CN115478116A - 用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒 - Google Patents

用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，以及试剂盒中所使用的特异性引物和探针。与现有技术相对比，本发明具有以下优点：与现有技术相对比，本发明具有以下优点：本发明所提供的特异性引物、探针和试剂盒，其针对的miR‑nsp3‑3p以及内参基因Let‑7d的引物探针序列特异性好，无非特异性扩增，检测的灵敏性和特异性高；该标志物由新冠病毒编码，本身就是病毒的核酸物质，因此具有疾病特异性，可用于重型、危重型患者的诊断和早期预警。

Description

用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗检测器械技术领域，具体涉及用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒。
技术背景
新冠肺炎的特点之一是患者在感染病毒后表现出不同的症状，一部分患者症状轻微甚至无症状，而另一部分患者则会迅速出现急性呼吸窘迫综合征等重型/危重型症状，最终造成严重的脏器损伤甚至死亡。尽早对重症患者采取特殊监护和施加有效治疗手段（如肺保护性通气等），对于降低新冠肺炎的死亡率有重要意义。然而目前对于重症患者诊断的指标较为复杂繁琐，需要多项指标联合判断，这大大增加了医生负担，造成了较高的漏诊和误诊现象。另外，重症的发生仍缺乏可靠的预警标志物，难以在初始阶段对轻、重症患者进行区分，往往只能待患者出现重症症状后再进行治疗，从而错失了最佳的治疗时机。因此，筛选新冠感染者中的重症患者，提前进行干预和救治，对于减少新冠肺炎死亡率，合理分配医疗资源，有效控制疫情传播有重要意义。目前临床上现有普遍应用的重型/危重型诊断方法，需要全套评估气促频率、指氧饱和度、动脉血氧分压/吸氧浓度、肺部影像学、呼吸衰竭、休克、器官衰竭等多个指标，操作较为繁琐，给医生临床诊断带来很大困难，容易造成重症患者漏诊和错诊。另一方面，目前临床上的重型/危重型早期预警指标包括低氧血症、组织氧合指标、外周血淋巴细胞技术、炎症因子、D-二聚体、胸部影像学等，均存在特异性和敏感性低的问题；难以在初始阶段对轻、重症患者进行区分，往往只能待患者出现重症症状后再进行治疗，从而错失了最佳的治疗时机。因此，为了更好的诊断和早期预警新冠感染重型/危重型患者，就迫切需要更好的生物标记物。
MicroRNA（miRNA）为一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸（RNA）分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，通过抑制靶基因mRNA的翻译过程对基因表达进行调节，从而参与包括个体发育、组织分化、能量代谢等大部分生理活动，也与许多疾病的发生密切相关。越来越多的研究发现病毒可以编码和表达miRNA，目前已有超过100种病毒来源的miRNA被鉴定出来。2021年，南京大学研发团队曾联合其余三家单位在国际知名杂志CellDiscovery发表论文，报道了一项关于新冠重症检测的多中心联合研究。该研究中，研究人员首先在江苏地区收集的新冠患者血清中鉴定出了一种由新冠病毒编码的microRNA-miR-nsp3-3p，miR-nsp3-3p是新冠病毒来源的核酸，它只存在于重症患者血清中，在轻症患者和健康人血清中均检测不到，提示了该标志物与新冠重症发生有关。进而，该团队在某某医院采集的血清样本中分别进行了独立验证，结果表明，血清miR-nsp3-3p在各个地区的样本中均能够准确区分轻、重症新冠患者，并且准确率显著高于D-二聚体、C反应蛋白、低密度脂蛋白和淋巴细胞数等传统检验指标。更重要的是，通过对轻、重症患者不同病程阶段、不同时间点采集的血样进行检测分析发现，在重症患者出现重症症状之前约7.4天，就能够在患者血清中检测到miR-nsp3-3p，并且随着患者康复该标志物转为阴性，轻症患者检测结果则一直为阴性。数据表明，该标志物对重症的预测准确率高达97.1%，是一种精准预测患者发展为重症的预警标志物，并且具有病程监测价值。在临床治疗中，对该标志物进行监测，将有望帮助医生提前判断新冠患者病情走向，对于将要进入重症期的患者进行密切监控和提前治疗，从而降低患者死亡率。
但之前的研究也发现，血清中除了miR-nsp3-3p之外，还含有一些其它与轻重症新冠患者检测相关的miRNA存在，但无论是最主要的miR-nsp3-3p，还是其它相关的多种miRNA，其总体来说，miRNA含量通常比较低，这也就导致针对miR-nsp3-3p和其它相关miRNA的检测操作复杂、检测难度大幅增加，且检测灵敏度也相应降低。申请人经过研究发现，现有的引物、探针难以实现miR-nsp3-3p等miRNA的准确检测，也严重制约了此种技术的发展及推广；同时新冠病毒由于其高传染性、高变异性以及高危害性，急需要一种能够快速、高灵敏度检测其相关miRNA的检测产品，从而实现轻、重症患者的有效区分，进一步实现医疗资源的合理调配。
发明内容
针对上述存在的拘束局限性，本发明提出了一种用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，以及试剂盒中所使用的特异性引物和探针；克服了背景技术中提到的不足和缺陷。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测miRNA标志物的引物组，所述miRNA标志物为miR-nsp3-3p，所述检测miR-nsp3-3p标志物的引物组中包括第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物，第一逆转录引物序列如SEQ ID NO.1所示，第一PCR上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，第一PCR下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
当miRNA标志物为miR-nsp3-3p时，检测用的引物核苷酸序列为：
第一逆转录引物，即SEQ ID NO.1为：
5' GGCGTTGAGCAGACCTCGAGACTGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCAACGCCCTGCCA 3'；
第一PCR上游引物序列，即SEQ ID NO.2为：
