JPWO2017104347A1

JPWO2017104347A1 - バクテリオファージ、青枯病防除剤及び青枯病防除方法

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Publication number: JPWO2017104347A1
Application number: JP2017556435A
Authority: JP
Inventors: 山田　隆; 隆山田; 藤江　誠; 誠藤江; 川崎　健; 健川崎
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-11-01
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: WO2017104347A1; JP6799329B2

Abstract

バクテリオファージは、ゲノムのサイズが２００，０００ｂｐ以上であって、ファージ粒子を構成するタンパク質に、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットとビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットとを含む。当該バクテリオファージは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染する。

Description

本発明は、バクテリオファージ、青枯病防除剤及び青枯病防除方法に関する。

青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）はナス科植物をはじめ２００種以上の植物に感染し、該植物を枯死させる青枯病を引き起こす。青枯病の対策に使用されてきた主な化学農薬は劇物である燻蒸剤クロロピクリン又は臭化メチルである。しかし、有効散布量の増大、環境汚染、オゾン層破壊、健康への影響及び残留農薬などの問題から、化学農薬に代わる安全な代替農薬及び防除技術の開発が強く望まれている。

特許文献１には、青枯病菌の６種類の株に溶菌活性を示すバクテリオファージが開示されている。特許文献２には、青枯病菌の６種類の株に感染する線状のバクテリオファージＲＳＭ１及びＲＳＭ１が感染しない９種類の株を含む１１種類の株に感染する線状のバクテリオファージＲＳＭ３が開示されている。特許文献２では、ＲＳＭ１又はＲＳＭ３を感染させた青枯病菌をトマト等の植物に予め接種しておくと、強病原性を有する青枯病菌による青枯病の発症を予防できることが示されている。

さらに、非特許文献１には、タイの土壌から単離された、青枯病菌に感染するジャンボファージＪ６が開示されている。特許文献１、特許文献２及び非特許文献１に開示されたバクテリオファージを使用する農薬は、クロロピクリン又は臭化メチルなどの化学農薬よりは安全性が高い点で有望である。

特開２００５−２７８５１３号公報特開２０１２−２３１７３１号公報

ＢｕｈｎｃｈｏｔｈＡ、外８名、「ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＲａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ−ｉｎｆｅｃｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓｆｒｏｍｔｏｍａｔｏｆｉｅｌｄｓｉｎＣｈｉｎｇＭａｉ，Ｔｈａｉｌａｎｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌｕｓｅａｓｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｓ」、２０１４年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.、１１８、ｐ．１０２３−１０３３

青枯病菌には、宿主域によるレース（ｒａｃｅ）、糖類の代謝型による生理型（ｂｉｏｖａｒ）及び遺伝子情報による系統型（ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ）の異なる様々な株が存在する。世界各地で発生し得る青枯病の病害を防ぐために、さらに多様な青枯病菌に有効な新規のバクテリオファージが求められている。また、使用頻度を抑えることで利便性を高め、かつコストを削減するために、長期に渡って防除効果を発揮するバクテリオファージが望ましい。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、多様な青枯病菌に起因する青枯病をより長期に渡って防除できるバクテリオファージ、青枯病防除剤及び青枯病防除方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
ゲノムのサイズが２００，０００ｂｐ以上であって、
ファージ粒子を構成するタンパク質に、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットとビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットとを含み、
Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染する。

この場合、前記ゲノムには、
２種類以上の溶菌酵素がコードされている、
こととしてもよい。

また、上記バクテリオファージは、
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１５年１２月１０日に受託された受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０２１７６で示されるＲＳＦ１である、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る青枯病防除剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。

本発明の第３の観点に係る青枯病防除剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージと、
前記バクテリオファージと異なり、かつＲａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染するバクテリオファージと、
を含む。

本発明の第４の観点に係る青枯病防除方法は、
上記本発明の第２の観点に係る青枯病防除剤又は上記本発明の第３の観点に係る青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。

