローンについて）、又はクローンの混合物から（ライブラリの場合）出発し、新たに成長させて、プレートから回収し、０．５の初期ＯＤ６００に希釈して、静的条件下で一晩成長させる。誘導のため、細菌（０．５のＯＤ６００に対応する）を遠心（４０００×ｇ、５分）によって回収し、特に指示がない限り、０．０５ｍＭイソプロピルチオ－β－Ｄ－ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むがグルコースは含まない同じ培地で３時間、撹拌（１６０ｒｐｍ）しながら成長させる。
Ｂ．ＥＧＦＲナノボディ発現を有するＡＤＡＳの合成
これらの親株から実施例１２に記載するとおりＡＤＡＳを合成し、上記に記載するとおりカーゴ（ＧＦＰ用のタンパク質及び遺伝子送達）を負荷する。
Ｃ．ＥＧＦＲナノボディを有するＡＤＡＳの特異性アッセイ
製造者が提供する標準的な細胞培養プロトコルによりＣａｃｏ－２（ヒト上皮結腸直腸腺癌）及びＡ－４３１（類表皮癌）細胞株を共培養する。次に共培養物を、上記に記載されるとおりの修飾した親株又はカーゴ（ＧＦＰ）を担持するＡＤＡＳと共にインキュベートする。ＦＡＣＳを用いてＡ－４３１及びＣａｃｏ－２細胞を分離し、ＧＦＰを発現する標的細胞の比率を定量化する。蛍光顕微鏡法もまた用いて個々の細胞の蛍光レベルを定量化することにより、注入されたタンパク質サブユニット数又はトランスフェクションに起因するタンパク質発現量を測定する。細胞特異的マーカーを標識する免疫細胞化学と併せて、顕微鏡法もまた用いて細胞型のＧＦＰ発現を細胞形態に基づき定量化することにより、Ｃａｃｏ－２細胞とＡ－４３１細胞とを区別する。
実施例３５．植物へのＴ３ＳＳ送達のためのカンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）ＡＤＡＳの合成
本例は、植物病原性細菌からのＡＤＡＳの作出及びカンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）をモデル生物としたその天然の送達機能の使用について記載する。植物病原体に見られるＴ３ＳＳは、植物細胞への効率的なタンパク質送達システムの基礎を成す。カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）のＴ３ＳＳエフェクターは十分に特徴付けられていないため、バイオフィルム形成を測定するアッセイを用いてカンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）ＡＤＡＳにおけるＴ３ＳＳの能力を判定する。次には、エフェクターをレポータータンパク質（例えばＧＦＰ）に置き換えることにより、異種発現したタンパク質をＴ３ＳＳを介して移入させる能力を判定することができる。
Ａ．Ｔ３ＳＳ欠損カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）の合成
Ｔ３ＳＳは、カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）において感染時のバイオフィルム形成に必要であり、ビルレンスを増加させる。鍵Ｔ３ＳＳタンパク質をコードするｈｒｐＢオペロンが欠損した突然変異体（Ｄｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ，２００５によって記載される）を作出することにより、Ｔ３ＳＳ欠損カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）を作出する。使用するプライマーは、５’－ＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧ－３’及び５’－ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧ－３’である。５０μＬ反応混合物中でゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を鋳型として使用する。ＰＣＲは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーマルサイクラーで、変性を９４℃で５分、続いて９４℃で３０秒、６２℃で４０秒、及び７２℃で１分を３０サイクル、最終伸長を７２℃で５分として実行する。０．９％アガロースゲルでＰＣＲ増幅産物を分析する。ＢａｍＨＩで消化することにより産生されるＸａｃｈｒｐ突然変異ＤＮＡ断片を使用してサザンブロットハイブリダイゼーションを実施し、電気泳動により断片化し、次にＨｙｂｏｎｄ－Ｎ膜に転写する。［α－３２Ｐ］ｄＡＴＰで標識した増幅ｈｒｐ８４０ｂｐ ＰＣＲ産物を使用してハイブリダイゼーション及び検出プロトコルを実施する。
プラスミド組込みによりｈｒｐＢ突然変異体を構築する。ＳｍａＩで消化した自殺ベクターｐＫ１９ｍｏｂＧＩＩに増幅産物をクローニングして、それぞれｐＫｍｏｂＢ及びｐＫｍｏｂＦを得る。広宿主域可動性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７－１株からの二親性交配により、プラスミドをカンキツかいよう病菌（Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）に移入する。細菌混合物をＨｙｂｏｎｄ－Ｃ膜にスポッティングし、栄養寒天上に置き、２８℃で４８時間インキュベートする。次に膜を洗浄し、細菌を選択培地に移し替える。ベクターにコードされている抗生物質耐性（Ｋｍ）によってカンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）突然変異株を選択し、サザンハイブリダイゼーションによって確かめる。
Ｂ．カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）ＡＤＡＳの合成
カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）ＡＤＡＳを作出するため、カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）（ｈｒｐＢ突然変異体及び非形質転換型）に、アラビノースプロモーター下でｆｔｓＺタンパク質を過剰発現するプラスミド（Ｌａｃｅｒｄａ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ，２０１７）を実施例１２と同様にトランスフェクトする。ｆｔｓＺ遺伝子配列は、Ｋｏｐａｃｚ ｅｔ ａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎ，２０１８からのものである。使用するプライマー配列は、フォワード－ＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧ；リバース－ＡＧＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧである。プラスミドはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒによって商業的に合成される。上記に記載するプロセスを用いてトランスフェクションを実行する。時間が経つと、選択されたコロニーが増殖し、ＡＤＡＳを産生し続ける。
Ｃ．カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）ＡＤＡＳがオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）にバイオフィルムを形成する能力
Ｔ３ＳＳは、カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）によるバイオフィルム形成に不可欠である。ｈｒｐＢ突然変異株及び正常株からのＡＤＡＳをオレンジ（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）植物における感染アッセイに使用する。植物は全て、白熱灯を備えるグロースチャンバーにおいて２８℃で１６時間明期として成長させる。１のＯＤ６００となるまでＡＤＡＳを精製し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２に１０４～１０７ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁する。このＡＤＡＳを無針注射器で葉に浸透させる。種々の株を接種した２０枚のオレンジ葉から癌腫病をカウントし、デジタル化した画像からＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して、カウントした葉の面積を測定する。Ｔ３ＳＳ発現カンキツかいよう病菌（Ｘ．ｃｉｔｒｉ）からのＡＤＡＳは、Ｔ３ＳＳ欠損親株と比べて有意に多い癌腫病形成を示す。
実施例３６．Ｔ４ＳＳを使用した植物形質転換剤としてのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＤＡＳの合成
本例は、モデルＤＮＡプラスミドなどのペイロードを送達することのできる、Ｔ４ＳＳを有するＡＤＡＳの作出について記載する。その天然のＴ４ＳＳ装置を使用した植物の形質転換方法としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用する。これにより、広い現場において漏れるリスクなしに噴霧モダリティで非複製アグロバクテリウムを展開することが可能になる。
Ａ．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）へのプラスミドのトランスフェクション
ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のトランスフェクションのため、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換キット（ＭＰｂｉｏ）に記載されるとおりの凍結融解方法及び材料を用いて、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＶ３１０１株に導入する。簡潔に言えば、１．０～２．０のＯＤ６００になるまでアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を成長させて、形質転換溶液に再懸濁し、プラスミドＤＮＡと混合し、液体窒素に１分間浸し、３０℃の水浴中に５分間浸し、プラスミド上の選択マーカーを含むルリア・ベルターニ培地で再び成長させる。
トマトのトランスフェクションのため、製造者の説明書によって記載される方法を用いて、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に導入する。簡潔に言えば、アグロバクテリウムを濡れた氷の上で解凍し、塩、エタノール、及び他の夾雑物を含まない精製プラスミドＤＮＡと混合する。この混合物を電気穿孔し、直ちに室温培地と混合し、再び３時間成長させる。
いずれのプロトコルからの細胞も、次に希釈し、選択に必要な抗生物質を含む寒天に播く。翌日、又はコロニーを目視できるようになったとき、それをシーケンシング用に選択する。プラスミド同一性の確認後、必要な選択マーカーを含有する培養培地（製造者の説明書によって指定される）の中で振盪しながら適切なコロニーを一晩成長させる。
Ｂ．アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＤＡＳの合成
ｐＳＲＫＧｍ骨格（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８）にアグロバクテリウムｆｔｓＺを含むプラスミドが商業的に合成される。次にそれをパートａ）に記載される方法を用いてアグロバクテリウムにトランスフェクトすることにより、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＤＡＳ親株を形成する。次にこの親株を製造者の指示に従いＩＰＴＧを添加して成長させ、実施例１５にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｃ．大型アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＤＡＳの合成
ｐＳＲＫＧｍ骨格（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８）にエキソヌクレアーゼＶを含むプラスミドが商業的に合成される。次にそれをパートａ）に記載される方法を用いてアグロバクテリウムにトランスフェクトすることにより、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＤＡＳ親株を形成する。次にこの親株を製造者の指示に従いＩＰＴＧを添加して成長させ、実施例１３にある方法を用いてＡＤＡＳを精製する。
Ｄ．ＧＦＰペイロードを有するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＤＡＳの合成
Ｂａｌｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１４が参照されるプラスミドｐＬＳＬＧＦＰ．Ｒを使用する。パートａ）に示される方法を用いてプラスミドｐＬＳＬＧＦＰ．Ｒをトランスフェクトする。パートｂ）又はｃ）にある方法を用いてＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＤＡＳを合成する。
Ｅ．植物へのＧＦＰペイロードを有するアグロバクテリウムＡＤＡＳのトランスフェクション
タバコ（ニコチアナ・タバカム変種キサンチ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒ Ｘａｎｔｈｉ））植物を１６時間明期及び８時間暗期サイクル下に２１℃で６０％湿度として成長させる。４～６週齢タバコ植物からの葉（完全に展開した上葉）をＡＤＡＳ形質転換に使用する。各植物につき１枚の葉を浸透させる。１ｍＬシリンジを使用してタバコ植物からの葉にアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を浸透させる。浸透後直ちに、植物に水をやり、ドーム型プラスチックで覆って高湿度を維持する。浸透後約２４時間でドーム型プラスチックを取り外す。蛍光リーダーで植物をイメージングし、目視できるＧＦＰを有する葉の割合を測定する。
実施例３７．ＡＤＡＳ分泌効率の測定
ＡＤＡＳの分泌効率を測定するため、タンパク質を内因的に合成及び分泌する能力並びに異種発現させたタンパク質を測定する。
Ａ．ＧＦＰを合成する親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
ＧＦＰ及びアンピシリン耐性を担持するベクターを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２ＧＦＰ（商標））に注文し、製造者の指図に従い培養する。
Ｂ．分子を合成するＡＤＡＳ能力
ＧＦＰを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株並びに天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からＡＤＡＳを生成する。ＧＦＰを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株から陽性対照として蛍光測定を行い、これをベースラインとして使用してＡＤＡＳからのＧＦＰ強度を測定する。ＡＤＡＳを実施例１２により合成し、９６ウェルプレートに播き、プレートリーダーを使用して蛍光を測定する。ＡＤＡＳは、成長又は分裂に必要なタンパク質を合成する必要がないため、生成された両方のＡＤＡＳとも、タンパク質合成の効率が高く、親株と比較してより高いＧＦＰ強度を呈する。細胞レベルでの強度を測定するため、標準的な細胞調製プロトコルを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株及びＡＤＡＳを固定し、スライドガラスにマウントする。共焦点顕微鏡を蛍光イメージングと共に使用してこれらをイメージングする。これらの画像を使用して平方単位面積当たりの蛍光強度を測定し、親株との直接比較に使用する。
