CN116897200A - 基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小rna用于预防或治疗应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产靶向动物病原体的致病因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的小RNA的新方法。该方法还包括生产针对宿主易感因子的小RNA，已知其沉默、失活或缺失会增强对靶向病原体的抗性。更具体地，本发明涉及在小球藻(Chlorella)细胞中表达外源性RNA干扰(RNAi)前体，所述小球藻细胞转而表达并释放细胞外囊泡(EV)包埋的抗菌小RNA。重要地，小球藻EV保护抗菌小RNA免受核糖核酸酶介导的消化。它们也被人肺泡上皮细胞快速且有效地内化，突出了它们在这些细胞中递送抗菌小RNA和控制呼吸道感染的潜力。本发明因此可以用于预防或治疗，以减少动物(包括人)的各种感染性疾病。此外，因为在光生物反应器中生产时和在冷冻储存时，小球藻EV的完整性和功能性保持不变，所以该新方法具有进一步开发用于基于EV的抗感染产品产业化的潜力。

Description

基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小RNA用于预防或治疗 应用
技术领域
本发明涉及一种生产靶向动物病原体的致病因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的小RNA的新方法。该方法还包括生产针对宿主易感因子的小RNA，已知其沉默、失活或缺失会增强对靶向病原体的抗性。更具体地，本发明涉及在小球藻(Chlorella)细胞中表达外源性RNA干扰(RNAi)前体，所述小球藻细胞转而表达并释放细胞外囊泡(EV)包埋和/或相关的抗菌小RNA。重要地，小球藻EV保护抗菌小RNA免受核糖核酸酶介导的消化。它们也被人肺泡上皮细胞快速且有效地内化，突出了它们在这些细胞中递送抗菌小RNA和控制呼吸道感染的潜力。本发明因此可以用于预防或治疗，以减少动物(包括人)的各种感染性疾病。此外，因为在光生物反应器中生产时和在冷冻储存时，小球藻EV的完整性和功能性保持不变，所以该新方法具有进一步开发用于基于EV的抗感染产品产业化的潜力。
背景技术
感染性疾病塑造了人类历史，在使用药用植物的很久以后，亚历山大·弗莱明爵士在20年代后期发现了抗生素。他的开创性工作导致了1945年至1960年抗生素发现的“黄金时代”。这一时期之后，新抗生素的鉴定急剧下降，主要是因为从天然产物或合成分子集合中鉴定新的抗菌素类别的挑战，但也是因为工业重点从发现转移到了现有抗生素化学支架的化学修饰。此外，由于迅速出现抗菌素耐药机制，鉴定和进一步开发新型抗生素所需的大量投资在经济上没有得到回报。实际上，抗生素的过度使用和滥用以及这些抗菌剂对细菌存活施加的强大选择压力，已经导致快速选择多重耐药细菌，这些细菌对人类健康的威胁现在越来越大。因此，如果我们想管理细菌性疾病，就迫切需要控制多重耐药细菌，并不断鉴定新型抗生素或抗生素的替代品。
病毒病原体也是对人类健康的主要威胁。在过去几十年中，由于气候变化、旅行便利和当地生态系统的变化(包括生物多样性的减少)以及抗病毒药物耐药性的出现，导致出现了人畜共患病毒病原体(Howard等人，2012；Strasfeld&Chou，2010)。病毒感染可以对人类健康产生重大影响，例如2014-2015年西非的埃博拉爆发导致超过11000名感染者死亡(Kaner&Schaack，2016)。另一个例子是蚊子传播的寨卡病毒的爆发，于2015年在巴西开始并在美洲、太平洋、亚洲和非洲传播(2017年在美国鉴定了最近一例确诊病例)。在过去二十年中，还观察到三种冠状病毒(CoV)疾病的爆发。严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)、中东呼吸综合征(MERS-CoV)和SARS-CoV-2病毒由于其对人群的致命影响而引起全球关注。例如，作为COVID-19病原体的SARS-CoV-2目前以大流行水平传播，已在全球造成超过400万人死亡以及前所未有的社会和经济混乱。这突出显示有必要定期鉴定针对人病原体的新解决方案，据估计人病原体每年造成1400万人死亡。它还强调需要开发多功能治疗平台，以允许快速生产针对任何新出现的病原体的靶向抗菌剂，以控制非预期感染性疾病(现在被世界卫生组织(WHO)称为“X疾病”)。
发明内容
结果和发明概述
在下面的结果中，发明人在本文中提供了小球藻细胞可以生产细胞外囊泡(EV)的最先证据。他们还首次证明了可以工程改造小球藻以生产EV包埋和/或与EV相关的生物活性抗菌小RNA。更具体地，他们通过用与来自植物病原菌的关键毒力因子具有序列同源性的反向重复转基因来转化普通小球藻(C.Vulgaris)，表明小球藻EV能够在细菌细胞中递送有效小RNA，从而抑制所述细菌细胞的致病性。此外，他们表明小球藻EV保护这些抗菌小RNA免受非特异性微球菌核酸酶介导的消化。因此，这些数据突出显示了小球藻EV作为向细菌病原体递送小RNA的载体的潜力。此外，因为已知植物EV在人相关肠道细菌中递送有效抗菌小RNA(Teng等人，2018)，而且在植物病原真菌和卵菌中也是如此(Cai等人，2018；Hou等人，2019)，所以预计小球藻EV将用于在对动物(包括人)具有致病性的广谱细菌、真菌和卵菌生物体中递送抗菌小RNA。
哺乳动物病原体使用复杂的策略以进入宿主细胞并在其中复制。出于该目的，它们通常劫持宿主细胞因子(此处称为宿主易感因子(HSF))。为了开发通过直接靶向病原体RNA或通过间接靶向HSF mRNA的基于小RNA的预防或治疗方法，必须评估小球藻EV是否也可以被将遇到或已经遇到目标病原体的人细胞内化。出于该目的，发明人研究了小球藻EV是否可以被人肺泡上皮细胞摄入，人肺泡上皮细胞与各种呼吸道感染有关。值得注意的是，他们表明小球藻EV被这些人细胞快速且有效地内化。此外，他们鉴定了优化EV的细胞内化所需的EV浓度。总体上，这些数据表明小球藻EV不仅适用于在致病细胞中递送小RNA，而且还可以用于在人肺泡上皮细胞中递送抗菌小RNA，也可能在其他细胞中递送，以减少感染(如呼吸道感染)。
基于这些发现，发明人进一步生成并表征了表达反向重复(IR)转基因的稳定小球藻转基因系，这些IR转基因单独或同时靶向SARS-CoV-2基因组和亚基因组RNA的大序列区域。此外，他们还生成了表达靶向关键HSF的IR转基因的小球藻系，先前已证明这些HSF的沉默或药物触发的失活会限制冠状病毒在人细胞中复制。此外，发明人还生成了表达IR转基因的小球藻系，这些IR转基因靶向对各种人细菌病原体的适应性、致病性或抗生素耐药性至关重要的基因，所述人细菌病原体包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。因此，这些参考小球藻转基因系将有助于生产具有抗病毒或抗菌活性的EV包埋的siRNA。
小球藻EV包埋和/或相关的小RNA产品的工业化的先决条件是证明它们可以在光生物反应器(PBR)中生产时保持完全完整性和功能性。为了解决该问题，发明人首先使生产抗菌siRNA的小球藻参考系在一升的PBR中生长，并收集了相应的细胞外培养基并进一步冷冻储存。随后将细胞外培养基解冻并进行过滤和超速离心，以回收纯化的EV。重要地，发现这些小球藻EV表现出正态尺寸分布，并被人肺泡上皮细胞有效地内化。此外，当相同的小球藻转基因系在150升的PBR中生长时，同样保持了EV的完整性，只是在这些条件下，回收的EV颗粒的产量比从烧瓶或小PBR收集的产率提高了～20倍。这些发现表明，在PBR中生产时，小球藻EV包埋的siRNA的完整性和功能性保持不变(尽管这些EV被冷冻储存)。因此，微藻诱导基因沉默(MIGS)技术具有进一步开发的潜力，用于在工业化前环境中高产率生产EV包埋的抗菌小RNA。
小球藻EV包埋和/或相关的抗菌小RNA可能工业化的另一个先决条件是以快速、可靠且具有成本效益的方式验证由PBR生产的每个批次的功效。为了解决该问题，发明人在细菌和人细胞中设计并工程改造了小RNA报告系统，该系统依赖于在有效的小球藻EV包埋的抗菌小RNA存在下进行差异性的荧光或生物发光信号检测。可以轻松操作这些定量报告系统以在产品制造之前确保生产的每个批次均有活性。它们还与选择表达最有活性的EV包埋和/或相关的小RNA的独立小球藻系有关。
基于所有这些发现，本发明人提出使用该MIGS技术以快速生产针对专门病原体的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA。更准确地，他们提出一种高产率生产靶向一种或多种目的病原体或HSF基因的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA的方法，通过以下进行：i)在小球藻细胞中表达iRNA分子(siRNA和miRNA的前体)，ii)收集所述小球藻细胞释放的EV，iii)在产品制造之前验证小球藻EV包埋的siRNA的功效，以及iv)将浓缩或纯化的EV产品递送至动物组织、动物体内(例如器官、体液)或被病毒或细菌感染的表面上。值得注意的是，在这种生产线中，携带有效EV的细胞外培养基或纯化的EV均可以冷冻储存，而不会对这些基于EV的抗感染剂的完整性和功能性产生重大负面影响。
因此，预计MIGS技术将广泛用于针对广谱动物病原体(包括人病原体)的预防和治疗应用。该方法将对公共卫生产生重大影响，尤其是在病毒、真菌、卵菌和/或细菌感染的管理方面。
本发明的方法的以下特征和优点值得提及。
1)小球藻是生产内源和异源分子的理想生物系统：
小球藻属于一组绿色微藻(绿藻门(Chlorophyta)，共球藻纲(Trebuxiophyceae))，其能够适应各种条件并生长。小球藻易于在实验室条件下维持，具有简单的生命周期、单倍体基因组和类似于高等植物的代谢途径(Blanc等人，2010)。它还具有在自养、异养或兼养条件下以高生长速率生长的能力(Zuniga等人，2016)。代谢灵活性、易于维持和生长的特点使得小球藻能够在PBR中用作各种目的分子的工业生产支架。特别是，可以容易地用卸甲的(disarmed)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化小球藻细胞(Cha等人，2012)，并且可以在2个月时间内选择稳定转化的转基因系。该异常快速的选择过程将小球藻定位为在短时间内生产任何目的构建体的理想生物系统。该特征在爆发或大流行情况下尤其有价值，因为可以利用小球藻快速生产针对来自任何目的病原体(现在可以在几天内对其进行测序)的毒力因子、必需基因和/或抗菌素耐药性基因的载体化(vectorized)小RNA。
总而言之，用目的转基因快速转化小球藻并由PBR获得大量小球藻细胞外培养基的可能性表明，该绿色微藻适用于专门的EV包埋和/或相关的抗菌小RNA的工业生产。
2)MIGS技术具有高度多功能性和序列特异性。
MIGS技术依赖于在小球藻中稳定表达反向重复的人工miRNA或有义-反义转基因，其将被内源Dicer样酶或其他内源RNA酶加工为siRNA或miRNA，并进一步内化至EV中。MIGS技术还依赖于由重组病毒生产RNAi前体，所述重组病毒可以感染小球藻细胞，并如先前在植物中描述的那样，类似地通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)来高产率生成小RNA群体(Bally等人，2018)。尤其可以以这样一种方式设计这些基于转基因和病毒的RNAi前体，即它们将靶向一个或多个目的基因并触发其选择性沉默。该特征对于控制一种或多种病原体的复制特别有价值，同时对共生微生物或动物生物体没有副作用。
3)MIGS技术可以用于生产抗菌小RNA群体，可能赋予持久的抗病性。
小球藻可以用于生产小RNA群体，其靶向来自单个基因或多达十几个基因的长达1500bp的区域。这与在动物或人中经典使用的单个siRNA不同，后者旨在靶向特异性的约20-22nt长的序列。值得注意的是，像植物那样，小球藻能够表达长dsRNA而不触发细胞毒性。这是与基于哺乳动物细胞的系统的重要区别，后者通常在检测到长dsRNA后触发强效炎症，长dsRNA被感应为病毒复制中间体，并通过RIG-I样受体(RLR)信号传导途径诱导强效干扰素反应(Fan&Jin，2019)。因此，小球藻非常适用于生产覆盖微生物基因的大部分的小RNA，从而使检测到对靶向微生物基因的强效沉默作用的机会最大化。此外，通过靶向长序列区域，微生物将不太可能沿靶向区域一直突变，从而产生针对靶向病原体的持久保护作用。这在RNA病毒的情况下特别重要，RNA病毒通常具有高突变率(例如流感病毒)。因此，预期MIGS技术会克服反复出现病原体定向逃逸突变的问题，因此预期会赋予持久抗病性。
4)MIGS技术有效针对原核细胞，而其他生产长dsRNA的平台则不然。
本发明人先前报道了外源应用siRNA可以以序列特异性的方式靶向细菌病原体中的毒力因子(Singla-Rastogi，Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。相比之下，长dsRNA在该过程中没有活性，表明它们不被细菌细胞摄入或在细菌细胞中没有活性。这是与以下的主要区别：先前报道的线虫和植物食草动物中的环境RNAi，其专门依赖于长dsRNA(Bolognesi等人，2012；Ivashuta等人，2015；Whangbo等人，2008)，或真菌和卵菌中的环境RNAi，其依赖于小RNA和长dsRNA两者(Koch等人，2016；Wang等人，2016)。因此，通过生产小RNA物种，MIGS技术具有用作抗菌剂的新型生产支架的潜力，而目前用于生产长dsRNA作为杀真菌剂、杀虫剂或杀线虫剂用于农业应用的其他生物系统则不然。MIGS技术还可以用于选择性靶向共生细菌的基因以增强其对人的有益作用。因此，MIGS是一种独特的RNAi生产支架技术，其可以用于针对原核细胞，以及可能用于针对许多其他不相关的微生物或寄生物。
5)像植物EV那样，预期小球藻EV会比哺乳动物EV更稳定，并且可能无毒/无免疫原性。
从事RNAi治疗领域的公司通常使用合成载体/siRNA，其可能具有毒性作用。本生物系统涉及生产小球藻EV，其类似于先前已被表明无毒、无免疫原性且稳定的植物纳米囊泡(Wang等人，2013；Zhang等人，2017)。因此，预期来自小球藻的EV的毒性表现会是安全的，如下面的实施例10所示，它们对细胞活力没有明显影响。此外，像它们的植物对应物那样，预期小球藻EV在宿主生物体中会比哺乳动物EV更稳定(Wang等人，2013；Zhang等人，2017)。
定义
本方法/用途可以在体内或体外进行。本文中的“体外”是指所要求保护的方法或用途的步骤是使用已从其通常宿主生物体中分离或直接在体外培养基中生长的生物组分(例如人细胞谱系)进行的。
本文中的“体内”是指所要求保护的方法或用途的步骤是使用整个生物体(例如整个个体)进行的。
如本文所用，术语“功能性干扰RNA”(功能性iRNA)是指能够诱导至少一个基因的序列特异性沉默过程的RNA分子。特别是，所述功能性干扰RNA分子可以是i)小干扰RNA，本领域公知为小干扰RNA或短干扰RNA(siRNA)分子(单链体或双链体)，或其前体；或ii)microRNA(miRNA)分子(单链体或双链体)或其前体。
RNAi是一种保守的基因调控机制，其促进植物、蝇、虫和哺乳动物的抗病毒抗性(Guo等人，2019)。抗病毒沉默的核心机制涉及RNA酶III DICER对病毒双链RNA(dsRNA)的识别和加工，其导致产生20-25nt长的短干扰RNA(siRNA)双链体。这些siRNA双链体随后与RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心成分即Argonaute(AGO)蛋白结合，并且一条链即向导链与AGO保持结合以转录后沉默病毒互补转录本。最近的研究表明了植物和/或动物内源小RNA还可以直接靶向来自真菌、细菌和卵菌病原体的毒力基因或必需基因，从而支持RNAi在宿主-病原体相互作用期间跨界基因调控中的更广泛作用(Cai等人，2019；Guo等人，2019；Hou等人，2019)。
本文中的术语“siRNA的前体”或“siRNA前体”是指可以在小球藻细胞(或小球藻提取物)中直接或间接加工成siRNA双链体的RNA分子。可以直接加工的siRNA前体的例子包括长双链RNA(长dsRNA)，而可以间接加工的siRNA前体的例子包括可以用作生产可加工的长dsRNA的模板的长单链RNA(长ssRNA)。
本文中的术语“miRNA的前体”或“miRNA前体”是指可以在小球藻细胞(或小球藻提取物)中加工成miRNA双链体的RNA分子。miRNA前体的例子包括初级miRNA前体(pri-miRNA)和pre-miRNA，其包含发夹环。
值得注意的是，编码所述前体分子的质粒或载体以及其他DNA构建体或病毒载体也涵盖于“功能性干扰RNA”的定义中。
对于靶向多个基因，本发明的方法可以使用i)数种不同iRNA的混合物，其总体上靶向多个目的基因，或ii)靶向数个不同目的基因的嵌合iRNA，或iii)任何这些嵌合iRNA的混合物。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法/用途包括将一个或多个长功能性iRNA作为前体引入小球藻细胞中，这些细胞将生产小RNA(如siRNA或miRNA)，其可以被进一步配制并用于预防致病性感染。
这些长功能性iRNA可以是长单链RNA分子(以下称为“长ssRNA”)。这些长ssRNA可以由可以感染小球藻细胞的RNA病毒产生，并在病毒复制期间进一步转化成长dsRNA分子(作为复制中间体)。所得病毒dsRNA随后被小球藻DCL酶加工成siRNA。
如本文所用，术语“长ssRNA”是指含有单链的单链结构，所述单链为至少50个碱基，更优选80至3000个碱基。长ssRNA在由小球藻转基因生产时可以含有80至3000个碱基，但在由重组RNA病毒生产时优选含有80至1500个碱基。
这些长功能性iRNA也可以是双链RNA分子(以下称为“长dsRNA”)。这些长dsRNA用作miRNA或siRNA前体，并且由于小球藻基因组编码的DCL蛋白而可以在小球藻细胞中加工成miRNA或siRNA(参见实施例2)。
如本文所用，术语“长dsRNA”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构，所述第一链和第二链为至少50个碱基对，更优选80至3000个碱基对。
本发明人的结果表明，在小球藻细胞中，长dsRNA可以有效地加工成有效小RNA(实施例5)。此类长dsRNA有利地为嵌合dsRNA，即它们与多个基因具有序列同源性。
本发明的方法中使用的长功能性iRNA优选为可由小球藻细胞中的DCL酶切割的长dsRNA，以生成miRNA或siRNA。
可以通过有义-反义转录构建体或通过VIGS，由发夹结构生成这些长dsRNA。更准确地，它们可以包含凸起、环或摆动碱基对，以调节dsRNA分子的活性，以便于介导目的细胞中的有效RNA干扰。可以通过基于核酸或基于非核酸的接头的方式来连接这些长dsRNA分子的互补有义区和反义区。这些长dsRNA还可以包含一个双链体结构和一个环结构，以形成对称或不对称的发夹二级结构。
在具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向～350bp的单个SARS-CoV-2病毒区域，并具有例如以下序列(参见实施例11)：IR-PLP＝SEQ ID NO：41-42；IR-3CL＝SEQ IDNO：43-44；IR-NSP10＝SEQ ID NO：45-46；IR-RDRP-1＝SEQ ID NO：47-48；IR-RDRP-2＝SEQID NO：49-50；IR-RDRP-3＝SEQ ID NO：51-52；IR-EndoN＝SEQ ID NO：53-54；IR-N＝SEQ IDNO：55-56；IR-E＝SEQ ID NO：57-58；IR-M＝SEQ ID NO：59-60；IR-S＝SEQ ID NO：61-62；IR-3’UTR＝SEQ ID NO：63-64；和IR-Hel＝SEQ ID NO：65-66。
此外，它们可以同时靶向～150-250bp的数个SARS-CoV-2病毒区域或HSF基因，并具有例如以下序列：IR-NSP1//NSP4/NSP3/PLP/3CL/NSP12/NSP13/NSP14＝SEQ ID NO：1-2；IR-S/E/M/N/前导序列(leader)-TRS/3’UTR＝SEQ ID NO：3-4；IR-Rpl13a/eIF3e/eIF3i/eIF3f＝SEQ ID NO：5-6；IR-eIF4A/eEF1a＝SEQ ID NO：7-8；IR-Snrpe/Naca/Kif11/Gbf1/Srp54a＝SEQ ID NO：9-10；和IR-ACE2/TMPRSS2/Psmd1/IMPα/IMPβ1＝SEQ ID NO：11-12。
在另一个具体的实施方案中(参见实施例12)，本发明的前体可以靶向来自铜绿假单胞菌的必需基因，包括LptH、LolA、TolB、LpxA、LpxD、dnaA、dnaN、gyrB、rpoC、secE和sodB，并具有以下序列：IR-LptH/LolA/TolB＝SEQ ID NO：13-14；IR-LpxA/LpxD/TolB＝SEQ IDNO：15-16；IR-dnaA/dnaB/gyrB＝SEQ ID NO：67-68；IR-rpoC/secE/SodB＝SEQ ID NO：69-70；和IR-secE/dnaN/gyrB＝SEQ ID NO：17-18。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自铜绿假单胞菌的关键毒力基因，包括参与调节和/或组装II型或III型分泌系统的基因XcpQ、PscF、PscC、PcrV、PcrR、ExoS、ExoU、ExsA、Vrf，群体感应信号传导因子LasR、RhlR、MvfR、VqsM，GAC信号传导成分GacA、RsmA，并具有以下序列：IR-XcpQ/ExsA/PcrV/LasR/RhlR/VqsM/RmsA＝SEQ ID NO：19-20；IR-XcpQ/PscF/PscC＝SEQ ID NO：21-22；IR-ExoS/ExsA/Vrf＝SEQ ID NO：23-24；IR-ExoU/ExsA/Vrf＝SEQ ID NO：25-26；IR-LasR/RhlR/VqsM＝SEQ ID NO：27-28；和IR-GacA/RmsA/MvfR＝SEQ ID NO：29-30。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向来自铜绿假单胞菌的关键抗生素耐药性基因，包括mexX、mexA和ampC，并具有以下序列：IR-mexX/mexA/ampC＝SEQ IDNO：31-32。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)的必需基因，包括FtsA、Can、Tsf、AccD、Der、Psd，并具有以下序列：IR-FtsA/Can/Tsf＝SEQ ID NO：71-72和IR-AccD/Der/Psd＝SEQ ID NO：73-74。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向福氏志贺氏菌的毒力基因，包括VirF、VirB、IcsA，使用构建体IR-VirF/VirB/IcsA＝SEQ ID NO：33-34，以及金黄色葡萄球菌的毒力基因，包括编码表面结合蛋白的基因fnbA、clfA、clfB、spa、atl，白细胞毒素lukF-PV、lukS-PV、lukE、lukD、HlgB，α溶血素hla，以及毒性休克综合征毒素-1tsst-1，使用以下构建体进行：IR-fnbA/clfA/clfB/spa＝SEQ ID NO：35-36；IR-lukF-PV/lukS-PV/lukE/lukD＝SEQ ID NO：37-38；和IR-HlgB/hla/tsst-1/atl＝SEQ ID NO：39-40。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向结核分枝杆菌的毒力基因，包括cspA、pcaA、icl1、rip、fad26、hphA，使用以下构建体进行：IR-cpsA＝SEQ ID NO：75-76；IR-pcaA＝SEQ ID NO：77-78；IR-icl1＝SEQ ID NO：79-80；IR-rip＝SEQ ID NO：81-82；IR-fad26＝SEQ ID NO：83-84；IR-hphA＝SEQ ID NO：85-86；和IR-cpsA/pcaA＝SEQ ID NO：87-88。
在另一个具体的实施方案中，本发明的前体可以靶向嗜肺军团菌的毒力基因，包括dotA、dotB、dotC、dotD、icmT、icmJ、pilD和ispF，使用以下构建体进行：IR-dotA＝SEQ IDNO：89-90；IR-dotD＝SEQ ID NO：91-92；IR-dotC＝SEQ ID NO：93-94；IR-dotB＝SEQ IDNO：95-96；IR-icmT＝SEQ ID NO：97-98；IR-icmJ＝SEQ ID NO：99-100；IR-pilD＝SEQ IDNO：101-102；IR-ispF＝SEQ ID NO：103-104；和IR-dotD/pilD＝SEQ ID NO：105-106。
本发明的目的在于SEQ ID NO：1-106的这些siRNA前体中的任一种在小球藻细胞中生产功能性小iRNA群体的用途。
如本申请的实施例所证明的，将dsRNA引入小球藻细胞会触发生产包埋在EV中和/或与EV相关的小RNA分子，其免受核糖核酸酶介导的消化(实施例2-8)。更准确地，本发明的小球藻细胞能够生产功能性小iRNA，如siRNA或miRNA。这些小RNA具有短尺寸，其少于50个碱基对，优选在10和30个碱基对之间。更特别地，小球藻细胞生产的功能性小iRNA主要含有18个碱基对或15个碱基对(参见实施例4和图2)。
这些小RNA可以配制成药用组合物或化妆品组合物，例如配制成局部组合物或可喷雾液体组合物(见下)。在这种情况下，含有所述小RNA的所述组合物可以直接施用于组织或受污染表面。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的功能性干扰小RNA是“siRNA”，其是指“siRNA双链体”或“siRNA单链体”。这些双链体或单链体siRNA的尺寸优选为15或18个核苷酸。因此，它们比通常尺寸为21或24个核苷酸的植物生产的siRNA短，也比通常尺寸为～22个核苷酸的哺乳动物生产的siRNA短。因此，由小球藻细胞生成的本发明的功能性小RNA与由植物和其他真核细胞生成的小RNA不同。
更具体地，术语“siRNA双链体”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构或双链体分子，所述第一链和第二链为至少10个碱基对，优选少于20个碱基对；优选地，所述反义链包含与靶向基因的转录本互补的至少10个连续核苷酸的区域。在优选的实施方案中，如下面的实验部分所示，这些分子精确地含有15至18个碱基对。这些siRNA双链体可以由小球藻DCL酶加工的长dsRNA前体产生。
如本文所用，术语“siRNA单链体”或“成熟siRNA”是指源自siRNA双链体的单链体分子(也称为“单链”分子)，但其已在微藻细胞的RISC机制中成熟并加载在小球藻AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白相关。它们具有短尺寸，其小于50个碱基，优选在10和30个碱基之间，更优选在10和18个碱基之间，甚至更优选在15和18个碱基之间。在具体的实施方案中，它们精确地含有15或18个碱基。
在另一个实施方案中，本发明的功能性iRNA是“miRNA”，其是指“miRNA双链体”或“miRNA单链体”。在优选的实施方案中，本发明的iRNA是双链miRNA。
更具体地，术语“miRNA双链体”是指含有第一链(有义链)和第二链(反义链)的双链结构或双链体分子，所述第一链和第二链为至少10个碱基对，优选至少15个碱基对；优选地，所述反义链包含与靶向基因的转录本互补的至少10个连续核苷酸的区域。这些miRNA双链体也可以含有凸起。这些miRNA双链体可以由小球藻DCL酶加工的miRNA前体产生。作为双链体siRNA，它们具有短尺寸，其小于50个碱基对，优选在10和35个碱基对之间。更特别地，由小球藻细胞生产的小miRNA主要含有18个碱基对。它们还可以含有15个碱基对(参见实施例4和图2)。
如本文所用，术语“miRNA单链体”或“成熟miRNA”是指源自miRNA双链体的单链体分子(也称为“单链”分子)，但其已在微藻细胞的RISC机制中成熟并加载在小球藻AGO蛋白中和/或与其他RNA结合蛋白相关。这些单链体miRNA通常含有在10和18个之间的核苷酸，甚至更优选在15和18个之间的核苷酸。在具体的实施方案中，它们精确地含有15或18个核苷酸。
设计iRNA(如可以转化为siRNA/miRNA的长dsRNA)的方法是本领域可得的，并且可以用于获得本发明的前体的序列。
发明人在本文中表明(实施例2-8)，可以使用长双链反向重复构建体，以便(i)有效地转化小球藻细胞以及(ii)使它们生产可以抑制致病性的功能性小iRNA，所述小iRNA包埋于EV中，EV保护这些RNA实体免受核糖核酸酶介导的消化(参见图5C)。
如本文所用，术语“序列同源性”是指具有序列相似性的序列，即核酸序列之间具有足够程度的同一性或对应性。在本发明的上下文中，当至少约80％，或者至少约81％，或者至少约82％，或者至少约83％，或者至少约84％，或者至少约85％，或者至少约86％，或者至少约87％，或者至少约88％，或者至少约89％，或者至少约90％，或者至少约91％，或者至少约92％，或者至少约93％，或者至少约94％，或者至少约95％，或者至少约96％，或者至少约97％，或者至少约98％，或者至少约99％的核苷酸相似时，则两个核苷酸序列共有“序列同源性”。
相反地，具有“无序列同源性”的核苷酸序列是同一性程度小于约10％、或者小于约5％、或者小于2％的核苷酸序列。
优选地，使用Needleman和Wunsch的算法鉴定相似或同源的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP第10版使用以下参数获得的值：使用GAP权重为50和长度权重为3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵获得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重为8和长度权重为2，以及BLOSUM62评分矩阵获得的氨基酸序列的同一性％和相似性％；或其任何等同程序。“等同程序”旨在指对于所讨论的任何两个序列，与GAP第10版生成的相应比对相比，生成具有相同核苷酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对的任何序列比较程序。
本发明的生产方法
在第一方面，本发明涉及一种用于生产功能性干扰小RNA的方法，所述方法包括至少以下步骤：
a)用包含至少一个目标基因的片段的siRNA或miRNA前体转化小球藻细胞，以及
b)在合适的条件下培养所述小球藻细胞，以使它们表达所述前体并释放靶向所述基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
术语“干扰小RNA”和“siRNA或miRNA前体”已在上面的定义部分中定义。
在优选的实施方案中，所述siRNA或miRNA前体是长单链或双链RNA分子。在更优选的实施方案中，所述siRNA或miRNA前体是长双链RNA分子，所述分子包含至少一个目标基因片段或其互补序列。
如上面所解释的，可以通过大型核苷酸构建体转化小球藻细胞。更准确地，所述前体中含有的靶向片段可以具有大尺寸，例如多达3000bp。
本发明的前体中含有的“片段”事实上可以含有单个基因的一个或数个部分，或数个基因的数个部分(参见下面的实施例11和12)。转化后，小球藻细胞将生产siRNA群体，其靶向来自单个基因或来自数个基因的一个或多个部分。这是相比于其他iRNA生产者细胞的一项明显优点，因为覆盖微生物基因的大部分使得触发对靶向微生物基因或HSF基因的有效沉默效应的机会最大化，并且减少了微生物获取针对小iRNA群体的耐药性(为此，它将必须沿小RNA靶向部分一直突变)的机会，从而产生针对靶向病原体的持久保护作用。也可以设计并使用含有来自数种病原体的基因的一个或多个部分的前体。
在具体的实施方案中，本发明的前体中含有的目标基因片段在50和3000bp之间，优选在100bp和2000bp之间，更优选在500bp和1500bp之间。
具体的“目标基因”描述于下面的相应章节中。
有用的小球藻属
小球藻是单细胞绿藻的一个属，其属于绿藻门。它是球形的，直径约2至10μm，没有鞭毛。它的叶绿体中含有绿色光合色素叶绿素-a和叶绿素-b。它在理想条件下迅速繁殖，只需要二氧化碳、水、光和少量矿物质即可生长。由于升高的蛋白质、维生素、矿物质和色素含量，各种小球藻细胞目前被用作人和牲畜的食物补充。
本发明的方法中使用的小球藻细胞可以是任何小球藻物种。特别是，它们可以是目前用作人和牲畜的食物补充的任何细胞(Safi C.等人，2014)。在具体的实施方案中，它们可以属于以下物种：椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)或多变小球藻(Chlorella variabilis)。
在优选的实施方案中，本发明的方法中使用的小球藻细胞来自普通小球藻物种。与其他小球藻细胞一样，普通小球藻细胞能够适应各种条件并生长。它们易于在实验室条件下维持，具有简单的生命周期、单倍体基因组和类似于高等植物的代谢途径。它们还具有在自养、异养或兼养条件下以高生长速率生长的能力(de Andrade等人，2017)。代谢灵活性、易于维持和生长的特点使得普通小球藻能够在光生物反应器(PBR)中用作各种目的分子的工业生产支架(Lin等人，2013；Blanc等人，2010)。
在本发明的方法的第一步中，将本发明的siRNA或miRNA前体引入所选择的小球藻细胞中。所述siRNA或miRNA前体将通过使用小球藻DCL酶和其他小RNA加工因子加工成siRNA或miRNA双链体。所述小RNA双链体和/或成熟小RNA向导(即加载至AGO中)随后在细胞外培养基中或在小球藻细胞表面释放，包埋至EV中和/或与EV相关。如下面的实施例(实施例5和7以及图5)中所证明的，当与含有抗菌小RNA的小球藻EV接触时，细菌细胞的毒力降低。
在将核酸插入细胞的上下文中，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并包括提及将核酸掺入真核细胞中，其中所述核酸可以稳定地掺入所述细胞的基因组(例如染色体、质粒)或瞬时表达(例如通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)瞬时递送基因构建体、用重组病毒感染)。
本发明的iRNA在宿主小球藻细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。稳定表达特别是指使用常规技术制备转基因小球藻细胞谱系。
作为非限制性例子，可以通过使用电穿孔、基因枪、PEG介导的原生质体转化、病毒介导的转化、缀合、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化等来进行本发明的方法的步骤a)。这些转化方法例如描述于Kim等人，2002；Cha等人，2012；Lin等人，2013；Yang等人，2015；Bai等人，2013；Niu等人，2011；Chien等人，2012；Run等人，2016中。
在优选的实施方案中，本发明方法的步骤a)涉及通过根癌农杆菌的方式将基因构建体递送至小球藻细胞中。该技术是公知的，不需要解释(Cha等人，2012；Lin等人，2013)。
在具体的实施方案中，本发明的方法包括向小球藻细胞引入一种或数种dsRNA，其靶向不同寄生物(如病毒、真菌、卵菌、细菌、昆虫或线虫)的一个或多个基因。在该实施方案中，EV针对数种病原体或寄生物的必需基因、毒力基因或抗微生物/抗寄生物抗性基因。
此类方法可用于同时预防或治疗由数种病原体和/或寄生物引起的疾病。可以使用含有嵌合iRNA的EV实施此类方法，所述嵌合iRNA与不同致病/寄生基因具有序列同源性，或者使用分别生产的EV的混合物(cocktail)，其中一些EV含有与一种病原体/寄生物的基因具有同源性的iRNA，而另一些EV含有与来自数种病原体/寄生物的基因具有同源性的iRNA。
在第二步中，培养含有本发明的前体的转化小球藻细胞，以表达所述前体并分泌靶向所述基因片段的功能性小iRNA。
在该步骤中，可以使用本领域公知的经典条件来培养小球藻细胞(Kim等人，2002；Cha等人，2012；Lin等人，2013；Yang等人，2015；Bai等人，2013；Niu等人，2011；Chien等人，2012；Run等人，2016)。标准培养方法描述于下面的实施例1中。
本发明人在本文中表明，与植物细胞一样，可以通过在生物胁迫条件下培养小球藻细胞来提高EV生产的产率，例如通过用植物防御激发子或防御相关植物激素(如水杨酸(SA))挑战小球藻细胞来进行。如下面的实施例16中所公开的，可以通过用热杀细菌(如大肠杆菌(E.coli)K12 TOP10或Pto DC3000细胞)的上清液处理细胞来提高小球藻EV的产率。使用来自热杀细菌细胞的上清液的基本原理是，这些上清液应当含有分子混合物，所述分子包括MAMP/PAMP，其可以被仍未知的小球藻模式识别受体(PRR)感应，从而如在植物中所发现的那样导致EV生产和/或分泌增强。
发明人发现了如植物EV那样，可以通过这种处理将小球藻的EV生产提高数倍。因此，提出因此可以利用一些生物胁迫来增加小球藻EV的生产和/或分泌。优选的处理是使用来自热杀细菌的上清液，其可以容易地以具有成本效益的方式生产，并已发现其适合于增强小球藻EV的生产(实施例16和图11)。
在一个优选的实施方案中，本发明的小RNA被分离为游离RNA分子。这些RNA分子可以直接用于预防或治疗目的(参见实施例5和7)。
在该实施方案中，本发明的方法进一步包括从培养的小球藻细胞中回收表达的小iRNA的步骤。
分离小球藻细胞内含有的完整RNA需要四个步骤：1)破坏小球藻细胞；2)使内源核糖核酸酶(RNA酶)活性失活；3)使核蛋白复合物变性；4)去除污染DNA和蛋白质。最重要的步骤是在破坏细胞时，立即使从膜结合细胞器释放的内源RNA酶失活。RNA纯化方法通常使用基于硅胶膜、基于树脂和磁性的核酸结合选项，并并入DNA酶处理以去除污染基因组DNA。然后从固体载体洗脱纯化的RNA。
众所周知，RNA易被降解，并且RNA酶普遍存在。许多市售可得的RNA纯化方法包括特定化学物质以使细胞或组织裂解物中存在的RNA酶灭活，还可以包括RNA酶抑制剂以在整个过程中防止RNA降解。这些方法中的任一种均可以用于回收本发明的小RNA。
在另一个优选的实施方案中，本发明的小RNA不用作游离RNA分子，而是包埋至细胞外囊泡(EV)中。本发明人实际上表明了小球藻细胞可以生产尺寸范围与植物外泌体相似的EV，这些EV被人肺泡上皮细胞快速且有效地摄入，所述EV很可能在所述人肺泡上皮细胞中递送其小iRNA内容物并进一步触发其沉默效应(参见实施例9)。如源自哺乳动物和植物的EV那样，这些源自小球藻的含有iRNA的EV可以用于预防或治疗目的。
在该特别优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括回收细胞外培养基中由小球藻细胞释放的细胞外囊泡(EV)的步骤。
在本发明的上下文中，可以通过本领域描述的任何常规方式来进行EV的回收。例如，文献中讨论了分离和纯化方式(Colao IL.等人，2018)。有效纯化的下游处理可以用于从细胞培养基中富集EV，例如通过尺寸排阻(基于典型直径)、沉降力或浮选密度、基于沉淀的方法和基于亲和力的捕获来进行。尽管可以使用差速超速离心，但将优选其他纯化方法，如过滤或色谱分离。由于尺寸分布密集且可重复以及过程易于改变规模，切向流过滤更有前景。也可以使免疫亲和方法适合于本发明的特定EV。
通过本发明的方法获得的EV
细胞外囊泡(EV)是纳米尺寸的膜结合囊泡，其被释放至细胞外空间中并将货物运送至受体细胞。哺乳动物EV部分由外泌体组成，外泌体由多泡体(MVB)和质膜融合形成，其中MVB释放直径范围为40至150纳米的囊泡(O'Brien等人，2020)。在过去十年中，哺乳动物外泌体被广泛表征为miRNA的载体。有趣地，新出现的证据表明，植物来源的EV也可以作为哺乳动物细胞和器官中miRNA的载体工作(Wang等人，2013；Zhang等人，2017)。这些基于脂质的颗粒在生物体中比其哺乳动物对应物更稳定。此外，它们具有无毒和无免疫原性的优点(Yang&Merlin，2020)，而在治疗方法中经典用作小RNA载体的合成纳米颗粒并不总是如此。
在另一方面，如上所述，本发明涉及通过本发明的方法获得的细胞外囊泡(EV)。这些EV含有功能性小iRNA群体，其靶向目的基因中的一个或数个区域。有趣地，可以从Mnase处理的小球藻EV中检测到抗菌小iRNA(参见实施例7和图5)。
如实施例3和图1所示，本发明人能够通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)并通过标记基于脂质的细胞外颗粒来表征小球藻EV。该首次分析揭示，小球藻EV的尺寸范围在50和200nm之间。进一步的透射电子显微镜(TEM)揭示了存在圆形颗粒，其具有表观脂质双层，平均直径～130nm。
发明人的结果(实施例2和表2)还表明，由小球藻细胞生产的EV不太可能在其膜中含有四次穿膜蛋白(tetraspanin)，因为小球藻基因组和转录组不含此类因子。然而，已知植物EV上存在四次穿膜蛋白8(tetraspanin 8)(Cai等人，2018)。因此，由小球藻细胞生产的EV与植物生产的EV不同。
本发明人的结果表明，这些EV可以快速且有效地被人细胞(如人肺泡上皮细胞)摄入(实施例9)，它们在所述人细胞中可以如植物或哺乳动物EV可以做到的那样递送所含有的功能性iRNA。
在优选的实施方案中，本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，其靶向一个或数个病毒基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗病毒剂。
例如，这些抗病毒EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，其靶向对SARS-CoV-2病毒的复制或致病性至关重要的一个或数个病毒基因的一个或数个区域。
在另一个优选的实施方案中，本发明的EV优选含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，其靶向一个或数个细菌基因中的数个区域。因此，这些EV可以用作抗菌剂。
例如，这些抗菌EV可以含有功能性小iRNA群体，优选为10至18个碱基对，其靶向致病细菌(如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌)的毒力因子或活力或抗生素耐药性基因。
如上面所解释的，可以通过各种方法进行EV的纯化。尽管可以使用差速超速离心，但出于工业目的将优选其他纯化方法，如过滤、色谱分离或亲和纯化方法。
本发明的药物组合物
除了其天然抗菌防御作用外，iRNA还被广泛用作创新抗感染方法的前瞻性工具。例如，对人或猴细胞进行的多项研究表明了合成siRNA显示出针对SARS-CoV-1的抗病毒作用，SARS-CoV-1与SARS-CoV-2密切相关，是2002/2003年SARS流行的原因(Asha等人，2018)。除了限制体外病毒复制以外，还表明了合成siRNA在体内触发针对小鼠、猕猴甚至人的各种病毒性呼吸道感染的保护(Tompkins等人，2004；Ge等人，2004；Bitko等人，2005；Li等人，2005；DeVincenzo等人，2010；Asha等人，2018)。例如，鼻内递送针对SARS-CoV-1RNA的合成siRNA显著降低了恒河猴中的病毒滴度、感染诱导的发热和急性弥漫性肺泡损伤(Li等人，2005)。因此，使用抗SARS-CoV-2siRNA代表了战胜COVID-19的一种有前景的方法。
同样，值得注意的是，本发明的天然细胞外囊泡(EV)中含有的本发明的小RNA被保护免受核糖核酸酶介导的消化(实施例7)。因此，含有iRNA的EV可以作为针对目标病原体的治疗工具高效且持久地用于药物组合物中。
在进一步的方面，本发明因此涉及含有本发明的EV作为活性成分的药物组合物。更准确地，如上所定义的，它们含有有效量的源自小球藻的EV。
本文中的“有效量”是指已在如下面实施例中所描述的测试中表明具有抗致病作用(例如抗菌或抗病毒作用)的量。在待处理的分离细胞的体外应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100pM之间，优选在0.05和10pM之间。在待处理整个动物(特别是人)的体内应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100nM之间，优选在0.05和10nM之间。
可以在适当的和/或环境可接受的载体中配制本发明的治疗组合物。此类载体可以是待处理的个体可以耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在控制感染方面保持有效。此类载体的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、Hank’s溶液、和其他生理平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
这些组合物还可以含有表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、摄食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线保护剂、缓冲剂、助流剂等。它还可以含有其他活性成分，如杀昆虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀螨剂。这些试剂可以与制剂领域常用的载体、表面活性剂或助剂、或其他组分组合，以有助于产品的处理和应用。适当的载体和助剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如天然或再生矿物物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂或粘合剂。
在优选的实施方案中，本发明是液体可喷雾组合物。然后可以容易地将其应用于组织或衣服或任何可以与病原体接触的材料上，作为预防措施或作为摆脱感染的治疗。它也可以容易地吸入，用于防止由鼻获取的感染。
在另一个优选的实施方案中，将本发明的组合物配制成丸剂，例如缓释丸剂，其以可容易地被动物和人吞咽以作用于肠粘膜或其他内部组织。
在另一个优选的实施方案中，将本发明的组合物配制成霜剂、洗剂或凝胶，其可以方便地应用于皮肤或毛发组织。
更一般地，可以在化妆产品中添加本发明的EV，以防止发生感染或增强有益微生物的生长。
本发明的治疗方法和用途
在本发明的另一方面，本发明涉及包括使用本发明的EV的治疗方法。这些EV可以用于治疗动物的任何寄生物感染和/或感染性疾病。
所述寄生物感染和/或感染性疾病可以由例如病毒、细菌、真菌、卵菌、或任何其他病原体或寄生物引起。
本发明的EV可以靶向所述病原体的基因和/或患病受试者/宿主的基因(如果已知该基因促进感染)。