5' CGGAGTTCGCCTGTGTTGTG 3'；
第一PCR下游引物序列，即SEQ ID NO.3为：
5' GACCTCGAGACTGTGCAGGG 3'。
进一步的，上述的一种检测miRNA标志物的引物组，所述引物组中还包括用于检测内参基因miRNA标志物Let-7d的第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物，第二逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，第二PCR上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二PCR下游引物序列如SEQ ID NO.7所示。
当内参基因miRNA标志物为Let-7d时，检测用的引物核苷酸序列为：
第二逆转录引物序列，即SEQ ID NO.5为：
5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAGTTGCAGGCTCGCAGGACTGGTTAGCACAACTAT 3'
第二PCR上游引物序列，即SEQ ID NO.6为：
5' ACCGACGAGGTAGTAGGTTGC 3'；
第二PCR下游引物序列，即SEQ ID NO.7为：
5' TAACCAAGTCCTGCGAGTTGC 3'。
上述逆转录引物和PCR的上下游引物可用于检测miR-nsp3-3p和内参基因Let-7d两种miRNA标志物。
内参即是内部参照，其在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常以其做为参照物使用。内参的主要作用是，校正上样量和上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。
本发明所给出的内参基因Let-7d并非是随意选择的，通常的内参基因选择为U6、U1snRNA、5S rRNA、7SL RNA以及一些其它的管家miRNA等，但通过实验发现，Let-7d做为内参基因时，其所能够实现的准确率最高，灵敏度最好，故此，本发明以Let-7d做为成品。
进一步的，上述的检测多种miRNA标志物的引物组，所述引物组中还包括有分别用于检测miR-nsp3-3p和Let-7d内参基因的第一探针和第二探针，第一探针序列如SEQ IDNO.4所示，第二探针序列如SEQ ID NO.8所示。
检测miRNA标志物还可在引物的基础上配合使用探针，具体为：
以第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物配合使用检测miR-nsp3-3p基因的Taqman探针，第一探针序列，即SEQ ID NO.4为：
FAM 5' CAGGGCGTTGGCAGACC 3' MGB；
以第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物配合使用检测Let-7d内参基因的Taqman探针，第二探针序列，即SEQ ID NO.8为：
FAM 5' TTGTGCTAACCAGTCCTGCGA 3' MGB。
本发明的第二个发明点在于，提供了检测miRNA标志物的引物组在制备用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中的应用，所述检测miRNA标志物的引物组为前述的引物组。
miRNA标志物miR-nsp3-3p，能够用于判定新型冠状病毒早期病例是否会发展成为新型冠状病毒中重型、危重型病例，而Let-7d做为内参基因，能够做为表达水平的参照物，故此，可将上述用于检测miRNA标志物的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物、第一探针、第二逆转录引物、第二PCR上游引物、第二PCR下游引物和第二探针共同制备成为检测试剂盒，实现早期病例的快速检测。
本发明的第三个发明点在于，提供了用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述试剂盒为染料法试剂盒，所述染料法试剂盒包括有前述的引物组。
染料法试剂盒的组成如下表1所示。
表1
Figure RE-487800DEST_PATH_IMAGE001
其中，阳性质控品和阴性质控品的区别在于，二者所添加的假病毒和人工合成品浓度不同，阳性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为103 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阴性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为101 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阳性质控品要求检测结果为阳性，阴性质控品要求检测结果为阴性。
针对本发明所提供的染料法试剂盒：
技术原理及过程为：采用反转录-荧光PCR染料技术，定性检测人血清中miR-nsp3-3p。针对miR-nsp3-3p的序列，本技术设计了特异性的引物，只有当待测样本中的模板与特异性引物完全互补配对时，PCR 扩增反应才可以正常进行，并产生荧光信号；反之，则无PCR扩增反应，检测不到荧光信号或检测到极低的荧光信号。反应结束后，通过分析“扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct 值）”，判断 miR-nsp3-3p表达阴阳性。
区分新型冠状病毒阳性感染者中重型、危重型病例筛查和早期预警的试剂盒，所述试剂盒包括miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的引物组合物、PCR反应混合液、阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
所述miR-nsp3-3p的引物组合物包括第一反转录引物、第一上游引物、第一下游引物具体如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示；
所述Let-7d内参基因的引物组合物包括第二反转录引物、第二上游引物、第二下游引物具体如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.7所示；