Ｃ．分子を分泌するＡＤＡＳ能力
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はＴ１ＳＳ媒介性リパーゼ分泌を用いて感染を容易にする。Ｔ１ＳＳは、分泌タンパク質の特異的Ｃ末端配列を認識するＡＢＣ輸送体を含む。天然Ｔ１ＳＳを内因性リパーゼと共に発現する親大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、並びにＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２００９によって記載されるとおり、輸送のためＣ末端配列と融合したＧＦＰを含有するプラスミドをトランスフェクトした別の株を生成する。
簡潔に言えば、融合タンパク質の分泌用のリパーゼＡＢＣ輸送体ドメイン（ＬＡＲＤ）を設計する。ＬＡＲＤは、βロール構造を含む４つのグリシンリッチリピートを含んだとともに、これを試験タンパク質のＣ末端に加える。融合タンパク質とＬＡＲＤとの間にＰｒｏ－Ｇｌｙリンカー又は第Ｘａ因子部位のいずれかを加える。ＧＦＰ融合タンパク質の分泌を分析する前に、ＧＦＰ融合タンパク質の発現を確かめる。これらのタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて、その予想サイズをウエスタンブロッティングにより確認する（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｎｃ．、ＰＡ、カタログ番号ＫＣＡ２１５）。加えて、ＧＦＰの蛍光が実証される。これらのタンパク質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の代表的なコロニーを紫外（ＵＶ）光下で観察する。分泌表現型であればリパーゼ活性によってトレースすることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトリブチルスズ寒天上で培養してＴｌｉＡ融合タンパク質の分泌を検出する。ＧＦＰ融合タンパク質がＧＦＰに対する抗体でも検出されるとき、ＬＡＲＤに対する抗体によって検出されたのと同じバンドが細胞及び上清中に検出される。
Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．を応用した方法を用いてもまた分泌を測定し、これについては以下に概説する。実施例１２に概説する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株からＡＤＡＳを生成する。
ＡＤＡＳによるリパーゼ分泌を測定するため、固体培地（ＬＡＴ：ＬＢブロス、１．５％Ｂａｃｔｏ寒天、０．５％トリブチルスズ）にＡＤＡＳを播く。分泌されたリパーゼは、典型的な表現型としてコロニーの周囲に発達するハローを生じる。ＡＤＡＳは親株よりも急速にハローが発達する。これに加えて、基質としてエタノール及びトリス－ＨＣＬ中に溶解させたパルミチン酸ｐ－ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を加えることにより、リパーゼ活性を分光光度法で測定する。ＡＤＡＳ及び親株培養物からの５０μＬ上清を２００μＬの基質に加え、プレートリーダーを使用して４２０ｎｍの吸光度を測定する。光学濃度の増加分を用いて活性を測定する。
リパーゼは内因的に発現するタンパク質であるため、異種発現したタンパク質の分泌はＧＦＰを使用して測定する。ＡＤＡＳ及び親株をＬＢブロスで成長させて、ブロスからの上清を収集し、ＧＦＰ発現を測定する。標準的なイムノブロット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｎｃ．、ＰＡ、カタログ番号ＫＣＡ２１５）をＧＦＰ特異的抗体と共に製造者の指示に従い用いることにより、ＧＦＰ分泌を測定する。
実施例３８．非桿状ナノ粒子含有ＡＤＡＳ（マグネトスピリラム・マグネティカム（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ））
本例は、非桿状細菌からＡＤＡＳを合成でき、及びそれがナノ粒子などのより大きい構造を含み得ることについて記載する。
Ａ．Ｍ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＤＡＳの調製
ＡＤＡＳを作出するため、Ｔ７プロモーター下でｆｔｓＺタンパク質（Ｑ２Ｗ８Ｋ６＿ＭＡＧＳＡ）を過剰発現するプラスミドをＭ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）にトランスフェクトする。プラスミドはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒによって商業的に合成される。標準的な細菌トランスフェクションプロセスを用いてトランスフェクションを実行する（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ分子生物学ハンドブックを参照のこと）。手短に言えば、室温の寒天プレートにコンピテント細胞を播く。バイアル内のコンピテント細胞に０．５～２ｎｇ／ｍｌのＤＮＡを加え、２０～３０分インキュベートする。次にチューブを４２℃の水浴に３０～６０秒間置くことにより各チューブに熱ショックを与え、細胞表面に一過性の細孔を作り出す。次に、選択的抗生物質を予め負荷した寒天ゲルに細胞を播き、一晩成長させる。プラスミドをトランスフェクトした細菌のみが生き残る。単一コロニーをピッキングし、５０～１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地中、３７℃において１２０ｒｐｍで連続的に振盪しながら培養する。時間が経つと、選択されたコロニーが増殖し、ＡＤＡＳを産生し続ける。或いは、実施例１４において用いられるのと同様のプロトコルを用いて大型ＡＤＡＳが調製される。
これに加えて、これらの細菌においてｆｔｓＺ様遺伝子を欠失させると、超常磁性磁鉄鉱マグネトソームが産生されることになる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０１０）。
Ｂ．Ｍ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＤＡＳのナノ粒子保持の特性評価
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３によって記載されるとおり、ＴＥＭを用いてＡＤＡＳマグネトソームの形態を分析する。簡潔に言えば、炭素コートｆｏｒｍｖａｒフィルムで覆った銅ＴＥＭグリッド上に２０μＬの細胞を２時間滴下し、次に滅菌蒸留水で２回洗浄し、風乾させる。マグネトソームサイズは、ＴＥＭ顕微鏡写真を測定することによる（長さ＋幅）／２として定義され、形状係数は幅／長さとして定義される。
Ｃ．Ｍ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＤＡＳ磁性の実証
Ｍ．マグネティカム（Ｍ．ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ）ＡＤＡＳの磁性特性を特徴付けるため、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０１０から変更したプロトコルを用いる。簡潔に言えば、試料をフリーズドライし、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｅｓｉｇｎ ＭＰＭＳ ＸＬ－５磁力計（感度、５．０×１０－１０Ａｍ２）を使用して低温磁気測定値を取る。２回の前処理後に５Ｋで２．５Ｔの磁場において収集された残留磁気（以下、ＳＩＲＭ５Ｋ＿２．５Ｔと呼ぶ）の熱消磁は、５Ｋ～３００Ｋと測定される。１つ目の前処理は、試料をゼロ磁場で３００Ｋから５Ｋに冷却することであり（ゼロ磁場中冷却［ＺＦＣ］）、２つ目は、それを２．５Ｔ磁場で３００Ｋから５Ｋに冷却することである（磁場中冷却［ＦＣ］）。フェルベイ転移点（Ｔｖ）は、ＦＣ曲線の一次導関数ｄＭ／ｄＴの極大値に対応する温度として定義される。交番磁場勾配磁力計（感度、１．０×１０－１１Ａｍ２；ＭｉｃｒｏＭａｇモデル２９００）で室温一次反転曲線（ＦＯＲＣ）を測定する。ＦＯＲＣｉｎｅｌバージョン１．０５ソフトウェアを平滑化係数（ＳＦ）を２として使用してＦＯＲＣ図を計算する。ＦＯＲＣ図は、磁性結晶の磁区状態、保磁力、及び静磁気相互作用に関する情報を提供する。
実施例３９．環境応答性ＡＤＡＳ
ブール論理ゲートに基づく論理演算を遺伝子調節ネットワークにコードして細胞の組込みを可能にし、又は環境及び細胞キュー並びにそれに応じた反応を区別する。天然の細胞には見られない様々な細胞センサー及びアクチュエータを関連付けるようにカスタマイズした遺伝論理回路を設計することができる。これらの修飾された細胞は、特異的入力に応答して細胞内又は細胞外で所望の結果を生じるようにプログラム化することができる。遺伝子回路の非モジュール性及び宿主シャーシの制限など、幾つかの欠点にも関わらず、これらはエンジニアリングされた生物において極めて有用であり、遺伝論理回路のライブラリが現在展開されているところである。幾つものかかる回路が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において記載されており、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳに取り入れる。
これらの回路は、入力（例えば、代謝産物、ｐＨ、熱、光、外部リガンド）に応答して調整可能な出力を生み出すことができる環境応答性ＡＤＡＳの基礎を成す。これらは複数の入力の存在に応答するようにＡＮＤゲートでエンジニアリングされるか、又はコードされた入力のいずれかに応答するようにＯＲゲートでエンジニアリングされる。このレパートリーを拡大して、ＮＯＲ、ＮＡＮＤ、ＸＯＲなどの他の論理ゲートを含めることができる。
Ａ．ＡＮＤ／ＯＲゲートを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの合成
シリンゲ菌（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）は、ｈｒｐＲ／ｈｒｐＳ装置と呼ばれる、Ｔ３ＳＳの発現を厳密に調節するＡＮＤゲートを形成するＩＩＩ型分泌調節装置を含む。Ｔ３ＳＳ装置の産生には、これらの両方のタンパク質の発現が必要である。標準的な分子生物学的技術を用いてプラスミド構築及びＤＮＡ操作を実施し、ＡＮＤゲートの構築については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１によって記載されるプロトコルに変更を加える。簡潔に言えば、ａ）ＩＰＴＧ誘導性Ｐｌａｃプロモーター及びＡＮＤゲートのｈｒｐＲ部分、及びｂ）熱誘導型プロモーターｐＬ（λファージ由来、通常は熱不安定性タンパク質によって抑制されている）及びＡＮＤゲートのｈｒｐＳ部分を含有するプラスミドを構築する。出力はＧＦＰタンパク質発現であり、これはＴ３ＳＳプロモーターを含み、ｈｒｐＲ及びｈｒｐＲの両方が発現したときに発現する。
標準的な分子生物学的技術に従いプラスミド構築及びＤＮＡ操作を実施する。ｈｒｐＲ及びｈｒｐＳ遺伝子プロモーターがＧＥＮＥＡＲＴによってＢｉｏＢｒｉｃｋ標準に従い合成される。特性評価用にＩＰＴＧ誘導性Ｐｌａｃを含有する且つＡＮＤゲートのｈｒｐＲ（ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ）を持つプラスミドｐＡＰＴ１１０（ｐ１５Ａ ｏｒｉ，Ｋａｎｒ）を使用する。ＡＮＤゲートのｈｒｐＳを持つ熱誘導性ｐＬプロモーターを含有するプラスミドｐＢＡＤ１８－Ｃｍ（ｐＢＲ３２２ ｏｒｉ，Ｃｍｒ）を入手する。ｐＳＢ３Ｋ３（ｐ１５Ａ ｏｒｉ，Ｋａｎｒ）を使用して、後にｈｒｐＲ（ＸｂａＩ／ＰｓｔＩ）をドライブするために使用される合成ＡＨＬ誘導性Ｐｌｕｘプロモーター（ＢＢａ＿Ｆ２６２０）をクローニングし、特徴付ける。対応するＲＢＳ及び適切な制限部位を含むプライマーでのＰＣＲ増幅により（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒグラジエントサーマルサイクラーを使用する）、各遺伝子コンストラクトの様々な配列を導入する。或いは、全てのコンストラクトが商業的に合成される。コンストラクトは全て、標的細胞株におけるその使用前にＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって確かめる。
特性評価実験は全て、適切な炭素源を補足したＭ９最少培地（１１．２８ｇ Ｍ９塩／ｌ、１ｍＭ塩酸チアミン、０．２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）で行う。炭素源の異なる２つのＭ９培地：Ｍ９－グリセロール（０．４％（ｖ／ｖ）グリセロール）及びＭ９－グルコース（０．０１％（ｖ／ｖ）グルコース）を使用する。使用する抗生物質濃度は、カナマイシンについて２５μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコールについて２５μｇ ｍｌ－１及びアンピシリンについて２５μｇ／ｍｌである。新しく画線したてのプレート上の単一コロニーから接種した細胞は、１４ｍｌファルコンチューブ内の４ｍｌ Ｍ９において３７℃で一晩、振盪（２００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら成長させる。一晩培養物を予め温めたＭ９培地に、１日培養物についてＯＤ６００＝０．０５で希釈し、特に指示されない限り、分析前にそれを３０℃で５時間誘導して成長させる。蛍光定量法による蛍光アッセイについては、希釈した培養物を９６ウェルマイクロプレート（Ｂｉｏ－Ｇｒｅｉｎｅｒ、煙突型黒色、透明平底）にロードし、１ウェル当たり２００μＬの最終容積となるように様々な濃度の５μＬ（単回入力誘導について）又は１０μＬ（二重入力誘導について）の誘導物質でマルチチャネルピペットによって誘導する。
ＯＲゲートをエンジニアリングするため、Ｒｏｓａｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１８によって記載される装置を使用する。第一に、構成的プロモーター下でＲＦＰをコードするシス抑制型ｍＲＮＡを構築する。この抑制は、ＲＡＪ１１ ｓＲＮＡの存在下で取り除かれる。両方ともＲＡＪ１１ ｓＲＮＡの発現を誘導するＩＰＴＧ誘導性プロモーターＰＬａｃと熱誘導型プロモーターｐＬとを含有するプラスミドを合成する。出力はＲＦＰ発現であり、これはいずれかの入力に応答して見られる。
入力シグナル（ＩＰＴＧ及び熱）を感知するエレメントとして、転写因子ＬａｃＩ及びｐＬによって調節される合成のＰＬベースのプロモーターを使用する。装置ＲＡＪ１１のリボレギュレーター配列（ｓＲＮＡ及び５’ＵＴＲ）は、先行研究から入手する（Ｒｏｄｒｉｇｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１２）。対応するＲＢＳ及び適切な制限部位を含むプライマーでのＰＣＲ増幅により（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒグラジエントサーマルサイクラーを使用する）、各遺伝子コンストラクトの様々な配列を導入する。コンストラクトは全て、標的細胞株におけるその使用前にＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって確かめる。
一晩培養物にはＬＢ培地を使用し、一方、特性評価培養物にはＭ９最少培地（１×Ｍ９塩、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４％グルコース、０．０５％カザミノ酸、及び０．０５％チアミン）を使用する。抗生物質としてアンピシリン及びカナマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度で使用する。
蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５）でＧＦＰ及びＲＦＰ培養物をアッセイして、吸光度（６００ｎｍ吸光度フィルタ）、緑色蛍光（４８５／１４ｎｍ励起フィルタ、５３５／２５ｎｍ発光フィルタ）、及び赤色蛍光（５７０／８ｎｍ励起フィルタ、６１０／１０ｎｍ発光フィルタ）を測定する。Ｍ９最少培地に対応する吸光度及び蛍光のバックグラウンド平均値を差し引いて、リードアウトを補正する。正規化した蛍光を蛍光と吸光度との比として計算する。次に、対照プラスミドで形質転換した細胞に対応する正規化した蛍光の平均値を差し引いて、最終的な発現推定値を得る。
これらのゲートはモデル装置であり、他の化学物質、細胞接触、ｐＨ、及び光を含めた任意の入力で活性化するように更に変更することができる。
Ｂ．ＡＮＤ／ＯＲゲートを有するＡＤＡＳの生成
実施例１２に記載するプロトコルによりＡＤＡＳを生成し、実施例１３にある方法により精製する。
Ｃ．論理ゲートはＡＤＡＳにおいて機能する
先述のとおり、ｈｒｐＲ／ｈｒｐＳは、両方ともに、産物を有効に生成してＡＮＤ論理ゲートを作り出すのに入力を必要とする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを４つの条件に供する：１．ＩＰＴＧなし／熱なし、２．ＩＴＰＧあり／熱なし、３．ＩＰＴＧなし／熱あり、及び４．ＩＴＰＧあり／熱あり。熱及びＩＰＴＧの両方が存在する条件４のみが、ｈｒｐＲ／ｈｒｐＳの発現を引き起こすことになり、それがＧＦＰの発現につながる。
ＧＦＰ発現は、ＩＰＴＧの濃度及び刺激曝露期間を変化させることにより調節できる可能性がある。種々の条件に曝露した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを９６ウェルプレートにロードし、蛍光プレートリーダーを使用して、異なる条件との相対的なＧＦＰ発現を定量化する。二重盲検実験により、ＧＦＰの存在がＩＰＴＧ及び熱の両方の存在を指定していることを確認し、刺激に対して応答性の装置の基礎を成す。
実施例４０．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び極限環境微生物由来の重金属捕集ＡＤＡＳ
重金属は環境上及び健康上のリスクを提起し、多くの場合に効率的且つ非侵襲的な方法で除去することが困難である。水銀に対して高親和性及び選択性を有する金属調節タンパク質であるＭｅｒＲのようなタンパク質の発現を用いて、水銀などの重金属を捕集するように細菌をエンジニアリングする。
Ａ．ＭｅｒＲを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の合成
Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３によって記載される方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株を合成する。簡潔に言えば、ＭｅｒＲを表面発現用の氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）と融合する。この融合タンパク質のＣ末端にヘキサヒスチジンタグを付加して発現を確認する。
簡潔に言えば、ＩＮＰ－ＭｅｒＲ融合体を以下のとおり構築する。プラスミドｐＴ７ＫＢからプライマーｍｅｒＲ１（５’ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡ ３’）及びｍｅｒＲ２（５’ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＡＡＧＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＣＣ ３’）でｍｅｒＲ断片をＰＣＲ増幅する。この増幅断片をＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化し、ゲル精製し、ｐＵＣ１８Ｎｏｔに挿入されたＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ ＩＮＰ断片を含有する同様に消化したｐＵＮＩにサブクローニングすることにより、ｐＵＮＩＭを生成する。得られたコンストラクトにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面にＭｅｒＲを発現させることが可能になる。
ＭｅｒＲの表面局在性を調べるため、ＩＮＰ－ＭｅｒＲ融合体のＣ末端部分にヘキサヒスチジンタグを付加する。Ｃ末端の６つのヒスチジンをコードする新しいリバースプライマー、ｍｅｒＲ３（５’ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴ ３’）でｍｅｒＲ断片を再び増幅する。ＩＮＰ－ＭｅｒＲ－Ｈ６融合体をコードする得られたプラスミド、ｐＵＮＩＭＨを調製する。
細菌クローンを対照としての非形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と共にＬＢブロスで成長させることにより、０、５、１０、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、及び１６０μＭの濃度のＨｇＣｌ２の存在下で水銀捕集量を測定する。各細菌クローンについて、成長及びその相対的水銀耐性を決定するため、１６及び１２０時間のインキュベーション後に６００ｎｍで吸光度を測定する。
Ｂ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの合成及び精製
実施例１２に記載するプロトコルによりＡＤＡＳを生成し、実施例１３にある方法により精製する。
Ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳによる水銀捕集
０、５、１０、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、及び１６０μＭの濃度のＨｇＣｌ２を含有するＬＢブロス中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを１６及び１２０時間インキュベートする。水銀を極めて低いレベルまで検出するように設計されたアッセイ（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１により設計されるキレートストリップ）を用いて水銀の残留レベルを試験する。
実施例４１．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳによるラクトース取込み及び代謝
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるラクトース取込みは膜結合型タンパク質β－ガラクトシドパーミアーゼによって行われ、これがラクトース及び他のβ－ガラクトシド類を細胞に輸送することを可能にする。糖分子の輸送はプロトンの共輸送を伴い、これによりｐＨ感受性色素を使用した取込みアッセイが可能となる。
Ａ．β－ガラクトシダーゼパーミアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株の合成
糖供給源としてラクトースのみを含むブロスを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株を合成する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、好ましい糖類の非存在下での糖供給源としてラクトースを取り込み及び利用するため、ｌａｃオペロンシステムを含有する。好ましい糖類を除去すると、ラクトースの取込み及び代謝に関与するこのタンパク質の発現が誘導される。取込みは膜結合型輸送体を介するため、ＡＤＡＳでの発現を一部には左右する親株での輸送体発現を増加させるには、このシステムの誘導が必要である。加えて、輸送体の発現のため、ｌａｃオペロンシステムを含有するプラスミドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳに導入される。
Ｂ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳによるラクトース取込み
実施例１２及び１３に記載するとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを合成し、精製する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳによるラクトース取込みをｐＨ感受性アッセイを用いて測定する。Ｐｒａｂｈａｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１４によって記載されるとおり、ｐＨ感受性色素ピラニンを使用してラクトース取込みを測定する。簡潔に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳをペレット化し、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．３ｍＭピラニン及び様々な濃度のラクトース（１ｍＭ～５ｍＭ）を含有する非緩衝クレブス液で少なくとも３回洗浄し、再懸濁する。懸濁液のｐＨを慎重に６．５に調整する一方、懸濁液を窒素で５分間バブリングし、二酸化炭素が溶解する結果としてｐＨが変化するのを防ぐため、細胞懸濁液の上に３０ｍＬ流動パラフィンを加える。この細胞懸濁液を蛍光測定（４５５ｎｍの励起波長及び５０９ｎｍの発光波長でフルオリメーターを使用する）用のアッセイプレートに直接移し替える。空の形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を陰性対照として、及び親株を陽性対照として使用して対照実験を実施する。
Ｃ．ラクトースをグルコース及びガラクトースに変換する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ
グルコースの非存在下では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は糖供給源としてラクトースを使用するため細菌性オペロンｌａｃオペロンを使用する。細菌性オペロンは、１つのｍＲＮＡ転写物から複数のタンパク質、ｌａｃオペロンの場合にはｌａｃＺ、ｌａｃＹ及びｌａｃＡを産生することが可能なポリシストロン性転写物である。ｌａｃＺ、ｌａｃＹ及びｌａｃＡの遺伝子産物は、それぞれ、ラクトースをグルコース及びガラクトースに切断するβ－ガラクトシダーゼ、細胞へのラクトースの輸送を可能にするβ－ガラクトシドパーミアーゼ、及びアセチル基をアセチル－ＣｏＡからガラクトシド、グルコシド及びラクトシドに転移させる酵素であるガラクトシドアセチルトランスフェラーゼである。ラクトースからグルコース及びガラクトースへの変換は酵素β－ガラクトシダーゼによって媒介され、この酵素の機能は、酵素活性アッセイを用いて直接測定することができる。
Ｄ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの合成及び精製
実施例１２及び１３に記載するとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを合成し、精製する。グルコースの非存在下での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳにおけるラクトース取込みを評価する。
Ｅ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳによるラクトースからグルコース及びガラクトースへの変換
酵素β－ガラクトシドパーミアーゼの活性を評価するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを収集し、例えばＥＭＢＬプロトコルによって記載されるとおり、初めに、タンパク質分解を防ぐためプロテアーゼ阻害薬を含む溶解緩衝液を用いて溶解させる。
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの市販のキット（カタログ番号Ｋ１４５５０１）を使用して、製造者の説明書を使用してこの酵素の活性を測定する。簡潔に言えば、β－ガラクトシダーゼはオルト－ニトロフェニル－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などのβ－ガラクトシドの加水分解を触媒する。ＯＮＰＧからＯＮＰアニオンへの加水分解により、鮮黄色が生じる。分光光度計又はマイクロプレートリーダーを使用してこの溶液のβ－ガラクトシダーゼ活性を定量化し、４２０ｎｍで変換された基質の量を決定する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株を陽性対照として使用する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳがラクトースを壊す能力は、ラクトース変換指数（Ｌ）［式中、Ｌ＝（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの酵素活性）／（親株の酵素活性）×１００］によって決まることになる。
実施例４２．プラスチック分解のためのＰＥＴアーゼ発現大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ
イデオネラ・サカイエンシス（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）は、ボトル再生利用施設の屋外から単離された、一般的なプラスチック、ポリ（エチレンテレフタラート）（ｐｏｌｙ－（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒａｐｈｔｈａｌａｔｅ））、即ちＰＥＴを壊して代謝することができる細菌である（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６）。これは酵素ＰＥＴアーゼを分泌し、ポリマーを壊して単量体にする。Ｉ．サカイエンシス（Ｉ．ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）ＰＥＴアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳは、広く使用されているプラスチックＰＥＴの分解能を有する（米国ではＰＥＴボトル単体で年間約３５憶ポンドが埋め立て処分場行きになっている）。
Ａ．ＰＥＴアーゼを発現させるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換
Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７によって記載されるプロトコルを用いてＰＥＴアーゼ合成大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ親株を合成する。簡潔に言えば、Ｎ末端２９アミノ酸を含まないイデオネラ・サカイエンシス（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）のＰＥＴアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＡＰ３８３７３．１）をｐＥＴ３２ａベクターに商業的にクローニング及びライゲートする。野生型又は変異体のいずれかのｐＥＴ３２ａ－ＰＥＴアーゼプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）細胞に形質転換し、それをＬＢ培地において３７℃で約０．８のＯＤ６００になるまで成長させて、次に０．６ｍＭイソプロピルβ－ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって１６℃で２４時間誘導する。親株をＰＥＴフィルム（以下のｃに記載する）と共にインキュベートしてＰＥＴアーゼ活性を確認する。