在优选的实施方案中，所述感染性疾病影响与外部环境接触的组织和/或器官，如所述受试者的毛发、指甲、肠道、呼吸道、消化道、眼睛、皮肤、伤口、阴道粘膜、泌尿道、听觉道。
在本发明的上下文中，可以通过各种方式(口服、局部、全身等)将本发明的EV或包含它们的组合物递送至动物组织。
可以在外用组合物(如喷雾剂或霜剂或丸剂)中添加本发明的EV。
在一个实施方案中，将本发明的组合物外用于动物组织(即通过喷洒组合物或通过将洗剂、凝胶、霜剂应用于所述组织)，以保护个体免受致病性感染。
本发明的组合物还可以应用于任何可以与病原体接触的组织。该组织优选选自：皮肤、毛发、粘膜、指甲、肠道、伤口、眼睛等。
优选地，所述动物为以下种类：人(Homo sapiens)、狼(Canis lupus)、家猫(Feliscatus)、马(Equus caballus)、家牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Caprahircus)、野猪(Sus scrofa)、原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)、灰雁(Anser anser)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、大西洋鲑(Salmo salar)和南美白对虾-斑节对虾(Penaeus vannamei-Penaeus monodon)。它可以是寄宿有益细菌的健康动物，或者已经被病原体感染的患病动物。
更优选地，所述动物是人。
它可以是寄宿有益细菌的健康人，或者已经被病原体感染的病人。
本发明的治疗方法包括口服、局部和全身施用本发明的EV。也可以考虑鼻腔和静脉内施用。
本发明的另一方面涉及如上所定义的EV或含有它们的治疗组合物的用途，用于制备旨在治疗感染性疾病或预防发生感染的药物。
本发明的EV可用于沉默任何微生物中的基因。现在公开目标微生物的例子。
致病菌
本发明的EV可用于沉默任何病原体中的基因，所述病原体为：致病性或非致病性细菌；革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、病毒、真菌、卵菌、或其他与动物生物体相关的寄生物。
在优选的实施方案中，所述病原体是人致病菌。
可以使用本发明的EV靶向的人致病菌的非限制性例子包括：衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、疏螺旋体属(Borrelia sp.)(伯氏疏螺旋体(burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(garinii)、阿弗西尼疏螺旋体(afzelii)、回归热疏螺旋体(recurrentis)、麝鼠勺螺旋体(crocidurae)、达氏疏螺旋体(duttonii)、赫姆斯氏疏螺旋体(hermsii)等)、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(流产布鲁氏菌(abortus)、犬布鲁氏菌(canis)、马耳他布鲁氏菌(melitensis)、猪布鲁氏菌(suis))、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、衣原体属(Chlamydia sp.)(肺炎衣原体(pneumoniae)、沙眼衣原体(trachomatis))、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、梭菌属(Clostridiumsp.)(肉毒梭菌(botulinum)、艰难梭菌(difficile)、产气荚膜梭菌(perfringens)、破伤风梭菌(tetani))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、埃立克体属(Ehrlichia sp.)(犬埃立克体(canis)、查菲埃立克体(chaffeensis))、肠球菌(Enterococcus)(粪肠球菌(faecalis)、屎肠球菌(faecium))、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、钩端螺旋体属(Leptospira sp.)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)(麻风分枝杆菌(leprae)、结核分枝杆菌(tuberculosis))、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、奈瑟菌(Neisseria)(淋病奈瑟菌(gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(meningitidis))、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)(伤寒沙门氏菌(typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(typhimurium))、志贺氏菌属(Shigella sp.)(宋内志贺氏菌(sonnei)、痢疾志贺氏菌(dysenteriae))、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、葡萄球菌(Staphylococcus)(金黄色葡萄球菌(aureus)、表皮葡萄球菌(epidermidis)、腐生葡萄球菌(saprophyticus))、链球菌属(Streptococcus sp.)(无乳链球菌(agalactiae)、变形链球菌(mutans)、肺炎链球菌(pneumoniae)、酿脓链球菌(pyogenes)、草绿色链球菌(viridans))、福赛坦氏菌(Tannerella forsythia)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
在优选的实施方案中，本发明的EV可用于沉默致病性革兰氏阴性细菌中的基因，所述细菌例如变形菌，包括大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌、志贺氏菌、或其他肠杆菌(Enterobacteriaceae)、假单胞菌、莫拉菌(Moraxella)、螺杆菌、狭养单胞菌(Stenotrophomonas)、蛭弧菌(Bdellovibrio)、醋酸菌、军团菌等。医学上相关的革兰氏阴性杆菌包括多种物种。其中一些主要引起呼吸系统问题(肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌)，主要引起泌尿系统问题(大肠杆菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、主要引起胃肠道问题(幽门螺杆菌、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii))。本发明的EV可以用于限制或预防由这些细菌中任一种引起的感染。
有益细菌
在具体的实施方案中，本文所描述的技术还可用于控制来自有益细菌的基因的表达，以增强其增殖和/或其对宿主动物的有益作用。
换言之，本发明的EV还可以用于通过抑制直接或间接负调节细菌生长的基因来促进有益(共生)细菌的复制。本发明的EV可以例如靶向负调节有益(共生/共栖)细菌存活的基因，或阻止其入侵宿主并与宿主结合的基因，或负控制其碳水化合物代谢和摄入的基因(敲低此类基因导致细菌滴度增加)。
优选地，所述有益共生或共栖细菌选自：内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、殊异韦荣菌(Veillonella dispar)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、肠杆菌、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、大肠杆菌K12、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)(长双歧杆菌(longum)、两歧双歧杆菌(bifidum)、青春双歧杆菌(adolescentis)、齿双歧杆菌(dentium)、短双歧杆菌(breve)、嗜热双歧杆菌(thermophilum))、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(解木聚糖拟杆菌(xylanisolvens)、多形拟杆菌(thetaiotaomicron)、脆弱拟杆菌(fragilis)、普通拟杆菌(vulgatus)、萨氏拟杆菌(salanitronis)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)(布氏瘤胃球菌(bromii)、查帕西斯瘤胃球菌(champanellensis)、SR1/5)、链球菌(Streptococcus)(副血链球菌(parasanguinis)、唾液链球菌(salivarius)、嗜热链球菌(thermophilus)、猪链球菌(suis)、酿脓链球菌(pyogenes)、咽峡炎链球菌(anginosus))、乳球菌(Lactococcus)(乳酸乳球菌(lactis)、格氏乳球菌(garvieae))、肠球菌(屎肠球菌(faecium)、粪肠球菌(faecalis)、铅黄肠球菌(casseliflavus)、耐久肠球菌(durans)、海氏肠球菌(hirae)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)(干酪乳杆菌(casei)、瘤胃乳杆菌(ruminis)、徳氏乳杆菌(delbrueckii)、布氏乳杆菌(buchneri)、罗伊氏乳杆菌(reuteri)、发酵乳杆菌(fermentum)、戊糖乳杆菌(pentosus)、食淀粉乳杆菌(amylovorus)、唾液乳杆菌(salivarius))、片球菌(Pediococcus)(戊糖片球菌(pentosaceus)、克氏片球菌(claussenii))、明串珠菌(Leuconostoc)(肠系膜明串珠菌(mesenteroides)、乳明串珠菌(lactis)、肉色明串珠菌(carnosum)、冷明串珠菌(gelidum)、柠檬色明串珠菌(citreum))、魏斯氏菌(Weissella)(泰国魏斯氏菌(thailandensis)、韩国魏斯氏菌(koreensis))、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)(土地类芽孢杆菌(terrae)、多粘类芽孢杆菌(polymyxa)、胶冻样类芽孢杆菌(mucilaginosus)、Y412MC10)、堆肥嗜热杆菌(Thermobacillus composti)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、芽孢杆菌(Bacillus)(解淀粉芽孢杆菌(amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(subtilis)、地衣芽孢杆菌(licheniformis)、萎缩芽孢杆菌(atrophaeus)、韦氏芽孢杆菌(weihenstephanensis)、蜡样芽孢杆菌(cereus)、苏云金芽孢杆菌(thuringiensis)、凝结芽孢杆菌(coagulans)、巨大芽孢杆菌(megaterium)、还原硒酸盐芽孢杆菌(selenitireducens))、嗜热脱氮地芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、嗜盐盐芽孢杆菌(Halobacillushalophilus)、李斯特菌属(Listeria sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、真杆菌(Eubacterium)(直肠真杆菌(rectale)、挑剔真杆菌(eligens)、惰性真杆菌(siraeum))、糖解梭菌(Clostridium saccharolyticum)和产丁酸盐细菌(SS3/4和SSC/2)。
因此，本发明涉及本发明的EV用于促进有益共生或共栖细菌在有需要的受试者中的有益作用。
在这种实施方案中，本发明的EV应当与有益细菌基因具有序列同源性，但与致病基因组、宿主基因组或宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的其他基因组没有序列同源性。
靶向病毒
本发明的EV也可用于沉默病毒基因。在这种情况下，它们含有部分与病毒转录本的片段互补的小RNA，以触发所述病毒转录本的降解和/或减少同源病毒蛋白的生产。
在优选的实施方案中，所述病毒可以感染人。例如，其选自：埃博拉病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、寨卡病毒(ZIKV)、冠状病毒、甲型流感病毒、人乳头瘤病毒(HPV)等。
其他病原体
本发明的EV还可用于沉默真菌病原体中的基因，所述真菌例如选自：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、芽生菌(Blastomyces)、白色念珠菌(Candida albicans)、耳念珠菌(Candida auris)、球孢子菌(Coccidioides)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei)和红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)。
本发明的嵌合EV
为了保护受试者免受由数种细菌病原体引起的疾病，本发明的方法有利地使用与多于一种病原体具有序列同源性的功能性EV(以下称为“嵌合EV”)。
在该实施方案中，本发明的EV中含有的小RNA可以靶向数种病原体或寄生物的数个基因。这些“嵌合EV”不是对一种病原体具有特异性的，而是可以影响数种病原体(例如一种细菌和一种病毒，一种细菌和一种真菌，两种不同的细菌，或三种不同的病毒等)的生长。
上面针对EV、iRNA、载体和转化方法提出的所有实施方案都涵盖在内，无需重复。
当本发明的EV靶向数种病原体或寄生物时，本发明的药物组合物可以同时治疗或预防由这些不同的病原体/寄生物引起的疾病。
在优选的实施方案中，本发明的EV含有嵌合iRNA，其抑制编码如上所定义的细菌细胞的毒力因子或必需基因的至少一个基因，以及编码其他病原体或寄生物的毒力因子或必需基因(已知其对宿主诱导的基因沉默敏感)的至少一个其他基因。它也可以是非细菌病原体或寄生物的有毒次生代谢物的生物合成所需的基因。
在另一个优选的实施方案中，本发明的治疗应用使用：(i)含有一种或多种iRNA的EV，所述iRNA靶向在大量病原体中保守的必需基因或毒力基因的广泛序列区域，或(ii)含有一种或多种iRNA的EV，所述iRNA靶向来自不相关病原体的必需因子或毒力因子基因。这种具体实施方案赋予对多种病原体的广谱保护。
本发明的EV可用于沉默任何微生物中的任何基因。现在公开目标基因的例子。
目标细菌基因
对于抗菌应用，本发明的EV应当含有与至少一个细菌基因具有足够序列同源性的有效小RNA，以诱导所述至少一个基因的序列特异性沉默。此外，为了防止不需要的脱靶效应，所述EV中含有的dsRNA、miRNA或小RNA物种与真核宿主基因组或有益细菌、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的其他基因组的序列同源性应当是准不存在的(如果不是不存在的)。
根据本发明，术语“细菌基因”是指细菌中的任何基因，包括天然存在于细菌中的(天然)蛋白质编码基因或非编码基因，和通过重组DNA技术引入细菌中的人工基因。所述目标细菌基因是给定细菌物种特异性的，或在多种细菌物种中保守。优选地，它与真核宿主基因组、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的哺乳动物的任何基因均不具有同源性。这避免了对动物宿主、与宿主相关的有益细菌、宿主定植体和/或以宿主生物体为食的动物的附带效应。
在优选的实施方案中，所述至少一个细菌基因是细菌毒力因子或细菌必需基因或抗生素耐药性基因。
如本文所用，术语“细菌必需基因”是指对细菌细胞活力至关重要的任何细菌基因。假如所有营养物质都可得，则这些基因是维持细菌存活所绝对必需的。据认为，细菌绝对必需的必需基因数量为约250-500个。通过使用转座子测序方法，从不相关的细菌中鉴定此类必需基因现在变得相对容易可得。这些必需基因编码蛋白质以维持中枢代谢、复制DNA、确保适当的细胞分裂、将基因翻译成蛋白质、维持基本的细胞结构、以及介导进出细胞的运输过程。在本发明的上下文中，本发明的iRNA可以靶向例如：必需基因LptH、LolA、TolB、LpxA、LpxD、dnaA、dnaN、gyrB、rpoC、secE和sodB、参与氨基酸合成的必需基因(AroA、LysC、CysH、GalU)，转肽酶(PbpA、PbpB、PbpC)、编码细菌转录机制成分的基因(例如sigma70、sigma 54)、编码细菌细胞壁结构成分的基因(肽聚糖生物合成基因)、对细胞分裂至关重要的基因(例如FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW)、肌动蛋白的结构同源物(例如MreB、Mbl)、其他关键基因如ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、肌动蛋白相关基因(MreB和Mld)。
如本文所用，术语“毒力基因”是指已表明对以下至少一项活性起关键作用的任何细菌基因：致病性、疾病发生、特定宿主组织或宿主细胞环境的定植等。所有这些活性都有助于细菌在宿主中生长和/或促进疾病症状，尽管它们对细菌的体外生存不是必需的。
在本发明的上下文中，本发明的EV靶向例如：分泌系统(包括II型或III型分泌系统)的结构基因(例如PscC、PscJ、PscN、XcpQ、PcrV、PcrR)，IV型分泌系统的结构基因(例如VirB1、VirD4)、编码GAC信号传导相关成分的基因(GacA、RsmA)、VI型分泌系统的结构基因(例如TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp)、dot/icm系统的基因(DotC、DotD、DotF、DotG和DotH)、转录调节因子或III型分泌效应子(ExoS、ExoU、exsA、VirF、VirB)、编码cAMP依赖性DNA结合蛋白的Vrf基因、粘附素(例如IcsA)、群体感应相关基因(例如LasR、RhlR、MvfR、VqsM、LuxS、Luxl/LuxR)、编码表面结合蛋白的基因(fnbA、clfA、clfB、spa、atl)、白细胞毒素(lukF-PV、lukS-PV、lukE、lukD、HlgB)、α溶血素hla、以及中毒性休克综合征毒素-1tsst-1。
本发明的EV还可以抑制抗生素耐药性基因的表达，以使细菌对所述抗生素治疗敏感。
这些抗生素耐药性基因例如是：细菌外排泵基因(Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme型)、β-内酰胺酶的四个分子类别的基因：A类(例如TEM、SHV、GES型)、B类(例如金属β-内酰胺酶VIM、NDM)、C类(例如AmpC型)、D类(OXA型)。抗生素耐药性基因的非限制性例子包括：VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116和GES-9，以及当这些基因在微生物中缺失或失活时导致细菌致死的其他重要基因，以及综合抗生素耐药性数据库2017(或CARD 2017)中列出的那些基因。
在优选的实施方案中，所述毒力因子基因或细菌活力基因或抗生素耐药性基因因此选自：LptH、LolA、TolB、LpxA、LpxD、XcpQ、PcrV、PcrR、Vrf、dnaA、dnaN、gyrB、rpoC、secE、sodB、ExoS、ExoU、exsA,LasR、RhlR、MvfR、VqsM、GacA、RsmA、VirF、VirB、IcsA、fnbA、clfA、clfB、spa、atl、lukF-PV、lukS-PV、lukE、lukD、HlgB、hla、tsst-1、mexX、mexA、ampC、PscC、PscJ、PscN、VirB1、VirD4、TssM、TssJ、TssB/TssC、TssE、VgrG、Hcp、DotC、DotD、DotF、DotG、DotH、LuxS、Luxl/LuxR、AroA、LysC、CysH、GalU、PbpA、PbpB、PbpC、Pigma70、Sigma 54、Arc、Ptr、Nor、Mep、Cme、TEM、SHV、GES、VIM、NDM、mexX、mexA、AmpC、VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、Case、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116、GES-9、FtsZ、FtsA、FtsN、FtsK、FtsI、FtsW、ZipA、ZapA、TolA、TolB、TolQ、TolR、Pal、MinCD、MreB和Mld。
在抗菌应用中，本发明的EV有利地与来自细菌病原体物种的活力必需基因或毒力基因具有序列同源性，但与共生细菌基因组没有序列同源性。所述方法的这种有利的实施方案避免了对宿主中存在的共生细菌的附带效应。
针对这些基因中的一些的特别有用的序列在下面的实施例12以及以下中提供：SEQ ID NO：13-32和57-70用于铜绿假单胞菌，SEQ ID NO：71-74和33-34用于福氏志贺氏菌，SEQ ID NO：35-40用于金黄色葡萄球菌，SEQ ID NO：75-88用于结核分枝杆菌，SEQ IDNO：89-106用于嗜肺军团菌(参见表1中这些有用序列的详细信息)。
目标病毒基因
本发明的EV中含有的小RNA靶向的基因例如是：来自埃博拉病毒的NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24和/或L(RdRp)基因、来自HBV的preS1、PreS2、C、P、S和X基因、来自HCV的5’UTR、C、E1、E2、2、3、4B、5A、5B和/或3’UTR基因和区域、来自ZIKV的C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4B和/或NS5基因、来自CHIKV的5’cap、nsP1、nsP2、nsP3、nsP4、C、E3、E2、6K和E1基因、来自HIV的5’LTR、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev、env、nef和/或3’LTR基因和区域、来自流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和/或M基因、来自HPV的E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1和/或L2基因。
靶向SARS-CoV-2病毒区域的特别有用的序列在下面的实施例11以及以下中提供：SEQ ID NO：41-46(单个基因)和SEQ ID NO：1-12(多个基因)(参见表1中这些有用序列的详细信息)。
本发明的体外抗菌/抗病毒方法和用途
在另一方面，本发明涉及一种用于抑制目标致病细胞中至少一个基因的表达的体外方法，所述方法包括将所述目标致病细胞与本发明的一种或多种EV或与包含其的组合物体外接触的步骤。
换言之，本发明涉及本发明的EV或包含其的组合物的体外用途，用于抑制致病细胞中至少一个基因的表达，其中所述目标致病细胞与所述EV或与所述组合物直接接触。
本文中的“抑制至少一个基因的表达”是指所述基因的表达降低，即，目标序列的mRNA或蛋白质水平在统计学上低于合适对照中的同一目标序列的mRNA水平或蛋白质水平，所述对照暴露于靶向无关基因的对照小RNA。特别是，根据本发明降低目标基因的mRNA多核苷酸水平和/或多肽水平导致mRNA多核苷酸水平或由其编码的多肽水平达到在合适对照中的同一目标序列的小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％。测定RNA转录本的表达水平、由靶向基因编码的多肽的表达水平、或所述多核苷酸或多肽的活性的方法在本领域中是公知的。发明人还开发了报告系统(见下)。
在该方面，可以靶向任何类型的细菌。如上所述，可以靶向感染动物(包括人)宿主的致病菌，或对动物(包括人)宿主提供有益作用的有益(例如共生或共栖)细菌。
该方法对于抑制或限制体外、表面上或样品中的病原体的致病性和生长特别有意义。
在另一个实施方案中，如上所述，该方法还可以用于通过抑制直接或间接负调节细菌生长的基因来促进有益细菌的复制。
在另一个实施方案中，还可以使用该方法，通过靶向参与细菌对抗生素化合物的耐药性的基因来恢复细菌细胞对所述抗生素化合物的敏感性。
用本发明的药物组合物恢复抗生素敏感性
在另一方面，发明人提出使用本发明的EV，通过靶向参与细菌对抗生素化合物的耐药性的基因来恢复细菌细胞对所述抗生素化合物的敏感性。
本发明的组合物可以与其他化合物同时或连续应用。特别是，本发明的组合物可以与抗生素化合物一起应用，尤其是当它们携带的iRNA靶向抗生素耐药性基因时。
在这种情况下，本发明的组合物可以作为“试剂盒(kit of parts)”供应，所述试剂盒包含本发明的EV(上面定义的小RNA)和单独容器中的相应杀菌化合物。
因此，在进一步的方面，本发明因此涉及一种药用试剂盒，其含有：
a)如上所公开的本发明的源自小球藻的EV，其含有特异性抑制抗生素耐药性基因的小干扰RNA，或含有所述EV的治疗组合物，以及
b)抗生素化合物。
本发明的目的还在于这种药用试剂盒用于治疗和/或预防有需要的受试者的细菌感染的用途，以及使用所述药用试剂盒的治疗方法。
在另一方面，本发明涉及一种组合产品，其包含：
a)如上所公开的本发明的源自小球藻的EV，其含有特异性抑制抗生素耐药性基因的小干扰RNA，或含有所述EV的治疗组合物，以及
b)抗生素化合物，
其用于同时、分别或交错使用，用于预防和/或治疗有需要的受试者的细菌感染。
在优选的实施方案中，所述EV在所述抗生素化合物之前施用，优选在一周前，更优选在一天前施用。
在这些试剂盒和产品中，所述抗生素耐药性基因优选选自：VIM-1、VIM-2、VIM-3、VIM-5、CasE、OXA-28、OXA-14、OXA-19、OXA-145、PER-1、TEM-116和GES-9。
“抗生素化合物”是指用于或提出用于杀灭细菌的化合物。治疗领域中使用的经典抗生素化合物例如是铜基杀菌剂或源自大型生物和微生物的次生代谢物。这些包括但不限于：氨基糖苷类(Aminoglycosides)、碳青霉烯类(Carbapenems)、头孢他啶(Ceftazidime)(第3代)、头孢吡肟(Cefepime)(第4代)、头孢吡普(Ceftobiprole)(第5代)、头孢洛生/他唑巴坦(Ceftolozane/tazobactam)、氟喹诺酮类(Fluoroquinolones)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉维酸(Ticarcillin/clavulanic acid)、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、妥布霉素(Tobramycin)、巴龙霉素(Paromomycin)、链霉素(Streptomycin)、大观霉素(Spectinomycin)、格尔德霉素(Geldenamycin)、除莠霉素(herbimycin)、利福昔明(Rifaximin)、厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南(Imipenem)、美罗培南(Meropenem)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢拉定(Cephradine)、头孢匹林(Cephapirin)、头孢噻吩(Cephalothin)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢替坦(Cefotetan)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢美唑(Cefmetazole)、头孢尼西(Cefonicid)、氯碳头孢(Loracarbef)、头孢丙烯(Cefprozil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢克肟(Cefixime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢地托仑(Cefditoren)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢布烯(Ceftibuten)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、拉氧头孢(Moxalactam)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢菌素(Cephalosporins)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢菌素(Cephalosporins)、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢吡普(Ceftobiprole)、糖肽(Glycopeptides)、替考拉宁(Teicoplanin)、万古霉素(Vancomycin)、特拉万星(Telavancin)、达巴万星(Dalbavancin)、奥利万星(Oritavancin)、林可酰胺(Lincosamides)(Bs)、克林霉素(Clindamycin)、林可霉素(Lincomycin)、脂肽(Lipopeptide)、达托霉素(Daptomycin)、大环内酯类(Macrolides)(Bs)、阿奇霉素(Azithromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、红霉素(Erythromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、泰利霉素(Telithromycin)、螺旋霉素(Spiramycin)、非达霉素(Fidaxomicin)、单酰胺环类(Monobactams)、氨曲南(Aztreonam)、硝基呋喃类(Nitrofurans)、呋喃唑酮(Furazolidone)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)(Bs)、噁唑烷酮类(Oxazolidinones)(Bs)、利奈唑胺(Linezolid)、泼斯唑来(Posizolid)、雷得唑来(Radezolid)、特地唑胺(Torezolid)、青霉素类(Penicillins)、阿莫西林(Amoxicillin)、氨苄西林(Ampicillin)、阿洛西林(Azlocillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林(Mezlocillin)、甲氧西林(Methicillin)、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、青霉素G、青霉素、哌拉西林(Piperacillin)、替莫西林(Temocillin)、替卡西林(Ticarcillin)、青霉素组合、阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/clavulanate)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/sulbactam)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉维酸(Ticarcillin/clavulanate)、多肽类(Polypeptides)、杆菌肽(Bacitracin)、粘菌素(Colistin)、多粘菌素B(Polymyxin B)、喹诺酮类/氟喹诺酮类(Quinolones/Fluoroquinolones)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、吉米沙星(Gemifloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、那氟沙星(Nadifloxacin)、萘啶酸(Nalidixic acid)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、曲伐沙星(Trovafloxacin)、格帕沙星(Grepafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、替马沙星(Temafloxacin)、磺胺类(Sulfonamides)(Bs)、磺胺米隆(Mafenide)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺嘧啶银(Silversulfadiazine)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)、磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、磺胺二甲异噁唑(Sulfanilimide)(旧)、柳氮磺吡啶(Sulfasalazine)、磺胺异噁唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明)(Trimethoprim-Sulfamethoxazole(Co-trimoxazole))(TMP-SMX)、磺胺米柯定(Sulfonamidochrysoidine)(旧)、四环素类(Tetracyclines)(Bs)、地美环素(Demeclocycline)、多西环素(Doxycycline)、美他环素(Metacycline)、米诺环素(Minocycline)、土霉素(Oxytetracycline)、四环素(Tetracycline)、氯法齐明(Clofazimine)、氨苯砜(Dapsone)、卷曲霉素(Capreomycin)、环丝氨酸(Cycloserine)、乙胺丁醇(Ethambutol)(Bs)、乙硫异烟胺(Ethionamide)、异烟肼(Isoniazid)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、利福平(Rifampicin)、利福布汀(Rifabutin)、利福喷丁(Rifapentine)、链霉素(Streptomycin)、胂凡纳明(Arsphenamine)、氯霉素(Chloramphenicol)(Bs)、磷霉素(Fosfomycin)、夫西地酸(Fusidic acid)、甲硝唑(Metronidazole)、莫匹罗星(Mupirocin)、平板霉素(Platensimycin)、奎奴普汀/达福普汀(Quinupristin/Dalfopristin)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、替加环素(Tigecycline)(Bs)、替硝唑(Tinidazole)、甲氧苄啶(Trimethoprim)(Bs)等。
优选地，目标细菌随后选自：衣氏放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、百日咳博德特氏菌、疏螺旋体属(伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、阿弗西尼疏螺旋体、回归热疏螺旋体、麝鼠勺螺旋体、达氏疏螺旋体、赫姆斯氏疏螺旋体等)、布鲁氏菌属(流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌、猪布鲁氏菌)、空肠弯曲杆菌、衣原体属(肺炎衣原体、沙眼衣原体)、鹦鹉热衣原体、梭菌属(肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌)、白喉棒状杆菌、埃立克体属(犬埃立克体、查菲埃立克体)、肠球菌(粪肠球菌、屎肠球菌)、大肠杆菌O157:H7、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、钩端螺旋体属、单核细胞增生李斯特菌、分枝杆菌属(麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌)、肺炎支原体、奈瑟菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌)、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌、星形诺卡氏菌、立氏立克次体、沙门氏菌属(伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、志贺氏菌属(宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌)、葡萄球菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌)、链球菌属(无乳链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、草绿色链球菌)、福赛坦氏菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌等。
待使用的EV的量通常取决于细菌的数量和靶向细菌的类型。在待处理的分离细胞的体外应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100pM之间，优选在0.05和10pM之间。在待处理整个动物(特别是人)的体内应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100nM之间，优选在0.05和10nM之间，。
优选地，所述受试者为以下种类的动物：人、狼、家猫、马、家牛、绵羊、山羊、野猪、原鸡、火鸡、灰雁、绿头鸭、穴兔。
本发明的转基因小球藻细胞
用本发明的iRNA转化并能够生成本发明的小RNA的小球藻细胞在下文中命名为“本发明的转基因小球藻细胞”或“本发明的重组小球藻细胞”或“本发明的宿主细胞”。
这些生产者细胞可以是任何小球藻物种。特别是，它们可以是目前用作人和牲畜的食物补充的任何细胞。在具体的实施方案中，它们可以属于以下物种：椭圆小球藻、蛋白核小球藻、索罗金小球藻、普通小球藻或多变小球藻。
在另一方面，本发明涉及分离的小球藻细胞或稳定或瞬时表达至少一种本发明的功能性iRNA的转基因小球藻。它还涉及含有DNA或病毒载体的分离的小球藻细胞，所述DNA或病毒载体含有本发明的前体。所述小球藻细胞可以是用所述DNA构建体或载体转化而获得的基因修饰细胞。
如上所述，转化过程的例子是农杆菌介导的转化或鸟枪法介导的转化。
上面针对小球藻细胞、iRNA、前体、载体和转化方法提出的所有实施方案都涵盖在内，无需重复。
生成这种转基因小球藻的方法在下面的实施例部分中公开(实施例1)。它们含有以下步骤：
i)如上面所解释的，用表达至少一个本发明的长功能性干扰RNA的DNA载体转化小球藻细胞，或，
ii)用病毒感染小球藻细胞，所述病毒优选选自能够感染小球藻细胞的RNA病毒，其被工程改造为由其基因组表达至少一种本发明的功能性干扰RNA，
经过足够的时间(通常为3至8天)以使小球藻细胞稳定或瞬时表达显著量的小RNA。
本文中的“显著量”是指已在如上所述的测试中表明具有抗菌作用的量。在待处理的分离细胞的体外应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100pM之间，优选在0.05和10pM之间。在待处理整个动物(特别是人)的体内应用中，含有有效小RNA的EV的该量优选在0.05和100nM之间，优选在0.05和10nM之间。
特别是，所述转基因小球藻能够对病原体(例如病毒或细菌)进行宿主诱导的基因沉默，并且含有可表达的iRNA，所述iRNA能够下调或抑制所述病原体的至少一个基因的表达。
在另一方面，本发明涉及一种稳定或瞬时表达上述小RNA的目标转基因小球藻细胞。在一个实施方案中，所述目标转基因小球藻含有上述本发明的前体。
更准确地，本发明涉及一种含有并表达siRNA或miRNA前体的重组小球藻细胞，所述前体包含至少一个目标基因片段，所述小球藻细胞释放靶向所述基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
在一个优选的实施方案中，所述至少一个目标基因是卵菌基因、病毒基因、细菌基因、或真菌基因或任何其他病原体或寄生物的基因。
在一个优选的实施方案中，所述小球藻细胞选自：椭圆小球藻、蛋白核小球藻、索罗金小球藻、普通小球藻或多变小球藻。
在进一步的方面，本发明还涉及一种药物组合物，其含有稳定或瞬时表达上述小RNA的转基因小球藻细胞作为活性成分。更准确地，这些药物组合物有利地含有有效量的转基因小球藻细胞，其一旦应用于目标受试者就能够原位生产本发明的小RNA。在该方面，小球藻细胞的生物质可以作为膳食补充剂，更优选作为宠物食品补充剂。如上面题为“本发明的治疗方法和用途”的部分所公开的，它优选用作兽医治疗。
为了获得这些转基因细胞的高产率或提高这些转基因细胞生产EV的能力，可以遵循上面题为“本发明的生产方法”的具体部分中公开的建议。它们在这里比照适用，无需重复。
如先前所公开的，可以在适当的和/或环境可接受的载体中配制这些组合物。此类载体可以是待处理的个体可以耐受的任何材料。此外，载体必须使得组合物在控制感染方面保持有效。此类载体的例子包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、Hank’s溶液、和其他生理平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液。
本发明的平台
在最后一方面，本发明涉及一种用于高通量生产功能性EV包埋的干扰小RNA的多功能平台，所述平台使用如上所定义的重组小球藻细胞。
“多功能”是指该平台能够适应或被调节以适应许多不同的功能或活动，以快速的方式生成多种不同病原体的调节剂。
该平台被称为“MIGS平台”。它可用于生产大量siRNA群体，其靶向多达十几个基因中的长达1500bp的区域。因此，这些siRNA针对任何病原体均有效，所述病原体不能轻易建立耐药性机制。它们包埋在已知非常稳定且无毒/无免疫原性的细胞外囊泡中。该平台的所有优点已在上面突出显示。
发明人还生成了用于快速评估由转化小球藻参考系生产的每批次P40或P100级分的生物活性的工具。更准确地，他们工程改造了表达报告系统的细菌(在此是大肠杆菌K12菌株)，当EV包埋的siRNA被内化并在细菌细胞中发挥活性时，所述报告系统表现出差异性的siRNA靶向报告基因表达。
本文提出了五种不同的报告系统：
第一报告系统家族基于二分盒(bipartite cassette)的质粒表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即LacI-lite)的短寿命变体，在其5’或3’末端携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由pLac启动子指导并由lacO操纵子调节(图9A)。在没有EV包埋和/或相关的小RNA的情况下，LacI-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号。相反，当给定的小RNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，LacI-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号(图9A)。值得注意的是，LacI-lacO以外的其他系统也可以用于同一目的，如TetR-lite/tetO2或cI-lite/λPR系统。可以在目的质粒中将二分报告系统与适合在大肠杆菌和Pto DC3000中表达和复制的骨架组装在一起。然后可以在LacI-lite阻遏子的3’端引入目标基因(本文中例如Pto DC3000基因fusA)特异性的小RNA目标序列。可以用IPTG孵育转化的细菌细胞，可以测量OD600和GFP荧光。可以使用-IPTG和氯霉素对照对+IPTG条件的GFP荧光进行归一化，以便在去除背景信号后确定正确的诱导动力学。
可以生成基于GFP的报告基因的第二报告系统，通过将强组成型启动子pCMV组装至在编码序列的3’末端与小RNA目标序列融合的GFP转基因来进行(图9D)。该报告基因可以进一步转染至用候选EV群体处理的人细胞中，并且可以通过不同的方法(包括在处理后24小时和48小时进行蛋白质印迹分析)进一步监测GFP蛋白的沉默。
第三报告系统家族依赖于基于质粒的盒的表达，所述盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体组成型表达非靶向DsRed报告基因，其用作用于归一化的内部对照，所述第二构建体携带不稳定化的GFP报告基因，在其下游区域(或上游区域)含有目的抗菌siRNA目标区域(图9E)。当在细菌(例如大肠杆菌)中表达时，在给定的有效EV包埋的siRNA群体被内化后，该系统将导致GFP表达和荧光信号特异性降低。
第四报告系统家族基于三分盒(tripartite cassette)的质粒表达，所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子的短寿命变体(即TetR-lite)，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制，所述第三构建体表达非靶向DsRed报告基因，其作为用于归一化的内部对照(图9F)。在没有EV包埋的小RNA的情况下，TetR-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号(应当仅检测到DsRed报告基因的荧光)。相反，当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号。
第五报告系统家族依赖于基于质粒的二分盒的表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或上游区域)携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)或由生物发光报告基因(例如发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)操纵子luxCDABE(Meighen，1991))组成，其转录活性由tetO2(或tetO1)操纵子控制(图9G)。当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP或luxCDABE操纵子表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号或生物发光信号。值得注意的是，TetR-tetO2以外的其他系统也可以用于同一目的，如lacI-lite/lacO或cl-lite/λPR系统。
