JP6799329B2 - バクテリオファージ、青枯病防除剤及び青枯病防除方法 - Google Patents
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Description
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2015年12月10日に受託された受託番号:NITE BP−02176で示されるRSF1である。
上記本発明の第1の観点に係るバクテリオファージを含む。
上記本発明の第2の観点に係る青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。
本実施の形態に係るバクテリオファージは、ゲノムのサイズが200,000bp以上でジャンボファージとも言われる。本実施の形態に係るバクテリオファージのファージ粒子の構造は、十二面体の頭部と尾部とを含むmyovirus型である。頭部の長さは100〜130nm、好ましくは110〜120nmである。尾部の長さは150〜200nm、好ましくは170〜190nmである。尾部の幅は20〜30nm、好ましくは22〜28nmである。当該バクテリオファージの一例として、図1にRSF1の形態を示す。RSF1は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に2015年12月10日に受託され、ブタペスト条約に基づく国際寄託への移管請求が2016年10月14日に受領されている(受託番号:NITE BP−02176)。
本実施の形態に係る青枯病防除剤は、上記実施の形態1に係るバクテリオファージ(以下、「第1のバクテリオファージ」とする)に加え、第1のバクテリオファージと異なり、かつ青枯病菌に感染するバクテリオファージ(以下、「第2のバクテリオファージ」とする)をさらに含む。以下、本実施の形態について、上記実施の形態1と異なる点について主に説明する。
試験に用いた青枯病菌株は、0.1%(W/V)カザミノ酸、1.0%(W/V)ペプトン及び0.5%(W/V)グルコースを含有するCPG培地において、28℃で振盪培養した(200〜300rpm)。
RSF1のファージ粒子(1012pfu/mL)をリンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡(H600A、日立製作所製)で観察した。
図1に示すように、RSF1のファージ粒子は、頭部が約115nmの正二十面体、尾部の長さが180nm、尾部の幅が25nmのmyovirus型であった。なお、図1中のバーは100nmの長さを示す。
フェノール抽出によってファージ粒子からゲノムDNAを単離した。ゲノムのサイズを決めるため、精製したファージ粒子を0.5%低融点アガロース(InCert(商標)アガロース、FMC社製)に包埋した。次に、1mg/mLのプロテアーゼK(メルク社製)及び1%(W/V)のSarkosylで処理し、核酸に対してCHEF MAPPER(商標)電気泳動装置(Bio−Rad社製)でパルスフィールドゲル電気泳動法を実施した。
図2は、パルスフィールドゲル電気泳動法で得られたバンドを示す。レーン1はサイズマーカーであるラムダラダーのバンドを示す。レーン2に示すRSF1のゲノムのサイズは、約230kbpであった。
RSF1のゲノムDNAのショットガン配列決定をGS Junior Sequence System(ロシュ社製)で行った。決定した塩基配列のアセンブリをGS De Novo Assembler v2.6で行った。解析された塩基配列は、222,888bpであった。「ATG」で始まる150bpより大きいオープンリーディングフレーム(ORF)をGlimmer v3.02で同定した。配列データベースに対してBLASTP/RPS−BLASTでホモロジー検索を行った。ホモロジー検索では、著しい類似性のカットオフとして、E−valueが1e−5未満とした。なお、配列データベースは、KEGG GENES、NCBI/Cdd sequence domain database(version 3.12)、UniProt sequence database(Release 2014_08)及びNCBI RefSeq complete viral genome section database(Release 67、2014年9月8日)である。tRNA遺伝子は、tRNAScan−SE 1.4(option;−B for bacterial tRNAs)を用いて同定した。環状ゲノム地図は、CGViewで描いた。
RSF1の環状ゲノム地図を図3に示す。ゲノムは環状に重複した222,888bpの二重鎖DNAであった。ゲノムには、計230個の遺伝子がコードされていた。230個の遺伝子のうち、55個が時計回りにコードされていて、残りが反時計回りにコードされていた。配列データベースで生物学的に特徴づけられていたタンパク質との類似性に基づいて、27個のORFのアノテーションを決定することができた。