Ｂ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの合成及び精製
実施例１２及び１３に記載するとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを合成し、精製する。グルコースの非存在下での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳにおけるラクトース取込みを評価する。
Ｃ．ＰＥＴアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳを使用したＰＥＴの分解
イデオネラ・サカイエンシス（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）２０１－Ｆ６をＢＣＲＣから入手し、製造者の指示に従い培養する。これは、ＰＥＴアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の活性を測定するための陽性対照として働く。
Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６によって記載されるプロトコルを用いて、ＰＥＴを分解する能力を測定する。簡潔に言えば、Ｉ．サカイエンシス（Ｉ．ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳの培養した試料を、低い結晶化度のＰＥＴ薄膜（ＰＥＴフィルム）（約６０ｍｇ、２０×１５×０．２ｍｍ、Ｍｗ：４５×１０３、Ｍｗ／Ｍｎ：１．９、Ｔｇ：７７℃、Ｔｍ：２５５℃、結晶化度：１．９％、密度：１．３３７８ｇ／ｃｍ３）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁する。ＰＥＴフィルムを７０％エタノールで滅菌し、無菌空気で風乾させた後、試験管に入れる。この試験管を３０℃において３００ストローク／分で振盪する。
ＣＯ２生成の定量化をＰＥＴ分解の尺度として用いる。生成されたＣＯ２をＡｓｃａｒｉｔｅに捕捉し、重量を測定して吸収されたＣＯ２を計算する。バイオフィルム様材料及び処理済みＰＥＴフィルムを培地と分離して、分解されたフィルムの炭素量を決定する。ＰＥＴからＣＯ２への変換率（Ｒ）を以下のとおり計算する。
Figure 2022513709000010
式中、ＣＯ２（ＰＥＴ＋）及びＣＯ２（ＰＥＴ－）はＰＥＴのそれぞれ存在下及び非存在下で培養した生成ＣＯ２の炭素量を指す。
ＰＥＴアーゼ指数（Ｙ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳのプラスチック分解効率を測定し、これは以下のとおり計算する：
Ｙ＝Ｒ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤＡＳ）／Ｒ（Ｉ．サカイエンシス（Ｉ．ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ））
式中、Ｒは、上記に示す変換率を指す。
Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１８によって記載されるとおり、より高い活性を有し且つ分解されるプラスチックの範囲を増加させることが示されている突然変異型ＰＥＴアーゼ酵素を発現するようにＡＤＡＳを更に最適化することができる。
実施例４３．Ｔ４分泌装置を介したＲＮＡ分泌
Ｔ４ＳＳはＤＮＡの分泌能を有することが示されているが、更にはＴ４ＳＳがＲＮＡの分泌能を有することが示される必要がある。本例は、ＲＮＡへのＲＮＡ結合タンパク質のカップリングを介したＲＮＡの分泌について記載する。
Ａ．ＲＮＡ分泌Ｔ４分泌装置を有するアグロバクテリウムの合成
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に最適化されたＣａｓ９（Ｇｅｎｅｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２０１６から）及びトンブスウイルスｐ１９（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６６１０４）配列をｖｉｒＦプロモーター下でＶｉｒＥ２及びＶｉｒＦのＮ末端に融合する。ｓｇＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ配列もまたこの配列中、ｖｉｒＦプロモーターの制御下に置く。ＩＬＶ１に対するｓｇＲＮＡ配列については、Ｇｅｎｅｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２０１６に記載されている。プロトコルは、Ｖｅｒｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００５及びＶｅｒｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００に記載されるものに幾つかの変化を加えたとおりである。簡潔に言えば、プラスミドが商業的に合成され、それをＴ４ＳＳ装置を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びＴ４ＳＳ装置を含まないアグロバクテリウムに電気穿孔する。次にアグロバクテリウムをＬＢプレートで培養し、次に標準プロトコルにより成長させる。融合タンパク質の存在をウエスタンブロットで確かめる。更に、ＲＮＡ単離後にｓｇＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ配列をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒからの市販の小規模ＲＮＡ単離キットによるＱｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイで確かめる。
Ｂ．酵母へのＲＮＡのＴ４ＳＳ送達を実証する
酵母へのＴ４ＳＳの送達プロトコルについては、Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００３に記載される。簡単に言えば、アグロバクテリウム株を抗生物質を含む最少培地で一晩成長させて、回収し、誘導培地に希釈し、次に使用前に５時間成長させる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を標準培地で一晩成長させて、１：１０希釈し、更に５時間再び成長させる。アグロバクテリウム及び酵母の培養物を合わせて１：１混合し、硝酸セルロースフィルタ上で成長させる。６日間共培養した後、混合物をセフォタキシム含有酵母培地に播くことにより分析し、酵母コロニーを成長させ、ＲＮＡ単離後に送達されたＲＮＡの存在に関してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒからの市販の小規模ＲＮＡ単離キットによるＱｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイにより分析する。
Ｃ．酵母におけるＴ４ＳＳ媒介性ＤＮＡ編集を実証する
上述のプロトコルに従い、イソロイシン不含培地で酵母コロニーを成長させて、Ｔ４ＳＳを含む及び含まない並びにｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９カセットを含む及び含まないアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と共培養したものについてコロニーを測定する。
他の実施形態
本発明の一部の実施形態は、番号を付した以下のパラグラフの範囲内にある。
１．単離された高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）。
２．少なくとも：１００００ｎｍ２当たり１個、５０００ｎｍ２当たり１個、３５００ｎｍ２当たり１個、１０００ｎｍ２当たり１個のＡＴＰ合成酵素濃度を含む、パラグラフ１の高活性ＡＤＡＳ。
３．ＡＤＡＳが、εドメインを欠いているなど、任意選択で調節ドメインを欠いているＡＴＰ合成酵素を含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
４．光起電性プロトンポンプを更に含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
５．光起電性プロトンポンプがプロテオロドプシンである、パラグラフ４の高活性ＡＤＡＳ。
６．プロテオロドプシンが、未培養海洋細菌クレードＳＡＲ８６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ７３０１４．１からのプロテオロドプシンのアミノ酸配列を含む、パラグラフ５の高活性ＡＤＡＳ。
７．光起電性プロトンポンプがグロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）ロドプシンである、パラグラフ４の高活性ＡＤＡＳ。
８．光起電性プロトンポンプが、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ） ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ハロテリゲナ・トゥルクメニカ（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ ｔｕｒｋｍｅｎｉｃａ）、又はハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）からのバクテリオロドプシン、デルタロドプシン、又はハロロドプシンである、パラグラフ４の高活性ＡＤＡＳ。
９．レチナールを更に含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１０．レチナール合成タンパク質（又はタンパク質装置）、又はそれをコードする核酸を更に含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１１．１つ以上の解糖経路タンパク質を更に含む、前出のパラグラフ（ｐａｒａｇｒａｐｈｓｓ）のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１２．解糖経路タンパク質がホスホフルクトキナーゼ（Ｐｆｋ－Ａ）である、パラグラフ１１の高活性ＡＤＡＳ。
１３．Ｐｆｋ－ＡがＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ７９６のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１２の高活性ＡＤＡＳ。
１４．解糖経路タンパク質がトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）である、パラグラフ１２の高活性ＡＤＡＳ。
１５．ｔｐｉがＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ８５８のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１４の高活性ＡＤＡＳ。
１６．１つ以上の代謝的に非必須のタンパク質を欠いている、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１７．ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、又はこれらの組み合わせのうちの１つ以上を欠いている、及び、詳細な実施形態において、１つ以上のエンドリボヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｒｉｂｏｓｕｃｌｅａｓｅ）（ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼｈ、ＲＮアーゼＩＩＩ、ＲＮアーゼＬ、ＲＮアーゼＰｈｙＭなど）又はエキソリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＲ、ＲＮアーゼＰＨ、ＲＮアーゼＤなど）；又はセリン、システイン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びメタロプロテアーゼ；又は前述のいずれかの組み合わせを欠いている、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１８．細菌分泌装置を更に含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
１９．細菌分泌装置が、カーゴをＡＤＡＳ外膜を越えて動物、真菌、細菌、又は植物細胞などの標的細胞の中へと移行させる能力を有する、パラグラフ１８の高活性ＡＤＡＳ。
２０．細菌分泌装置が、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、又はＴ６ＳＳである、パラグラフ１８又は１９の高活性ＡＤＡＳ。
２１．細菌分泌装置がＴ３／４ＳＳである、パラグラフ１８又は１９の高活性ＡＤＡＳ。
２２．Ｔ３／４ＳＳが修飾されたエフェクター機能、例えば、ＳｏｐＤ２、ＳｏｐＥ、Ｂｏｐ、Ｍａｐ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＦ、ＮｌｅＣ、ＮｌｅＨ２、又はＮｌｅＥ２から選択されるエフェクターを有する、パラグラフ２１の高活性ＡＤＡＳ。
２３．修飾されたエフェクター機能が、核、ゴルジ、ミトコンドリア、アクチン、微絨毛、ＺＯ－１、微小管、又は細胞質の中への移行など、細胞内ターゲティングの機能である、パラグラフ２２の高活性ＡＤＡＳ。
２４．修飾されたエフェクター機能が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＮｌｅＥ２に基づく核ターゲティングである、パラグラフ２２の高活性ＡＤＡＳ。
２５．修飾されたエフェクター機能が、糸状仮足形成、タイトジャンクションの破壊、微絨毛の消失、又はＳＧＬＴ－１不活性化の機能である、パラグラフ２２の高活性ＡＤＡＳ。
２６．細菌分泌装置がＴ６ＳＳである、パラグラフ１８又は１９の高活性ＡＤＡＳ。
２７．Ｔ６ＳＳが、その天然宿主において、細菌を標的化し、且つその細菌を死滅させるエフェクターを含む、パラグラフ２６の高活性ＡＤＡＳ。
２８．Ｔ６ＳＳがプチダ菌（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｋ１－Ｔ６ＳＳに由来し、及び任意選択で、エフェクターがＴｋｅ２のアミノ酸配列（受託番号ＡＵＺ５９４２７．１）を含む、パラグラフ２６又はパラグラフ２７の高活性ＡＤＡＳ。
２９．Ｔ６ＳＳが、その天然宿主において、真菌を標的化し、且つ真菌を死滅させるエフェクターを含む、パラグラフ２６の高活性ＡＤＡＳ。
３０．Ｔ６ＳＳが霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ Ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に由来し、エフェクターがＴｆｅ１（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＳＭＤＢ１１＿ＲＳ０５５３０）又はＴｆｅ２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＳＭＤＢ１１＿ＲＳ０５３９０）のアミノ酸配列を含む、パラグラフ２９の高活性ＡＤＡＳ。
３１．細菌分泌装置がカーゴを細胞外に移行させる能力を有する、パラグラフ１８の高活性ＡＤＡＳ。
３２．細菌分泌装置が、Ｔ１ＳＳ、Ｔ２ＳＳ、Ｔ５ＳＳ、Ｔ７ＳＳ、Ｓｅｃ、又はＴａｔである、パラグラフ３１の高活性ＡＤＡＳ。
３３．膜に輸送体を含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