这些报告系统也是本发明的一部分，将有助于在产品制造之前验证EV包埋的siRNA批次的生物活性。
除了以上布置以外，本发明还包含其他布置，其将从下面的描述中显现，其参考本发明的主题的示例性实施方案并参考附图和序列的表，其中：
表1：实施例中所用工具的序列详细信息
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附图说明
图1.小球藻EV的散射和荧光NTA分析
A)来自P40级分的整体小球藻颗粒的尺寸分布，通过散射分析(使用ParticleMetrix ZetaView系统)确定。
B)来自P100级分的整体小球藻颗粒的尺寸分布，通过散射分析(使用ParticleMetrix ZetaView系统)确定。
C)P100小球藻EV的透射电子显微镜(TEM)图像。
D)由TEM图像测量的P100小球藻EV的尺寸分布(n＝609)。
E)来自P40级分的PKH26标记的小球藻颗粒的尺寸分布(使用Particle MetrixZetaView系统)。使用488nm激光器进行测量。
图2.多变小球藻AGO和DCL蛋白的系统发育分析以及来自普通小球藻参考转基因系的小RNA的RNA测序分析
A)NJ树(1000个引导)，分别包括来自植物、动物、真菌和藻类的111个AGO序列和77个DCL序列。显示了多变小球藻AGO和DCL蛋白的位置。树在中点生根。
B)拟南芥(Arabidopsis)IR-CFA6/HRPL#4和小球藻参考转基因系IT20-3的小RNA之间的比较尺寸分布谱。来自小球藻的最丰富的小RNA群体长18nt，而在拟南芥中它们长21和24nt。同样值得注意的是，小球藻和拟南芥分别在15和16nt处表现出小RNA物种的小峰。该分析中分别显示了两个生物学重复。
图3.可以工程改造普通小球藻以生产靶向Pto DC3000毒力因子cfa6和hrpL的活性小RNA
A)IT20构建体的示意图，该构建体被设计为在组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制下表达靶向Pto DC3000 cfa6和hrpL mRNA的小RNA。使用Green Gate组装策略，在有义(B模块)和反义(D模块)方向上克隆了靶向两个毒力基因的嵌合的504bp区域。
B)在感染后3小时(hpi)对用以下孵育的拟南芥(登录号Col-0)叶切片进行气孔重新开放测定：水(模拟)或来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)、野生型小球藻或表达IR-CFA6/HRPL转基因的转基因小球藻系的总RNA(20μg)。将叶子与野生型(Pto/Pto Wt)或突变Pto DC3000菌株孵育(值得注意的是，PtoΔCor的cfa6基因缺失，因此气孔重新开放发生改变)。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析(2way ANOVA)进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
C)小RNA读取的覆盖度，显示沿IR-CFA6/HRPL反向重复序列(在负链和正链两者上)的映射读取总计数。黑色读取映射至cfa6序列区域，而深灰色读取映射至hrpL序列区域。
图4.针对Pto DC3000 hrpL转录本的小球藻人工小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因。
A)Pto DC3000ΔhrpL菌株以及分别用编码WT hrpL或mut hrpL(在组成型启动子NPTII的控制下)的质粒转化后生成的补充菌株的示意图。
B)在3hpi，在用以下孵育的拟南芥(Col-0)叶切片上进行气孔重新开放测定：来自拟南芥(At)或表达IR-HRPL构建体的小球藻转基因系(拟南芥，克隆IT29#4；小球藻，克隆IT29#12和IT29#15)或表达对照IR-CYP51构建体的小球藻转基因系(小球藻，IT19#7)的总RNA(20μg)。如图3B所述评估气孔重新开放反应。
图5.使用来自转基因普通小球藻系的浓缩培养基(CM)和P40级分进行气孔重新开放测定
A)在3hpi，在用以下孵育的拟南芥(Col-0)叶切片上进行气孔重新开放测定：水(模拟)、来自小球藻转基因系(IT20#3和IT20#5)和野生型(Wt)系的总RNA(20μg)或浓缩培养基(CM)。还使用来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4参考系的总RNA(20μg)作为对照。叶切片接种Pto DC3000 Wt或突变菌株。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
B)如A)中那样，除了来自IT20#3系的P40级分用于该测定。还使用来自同一小球藻转基因系的RNA提取物作为阳性对照。N，分析的气孔的总数。使用双因素方差分析进行统计分析，并与模拟条件进行比较(p值：ns>0.05；***<0.001；****<0.0001)。
C)如B)中那样，但在37℃，在存在或不存在300U/ml Mnase的情况下孵育P40级分30’。通过加入终浓度为20mM的EGTA来阻断消化反应。
D)描绘了来自P100级分样品的小RNA读取的覆盖度，其计算为沿IR-CFA6/HRPL反向重复序列的映射读取总计数，包括构建体的正链和负链两者。黑色读取映射至cfa6序列区域，而深灰色读取映射至hrpL序列区域。
E)使用补充Wt或Mut hrpL版本的Pto DC3000ΔhrpL细菌进行气孔重新开放测定。如前所述，用Mnase处理来自小球藻IR-HRPL(IT29#12)和IR-CYP51(IT19#7)系的P40和P100EV级分，然后进行测定。如A)中所述评估气孔重新开放反应。
图6.通过共聚焦荧光显微术、流式细胞术和酶标仪分析PKH26标记的小球藻EV在A549和A549-ACE2细胞中的内化
A)用或未用来自P40级分的PKH26标记的小球藻EV孵育的A549细胞的共聚焦荧光显微术图像。蓝色为核基因组DNA的DAPI染色；红色为小球藻EV脂膜的PKH26染色。在A549-ACE2细胞中获得了类似的结果(未显示)。
B)通过流式细胞术对PKH26标记的小球藻EV在A549-ACE2细胞中的内化进行定量。用0.06pM或0.5pM PKH26标记的EV孵育细胞，并测量5000个细胞上的荧光内化。用FlowJo10.7软件进行数据分析。当分析50000个人细胞时获得了类似的结果(未显示)。
C)原始荧光数据显示48小时时程实验中A549-ACE2细胞中DiR标记的EV内化的动力学。像素表示孔的离散部分，显示每个孔中NIR强度的空间分布。
D)在48小时时程实验中A549-ACE2细胞中DiR标记的EV内化的动力学。条形表示在不同时间点的NIR荧光信号的净强度。
图7.用来自不同转基因系的不同量的小球藻EV处理后的细胞活力
通过生物发光测定来确定细胞活力，所述测定对培养基中活细胞释放的ATP的量进行量化。使用未处理(Ctl)和20％ EtOH处理的细胞(EtOH)作为对照。Wt对应于菌株，IT54表达靶向SARS-CoV-2(SC2)RdRp转录本的IR构建体；IT64同时靶向以下SC2转录本：Nsp14、Nsp13、Nsp12、Nsp5、Nsp4、Nsp3、Nsp1；IT66靶向4种人转录本：Rpl13、eIF3e、eIF3i、eIF3f；IT69靶向LUC转基因的转录本。
图8.SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS病毒中Nsp12、Nsp13和刺突(Spike)IR序列保守性的示意图
将用于生成靶向SARS-CoV-2(SC2)基因Nsp12、Nsp13和刺突的构建体的IR区域与SARS-CoV-1(SC1)和MERS病毒的相应序列进行比对。总体而言，在所考虑的区域，SC1和SC2之间的相似性范围大约75-92％，而MERS-SC2约为67-71％。n.a.：来自SC2病毒的所选择的IR区域与MERS刺突(Spike)DNA序列没有显著相似性。
图9.将用于监测细菌细胞中EV包埋的siRNA活性的报告系统的示意图
A)二分盒的示意图，所述二分盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性增益。该系统由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描绘的lacI-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或潜在地在其上游区域)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的nptII启动子序列)和下游终止子序列(例如SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))，其转录活性由pLac启动子中的lacO操纵子控制，并由下游终止子序列(例如SoxR终止子序列)组成。在正常情况下，GFP表达被LacI-lite阻遏子的存在所阻遏(1)。靶向调节区域“X”的EV含有的小RNA触发这种阻遏子的沉默，从而释放抑制并允许GFP表达(2)。
B)在含有R37构建体的大肠杆菌TOP10细胞上，不同浓度的IPTG介导荧光诱导动力学。该构建体具有小RNA靶向区域，其对应于Pto DC3000基因fusA，克隆在lacI基因的3’末端。通过减去-IPTG和+氯霉素条件的荧光值得到的GFP荧光用作对照。通过在37℃用特定的滤光器每5’执行一次数据采集，持续15小时，来在Tecan Infinite 200读板器系统中监测荧光和OD600(未显示)。
C)在含有R37构建体的Pto DC3000 Wt细胞上，IPTG介导的荧光诱导动力学。通过减去-IPTG和+氯霉素条件的荧光值得到的GFP荧光用作对照。通过在28℃用特定的滤光器每5’执行一次数据采集，持续15小时，来在Tecan Infinite 200读板器系统中监测荧光和OD600(未显示)。
D)报告系统的示意图，所述报告系统设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性损失。所述系统由在组成型启动子pCMV控制下的表达GFP的盒组成。GFP在其3’末端与小RNA目标序列(X)融合。在正常情况下，GFP连续表达(1)。用靶向调节区域“X”的EV含有的小RNA处理会触发GFP mRNA降解和蛋白质水平降低，这尤其可以通过蛋白质印迹分析进行监测(2)。
E)第一双报告基因家族盒的示意图，所述盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性降低。双报告基因盒由第一DsRed报告基因构建体和第二构建体组成，所述第一DsRed报告基因构建体由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的Rpsm启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的TonB终止子序列)驱动；所述第二构建体由不稳定化的GFP报告基因版本(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))组成，在其下游区域(或上游，未显示)含有克隆的目的siRNA目标序列区域，由组成型启动子驱动(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)，并具有下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)。
F)第二三分盒的示意图，所述三分盒设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测GFP表达的特异性增益。所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描述的TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或最终在其上游区域，未显示)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))，其转录活性由tetO2操纵子控制，并由下游终止子序列组成(作为例子，例如此处描绘的soxR或tonB终止子序列)；所述第三构建体包括DsRed报告基因序列，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的Rpsm启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的TonB终止子序列)驱动。
G)第三二分盒的示意图，其设计为在用给定的EV包埋的siRNA群体处理后检测报告基因表达的特异性增益。所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体包括转录阻遏子(如所描述的TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域(或最终在其上游区域，未显示)中含有目的siRNA目标区域，由组成型启动子(作为例子，例如此处描绘的NPTII启动子序列)和下游终止子序列(作为例子，例如此处描绘的SoxR终止子序列)驱动；所述第二构建体包括不稳定化的GFP报告基因序列(例如在其下游区域携带降解标签的GFPsmf2序列或中等稳定性GFP变体gpf-aav序列(Campbell-Valois等人，2014；Elowitz&Leibler，2000))或生物发光报告基因(例如发光光杆状菌操纵子luxCDABE(Meighen，1991))，其转录活性由tetO2操纵子控制，并由下游终止子序列组成(作为例子，例如此处描绘的soxR或tonB终止子序列)。
图10.在光生物反应器中培养参考小球藻系不影响相应EV级分的质量和功能性
A)可以容易地在不同尺寸的光生物反应器(PBR)(1至150L PBR)(AlgoSolis，Saint Nazaire，法国)中培养转基因小球藻，如IT20#3参考系。
B)用来自1L PBR培养物的P40级分的PKH26标记的小球藻EV处理或不处理的A549细胞的共聚焦荧光显微术图像。蓝色为核基因组DNA的DAPI染色；红色为EV脂膜的PKH26染色。
C)通过散射分析(使用Particle Metrix ZetaView系统)测定小球藻颗粒在0-500nm范围内的尺寸分布，所述小球藻颗粒来自从150L PBR培养物中获得的P40级分。
D)使用Particle Metrix ZetaView系统测定PKH26标记的小球藻颗粒在0-500nm范围内的尺寸分布，所述小球藻颗粒来自从150L PBR培养物中获得的P40级分。使用488nm激光器进行测量。
E)使用来自参考IT20#3和对照IT19#7系的总RNA和P40级分进行气孔重新开放测定。如所描绘的，使用来自不同生产系统的细胞生物质和培养基来制备样品。如先前所述评估气孔重新开放反应。
图11.用热杀细菌的上清液处理会改善小球藻EV的生产和/或分泌
A)增加EV生产的处理方案。使新鲜稀释的小球藻培养物生长至早期稳定期(2至4×106个细胞/ml)。然后用相当于25mg/ml的上清液处理培养物，所述上清液来自重悬于水中的热杀大肠杆菌和Pto DC3000细胞。在两天后，收集来自不同处理(未处理、+大肠杆菌和+Pto DC3000)的P100级分并进行定量。还确定了小球藻细胞的总数以检查对微藻生长的可能影响。
(B)未处理(Ctl)、+大肠杆菌和+Pto DC3000(DC3000)培养物的P100级分中的颗粒浓度。N＝4个独立的生物学重复。
具体实施方式
实施例
实施例1：材料和方法
普通小球藻材料和生长条件
野生型普通小球藻藻株UTEX265保持于1％ BG11琼脂平板中，并在Sanyo MLR-351生长室中在自养条件下生长。环境条件设定为25℃，14h/10h光周期和约100μmol/m2/s的光强度。在相同的条件下，使用含有20μg/ml潮霉素的平板保持转基因小球藻系。通过在充气的25cm2塑料烧瓶中接种BG11(pH 7)中的单个菌落而不搅拌来开始液体培养，然后每周定期稀释一次或两次(稀释比例1:10)，以达到最终体积(200-800ml，分在数个充气的75cm2烧瓶中)。使用Malassez室评估培养密度。为了评估培养物的无外来污染性，通过将1ml培养物加入补充有蛋白胨的BG11中来进行常规污染测试。混合物避光保持3周，使细菌生长，然后进行显微镜观察。150L PBR中的小球藻生产在连续光周期制度下进行，白光的光强度从150增加至400μmol/m2/s以应对PBR中不断增长的细胞密度，平均温度为22.9±6℃，固定pH值为8。在这些标准生长条件下，转基因小球藻细胞在8天后达到约1.1g/L的最大培养密度。通过以下进行无细胞培养基收集：以3600g连续两轮离心，以进行总细胞沉淀，并以4000g离心以去除所有剩余的细胞。
生物信息学、序列保守性和系统发育分析
为了鉴定属于囊泡和细胞外囊泡生物发生或功能的序列，使用候选的人和植物序列作为NCBI和JGI(多变小球藻)数据库的BLASTP分析查询。保留前10次命中并用于与查询序列进行局部比对。还在Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)数据库上分析了最佳候选物(即序列相似性最高的候选物)，并使用PHMMER搜索(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)以将蛋白质结构域组成与查询进行比较。认为显示出高序列相似性和保守结构域组成的小球藻蛋白是“推定直系同源物”。
对于普通小球藻分析，使用UTEX 395株的转录组(Guarnieri等人，2018)进行局部blastp和blastn搜索。如前所述分析检索到的序列的相似性和结构域结构。
对于小球藻AGO和DCL系统发育分析，将人和拟南芥的AGO和DCL的蛋白质序列用作针对多变小球藻基因组(JGI)的BLASTP分析的查询。植物、动物和真菌AGO(Murphy等人，2008)和DCL(Mukherjee等人，2013；Gao等人，2014)的蛋白质序列获自文献。初步比对后共保留111个AGO蛋白和77个DCL蛋白，消除歧义的序列。分析蛋白质结构域结构以明确识别与典型蛋白相似的AGO和DCL蛋白。手动剪切序列比对，以仅保留最保守的区域进行分析，对于AGO对应于288aa，对于DCL对应于436aa。MEGA X软件用于进行NJ系统发育，使用FigTree1.4编辑树。
生成用于在小球藻中生产小RNA的构建体
使用Green Gate组装策略生成了反向重复构建体，其设计为生产靶向来自各种细菌植物病原体的毒力基因和必需基因的特定区域(140-400bp)的人工小RNA。将基因特异性靶向区域或嵌合靶向区域克隆为“B”(有义)和“D”(反义)模块，并组装在表达构建体中。所有生成的发夹均含有来自牵牛花查耳酮合酶基因CHSA(SEQ ID NO：107)的特定内含子序列，并在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下，包括潮霉素耐药性盒。先前已描述了嵌合cfa6-hrpL构建体(IT20)(PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。组装为靶向来自人致病菌铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌和结核分枝杆菌的基因的表达构建体的精确目标区域示于下表中：
SARS-CoV-2特异性的表达构建体靶向病毒基因组的以下区域：
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嵌合抗病毒(SARS-CoV-2)和抗HSF(人)构建体同时靶向病毒RNA或人转录本的以下区域：
通过将不同DNA片段同时连接成“B”Green Gate模块来获得所有嵌合构建体，并使用特异性寡核苷酸来生成和克隆反向平行链作为“D”模块。通过限制性分析、Sanger测序验证所有质粒，然后通过电穿孔法引入根癌农杆菌C58C1菌株中。
普通小球藻转基因系的生成
使用卸甲的根癌农杆菌菌株进行普通小球藻基因转化。更详细地，将来自指数生长培养物的总共5×106个细胞接种在BG11琼脂平板上，并在正常光辐照度下生长5天。在转化前一天，预接种来自甘油储备液或在28℃、180rpm振荡下LB平板的根癌农杆菌，其携带合适的反向重复构建体。转化当天，使用5mL根癌农杆菌预接种物接种50ml LB并生长至OD600＝0.8-1.2。在正确的光密度时，收集、洗涤细菌并以OD600＝0.5重悬于诱导培养基(BG11，pH5.6，乙酰丁香酮100μM)中。将小球藻细胞从平板上轻轻刮下，重悬于200μl细菌中，并在25℃、在诱导培养基琼脂平板上避光共培养2天。共培养后，收获细胞，放入补充有50μg/mLTIM或头孢噻肟的7ml BG11中，并在25℃避光放置2天。最后，收集细胞并接种至补充有20μg/ml潮霉素和50μg/ml替卡西林二钠/克拉维酸钾(TIM，T0190，Duchefa)或头孢噻肟(C7039，Merck)的BG11琼脂平板上。避光放置2天后，将板暴露于光照。2-3周后，将20-30个群落接种在具有20μg/ml潮霉素的新鲜BG11琼脂平板上。
普通小球藻转基因品系的选择与鉴定
为了鉴定携带表达构建体的克隆，从转化体群落中收集gDNA，如下。用无菌塑料枪头从琼脂平板上生长的群落刮下一些小球藻细胞，并放入10μl HotShot5裂解缓冲液(150mM NaOH，0.1mM EDTA，1％ Triton X-100)中。在RT孵育混合物10’，并在95℃煮沸15’。然后通过加入100μl H2O来稀释裂解物，1-5μl用作使用IT特异性寡核苷酸的PCR反应的模板。纳入野生型株作为阴性对照，对应的IT质粒(每个反应5ng)作为阳性对照。
总RNA提取(小球藻)
通过离心(Beckman转头JS5.3，5000g，15’，18℃)收获50-800ml液体小球藻培养物(5×106-1×107个细胞/ml)，在1×PBS中洗涤沉淀并在液氮中快速冷冻。使用研钵和研杵在液氮中将冷冻颗粒研磨成细粉。根据制造商的说明，使用约100mg粉末，使用Tri-Reagent(Sigma，St.Louis，MO)进行总RNA提取。
小球藻EV级分的纯化
为了分离小球藻EV，采用了两种无细胞培养基浓度/纯化策略：通过离心浓缩(Pall macrosep 100kDa设备)或切向流过滤(Sartorius VivaFlow 50R 100kDa设备)。对于第一种方法，进一步离心在细胞分离后收集的BG11(Beckman转头JS5.3，5000g，10’，18℃)以消除所有残留细胞。然后根据制造商的说明使用Pall Macrosep100kDa设备(MAP100C37)过滤上清液。然后使回收的浓缩培养基(CM)通过0.45μm过滤器并储存于4℃，然后进行进一步的纯化步骤。对于第二种策略，进一步离心在细胞分离后收集的BG11(Beckman转头JA18，10000g，10’，4℃)并真空过滤至0.65μm Whatman纸过滤器上，以消除所有残留细胞。然后根据制造商的说明，使用Sartorius VivaFlow 50R 100kDa系统(VF05H4)过滤上清液。然后使回收的浓缩培养基(CM)通过0.45μm过滤器并用于纯化小球藻EV。从CM开始，通过在4℃、在Sorvall WX 80超速离心机(ThermoFisher)中以40000g超速离心1小时来获得P40级分，以100000g获得P100级分。离心后，弃去上清液，将纯化的EV沉淀(来自P40或P100纯化)重悬于1ml过滤的1×PBS中，并使用0.22μm过滤器过滤。对于样品质量分析，使用纳米颗粒跟踪系统(ParticleMetrix ZetaView)处理了1/200的EV样品。为了估计样品中外泌体样EV的量，使用PKH26染料标记颗粒。
为了从150L PBR的无细胞细胞外培养基中回收P40级分，采用了改进的超滤和超速离心方案。首先，在Millipore玻璃纤维预过滤器AP25(2μm)上进行两轮真空过滤。然后以5000g(10’，4℃)离心样品，然后在MF-Millipore 0.65μm过滤器上进行第二次真空过滤，以消除仍存在于无细胞培养基中的悬浮有机物质。然后如上所述处理澄清的培养基，以通过离心过滤和超速离心纯化P40级分。
使用细菌上清液提高小球藻EV生产
稀释新鲜(最多4天)Wt小球藻培养物，并以≈5×105个细胞/ml分在3个不同的75cm2充气烧瓶中，培养物50ml。使烧瓶达到指数期的结束，在我们的条件下≈3/4天，2/4×106个细胞/ml，然后开始用细菌上清液处理。在汇合生长时从平板上刮下细菌，大肠杆菌K12、TOP10和Pto DC3000 Wt，将回收的沉淀重悬于300μl H2O中并称重，然后在95℃热灭活15’。通过离心将灭活的细菌旋转沉淀，并将上清液稀释至10μg沉淀/100μl的浓度。用细菌上清液处理小球藻培养物至终浓度为10μg/100ml，然后放回培养箱中，在标准条件(25℃，14/10光/暗，无振荡)下48小时。在孵育结束时，使用Malassez室对小球藻细胞进行计数，以验证处理不会影响细胞生长。然后，如上所述制备P100级分(Sartorius Vivaflow 50R100kDa)并通过NTA分析进行分析。
用PKH26或DiR染料标记EV
对于使用PKH26染料(Sigma)标记EV，将P40级分和含有相同体积BG11培养基的超速离心管用稀释剂C加至1ml。然后，根据制造商的方案将6μl PKH26染料加至两管中。连续混合样品30”并孵育5’。在室温孵育后，加入2ml 1％ BSA的PBS溶液，并用BG11加至体积为8.5ml。在沉淀前，在超速离心管底部仔细形成1.5ml 0.931M葡萄糖溶液分层。在4℃以190000g超速离心样品2小时，并小心弃去所有上清液。在4℃以100000g用1×PBS洗涤所得沉淀30’。使标记的EV通过0.45μm过滤器进行注射器过滤，然后进一步处理(NTA分析或内化实验)。
对于DiR标记，制备染料在100％乙醇中的1mg/ml工作溶液，并将5μl该溶液加至1ml新鲜制备的P40级分中，终浓度为5μM。在37℃孵育样品1小时，然后在4℃以100000g离心30’。在4℃以100000g用1×PBS洗涤所得沉淀30’，以去除游离染料，最后重悬于1ml 1×PBS中。在使用前使标记的EV通过0.45μm过滤器。
EV内化分析(流式细胞术和酶标仪)
通过流式细胞术评估PKH26标记的EV的内化。用1×PBS洗涤用PKH26标记EV孵育的A549-ACE2细胞5次。最后一次洗涤后，在37℃用胰蛋白酶-EDTA 1×处理细胞5’以使它们从烧瓶分离。收集后，将细胞以200g离心3’，用1×PBS洗涤两次，重悬于200μl BSA 0.5％的PBS 1×溶液中，并在分析前置于冰上。对于每个样品，处理并使用合适的荧光通道分选5000和50000个之间的细胞。使用FlowJo 10.7软件分析数据。
使用酶标仪分析DiR标记的细胞内化动力学。用0.5pM DiR标记的EV(3×108个颗粒/ml)孵育A549-ACE2细胞，每次测试50000个细胞。在TECAN Infinite 200酶标仪中孵育2、4、24和48小时后，使用以下设置测量DiR荧光：激发750nm，发射782nm，增益255。在Excel上导出和分析数据。
标记EV的共聚焦显微术观察
对于显微镜观察，在处理前24小时使A549-ACE2细胞在聚赖氨酸处理的盖玻片上生长。第二天，在RT用PHK26标记的EV孵育细胞，并在孵育4小时后使用4％ PFA固定15’。用1×PBS洗涤3次后，加入10μl DAPI(2μg/ml)，并在RT避光孵育细胞5’。最后用1×PBS洗涤样品3次，将盖玻片安装至载玻片并在4℃避光储存，然后显微镜观察。使用Leica SP5显微镜获取细胞的共聚焦图像，并用ImageJ 1.53c处理图像。
气孔重新开放测定
植物(4/5周龄，8h/16h光/暗光周期)在进行任何处理之前保持在光照(100μE/m2/s)下以确保气孔完全扩张。将完整的幼叶切片(每种条件至少6个)浸入水或细菌悬浮液中(浓度为108cfu/ml，OD600＝0.2)。在细菌感染前一小时，用EV(从≈10pM开始)或总RNA(20μg)处理切片。用细菌感染3小时后，用碘化丙啶(10ng/ml H2O溶液)标记叶切片10’，在H2O中洗涤5’，并在SP5激光扫描共聚焦显微镜下观察。对于每种条件，从不同的叶表面区域拍摄10-15张图片。从图片中，使用ImageJ 1.53c手动测量气孔以获得其宽度和长度，每个条件至少60个气孔。使用excel计算宽度/长度比，并使用双因素方差分析检验进行统计分析。
对于Mnase保护测定，在与叶切片孵育之前，通过在37℃、在存在或不存在300U/mlMnase的情况下孵育30’来处理样品。通过加入EGTA至终浓度为20mM来停止反应，然后使用样品进行气孔重新开放测定。
生成构建体以检测细菌和真核细胞中的小RNA活性
为了检测来自总RNA提取物或纯化的EV样品中的小RNA活性，使用Green gate方法生成了功能获得的基于lacI的报告基因构建体。使用抑制质粒(repressilator plasmid)作为PCR扩增的模板将报告系统的所有元件克隆在不同的Green gate模块中(Elowitz和Leibler，2000)。该策略旨在在同一构建体中组装两个不同的盒：一个组成型表达LacI阻遏子，其在5’或3’末端融合至siRNA目标序列(盒C-F)，一个仅在没有LacI阻遏子的情况下表达GFP报告基因(盒A-B)。为此，克隆pLac(与RBS)启动子作为A模块，克隆不稳定化的GFPaav与tRrnB T1终止子作为B模块，组成型pNPTII启动子(与RBS)作为C模块，LacI-lite不稳定化阻遏子作为模块D和E，小RNA目标区域作为模块D和E，以及tRrnB T1终止子作为模块F。选择在LacI基因3’末端带有fusA目标区域的构建体R37，以使用lacI抑制剂IPTG测试大肠杆菌TOP10细胞中GFP诱导的动力学。
对于真核细胞中的报告系统，在pDEST FHA质粒(Invitrogen Gateway)中组装荧光缺失系统，其与EGFP融合。在pCMV启动子表达下，在EGFP基因的3’末端克隆了大约100bp的小RNA目标区域，其两侧为AscI和BstBI限制性位点，所述pCMV启动子含有相同位点，生成以下报告(参见下表)。
使用细菌报告系统检测小RNA活性
为了在细菌细胞中测试报告基因构建体，在37℃，180rpm将携带R37构建体的大肠杆菌TOP10细胞O/N接种于补充有50μg/ml大观霉素的LB中。第二天，通过将O/N培养物1:1000接种于新鲜培养基中，在相同条件下进行4-5小时的过日(overday)培养。在预培养结束时，测量OD600并连续稀释培养物以达到OD600＝0.02。将总共180μl稀释的培养物按两个技术重复放入96孔板中，以在TECAN Infinite 200Pro读板器中进行动力学。用含有不同IPTG浓度(1至0.001mM)(+IPTG条件)、25μg/ml氯霉素(背景对照)或用H2O稀释的LB(-IPTG条件)的20μl LB处理细胞。通过读板器中的特定滤光器的方式，在12-16小时反应动力学内在每个时间点(5’)同时测量OD600和GFP荧光。在动力学结束时，分析OD600值以确认细胞在时间过程中正确生长。如下对GFP荧光进行归一化：从对照氯霉素孔和-IPTG条件的平均值中减去+IPTG处理的技术重复的平均值。
EV处理的A549-ACE2细胞的细胞活力测定
对于细胞活力测定，将25000个A549-ACE2细胞按三个重复接种于96孔板中，并用含有不同EV浓度的100μl培养基孵育24小时。未处理细胞、仅具有培养基的孔(以测量背景发光)以及在RT用20％乙醇处理20分钟的细胞(有毒化合物的阳性对照)用作对照。对于发光读数，每孔加入100μl CellTiter-Glo 2.0发光细胞活力测定试剂(Promega)。在定轨振荡器上混合样品2’，并在RT孵育10’。将样品转移至Grenier 96孔白底板，并使用BertholdTechnologies发光计(Tristar LB941)读取发光值。导出数据并在Excel上分析，并计算每个重复(每次测试3个技术重复)相对于未处理细胞的活力百分比。
小RNA测序和数据挖掘
通过构建了多达43个核苷酸的自定义文库并进行测序，所述文库用于对来自小球藻参考系IT20-3(IR cfa6/hrpL)的P100级分的总RNA和源自EV的RNA进行小RNA测序。使用UMI库v0.2.3(https://github.com/CGATOxford/UMI-tools)剪切读取衔接子。基于Q20的碱基判定(base-call)阈值(99％的碱基判定准确率)来过滤掉低质量的读取。为了表示由cfa6/hrpL发夹生产小RNA，我们选择了在10和25个核苷酸之间的读取大小子集，用于进一步分析和图形表示。使用bowtie将读取映射至IR cfa6/hrpL序列(Langmead等人，2009)，允许零错配。然后，我们使用内部R脚本从“.bam”文件中加载比对的读取，并使用GenomicAlignments包(https://github.com/Bioconductor/GenomicAlignments)表示cfa6/hrpL发夹两个末端的读取丰度。
小球藻EV的透射电子显微术观察
对于透射电子显微术，将一滴纯化的EV(2至10μl，109至1011个颗粒/ml)沉积在formvar/碳涂覆的网格上20’。孵育后，去除多余的样品，并在RT用2％多聚甲醛/1％戊二醛的0.1M PBS溶液(pH 7.4)固定网格20’。在H2O中洗涤1’6次后，用乙酸铀酰的甲基纤维素溶液(4％乙酸铀酰的H2O/甲基纤维素溶液，比例为1:9)增强样品衬度(contrast)10’。在孵育期结束时，去除多余的衬度并风干网格，然后进行可视化。在配备4k CCD相机的TecnaiSpirit电子显微镜(Thermo Fisher，Eindhoven，荷兰)上获取电子显微照片。
实施例2：小球藻微藻具有高度保守的EV生物发生因子以及与植物相关的EV因子
为了确定小球藻是否可以用作用于生产EV包埋和/或相关的小RNA的支架，我们首先研究了可能存在于其基因组或转录组中的EV生物发生及功能所需的核心成分。为此，我们使用多变小球藻NC64a、普通小球藻UTEX 395、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、人和拟南芥的可用基因组和转录组进行了计算机比较分析。该分析的结果揭示，多变小球藻编码ESCRT-I、ESCRT-II和ESCRT-III复合物以及植物FREE1/FYVE1样蛋白(一种植物特异性ESCRT，其对细胞内囊泡生物发生至关重要)的推定直系同源物(表2，Kolb等人，2015)。通过分析普通小球藻UTEX 395转录组，我们还能够鉴定出EV生物发生涉及的大多数典型ESCRT因子。令人惊讶地，尽管在多变小球藻的转录组中检索到单个编码经典ESCRT-0相关蛋白(例如人STAM1/2)的转录本，我们没有在多变小球藻的基因组中鉴定出这种推定因子。然而，人和普通小球藻蛋白之间的低序列相似性表明，小球藻ESCRT-0复合物更可能由不同的且仍然未知的因子组成。另一个非常有趣的观察结果是小球藻基因组和转录组中明显没有四次穿膜蛋白：使用特定候选物(例如人CD63)或四次穿膜蛋白结构域(PF00335)针对Pfam或JGI蛋白质结构域数据库的搜索未能鉴定出此类因子，已知此类因子存在于植物和哺乳动物两者中。在其他绿藻中也没有观察到四次穿膜蛋白(Wang等人，2012)，虽然认为该蛋白质家族存在于所有多细胞生物中，但在单细胞物种中，数据显示基因增益和损失的情况更复杂，需要进一步研究。
表2：酵母、人、植物和小球藻中编码ESCRT复合物和其他微囊泡相关蛋白的因子的比较
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相比之下，在小球藻中回收了潜在的ESCRT非依赖性EV生物发生因子，如Rab GTP酶(例如人Rab27a和Rab27b的直系同源物，其控制外泌体分泌的不同步骤(Ostrowski等人，2010))。此外，我们检索到了突触融合蛋白PENETRATION1(PEN1)的推定直系同源物，其最近被表征为拟南芥和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)的外泌体标志物(Rutter和Innes，2017；Zhang等人，2020)。除了该因子之外，我们还能够鉴定出其他植物EV标志物的同源物，如HSP70和BRO/ALIX(表2)。总体上，我们的数据表明小球藻微藻具有人、酵母和植物之间共有的保守的EV相关因子，但也具有迄今为止仅从植物基因组中回收的EV相关因子。它们还表明，相比于酵母或人，小球藻EV生物发生和功能的机制与植物的机制更密切相关。
实施例3：普通小球藻的细胞外培养基含有尺寸在50和200nm之间的EV
为了确定小球藻是否可以生产EV，并表征这些基于脂质的囊泡，我们接下来决定调整先前用于分离和纯化拟南芥叶质外体EV的方案(Rutter和Innes，2017；PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。简要地，首先使用100kDa MWCO Pall膜通过离心，或使用100kDa Sartorius VivaFlow 50R切向过滤装置，来浓缩来自烧瓶中生长的小球藻的无细胞培养基，以获得将用于EV纯化的浓缩培养基(30-50×)。如先前在拟南芥中报道的那样(Rutter和Innes，2017)，进一步在4℃以40000g的离心速度超速离心所得的浓缩培养基(称为“CM”)，以将小球藻EV与分泌的蛋白质/多糖分离。后一个纯化步骤导致回收称为“P40级分”的级分。可选地，还通过在4℃以100000g进行CM超速离心步骤来获得“P100级分”。这些级分的纳米颗粒跟踪分析(NTA)揭示了存在尺寸在50至350nm之间的颗粒群体，以及以120nm左右为中心的更离散且丰富的颗粒群体(图1A、图1B分别为P40和P100)。为了进一步确认这些结果并更深入地了解这些小球藻EV的形态，通过透射电子显微术(TEM)分析了P100级分。后一种分析揭示了存在具有明显脂质双层的圆形颗粒，形态与哺乳动物和植物EV相似(图1C，Rutter和Innes，2017；Zhang等人，2020；Noble等人，2020)。尺寸测量揭示了存在平均直径为～130nm的异质颗粒，表明通过NTA检测到的颗粒确实对应于小球藻EV(图1D)。用亲脂性染料PKH26进一步标记P40级分，PKH26使用脂肪族尾部锚定至脂质双层中(Fick等人，1995；Askenasy等人，2002)，经典用于标记哺乳动物外泌体以进行荧光成像(Chuo等人，2018)，揭示了尺寸超过200nm的绝大多数颗粒不是基于脂质的颗粒(图1E)。基于该荧光成像与TEM和NTA分析的结合，我们得出结论，可以从烧瓶的无细胞培养基中回收尺寸在50和200nm之间的小球藻EV。迄今为止，这些结果提供了支持无细胞培养基中存在小球藻EV的最先证据。
实施例4：小球藻细胞生产小RNA，表明该微藻中存在的RNAi机制具有功能
在藻类和微藻中，已在来自数个不同谱系的几个物种(包括红藻门(Rhodophyta)、绿藻门(Chlorophyta)、定鞭藻门(Haptophyta)、不等鞭毛类(Stramenopiles)和沟鞭藻门(Dinoflagellata))中证明存在小RNA和/或RNAi活性(Cerutti等人，2011)。尽管小球藻基因组含有由单个DCL和AGO蛋白组成的简单RNAi机制(Cerrutti等人，2011)，我们发现所述蛋白在系统发育上与其植物对应物相关(图2A)，但目前没有证据表明该绿藻可以生产小的非编码RNA。为了测试该可能性，我们对从普通小球藻细胞提取的总RNA进行了小RNA测序(sRNA-seq)。作为对照，我们还使用了我们先前从拟南芥成长叶组织提取的总RNA生成的sRNA-seq数据集。非常有趣地，我们发现普通小球藻生产的主要小RNA群体的尺寸为18nt，这与通常从拟南芥和其他植物物种中回收的两种主要的21和24nt长的小RNA物种非常不同(图2B)。此外，我们注意到普通小球藻和拟南芥可以额外生产分别为15和16nt长的小RNA的小峰(图2B)。鉴于Dicer充当分子尺并以精确长度切割dsRNA底物，所述长度由PAZ和RNA酶III结构域之间的距离决定(Zhang等人，2004)，因此与植物DCL酶的结构相比，小球藻DCL酶的结构可能表现出不同的特征，其将有利于生产较短的小RNA物种。可选地或另外，从小球藻基因组和转录组检索到的其他RNA酶III酶(表3)或其他生物发生因子可能有助于该过程。总之，这些数据提供的证据表明，小球藻可以生产小RNA物种，其与先前在植物中报道的小RNA物种相比具有不同的尺寸等级。它们还表明小球藻配备有小RNA生物发生的功能机制。
表3：通过在多变小球藻和普通小球藻中blast搜索鉴定的推定RNA酶III和DCL样因子
*潜在地为同一转录本的一部分
实施例5：可以工程改造小球藻以生产具有抗菌活性的小RNA
先前的研究证明，外源施用小RNA和/或长dsRNA可以有效针对真核致病/寄生(微)生物，包括真菌、卵菌、昆虫和线虫(Ivashuta等人，2015；Wang等人，2016；Koch等人，2016；Wang&Jin，2017；Wang等人，2017)。还可以针对致病细菌发生环境RNAi，其依赖于小RNA实体而不是长dsRNA(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。基于这些研究以及普通小球藻生产小RNA物种的能力(实施例4)，我们推断我们可以利用该生物系统来生产抗菌小RNA。为了测试该可能性，用反向重复(IR)转基因稳定转化普通小球藻，所述转基因与丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)菌株DC3000(Pto DC3000)的两种主要毒力因子具有序列同源性，该菌株是一种革兰氏阴性细菌，先前表明其对环境RNAi敏感(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170，图3A)。第一靶向毒力因子是冠菌酸聚酮合酶I(cfa6)基因，其编码植物毒素冠菌素(COR)的主要结构成分(Brooks等人，2004)。第二靶向毒力因子是hrpL，其编码一种替选的σ因子，已知该因子直接控制III型分泌系统相关基因的表达，并间接调节COR生物合成基因的表达(Fouts等人，2002；Sreedharan等人，2006)。有趣地，当在拟南芥中稳定表达时，IR-CFA6/HRPL反向重复被内源植物DCL有效地加工成抗Cfa6 siRNA和抗HrpL siRNA，其进而靶向Pto DC3000中的cfa6和hrpL基因，同时在感染期间抑制其致病性(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。重要地，在外源施用来自这些转基因植物的总RNA后，这些表型中的一些完全重现，所述转基因植物含有有效的抗cfa6和抗hrpL siRNA(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。特别是，外源应用这些RNA提取物抑制Pto DC3000触发气孔开放的能力，这是该细菌通过气孔进入并定植内叶组织的主要毒力反应(Melotto等人，2006；PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。
通过使用对抗Cfa6 siRNA和抗HrpL siRNA高度敏感的相同气孔重新开放读数，我们发现源自测试的表达IR-CFA6/HRPL转基因的五个独立小球藻IT20系的RNA提取物均抑制气孔重新开放事件(图3B)。重要地，这些表型与存在源自对照拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物的情况下观察到的表型相当，模仿了响应无法产生COR的Pto DC3000突变菌株检测到的气孔重新开放受损表型(图3B)。此外，由于已知该表型依赖于抗cfa6 siRNA和抗hrpL siRNA，而不依赖于未加工的IR-CFA6/HRPL转录本(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)，我们的数据表明小球藻IR-CFA6/HRPL系可能能够生产抗菌小RNA物种。因此，从小球藻IR-CFA6/HRPL IT20#3参考系回收了映射至IR-CFA6/HRPL反向转基因转录本的小RNA(图3C)。还值得注意的是，这些小RNA由反向重复转录本的cfa6和hrpL区域两者产生，对应于hrpL区域的小RNA的积累增强(图3C)。总体上，这些数据提供的证据表明，可以工程改造小球藻以生产表现出抗菌活性的小RNA。
实施例6：针对毒力因子hrpL的小球藻人工小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因
为了确定小球藻人工小RNA是否可能是观察到的抗菌活性的原因，我们接下来利用了先前描述的重组细菌，其表达hrpL基因的小RNA弹性(resilient)版本(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。该hrpL基因突变版本在小RNA靶向区域含有尽可能多的沉默突变，以改变抗hrpL小RNA与hrpL mRNA的结合，同时生产野生型HrpL蛋白。在质粒中克隆hrpL基因的突变和Wt版本两者，其在新霉素磷酸转移酶II(NPTII)启动子的控制下，并进一步转化Pto DC3000ΔhrpL菌株，所述菌株缺失hrpL基因，因此其重新打开气孔的能力完全损坏(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170，图4A)。值得注意的是，所得的重组细菌称为Pto DC3000ΔhrpL WThrpL和mut hrpL，先前表明其恢复了Pto DC3000ΔhrpL菌株重新打开气孔的能力，表明两种转基因均具有功能(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。随后在来自拟南芥IR-HRPL#4系或小球藻IT29#12、IT29#15系(其从小球藻基因组表达特异性靶向hrpL基因的IR-HRPL反向重复序列)的总RNA提取物的存在下，将这些重组细菌用于气孔重新开放测定。作为对照，我们使用Pto DC3000 Wt和ΔhrpL菌株以及来自IT19#7参考系的总RNA，所述IT19#7参考系从小球藻基因组表达IR-CYP51反向重复序列，该重复序列不与Pto DC3000基因组表现出序列同源性，而是靶向真菌植物病原体禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的三个细胞色素P450羊毛甾醇C-14α-去甲基化酶(CYP51)基因(Koch等人，2013)。我们发现，补充有hrpL Wt基因的细菌对源自两个独立的小球藻IT29#12和IT29#15系的RNA提取物敏感，但也对来自对照拟南芥IR-HRPL#4系的RNA提取物敏感，表现为这些细菌重新打开气孔的能力改变(图4B)。相比之下，这些重组细菌在源自小球藻IT19#7参考系的RNA提取物存在下重新打开气孔(图4B)，这支持抗hrpL小RNA在该现象中的特异性作用。重要地，我们发现补充有突变hrpL基因的细菌对源自两个独立的小球藻IT29系和对照拟南芥IR-HRPL#4系的RNA提取物具有完全抗性，允许正常的气孔重新开放表型(图4B)。后一组数据表明，气孔重新开放表型的抑制不是由于这些抗hrpL小RNA的潜在脱靶效应，而是由它们对hrpL转录本序列的靶向效应引起。它们还表明，由小球藻或拟南芥转基因系产生的抗hrpL小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因。因此，实施例5和6中报告的结果提供了概念验证，证明可以工程改造小球藻以序列特异性方式生产有效的抗菌小RNA。