针对miR-nsp3-3p序列设计了特异性引物，并以此建立了一种包括Let-7d内参基因引物组合的具有更好的诊断和早期预警新冠感染重型/危重型患者能力的荧光PCR检测方法。
上述该方法每次检测样本时必须设立阳性对照(阳性质控品)和阴性对照(阴性质控品)(无模板对照)，对于检测结果的判读具有重要意义：检测试剂盒内阳性质控品、阴性质控品、空白对照，经提取后的RNA应满足：
阳性质控品：miR-nsp3-3p的Ct值＜36、Let-7d（内对照）的Ct值＜30；
阴性质控品：miR-nsp3-3p的Ct值＞36、Let-7d（内对照）的Ct值＜30；
空白对照：miR-nsp3-3p的Ct值＞36、Let-7d（内对照）的Ct值≥30。
miR-nsp3-3p、Let-7d（内对照）的引物浓度为1.0-4.0μmol/L。
miR-nsp3-3p、Let-7d（内对照）的引物浓度优选为3.0μmol/L。
染料法试剂盒反应程序为25℃5min；50℃15min；95℃10min；94℃15s，55℃40s，40个循环；95℃15s；60℃1min；95℃15s。
该试剂盒的工作流程，包括以提取的总RNA为模板，利用本发明提供的含有miR-nsp3-3p基因引物、Let-7d基因（内对照）引物的试剂盒进行实时荧光定量PCR，同时设立阳性对照和阴性对照。本方法可监控样本采集、样本提取和PCR反应过程，既保证了检测结果的特异性，同时保证了准确性。在内参基因有效扩增的情况下，根据扩增曲线和Ct值判断检测结果。
本发明的第四个发明点在于，提供了用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述试剂盒为探针法试剂盒，所述探针法试剂盒包括有前述的引物组和探针。
探针法试剂盒的组成如下表2所示。
表2
Figure RE-798696DEST_PATH_IMAGE002
其中，阳性质控品和阴性质控品的区别在于，二者所添加的假病毒和人工合成品浓度不同，阳性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为103 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阴性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为101 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阳性质控品要求检测结果为阳性，阴性质控品要求检测结果为阴性。
针对本发明所提供的探针法试剂盒：
技术原理及过程为：采用反转录-荧光PCR探针技术，定性检测人血清中miR-nsp3-3p。针对miRnsp3-3p的序列，本技术设计了特异性的引物和探针，只有当待测样本中的模板与特异性引物完全互补配对时，PCR 扩增反应才可以正常进行；特异性探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步并产生荧光信号。反应结束后，通过分析“扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct 值）”，判断 miR-nsp3-3p表达阴阳性。
荧光基团FAM是目前较常规使用的发光基团，也可以选择发光基团VIC或CY5；而淬灭基团MGB可以使探针序列的Tm提高10℃，因此可以缩短探针序列的长度，使得探针存在错配、发夹、二聚体的可能性更低。
区分新型冠状病毒阳性感染者中重型、危重型病例筛查和早期预警的试剂盒，包括miR-nsp3-3p、Let-7d基因（内对照）的引物和探针组合物、ROX荧光参比染料、PCR反应混合液、阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
所述miR-nsp3-3p的引物和探针组合物包括第一反转录引物、第一上游引物、第一下游引物和第一探针，具体如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示；
所述Let-7d（内对照）的引物和探针组合物包括第二反转录引物、第二上游引物、第二下游引物和第二探针，具体如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；
针对miR-nsp3-3p、Let-7d（内对照）序列设计了特异性引物以及与引物对配合使用的Taqman荧光探针，并以此建立了一种包括Let-7d内参基因引物探针组合的具有更好的诊断和早期预警新冠感染重型/危重型患者能力的荧光PCR检测方法。
上述该方法每次检测样本时必须设立阳性对照(阳性质控品)和阴性对照(阴性质控品)(无模板对照)，对于检测结果的判读具有重要意义：检测试剂盒内阳性质控品、阴性质控品、空白对照，经提取后的RNA应满足：
阳性质控品：miR-nsp3-3p的Ct值＜36、Let-7d（内对照）的Ct值＜30；
阴性质控品：miR-nsp3-3p的Ct值＞36、Let-7d（内对照）的Ct值＜30；
空白对照：miR-nsp3-3p的Ct值＞36、Let-7d（内对照）的Ct值≥30。
上述第一、二探针核苷酸序列5'端标记的荧光基团为FAM，3'端标记的淬灭基团为MGB。
上述miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的引物浓度为1.0-4.0μmol/L，探针浓度为5-15μmol/L。
上述miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的引物浓度优选为3.0μmol/L，探针浓度为13μmol/L。
miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因采用PCR仪上的FAM通道进行检测。
试剂盒工作流程包括3步扩增法，反应程序为50℃15min；95℃10min；94℃15s，55℃40s，40个循环，在55℃时检测并采集荧光信号。
该试剂盒的使用方法，包括以提取的总RNA为模板，利用本发明提供的含有miR-nsp3-3p基因引物探针和Let-7d内参基因引物探针的试剂盒进行实时荧光定量PCR，采用PCR仪上的FAM通道进行扩增，同时设立阳性对照和阴性对照。本方法可监控样本采集、样本提取和PCR反应过程，既保证了检测结果的特异性，同时保证了准确性。在内参基因有效扩增的情况下，根据扩增曲线和Ct值判断检测结果。
进一步的，上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述试剂盒中，还包括有PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