３４．輸送体が、グルコース、ナトリウム、カリウム、金属イオン、アニオン性溶質、カチオン性溶質、又は水に特異的である、パラグラフ３３の高活性ＡＤＡＳ。
３５．膜がターゲティング薬剤を含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
３６．ターゲティング薬剤が、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、又はＶＥＧＦ－Ｒなどの腫瘍抗原に向けられるナノボディなど、ナノボディである、パラグラフ３５の高活性ＡＤＡＳ。
３７．ターゲティング薬剤が、レクチン、例えばマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）など、糖質結合タンパク質である、パラグラフ３５の高活性ＡＤＡＳ。
３８．ターゲティング薬剤が、ＲＧＤモチーフ又はＣｅｎｄＲペプチドなど、腫瘍ターゲティングペプチドである、パラグラフ３５の高活性ＡＤＡＳ。
３９．ＡＤＡＳ膜が酵素を含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
４０．酵素が、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、又はこれらの組み合わせである、パラグラフ３９の高活性ＡＤＡＳ。
４１．酵素がＡＤＡＳ膜に化学的に、任意選択で外膜へのリンカーを介してコンジュゲートされる、パラグラフ３９又はパラグラフ４０の高活性ＡＤＡＳ。
４２．ＡＤＡＳの内部容積に分散したカーゴを含む、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳであって、カーゴが、核酸、リボソーム、ペプチド、ホルモン、アミノ酸、糖質、脂質、タンパク質、有機粒子、無機粒子、小分子、又はこれらの組み合わせを含む、高活性ＡＤＡＳ。
４３．ＡＤＡＳが細菌分泌装置とカーゴとを含み、任意選択でカーゴが、細菌分泌装置による細胞外移行を仕向ける部分を含み、例えば、一部の実施形態においてその部分が、Ｐｈｏ／Ｄ、Ｔａｔ、又は合成ペプチドシグナルである、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
４４．カーゴが、非修飾バージョンのカーゴと比較して安定性が向上するように修飾されている、パラグラフ４２又は４３のＡＤＡＳ。
４５．カーゴがタンパク質を含む、パラグラフ４２～４４のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
４６．タンパク質が、ホルモン、例えば、パラクリン、エンドクリン、オートクリンである、パラグラフ４５の高活性ＡＤＡＳ。
４７．タンパク質が、細胞質又は他の環境において約：１．０１、１．１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１０００００、１０００００００より高い安定性を有する、パラグラフ６０又はパラグラフ６１の高活性ＡＤＡＳ。
４８．カーゴが、アブシジン酸、オーキシン、サイトカイニン、エチレン、ジベレリン、又はこれらの組み合わせなど、植物ホルモンを含む、パラグラフ４２～４４のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
４９．カーゴが、免疫賦活薬、チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４の阻害薬）、抑制薬、スーパー抗原、小分子（シクロスポリンＡ、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、又はＳＴＩＮＧ作動薬（例えば、ＭＫ－１４５４））など、免疫調節薬である、パラグラフ４２～４４のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
５０．カーゴが、環状ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｔＲＮＡ又はこれらの組み合わせなど、ＲＮＡを含む、パラグラフ４２～４４のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
５１．カーゴがタンパク質コードｍＲＮＡを含む、パラグラフ５０の高活性ＡＤＡＳ。
５２．タンパク質コードｍＲＮＡが、酵素（例えば、及びヒトＰＢＧＤ（ｈＰＢＧＤ）ｍＲＮＡなど、肝酵素活性を付与する酵素）をコードするか、又は抗原をコードする、例えば、ＣＭＶ糖タンパク質ｇＢ及び／又は五量体複合体（ＰＣ））をコードするｍＲＮＡなど、免疫応答を引き出す抗原（強力で且つ持続性のある中和抗体力価を引き出すなど）をコードする、パラグラフ５１の高活性ＡＤＡＳ。
５３．ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、ｔＲＮＡ又はこれらの組み合わせなど、低分子非コードＲＮＡである、パラグラフ５０の高活性ＡＤＡＳ。
５４．ＲＮＡが、ｔＲＮＡ足場など、例えばステムループ（ｓｔｅｐ－ｌｏｏｐ）構造の付加によって安定化されている、パラグラフ５０～５３のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
５５．ＲＮＡが、例えばＡＤＡＳプラズムにおいて、約：１．０１、１．１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１０００００、１０００００００より高い安定性を有する、パラグラフ６５～７０のいずれか１つのＡＤＡＳ。
５６．高活性ＡＤＡＳがカーゴを分解しない、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＳＡＳ。
５７．カーゴが遺伝子編集システムを含む、パラグラフ４２又は４３の高活性ＡＤＡＳ。
５８．カーゴが、プラスミドなどのＤＮＡ、又は環状ＲＮＡであり、任意選択でＤＮＡ又は環状ＲＮＡがタンパク質コード配列を含む、パラグラフ５８の高活性ＡＤＡＳ。
５９．ＡＤＡＳが二重膜ＡＤＡＳである、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
６０．二重膜ＡＤＡＳが細菌分泌装置を更に含む、パラグラフ５９の高活性ＡＤＡＳ。
６１．細菌分泌装置が、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳから選択され、任意選択でＴ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳが、標的細胞の適応度に影響を与えない減弱化した又は非機能性のエフェクターを有する、パラグラフ６０の高活性ＡＤＡＳ。
６２．細菌性親株に由来する、パラグラフ５９～６１のいずれか１つの高活性ＡＤＡＳであって、親株が、植物片利共生菌（例えば、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））又は植物病原菌（例えば、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）又はシリンゲ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ））などの植物細菌又は片利共生ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、又はアクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．））又は病原性ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＨＥＣ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））などのヒト細菌、又は極限環境微生物、前述のいずれかの機能化派生株を含めたもの、例えば、抗微生物薬を分泌する、プラスチックを消化する、殺虫薬を分泌する、極限環境を生き延びる、ナノ粒子を作る、他の生物の中に組み込まれる、環境に応答する、及びレポーターシグナルを生じる、のうちの１つ以上を行うように細菌を誘導する機能性カセットなど、機能性カセットを含めたものから選択される、高活性ＡＤＡＳ。
６３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、又は赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）から選択される親株に由来する、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
６４．ＡＴＰ合成酵素を過剰発現するように操作又は誘導された親株に由来する、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
６５．ＡＤＡＳが、親株にとって異種のＡＴＰ合成酵素を含む、パラグラフ６４の高活性ＡＤＡＳ。
６６．親株が、機能性ＦｏＦ１ ＡＴＰ合成酵素を発現するように修飾される、パラグラフ６４又は６５の高活性ＡＤＡＳ。
６７．印加電圧（例えば、３７ｍＶ）、非大気中酸素濃度（例えば、１～５％Ｏ２、５～１０％Ｏ２、１０～１５％Ｏ２、２５～３０％Ｏ２）、低ｐＨ（約：４．５、５．０、５．５、６．０、６．５）、又はこれらの組み合わせから選択される条件下で培養された親株から入手される、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
６８．アルギニン（例えば、ａｒｇＡのノックアウト、株ＪＷ２７８６－１及びＮＫ５９９２など）、システイン ｃｙｓＥのノックアウト（株ＪＷ３５８２－２及びＪＭ１５など）、グルタミン、例えばｇｌｎＡのノックアウト（株ＪＷ３８４１－１及びＭ５００４など）、グリシン、例えばｇｌｙＡのノックアウト（株ＪＷ２５３５－１及びＡＴ２４５７など）、ヒスチジン、例えばｈｉｓＢのノックアウト（株ＪＷ２００４－１及びＳＢ３９３０など）、イソロイシン、例えばｉｌｖＡのノックアウト（株ＪＷ３７４５－２及びＡＢ１２５５など）、ロイシン、例えばｌｅｕＢのノックアウト（株ＪＷ５８０７－２及びＣＶ５１４など）、リジン、例えばｌｙｓＡのノックアウト（株ＪＷ２８０６－１及びＫＬ３３４など）、メチオニン、例えばｍｅｔＡのノックアウト（株ＪＷ３９７３－１及びＤＬ４１など）、フェニルアラニン、例えばｐｈｅＡのノックアウト（株ＪＷ２５８０－１及びＫＡ１９７など）、プロリン、例えばｐｒｏＡのノックアウト（株ＪＷ０２３３－２及びＮＫ５５２５など）、セリン、例えばｓｅｒＡのノックアウト（株ＪＷ２８８０－１及びＪＣ１５８など）、スレオニン、例えばｔｈｒＣのノックアウト（株ＪＷ０００３－２及びＧｉｆ ４１など）、トリプトファン、例えばｔｒｐＣのノックアウト（株ＪＷ１２５４－２及びＣＡＧ１８４５５など）、チロシン、例えばｔｙｒＡのノックアウト（株ＪＷ２５８１－１及びＮ３０８７など）、バリン／イソロイシン／ロイシン、例えばｉｌｖｄのノックアウト（株ＪＷ５６０５－１及びＣＡＧ１８４３１など）のうちの少なくとも１、２、３、４つ、又はそれ以上に関して栄養要求性の親株に由来する、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳ。
６９．細菌細胞から作成される、前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳであって、親株が、植物片利共生菌（例えば、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））又は植物病原菌（例えば、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）又はシリンゲ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ））などの植物細菌又は片利共生ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、又はアクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．））又は病原性ヒト細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＨＥＣ、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））などのヒト細菌、又は極限環境微生物、前述のいずれかの機能化派生株を含めたもの、例えば、抗微生物薬を分泌する、プラスチックを消化する、殺虫薬を分泌する、極限環境を生き延びる、ナノ粒子を作る、他の生物の中に組み込まれる、環境に応答する、及びレポーターシグナルを生じる、のうちの１つ以上を行うように細菌を誘導する機能性カセットなど、機能性カセットを含めたものから選択される、高活性ＡＤＡＳ。
７０．修飾された膜を含む、前出のパラグラフのいずれかの高活性ＡＤＡＳ。
７１．植物又は動物での免疫原性又は免疫刺激性が低くなるように膜が修飾される、パラグラフ７０の高活性ＡＤＡＳ。
７２．親株から作成される、パラグラフ７１の高活性ＡＤＡＳであって、親株の免疫刺激能力が、洗浄剤、酵素による産生後処理、又はＰＥＧによる官能化によって低下又は消失している、高活性ＡＤＡＳ。
７３．親株から作成される、パラグラフ７１の高活性ＡＤＡＳであって、親株のＬＰＳ合成経路のノックアウトを通じて、例えば、ｍｓｂＢ及び／又はｐｕｒＩをノックアウトすることにより膜が修飾されている。
７４．高浸透圧条件への曝露によって細胞壁欠損粒子を産生する親株から作成される、パラグラフ７１の高活性ＡＤＡＳ。
７５．前出のパラグラフのいずれか１つの高活性ＡＤＡＳを含む組成物。
７６．ＡＤＡＳを含む組成物であって、ＡＤＡＳの少なくとも約：８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％、又はそれ以上が細菌分泌装置を含有する、組成物。
７７．細菌分泌装置が、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ３／４ＳＳ、又はＴ６ＳＳのうちの１つである、パラグラフ７６の組成物。
７８．Ｔ３ＳＳを含む、ＡＤＡＳの組成物であって、ＡＤＡＳが、約：４００００、３５０００，３００００、２５０００、１９６００、１５０００、１００００、又は５０００ｎｍ２に１より高い平均Ｔ３ＳＳ膜密度を含む、組成物。
７９．ＡＤＡＳがネズミチフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）親株に由来する、パラグラフ７８の組成物。
８０．Ｔ３ＳＳを含むＡＤＡＳの組成物であって、ＡＤＡＳが、約：３０００００、２５００００、２０００００、１５００００、１０００００、５００００、２００００、１００００、５０００ｎｍ２に１より高い平均Ｔ３ＳＳ膜密度を含む、組成物。
８１．ＡＤＡＳがアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）親株に由来する、パラグラフ８０の組成物。
８２．ＡＤＡＳの組成物であって、ＡＤＡＳの少なくとも約：８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％、又はそれ以上が、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３／４ＳＳ、Ｔ６ＳＳを含めた細菌分泌装置であって、及び任意選択で、外因性糖質、リン酸産生合成酵素、光応答性タンパク質、細胞内移行タンパク質、酵素、機能性カーゴ、生物特異的エフェクター、融合タンパク質のうちの１つ以上を含む細菌分泌装置を含有する、組成物。
８３．ＡＤＡＳが高活性ＡＤＡＳである、パラグラフ７５～８２のいずれか１つの組成物。
８４．ＩＰ、ＩＶ、ＩＭ、経口、局所（クリーム、ゲル、軟膏、経皮パッチ）、エアロゾル、又は噴霧投与用に製剤化される、パラグラフ７５～８３のいずれか１つの組成物。
８５．液体製剤、又は凍結乾燥製剤である、パラグラフ７５～８４のいずれか１つの組成物。
８６．パラグラフ１～７４のＡＤＡＳのいずれか１つを作成する方法であって、ＡＤＡＳ形成を促進する条件下で親株（ｓｔａｉｎ）を培養すること、及びＡＤＡＳを回収することを含み、任意選択でＡＤＡＳを任意の残留親株細胞又は他の夾雑物から単離するステップを更に含む、方法。