实施例7：来自小球藻IR-CFA6/HRPL转基因系的EV表现出抗菌活性
先前研究报道，植物EV可以在真菌、卵菌和细菌细胞中递送具有生物活性的抗菌小RNA(Cai等人，2018；Teng等人，2018；Hou等人，2019；PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)，从而降低所述细胞的致病性。为了研究该现象是否同样适用于小球藻EV包埋和/或相关的抗菌小RNA，我们首先从表达IR-CFA6/HRPL转基因的两个独立的小球藻IT20系收集无细胞培养基，并进一步使用超滤方法，其设计为保留30-90nm以上的颗粒。所得浓缩培养基(CM)相当于原始小球藻培养基的30-50倍浓缩，使用0.45μm灭菌过滤器对其进行额外过滤，以消除可能的源自超滤过程的细菌污染物。使用气孔重新开放测定进一步分析CM的抗菌活性，并将来自相应小球藻IT20细胞和来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的RNA提取物纳入测定作为阳性对照。有趣地，来自两个独立的小球藻IT20系的CM抑制气孔重新开放事件，其程度与源自相同生产细胞或拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA提取物相同(图5A)。这些结果表明，小球藻IT20系可以生产大于30-90nm的细胞外EV，其含有抗cfa6和/或抗hrpL小RNA。与这一想法一致，我们发现来自参考小球藻IT20#3系的P40级分完全有能力抑制Pto DC3000诱导的气孔重新开放，其程度与来自小球藻细胞或来自拟南芥IR-CFA6/HRPL#4植物的总RNA相同(图5B)。我们得出结论，来自小球藻IT20系的EV可能加载抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA和/或与其相关，这些小RNA必须被递送至Pto DC3000细胞中以触发检测到的抗菌作用。
我们先前表明了植物EV保护抗菌小RNA免受非特异性微球菌核酸酶(Mnase)介导的消化(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。在此，为了确定小球藻EV是否可以共有相似的特征，我们用Mnase处理IT20#3参考系的P40级分，并将其进一步用于气孔重新开放测定。更详细地，在37℃，在存在或不存在300U/ml Mnase的情况下孵育样品30’。在此孵育期结束时，加入终浓度为20mM的EGTA以抑制Mnase活性，并将样品进一步用于气孔重新开放测定。值得注意的是，我们发现像用作对照的未处理P40级分那样，用Mnase处理的P40级分仍然能够完全抑制Pto DC3000诱导的气孔重新开放(图5C)。这些数据表明，当包埋在小球藻EV中和/或与其相关时，保护了抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA免受核糖核酸酶介导的消化。与该假设一致，我们能够通过sRNA-seq分析从小球藻IT20#3参考系生产的Mnase处理的EV样品中检测到抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA读取(图5D)。
基于这些总体结果，我们提出由小球藻IT20#3系生产的EV相关的抗cfa6小RNA和抗hrpL小RNA在囊泡内和/或在囊泡外，但可能与核糖核蛋白复合物相关，因此被保护免受RNA酶的影响。
实施例8：针对hrpL的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA是抑制hrpL介导的气孔重新开放功能的原因
为了确认抗菌小RNA是生物活性货物，并比较P40和P100级分的抗菌潜力，我们使用实施例4中描述的Pto DC3000ΔhrpL Wt hrpL和Mut hrpL细菌进行了气孔重新开放测定。如先前所述的，从小球藻IT19#7(IR-CYP51)和IT29#12(IR-HRPL)参考系收集P40和P100级分，并用Mnase处理，使用未处理Pto DC3000 Wt和ΔhrpL菌株作为对照。如使用实施例4中的总RNA提取物所观察到的那样，只有补充有Wt hrpL基因的细菌对来自小球藻IT29#12参考系的EV敏感，P40和P100级分显示出相似的抗菌作用(图5E)。相比之下，这些重组细菌在源自小球藻IT19#7系的Mnase处理的P40和P100级分的存在下重新打开气孔(图5E)，这支持EV包埋和/或相关的抗hrpL小RNA的特异性作用。重要地，表达hrpL突变版本的重组细菌对由小球藻IT29#12参考系生产的Mnase处理的P40和P100级分介导的气孔重新开放作用的抑制完全不应(refractory)(图5B)。这些数据支持EV包埋和/或相关的抗hrpL小RNA在抑制Pto DC3000重新打开气孔的能力方面的因果作用。它们还表明，小球藻EV可能在PtoDC3000细胞中递送抗hrpL小RNA，以序列特异性方式靶向hrpL基因，从而抑制细菌触发的气孔重新开放。
实施例9：小球藻EV被人肺泡上皮细胞有效内化
大量的哺乳动物病原体使用复杂的策略以进入宿主细胞并在其中复制。此外，现在已经确定各种病原体劫持宿主细胞因子以在其宿主中复制。因此，无论是直接针对病原体转录本，还是间接针对宿主易感因子，基于RNAi的预防或治疗方法的开发都依赖于在宿主细胞中递送小RNA，所述宿主细胞将遇到或已经遇到靶向病原体。哺乳动物EV在该方面特别有价值，因为它们可以在各种细胞类型和器官中递送有效的小RNA(O’Brien等人，2020)。有趣地，植物EV也可以被哺乳动物细胞摄入并在受体细胞中递送siRNA。例如，在不同的人细胞类型中证实了源自葡萄柚的纳米囊泡的嗜性，所述人细胞类型包括A549人肺泡上皮细胞，已证明了siRNA在其中递送(Wang等人，2013；Zhang等人，2016)。此外，在鼻内施用后，这些基于脂质的颗粒在小鼠的肺和大脑中显著回收(Wang等人，2013)，这表明这些载体也可以在体内运行，用于递送基于RNAi的分子。在此，我们研究了小球藻EV是否可以类似地被人细胞摄入。出于该目的，我们使用了与铜绿假单胞菌感染尤其相关的A549细胞系，但也使用了A549-ACE2细胞，其过表达对于SARS-CoV-2进入宿主细胞至关重要的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体(Hoffman等人，2020)。我们首先用PKH26标记来自P40级分的小球藻EV，并进一步将它们与A549和A549-ACE2细胞孵育4小时。多次洗涤后，将对照细胞和用PKH26标记的小球藻EV孵育的细胞固定并用DAPI染色，DAPI与DNA中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的区域结合，从而使细胞核染色。共聚焦分析揭示了人细胞中来自PKH26标记的EV的清晰红色荧光信号，提供了小球藻EV可以被A549和A549-ACE2细胞内化的最先证据(图6A，数据未显示)。接下来，我们使用荧光激活细胞分选(FACS)方法对PKH26标记的小球藻EV摄入事件进行量化。在以0.06pM的浓度孵育PKH26标记的小球藻EV后4小时，我们发现17％的A549-ACE2细胞吸收了这些脂质颗粒(图6B，左栏)。重要地，当在相同条件下使用浓度为0.5pM的PKH26标记的小球藻EV时，在～92％的A549-ACE2细胞中发生这些摄入事件(图6B，右栏)，并且在A549细胞中发现了类似的结果(数据未显示)。总体上，这些数据不仅证明小球藻EV被A549和A549-ACE2细胞有效摄入，而且还为我们提供了所需的最佳浓度，以确保大多数靶向的人肺泡上皮细胞将在体外感染测定中摄入抗菌siRNA载体。
我们进一步研究了由人肺泡上皮细胞内化小球藻EV事件的时间范围。出于该目的，用近红外(NIR)亲脂性1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三羰菁碘化物(DiR)染料标记小球藻EV，并将其与A549和A549-ACE2细胞孵育2h、4h、24h和48h。洗涤人细胞后，使用微孔板荧光计分析其NIR荧光发射。有趣地，在DIR标记的EV孵育后2小时已经检测到NIR荧光信号，突出显示了A549或A549-ACE2细胞快速内化小球藻EV(图6C/D，数据未显示)。此外，我们注意到，从一个实验到另一个实验，在EV处理后8或24小时观察到NIR荧光强度的峰(图6C/D，数据未显示)。这些结果表明，A549和A549-ACE2细胞最大程度的EV内化事件必须发生在这些时间点之间。这些EV摄入动力学对于优化设计体外感染测定中的EV处理尤其有价值。
实施例10：小球藻EV不改变人肺泡上皮细胞的活力
为了将MIGS技术用于未来开发基于小RNA的疗法，评估微藻EV对哺乳动物细胞或生物体的免疫原性和/或其毒性的影响非常重要。数项研究已在人细胞和用植物EV处理的小鼠中探讨了这些问题，但目前没有关于微藻EV的可得信息(Garaeva等人，2021；Maji等人，2017)。因此，我们通过在以下的存在下孵育细胞培养物，对A549-ACE2细胞进行了细胞活力测定：不同浓度的小球藻EV，其来自野生型和表达小RNA的转基因系，所述小RNA靶向SARS-CoV-2基因(IT54、IT64)、人基因(IT66，详细信息参见实施例1)或作为对照的荧光素酶基因(IT69)。值得注意的是，基于图6中获得的结果，选择用于细胞活力测定的浓度应当导致整个靶向人细胞群体摄入显著量的小球藻EV。在EV与A549-ACE2细胞孵育24小时后，使用未处理和乙醇(EtOH)处理的细胞作为对照，通过生物发光测定来确定细胞活力，所述测定对培养基中活细胞释放的ATP的量进行量化。重要地，虽然EtOH处理触发了预期的活细胞数量减少～70％，但我们没有检测到不同小球藻EV群体对A549-ACE2细胞活力的任何影响(图7)。总体上，这些结果表明小球藻EV不改变人肺泡上皮细胞的活力。
实施例11：表达针对SARS-CoV-2RNA或HSF mRNA的反向重复转基因的稳定小球藻系的生成
为了生产针对SARS-CoV-2的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA，我们生成了20个反向重复构建体，并使用农杆菌介导的转化，在普通小球藻中将它们全部转化。更具体地，靶向了16个病毒序列区域，其跨越SARS-CoV-2的基因组和亚基因组RNA。例如，我们决定靶向对应于RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)和刺突区域的病毒区域，先前设计了两种来自所述病毒区域的合成siRNA来限制恒河猴中的SARS-CoV-1复制(图8，Li等人，2005)。作为另一个例子，我们靶向前导序列，已知其siRNA定向沉默会抑制从SARS-CoV-1转录所有亚基因组RNA，导致哺乳动物细胞中病毒复制强烈受损(Li等人，2005)。同样重要的是要注意，这些病毒区域中的数个与其他冠状病毒序列表现出序列保守性，因此有潜力触发针对各种冠状病毒的交叉保护，包括未来将出现的有害冠状病毒。因此，这些小球藻转基因系对于未来针对其他冠状病毒的再利用方法可能很有价值。为了支持该假设，我们在此提供SARS-CoV-2RdRP和解旋酶的靶向区域与SARS-CoV-1和MERS的RdRP和解旋酶序列的序列比对，其表现出广泛的序列相似性(图8)。图8还描绘了SARS-CoV-2刺突的靶向区域与SARS-CoV-1刺突序列的序列比对，以突出显示那些病毒区域之间的高度序列相似性。
以下IR构建体靶向～350bp的单个SARS-CoV-2病毒区域(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：107的内含子)：
-IR-PLP，SEQ ID NO：41-42；
-IR-3CL，SEQ ID NO：43-44；
-IR-NSP10，SEQ ID NO：45-46；
-IR-RDRP-1，SEQ ID NO：47-48；
-IR-RDRP-2，SEQ ID NO：49-50；
-IR-RDRP-3，SEQ ID NO：51-52；
-IR-EndoN，SEQ ID NO：53-54；
-IR-N，SEQ ID NO：55-56；
-IR-E，SEQ ID NO：57-58；
-IR-M，SEQ ID NO：59-60；
-IR-S，SEQ ID NO：61-62；
-IR-3’UTR，SEQ ID NO：63-64；和
-IR-Hel，SEQ ID NO：65-66。
以下嵌合IR构建体同时靶向多个SARS-CoV-2病毒区域，每个～150bp(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：107的内含子)：
-IR-NSP1/NSP4/NSP3/PLP/3CL/NSP12/NSP13/NSP14，SEQ ID NO：1-2；和
-IR-S/E/M/N/前导序列-TRS/3’UTR，SEQ ID NO：3-4。
值得注意的是，当在普通小球藻中稳定表达时，这些嵌合IR转基因应当生产长dsRNA，其将可能通过小球藻DCL酶和/或其他小球藻RNA酶III的进行性活性一直被加工，从而产生同时靶向多个SARS-CoV-2RNA的小RNA群体。该原则得到了先前数据的支持，尤其是表明当在拟南芥中稳定表达时，类似的IR结构会触发同时生产针对两种细菌毒力因子的抗菌siRNA群体(Singla-Rastogi&Navarro，PCT/EP2019/072169，PCT/EP2019/072170)。
此外，我们选择靶向16种宿主因子，此处称为宿主易感因子(HSF)，最近表明其对于冠状病毒在人细胞中建立其生命周期至关重要(V’kovski等人，2019；Hoffman等人，2020；Siddiqui等人，2020；Gordon等人，2020)。特别是，我们的目标是同时靶向翻译因子Rpl13a、eIF3e、eIF3i和eIF3f，其对于靠近冠状病毒复制复合物的翻译活性至关重要(V’kovski等人，2019)。重要地，已表明沉默这些宿主因子中的每一个会大幅减少重组MHV冠状病毒在人细胞中的复制(V’kovski等人，2019)，并且可能类似地防止SARS-CoV-2在人细胞中复制。该靶向策略特别相关，因为已知冠状病毒会劫持宿主翻译机制以实现在其宿主中复制(V’kovski等人，2019；Gordon等人，2020)。此外，我们同时靶向真核起始因子-4A(eIF4A)和翻译伸长因子-1A(eEF1A)的mRNA。靶向这些因子的基本原理得到以下事实的支持：美国食品和药物管理局(FDA)批准的eIF4A抑制剂(即zotatifin)和eEF1A抑制剂(即ternatin-4或aplidin/plitidepsin)可以有效限制SARS-CoV-2在人细胞中的感染性，并且目前用于治疗COVID-19患者的临床试验(Gordon等人，2020)。此外，我们靶向对于以下至关重要的宿主因子：(i)人细胞中的囊泡运输和冠状病毒复制(Snrpe、Naca、Kif11、Gbf1和Srp54a)(V’kovski等人，2019)，(ii)SARS-CoV-2进入人细胞(ACE2、TMPRSS2)(Hoffman等人，2020)，以及(iii)20S和26S蛋白酶体功能，其是重组MHV冠状病毒在人细胞中复制所必需的(V’kovski等人，2019)。最后，伊维菌素抑制不相关病毒的病毒输入，尤其是通过抑制IMPα1和IMPβ1功能，基于施用伊维菌素后SARS-CoV-2体外复制有效减少(Siddiqui等人，2020)，我们决定靶向这些额外的HSF mRNA。
以下嵌合IR构建体同时靶向多个HSF区域，每个～150bp(除了目标序列以外，它们含有SEQ ID NO：107的内含子)：
-IR-Rpl13a/eIF3e/eIF3i/eIF3f，SEQ ID NO：5-6；
-IR-eIF4A/eEF1a，SEQ ID NO：7-8；
-IR-Snrpe/Naca/Kif11/Gbf1/Srp54a，SEQ ID NO：9-10；和
-IR-ACE2/TMPRSS2/Psmd1/IMPα/IMPβ1，SEQ ID NO：11-12。
实施例12：表达针对来自铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因和必需基因的IR转基因的稳定小球藻系的生成
为了生产可能最终用作基于RNAi的细菌预防剂或治疗剂的小球藻EV包埋的小RNA，我们生成IR构建体，并使用农杆菌介导的转化在普通小球藻中稳定表达它们。更具体地，我们靶向来自铜绿假单胞菌的必需基因，包括LptH、LolA、TolB、LpxA、LpxD、dnaA、dnaB、dnaN、gyrB、rpoC、secE和sodB，使用以下构建体(除了目标序列以外，它们均含有SEQ IDNO：107的内含子)进行：
-IR-LptH/LolA/TolB，SEQ ID NO：13-14；
-IR-LpxA/LpxD/TolB，SEQ ID NO：15-16；
-IR-dnaA/dnaB/gyrB，SEQ ID NO：67-68；
-IR-rpoC/secE/SodB，SEQ ID NO：69-70；和
-IR-secE/dnaN/gyrB，SEQ ID NO：17-18。
我们还靶向福氏志贺氏菌的必需基因，包括FtsA、Can、Tsf、AccD、Der、Psd，使用以下构建体进行：
-IR-FtsA/Can/Tsf，SEQ ID NO：71-72和
-IR-AccD/Der/Psd，SEQ ID NO：73-74。
相同的方法还用于生产针对来自铜绿假单胞菌的关键毒力基因的小球藻EV包埋的小RNA，所述毒力基因包括参与II型或III型分泌系统调节和/或组装的基因XcpQ、PscC、PcrV、ExoS、ExoU、ExsA、Vrf，群体感应信号传导因子LasR、RhlR、MvfR、VqsM，GAC信号传导成分GacA和RsmA，通过使用以下构建体进行：
-IR-XcpQ/ExsA/PcrV/LasR/RhlR/VqsM/RmsA，SEQ ID NO：19-20；
-IR-XcpQ/PscF/PscC，SEQ ID NO：21-22；
-IR-ExoS/exsA/Vrf，SEQ ID NO：23-24；
-IR-ExoU/ExsA/Vrf，SEQ ID NO：25-26；
-IR-LasR/RhlR/VqsM，SEQ ID NO：27-28；和
-IR-GacA/RmsA/MvfR，SEQ ID NO：29-30。
我们另外使用该方法生产针对来自铜绿假单胞菌的关键抗生素耐药性基因的小球藻EV包埋的小RNA，所述抗生素耐药性基因包括mexX、mexA和ampC，使用以下构建体进行：
-IR-mexX/mexA/ampC SEQ ID NO：31-32。
我们还靶向福氏志贺氏菌的毒力基因，包括VirF、VirB、IcsA，使用构建体IR-VirF/VirB/IcsA，SEQ ID NO：33-34进行；靶向金黄色葡萄球菌的毒力基因，包括编码表面结合蛋白fnbA、clfA、clfB、spa、atl、白细胞毒素lukF-PV、lukS-PV、lukE、lukD、HlgB、α溶血素hla和中毒性休克综合征毒素-1tsst-1的基因，通过使用以下构建体进行：
-IR-fnbA/clfA/clfB/spa，SEQ ID NO：35-36；
-IR-lukF-PV/lukS-PV/lukE/lukD，SEQ ID NO：37-38；和
-IR-HlgB/hla/tsst-1/atl，SEQ ID NO：39-40。
我们还靶向结核分枝杆菌的毒力基因，包括cspA、pcaA、icl1、rip、fad26、hphA，使用以下构建体进行：
-IR-cpsA，SEQ ID NO：75-76；
-IR-pcaA，SEQ ID NO：77-78；
-IR-icl1，SEQ ID NO：79-80；
-IR-rip，SEQ ID NO：81-82；
-IR-fad26，SEQ ID NO：83-84；
-IR-hphA，SEQ ID NO：85-86；和
-IR-cpsA/pcaA，SEQ ID NO：87-88。
我们还靶向嗜肺军团菌的毒力基因，包括dotA、dotB、dotC、dotD、icmT、icmJ、pilD和ispF，使用以下构建体进行：
-IR-dotA，SEQ ID NO：89-90；
-IR-dotD，SEQ ID NO：91-92；
-IR-dotC，SEQ ID NO：93-94；
-IR-dotB，SEQ ID NO：95-96；
-IR-icmT，SEQ ID NO：97-98；
-IR-icmJ，SEQ ID NO：99-100；
-IR-pilD，SEQ ID NO：101-102；
-IR-ispF，SEQ ID NO：103-104；和
-IR-dotD/pilD,SEQ ID NO：105-106。
实施例13：设计和生成报告系统以快速且可靠地检测由小球藻转基因系生产的EV含有的小RNA的生物活性
13.1.为了验证由表达抗菌小RNA的小球藻转基因系生产的EV的生物活性，我们开发了细菌细胞和人细胞中的两种类型的报告系统。当EV包埋和/或相关的小RNA被受体细胞内化时，预期两种报告系统均会表现出差异性的报告基因表达。
第一报告系统家族基于二分盒的质粒表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即LacI-lite)的短寿命变体，在其5’或3’末端携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由pLac启动子指导并由lacO操纵子调节(图9A)。在没有EV包埋和/或相关的小RNA的情况下，LacI-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号。相反，当给定的小RNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，LacI-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号(图9A)。值得注意的是，LacI-lacO以外的其他系统也可以用于同一目的，如TetR-lite/tetO2或cI-lite/λPR系统。我们在目的质粒中将二分报告系统与适合在大肠杆菌和Pto DC3000中表达和复制的骨架组装在一起。在这两种情况下，我们在LacI-lite阻遏子的3’末端引入对Pto DC3000基因fusA具有特异性的小RNA目标序列，得到R37构建体。作为第一表征步骤，我们利用了异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)直接抑制LacI蛋白的能力，以测试报告系统及其在细菌中转化后的敏感性。因此，我们用不同的IPTG浓度(10-3至1M)孵育了用R37构建体转化的大肠杆菌TOP10细菌细胞，并在15小时的动力学实验过程中连续测量OD600和GFP荧光。使用-IPTG和氯霉素对照对+IPTG条件的GFP荧光进行归一化，以便在去除背景信号后确定正确的诱导动力学。分析揭示了0.1mM的IPTG浓度足以在60’后触发GFP诱导，孵育约2-3小时后荧光开始急剧增加(图9B)。有趣地，如OD600测量所示，报告基因的存在和IPTG本身均不影响细菌在动力学过程中的生长速率(数据未显示)。在用R37构建体生成PtoDC3000兼容载体后，我们在该细菌植物病原体中进行了相同的IPTG测试。归一化GFP荧光揭示了报告系统具有活性，并从孵育2-3小时开始在该假单胞菌物种中也响应IPTG诱导(图9C)。然而，我们注意到与在大肠杆菌细胞中检测到的水平相比，总体GFP水平较低。
对于第二报告系统，我们通过将强组成型启动子pCMV组装至在编码序列3’末端与小RNA目标序列融合的GFP转基因，生成了基于GFP的报告基因(图9D)。将该报告基因进一步转染至用候选EV群体处理的人细胞中，并且通过不同的方法(包括在处理后24小时和48小时进行蛋白质印迹分析)进一步监测GFP蛋白的沉默。
此外，我们工程改造了其他细菌(包括大肠杆菌K12菌株)以表达双报告系统，当EV包埋的siRNA被细菌细胞内化时，所述双报告系统可以表现出差异性的siRNA靶向报告基因表达。
第一报告系统家族依赖于基于质粒的盒的表达，所述盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体组成型表达非靶向DsRed报告基因，其用作归一化的内部对照，所述第二构建体携带不稳定化的GFP报告基因，在其下游区域含有目的抗菌siRNA目标区域(图9E)。当在细菌(例如大肠杆菌)中表达时，在给定的EV包埋的siRNA群体被内化后，预测该系统会导致GFP表达和荧光信号特异性降低。
第二双报告系统家族基于三分盒(tripartite cassette)的质粒表达，所述三分盒由第一构建体、第二构建体和第三构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子的短寿命变体(即TetR-lite)，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)，其转录活性由tetO2操纵子控制，所述第三构建体表达非靶向DsRed报告基因，其作为归一化的内部对照(图9F)。在没有EV包埋的小RNA的情况下，TetR-lite蛋白应当在细菌中组成型产生，进而关闭GFP的表达，导致没有GFP荧光信号(应当仅检测到DsRed报告基因的荧光)。相反，当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号。
第三报告系统家族依赖于基于质粒的二分盒的表达，所述二分盒由第一构建体和第二构建体组成，所述第一构建体表达转录阻遏子(即TetR-lite)的短寿命变体，在其下游区域携带目的抗菌siRNA目标区域，所述第二构建体由GFP的中等稳定性变体组成(Andersen等人，1998；Elowitz&Leibler，2000)或由生物发光报告基因(例如发光光杆状菌操纵子luxCDABE(Meighen，1991))组成，其转录活性由tetO2操纵子控制(图9G)。当给定的siRNA群体被细菌细胞内化并在其中发挥活性时，TetR-lite的沉默导致GFP或luxCDABE操纵子表达的去抑制，导致检测到GFP荧光信号或生物发光信号。值得注意的是，TetR-tetO2以外的其他系统也可以用于同一目的，如lacI-lite/lacO或cl-lite/λPR系统。
总体上，我们生成了五个报告系统家族，其将允许我们以快速且可靠的方式对EV含有的小RNA的生物活性进行量化。
实施例14：光生物反应器中生产的小球藻EV保持其完整性和被A549和A549-ACE2细胞摄入的能力
开发源自MIGS的应用的先决条件是验证在光生物反应器(PBR)中生产时小球藻EV保持其完整性和功能性。为了解决该问题，在连续光照条件下(270μmol/m2/s)在1L PBR中使表达IR-CFA6/HRPL转基因的参考小球藻IT20#3转基因系生长3.3天(图10A)。值得注意的是，该系的生长速率与在相同PBR条件下生长的野生型普通小球藻株的生长速度相当，表明反向重复转基因的表达似乎未改变该微藻的适应性(数据未显示)。这是与哺乳动物细胞系的一个重要区别，哺乳动物细胞系在通过RIG-I样受体(RLR)感应到长dsRNA后触发强效炎症反应(Fan&Jin，2019)。进一步收集来自以上小球藻IT20#3培养物的细胞外培养基，并使用低速离心方法从微藻细胞分离，以3000至4000g，10至15min离心两轮。使用实施例3所述的超滤和超速离心方法进一步纯化小球藻EV，并通过NTA分析所得P40级分。我们发现EV的尺寸分布与从烧瓶条件下生长的同一小球藻系中检索到的相似(数据未显示)。此外，当分析从烧瓶和PBR条件下回收的相当体积的无细胞培养基时，我们从1升收集的细胞外培养基中检测到相似数量的PKH26阳性外泌体样颗粒，范围为每ml 3.7×107至3.8×108个颗粒。为了进一步分析从PBR回收的小球藻EV的功能性，我们接下来监测了它们被A549和A549-ACE2人细胞摄入的能力。如实施例7所述，用PKH26染料标记来自从PBR收集的无细胞培养基的P40级分，将其与A549或A549-ACE2细胞一起孵育，并通过共聚焦显微术进一步分析。重要地，如用源自烧瓶中生长的小球藻的P40级分的PKH26阳性EV所观察到的那样，我们发现在A549和A549-ACE2细胞内清楚地检测到这些小球藻EV(图6A、图10B)。总之，这些数据表明在小型PBR中生产时，小球藻EV的完整性和功能性得以保持。
实施例15.可以相对容易地由150L PBR的细胞外培养基生产和纯化小球藻EV含有的抗菌小RNA，而不改变其产率、完整性和功能性。
接下来，我们想验证从生产的几升(实验室)扩大至几m3(前工业)是否不会影响小球藻EV的产率和完整性。为了测试这一点，如实施例1中所详述的，我们使参考小球藻IT20#3系在150L PBR中生长(图10A)。NTA分析揭示，尽管原始样品中存在悬浮有机物质，但小球藻EV的尺寸分布很好地集中在直径150nm左右，～70％的样品尺寸范围在100和200nm之间，其余的在200nm以上(图10C)。进一步PKH26标记从150L PBR中回收的P40级分，然后在荧光模式下进行NTA分析，表现出的尺寸分布类似于在散射模式下对未标记的P40级分进行NTA分析时观察到的尺寸分布(图10C/D)。该结果表明从未标记的P40级分中检测到的颗粒可能是基于脂质的EV。有趣地，从5L无细胞培养基中获得的颗粒浓度相当高：3.3×1010个颗粒/ml，对应于～2.5ml中～60pM。相比之下，从数个烧瓶(～800ml无细胞培养基)获得的EV的生产通常在1ml中产生～0.5pM(3×108个颗粒/ml)。因此，在150L PBR中生产小球藻EV的产率是烧瓶中的～20倍。总体上，这些数据表明从150L PBR中回收的小球藻EV表现出正态尺寸分布。它们还表明即使在使用标准生长条件时，此类PBR中的EV产率也可以提高～20倍。因此，预计通过优化生长条件和随后的预过滤、过滤和纯化步骤，将相对容易地提高EV产率。
最后，我们评估了从150L PBR培养物获得的小球藻EV包埋和/或相关的小RNA的生物活性。为此，如实施例5中所述，我们在气孔重开测定中比较了来自不同生产系统(烧瓶、1L和150L PBR)的IT20#3(IR-CFA6/HRPL)和IT19#7(IR-CYP51)系的总RNA和P40级分。该比较分析揭示了来自小球藻IT20#3系的总RNA和P40级分具有相似的抗菌作用，抑制PtoDC3000触发的气孔重新开放，不依赖于采用的生产方法(图10E)。
因此，我们的结果提供了一个概念验证，证明可以相对容易地由150L PBR的细胞外培养基生产和纯化小球藻EV含有的抗菌小RNA，而不改变其产率、完整性和功能性。
实施例16.通过用来自热杀细菌的上清液处理小球藻培养物来优化EV的生产和/或分泌
我们的来自不同条件(烧瓶与PBR)下生长的小球藻培养物的数据表明，生长条件(如150L PBR中使用的条件)可以提高纯化EV的产率(实施例15)。除了生长条件以外，还有新数据表明非生物和生物胁迫可以促进由真核细胞生产和/或分泌EV(Collett等人，2018；Nakase等人，2021)。例如，表明了特定的温度条件或病毒感染会触发EV从细胞的释放增强(Bewicke等人，2017；Schatz等人，2017)。此外，在响应丁香假单胞菌感染时以及用水杨酸处理后，发现植物EV分泌增加(Rutter&Innes，2017)，水杨酸是一种植物激素，已知其促进针对(半)生体营养植物病原体的抗病性(Durrant&Dong，2004)。此外，我们检测到在响应细菌微生物或病原体相关分子模式(MAMP/PAMP)鞭毛蛋白肽flg22时，植物EV分泌和/或生物发生增加，模式识别受体(PRR)鞭毛蛋白感应因子2(FLS2)感应flg22并触发植物免疫信号传导(Gomez-Gomez&Boller，2000；Zipfel等人，2004；Navarro等人，2004；数据未显示)。为了确定小球藻EV的分泌和/或生物发生是否可以在响应生物胁迫时得到类似的增强，我们决定用早期稳定期的培养物进行研究,以获得足够的生物量并使生物胁迫对EV生产和/或释放的最终积极影响最大化。用来自热杀大肠杆菌K12 TOP10或Pto DC3000 Wt细胞的上清液进一步处理小球藻培养物，然后将其置于标准生长条件下，以避免同时施加多种胁迫的风险，这可能会改变小球藻的生长和/或EV的生产/分泌。使用来自热杀细菌细胞的上清液的基本原理是，它们应当含有分子混合物，包括MAMP/PAMP，其可以被仍未知的小球藻PRR感应，从而如在植物中所发现的那样导致EV生产和/或分泌增强。孵育2天后，我们对细胞和纯化的EV进行定量(图11A)。有趣地，尽管处理在孵育的2天内没有显著影响小球藻生长(数据未显示)，但与对照条件相比，使用任一细菌上清液处理后，检测到纯化EV的产率增加了5至7倍(图11B)。因此，这些生物胁迫可以用于增加小球藻EV的生产和/或分泌。鉴于可以容易地以具有成本效益的方式生产热杀细菌的上清液，我们的发现揭示了可能适合提高大型PBR中小球藻EV生产的有前景的条件。
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序列表
<110> 免疫科技公司
国家科学研究中心
<120> 基于小球藻生产细胞外囊泡包埋的小RNA用于预防或治疗应用
<130> B380081 D40541
<150> EP20306018.1
<151> 2020-09-11
<160> 107
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsp1/Nsp13/Nsp4/Nsp3/Nsp5/Nsp12/Nsp14 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自SARS-CoV-2的Nsp1、Nsp13、Nsp4、Nsp5、
Nsp3、Nsp12和Nsp14基因
<400> 1
atggagagcc ttgtccctgg tttcaacgag aaaacacacg tccaactcag tttgcctgtt 60
ttacaggttc gcgacgtgct cgtacgtggc tttggagact ccgtggagga ggtcttatca 120
gaggcacgtc aacatcttaa agatggcact tgtggcttga tcgctgttgg ggcttgtgtt 180
ctttgcaatt cacagacttc attaagatgt ggtgcttgca tacgtagacc attcttatgt 240
tgtaaatgct gttacgacca tgtcatatca acatcacata aattagtctt gtctgttaat 300
ccgtatgttt gcaatgctcc atgcacactt gtgttccttt ttgttgctgc tattttctat 360
ttaataacac ctgttcatgt catgtctaaa catactgact tttcaagtga aatcatagga 420
tacaaggcta ttgatggtgg tgtcactcgt gacatagcat ctacagtgcg caccaacaaa 480
ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac 540
ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt acttaatgag aagtgctctg cctatacagt 600
tgaactcggt acagaagaag cagtggtttt agaaaaatgg cattcccatc tggtaaagtt 660
gagggttgta tggtacaagt aacttgtggt acaactacac ttaacggtct ttggcttgat 720
gacgtagttt actgtccaag acatgtgatc tgcacctctg aagacatgct ccatgttgga 780
ctgagactga ccttactaaa ggacctcatg aattttgctc tcaacataca atgctagtta 840
aacagggtga tgattatgtg taccttcctt acccagatcc atcaagaatc ctaggggccg 900
gctgttttgt agatgagtca gctgaaaatg taacaggact ctttaaagat tgtagtaagg 960
taatcactgg gttacatcct acacaggcac ctacacacct cagtgttgac actaaattca 1020
aaactgaagg tttatgtgtt gacatacctg gcatacctaa ggaca 1065
<210> 2
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsp1/Nsp13/Nsp4/Nsp3/Nsp5/Nsp12/Nsp14 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自SARS-CoV-2序列的Nsp1、Nsp13、Nsp4、Nsp5、
Nsp3、Nsp12和Nsp14基因
<400> 2
tgtccttagg tatgccaggt atgtcaacac ataaaccttc agttttgaat ttagtgtcaa 60
cactgaggtg tgtaggtgcc tgtgtaggat gtaacccagt gattacctta ctacaatctt 120
taaagagtcc tgttacattt tcagctgact catctacaaa acagccggcc cctaggattc 180
ttgatggatc tgggtaagga aggtacacat aatcatcacc ctgtttaact agcattgtat 240
gttgagagca aaattcatga ggtcctttag taaggtcagt ctcagtccaa catggagcat 300
gtcttcagag gtgcagatca catgtcttgg acagtaaact acgtcatcaa gccaaagacc 360
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gaatgccatt tttctaaaac cactgcttct tctgtaccga gttcaactgt ataggcagag 480
cacttctcat taagtacttt atcaatcctt tcatcaagtt caaaagtgat attcacactc 540
ttgtaacctt gcacttctat cacagtgtca tcaccaaaag taacctttgt tggtgcgcac 600
tgtagatgct atgtcacgag tgacaccacc atcaatagcc ttgtatccta tgatttcact 660
tgaaaagtca gtatgtttag acatgacatg aacaggtgtt attaaataga aaatagcagc 720
aacaaaaagg aacacaagtg tgcatggagc attgcaaaca tacggattaa cagacaagac 780
taatttatgt gatgttgata tgacatggtc gtaacagcat ttacaacata agaatggtct 840
acgtatgcaa gcaccacatc ttaatgaagt ctgtgaattg caaagaacac aagccccaac 900
agcgatcaag ccacaagtgc catctttaag atgttgacgt gcctctgata agacctcctc 960
cacggagtct ccaaagccac gtacgagcac gtcgcgaacc tgtaaaacag gcaaactgag 1020
ttggacgtgt gttttctcgt tgaaaccagg gacaaggctc tccat 1065
<210> 3
<211> 898
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E/M/N/S/前导序列/TRS/3’UTR dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自SARS-CoV-2的E、M、N、S、
亚基因组5’前导序列、TRS和3’UTR基因和区域
<400> 3
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt gatcggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct 180
taaaaagctc cttgaacaat ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg 240
tcttctacaa tttgcctatg ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt 300
cctctggctg tatgcatgtc tgataatgga ccccaaaatc agcgaaatgc accccgcatt 360
acgtttggtg gaccctcaga ttcaactggc agtaaccaga atggagaacg cagtggggcg 420
cgatcaaaac aacgtcggcc ccaaggttta cccaataata ctgcgtcttg gttcaccgct 480
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ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat acactaattc tttcacacgt ggtgtttatt 600
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ttagaagcag gtaacaaacc aaccaacttt cgatctcttg tagatctgtt ctctaaacga 720
actccactaa actaaactca tgcagaccac acaaggcaga tgggctatat aaacgttttc 780
gcttttccgt ttacgatata tagtctactc ttgtgcagaa tgaattctcg taactacata 840
gcacaagtag atgtagttaa ctttaatctc acatagcaat ctttaatcag tgtgtaac 898
<210> 4
<211> 898
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E/M/N/S/前导序列/TRS/3’UTR dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自SARS-CoV-2的E、M、N、S、
亚基因组5’前导序列、TRS和3’UTR基因和区域
<400> 4
gttacacact gattaaagat tgctatgtga gattaaagtt aactacatct acttgtgcta 60
tgtagttacg agaattcatt ctgcacaaga gtagactata tatcgtaaac ggaaaagcga 120
aaacgtttat atagcccatc tgccttgtgt ggtctgcatg agtttagttt agtggagttc 180
gtttagagaa cagatctaca agagatcgaa agttggttgg tttgttacct gcttcgttta 240
ggtaagaaca agtcctgagt tgaatgtaaa actgaggatc tgaaaacttt gtcagggtaa 300
taaacaccac gtgtgaaaga attagtgtat gcagggggta attgagttct ggttgtaaga 360
ttaacacact gactagagac tagtggcaat aaaacaagaa aaacaaacat gcactgagag 420
cggtgaacca agacgcagta ttattgggta aaccttgggg ccgacgttgt tttgatcgcg 480
ccccactgcg ttctccattc tggttactgc cagttgaatc tgagggtcca ccaaacgtaa 540
tgcggggtgc atttcgctga ttttggggtc cattatcaga catgcataca gccagaggaa 600
aattaactta attatataca aaaacctatt cctgttggca taggcaaatt gtagaagaca 660
aatccatgta aggaatagga aacctattac taggttccat tgttcaagga gctttttaag 720
ctcttcaacg gtaatagtac cgttggaatc tgccgatcac aatattgcag cagtacgcac 780
acaatcgaag cgcagtaagg atggctagtg taactagcaa gaataccacg aaagcaagaa 840
aaagaagtac gctattaact attaacgtac ctgtctcttc cgaaacgaat gagtacat 898
<210> 5
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl13/eIF3e/eIF3l/eIF3F dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的Rpl13、eIF3e、eIF3i和eIF3F基因
<400> 5
ccgctccaaa ctcatcctct tccccaggaa gccctcggcc cccaagaagg gagacagttc 60
tgctgaagaa ctgaaactgg ccacccagct gaccggaccg gtcatgcccg tccggaacgt 120
ctataagaag gagaaagctc gagtcatcac tgaggaagag aagaatttca aagccttcgc 180
tagtctccgt atggcccgtg ccaacgcccg gctcttcggc atacgggcaa aaagagccaa 240
ggaagccgca gaacaggatg gatcccaggg atggtaggat gctctttgac tacctggcgg 300
acaagcatgg ttttaggcag gaatatttag atacactcta cagatatgca aaattccagt 360
acgaatgtgg gaattactca ggagcagcag aatatcttta tttttttaga gtgctggttc 420
cagcaacaga tagaaatgct ttaagttcac tctggggaaa gctggcctct gaaatcttaa 480