本発明によれば、多様な青枯病菌に起因する青枯病をより長期に渡って防除できる。

本発明に係るバクテリオファージＲＳＦ１の形態の一例を示す図である。ＲＳＦ１のゲノムのサイズを示す図である。ＲＳＦ１の環状ゲノム地図を示す図である。ＲＳＦ１のファージ粒子のタンパク質を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す図である。ＲＳＬ２のファージ粒子のタンパク質を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す図である。ＲＳＦ１の感染サイクルを示す図である。ＲＳＦ１による青枯病防除効果を示す図である。（Ａ）は対照区の結果を示す図である。（Ｂ）はファージ処理区の結果を示す図である。

本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。

（実施の形態１）
本実施の形態に係るバクテリオファージは、ゲノムのサイズが２００，０００ｂｐ以上でジャンボファージとも言われる。本実施の形態に係るバクテリオファージのファージ粒子の構造は、十二面体の頭部と尾部とを含むｍｙｏｖｉｒｕｓ型である。頭部の長さは１００〜１３０ｎｍ、好ましくは１１０〜１２０ｎｍである。尾部の長さは１５０〜２００ｎｍ、好ましくは１７０〜１９０ｎｍである。尾部の幅は２０〜３０ｎｍ、好ましくは２２〜２８ｎｍである。当該バクテリオファージの一例として、図１にＲＳＦ１の形態を示す。ＲＳＦ１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室）に２０１５年１２月１０日に受託され、ブタペスト条約に基づく国際寄託への移管請求が２０１６年１０月１４日に受領されている（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０２１７６）。

本実施の形態に係るバクテリオファージは、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に感染する。当該バクテリオファージは、レース、生理型及び系統型が異なる多様な青枯病菌に感染する。当該バクテリオファージは、感染した青枯病菌に対する溶菌活性を有する。当該バクテリオファージが有効な青枯病菌の株としては、例えば、Ｃ３１９、Ｍ４Ｓ、Ｐｓ２９、Ｐｓ６５、Ｐｓ７２、Ｐｓ７４、ＲＳ１００２などに加え、独立行政法人農業生物資源研究所から入手可能なＭＡＦＦ１０６６０３、１０６６１１、２１１２７０、２１１５１４、３０１４８５、３０１５５６、３０１５５８、３２７０３２、７３０１０３、７３０１３５、７３０１３８、７３０１３９などが挙げられる。なお、ここに挙げた株は例示であって、本実施の形態に係るバクテリオファージの宿主域は、さらに広いと考えられる。

公知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージＫＺでは、感染サイクルにおいて、宿主のＲＮＡポリメラーゼの活性がない初期に遺伝子を発現させるためのビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼと、中期及び後期におけるファージ発現のための初期発現ＲＮＡポリメラーゼとを含むマルチサブユニットＲＮＡポリメラーゼが機能すると言われている。本実施の形態に係るバクテリオファージのゲノムには、ＫＺが有するマルチサブユニットＲＮＡポリメラーゼをコードする複数の遺伝子すべてに対応する遺伝子が含まれている。

より詳細には、マルチサブユニットＲＮＡポリメラーゼをコードする複数の遺伝子は、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ＲｐｏＢ）のＮ領域及びＣ領域をそれぞれコードする２個の遺伝子、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット（ＲｐｏＣ）のＮ領域及びＣ領域をそれぞれコードする２個の遺伝子、初期発現ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ＲｐｏＢ）のＮ領域及びＣ領域をそれぞれコードする２個の遺伝子、及び初期発現ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット（ＲｐｏＣ）のＮ領域及びＣ領域をそれぞれコードする２個の遺伝子である。

実際、本実施の形態に係るバクテリオファージは、上記のビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット及びビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに関する４個の遺伝子をタンパク質として発現させる。このため、当該バクテリオファージは、ファージ粒子を構成するタンパク質（ビリオンタンパク質）に、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットとビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットとを含む。本実施の形態に係るバクテリオファージは、フルセットのβサブユニットの遺伝子及びβ’サブユニットの遺伝子をファージ粒子内に持ち込み、青枯病菌への感染時にゲノムと一緒に青枯病菌内に導入する。こうすることで、当該バクテリオファージは、青枯病菌のＲＮＡポリメラーゼに依存せずに迅速かつ効率的にゲノムＤＮＡを転写できるので、青枯病菌への高い感染効率を示す。