８７．単一、二重、三重、又は四重栄養要求性親株を使用することを含む、パラグラフ８６の方法であって、前記親株が、ｆｔｓＺを発現するプラスミドを更に含む、方法。
８８．ｅｘｏＩ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：９４６５２９）及びｓｂｃＤ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：９４５０４９）ヌクレアーゼ、又はＩ－ＣｅｕＩ（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ３２７６１．１）ヌクレアーゼなどの誘導性ＤＮアーゼシステムで親株を形質転換することを含む、パラグラフ８６の方法。
８９．単一、二重、三重、又は四重栄養要求株を使用すること、及び誘導性ヌクレアーゼをコードするプラスミド上に補足遺伝子を有することを含む、パラグラフ８８の方法。
９０．親株が、印加電圧（例えば、３７ｍＶ）、非大気中酸素濃度（例えば、１～５％Ｏ２、５～１０％Ｏ２、１０～１５％Ｏ２、２５～３０％Ｏ２）、低ｐＨ（４．５～６．５）、又はこれらの組み合わせから選択される条件下で培養される、パラグラフ８６の方法。
９１．親株が鞭毛及び望ましくない分泌装置を欠いており、任意選択で鞭毛及び望ましくない分泌装置がλＲｅｄリコンビニアリングを用いて除去される、パラグラフ８６の方法。
９２．親株ゲノムから、ｆｌｈＤ及びｆｌｈＣなどの鞭毛制御遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲドメインを含有するプラスミドの挿入によって鞭毛制御成分が切り出される、パラグラフ８６の方法。
９３．ロドプシンコード遺伝子を含有するプラスミドを含むＡＤＡＳが光の存在下で培養される、高活性ＡＤＡＳを作成する方法。
９４．ロドプシンが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ７３０１４．１のアミノ酸配列を有するＳＡＲ８６未培養細菌からのプロテオロドプシンであり、更に任意選択で培養物にレチナールが補足される、パラグラフ９３の方法。
９５．ロドプシンがプロテオロドプシンであり、プラスミドが、レチナールを合成する遺伝子を更に含有する（かかるプラスミドは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，２０１２からのｐＡＣＹＣ－ＲＤＳプラスミドである）、パラグラフ９３又は９４の方法。
９６．親株が、次にはＡＤＡＳの膜上に発現するナノボディをコードする核酸配列を含有する、パラグラフ８６～９５のいずれか１つの方法。
９７．親株が、１つ以上の細菌分泌装置オペロンをコードする核酸配列を含有する、パラグラフ８６～９５のいずれか１つの方法。
９８．親株がカーゴを含む、パラグラフ８６～９７のいずれか１つの方法。
９９．親株が、小分子カーゴを合成する一組の遺伝子をコードする核酸配列を含有する、パラグラフ８６～９７のいずれか１つの方法。
１００．パラグラフ８６～９９のいずれか１つの方法によって作成されるＡＤＡＳ。
１０１．動物細胞の状態を調節する方法であって、前出のパラグラフのいずれか１つのＡＤＡＳ又は組成物の有効量に動物細胞への到達手段を提供することを含む、方法。
１０２．ＡＤＡＳ又は組成物に、ヒトなどの哺乳類など、動物体内においてインビボで動物細胞への到達手段が提供される、パラグラフ１０１の方法。
１０３．動物細胞が、健常動物体内で細菌に曝露される、パラグラフ１０２の方法。
１０４．動物細胞が、肺上皮、免疫細胞、皮膚細胞、口腔上皮細胞、腸上皮細胞、生殖器上皮細胞、又は尿路細胞である、パラグラフ１０３の方法。
１０５．動物細胞が、クローン病又は大腸炎などの炎症性腸疾患を有するヒト対象からの腸上皮細胞など、腸上皮細胞である、パラグラフ１０４の方法。
１０６．動物細胞が、炎症性腸疾患を有する対象からの腸上皮細胞であり、ＡＤＡＳが、細菌分泌装置と抗炎症剤を含むカーゴとを含む、パラグラフ１０５の方法。
１０７．動物細胞が罹患状態で細菌に曝露される、パラグラフ１０２の方法。
１０８．動物細胞が、腫瘍など、病原性である、パラグラフ１０２の方法。
１０９．動物細胞が、創傷、潰瘍、腫瘍、又は炎症性障害など、罹患状態で細菌に曝露される、パラグラフ１０２の方法。
１１０．ＡＤＡＳが動物片利共生親株に由来する、パラグラフ１０２～１０９のいずれか１つの方法。
１１１．ＡＤＡＳが動物病原性親株に由来する、パラグラフ１０２～１０９のいずれか１つの方法。
１１２．動物細胞が、Ｔ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳに接触し、カーゴが動物細胞に送達される、パラグラフ１０２のいずれか１つの方法。
１１３．動物細胞に、カーゴと分泌装置とを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、カーゴが細胞外に分泌されて動物細胞と接触する、パラグラフ１０２の方法。
１１４．動物細胞の状態を調節する方法であって、パラグラフ１～８５のいずれか１つの有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、動物細胞の近傍にある細菌又は真菌細胞への到達手段を提供することを含む、方法。
１１５．細菌又は真菌細胞が病原性である、パラグラフ１１４の方法。
１１６．病原性細菌又は真菌細胞の適応度が低下する、パラグラフ１１５の方法。
１１７．細菌又は真菌細胞が片利共生性である、パラグラフ１１４の方法。
１１８．片利共生細菌又は真菌細胞の適応度が増加する、パラグラフ１１７の方法。
１１９．適応度が、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は真菌数の適応度の低下により増加する、パラグラフ１１８の方法。
１２０．細菌又は真菌細胞をＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳに接触させて、カーゴが細菌又は真菌細胞に送達される、パラグラフ１１４の方法。
１２１．細菌又は真菌細胞に、細菌又は真菌細胞と接触するカーゴを細胞外に分泌する有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供される、請求項１２０の方法。
１２２．ＡＤＡＳが、細菌又は真菌細胞の競合者である親株に由来する、パラグラフ１１４～１２１のいずれか１つの方法。
１２３．ＡＤＡＳが、細菌又は真菌細胞の相利共生細菌である親株に由来する、パラグラフ１１４～１２１のいずれか１つの方法。
１２４．植物又は真菌細胞の状態を調節する方法であって、パラグラフ１～８５のいずれか１つの有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、ａ）植物又は真菌細胞、ｂ）植物又は真菌細胞の近傍にある隣接細菌又は隣接真菌細胞、又はｃ）植物又は真菌細胞の近傍にある昆虫又は線虫細胞への到達手段を提供することを含む、方法。
１２５．ＡＤＡＳ又は組成物に、例えば、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、及びコメを含めた条植え作物、並びにトマト及びトウガラシなどのナス科植物；メロン及びキュウリなどのウリ科植物；キャベツ及びブロッコリーなどのアブラナ科植物；ケール及びレタスなどの葉物野菜；ジャガイモ及びニンジンなどの塊根及び塊茎；マメ類及びトウモロコシなどの大型種子野菜；及びキノコ類を含めた野菜作物など、作物植物体内においてインプランタで植物細胞への到達手段が提供される、パラグラフ１２４の方法。
１２６．植物又は真菌細胞が健常植物又は真菌体内で細菌に曝露される、パラグラフ１２５の方法。
１２７．植物又は真菌細胞が罹患状態で細菌に曝露される、パラグラフ１２５の方法。
１２８．植物又は真菌細胞が、分裂組織細胞などの分裂細胞であるか、又は腫瘍などの病原性細胞である、パラグラフ１２５の方法。
１２９．植物又は真菌細胞が創傷などの罹患状態で細菌に曝露されるか、或いは植物又は真菌細胞はヒトの食物の一部ではない、パラグラフ１２５の方法。
１３０．ＡＤＡＳが片利共生親株に由来する、パラグラフ１２４～１２９のいずれか１つの方法。
１３１．ＡＤＡＳが植物又は真菌病原性親株に由来する、パラグラフ１２４～１２９のいずれか１つの方法。
１３２．ＡＤＡＳがＴ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含み、カーゴが植物又は真菌細胞に送達される、パラグラフ１２４の方法。
１３３．植物又は真菌細胞に細菌分泌装置とカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、細菌分泌装置がカーゴを細胞外に分泌し、それによって植物又は真菌細胞がカーゴと接触する、請求項１２４の方法。
１３４．有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、植物又は真菌細胞の近傍にある隣接細菌又は隣接真菌細胞への到達手段を提供することを含む、パラグラフ１２４の方法。
１３５．隣接細菌又は隣接真菌細胞が病原性であり、任意選択で病原性隣接細菌又は隣接真菌細胞の適応度が低下する、請求項１３４の方法。
１３６．隣接細菌又は隣接真菌細胞が片利共生性であり、任意選択で片利共生隣接細菌又は隣接真菌細胞の適応度が増加する、請求項１３４の方法。
１３７．適応度が、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は競合真菌の減少によって増加する、パラグラフ１３６の方法。
１３８．隣接細菌又は隣接真菌細胞が、Ｔ３／４ＳＳ又はＴ６ＳＳとカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳに接触し、カーゴが隣接細菌又は隣接真菌細胞に送達される、パラグラフ１３４の方法。
１３９．隣接細菌又は隣接真菌細胞に、細菌分泌装置とカーゴとを含む有効量のＡＤＡＳへの到達手段が提供され、細菌分泌装置がカーゴを細胞外に分泌し、それによって隣接細菌又は隣接真菌細胞がカーゴと接触する、パラグラフ１３４の方法。
１４０．ＡＤＡＳが、隣接細菌又は隣接真菌細胞の競合者である親株に由来する、パラグラフ１３４～１３９のいずれか１つの方法。
１４１．ＡＤＡＳが、隣接細菌又は隣接真菌細胞の相利共生細菌である親株に由来する、パラグラフ１３４～１３９のいずれか１つの方法。
１４２．有効量のＡＤＡＳ又は組成物に、植物又は真菌の近傍にある昆虫又は線虫細胞への到達手段を提供することを含む、パラグラフ１２４の方法。
１４３．昆虫又は線虫が病原性である、パラグラフ１４２の方法。
１４４．病原性昆虫又は線虫細胞の適応度が低下する、パラグラフ１４２の方法。
１４５．病原性昆虫又は線虫細胞の適応度が、昆虫又は線虫細胞の共生者の調節によって低下する、パラグラフ１４４の方法。
１４６．昆虫又は線虫が片利共生性である、パラグラフ１４２の方法。
１４７．片利共生昆虫又は線虫細胞の適応度が増加する、パラグラフ１４６の方法。
１４８．適応度が、中性、片利共生性、又は病原性であり得る競合細菌又は真菌の減少によって増加する、パラグラフ１４７の方法。
１４９．パラグラフ１～８４のいずれか１つのＡＤＡＳ又は組成物など、ＡＤＡＳの有効量を環境に接触させることを含む、環境から１つ以上の望ましくない材料を除去する方法であって、ＡＤＡＳが、１つ以上の望ましくない材料を取り込む、キレート化する、又は分解する１つ以上の分子（タンパク質、ポリマー、ナノ粒子、結合剤、又はこれらの組み合わせなど）を含む、方法。
１５０．望ましくない材料が水銀などの重金属を含み、ＡＤＡＳが、水銀に対するＭｅｒＲなど、重金属と結合する１つ以上の分子（タンパク質、ポリマー、ナノ粒子、結合剤、又はこれらの組み合わせなど）を含む、パラグラフ１４９の方法。
１５１．望ましくない材料がＰＥＴなどのプラスチックを含み、ＡＤＡＳが、ＰＥＴアーゼなど、１つ以上のプラスチック分解酵素を含む、パラグラフ１４９の方法。
１５２．望ましくない材料が１つ以上の有機小分子を含み、ＡＤＡＳが、前記１つ以上の有機小分子の代謝能を有する１つ以上の酵素を含む、パラグラフ１４９の方法。
１５３．細菌又はＡＤＡＳを含む組成物であって、細菌又はＡＤＡＳが、Ｔ４ＳＳと、ＲＮＡ結合タンパク質カーゴと、ＲＮＡ結合タンパク質が結合する、且つＴ４ＳＳを通じた標的細胞への送達に好適なＲＮＡカーゴとを含む、組成物。
１５４．ＲＮＡ結合タンパク質が、ＶｉｒＥ２及びＶｉｒＦに融合したＣａｓ９であり、ＲＮＡカーゴがガイドＲＮＡであり、及び、任意選択で、Ｔ４ＳＳがアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ装置である、パラグラフ１５３の組成物。
１５５．ＲＮＡ結合タンパク質が、ＶｉｒＥ２又はＶｉｒＦに融合したカーネーションイタリア輪紋ウイルスのｐ１９であり、ＲＮＡカーゴがｓｉＲＮＡであり、任意選択でＴ４ＳＳがアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ装置である、パラグラフ１５３の組成物。
１５６．ＶｉｒＥ２及びＶｉｒＦに融合したＣａｓ９とＲＮＡカーゴとを含有するプラスミドがアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞にトランスフェクトされる、パラグラフ１５６の組成物を作成する方法。
１５７．植物細胞又は動物細胞にＲＮＡを送達する方法であって、前記植物細胞又は動物細胞に細菌又はＡＤＡＳを接触させることを含み、細菌又はＡＤＡＳがＴ４ＳＳとＲＮＡ結合タンパク質カーゴとＲＮＡカーゴとを含む、方法。
１５８．植物細胞又は動物細胞にＲＮＡ及びタンパク質を送達する方法であって、前記植物細胞又は動物細胞に細菌又はＡＤＡＳを接触させることを含み、細菌又はＡＤＡＳがＴ４ＳＳとＲＮＡ結合タンパク質カーゴとＲＮＡカーゴとを含む、方法。

Claims (130)

  1. 複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない組成物の製造方法であって、
    （ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；
    （ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に前記親細菌を曝露すること；及び
    （ｃ）前記ミニ細胞を前記親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない複数のＡＤＡＳを含む組成物を作製すること
    を含む方法。
  2. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子がｍｉｎＥポリペプチドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記親細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、前記ｍｉｎＥポリペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記親細菌がネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であり、前記ｍｉｎＥポリペプチドがネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｉｎＥである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記親細菌が、Ｚリング阻害タンパク質のレベル又は活性の低下を呈する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記Ｚリング阻害タンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記Ｚリング阻害タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記Ｚリング阻害タンパク質がｍｉｎＣポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