tgcagaattg ggatgcagcc atggaagaca tgccaccaag catgtcctca ctggctcagc 540
tgacaacagc tgtcgtctct gggactgtga aacaggaaag cagctggccc ttctcaagac 600
caattcggct gtccggacct gcggttttga ctttgggggc aacatcatca tgttctccac 660
ggacaagcag atgggctacc agtgctttgt gagctttttt gacctgcggg atccgagcca 720
gattgacaac aatgagccct acatgaagat ccgtgctgtg gacagctacg agagacgcaa 780
cgagggtgct gcccgagtta tcgggaccct gttgggaact gtcgacaaac actcagtgga 840
ggtcaccaat tgcttttcag tgccgcacaa tgagtcagaa gatgaagtgg ctgttgacat 900
ggaatttgct aagaatatgt atgaactgca taaaaaagtt tctccaaatg agctcatcct 960
gggctggtac gctacgggcc atgacatcac agagcactct gtgctgatcc acgagtacta 1020
cagccg 1026
<210> 6
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl13/eIF3e/eIF3l/eIF3F dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的Rpl13、eIF3e、eIF3i和eIF3F基因
<400> 6
cggctgtagt actcgtggat cagcacagag tgctctgtga tgtcatggcc cgtagcgtac 60
cagcccagga tgagctcatt tggagaaact tttttatgca gttcatacat attcttagca 120
aattccatgt caacagccac ttcatcttct gactcattgt gcggcactga aaagcaattg 180
gtgacctcca ctgagtgttt gtcgacagtt cccaacaggg tcccgataac tcgggcagca 240
ccctcgttgc gtctctcgta gctgtccaca gcacggatct tcatgtaggg ctcattgttg 300
tcaatctggc tcggatcccg caggtcaaaa aagctcacaa agcactggta gcccatctgc 360
ttgtccgtgg agaacatgat gatgttgccc ccaaagtcaa aaccgcaggt ccggacagcc 420
gaattggtct tgagaagggc cagctgcttt cctgtttcac agtcccagag acgacagctg 480
ttgtcagctg agccagtgag gacatgcttg gtggcatgtc ttccatggct gcatcccaat 540
tctgcattaa gatttcagag gccagctttc cccagagtga acttaaagca tttctatctg 600
ttgctggaac cagcactcta aaaaaataaa gatattctgc tgctcctgag taattcccac 660
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gcttccttgg ctctttttgc ccgtatgccg aagagccggg cgttggcacg ggccatacgg 840
agactagcga aggctttgaa attcttctct tcctcagtga tgactcgagc tttctccttc 900
ttatagacgt tccggacggg catgaccggt ccggtcagct gggtggccag tttcagttct 960
tcagcagaac tgtctccctt cttgggggcc gagggcttcc tggggaagag gatgagtttg 1020
gagcgg 1026
<210> 7
<211> 704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eEIF1A/eIF4A dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的eEIF1A和eEIF4A基因
<400> 7
cctaaaagcc aaaatgggaa aggaaaagac tcatatcaac attgtcgtca ttggacacgt 60
agattcgggc aagtccacca ctactggcca tctgatctat aaatgcggtg gcatcgacaa 120
aagaaccatt gaaaaatttg agaaggaggc tgctgagatg ggaaagggct ccttcaagta 180
tgcctgggtc ttggataaac tgaaagctga gcgtgaacgt ggtatcacca ttgatatctc 240
cttgtggaaa tttgagacca gcaagtacta tgtgactatc attgatgccc caggacacag 300
agactttatc aaaaacatga ttacagggac atctcaggct gactgtgctg gatcaatggc 360
cccgatggga tggagcccga aggcgtcatc gagagtaact ggaatgagat tgttgacagc 420
tttgatgaca tgaacctctc ggagtccctt ctccgtggca tctacgcgta tggttttgag 480
aagccctctg ccatccagca gcgagccatt ctaccttgta tcaagggtta tgatgtgatt 540
gctcaagccc aatctgggac tgggaaaacg gccacatttg ccatatcgat tctgcagcag 600
attgaattag atctaaaagc cacccaggcc ttggtcctag cacccactcg agaattggct 660
cagcagatac agaaggtggt catggcacta ggagactaca tggg 704
<210> 8
<211> 704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eEIF1A/eIF4A dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的eEIF1A和eEIF4A基因
<400> 8
cccatgtagt ctcctagtgc catgaccacc ttctgtatct gctgagccaa ttctcgagtg 60
ggtgctagga ccaaggcctg ggtggctttt agatctaatt caatctgctg cagaatcgat 120
atggcaaatg tggccgtttt cccagtccca gattgggctt gagcaatcac atcataaccc 180
ttgatacaag gtagaatggc tcgctgctgg atggcagagg gcttctcaaa accatacgcg 240
tagatgccac ggagaaggga ctccgagagg ttcatgtcat caaagctgtc aacaatctca 300
ttccagttac tctcgatgac gccttcgggc tccatcccat cggggccatt gatccagcac 360
agtcagcctg agatgtccct gtaatcatgt ttttgataaa gtctctgtgt cctggggcat 420
caatgatagt cacatagtac ttgctggtct caaatttcca caaggagata tcaatggtga 480
taccacgttc acgctcagct ttcagtttat ccaagaccca ggcatacttg aaggagccct 540
ttcccatctc agcagcctcc ttctcaaatt tttcaatggt tcttttgtcg atgccaccgc 600
atttatagat cagatggcca gtagtggtgg acttgcccga atctacgtgt ccaatgacga 660
caatgttgat atgagtcttt tcctttccca ttttggcttt tagg 704
<210> 9
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Snrpe/Naca/Kif11l/Gbf1/Srp54 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的Snrpe、Naca、Kif11、Gbf1和Srp54基因
<400> 9
gggtcagaaa gtgcagaagg ttatggtgca gcccatcaac ctcatcttca gatacttaca 60
aaatagatcg cggattcagg tgtggctcta tgagcaagtg aatatgcgga tagaaggctg 120
tatcattggt tttgatgagt atatgaacct tgtattagat gatgcagaag agattcattc 180
taaaacaaag tcaagaaaac aactgggtcg gatcatgcta gatcaatttc tgccgtcctc 240
tcctgggctg gtgttggaat caccctctaa accccttgcc cctgctgatg aggatgagct 300
gctgcctctg attcccccgg aaccaatctc tgggggagtg cctttccagt cggtcctcgt 360
caacatgccc acccctaaat ctgctggaat ccctgtccca accccctctg ccaagcaacc 420
tgttacgaaa tgcaggtggt ggtgagatgc agaccattta atttggcaga gcggaaagct 480
agcgcccatt caatagtaga atgtgatcct gtacgaaaag aagttagtgt acgaactgga 540
ggattggctg acaagagctc aaggaaaaca tacacttttg atatggtgtt tggagcatct 600
actaaacaga ttgatgttta ccgaagtgtt gtttgtccag tgcgggatcc tctgctgcat 660
agtttcggtc atctaaagga ggttttaaac agtataacag aactctcaga aattgagccc 720
aatgtattcc ttcgaccttt tctggaagtg attcgctctg aagataccac tggccctatc 780
actggactgg cactcacctc tgtcaacaag ttcctgtcct atgcactcat agatcccacc 840
caagcatacc tgtctgtctg ctcccagctt tcttgggttt cttccgacgg cgtggggcct 900
cgctaaggaa ttcccggccc ctcagggcca cggctttagc ggtgtctttt gcgagttctt 960
cgtaagtaca tcttaaagct gtcaagatgg ttctagcaga ccttggaaga aaaataacat 1020
cagcattacg ctcgttgagc aatgccacca tt 1052
<210> 10
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Snrpe/Naca/Kif11l/Gbf1/Srp54 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的Snrpe、Naca、Kif11、Gbf1和Srp54基因
<400> 10
aatggtggca ttgctcaacg agcgtaatgc tgatgttatt tttcttccaa ggtctgctag 60
aaccatcttg acagctttaa gatgtactta cgaagaactc gcaaaagaca ccgctaaagc 120
cgtggccctg aggggccggg aattccttag cgaggcccca cgccgtcgga agaaacccaa 180
gaaagctggg agcagacaga caggtatgct tgggtgggat ctatgagtgc ataggacagg 240
aacttgttga cagaggtgag tgccagtcca gtgatagggc cagtggtatc ttcagagcga 300
atcacttcca gaaaaggtcg aaggaataca ttgggctcaa tttctgagag ttctgttata 360
ctgtttaaaa cctcctttag atgaccgaaa ctatgcagca gaggatcccg cactggacaa 420
acaacacttc ggtaaacatc aatctgttta gtagatgctc caaacaccat atcaaaagtg 480
tatgttttcc ttgagctctt gtcagccaat cctccagttc gtacactaac ttcttttcgt 540
acaggatcac attctactat tgaatgggcg ctagctttcc gctctgccaa attaaatggt 600
ctgcatctca ccaccacctg catttcgtaa caggttgctt ggcagagggg gttgggacag 660
ggattccagc agatttaggg gtgggcatgt tgacgaggac cgactggaaa ggcactcccc 720
cagagattgg ttccggggga atcagaggca gcagctcatc ctcatcagca ggggcaaggg 780
gtttagaggg tgattccaac accagcccag gagaggacgg cagaaattga tctagcatga 840
tccgacccag ttgttttctt gactttgttt tagaatgaat ctcttctgca tcatctaata 900
caaggttcat atactcatca aaaccaatga tacagccttc tatccgcata ttcacttgct 960
catagagcca cacctgaatc cgcgatctat tttgtaagta tctgaagatg aggttgatgg 1020
gctgcaccat aaccttctgc actttctgac cc 1052
<210> 11
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACE2/TMPRSS2/Psmd1/KpnA1/IMPB1 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的ACE2、TMPRSS2、Psmd1、KpnA1和IMPB1基因
<400> 11
gctgctcagt ccaccattga ggaacaggcc aagacatttt tggacaagtt taaccacgaa 60
gccgaagacc tgttctatca aagttcactt gcttcttgga attataacac caatattact 120
gaagagaatg tccaaaacat gaataatgct ggggacaaat ggtctgcctt tttaaaggaa 180
cagtccacac ttgcccaaat ggatctggag ccggatacca agtagaaaaa gtgatttctc 240
atccaaatta tgactccaag accaagaaca atgacattgc gctgatgaag ctgcagaagc 300
ctctgacttt caacgaccta gtgaaaccag tgtgtctgcc caacccaggc atgatgctgc 360
agccagaaca gctctgctgg atttccgggt ggggggccac cgaggagaaa gggaagaatg 420
cgggacctct tcaatgtcaa tgataactct gaatatgtgg aaactattat agcaaaatgc 480
attgatcact acaccaaaca atgtgtggaa aatgcagatt tgcctgaagg agaaaaaaaa 540
ccaattgacc agagattgga aggcatcgta aataaaatgt tccagcgatg tctagatgat 600
cacaagtata aacaggctat tggcattgct ctggagacag tgccagatgg aggctttcat 660
gaggctcaga ttagtaacat ggagatggca ccaggtggtg tcatcacttc tgacatgatt 720
gaaatgatat tttccaaaag cccagagcaa cagctttcag caacacagaa attcaggaag 780
ctgctttcaa aagaacctaa ccctcctatt gatgaagtta tcagcacacc aggagtagtg 840
aagcacagtc aggttgccag agttgcagct ggtctacaaa tcaagaactc tttgacatct 900
aaagatccag atatcaaggc acaatatcag cagaggtggc ttgctattga tgctaatgct 960
cgacgagaag tcaagaacta tgttttgcag acattgggta cagaaactta ccggcctagt 1020
tctgcctcac agtgtgtggc tggtattgct tg 1052
<210> 12
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACE2/TMPRSS2/Psmd1/KpnA1/IMPB1 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自人的ACE2、TMPRSS2、Psmd1、KpnA1和IMPB1基因
<400> 12
caagcaatac cagccacaca ctgtgaggca gaactaggcc ggtaagtttc tgtacccaat 60
gtctgcaaaa catagttctt gacttctcgt cgagcattag catcaatagc aagccacctc 120
tgctgatatt gtgccttgat atctggatct ttagatgtca aagagttctt gatttgtaga 180
ccagctgcaa ctctggcaac ctgactgtgc ttcactactc ctggtgtgct gataacttca 240
tcaataggag ggttaggttc ttttgaaagc agcttcctga atttctgtgt tgctgaaagc 300
tgttgctctg ggcttttgga aaatatcatt tcaatcatgt cagaagtgat gacaccacct 360
ggtgccatct ccatgttact aatctgagcc tcatgaaagc ctccatctgg cactgtctcc 420
agagcaatgc caatagcctg tttatacttg tgatcatcta gacatcgctg gaacatttta 480
tttacgatgc cttccaatct ctggtcaatt ggtttttttt ctccttcagg caaatctgca 540
ttttccacac attgtttggt gtagtgatca atgcattttg ctataatagt ttccacatat 600
tcagagttat cattgacatt gaagaggtcc cgcattcttc cctttctcct cggtggcccc 660
ccacccggaa atccagcaga gctgttctgg ctgcagcatc atgcctgggt tgggcagaca 720
cactggtttc actaggtcgt tgaaagtcag aggcttctgc agcttcatca gcgcaatgtc 780
attgttcttg gtcttggagt cataatttgg atgagaaatc actttttcta cttggtatcc 840
ggctccagat ccatttgggc aagtgtggac tgttccttta aaaaggcaga ccatttgtcc 900
ccagcattat tcatgttttg gacattctct tcagtaatat tggtgttata attccaagaa 960
gcaagtgaac tttgatagaa caggtcttcg gcttcgtggt taaacttgtc caaaaatgtc 1020
ttggcctgtt cctcaatggt ggactgagca gc 1052
<210> 13
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LptH/LolA/TolB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LptH、LolA和TolB基因
<400> 13
atgaggttcg ttaataccct cccccttatt ttcggtctga ctgccgccct cggcagctcc 60
atggccttgg ccctgccttc ggaccgcgaa caaccgatcc gcgtccaggc cgacagcgcc 120
gaactggacg acaagcaggg cgtcgcggtc taccgcggcg acgtcgtggt gacccagggc 180
agcaccaagc tgaccggcaa caccgtgacc ctgaagcagg acaagaacgg cgacatcgag 240
gtcgtgacct gatcatgcga ctgatccgca cgttgttcgt tgccgccctg gccatgggcg 300
cttcgctggc ccatgccgac gacagcgccg ccgtccagcg cctgaccggc ctgctgaaca 360
aggcccagac cctgaccgcg cgtttttccc agctgaccct ggacggtagc ggcacgcgcc 420
tgcaggaaac cgccggccaa ctgagcctga agcggccggg actgttccgc tggcataccg 480
atgcgccgaa cgagcaattg ctcagcatgt gagtaccctg attcgcattg cgctgttcgc 540
cctggccctg atggcaggtg ctgcgcaggc tgccgacccg ctggtgatct ccagcggtaa 600
cgaccgtgcc attcccatcg ccgtggtgcc gttcggcttc caggggggca acgtgttgcc 660
ggaagacatg tccaatatca tcggcaacga cctgcgcaac tccggctact tcgagccgct 720
gccccggcag aacatgatca gccagccggc gcaggcca 758
<210> 14
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LptH/LolA/TolB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LptH、LolA和TolB基因
<400> 14
tggcctgcgc cggctggctg atcatgttct gccggggcag cggctcgaag tagccggagt 60
tgcgcaggtc gttgccgatg atattggaca tgtcttccgg caacacgttg cccccctgga 120
agccgaacgg caccacggcg atgggaatgg cacggtcgtt accgctggag atcaccagcg 180
ggtcggcagc ctgcgcagca cctgccatca gggccagggc gaacagcgca atgcgaatca 240
gggtactcac gcattgagca attgctcgtt cggcgcatcg gtatgccagc ggaacagtcc 300
cggccgcttc aggctcagtt ggccggcggt ttcctgcagg cgcgtgccgc taccgtccag 360
ggtcagctgg gaaaaacgcg cggtcagggt ctgggccttg ttcagcaggc cggtcaggcg 420
ctggacggcg gcgctgtcgt cggcatgggc cagcgaagcg cccatggcca gggcggcaac 480
gaacaacgtg cggatcagtc gcatgatcag gtcacgacct cgatgtcgcc gttcttgtcc 540
tgcttcaggg tcacggtgtt gccggtcagc ttggtgctgc cctgggtcac cacgacgtcg 600
ccgcggtaga ccgcgacgcc ctgcttgtcg tccagttcgg cgctgtcggc ctggacgcgg 660
atcggttgtt cgcggtccga aggcagggcc aaggccatgg agctgccgag ggcggcagtc 720
agaccgaaaa taagggggag ggtattaacg aacctcat 758
<210> 15
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LpxA/LpxD/TolB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LpxA、LpxD和TolB基因
<400> 15
atgagtttga tcgatcctcg cgccatcatc gatccgagcg ccaggctggc ggctgacgtc 60
caggtgggcc cgtggtccat cgtcggggcg gaagtggaga tcggtgaagg gacggtgatc 120
ggtccgcacg tggtgctcaa gggccccacg aagatcggca agcacaaccg catctaccag 180
ttttccagcg tcggcgagga tactcccgac ctgaaataca agggcgagcc gacgcgcctg 240
gtgatcggtg gatcatgatg agtaccttgt cctacaccct gggccagctg gccgcgcatg 300
tcggcgcgga agtccgtggc gacgcggacc tgccaatcca gggcctggcg accttgcagg 360
aggccggacc ggctcagctg agcttcctgg ccaacccgca gtatcgcaag tacctgcccg 420
aaagccgtgc cggcgccgtc ctgctgacgg ctgccgacgc cgacgggttc gccggtaccg 480
cgctggtggt ggccaacccc taccgcatgt gagtaccctg attcgcattg cgctgttcgc 540
cctggccctg atggcaggtg ctgcgcaggc tgccgacccg ctggtgatct ccagcggtaa 600
cgaccgtgcc attcccatcg ccgtggtgcc gttcggcttc caggggggca acgtgttgcc 660
ggaagacatg tccaatatca tcggcaacga cctgcgcaac tccggctact tcgagccgct 720
gccccggcag aacatgatca gccagccggc gcaggcca 758
<210> 16
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LpxA/LpxD/TolB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LpxA、LpxD和TolB基因
<400> 16
tggcctgcgc cggctggctg atcatgttct gccggggcag cggctcgaag tagccggagt 60
tgcgcaggtc gttgccgatg atattggaca tgtcttccgg caacacgttg cccccctgga 120
agccgaacgg caccacggcg atgggaatgg cacggtcgtt accgctggag atcaccagcg 180
ggtcggcagc ctgcgcagca cctgccatca gggccagggc gaacagcgca atgcgaatca 240
gggtactcac gcatggtagg ggttggccac caccagcgcg gtaccggcga acccgtcggc 300
gtcggcagcc gtcagcagga cggcgccggc acggctttcg ggcaggtact tgcgatactg 360
cgggttggcc aggaagctca gctgagccgg tccggcctcc tgcaaggtcg ccaggccctg 420
gattggcagg tccgcgtcgc cacggacttc cgcgccgaca tgcgcggcca gctggcccag 480
ggtgtaggac aaggtactca tcatgatcca ccgatcacca ggcgcgtcgg ctcgcccttg 540
tatttcaggt cgggagtatc ctcgccgacg ctggaaaact ggtagatgcg gttgtgcttg 600
ccgatcttcg tggggccctt gagcaccacg tgcggaccga tcaccgtccc ttcaccgatc 660
tccacttccg ccccgacgat ggaccacggg cccacctgga cgtcagccgc cagcctggcg 720
ctcggatcga tgatggcgcg aggatcgatc aaactcat 758
<210> 17
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE/dnaN/gyrB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的secE、dnaN和gyrB基因
<400> 17
atgaatgcca aggcagaagc caaagaatca cgttttgatc tcttgaaatg gctcttggtt 60
gccgttctgg ttgtggttgc cgttgtgggc aatcagtact tttcggctca accaatcctg 120
tatcgcgttc tcggtattct cgttctggcg gtgatcgctg ctttcctggc tctgcaaacg 180
gccaaggggc aggccttctt tagtcttgct aaggaagcgc gcgtcgagat tcgcaaggtc 240
gtatggccga gatcatgcat ttcaccattc aacgcgaagc cctgttgaaa ccgctgcaac 300
tggtcgccgg cgtcgtggaa cgccgccaga cattgccggt tctctccaac gtcctgctgg 360
tggtcgaagg ccagcaactg tcgctgaccg gcaccgacct cgaagtcgag ctggttggtc 420
gcgtggtact ggaagatgcc gccgaacccg gcgagatcac cgtaccggcg cgcaagctga 480
tggacatctg caagagcctg ccgagcatat gagcgagaac aacacgtacg actcttccag 540
catcaaggtg ctgaaggggc tggatgccgt acgcaagcgc cccggcatgt acatcggcga 600
caccgacgat ggcaccggtc tgcaccacat ggtgttcgag gtggtggata actccatcga 660
cgaagcgctg gccggttact gcagcgaaat cagcatcacc atccatacgg atgagtcgat 720
cactgtccgc gacaatggac gcggtattcc ggtggata 758
<210> 18
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> secE/dnaN/gyrB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的secE、dnaN和gyrB基因
<400> 18
tatccaccgg aataccgcgt ccattgtcgc ggacagtgat cgactcatcc gtatggatgg 60
tgatgctgat ttcgctgcag taaccggcca gcgcttcgtc gatggagtta tccaccacct 120
cgaacaccat gtggtgcaga ccggtgccat cgtcggtgtc gccgatgtac atgccggggc 180
gcttgcgtac ggcatccagc cccttcagca ccttgatgct ggaagagtcg tacgtgttgt 240
tctcgctcat gcattcggca ggctcttgca gatgtccatc agcttgcgcg ccggtacggt 300
gatctcgccg ggttcggcgg catcttccag taccacgcga ccaaccagct cgacttcgag 360
gtcggtgccg gtcagcgaca gttgctggcc ttcgaccacc agcaggacgt tggagagaac 420
cggcaatgtc tggcggcgtt ccacgacgcc ggcgaccagt tgcagcggtt tcaacagggc 480
ttcgcgttga atggtgaaat gcatgatctc ggccatacga ccttgcgaat ctcgacgcgc 540
gcttccttag caagactaaa gaaggcctgc cccttggccg tttgcagagc caggaaagca 600
gcgatcaccg ccagaacgag aataccgaga acgcgataca ggattggttg agccgaaaag 660
tactgattgc ccacaacggc aaccacaacc agaacggcaa ccaagagcca tttcaagaga 720
tcaaaacgtg attctttggc ttctgccttg gcattcat 758
<210> 19
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XcpQ/ExsA/PcrV/LasR/RhlR/VqsM/RmsA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的XcpQ、ExsA、PcrV、LasR、
RhlR、VqsM和RmsA基因
<400> 19
atgtcccagc ctttgctccg cgccctgttt gccccttcca gtcgttcgta cgttcccgcc 60
gtccttctca gcctggccct cggcatccag gcggcgcacg ccgaaaacag cggcgggaac 120
gccttcgtcc cggccggcaa ccagcaggag gatcatgcaa ggagccaaat ctcttggccg 180
aaagcagata acgtcttgtc attggaacat tccaactttc gaatacaggg taaacaagga 240
agagggcgta tatgttctgc tcgagggcga actgaccgtc caggacatcg attccacttt 300
ttgcgcatat ggaagtcaga aaccttaatg ccgctcgcga gctgttcctg gacgagctcc 360
tggccgcgtc ggcggcgcct gccagtgccg agcaggagga actgctggcc ctgttgcgca 420
gcgagcggat cgtgctggcc cacgccggcc agccgctgat gcatggcctt ggttgacggt 480
tttcttgagc tggaacgctc aagtggaaaa ttggagtgga gcgccatcct gcagaagatg 540
gcgagcgacc ttggattctc gaagatcctg ttcggcctgt tgcctaagga cagccaggac 600
tacgagaacg ccgtgcatga ggaatgacgg aggctttttg ctgtggtggg acggtttgcg 660
tagcgagatg cagccgatcc acgacagcca gggcgtgttc gccgtcctgg aaaaggaagt 720
gcggcgcctg ggcttcgatt actacgccta tggcgtgcgc cacacgaagc atggtgaccg 780
aacacatatt tgattttgaa tggcgccctc tgcagaacta tcttcgtgat cgtgatatcg 840
caataccacc ctttgcggca gaacaagagt caagaagtga cgcactttac aactggatag 900
tcagcaaggg gtattcagga tccaatgctg attctgactc gtcgggtcgg agagaccctg 960
atggtaggtg acgacgtcac cgtgacggta ctgggtgtca aagggaacca ggtgcgcatc 1020
ggcgtcaacg cgccgaagga agtcgccgta caccgggagg aaatttacca gcgc 1074
<210> 20
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XcpQ/ExsA/PcrV/LasR/RhlR/VqsM/RmsA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的XcpQ、ExsA、PcrV、LasR、
RhlR、VqsM和RmsA基因
<400> 20
gcgctggtaa atttcctccc ggtgtacggc gacttccttc ggcgcgttga cgccgatgcg 60
cacctggttc cctttgacac ccagtaccgt cacggtgacg tcgtcaccta ccatcagggt 120
ctctccgacc cgacgagtca gaatcagcat tgactcctga ataccccttg ctgactatcc 180
agttgtaaag tgcgtcactt cttgactctt gttctgccgc aaagggtggt attgcgatat 240
cacgatcacg aagatagttc tgcagagggc gccattcaaa atcaaatatg tgttcggtca 300
ccattggacg tgtggcgcac gccataggcg tagtaatcga agcccaggcg ccgcacttcc 360
ttttccagga cggcgaacac gccctggctg tcgtggatcg gctgcatctc gctacgcaaa 420
ccgtcccacc acagcaaaaa gcctccgtca ttcctcatgc ttggcgttct cgtagtcctg 480
gctgtcctta ggcaacaggc cgaacaggat cttcgagaat ccaaggtcgc tcgccatctt 540
ctgcaggatg gcgctccact ccaattttcc acttgagcgt tccagctcaa gaaaaccgtc 600
aaccaaggcc atgcaccagc ggctggccgg cgtgggccag cacgatccgc tcgctgcgca 660
acagggccag cagttcctcc tgctcggcac tggcaggcgc cgccgacgcg gccaggagct 720
cgtccaggaa cagctcgcga gcggcattaa ggtttctgac ttccatgcat gcaaaaagtg 780
gaatcgatgt cctggacggt cagttcgccc tcgagcagaa catatacgcc ctcttccttg 840
tttaccctgt attcgaaagt tggaatgttc caatgacaag acgttatctg ctttcggcca 900
agagatttgg ctccttgcat gatcctcctg ctggttgccg gccgggacga aggcgttccc 960
gccgctgttt tcggcgtgcg ccgcctggat gccgagggcc aggctgagaa ggacggcggg 1020
aacgtacgaa cgactggaag gggcaaacag ggcgcggagc aaaggctggg acat 1074
<210> 21
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XcpQ/PscF/PscC dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的XcpQ、PscF和PscC基因
<400> 21
atgtcccagc ctttgctccg cgccctgttt gccccttcca gtcgttcgta cgttcccgcc 60
gtccttctca gcctggccct cggcatccag gcggcgcacg ccgaaaacag cggcgggaac 120
gccttcgtcc cggccggcaa ccagcaggag gcgcactgga cgatcaacct caaggatgcc 180
gacatccgcg aattcatcga ccagatttcc gaaatcaccg gcgagacctt cgtcgtcgac 240
ccgcgggtca gatctcagat cttctgcagg atgccttgca tcaggtcgcg cagcgcacgg 300
gtcaccgtcg agttgatgtt gtagatgacc gaccacttgt tgatcttgtg ttgcagctcg 360
gccagcagcg ccgggttgtc ggcattgtcg gtcccctgca aggccttgat cgcgtcgttg 420
acgtccttgt tcgctgcgtt ggcctgctcc ttcagggcat tggccacggt atcgagggta 480
ttccccgggt tggggttgaa tatcgcatat gcgccgcctg ctgatcggcg gactgctggc 540
gctgctgcct ggcgcggtct tgcgcgcgca gccgctggac tggcccagcc tgccttacga 600
ctatgtggcg cagggcgaaa gcctgcgcga cgtgctggcc aacttcggcg ccaactacga 660
tgcctcggtg atcgtcagcg acaaggtcaa cgaccaggtc agcggtcgct tcgacctgga 720
aagcccgcag gccttcctgc agttgatggc ctccctct 758
<210> 22
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XcpQ/PscF/PscC dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的XcpQ、PscF和PscC基因
<400> 22
agagggaggc catcaactgc aggaaggcct gcgggctttc caggtcgaag cgaccgctga 60
cctggtcgtt gaccttgtcg ctgacgatca ccgaggcatc gtagttggcg ccgaagttgg 120
ccagcacgtc gcgcaggctt tcgccctgcg ccacatagtc gtaaggcagg ctgggccagt 180
ccagcggctg cgcgcgcaag accgcgccag gcagcagcgc cagcagtccg ccgatcagca 240
ggcggcgcat gcatgatatt caaccccaac ccggggaata ccctcgatac cgtggccaat 300
gccctgaagg agcaggccaa cgcagcgaac aaggacgtca acgacgcgat caaggccttg 360
caggggaccg acaatgccga caacccggcg ctgctggccg agctgcaaca caagatcaac 420
aagtggtcgg tcatctacaa catcaactcg acggtgaccc gtgcgctgcg cgacctgatg 480
caaggcatcc tgcagaagat ctgagatctg acccgcgggt cgacgacgaa ggtctcgccg 540
gtgatttcgg aaatctggtc gatgaattcg cggatgtcgg catccttgag gttgatcgtc 600
cagtgcgcct cctgctggtt gccggccggg acgaaggcgt tcccgccgct gttttcggcg 660
tgcgccgcct ggatgccgag ggccaggctg agaaggacgg cgggaacgta cgaacgactg 720