精製したファージ粒子について公知の方法でSDS−PAGE(10〜12%(W/V)ポリアクリルアミド)を行った。タンパク質のバンドは、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色することで可視化し、ゲルから切り出して、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した後、トリプシンで断片化した。トリプシンペプチドをshort ODS column(PepMap 100;5μm C18、5mm×300μm ID、Thermo Fisher Scientific社製)を用いてトラップし、ODS column(Nano HPLC Capillary Column、3μm C18、120mm×75μm ID、日京テクノス社製)を用いたnano−liquid chromatography(nanoLC)で分離した。nanoLCには、Ultimate(商標) 3000 RSLC nano system(Thermo Fisher Scientific社製)を使用した。
図4はRSF1の構造タンパク質を分離したSDS−PAGEのバンドを示す。RSF1のファージ粒子を構成するタンパク質に、ORF40、ORF51、ORF41及びORF199由来のタンパク質が含まれていた。
種々の青枯病菌株を用いた上記のプラークアッセイによって、RSF1の宿主域を検討した。さらに、比較のため、RSL2の宿主域も同様に検討した。
表1は、RSL2及びRSF1の宿主域を示す。RSL2又はRSF1に対する感受性に関しては、「+」は感受性があることを示し、「−」は感受性がない(抵抗性である)ことを示す。RSF1は種々の植物を宿主植物とする19種類の菌株に感染する。RSF1が感染する菌株には、RSL2が感染しないPs65、MAFF211514、MAFF301485及びMAFF301558が含まれており、RSF1は、RSL2と比較して、日本由来の青枯病菌株に対して広い宿主域を示した。また、RSF1は青枯病菌のみに感染し、腸内細菌、Pseudomonas、Rhizobium及びグラム陽性菌などには感染しない。
ワンステップ増殖法で感染サイクルを評価した。培養によりOD600が0.1に達したMAFF730138株を遠心(6000×g)で回収し、最終培養液量が10mLとなるようにCPG培地に懸濁した(およそ1×108cfu/mL)。RSF1をMOI=0.1となるように加えて、28℃で10分間吸着させた。遠心後、当初の量のCPGに試料を再懸濁し、最終液量が10mLになるように希釈系列を調製した。細胞を28℃でインキュベーションした。試料を30分ごとに採取し、タイターをプラークアッセイで決定した。
細胞あたりのRSF1の数の経時変化を図6に示す。RSF1は、MAFF730138株を宿主とした場合、潜伏期が90分、かつ4時間の感染サイクルで、バーストサイズが約80pfu/細胞であった。なお、RSL2の感染サイクルを同様に評価すると、潜伏期が150分、かつ4.5時間の感染サイクルで、バーストサイズが約40〜50pfu/細胞であった。RSL2は、ファージ粒子にビリオン関連RNAポリメラーゼのβ’サブユニットの一部を欠くため、初期の発現に宿主のRNAポリメラーゼに依存するのに対し、RSF1は、ファージ粒子にビリオン関連RNAポリメラーゼのβサブユニット及びβ’サブユニットをフルセットで有するため、潜伏期及び感染サイクルが短いと考えられる。これにより、RSF1の感染効率が、RSL2よりも高められている。
青枯病菌株MAFF211514を、28℃で1〜2日、CPG培地で培養した。遠心後、細胞を1.5×109細胞/mL(OD600=1.0)の濃度で滅菌水に懸濁した。5mLの細胞懸濁液を、断根したトマト苗(Solanum lycopersicum L.、品種「大型福寿」)のポット内の土壌に投与した(対照区)。なお、トマト苗として、葉が4〜6枚の1ヶ月苗を用いた。土壌1gあたりの細胞の濃度は、約1×106cfuである。ファージ処理区には、細胞懸濁液を投与する1日前に、5mLのRSF1懸濁液(1.5×1010pfu)を苗根部に添加した。
図7(A)及び(B)は、それぞれ対照区及びファージ処理区のトマト苗に現れた病徴を示す。病徴指数「0」は変化なし、「1」は子葉から上に向かい第1葉が萎凋、「2」は第2葉が萎凋、「3」は第3葉が萎凋、「4」は第4葉が萎凋、「5」は枯死、を示す。図7(A)に示すように、対照区のトマト苗には、細胞懸濁液の投与から約1週間後に顕著な青枯病の病徴が出現した。約2週間後には対照区のトマト苗の80%が枯死した。一方、図7(B)に示すように、ファージ処理区では、3週間後でもトマト苗に変化がなかった。その後、ファージ処理区のトマト苗には、少し萎えた第1葉が若干観察されたがこれは青枯病の病徴とは異なっていた。ファージ処理区のトマト苗は、1ヶ月後でも青枯病の発症はなかった。また、潜在的に発生するRSF1に対する耐性菌は、病原性を喪失していると考えられる。
Claims (3)
- 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2015年12月10日に受託された受託番号:NITE BP−02176で示されるRSF1である、
バクテリオファージ。 - 請求項1に記載のバクテリオファージを含む、
青枯病防除剤。 - 請求項2に記載の青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む、
青枯病防除方法。
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