进一步的，上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述PCR反应液中，包含有DEPC水、qPCR缓冲液、MgCl2、核苷酸混合液、逆转录酶、DNA聚合酶和染料试剂。
进一步的，上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述染料试剂为ROX参比染料或SYBR Green荧光染料。
ROX 参比染料设计用于在实时定量 PCR 或 RT-PCR 中对荧光报告基因信号进行标准化；
SYBR Green是一种高敏感性的荧光染液，染液与核酸结合后，SYBR Green的荧光信号会明显增强。
本发明的第四个发明点在于，提供了上述用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
取外周血血清样本；
提取样本的总RNA，以总RNA为扩增模板；
分别配制血清样本、阳性质控品、阴性质控品和空白对照的PCR反应体系；
以各PCR反应体系进行PCR反应；
依据PCR反应结果的扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴阳性。
与现有技术相对比，本发明具有以下优点：
1. 本发明所提供的特异性引物、探针和试剂盒，其针对的miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的引物探针序列特异性好，无非特异性扩增，检测的灵敏性和特异性高；该标志物由新冠病毒编码，本身就是病毒的核酸物质，因此具有疾病特异性，可用于重型、危重型患者的诊断和早期预警；
2. 本发明所提供的检测用标志物应用简便，利于推广，此前有报道表明，通过对患者转录组、蛋白质组、代谢组等数据进行分析也可以预测患者病情进展，但这些方法都较为复杂；该研究发现的miR-nsp3-3p标志物在保证准确性的同时，只需要采集少量血清样本，在任何具备病毒核酸检验条件的医疗设施中均可完成检测，因而具有迅速推广应用的条件，可作为一种简单、快速、精准的手段迅速部署至抗疫一线；
3. 对突变株病毒具有普适性，鉴于新冠病毒具有变异迅速的特点，很容易产生新的突变株，现有研究进一步分析了miR-nsp3-3p的保守性，发现其在不同新冠毒株间高度保守，表明即使在新冠病毒突变株感染的患者中，miR-nsp3-3p仍然能够被病毒编码，因而同样能够用于重症预测。这一特点对于目前以突变株为主的疫情传播情况而言意义重大，也进一步提高了该标志物在各个不同国家和地区推广应用的潜力。
4.提供客观指标指导科学防疫。这一新型标志物的发现有望为各国的疫情防控工作提供科学指导。
附图说明
图1为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的探针法试剂盒的扩增曲线图谱。
图2为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的染料法试剂盒，以miR-nsp3-3p为靶标时的熔解曲线图谱。
图3为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的染料法试剂盒，以Let-7d内参基因为靶标时的熔解曲线图谱。
图4为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中，引物浓度为1μmol/L+探针浓度为5μmol/L时的检测结果图。
图5为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中，引物浓度为3μmol/L+探针浓度为13μmol/L时的检测结果图。
图6为本发明一实施例所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中，引物浓度为4μmol/L+探针浓度为15μmol/L时的检测结果图。
图7为上述三种不同引物浓度和探针浓度的检测结果汇总图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。
为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种检测miRNA标志物的引物组，所述miRNA标志物为miR-nsp3-3p，所述检测miR-nsp3-3p标志物的引物组中包括第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物，第一逆转录引物序列如SEQ ID NO.1所示，第一PCR上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，第一PCR下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
当miRNA标志物为miR-nsp3-3p时，检测用的引物核苷酸序列为：
第一逆转录引物，即SEQ ID NO.1为：
5' GGCGTTGAGCAGACCTCGAGACTGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCAACGCCCTGCCA 3'；
第一PCR上游引物序列，即SEQ ID NO.2为：
5' CGGAGTTCGCCTGTGTTGTG 3'；
第一PCR下游引物序列，即SEQ ID NO.3为：
5' GACCTCGAGACTGTGCAGGG 3'。
上述的一种检测miRNA标志物的引物组，所述引物组中还包括用于检测内参基因miRNA标志物Let-7d的第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物，第二逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，第二PCR上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二PCR下游引物序列如SEQ ID NO.7所示。
当内参基因miRNA标志物为Let-7d时，检测用的引物核苷酸序列为：
第二逆转录引物序列，即SEQ ID NO.5为：
5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAGTTGCAGGCTCGCAGGACTGGTTAGCACAACTAT 3'
第二PCR上游引物序列，即SEQ ID NO.6为：
5' ACCGACGAGGTAGTAGGTTGCAT 3'；