gaaggggcaa acagggcgcg gagcaaaggc tgggacat 758
<210> 23
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ExoS/ExsA/Vrf dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的ExoS、ExsA和Vrf基因
<400> 23
atgcatattc aatcgcttca gcagagtccg tctttcgccg tcgaattgca ccaggccgcc 60
agtgggcgtt tgggacagat tgaggcccgc caggtcgcca cccccagtga agcgcagcag 120
ttggcccagc gccaggacgc gccgaagggt gaggggctgc tcgctcgctt gggtgcggca 180
ctcgtgcgtc ccttcgtggc gatcatggac tggctgggca agctgttggg ctcccacgcc 240
cgcaccggcc gatcatgcaa ggagccaaat ctcttggccg aaagcagata acgtcttgtc 300
attggaacat tccaactttc gaatacaggg taaacaagga agagggcgta tatgttctgc 360
tcgagggcga actgaccgtc caggacatcg attccacttt ttgcctggcg cctggcgagt 420
tgcttttcgt ccgccgcgga agctatgtcg taagtaccaa gggaaaggac agccgaatac 480
tctggattcc attatctgcc cagtgcatat ggtagctatt acccacacac ccaaactcaa 540
acacctagac aagctgctcg cacactgtca ccgccgccgc tacaccgcaa agagcaccat 600
catctatgcc ggcgatcgct gcgaaacgct gttcttcatc atcaagggtt cggtcaccat 660
cctcatcgag gacgacgacg gccgcgaaat gatcatcggc tacctcaaca gcggtgattt 720
cttcggcgag ctgggattgt tcgaaaagga aggcagcg 758
<210> 24
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ExoS/ExsA/Vrf dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的ExoS、ExsA和Vrf基因
<400> 24
cgctgccttc cttttcgaac aatcccagct cgccgaagaa atcaccgctg ttgaggtagc 60
cgatgatcat ttcgcggccg tcgtcgtcct cgatgaggat ggtgaccgaa cccttgatga 120
tgaagaacag cgtttcgcag cgatcgccgg catagatgat ggtgctcttt gcggtgtagc 180
ggcggcggtg acagtgtgcg agcagcttgt ctaggtgttt gagtttgggt gtgtgggtaa 240
tagctaccat gcatactggg cagataatgg aatccagagt attcggctgt cctttccctt 300
ggtacttacg acatagcttc cgcggcggac gaaaagcaac tcgccaggcg ccaggcaaaa 360
agtggaatcg atgtcctgga cggtcagttc gccctcgagc agaacatata cgccctcttc 420
cttgtttacc ctgtattcga aagttggaat gttccaatga caagacgtta tctgctttcg 480
gccaagagat ttggctcctt gcatgatcgg ccggtgcggg cgtgggagcc caacagcttg 540
cccagccagt ccatgatcgc cacgaaggga cgcacgagtg ccgcacccaa gcgagcgagc 600
agcccctcac ccttcggcgc gtcctggcgc tgggccaact gctgcgcttc actgggggtg 660
gcgacctggc gggcctcaat ctgtcccaaa cgcccactgg cggcctggtg caattcgacg 720
gcgaaagacg gactctgctg aagcgattga atatgcat 758
<210> 25
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ExoU/ExsA/Vrf dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的ExoU、ExsA和Vrf基因
<400> 25
atgcatatcc aatcgttggg ggctactgcc tcctcgctga atcaggagcc tgtcgaaacc 60
ccgtcgcagg cagcgcataa gtccgccagc ttgcgtcagg aaccttcagg gcaaggtctc 120
ggggttgccc taaagagcac gccgggaata ctttccggga agttgccgga aagcgttagc 180
gacgtgcgtt tcagcagtcc ccaagggcaa ggggagtccc gtactctgac tgactcggca 240
gggccgcggc gatcatgcaa ggagccaaat ctcttggccg aaagcagata acgtcttgtc 300
attggaacat tccaactttc gaatacaggg taaacaagga agagggcgta tatgttctgc 360
tcgagggcga actgaccgtc caggacatcg attccacttt ttgcctggcg cctggcgagt 420
tgcttttcgt ccgccgcgga agctatgtcg taagtaccaa gggaaaggac agccgaatac 480
tctggattcc attatctgcc cagtgcatat ggtagctatt acccacacac ccaaactcaa 540
acacctagac aagctgctcg cacactgtca ccgccgccgc tacaccgcaa agagcaccat 600
catctatgcc ggcgatcgct gcgaaacgct gttcttcatc atcaagggtt cggtcaccat 660
cctcatcgag gacgacgacg gccgcgaaat gatcatcggc tacctcaaca gcggtgattt 720
cttcggcgag ctgggattgt tcgaaaagga aggcagcg 758
<210> 26
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ExoU/ExsA/Vrf dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的ExoU、ExsA和Vrf基因
<400> 26
cgctgccttc cttttcgaac aatcccagct cgccgaagaa atcaccgctg ttgaggtagc 60
cgatgatcat ttcgcggccg tcgtcgtcct cgatgaggat ggtgaccgaa cccttgatga 120
tgaagaacag cgtttcgcag cgatcgccgg catagatgat ggtgctcttt gcggtgtagc 180
ggcggcggtg acagtgtgcg agcagcttgt ctaggtgttt gagtttgggt gtgtgggtaa 240
tagctaccat gcatactggg cagataatgg aatccagagt attcggctgt cctttccctt 300
ggtacttacg acatagcttc cgcggcggac gaaaagcaac tcgccaggcg ccaggcaaaa 360
agtggaatcg atgtcctgga cggtcagttc gccctcgagc agaacatata cgccctcttc 420
cttgtttacc ctgtattcga aagttggaat gttccaatga caagacgtta tctgctttcg 480
gccaagagat ttggctcctt gcatgatcgc cgcggccctg ccgagtcagt cagagtacgg 540
gactcccctt gcccttgggg actgctgaaa cgcacgtcgc taacgctttc cggcaacttc 600
ccggaaagta ttcccggcgt gctctttagg gcaaccccga gaccttgccc tgaaggttcc 660
tgacgcaagc tggcggactt atgcgctgcc tgcgacgggg tttcgacagg ctcctgattc 720
agcgaggagg cagtagcccc caacgattgg atatgcat 758
<210> 27
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LasR/RhlR/VqsM dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LasR、RhlR和VqsM基因
<400> 27
atggccttgg ttgacggttt tcttgagctg gaacgctcaa gtggaaaatt ggagtggagc 60
gccatcctgc agaagatggc gagcgacctt ggattctcga agatcctgtt cggcctgttg 120
cctaaggaca gccaggacta cgagaacgcc ttcatcgtcg gcaactaccc ggccgcctgg 180
cgcgagcatt acgaccgggc tggctacgcg cgggtcgacc cgacggtcag tcactgtacc 240
cagagcgtac gatcatgagg aatgacggag gctttttgct gtggtgggac ggtttgcgta 300
gcgagatgca gccgatccac gacagccagg gcgtgttcgc cgtcctggaa aaggaagtgc 360
ggcgcctggg cttcgattac tacgcctatg gcgtgcgcca cacgattccc ttcacccggc 420
cgaagaccga ggtccatggc acctatccca aggcctggct ggagcgatac cagatgcaga 480
actacggggc cgtggatccg gcgagcatat ggtgaccgaa cacatatttg attttgaatg 540
gcgccctctg cagaactatc ttcgtgatcg tgatatcgca ataccaccct ttgcggcaga 600
acaagagtca agaagtgacg cactttacaa ctggatagtc agcaaggggt attcaggaaa 660
agaaggactg aatcttggaa cttattacca tatatctgat tatggcgtga taggattggc 720
gttgctatgc gccgagaacg taggtgatat tttgaaag 758
<210> 28
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LasR/RhlR/VqsM dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的LasR、RhlR和VqsM基因
<400> 28
ctttcaaaat atcacctacg ttctcggcgc atagcaacgc caatcctatc acgccataat 60
cagatatatg gtaataagtt ccaagattca gtccttcttt tcctgaatac cccttgctga 120
ctatccagtt gtaaagtgcg tcacttcttg actcttgttc tgccgcaaag ggtggtattg 180
cgatatcacg atcacgaaga tagttctgca gagggcgcca ttcaaaatca aatatgtgtt 240
cggtcaccat gcattcgccg gatccacggc cccgtagttc tgcatctggt atcgctccag 300
ccaggccttg ggataggtgc catggacctc ggtcttcggc cgggtgaagg gaatcgtgtg 360
gcgcacgcca taggcgtagt aatcgaagcc caggcgccgc acttcctttt ccaggacggc 420
gaacacgccc tggctgtcgt ggatcggctg catctcgcta cgcaaaccgt cccaccacag 480
caaaaagcct ccgtcattcc tcatgatcgt acgctctggg tacagtgact gaccgtcggg 540
tcgacccgcg cgtagccagc ccggtcgtaa tgctcgcgcc aggcggccgg gtagttgccg 600
acgatgaagg cgttctcgta gtcctggctg tccttaggca acaggccgaa caggatcttc 660
gagaatccaa ggtcgctcgc catcttctgc aggatggcgc tccactccaa ttttccactt 720
gagcgttcca gctcaagaaa accgtcaacc aaggccat 758
<210> 29
<211> 694
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GacA/RmsA/MvfR dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的GacA、RmsA和MvfR基因
<400> 29
gtgattaagg tgctggtggt cgacgaccac gatctggtac gcaccggtat tacccgcatg 60
ctggccgaca tcgaaggctt gcaagtggtc ggccaggccg actgcggtga agactgtctg 120
aaactggccc gcgaactgaa gccggatgtc gtcctgatgg acgtgaagat gcccggtatc 180
ggcggcctgg aggcgacccg caagctgctg cgcagccagc ccgacatcaa ggtcgtggta 240
gtcaccgtct gatcatgctg attctgactc gtcgggtcgg agagaccctg atggtaggtg 300
acgacgtcac cgtgacggta ctgggtgtca aagggaacca ggtgcgcatc ggcgtcaacg 360
cgccgaagga agtcgccgta caccgggagg aaatttacca gcgcatccag aaagagaaag 420
atcaagagcc aaaccattaa gcatatgcct attcataacc tgaatcacgt gaacatgttc 480
ctccaggtca tcgcctccgg ttcgatttcc tccgctgcgc ggatcctgcg caagtcgcac 540
accgcggtca gctcggcggt cagcaacctg gaaatcgacc tgtgcgtgga gctggtccgt 600
cgggacggct acaaggtcga acccaccgag caggcgcttc gcctgatccc ttacatgcgc 660
agcctgctga actaccagca gctgatcggc gaca 694
<210> 30
<211> 694
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GacA/RmsA/MvfR dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的GacA、RmsA和MvfR基因
<400> 30
tgtcgccgat cagctgctgg tagttcagca ggctgcgcat gtaagggatc aggcgaagcg 60
cctgctcggt gggttcgacc ttgtagccgt cccgacggac cagctccacg cacaggtcga 120
tttccaggtt gctgaccgcc gagctgaccg cggtgtgcga cttgcgcagg atccgcgcag 180
cggaggaaat cgaaccggag gcgatgacct ggaggaacat gttcacgtga ttcaggttat 240
gaataggcat gcatttaatg gtttggctct tgatctttct ctttctggat gcgctggtaa 300
atttcctccc ggtgtacggc gacttccttc ggcgcgttga cgccgatgcg cacctggttc 360
cctttgacac ccagtaccgt cacggtgacg tcgtcaccta ccatcagggt ctctccgacc 420
cgacgagtca gaatcagcat gatcagacgg tgactaccac gaccttgatg tcgggctggc 480
tgcgcagcag cttgcgggtc gcctccaggc cgccgatacc gggcatcttc acgtccatca 540
ggacgacatc cggcttcagt tcgcgggcca gtttcagaca gtcttcaccg cagtcggcct 600
ggccgaccac ttgcaagcct tcgatgtcgg ccagcatgcg ggtaataccg gtgcgtacca 660
gatcgtggtc gtcgaccacc agcaccttaa tcac 694
<210> 31
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mexX/mexA/ampC dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的mexX、mexA和ampC基因
<400> 31
atggaccggc tcgctgcgcg gctgctggcg gccctggtcg ccctattcct gctgggctgc 60
gaagaagcag cggacgccgg gaagactgcg gaggcccccg ccgaggtcgg cgtgatcgtc 120
gccaggccgg cgcctatcgg catcaccagc gagctgcccg gacgcctgga agcgtaccgc 180
caggctgaag tgcgggcgcg cgtcgccggc atcgtcaccc gtcgcctgta cgaggaaggc 240
caggacgtcc gatcatgcaa cgaacgccag ccatgcgtgt actggttccg gccctgctgg 300
tcgcgatttc ggccctttcc gggtgcggaa aaagcgaggc gccgccgccg gcgcaaacgc 360
cggaggtcgg gatcgtgacc ctggaagcgc agacggtgac cctgaatacc gagctgccgg 420
gccggaccaa tgcgttccgc atcgccgagg tgcgtcccca ggtgaacggc atcatcctca 480
agcgcctgtt caaggaaggc agcggcatat gcgcgatacc agattcccct gcctgtgcgg 540
catcgccgct tccacactgc tgttcgccac caccccggcc attgccggcg aggccccggc 600
ggatcgcctg aaggcactgg tcgacgccgc cgtacaaccg gtgatgaagg ccaatgacat 660
tccgggcctg gccgtagcca tcagcctgaa aggagaaccg cattacttca gctatgggct 720
ggcctcgaaa gaggacggcc gccgggtgac gccggaga 758
<210> 32
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mexX/mexA/ampC dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的mexX、mexA和ampC基因
<400> 32
tctccggcgt cacccggcgg ccgtcctctt tcgaggccag cccatagctg aagtaatgcg 60
gttctccttt caggctgatg gctacggcca ggcccggaat gtcattggcc ttcatcaccg 120
gttgtacggc ggcgtcgacc agtgccttca ggcgatccgc cggggcctcg ccggcaatgg 180
ccggggtggt ggcgaacagc agtgtggaag cggcgatgcc gcacaggcag gggaatctgg 240
tatcgcgcat gcatcgctgc cttccttgaa caggcgcttg aggatgatgc cgttcacctg 300
gggacgcacc tcggcgatgc ggaacgcatt ggtccggccc ggcagctcgg tattcagggt 360
caccgtctgc gcttccaggg tcacgatccc gacctccggc gtttgcgccg gcggcggcgc 420
ctcgcttttt ccgcacccgg aaagggccga aatcgcgacc agcagggccg gaaccagtac 480
acgcatggct ggcgttcgtt gcatgatcgg acgtcctggc cttcctcgta caggcgacgg 540
gtgacgatgc cggcgacgcg cgcccgcact tcagcctggc ggtacgcttc caggcgtccg 600
ggcagctcgc tggtgatgcc gataggcgcc ggcctggcga cgatcacgcc gacctcggcg 660
ggggcctccg cagtcttccc ggcgtccgct gcttcttcgc agcccagcag gaatagggcg 720
accagggccg ccagcagccg cgcagcgagc cggtccat 758
<210> 33
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VirF/VirB/IcsA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的VirF、VirB和IcsA基因
<400> 33
atgatggata tgggacataa aaacaaaata gatataaagg ttcgcttgca taactatatt 60
attttatatg caaaaaggtg ttcaatgacg gttagctcag gcaatgaaac tttgactatc 120
gatgaagggc aaattgcttt tatagagcga aatatacaaa taaacgtctc cataaaaaaa 180
tctgatagca ttaatccatt tgagattata agccttgaca gaaatttatt attaagcatt 240
attagaataa gatcatggtg gatttgtgca acgacttgtt aagtataaag gaaggccaaa 300
agaaagagtt tacactccat tctggtaata aagtttcctt tatcaaagcc aagattcctc 360
ataaaaggat ccaagattta accttcgtca accaaaaaac gaatgtacgc gatcaagaat 420
ccctaacaga agaatcatta gccgatatca taaaaactat aaagctacaa caattcttcc 480
ctgtaatagg aagggagatt gatggcatcc cttgggagct ggtgaagatg gaatggatgc 540
gtggtatata acttcttcca acccctctca tgcatctaga actaagctac ggattaactc 600
tgatattatg attagcgcag gtcatggtgg tgctggtgat aataatgatg gtaatagttg 660
tggcggtaat ggtggtgact ctattaccgg atctgacttg tctataatca atcaaggcat 720
gattcttggt ggtagcggcg gtagcggtgc tgaccata 758
<210> 34
<211> 758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VirF/VirB/IcsA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的VirF、VirB和IcsA基因
<400> 34
tatggtcagc accgctaccg ccgctaccac caagaatcat gccttgattg attatagaca 60
agtcagatcc ggtaatagag tcaccaccat taccgccaca actattacca tcattattat 120
caccagcacc accatgacct gcgctaatca taatatcaga gttaatccgt agcttagttc 180
tagatgcatg agaggggttg gaagaagtta tataccacgc atccattcca tcttcaccag 240
ctcccaaggg gcatcatcaa tctcccttcc tattacaggg aagaattgtt gtagctttat 300
agtttttatg atatcggcta atgattcttc tgttagggat tcttgatcgc gtacattcgt 360
tttttggttg acgaaggtta aatcttggat ccttttatga ggaatcttgg ctttgataaa 420
ggaaacttta ttaccagaat ggagtgtaaa ctctttcttt tggccttcct ttatacttaa 480
caagtcgttg cacaaatcca ccatgatctt attctaataa tgcttaataa taaatttctg 540
tcaaggctta taatctcaaa tggattaatg ctatcagatt tttttatgga gacgtttatt 600
tgtatatttc gctctataaa agcaatttgc ccttcatcga tagtcaaagt ttcattgcct 660
gagctaaccg tcattgaaca cctttttgca tataaaataa tatagttatg caagcgaacc 720
tttatatcta ttttgttttt atgtcccata tccatcat 758
<210> 35
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fnbA/clfA/clfB/spa dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的fnbA、clfA、clfB和spa基因
<400> 35
atgggacaag acaaagaagc tgcagcatca gaacaaaaga caactacagt agaagaaaat 60
gggaattcag ctactgataa taaaacaagt gaaacacaaa caactgcaac taacgttaat 120
catatagaag aaactcaatc atataacgca acagtaacag aacaaccgtc aaacgcaaca 180
caagtaacaa ctgaagaagc gatcatgaat atgaagaaaa aagaaaaaca cgcaattcgg 240
aaaaaatcga ttggcgtggc ttcagtgctt gtaggtacgt taatcggttt tggactactc 300
agcagtaaag aagcagatgc aagtgaaaat agtgttacgc aatctgatag cgcaagtaac 360
gaaagcaaaa gtaatgattc aagtagcgtt agtgctgcac ctaagcattt acgctttttc 420
tttatgatct tgcttgcgtt ttctaaacaa tagtaatgat cctaataatg ccatcattgc 480
accaaataaa gttgcatttg tgttttcgct cttatctcct gtttctggta aagcatcagt 540
tttgtgttgt tttgatacct tattagaatg gtttacttca cctttaggat ttgatggtgc 600
tttctgttat gcttatagtt cgcgacgacg tccagctaat aacgctgcac ctaaggctaa 660
tgataatcca ccaaatacag ttgtaccgat gaatggattt tcttcaccag tttctggtaa 720
tgcttgagct ttgttagcat ctgcatggtt tgctggttgc ttcttatcaa caacaagttc 780
ttgaccaggt ttgatcatgt ttttatcagc ta 812
<210> 36
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fnbA/clfA/clfB/spa dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的fnbA、clfA、clfB和spa基因
<400> 36
tagctgataa aaacatgatc aaacctggtc aagaacttgt tgttgataag aagcaaccag 60
caaaccatgc agatgctaac aaagctcaag cattaccaga aactggtgaa gaaaatccat 120
tcatcggtac aactgtattt ggtggattat cattagcctt aggtgcagcg ttattagctg 180
gacgtcgtcg cgaactataa gcacaacaga aagcaccatc aaatcctaaa ggtgaagtaa 240
accattctaa taaggtatca aaacaacaca aaactgatgc tttaccagaa acaggagata 300
agagcgaaaa cacaaatgca actttatttg gtgcaatgat ggcattatta ggatcattac 360
tattgtttag aaaacgcaag caagatcata aagaaaaagc gtaagcattt aggtgcagca 420
ctaacgctac ttgaatcatt acttttgctt tcgttacttg cgctatcaga ttgcgtaaca 480
ctattttcac ttgcatctgc ttctttactg ctgagtagtc caaaaccgat taacgtacct 540
acaagcactg aagccacgcc aatcgatttt ttccgaattg cgtgtttttc ttttttcttc 600
atattcatga tcgcttcttc agttgttact tgtgttgcgt ttgacggttg ttctgttact 660
gttgcgttat atgattgagt ttcttctata tgattaacgt tagttgcagt tgtttgtgtt 720
tcacttgttt tattatcagt agctgaattc ccattttctt ctactgtagt tgtcttttgt 780
tctgatgctg cagcttcttt gtcttgtccc at 812
<210> 37
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lukF-PV/lukS-PV/lukE/lukD dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的lukF-PV、lukS-PV、lukE和lukD基因
<400> 37
ttagctcata ggattttttt ccttagattg agtatctatt aatttaactg tatgattttc 60
ccaatcaact tcataaattg atgtatgagt tgctctattt tcatctttat aattattacc 120
tatccagtga agttgattcc aaaagtttgt atatctatcc atttctcttt gataagtaac 180
agtaattttc gatttttttg gatctcaatt atgtcctttc actttaattt catgagtttt 240
ccagttcact tcatatttaa ctgtgtaatt tctgtttaca aatgcgttgt gtattctaga 300
tccttctaaa taactattgc catagtgtgt tgttcttcta gtagcatgag taacatccat 360
atttctgcca tacgttattt caaattcact tgtatctcct gagcgcatat gtttaagaaa 420
aaaatgttag ctgcaagttt gtcagtagga ctgattgcac ctttagcatc tccgattcaa 480
gaatctagag caaatactaa tattgaaaat attggtgatg gtgctgaagt aatcaaacgt 540
acggaggatg taagtagtaa gaaatggggc gttactcaaa atgtccaatt cgactttgta 600
aaagataaat gcatgaaaat tgaaaaatta ggcaaatcat cagttgcttc atcaattgca 660
ctgcttttgc tatcgaatac agttgatgca gctcaaaata tcacacctaa aagagagaaa 720
aaagtagatg acaaaatcac tttatacaaa acaacagcaa catctgataa tgataaattg 780
aatatttttc aaattttaac gtttaatttc at 812
<210> 38
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lukF-PV/lukS-PV/lukE/lukD dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的lukF-PV、lukS-PV、lukE和lukD基因
<400> 38
atgaaattaa acgttaaaat ttgaaaaata ttcaatttat cattatcaga tgttgctgtt 60
gttttgtata aagtgatttt gtcatctact tttttctctc ttttaggtgt gatattttga 120
gctgcatcaa ctgtattcga tagcaaaagc agtgcaattg atgaagcaac tgatgatttg 180
cctaattttt caattttcat gcacttatct tttacaaagt cgaattggac attttgagta 240
acgccccatt tcttactact tacatcctcc gtacgtttga ttacttcagc accatcacca 300
atattttcaa tattagtatt tgctctagat tcttgaatcg gagatgctaa aggtgcaatc 360
agtcctactg acaaacttgc agctaacatt tttttcttaa acatgcatgc tcaggagata 420
caagtgaatt tgaaataacg tatggcagaa atatggatgt tactcatgct actagaagaa 480
caacacacta tggcaatagt tatttagaag gatctagaat acacaacgca tttgtaaaca 540
gaaattacac agttaaatat gaagtgaact ggaaaactca tgaaattaaa gtgaaaggac 600
ataattgaga tccaaaaaaa tcgaaaatta ctgttactta tcaaagagaa atggatagat 660
atacaaactt ttggaatcaa cttcactgga taggtaataa ttataaagat gaaaatagag 720
caactcatac atcaatttat gaagttgatt gggaaaatca tacagttaaa ttaatagata 780
ctcaatctaa ggaaaaaaat cctatgagct aa 812
<210> 39
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HlgB/hla/tsst-1/atl dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的HlgB、hla、tsst-1和atl基因
<400> 39
atgaaaatga ataaattagt caaatcatcc gttgctacat ctatggcatt attattactt 60
tctggtactg ctaatgctga aggtaaaata acaccagtca gcgtaaaaaa agtcgatgac 120
aaagttactt tatacaaaac aacagccaca gcagattctg ataaatttaa aatttcacag 180
attttaacat ttaatttcat gatcttaatt tgtcatttct tctttttccc aatcgatttt 240
atatctttct gaagaacgat ctatccattt atctttagta ttggtacctt tccaatttgt 300
tgaagtccag tgcaattggt agtcatcacg aactcgttcg tatattacat ctatatttgt 360
ttgttgtttg gatgcttttc tatccatagt aataactgta gcgagcatat gaataaaaaa 420
ttactaatga atttttttat cgtaagccct ttgttgcttg cgacaatcgc tacagatttt 480
acccctgttc ccttatcatc taatcaaata atcaaaactg caaaagcatc tacaaacgat 540
aatataaagg atttgctaga ctggtatagt agtgggtctg acacttttac aaatagtgaa 600
gttttagaat gcttatttat attgtgggat gtcgaagtat ttgccgactt cgccaatttt 660
atcatagtag cctttgatga ttttagcatt gatgttagcc caatctacat ctgtagcata 720
ttggtgtgtt cctggatgtg caggattcca tctcattttg taaagtgtat tttgaccagc 780
ttttacatat gagttgccga tgaatttagc ac 812
<210> 40
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HlgB/hla/tsst-1/atl dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自金黄色葡萄球菌的HlgB、hla、tsst-1和atl基因
<400> 40
gtgctaaatt catcggcaac tcatatgtaa aagctggtca aaatacactt tacaaaatga 60
gatggaatcc tgcacatcca ggaacacacc aatatgctac agatgtagat tgggctaaca 120
tcaatgctaa aatcatcaaa ggctactatg ataaaattgg cgaagtcggc aaatacttcg 180
acatcccaca atataaataa gcactctaaa acttcactat ttgtaaaagt gtcagaccca 240
ctactatacc agtctagcaa atcctttata ttatcgtttg tagatgcttt tgcagttttg 300
attatttgat tagatgataa gggaacaggg gtaaaatctg tagcgattgt cgcaagcaac 360
aaagggctta cgataaaaaa attcattagt aattttttat tcatgcattc gctacagtta 420
ttactatgga tagaaaagca tccaaacaac aaacaaatat agatgtaata tacgaacgag 480
ttcgtgatga ctaccaattg cactggactt caacaaattg gaaaggtacc aatactaaag 540
ataaatggat agatcgttct tcagaaagat ataaaatcga ttgggaaaaa gaagaaatga 600
caaattaaga tcatgaaatt aaatgttaaa atctgtgaaa ttttaaattt atcagaatct 660
gctgtggctg ttgttttgta taaagtaact ttgtcatcga ctttttttac gctgactggt 720
gttattttac cttcagcatt agcagtacca gaaagtaata ataatgccat agatgtagca 780
acggatgatt tgactaattt attcattttc at 812
<210> 41
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PLP dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的PLP RNA区域
<400> 41
agaagtgcaa ggttacaaga gtgtgaatat cacttttgaa cttgatgaaa ggattgataa 60
agtacttaat gagaagtgct ctgcctatac agttgaactc ggtacagaag taaatgagtt 120
cgcctgtgtt gtggcagatg ctgtcataaa aactttgcaa ccagtatctg aattacttac 180
accactgggc attgatttag atgagtggag tatggctaca tactacttat ttgatgagtc 240
tggtgagttt aaattggct 259
<210> 42
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PLP dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的PLP RNA区域
<400> 42
agccaattta aactcaccag actcatcaaa taagtagtat gtagccatac tccactcatc 60
taaatcaatg cccagtggtg taagtaattc agatactggt tgcaaagttt ttatgacagc 120
atctgccaca acacaggcga actcatttac ttctgtaccg agttcaactg tataggcaga 180
gcacttctca ttaagtactt tatcaatcct ttcatcaagt tcaaaagtga tattcacact 240
cttgtaacct tgcacttct 259
<210> 43
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3CL dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的3CL RNA区域
<400> 43
cccatctggt aaagttgagg gttgtatggt acaagtaact tgtggtacaa ctacacttaa 60
cggtctttgg cttgatgacg tagtttactg tccaagacat gtgatctgca cctctgaaga 120
catgcttaac cctaattatg aagatttact cattcgtaag tctaatcata atttcttggt 180
acaggctggt aatgttcaac tcagggttat tggacattct atgcaaaatt gtgtacttaa 240
gcttaaggtt gatacagcca atcctaagac acctaagtat aagtttgttc gcattcaacc 300
aggacagac 309
<210> 44
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3CL dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的3CL RNA区域
<400> 44
gtctgtcctg gttgaatgcg aacaaactta tacttaggtg tcttaggatt ggctgtatca 60