  11. 前記Ｚリング阻害タンパク質がｍｉｎＤポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ＡＤＡＳが少なくとも２つのＺリング阻害タンパク質の発現の低下を呈する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ＡＤＡＳが、ｍｉｎＣポリペプチド及びｍｉｎＤポリペプチドの発現の低下を呈する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＡＤＡＳが、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの発現の低下を呈する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号４と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号４と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子がＤｉｖＩＶＡポリペプチドである、請求項１、１５、及び１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記親細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、前記細胞分裂トポロジー特異性因子が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡである、請求項１７に記載の方法。
  19. レベル又は活性の前記低下が機能喪失型突然変異によって起こる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記機能喪失型突然変異がｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失又はＤｉＶＩＶＡの欠失である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＡＤＡＳが、少なくとも１ｍＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は５０ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記親細菌が、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブクネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンディダトゥス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロコスフェエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、デクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、デスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルフォタレア属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マグネトスピリルム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ルブリビバックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シンビオバクテリウム属（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はサーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）細菌であり、前記細胞分裂トポロジー特異性因子が前記親細菌の内因性ｍｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡである、請求項２１に記載の方法。
  23. ステップ（ｃ）の前記組成物が、１００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）未満の生存細菌細胞を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. ステップ（ｃ）の前記組成物が、１０ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は０．１ＣＦＵ／ｍＬ未満の生存細菌細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＡＤＡＳがカーゴを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記組成物が動物への送達用に製剤化される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記組成物が植物への送達用に製剤化される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記組成物が昆虫への送達用に製剤化される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記組成物が、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル、又は気体組成物として製剤化される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物であって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まない、組成物。
  31. 前記ＡＤＡＳが、少なくとも１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、２ｍＭ、又は２．５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する、請求項３０に記載の組成物。
  32. 複数の高活性ＡＤＡＳを含む組成物であって、前記ＡＤＡＳが少なくとも３ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まない、組成物。
  33. 前記ＡＤＡＳが、少なくとも４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、又は５０ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有する、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記ＡＤＡＳのＡＴＰ濃度が、３７℃で１２時間インキュベートした後に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％増加する、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来する、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、前記ＡＤＡＳが細胞分裂トポロジー特異性因子を含まず、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まない、組成物。
  37. 複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、生存細菌細胞を実質的に含まない、且つ
    （ａ）細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する複数の親細菌を作成、提供、又は入手すること；
    （ｂ）ミニ細胞の形成を許容する条件に前記親細菌を曝露すること；及び
    （ｃ）前記ミニ細胞を前記親細菌から分離することであって、それにより生存細菌細胞を実質的に含まない組成物を作製すること
    を含む方法によって作製される組成物。
  38. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号１と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子がｍｉｎＥポリペプチドである、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記親細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、前記ｍｉｎＥポリペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｉｎＥである、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記親細菌がネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であり、前記ｍｉｎＥポリペプチドがネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｉｎＥである、請求項４２に記載の組成物。
  43. 前記親細菌が、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブクネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンディダトゥス属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロコスフェエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、デクロロモナス属（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、デスルフィトバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デスルフォタレア属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グロエオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マグネトスピリルム属（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ルブリビバックス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アイアカシオ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ウィグルスウォーチア属（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デイノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エクシグオバクテリウム属（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、モーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シンビオバクテリウム属（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はサーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）細菌であり、及び前記細胞分裂トポロジー特異性因子が前記親細菌の内因性ｍｉｎＥ又はＤｉｖＩＶＡである、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ＡＤＡＳがＺリング阻害タンパク質のレベルの低下を呈する、請求項３０～４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記Ｚリング阻害タンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記Ｚリング阻害タンパク質が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記Ｚリング阻害タンパク質がｍｉｎＣポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
  48. 前記Ｚリング阻害タンパク質がｍｉｎＤポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
  49. 前記ＡＤＡＳが少なくとも２つのＺリング阻害タンパク質の発現の低下を呈する、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記ＡＤＡＳが、ｍｉｎＣポリペプチド及びｍｉｎＤポリペプチドの発現の低下を呈する、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記ＡＤＡＳが、ｍｉｎＣポリペプチド、ｍｉｎＤポリペプチド、及びｍｉｎＥポリペプチドの発現の低下を呈する、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号４と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３５～５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子が、配列番号４と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記細胞分裂トポロジー特異性因子がＤｉｖＩＶＡポリペプチドである、請求項５２又は５３に記載の組成物。
  55. 前記親細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、前記細胞分裂トポロジー特異性因子が枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤｉｖＩＶＡである、請求項５３又は５４に記載の組成物。
  56. レベル又は活性の前記低下が機能喪失型突然変異によって起こる、請求項３５～５１のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記機能喪失型突然変異が遺伝子欠失である、請求項５６に記載の組成物。
  58. 前記機能喪失型突然変異が誘導性機能喪失型突然変異であり、機能喪失が、前記親細胞を誘導条件に曝露することによって誘導される、請求項５６又は５７に記載の組成物。
  59. 前記誘導性機能喪失型突然変異が温度感受性突然変異であり、前記誘導条件が温度条件である、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記親細胞がｍｉｎＣＤＥオペロンの欠失を有する、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ＡＤＡＳが機能性転写装置と機能性翻訳装置とを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の組成物。
  62. 前記ＡＤＡＳが異種タンパク質を産生する、請求項６１に記載の組成物。
  63. 前記ＡＤＡＳが、プラスミドであって、誘導性プロモーターと前記異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを含み、前記ＡＤＡＳを適切な条件下で前記誘導性プロモーターの誘導物質と接触させると、前記異種タンパク質が産生されることになる、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記異種タンパク質の産生が、前記誘導物質と接触させていないＡＤＡＳと比べて前記誘導物質と接触させたＡＤＡＳにおいて少なくとも１．６倍に増加する、請求項６３に記載の組成物。