第二PCR下游引物序列，即SEQ ID NO.7为：
5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAGTTGC 3'。
针对miR-nsp3-3p和Let-7d内参基因的使用，目前尚未发现其它的标志物可以早期甄别新冠中重型和危重型病患，而内参基因let-7d在生物个体内表达量基本一致，且并非低表达，与目标基因表达水平相似，且与miR-nsp3-3p同步进行逆转录和扩增反应，能够有效避免由于样本问题造成的假阴性。
上述的检测多种miRNA标志物的引物组，所述引物组中还包括有分别用于检测miR-nsp3-3p和Let-7d内参基因的第一探针和第二探针，第一探针序列如SEQ ID NO.4所示，第二探针序列如SEQ ID NO.8所示。
检测miRNA标志物还可在引物的基础上配合使用探针，具体为：
以第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物配合使用检测miR-nsp3-3p基因的Taqman探针，第一探针序列，即SEQ ID NO.4为：
FAM 5' CAGGGCGTTGGCAGACC 3' MGB；
以第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物配合使用检测Let-7d内参基因的Taqman探针，第二探针序列，即SEQ ID NO.8为：
FAM 5' TTGTGCTAACCAGTCCTGCGA 3' MGB。
本发明的第二个发明点在于，提供了检测miRNA标志物的引物组在制备用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中的应用，所述检测miRNA标志物的引物组为前述的引物组。
miRNA标志物miR-nsp3-3p，能够用于判定新型冠状病毒早期病例是否会发展成为新型冠状病毒中重型、危重型病例，而Let-7d做为内参基因，能够做为表达水平的参照物，故此，可将上述用于检测miRNA标志物的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物、第一探针、第二逆转录引物、第二PCR上游引物、第二PCR下游引物和第二探针共同制备成为检测试剂盒，实现早期病例的快速检测。
本发明还提供了用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述试剂盒为染料法试剂盒，所述染料法试剂盒包括有前述的引物组。
染料法试剂盒的组成如前述表1所示。
本发明还提供了用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述试剂盒为探针法试剂盒，所述探针法试剂盒包括有前述的引物组和探针。
探针法试剂盒的组成如前述表2所示。
上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中，还包括有PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述PCR反应液中，包含有DEPC水、qPCR缓冲液、MgCl2、核苷酸混合液、逆转录酶、DNA聚合酶和染料试剂。
进一步的，上述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，所述染料试剂为ROX参比染料或SYBR Green荧光染料。
ROX和SYGR Green的各自作用不同，具体为：
探针法试剂盒的ROX参比染料是一种惰性参比染料，主要作用是校正荧光信号，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到，ROX参比染料本身并不参与qPCR反应，荧光信号不会随着qPCR扩增而改变，实验过程中很多因素会引起孔间差异：如不均匀的照明、孔与孔之间光学因素、反应体系的浓度不同等等，因此用ROX参比染料作为阳性参比，对其荧光信号进行归一化校正，以提高数据的精确度，如使用ABI机型，推荐使用含ROX反应体系，如使用罗氏或其它品牌的机器，也可以不使用ROX染料；
染料法试剂盒的SYBR Green染料，则是获取实验数据所必须的试剂盒组分，在游离状态下，SYBR Green染料只能发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，其它染料如EvaGreen染料也可以使用。
本发明还提供了上述用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
取外周血血清样本；
提取样本的总RNA，以总RNA为扩增模板；
分别配制血清样本、阳性质控品、阴性质控品和空白对照的PCR反应体系；
以各PCR反应体系进行PCR反应；
依据PCR反应结果的扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴阳性。
实施例2
1、探针法试剂盒的制备
探针法试剂盒包含组分如前述表2所示。
探针法试剂盒的检测miR-nsp3-3p基因的引物核苷酸序列为：
第一逆转录引物：SEQ ID NO.1:
5' GGCGTTGAGCAGACCTCGAGACTGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCAACGCCCTGCCA 3'；
第一上游引物：SEQ ID NO.2: 5' CGGAGTTCGCCTGTGTTGTG 3'；
第一下游引物：
SEQ ID NO.3: 5' GACCTCGAGACTGTGCAGGG 3'；
配合使用检测miR-nsp3-3p基因的Taqman探针，其核苷酸序列为：
第一探针：SEQ ID NO.4:FAM 5' CAGGGCGTTGGCAGACC 3' MGB；
Let-7d内参基因的引物核苷酸序列为：
第二逆转录引物：SEQ ID NO.5:
5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAGTTGCAGG CTCGCAGGACTGGTTAGCACAACTAT 3'；
第二上游引物：SEQ ID NO.6:
5' ACCGACGAGGTAGTAGGTTGCAT 3'；
第二下游引物：SEQ ID NO.7:
5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAGTTGC 3'；
配合使用检测Let-7d基因的Taqman探针，其核苷酸序列为：
第二探针：SEQ ID NO.8:
FAM 5' TTGTGCTAACCAGTCCTGCGA 3' MGB；
探针法试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
阳性质控品和阴性质控品的区别在于，二者所添加的假病毒和人工合成品浓度不同，阳性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为103 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阴性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为101 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阳性质控品要求检测结果为阳性，阴性质控品要求检测结果为阴性。
空白对照为不含被测物的空白样本。
使用上述试剂盒进行荧光PCR扩增，反应条件为：50℃15min；95℃10min；94℃15s，55℃40s，40个循环，在55℃时检测并采集荧光信号。
对于miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因，均采用FAM通道进行检测，根据扩增曲线和Ct值评估新冠感染患者重型的诊断和早期预警。
探针法试剂盒中，引物的浓度为1-4μmol/L，优选为3μmol/L；探针的浓度为5-15μmol/L，优选为13μmol/L。不同浓度的引物检测结果如图4-7所示。
上述探针法试剂盒的反应体系如表3所示。
表3
Figure RE-990643DEST_PATH_IMAGE003
如图1所示为本发明所提供的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的探针法试剂盒，针对同一样本的8次平行检测扩增曲线，从图1中的阈值线和扩增曲线得到的Ct值可以看出，8次实验结果数值基本一致，因此可以验证本发明探针法试剂盒的重复性好，CV值<2%，可有效避免误差，提高检测稳定性。
实施例3:
1、染料法试剂盒的制备
染料法试剂盒包含组分如前述表1所示。
所述试剂盒的检测miR-nsp3-3p基因的引物核苷酸序列为：
第一逆转录引物：SEQ ID NO.1:
5' GGCGTTGAGCAGACCTCGAGACTGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCAACGCCCTGCCA 3'；
第一上游引物：SEQ ID NO.2:
5' CGGAGTTCGCCTGTGTTGTG 3'；
第一下游引物：SEQ ID NO.3:
5' GACCTCGAGACTGTGCAGGG 3'；
Let-7d内参基因的引物核苷酸序列为：
第二逆转录引物：SEQ ID NO.5：5' GTGCTAACCAAGTCCTGCGAG TTGCAGGCTCGCAGGACTGGTTAGCACAACTAT 3'；
第二上游引物：SEQ ID NO.6:
5' ACCGACGAGGTAGTAGGTTGC 3'；
第二游引物：SEQ ID NO.7:
5' TAACCAAGTCCTGCGAGTTGC 3'；
染料法试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
阳性质控品和阴性质控品的区别在于，二者所添加的假病毒和人工合成品浓度不同，阳性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为103 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阴性参考品：新型冠状病毒假病毒合成品浓度为101 copies/μL,内对照人工合成品浓度为103 copies/μL；阳性质控品要求检测结果为阳性，阴性质控品要求检测结果为阴性。
空白对照为不含被测物的空白样本。
使用染料法试剂盒进行荧光PCR扩增，反应条件为：25℃5min； 50℃15min；95℃10min；94℃15s，55℃40s，40个循环； 95℃15s； 60℃1min； 95℃15s。根据扩增曲线和Ct值评估新冠感染患者重型的诊断和早期预警。
染料法法试剂盒中，引物的浓度为1-4μmol/L，优选为3μmol/L；探针的浓度为5-15μmol/L，优选为13μmol/L。不同浓度的引物检测结果如图4-7所示。
上述染料法试剂盒的反应体系如表4所示。
表4
Figure RE-336173DEST_PATH_IMAGE004
本发明提供的染料法试剂盒中，虽然采用了不同靶标，但其均是采用的SYBRGreen染料，而此种染料是非特异的染料，只要有扩增，染料就可以镶嵌在双链中发出荧光；做熔解曲线的目的是为了观察所扩增发出荧光的片段是否为实验所需要的产物；若熔解曲线做出来只有单峰，且出峰位置是相应的退火温度，则可以确定确为本实验产物所发出的荧光，实验结果有效（特异性好）；若熔解曲线出现杂峰或出峰位置不是本实验产物相应的退火温度，则表明实验产物不单一，也即是引物扩增了除目的产物以外的其它产物，引物特异性差。
基于上述描述，从图2、3可以明确看出，在提供了针对不同靶标的引物单峰的熔解曲线图中，其所对应的产物Tm值不同，也即是其出现的是单峰且出峰位置与退火温度相应，从而验证了本发明染料法试剂盒引物特异性好。
实施例4
利用实施例2的探针法试剂盒检测人源性外周血血清样本的方法：
探针法试剂盒进行实时荧光PCR法检测miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的流程，包括以下操作步骤：
1）采用柱提法总RNA提取试剂盒、磁珠法总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）、天根全自动提取仪提取待测样品的总RNA，以获得扩增模板；
2）血清样本PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物和探针混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
血清样本PCR反应体系如下表5所示。
表5
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE005
3）阳性质控品PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物和探针混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