accttaagct taagtacaca attttgcata gaatgtccaa taaccctgag ttgaacatta 120
ccagcctgta ccaagaaatt atgattagac ttacgaatga gtaaatcttc ataattaggg 180
ttaagcatgt cttcagaggt gcagatcaca tgtcttggac agtaaactac gtcatcaagc 240
caaagaccgt taagtgtagt tgtaccacaa gttacttgta ccatacaacc ctcaacttta 300
ccagatggg 309
<210> 45
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsp10 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的Nsp10 RNA区域
<400> 45
agtgcctgcc aattcaactg tattatcttt ctgtgctttt gctgtagatg ctgctaaagc 60
ttacaaagat tatctagcta gtgggggaca accaatcact aattgtgtta agatgttgtg 120
tacacacact ggtactggtc aggcaataac agttacaccg gaagccaata tggatcaaga 180
atcctttggt ggtgcatcgt gttgtctgta ctgccgttgc cacatagatc atccaaatcc 240
taaaggattt tgtgacttaa aaggtaagta tgtacaaata cctacaactt gtgctaatga 300
ccctgtgg 308
<210> 46
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nsp10 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的Nsp10 RNA区域
<400> 46
ccacagggtc attagcacaa gttgtaggta tttgtacata cttacctttt aagtcacaaa 60
atcctttagg atttggatga tctatgtggc aacggcagta cagacaacac gatgcaccac 120
caaaggattc ttgatccata ttggcttccg gtgtaactgt tattgcctga ccagtaccag 180
tgtgtgtaca caacatctta acacaattag tgattggttg tcccccacta gctagataat 240
ctttgtaagc tttagcagca tctacagcaa aagcacagaa agataataca gttgaattgg 300
caggcact 308
<210> 47
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-1 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 47
taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg 60
cttttgacat ctacaatgat aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgtt 120
gtcgcttcca agaaaaggac gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga 180
gacacacttt ctctaactac caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc 240
cagctgttgc taaacatgac ttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtac 294
<210> 48
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-1 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 48
gtaccatgtc accgtctatt ctaaacttaa agaagtcatg tttagcaaca gctggacaat 60
ccttaagtaa attataaatt gtttcttcat gttggtagtt agagaaagtg tgtctcttaa 120
ctacaaagta agaatcaatt aaattgtcat cttcgtcctt ttcttggaag cgacaacaat 180
tagtttttag gaatttagca aaaccagcta ctttatcatt gtagatgtca aaagccctgt 240
atacgacatc agtactagtg cctgtgccgc acggtgtaag acgggctgca ctta 294
<210> 49
<211> 254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-2 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 49
actggatacc acttcagaga gctaggtgtt gtacataatc aggatgtaaa cttacatagc 60
tctagactta gttttaagga attacttgtg tatgctgctg accctgctat gcacgctgct 120
tctggtaatc tattactaga taaacgcact acgtgctttt cagtagctgc acttactaac 180
aatgttgctt ttcaaactgt caaacccggt aattttaaca aagacttcta tgactttgct 240
gtgtctaagg gttt 254
<210> 50
<211> 254
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-2 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 50
aaacccttag acacagcaaa gtcatagaag tctttgttaa aattaccggg tttgacagtt 60
tgaaaagcaa cattgttagt aagtgcagct actgaaaagc acgtagtgcg tttatctagt 120
aatagattac cagaagcagc gtgcatagca gggtcagcag catacacaag taattcctta 180
aaactaagtc tagagctatg taagtttaca tcctgattat gtacaacacc tagctctctg 240
aagtggtatc cagt 254
<210> 51
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-3 dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 51
tgttggactg agactgacct tactaaagga cctcatgaat tttgctctca acatacaatg 60
ctagttaaac agggtgatga ttatgtgtac cttccttacc cagatccatc aagaatccta 120
ggggccggct gttttgtaga tgatatcgta aaaacagatg gtacacttat gattgaacgg 180
ttcgtgtctt tagctataga tgcttaccca cttactaaac atcctaatca ggagtatgct 240
gatgtctttc at 252
<210> 52
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RDRP-3 dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的RDRP RNA区域
<400> 52
atgaaagaca tcagcatact cctgattagg atgtttagta agtgggtaag catctatagc 60
taaagacacg aaccgttcaa tcataagtgt accatctgtt tttacgatat catctacaaa 120
acagccggcc cctaggattc ttgatggatc tgggtaagga aggtacacat aatcatcacc 180
ctgtttaact agcattgtat gttgagagca aaattcatga ggtcctttag taaggtcagt 240
ctcagtccaa ca 252
<210> 53
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EndoN dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的EndoN (Nsp15) RNA区域
<400> 53
gtgcaccact cactgtcttt tttgatggta gagttgatgg tcaagtagac ttatttagaa 60
atgcccgtaa tggtgttctt attacagaag gtagtgttaa aggtttacaa ccatctgtag 120
gtcccaaaca agctagtctt aatggagtca cattaattgg agaagccgta aaaacacagt 180
tcaattatta taagaaagtt gatggtgttg tccaacaatt acctgaaact tactttactc 240
agagtagaaa tttacaagaa tttaaaccca ggagtcaaat ggaa 284
<210> 54
<211> 284
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EndoN dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的EndoN (Nsp15) RNA区域
<400> 54
ttccatttga ctcctgggtt taaattcttg taaatttcta ctctgagtaa agtaagtttc 60
aggtaattgt tggacaacac catcaacttt cttataataa ttgaactgtg tttttacggc 120
ttctccaatt aatgtgactc cattaagact agcttgtttg ggacctacag atggttgtaa 180
acctttaaca ctaccttctg taataagaac accattacgg gcatttctaa ataagtctac 240
ttgaccatca actctaccat caaaaaagac agtgagtggt gcac 284
<210> 55
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的N RNA区域
<400> 55
tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc 60
caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac 120
gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc 180
taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg 240
ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccg 289
<210> 56
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的N RNA区域
<400> 56
cgggtgccaa tgtgatcttt tggtgtattc aaggctccct cagttgcaac ccatatgatg 60
ccgtctttgt tagcaccata gggaagtcca gcttctggcc cagttcctag gtagtagaaa 120
taccatcttg gactgagatc tttcatttta ccgtcaccac cacgaattcg tctggtagct 180
cttcggtagt agccaatttg gtcatctgga ctgctattgg tgttaattgg aacgccttgt 240
cctcgaggga atttaaggtc ttccttgcca tgttgagtga gagcggtga 289
<210> 57
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的E RNA区域
<400> 57
cggaagagac aggtacgtta atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat 60
tcttgctagt tacactagcc atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata 120
ttgttaacgt gagtcttgta aaaccttctt 150
<210> 58
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的E RNA区域
<400> 58
aagaaggttt tacaagactc acgttaacaa tattgcagca gtacgcacac aatcgaagcg 60
cagtaaggat ggctagtgta actagcaaga ataccacgaa agcaagaaaa agaagtacgc 120
tattaactat taacgtacct gtctcttccg 150
<210> 59
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的M RNA区域
<400> 59
ggcagattcc aacggtacta ttaccgttga agagcttaaa aagctccttg aacaatggaa 60
cctagtaata ggtttcctat tccttacatg gatttgtctt ctacaatttg cctatgccaa 120
caggaatagg tttttgtata taattaagtt aattttcctc tggctgttat ggccagtaac 180
tttagcttgt tttgtgcttg ctgctgttta cagaataaat tggatcaccg gtggaattgc 240
tatcgcaatg gcttgtcttg taggcttgat gtggctcagc tacttcattg cttctttcag 300
actgtttgcg cgtac 315
<210> 60
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> M dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的M RNA区域
<400> 60
gtacgcgcaa acagtctgaa agaagcaatg aagtagctga gccacatcaa gcctacaaga 60
caagccattg cgatagcaat tccaccggtg atccaattta ttctgtaaac agcagcaagc 120
acaaaacaag ctaaagttac tggccataac agccagagga aaattaactt aattatatac 180
aaaaacctat tcctgttggc ataggcaaat tgtagaagac aaatccatgt aaggaatagg 240
aaacctatta ctaggttcca ttgttcaagg agctttttaa gctcttcaac ggtaatagta 300
ccgttggaat ctgcc 315
<210> 61
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的S RNA区域
<400> 61
tggtttaaca ggcacaggtg ttcttactga gtctaacaaa aagtttctgc ctttccaaca 60
atttggcaga gacattgctg acactactga tgctgtccgt gatccacaga cacttgagat 120
tcttgacatt acaccatgtt cttttggtgg tgtcagtgtt ataacaccag gaacaaatac 180
ttctaaccag gttgctgttc tttatcagga tgttaactgc acagaagtcc ctgttgctat 240
tcatgcagat caacttactc ctacttggcg tgtttattct acaggttcta atgtttttca 300
aacacgtgca ggctgtttaa taggggc 327
<210> 62
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的S RNA区域
<400> 62
gcccctatta aacagcctgc acgtgtttga aaaacattag aacctgtaga ataaacacgc 60
caagtaggag taagttgatc tgcatgaata gcaacaggga cttctgtgca gttaacatcc 120
tgataaagaa cagcaacctg gttagaagta tttgttcctg gtgttataac actgacacca 180
ccaaaagaac atggtgtaat gtcaagaatc tcaagtgtct gtggatcacg gacagcatca 240
gtagtgtcag caatgtctct gccaaattgt tggaaaggca gaaacttttt gttagactca 300
gtaagaacac ctgtgcctgt taaacca 327
<210> 63
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3’UTR dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的3’UTR RNA区域
<400> 63
cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc ttttccgttt acgatatata 60
gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc acaagtagat gtagttaact 120
ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta gggaggactt gaaagagcca 180
ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt acagtgaaca atgctaggga 240
gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat tttagtagtg ctatccccat 300
gtga 304
<210> 64
<211> 304
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3’UTR dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的3’UTR RNA区域
<400> 64
tcacatgggg atagcactac taaaattaat tttacacatt agggctcttc catataggca 60
gctctcccta gcattgttca ctgtacactc gatcgtactc cgcgtggcct cggtgaaaat 120
gtggtggctc tttcaagtcc tccctaatgt tacacactga ttaaagattg ctatgtgaga 180
ttaaagttaa ctacatctac ttgtgctatg tagttacgag aattcattct gcacaagagt 240
agactatata tcgtaaacgg aaaagcgaaa acgtttatat agcccatctg ccttgtgtgg 300
tctg 304
<210> 65
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 解旋酶dsRNA的第一臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的解旋酶RNA区域
<400> 65
gctgttgggg cttgtgttct ttgcaattca cagacttcat taagatgtgg tgcttgcata 60
cgtagaccat tcttatgttg taaatgctgt tacgaccatg tcatatcaac atcacataaa 120
ttagtcttgt ctgttaatcc gtatgtttgc aatgctccag gttgtgatgt cacagatgtg 180
actcaacttt acttaggagg tatgagctat tattgtaaat cacataaacc acccattagt 240
tttccattgt gtgctaatgg acaagttttt ggtttatata aaaatacatg tgttggtagc 300
gataatgtta ctgactttaa tgcaattgca acatgtgact ggacaaatgc tgg 353
<210> 66
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 解旋酶dsRNA的第二臂的序列，该dsRNA用于靶向来自SARS-CoV-2的解旋酶RNA区域
<400> 66
ccagcatttg tccagtcaca tgttgcaatt gcattaaagt cagtaacatt atcgctacca 60
acacatgtat ttttatataa accaaaaact tgtccattag cacacaatgg aaaactaatg 120
ggtggtttat gtgatttaca ataatagctc atacctccta agtaaagttg agtcacatct 180
gtgacatcac aacctggagc attgcaaaca tacggattaa cagacaagac taatttatgt 240
gatgttgata tgacatggtc gtaacagcat ttacaacata agaatggtct acgtatgcaa 300
gcaccacatc ttaatgaagt ctgtgaattg caaagaacac aagccccaac agc 353
<210> 67
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnaA/dnaB/gyrB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的dnaA、dnaB和gyrB基因
<400> 67
gtgtccgtgg aactttggca gcagtgcgtg gatcttctcc gcgatgagct gccgtcccaa 60
caattcaaca cctggatccg tcccttgcag gtcgaagccg aggcgacgaa ttgcgtgtgt 120
atgcacccaa ccgtttcgtc ctcgattggg tgaacgagaa atacctcggt cggcttctgg 180
aactgctcgg tgaacgcggg agggtcagtt gatcatgcat ttcaccattc aacgcgaagc 240
cctgttgaaa ccgctgcaac tggtcgccgg cgtcgtggaa cgccgccaga cattgccggt 300
tctctccaac gtcctgctgg tggtcgaagg ccagcaactg tcgctgaccg gcaccgacct 360
cgaagtcgag ctggttggtc gcgtggtact ggaagatgcc gccgaacccg gcgagatcac 420
catgcatgag cgagaacaac acgtacgact cttccagcat caaggtgctg aaggggctgg 480
atgccgtacg caagcgcccc ggcatgtaca tcggcgacac cgacgatggc accggtctgc 540
accacatggt gttcgaggtg gtggataact ccatcgacga agcgctggcc ggttactgca 600
gcgaaatcag catcaccatc catacgg 627
<210> 68
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dnaA/dnaN/gyrB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的dnaA、dnaB和gyrB基因
<400> 68
ccgtatggat ggtgatgctg atttcgctgc agtaaccggc cagcgcttcg tcgatggagt 60
tatccaccac ctcgaacacc atgtggtgca gaccggtgcc atcgtcggtg tcgccgatgt 120
acatgccggg gcgcttgcgt acggcatcca gccccttcag caccttgatg ctggaagagt 180
cgtacgtgtt gttctcgctc atgcatggtg atctcgccgg gttcggcggc atcttccagt 240
accacgcgac caaccagctc gacttcgagg tcggtgccgg tcagcgacag ttgctggcct 300
tcgaccacca gcaggacgtt ggagagaacc ggcaatgtct ggcggcgttc cacgacgccg 360
gcgaccagtt gcagcggttt caacagggct tcgcgttgaa tggtgaaatg catgatcaac 420
tgaccctccc gcgttcaccg agcagttcca gaagccgacc gaggtatttc tcgttcaccc 480
aatcgaggac gaaacggttg ggtgcataca cacgcaattc gtcgcctcgg cttcgacctg 540
caagggacgg atccaggtgt tgaattgttg ggacggcagc tcatcgcgga gaagatccac 600
gcactgctgc caaagttcca cggacac 627
<210> 69
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoC/secE/SodB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的rpoC、secE和SodB基因
<400> 69
tgaaagactt gcttaatctg ttgaaaaacc agggtcaaat cgaagagttc gatgccatcc 60
gtattggcct ggcttcgccc gagatgattc gttcctggtc tttcggcgaa gttaaaaagc 120
cggaaaccat caactaccgt accttcaagc cggagcgcga cggcctgttc tgcgccaaga 180
tcttcggccc ggtgaaggat tacgagtgcc tgtgcggcaa gtacaagcgc ctcaagcacc 240
gcggtgtgat ctgcgagaag tgatcatgaa tgccaaggca gaagccaaag aatcacgttt 300
tgatctcttg aaatggctct tggttgccgt tctggttgtg gttgccgttg tgggcaatca 360
gtacttttcg gctcaaccaa tcctgtatcg cgttctcggt attctcgttc tggcggtgat 420
cgctgctttc ctggctctgc aaacggccaa ggggcaggcc ttctttagtc ttgctaagga 480
agcgcgcgtc gagattcgca aggtcgtatg gccgagtcgt caagaaacaa ctcagaccac 540
gctgatcgat gcatggcttt cgaattgccg ccgctgcctt acgaaaagaa cgcccttgag 600
ccgcacattt ccgcagaaac cctggaatac caccacgaca agcaccacaa cacctacgtg 660
gtgaacctga acaacctgat cccgggcacc gagttcgaag gcaagagcct cgaagagatc 720
gtcaagagct cctccggcgg catcttcaac aacgccgccc aggtgtggaa ccacaccttc 780
tactggaact gcctgagccc 800
<210> 70
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rpoC/secE/SodB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自铜绿假单胞菌的rpoC、secE和SodB基因
<400> 70
gggctcaggc agttccagta gaaggtgtgg ttccacacct gggcggcgtt gttgaagatg 60
ccgccggagg agctcttgac gatctcttcg aggctcttgc cttcgaactc ggtgcccggg 120
atcaggttgt tcaggttcac cacgtaggtg ttgtggtgct tgtcgtggtg gtattccagg 180
gtttctgcgg aaatgtgcgg ctcaagggcg ttcttttcgt aaggcagcgg cggcaattcg 240
aaagccatgc atcgatcagc gtggtctgag ttgtttcttg acgactcggc catacgacct 300
tgcgaatctc gacgcgcgct tccttagcaa gactaaagaa ggcctgcccc ttggccgttt 360
gcagagccag gaaagcagcg atcaccgcca gaacgagaat accgagaacg cgatacagga 420
ttggttgagc cgaaaagtac tgattgccca caacggcaac cacaaccaga acggcaacca 480
agagccattt caagagatca aaacgtgatt ctttggcttc tgccttggca ttcatgatca 540
cttctcgcag atcacaccgc ggtgcttgag gcgcttgtac ttgccgcaca ggcactcgta 600
atccttcacc gggccgaaga tcttggcgca gaacaggccg tcgcgctccg gcttgaaggt 660
acggtagttg atggtttccg gctttttaac ttcgccgaaa gaccaggaac gaatcatctc 720
gggcgaagcc aggccaatac ggatggcatc gaactcttcg atttgaccct ggtttttcaa 780
cagattaagc aagtctttca 800
<210> 71
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FtsA/Can/Tsf dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的FtsA、Can和Tsf基因
<400> 71
atgatcaagg cgacggacag aaaactggta gtaggactgg aaattggtac cgcgaaggtt 60
gccgctttag taggggaagt tctgcccgac ggtatggtca atatcattgg cgtgggcagc 120
tgcccgtcac gtggtatgga taaaggtggg gtgaacgacc tcgaatccgt ggtcaagtgc 180
gtacaacgcg ccattgacca ggcagaattg atggcaggat ctttgtggtt ggcgtgtttc 240
agcttgaggt tggaaatccc gtgacggtaa cgttgctcaa gggtttcgcg gttggtggcg 300
gtaacatcca gatcacgcag caagccgtcg tgaatgccgt aggcccagcc gtgaatggta 360
actttctgcc cgcgtttcca cgctgattgc ataatggtgg agtggcccag gttatacacc 420
tatgctggct gaaattaccg catccctggt aaaagagctg cgtgagcgta ctggcgcagg 480
catgatggat tgcaaaaaag cactgactga agctaacggc gacatcgagc tggcaatcga 540
aaacatgcgt aagtccggtg ctattaaagc agcgaaaaaa gcaggcaacg ttgctgctga 600
cggcgtgatc aaaaccaaaa tcgacggcaa ct 632
<210> 72
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FtsA/Can/Tsf dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的FtsA、Can和Tsf基因
<400> 72
agttgccgtc gattttggtt ttgatcacgc cgtcagcagc aacgttgcct gcttttttcg 60
ctgctttaat agcaccggac ttacgcatgt tttcgattgc cagctcgatg tcgccgttag 120
cttcagtcag tgcttttttg caatccatca tgcctgcgcc agtacgctca cgcagctctt 180
ttaccaggga tgcggtaatt tcagccagca taggtgtata acctgggcca ctccaccatt 240
atgcaatcag cgtggaaacg cgggcagaaa gttaccattc acggctgggc ctacggcatt 300
cacgacggct tgctgcgtga tctggatgtt accgccacca accgcgaaac ccttgagcaa 360
cgttaccgtc acgggatttc caacctcaag ctgaaacacg ccaaccacaa agatcctgcc 420
atcaattctg cctggtcaat ggcgcgttgt acgcacttga ccacggattc gaggtcgttc 480
accccacctt tatccatacc acgtgacggg cagctgccca cgccaatgat attgaccata 540
ccgtcgggca gaacttcccc tactaaagcg gcaaccttcg cggtaccaat ttccagtcct 600
actaccagtt ttctgtccgt cgccttgatc at 632
<210> 73
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AccD/Der/Psd dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的AccD、Der和Psd基因
<400> 73
taccgggggt accactacgc cttcacgcgg cgcttcagga ttcggcgctg gcagattcat 60
caacttcgcc agaatgctcg ccagtttcag gcgcatttcc ggacgacgga cgatcatgtc 120
gatcgcgcct ttctcgatca ggaattcact gcgctggaat ctaggcggca gtttttcgcg 180
aacggtctgt tcgataacac gcggaccggc aaagccgatt aacgcttgat ctttcttgat 240
gtgcttcatc agacgcttac gtttacgcat ctgggttggc gtcagggtgt tacgcttgtt 300
cgcatacggg ttttcccctt ctttgaactg aatacgaatc ggcgatccca ttacgtccag 360
cgatttgcgg aagtagttca tcaagtagcg cttgtaggaa tcaggcaggt ctttcacctg 420
attaccgtga atcaccacaa tcggcgggat gctttttatc gtcaaccaat gggctggcgt 480
cgtgttctgc ttcgatctct tcagcaggaa gtggggcggg ttcagcgtct ggcgtaacaa 540
aggtttcggt agatactgcc agcggctggc caattttcgt gacagacagg ctttccagtt 600
gctcaaccag attcacttta cccggtgcaa acaggttgat aacggtggaa ccgagtttaa 660
agcgacccat ttcctggcct tt 682
<210> 74
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AccD/Der/Psd dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自福氏志贺氏菌的AccD、Der和Psd基因
<400> 74
aaaggccagg aaatgggtcg ctttaaactc ggttccaccg ttatcaacct gtttgcaccg 60
ggtaaagtga atctggttga gcaactggaa agcctgtctg tcacgaaaat tggccagccg 120
ctggcagtat ctaccgaaac ctttgttacg ccagacgctg aacccgcccc acttcctgct 180
gaagagatcg aagcagaaca cgacgccagc ccattggttg acgataaaaa gcatcccgcc 240
gattgtggtg attcacggta atcaggtgaa agacctgcct gattcctaca agcgctactt 300
gatgaactac ttccgcaaat cgctggacgt aatgggatcg ccgattcgta ttcagttcaa 360
agaaggggaa aacccgtatg cgaacaagcg taacaccctg acgccaaccc agatgcgtaa 420
acgtaagcgt ctgatgaagc acatcaagaa agatcaagcg ttaatcggct ttgccggtcc 480
gcgtgttatc gaacagaccg ttcgcgaaaa actgccgcct agattccagc gcagtgaatt 540
cctgatcgag aaaggcgcga tcgacatgat cgtccgtcgt ccggaaatgc gcctgaaact 600
ggcgagcatt ctggcgaagt tgatgaatct gccagcgccg aatcctgaag cgccgcgtga 660
aggcgtagtg gtacccccgg ta 682
<210> 75
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cpsA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的cpsA (Rv3484) 基因
<400> 75
atggcgcgtt ctgagggcaa tcgcccacgc catcgcgctg tgcctcagcc gtcgcggatc 60
cgcaagcggc tgtcgcgggg cgttatgacg ctcgtgtcgg tggttgccct gctgatgacc 120
ggcgcagggt attgggtagc ccacggcgcg ctgggcggca tcaccatttc gcaggcccta 180
acccccgagg atccccgttc cagcggcaac aacatgaaca tcttgctcat cgggctggac 240
tcgcgcaaag accaggaagg caacgacctg ccctggtcgg tcttgaagca gctacacgcg 300
ggcgattccg acgacggcgg ctacaacacg aacacgctga tacttgtgca cgtcggtgcc 360
gatgg 365
<210> 76
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cpsA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的cpsA (Rv3484) 基因
<400> 76
ccatcggcac cgacgtgcac aagtatcagc gtgttcgtgt tgtagccgcc gtcgtcggaa 60
tcgcccgcgt gtagctgctt caagaccgac cagggcaggt cgttgccttc ctggtctttg 120
cgcgagtcca gcccgatgag caagatgttc atgttgttgc cgctggaacg gggatcctcg 180
ggggttaggg cctgcgaaat ggtgatgccg cccagcgcgc cgtgggctac ccaataccct 240
gcgccggtca tcagcagggc aaccaccgac acgagcgtca taacgccccg cgacagccgc 300
ttgcggatcc gcgacggctg aggcacagcg cgatggcgtg ggcgattgcc ctcagaacgc 360
gccat 365
<210> 77
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcaA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的pcaA (Rv0470c) 基因
<400> 77
atgtccgtgc agctcacgcc gcattttgga aacgtgcaag ctcattacga cctctccgac 60
gactttttcc ggctgttctt ggaccccacc cagacctaca gctgtgccta cttcgaacgc 120
gacgacatga cgctgcagga ggcccagatc gccaagatcg acctggccct gggcaagctg 180
aacctcgaac ccgggatgac gttgctggac atcggctgcg gctggggcgc gaccatgcgg 240
cgcgccatcg agaaatacga cgtcaatgtc gtgggcctga cgttgtcgga gaaccaggcc 300
ggtcatgtcc agaaaatgtt cgaccaaatg gacacccccc gctccagacg agtgttgctg 360
gagggatggg agaaatttga cgagcccgtc gaccgcatcg tctcgatcgg cgcgttcgag 420
cacttcggcc accagcgcta ccacca 446
<210> 78
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcaA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的pcaA (Rv0470c) 基因
<400> 78
tggtggtagc gctggtggcc gaagtgctcg aacgcgccga tcgagacgat gcggtcgacg 60
ggctcgtcaa atttctccca tccctccagc aacactcgtc tggagcgggg ggtgtccatt 120
tggtcgaaca ttttctggac atgaccggcc tggttctccg acaacgtcag gcccacgaca 180
ttgacgtcgt atttctcgat ggcgcgccgc atggtcgcgc cccagccgca gccgatgtcc 240
agcaacgtca tcccgggttc gaggttcagc ttgcccaggg ccaggtcgat cttggcgatc 300
tgggcctcct gcagcgtcat gtcgtcgcgt tcgaagtagg cacagctgta ggtctgggtg 360
gggtccaaga acagccggaa aaagtcgtcg gagaggtcgt aatgagcttg cacgtttcca 420
aaatgcggcg tgagctgcac ggacat 446
<210> 79
<211> 407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icl1 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的icl1 (Rv0467) 基因
<400> 79
atgtctgtcg tcggcacccc gaagagcgcg gagcagatcc agcaggaatg ggacacgaac 60