  65. 前記異種タンパク質の前記産生速度が、前記ＡＤＡＳを前記誘導物質と接触させてから３時間以内に目標レベルに達する、請求項６４に記載の組成物。
  66. 前記異種タンパク質が少なくとも各ＡＤＡＳにつき毎時０．１フェムトグラムの速度で産生される、請求項６４又は６５に記載の組成物。
  67. 前記異種タンパク質が、少なくとも８時間の持続期間にわたって産生される、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の組成物。
  68. １００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）未満の生存細菌細胞を含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. １０ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は０．１ＣＦＵ／ｍＬ未満の生存細菌細胞を含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記ＡＤＡＳがカーゴを含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. 前記カーゴが、核酸、プラスミド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、アミノ酸、小分子、遺伝子編集システム、ホルモン、免疫調節薬、糖質、脂質、有機粒子、無機粒子、又はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）である、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記カーゴが前記ＡＤＡＳに封入される、請求項７１に記載の組成物。
  73. 前記カーゴが前記ＡＤＡＳの表面に取り付けられる、請求項７１に記載の組成物。
  74. 前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はプラスミドである、請求項７１に記載の組成物。
  75. 前記核酸がタンパク質をコードする、請求項７１又は７４に記載の組成物。
  76. 前記酵素が、標的産物が産生されるように基質を変化させる、請求項７１に記載の組成物。
  77. 前記基質が前記ＡＤＡＳに存在し、前記標的産物が前記ＡＤＡＳにおいて産生される、請求項７６に記載の組成物。
  78. 前記基質が、前記ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する、請求項７６に記載の組成物。
  79. 前記ＡＤＡＳが異種細菌分泌装置を含む、請求項１～７８のいずれか一項に記載の組成物。
  80. 前記異種細菌分泌装置が３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）である、請求項７９に記載の組成物。
  81. 前記カーゴが、前記細菌分泌装置による細胞外移行を仕向ける部分を含む、請求項７９又は８０に記載の組成物。
  82. 前記ＡＤＡＳがターゲティング部分を含む、請求項１～８１のいずれか一項に記載の組成物。
  83. 前記ターゲティング部分が、ナノボディ、糖質結合タンパク質、又は腫瘍ターゲティングペプチドである、請求項８２に記載の組成物。
  84. 前記ＡＤＡＳが、野生型親細菌から作製されたＡＤＡＳと比べてプロテアーゼレベル又は活性の低下を呈する、請求項１～８３のいずれか一項に記載の組成物。
  85. 前記ＡＤＡＳが、少なくとも１つのプロテアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記ＡＤＡＳが、野生型親（ｐａｔｅｎｔ）細菌から作製されたＡＤＡＳと比べてＲＮアーゼレベル又は活性の低下を呈する、請求項１～８５のいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記ＡＤＡＳが、少なくとも１つのＲＮアーゼの発現が低下又は消失するように修飾されている親細菌から作製される、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記ＲＮアーゼがエンドリボヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、請求項８６又は８７に記載の組成物。
  89. 前記ＡＤＡＳが、低下したリポ多糖（ＬＰＳ）を呈するように修飾されている、請求項１～８８のいずれか一項に記載の組成物。
  90. 前記ＡＤＡＳが、低下したＬＰＳを呈するように修飾されている親細菌から作製される、請求項６０に記載の組成物。
  91. 前記修飾が、リピドＡ生合成ミリストイルトランスフェラーゼ（ｍｓｂＢ）の突然変異である、請求項８９に記載の組成物。
  92. 前記ＡＤＡＳが、哺乳類病原体又は哺乳類片利共生細菌である親細菌に由来する、請求項１～９１のいずれか一項に記載の前記組成物。
  93. 前記哺乳類片利共生細菌が、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、又はアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種であり、又は哺乳類病原性細菌が、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ）、又はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）である、請求項９２に記載の組成物。
  94. 前記ＡＤＡＳが、植物病原体又は植物片利共生細菌である親細菌に由来する、請求項１～９１のいずれか一項に記載の組成物。
  95. 前記植物片利共生細菌が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプチダ菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）であり、又は前記植物病原性細菌がキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種又はシリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）である、請求項９４に記載の組成物。
  96. 前記ＡＤＡＳが栄養要求性親細菌に由来する、請求項１～９５のいずれか一項に記載の組成物。
  97. 前記ＡＤＡＳが凍結乾燥及び再構成され、前記再構成されたＡＤＡＳが、凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度の少なくとも９５％であるＡＴＰ濃度を有する、請求項１～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  98. 前記再構成されたＡＤＡＳが、凍結乾燥されていないＡＤＡＳのＡＴＰ濃度と少なくとも等しいＡＴＰ濃度を有する、請求項９７に記載の組成物。
  99. 動物への送達用に製剤化される、請求項１～９８のいずれか一項に記載の組成物。
  100. 腹腔内、静脈内、筋肉内、経口、局所、エアロゾル、又は噴霧投与用に製剤化される、請求項９９に記載の組成物。
  101. 植物への送達用に製剤化される、請求項１～９８のいずれか一項に記載の組成物。
  102. 昆虫への送達用に製剤化される、請求項１～９７のいずれか一項に記載の組成物。
  103. 液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル、又は気体組成物として製剤化される、請求項９９～１０２のいずれか一項に記載の組成物。
  104. 標的細胞への高活性ＡＤＡＳの送達方法であって、
    （ａ）複数の高活性ＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記標的細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させること
    を含む、方法。
  105. 標的細胞へのＡＤＡＳの送達方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記標的細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させること
    を含む、方法。
  106. 前記標的細胞が動物細胞である、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  107. 前記標的細胞が植物細胞である、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  108. 前記標的細胞が昆虫細胞である、請求項１０４又は１０５に記載の方法。
  109. 標的細胞へのカーゴの送達方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、前記ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記標的細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させること
    を含む、方法。
  110. 標的細胞へのカーゴの送達方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、前記ＡＤＡＳがカーゴを含み、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記標的細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させること
    を含む、方法。
  111. 前記標的細胞が動物細胞である、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
  112. 前記標的細胞が植物細胞である、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
  113. 前記標的細胞が昆虫細胞である、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
  114. 動物細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記動物細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記動物細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  115. 植物細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記植物細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記植物細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  116. 昆虫細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記昆虫細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記昆虫細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  117. 動物細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記動物細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記動物細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  118. 植物細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記植物細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記植物細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  119. 昆虫細胞の状態を調節する方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記昆虫細胞をステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それによって前記昆虫細胞の状態が調節されること
    を含む、方法。
  120. それを必要としている動物を処置する方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記動物を有効量のステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それにより前記動物を処置すること
    を含む、方法。
  121. それを必要としている動物を処置する方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記動物を有効量のステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それにより前記動物を処置すること
    を含む、方法。
  122. 前記動物が癌を有する、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  123. 前記ＡＤＡＳが化学療法カーゴを担持する、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記ＡＤＡＳが免疫療法カーゴを担持する、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  125. それを必要としている植物を処置する方法であって、
    （ａ）複数の高活性非染色体性動的活性システム（ＡＤＡＳ）を含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが少なくとも１．２５ｍＭの初期ＡＴＰ濃度を有し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記植物又はその有害生物を有効量のステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それにより前記植物を処置すること
    を含む、方法。
  126. それを必要としている植物を処置する方法であって、
    （ａ）複数のＡＤＡＳを含む組成物を提供することであって、前記ＡＤＡＳが、細胞分裂トポロジー特異性因子のレベル又は活性の低下を呈する親細菌に由来し、及び前記組成物が生存細菌細胞を実質的に含まないこと；及び
    （ｂ）前記植物又はその有害生物を有効量のステップ（ａ）の前記組成物と接触させることであって、それにより前記植物を処置すること
    を含む、方法。
  127. 複数のＡＤＡＳを含む組成物であって、前記ＡＤＡＳが酵素を含み、及び前記酵素が、標的産物が産生されるように基質を変化させる、組成物。
  128. 前記基質が前記ＡＤＡＳに存在し、前記標的産物が前記ＡＤＡＳにおいて産生される、請求項１２７に記載の組成物。
  129. 前記基質が、前記ＡＤＡＳが送達される標的細胞又は環境に存在する、請求項１２７又は１２８に記載の組成物。
  130. 前記酵素がジアデニル酸シクラーゼＡであり、前記基質がＡＴＰであり、及び前記標的産物が環状ジ－ＡＭＰである、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の組成物。
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