阳性质控品PCR反应体系如下表6所示。
表6
Figure RE-987997DEST_PATH_IMAGE006
4）阴性质控品PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物和探针混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
阴性质控品PCR反应体系如下表7所示。
表7
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE007
5）空白对照PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物和探针混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
空白对照PCR反应体系如下表8所示。
表8
Figure RE-317347DEST_PATH_IMAGE008
6）将加好样的样本检测管、阳性质控检测管、阴性质控检测管、空白对照检测管分别置于ABI7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)内，按照如下反应参数进行设置：50℃15min；95℃10min …………；94℃15s，55℃40s，40个循环，在55℃时检测并采集荧光信号。对于miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因，均采用荧光PCR仪上的FAM通道进行检测，根据扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴阳性。
7）结果判读：按照所述试剂盒的阴性质控品、阳性质控品和空白对照符合规定的情况下，根据扩增曲线得到Ct值进行结果判定，已得到待测样本的定型结果。具体的判定标准如下表9所示。
表9
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE009
实施例5
利用实施例3的染料法试剂盒检测人源性外周血血清样本的方法：
染料法试剂盒进行实时荧光PCR法检测miR-nsp3-3p、Let-7d内参基因的流程，包括以下操作步骤：
1）采用柱提法总RNA提取试剂盒、磁珠法总RNA提取试剂盒（购自天根生化科技（北京）有限公司）、天根全自动提取仪提取待测样品的总RNA，以获得扩增模板；
2）血清样本PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
血清样本PCR反应体系如下表10所示。
表10
Figure RE-844143DEST_PATH_IMAGE010
3）阳性质控品PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
阳性质控品PCR反应体系如下表11所示。
表11
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE011
4）阴性质控品PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
阴性质控品PCR反应体系如下表12所示。
表12
Figure RE-339453DEST_PATH_IMAGE012
5）空白对照PCR反应体系配置：从试剂盒中取出PCR反应混合液、引物混合液、RNA模板和DEPC水按照如下配比加入到PCR反应管中，震荡混匀后进行离心；
空白对照PCR反应体系如下表13所示。
表13
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE013
6）将加好样的样本检测管、阳性质控检测管、阴性质控检测管、空白对照检测管分别置于ABI7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)内，按照如下反应参数进行设置：25℃5min ； 50℃15min；95℃10min；94℃15s，55℃40s，40个循环； 95℃15s； 60℃1min； 95℃15s。根据扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴阳性；
7）结果判读：按照所述试剂盒的阴性质控品、阳性质控品和空白对照符合规定的情况下，根据扩增曲线得到Ct值进行结果判定，已得到待测样本的定型结果。具体的判定标准如表14所示。
表14
Figure RE-395134DEST_PATH_IMAGE014
上述实施例2-5中，所给出的引物浓度/探针浓度，在一定范围内均可使用，本发明中，也相应给出了最优的浓度选择，其它的引物/探针浓度值，若浓度过高，不仅会浪费试剂，而且还有可能因过高的引物探针浓度导致错配或非特异性扩增的几率大幅增加；若浓度过低，则会严重降低PCR的产率。
试剂盒中，引物的浓度为1-4μmol/L，优选为3μmol/L；探针的浓度为5-15μmol/L，优选为13μmol/L。
表15-表17分别给出了引物浓度为1μmol/L+探针浓度为5μmol/L时、引物浓度为3μmol/L+探针浓度为13μmol/L时和引物浓度为4μmol/L+探针浓度为15μmol/L时的数据测定结果。
其中，Ct值为扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数，SD值为标准差，是离均差平方的算术平均数（即：方差）的算术平方根，标准差能反映一个数据集的离散程度，CV值为变异系数，又称离散系数，是概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为标准差与平均值之比；即当需要比较两组数据离散程度大小的时候，如果两组数据的测量尺度相差太大，或者数据量纲的不同，直接使用标准差来进行比较不合适，此时就应当消除测量尺度和量纲的影响。
表15
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE015
表16
Figure RE-211780DEST_PATH_IMAGE016
表17
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE017
三种不同浓度的引物和探针，其检测结果如图4-6所示，检测结果汇总如图7所示。
实施例6
为验证本发明所提供的引物和探针灵敏度高特异性好，申请人针对本发明提供的用于检测miR-nsp3-3p标志物的第一逆转录引物、第一PCR上游引物、第一PCR下游引物以及第一探针，提出了用于对比的三组引物和探针序列，具体为：