ccgcgctgga aggacgtcac ccgcacctac tccgccgagg acgtcgtcgc cctccagggc 120
agcgtggtcg aggagcacac gctggcccgc cgcggtgcgg aggtgctgtg ggagcagctg 180
cacgacctcg agtgggtcaa cgcgctgggc gcgctgaccg gcaacatggc cgtccagcag 240
gtgcgcgccg gcctgaaggc catctacctg tcgggctggc aggtcgccgg cgatgccaac 300
ctgtccgggc acacctaccc cgaccagagc ctgtatcccg ccaactcggt gccgcaggtg 360
gtccgccgga tcaacaacgc actgcagcgc gccgaccaga tcgccaa 407
<210> 80
<211> 407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icl1 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的icl1 (Rv0467) 基因
<400> 80
ttggcgatct ggtcggcgcg ctgcagtgcg ttgttgatcc ggcggaccac ctgcggcacc 60
gagttggcgg gatacaggct ctggtcgggg taggtgtgcc cggacaggtt ggcatcgccg 120
gcgacctgcc agcccgacag gtagatggcc ttcaggccgg cgcgcacctg ctggacggcc 180
atgttgccgg tcagcgcgcc cagcgcgttg acccactcga ggtcgtgcag ctgctcccac 240
agcacctccg caccgcggcg ggccagcgtg tgctcctcga ccacgctgcc ctggagggcg 300
acgacgtcct cggcggagta ggtgcgggtg acgtccttcc agcgcgggtt cgtgtcccat 360
tcctgctgga tctgctccgc gctcttcggg gtgccgacga cagacat 407
<210> 81
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rip dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的rip (Rv2869) 基因
<400> 81
atgatgtttg ttaccggcat tgtgctgttc gcgctcgcga tcctgatttc ggtggccctg 60
cacgaatgtg gtcacatgtg ggtcgcgcgc cgcaccggga tgaaggtacg tcgctatttc 120
gtcggctttg gccccacgtt gtggtcgacc cggcgcggcg agaccgaata cggtgtcaaa 180
gccgttccgc tgggcggctt ctgtgacatc gccggcatga ccccggtcga ggaactcgac 240
cccgacgaac gtgaccgtgc gatgtacaag caggccacct ggaagcgggt cgcagtgtta 300
ttcgccgggc ccggaatgaa cctcgctatc tgcctggtgc tgatctatgc catcgcgctg 360
gtctgggggc tgcctaacct gcatccgcca ac 392
<210> 82
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rip dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的rip (Rv2869) 基因
<400> 82
gttggcggat gcaggttagg cagcccccag accagcgcga tggcatagat cagcaccagg 60
cagatagcga ggttcattcc gggcccggcg aataacactg cgacccgctt ccaggtggcc 120
tgcttgtaca tcgcacggtc acgttcgtcg gggtcgagtt cctcgaccgg ggtcatgccg 180
gcgatgtcac agaagccgcc cagcggaacg gctttgacac cgtattcggt ctcgccgcgc 240
cgggtcgacc acaacgtggg gccaaagccg acgaaatagc gacgtacctt catcccggtg 300
cggcgcgcga cccacatgtg accacattcg tgcagggcca ccgaaatcag gatcgcgagc 360
gcgaacagca caatgccggt aacaaacatc at 392
<210> 83
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fad26 dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的fad26 (Rv2930) 基因
<400> 83
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccgacc ccaagggatt tgctgacagc 120
ttgacttggt cgcaggtcta cagtcgtgca tgcatcattg ctgaagaact caagttatgc 180
gggttacccg gagatcgagt ggcggtttta gcgccacaag gactggaata tgtccttgca 240
ttcctgggcg cacttcaggc tggatttatc gcggttccgc tgtcaactcc acagtatggc 300
attcacgatg accgcgtttc tgcggtgttg caggattcca agccggtagc cattctcacg 360
acttcgtccg tggtaggc 378
<210> 84
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fad26 dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的fad26 (Rv2930) 基因
<400> 84
gcctaccacg gacgaagtcg tgagaatggc taccggcttg gaatcctgca acaccgcaga 60
aacgcggtca tcgtgaatgc catactgtgg agttgacagc ggaaccgcga taaatccagc 120
ctgaagtgcg cccaggaatg caaggacata ttccagtcct tgtggcgcta aaaccgccac 180
tcgatctccg ggtaacccgc ataacttgag ttcttcagca atgatgcatg cacgactgta 240
gacctgcgac caagtcaagc tgtcagcaaa tcccttgggg tcggatccgt agtcgatgta 300
cgtatatgca gtgctgtcag gctgctggtc ggccctctct tgcagcaaag agggcactga 360
acggtcggtc accggcat 378
<210> 85
<211> 379
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hphA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的hphA (Rv0475) 基因
<400> 85
atggctgaaa actcgaacat tgatgacatc aaggctccgt tgcttgccgc gcttggagcg 60
gccgacctgg ccttggccac tgtcaacgag ttgatcacga acctgcgtga gcgtgcggag 120
gagactcgta cggacacccg cagccgggtc gaggagagcc gtgctcgcct gaccaagctg 180
caggaagatc tgcccgagca gctcaccgag ctgcgtgaga agttcaccgc cgaggagctg 240
cgtaaggccg ccgagggcta cctcgaggcc gcgactagcc ggtacaacga gctggtcgag 300
cgcggtgagg ccgctctaga gcggctgcgc agccagcaga gcttcgagga agtgtcggcg 360
cgcgccgaag gctacgtgg 379
<210> 86
<211> 379
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hphA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自结核分枝杆菌的hphA (Rv0475) 基因
<400> 86
ccacgtagcc ttcggcgcgc gccgacactt cctcgaagct ctgctggctg cgcagccgct 60
ctagagcggc ctcaccgcgc tcgaccagct cgttgtaccg gctagtcgcg gcctcgaggt 120
agccctcggc ggccttacgc agctcctcgg cggtgaactt ctcacgcagc tcggtgagct 180
gctcgggcag atcttcctgc agcttggtca ggcgagcacg gctctcctcg acccggctgc 240
gggtgtccgt acgagtctcc tccgcacgct cacgcaggtt cgtgatcaac tcgttgacag 300
tggccaaggc caggtcggcc gctccaagcg cggcaagcaa cggagccttg atgtcatcaa 360
tgttcgagtt ttcagccat 379
<210> 87
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cpsA/pcaA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自结核分枝杆菌的cpsA (Rv3484) 和pcaA(Rv0470c) 基因
<400> 87
atggcgcgtt ctgagggcaa tcgcccacgc catcgcgctg tgcctcagcc gtcgcggatc 60
cgcaagcggc tgtcgcgggg cgttatgacg ctcgtgtcgg tggttgccct gctgatgacc 120
ggcgcagggt attgggtagc ccacggcgcg ctgggcggca tcaccatttc gcaggcccta 180
acccccgagg atccccgttc cagcggcaac aacatgaaca tcttgctcat cgggctggac 240
tcgcgcaaag accaggaagg caacgacctg ccctggtcgg tcttgaagca gctacacgcg 300
ggcgattccg acgacggcgg ctacaacacg aacacgctga tacttgtgca cgtcggtgcc 360
gatgggatca tgtccgtgca gctcacgccg cattttggaa acgtgcaagc tcattacgac 420
ctctccgacg actttttccg gctgttcttg gaccccaccc agacctacag ctgtgcctac 480
ttcgaacgcg acgacatgac gctgcaggag gcccagatcg ccaagatcga cctggccctg 540
ggcaagctga acctcgaacc cgggatgacg ttgctggaca tcggctgcgg ctggggcgcg 600
accatgcggc gcgccatcga gaaatacgac gtcaatgtcg tgggcctgac gttgtcggag 660
aaccaggccg gtcatgtcca gaaaatgttc gaccaaatgg acaccccccg ctccagacga 720
gtgttgctgg agggatggga gaaatttgac gagcccgtcg accgcatcgt ctcgatcggc 780
gcgttcgagc acttcggcca ccagcgctac cacca 815
<210> 88
<211> 815
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cpsA/pcaA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自结核分枝杆菌的cpsA (Rv3484) 和pcaA(Rv0470c) 基因
<400> 88
tggtggtagc gctggtggcc gaagtgctcg aacgcgccga tcgagacgat gcggtcgacg 60
ggctcgtcaa atttctccca tccctccagc aacactcgtc tggagcgggg ggtgtccatt 120
tggtcgaaca ttttctggac atgaccggcc tggttctccg acaacgtcag gcccacgaca 180
ttgacgtcgt atttctcgat ggcgcgccgc atggtcgcgc cccagccgca gccgatgtcc 240
agcaacgtca tcccgggttc gaggttcagc ttgcccaggg ccaggtcgat cttggcgatc 300
tgggcctcct gcagcgtcat gtcgtcgcgt tcgaagtagg cacagctgta ggtctgggtg 360
gggtccaaga acagccggaa aaagtcgtcg gagaggtcgt aatgagcttg cacgtttcca 420
aaatgcggcg tgagctgcac ggacatgatc ccatcggcac cgacgtgcac aagtatcagc 480
gtgttcgtgt tgtagccgcc gtcgtcggaa tcgcccgcgt gtagctgctt caagaccgac 540
cagggcaggt cgttgccttc ctggtctttg cgcgagtcca gcccgatgag caagatgttc 600
atgttgttgc cgctggaacg gggatcctcg ggggttaggg cctgcgaaat ggtgatgccg 660
cccagcgcgc cgtgggctac ccaataccct gcgccggtca tcagcagggc aaccaccgac 720
acgagcgtca taacgccccg cgacagccgc ttgcggatcc gcgacggctg aggcacagcg 780
cgatggcgtg ggcgattgcc ctcagaacgc gccat 815
<210> 89
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotA dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotA (lpg2686) 基因
<400> 89
atgaataaat tagctattac ggtcctcctt tgcttttttc ctgcgcttgc actggctgaa 60
aatggagcct tgagtttcgc tcctccggca agcgatttgt ccgttgtttt tttaggtaac 120
ctatttggtg tagtcgatgg tgtattgcac ggcactggaa gccagataat gggcaatatg 180
tttggtgttt ttaactccgc tgtccttgcg ctgggcggta tcattataat gtacaccctt 240
atggtttcca ccatgaacac ggcccatgaa gggcaaatgc tcgggcaaaa atggtcttca 300
atctggattc ctcttcgctc caccttcggc ttggctttgt taatacccaa ggcatctggt 360
tatt 364
<210> 90
<211> 364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotA dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotA (lpg2686) 基因
<400> 90
aataaccaga tgccttgggt attaacaaag ccaagccgaa ggtggagcga agaggaatcc 60
agattgaaga ccatttttgc ccgagcattt gcccttcatg ggccgtgttc atggtggaaa 120
ccataagggt gtacattata atgataccgc ccagcgcaag gacagcggag ttaaaaacac 180
caaacatatt gcccattatc tggcttccag tgccgtgcaa tacaccatcg actacaccaa 240
ataggttacc taaaaaaaca acggacaaat cgcttgccgg aggagcgaaa ctcaaggctc 300
cattttcagc cagtgcaagc gcaggaaaaa agcaaaggag gaccgtaata gctaatttat 360
tcat 364
<210> 91
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotD dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotD (lpg2674) 基因
<400> 91
atgaacaaca ataagattgt cataatgttt attttttcag cgcttcttgc tggttgcgct 60
ggaacaatga aatttaaaaa accacccatc aataatccaa gtgatgatgc gaccattaaa 120
ttagcagaag ctgccgtttc agtcagtgac tccatgcttg aaatggcaaa agttgaaaaa 180
gtaattactc caccaagcaa agacaatacc ttaactatac ctaatgctta taacttgcaa 240
gcaagagcca gtgtcgattg gtctggtccg attgaagaat tgactgcacg tatcgccaaa 300
gcagcacatt tcagatttcg tgttttaggc aagtcgcctt cagttccagt tttaatcagc 360
atcagtacc 369
<210> 92
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotD dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotD (lpg2674) 基因
<400> 92
ggtactgatg ctgattaaaa ctggaactga aggcgacttg cctaaaacac gaaatctgaa 60
atgtgctgct ttggcgatac gtgcagtcaa ttcttcaatc ggaccagacc aatcgacact 120
ggctcttgct tgcaagttat aagcattagg tatagttaag gtattgtctt tgcttggtgg 180
agtaattact ttttcaactt ttgccatttc aagcatggag tcactgactg aaacggcagc 240
ttctgctaat ttaatggtcg catcatcact tggattattg atgggtggtt ttttaaattt 300
cattgttcca gcgcaaccag caagaagcgc tgaaaaaata aacattatga caatcttatt 360
gttgttcat 369
<210> 93
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotC dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotC (lpg2675) 基因
<400> 93
atgcgaaaat ttattcttag tttatctatt ttgctatcag ccctcctggt agcctgttct 60
tctcgtaatc attacgggga tactggctca ttggcaggac ttcaagctat ggctgattca 120
aaatacaccc gagctcaaaa aaaacaaaaa atgggtaaaa ttcgcgagat ggcccttaag 180
gaaaccgctt taagtgttgg cgcccaggct gggttagcct ggagagcaaa aataattgac 240
gagcaattaa acaaacaggc aaggaatctt gatgcaattt atgattttaa ttccctggtc 300
ttagagcata atattttgcc tcctgtatta cttgagggaa ggaatacttt gaatcttgca 360
gatgctcaa 369
<210> 94
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotC dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotC (lpg2675) 基因
<400> 94
ttgagcatct gcaagattca aagtattcct tccctcaagt aatacaggag gcaaaatatt 60
atgctctaag accagggaat taaaatcata aattgcatca agattccttg cctgtttgtt 120
taattgctcg tcaattattt ttgctctcca ggctaaccca gcctgggcgc caacacttaa 180
agcggtttcc ttaagggcca tctcgcgaat tttacccatt ttttgttttt tttgagctcg 240
ggtgtatttt gaatcagcca tagcttgaag tcctgccaat gagccagtat ccccgtaatg 300
attacgagaa gaacaggcta ccaggagggc tgatagcaaa atagataaac taagaataaa 360
ttttcgc 367
<210> 95
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotB dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotB (lpg2676) 基因
<400> 95
ctggcaacct attatagcac cagtaagtta atgtctatgg ataatattaa tttaatgccc 60
gatgagccaa ctcgtttcac tccagtattc atggacagaa tgctggagca tgcagaaagc 120
ctgaatgctt cagatataac aatccaaact ggcgaaccca tttttgcaga ggtttatgga 180
agactcctta aaattacaaa tcgacgtctt tccaatacag aattgggcga ccttattaat 240
tccatttatg gcccgaatgc cacgacacaa ttactttccg gtaaagatat agatactcat 300
tatgagtttc gacccaaccg tggtgtacgc tatcgatata gggttaacgc gactgcc 357
<210> 96
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotB dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的dotB (lpg2676) 基因
<400> 96
ggcagtcgcg ttaaccctat atcgatagcg tacaccacgg ttgggtcgaa actcataatg 60
agtatctata tctttaccgg aaagtaattg tgtcgtggca ttcgggccat aaatggaatt 120
aataaggtcg cccaattctg tattggaaag acgtcgattt gtaattttaa ggagtcttcc 180
ataaacctct gcaaaaatgg gttcgccagt ttggattgtt atatctgaag cattcaggct 240
ttctgcatgc tccagcattc tgtccatgaa tactggagtg aaacgagttg gctcatcggg 300
cattaaatta atattatcca tagacattaa cttactggtg ctataatagg ttgccag 357
<210> 97
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icmT dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的icmT (lpg0441) 基因
<400> 97
atggcaggtg gattttcagc aacgagccac tggcgtgact cagcgagaag cgcgcggttt 60
tttgtagttg atgcgagggc cgcattccca atatttttat ttctaatgca tataagagta 120
tggacaggtg ttttggtctt agtttctgca attttttttg ggataattga acattatggt 180
ttcactgtcc cggttttttt acgctggctc agaagttttt tagctggttc agttagatct 240
gctagacctt ggtggagata a 261
<210> 98
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icmT dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的icmT (lpg0441) 基因
<400> 98
ttatctccac caaggtctag cagatctaac tgaaccagct aaaaaacttc tgagccagcg 60
taaaaaaacc gggacagtga aaccataatg ttcaattatc ccaaaaaaaa ttgcagaaac 120
taagaccaaa acacctgtcc atactcttat atgcattaga aataaaaata ttgggaatgc 180
ggccctcgca tcaactacaa aaaaccgcgc gcttctcgct gagtcacgcc agtggctcgt 240
tgctgaaaat ccacctgcca t 261
<210> 99
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icmJ dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的icmJ (lpg0455) 基因
<400> 99
ctgaatgtga accaaactat ggcggataat caacaacgat gtgagctaaa actaattgct 60
tcaccaggtt cctggcgttt atattctgcc agaaaaattg atgagcgatt caaatcctat 120
gagcaaaaaa tctttcagcg agataggtat acttgtcaat tttgcgggtt tcaagcccga 180
ttataccaag acatcgtgaa tctggatggt gattatacaa acaataggtt atcaaattta 240
gttacagctt gttgtttttg tgcgcaatgc ttttttgttg agtcagttgg agttggtggt 300
t 301
<210> 100
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> icmJ dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的icmJ (lpg0455) 基因
<400> 100
aaccaccaac tccaactgac tcaacaaaaa agcattgcgc acaaaaacaa caagctgtaa 60
ctaaatttga taacctattg tttgtataat caccatccag attcacgatg tcttggtata 120
atcgggcttg aaacccgcaa aattgacaag tatacctatc tcgctgaaag attttttgct 180
cataggattt gaatcgctca tcaatttttc tggcagaata taaacgccag gaacctggtg 240
aagcaattag ttttagctca catcgttgtt gattatccgc catagtttgg ttcacattca 300
g 301
<210> 101
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pilD dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的pilD (lpg1524) 基因
<400> 101
gtgtcaatga taaatgcact aataatcaat tatccatggt ttatgtattt agtcgttgga 60
ctcttttctc tagccgttgg aagtttgctt aatgtgataa tctatcgctt accaattatt 120
ttgcaggaag agtggaaaga gcaatgctgt gagctattcc atcttgaaca gcgaaaagaa 180
aaaataaaac ttaatttatt tttaccacgt tctttttgtc ctcattgtaa agcgatggtt 240
aaagcgtggc agaatattcc tctgttaagc tatattttgt taagaggacg ctgttaccaa 300
tgtgatagtc caatttcaat ccgctaccct tttgttgaga cgttgaccac 350
<210> 102
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pilD dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的pilD (lpg1524) 基因
<400> 102
gtggtcaacg tctcaacaaa agggtagcgg attgaaattg gactatcaca ttggtaacag 60
cgtcctctta acaaaatata gcttaacaga ggaatattct gccacgcttt aaccatcgct 120
ttacaatgag gacaaaaaga acgtggtaaa aataaattaa gttttatttt ttcttttcgc 180
tgttcaagat ggaatagctc acagcattgc tctttccact cttcctgcaa aataattggt 240
aagcgataga ttatcacatt aagcaaactt ccaacggcta gagaaaagag tccaacgact 300
aaatacataa accatggata attgattatt agtgcattta tcattgacac 350
<210> 103
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ispF dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的ispF (lpg1363) 基因
<400> 103
atgggcgcct accaatatca agcgctaaaa gtgaatggca gcattagcaa aggtgtaata 60
gaagctgatt ctgaacgcca tgcacgtcaa ttattgcgag aacaaggact aatccctact 120
caagtccaaa cattaaccca gcaacgtgct gccagcagca aaagtaaagt ttctgcggct 180
gatttggcat tactcacgag acagctggca acacttctgg ctgccggtat tcctgttgaa 240
gaatcattgc gcggggtcag cgaacaaaca gaaaaagaca aagtcagaga gcttattatc 300
ggagttcgct ctaaagtatt ggaa 324
<210> 104
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ispF dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于靶向来自嗜肺军团菌的ispF (lpg1363) 基因
<400> 104
ttccaatact ttagagcgaa ctccgataat aagctctctg actttgtctt tttctgtttg 60
ttcgctgacc ccgcgcaatg attcttcaac aggaataccg gcagccagaa gtgttgccag 120
ctgtctcgtg agtaatgcca aatcagccgc agaaacttta cttttgctgc tggcagcacg 180
ttgctgggtt aatgtttgga cttgagtagg gattagtcct tgttctcgca ataattgacg 240
tgcatggcgt tcagaatcag cttctattac acctttgcta atgctgccat tcacttttag 300
cgcttgatat tggtaggcgc ccat 324
<210> 105
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotD/pilD dsRNA的第一臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自嗜肺军团菌的dotD (lpg2674) 和pilD (lpg1524)基因
<400> 105
atgaacaaca ataagattgt cataatgttt attttttcag cgcttcttgc tggttgcgct 60
ggaacaatga aatttaaaaa accacccatc aataatccaa gtgatgatgc gaccattaaa 120
ttagcagaag ctgccgtttc agtcagtgac tccatgcttg aaatggcaaa agttgaaaaa 180
gtaattactc caccaagcaa agacaatacc ttaactatac ctaatgctta taacttgcaa 240
gcaagagcca gtgtcgattg gtctggtccg attgaagaat tgactgcacg tatcgccaaa 300
gcagcacatt tcagatttcg tgttttaggc aagtcgcctt cagttccagt tttaatcagc 360
atcagtaccg atcgtgtcaa tgataaatgc actaataatc aattatccat ggtttatgta 420
tttagtcgtt ggactctttt ctctagccgt tggaagtttg cttaatgtga taatctatcg 480
cttaccaatt attttgcagg aagagtggaa agagcaatgc tgtgagctat tccatcttga 540
acagcgaaaa gaaaaaataa aacttaattt atttttacca cgttcttttt gtcctcattg 600
taaagcgatg gttaaagcgt ggcagaatat tcctctgtta agctatattt tgttaagagg 660
acgctgttac caatgtgata gtccaatttc aatccgctac ccttttgttg agacgttgac 720
cac 723
<210> 106
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dotD/pilD dsRNA的第二臂的序列，
该dsRNA用于同时靶向来自嗜肺军团菌的dotD (lpg2674) 和pilD (lpg1524)基因
<400> 106
gtggtcaacg tctcaacaaa agggtagcgg attgaaattg gactatcaca ttggtaacag 60
cgtcctctta acaaaatata gcttaacaga ggaatattct gccacgcttt aaccatcgct 120
ttacaatgag gacaaaaaga acgtggtaaa aataaattaa gttttatttt ttcttttcgc 180
tgttcaagat ggaatagctc acagcattgc tctttccact cttcctgcaa aataattggt 240
aagcgataga ttatcacatt aagcaaactt ccaacggcta gagaaaagag tccaacgact 300
aaatacataa accatggata attgattatt agtgcattta tcattgacac gatcggtact 360
gatgctgatt aaaactggaa ctgaaggcga cttgcctaaa acacgaaatc tgaaatgtgc 420
tgctttggcg atacgtgcag tcaattcttc aatcggacca gaccaatcga cactggctct 480
tgcttgcaag ttataagcat taggtatagt taaggtattg tctttgcttg gtggagtaat 540
tactttttca acttttgcca tttcaagcat ggagtcactg actgaaacgg cagcttctgc 600
taatttaatg gtcgcatcat cacttggatt attgatgggt ggttttttaa atttcattgt 660
tccagcgcaa ccagcaagaa gcgctgaaaa aataaacatt atgacaatct tattgttgtt 720
cat 723
<210> 107
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自矮牵牛（Petunia）查耳酮合酶基因CHSA的特定内含子序列的序列
<400> 107
ggcgcgccca atcgatgatt taaatgtgta agaatttctt atgttacatt attacattca 60
acgttttatc ttaattggct cttcatttga ttgaaatttg acaattattt cttgtttttt 120
tttttgtcac actctttttg ggttggggtg gccgacgaat tgtgggaagg tagaaagagg 180
ggaggacttt tgttatactc cattagtaat tactgtttcc gtttcaattt atgtgacaat 240
atttcctttt tagtcggttc caaaagaaaa tgtcagcatt ataaacaatt taattttgaa 300
attacaattt tgccattaat aaaatgattt acaaccacaa aagtatctat gagcctgttt 360
gggtgggctt ataagcagct tattttaagt ggcttataag tcaaaaagtg acattttttg 420
agaagttaga aaatcctaac ttctcaaaaa gtagctttta agccacttat gacttataag 480
tccaaaaatt tttaagttac caaacatata ttaatgggtt tataagctta taagccactt 540
ttaagctcac ccaaacgggt tctatgtctc actttagact acaaatttta aaagtcttca 600
tttatttctt aatctccgtg gcgagtaaaa ctataacaca taaagtgaaa cggagggaat 660
aagatggagt cataaactaa tccaaatcta tactctctcc gttaatttgt tttttagttt 720
gatttggtac attaataaaa cagatttttc gaaggttata aacacagaca gatgtttccc 780
agcgagctag caaaattcca agatttctgt cgaaaattcg tgtgtttcta gctagtactt 840
gatgttatct ttaacctttt agtaattttt tgtccttttc tttctatttt tcatcttaca 900
atgaattatg agcaagttcc ttaagtagca tcacacgtga gatgtttttt atgatattga 960
ctaaatccaa tctttaccat tccttaacta gtaaaataca acacatgtta attgatacat 1020
tgcttaacac tgaggttaga aaattttaga aattagttgt ccaaatgctt tgaaattaga 1080
aatctttaat cccttatttt tttttaaaat gttttttctc actccaaaga aagagaaact 1140
gacatgaaag ctcaaaagat catgaatctt actaactttg tggaactaaa tgtacatcag 1200
aatgtttctg acatgtgaaa atgaaagctc ttaattttct tcttttattt attgagggtt 1260
tttgcatgct atgcattcaa tttgagtact ttaaagcacc tataaacact tacttacact 1320
tgccttggag tttatgtttt agtgttttct tcacatcttt tttggtcaat ttgcaggtat 1380
ttggatccta ggtgagtcta gaggcgcgcc 1410

Claims (17)

1.一种用于生产功能性干扰小RNA的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)用包含至少一个目标基因的至少一个片段的siRNA或miRNA前体转化小球藻细胞，以及
b)在合适的条件下培养所述小球藻细胞，以便它们表达所述前体并释放靶向所述至少一个基因片段的细胞外囊泡(EV)包埋的功能性小iRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述siRNA或miRNA前体是长单链或双链RNA分子，优选长双链RNA分子。
3.根据权利要求1-2所述的方法，其中所述基因片段在50和3000bp之间。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其进一步包括从所述小球藻细胞中回收所述小iRNA的步骤。
5.根据权利要求1-3所述的方法，其进一步包括回收细胞外培养基中由所述小球藻细胞释放的细胞外囊泡(EV)的步骤。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述目标基因是卵菌基因、病毒基因、细菌基因或真菌基因。
7.小球藻衍生的EV，其通过权利要求5所述的方法获得，所述EV含有靶向所述至少一个目标基因中的一个或数个区域的功能性小iRNA群体。
8.根据权利要求7所述的小球藻衍生的EV，其中所述功能性小iRNA群体靶向来自至少一种病毒的一个或多个RNA病毒区域，所述病毒RNA区域优选对SARS-CoV-2病毒的复制或致病性至关重要。
9.根据权利要求7所述的小球藻衍生的EV，其中所述功能性小iRNA群体靶向至少一个细菌基因中的一个或数个区域，所述细菌基因优选为致病菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的毒力因子或活力基因或抗生素耐药性基因。
10.如权利要求7-9所定义的小球藻衍生的EV，其用于治疗有需要的受试者的寄生物感染和/或感染性疾病，所述寄生物感染和/或感染性疾病优选影响所述受试者的呼吸道或消化道。
11.药物组合物，其含有有效量的如权利要求7-10所定义的小球藻衍生的EV以及药学上可接受的载体。
12.重组小球藻细胞，其含有并表达包含至少一个目标基因的至少一个片段的siRNA或miRNA前体，所述小球藻细胞释放靶向所述至少一个基因片段的EV包埋的功能性小iRNA。
13.根据权利要求1-6所述的方法或根据权利要求12所述的重组小球藻细胞，其中所述siRNA前体具有选自SEQ ID NO：1-106的序列。
14.SEQ ID NO：1-106的siRNA前体中的任一种在小球藻细胞中生产功能性小iRNA群体的用途。
15.一种多功能平台，其用于高通量生产EV包埋的功能性干扰小RNA，所述平台使用如权利要求12所定义的重组小球藻细胞。
16.一种药物或兽用组合物，其含有有效量的如权利要求12所定义的重组小球藻细胞。
17.一种膳食补充剂，其含有有效量的如权利要求12所定义的重组小球藻细胞，所述补充剂优选配制用于口服施用。
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