第一组对比：
对比逆转录引物：序列同SEQ ID NO.1一致；
对比上游引物：5' CCGGAGTTCGCCTGTGTTG 3'；
对比下游引物：5' CAGACCTCGAGACTGTGCAGG 3'；
对比FAM探针：5' CAGGGCGTTGGCAGACCT 3'；
第二组对比：
对比逆转录引物：序列同SEQ ID NO.1一致；
对比上游引物：5' GGAGTTCGCCTGTGTTGTGG 3'；
对比下游引物：5' ACCTCGAGACTGTGCAGGGT 3'；
对比FAM探针：5' AGGGCGTTGGCAGACCTC 3'；
第三组对比：
对比逆转录引物：5'
GTCGTGTCCAGTACCTCAGGTTCTGCTGGGACGCGAGGACTGGGACACGACCTGCCA 3'；
对比上游引物：5'
AGAGTTCGCCTGTGTTGTGG 3'；
对比下游引物：5'
CGTGTCCAGTACCTCAGGTTCT 3'；
对比FAM探针：5'
CAGGTCGTGTCCCAGTCCTC 3'。
以上述三组用于对比的引物和探针，与同样的内参基因，采用与实施例2相同的方法制备探针法试剂盒，再采用与实施例4相同的方法检测人源性外周血血清样本，并将结果与实施例2和实施例4所得到结果进行对比，对比结果如下表18所示。
表18
Figure RE-276688DEST_PATH_IMAGE018
从表18可以看出，三组对比的引物序列和探针序列，虽然只调整了其中的极少量碱基或是采用了其它的引物探针备选序列，但其检测试剂盒的各项指标已经大幅下降，尤其是检出准确率方面差异极大。在分别采用本发明所记载的试剂盒和三组含有对比引物和探针序列的试剂盒针对早期新型冠状病毒病例的血清进行检测后发现，所采集血清的样本后期共出现了20例重症，而本发明试剂盒预警出了其中的17例，准确率达到了85%，采用三组对比引物和探针序列的试剂盒，则只分别预警出了10-12例，准确率为50-60%，说明本发明提供的引物序列和探针序列是的确具有最优技术效果的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述miRNA标志物为miR-nsp3-3p，所述检测miR-nsp3-3p标志物的引物组中包括第一逆转录引物、第一PCR上游引物和第一PCR下游引物，第一逆转录引物序列如SE Q ID NO.1所示，第一PCR上游引物序列如SEQ IDNO.2所示，第一PCR下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述引物组中还包括用于检测内参基因miRNA标志物Let-7d的第二逆转录引物、第二PCR上游引物和第二PCR下游引物，第二逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，第二PCR上游引物序列如SEQ IDNO.6所示，第二PCR下游引物序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的检测多种miRNA标志物的引物组，其特征在于，所述引物组中还包括有分别用于检测miR-nsp3-3p和Let-7d内参基因的第一探针和第二探针，第一探针序列如SEQ ID NO.4所示，第二探针序列如SEQ ID NO.8所示。
4.检测miRNA标志物的引物组在制备用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测miRNA标志物的引物组为权利要求1-3任一所述的引物组。
5.用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为染料法试剂盒，所述染料法试剂盒包括有权利要求1-2所述的引物组。
6.用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为探针法试剂盒，所述探针法试剂盒包括有权利要求1-2所述的引物组和权利要求3所述的探针。
7.根据权利要求5或6所述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包括有PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品和空白对照。
8.根据权利要求7所述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中，包含有DEPC水、qPCR缓冲液、MgCl2、核苷酸混合液、逆转录酶、DNA聚合酶和染料试剂。
9.根据权利要求8所述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒，其特征在于，所述染料试剂为ROX参比染料或SYBR Green荧光染料。
10.权利要求5-9任意一项所述的用于新型冠状病毒中重型、危重型病例早期预警的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取外周血血清样本；
S2.提取样本的总RNA，以总RNA为扩增模板；
S3.分别配制血清样本、阳性质控品、阴性质控品和空白对照的PCR反应体系；
S4.以各PCR反应体系进行PCR反应；
S5.依据PCR反应结果的扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴阳性。
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Citations (2)

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CN104745678A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 江苏命码生物科技有限公司 一种体外辅助诊断胰腺癌的试剂盒
WO2022053687A2 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Immunrise Chlorella-based production of extracellular vesicle-embedded small rnas for prophylactic or therapeutic applications

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