好ましくは、本実施の形態に係るバクテリオファージのゲノムには、２種類以上の溶菌酵素がコードされている。溶菌酵素は、例えば、キチナーゼ様酵素、ＬｙｓＭ様ムレイン溶解酵素及び糖転移酵素である。当該バクテリオファージは、複数の種類の溶菌酵素をゲノムにコードしているため、長期に渡って青枯病菌に対する溶菌活性を維持できる。

上記バクテリオファージは、土壌などを含む試料を、洗浄して遠心分離し、膜フィルターで上清を濾過することで得られる。さらに、宿主として適切な青枯病菌を用いることで、目的とするバクテリオファージを単離することができる。バクテリオファージの単離及び力価の測定には、寒天培地に青枯病菌とバクテリオファージ試料との混合液を加えた軟寒天培地（０．４５％寒天）を重層してプラークを形成させるプラークアッセイが好適である。

バクテリオファージの青枯病菌への感染方法は、当該技術分野で公知である任意の方法を用いることができる。一例としては０．１％カザミノ酸、１％ペプトン及び０．５％グルコースを含有するＣＰＧ培地で培養した青枯病菌を含む培養液にバクテリオファージを加え、培養することでバクテリオファージを青枯病菌に感染させることができる。

上記バクテリオファージは、下記実施例１に示すように幅広い宿主域を有しており、感染した青枯病菌を溶菌する。このため、当該バクテリオファージは、青枯病防除剤の有効成分として好適である。ここで、「防除」とは、青枯病菌の植物への感染の予防、青枯病菌による植物の病害の予防、青枯病菌による植物の病害の拡大防止及び青枯病菌の駆除を含む。

本実施の形態に係る青枯病防除剤は、上記バクテリオファージを含む。青枯病防除剤におけるバクテリオファージの含有量は、例えば感染単位で特定される。感染単位は細菌培養用平板上に透明領域又はプラークを形成する能力であるプラーク形成単位（ｐｆｕ）として定義される。青枯病防除剤は、例えば、滅菌水に懸濁した状態で、バクテリオファージを、１０^３〜１０^１４ｐｆｕ／ｍＬ、１０^４〜１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ又は１０^３〜１０^８ｐｆｕ／ｍＬで含む。青枯病防除剤は、有効成分であるバクテリオファージ以外にも、一般に薬学的又は植物学的に許容される他の物質、組成物などを含んでもよい。

当該青枯病防除剤は、青枯病防除方法に利用できる。青枯病防除方法は、上記青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む。植物は、青枯病菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよいが、好ましくはナス科の植物、より具体的には、トマト、ジャガイモ、ナス及びタバコなどである。

上記投与ステップにおける青枯病防除剤の用量は、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積などに応じて、適宜决定することができる。例えば、好適な用量は、植物個体あたり１０^２〜１０^１０ｐｆｕ、好ましくは１０^４〜１０^８ｐｆｕである。青枯病防除剤は、上記用量のバクテリオファージを好適な担体又は希釈剤中に含み、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積などに応じて、例えば１００μＬ〜１００ｍＬ又は１〜１０ｍＬである。なお、植物成長媒体は、土壌、マット、固形培地などの構造体、養液栽培における養液、及び水栽培における水などである。

当該青枯病防除剤を含む懸濁液を植物成長媒体に投与する場合、例えば、植物成長媒体の表面積１ｍ^２あたり、１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを散布することで投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。

本実施の形態に係る青枯病防除剤は、植物又は植物成長媒体に単回で投与されてもよいし、任意の時間間隔で植物又は植物成長媒体に複数回投与されてもよい。例えば、青枯病防除剤は、数ヶ月、１ヶ月若しくは１週間に１回又は複数回、あるいは２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回などの間隔で植物などに投与されてもよい。投与間隔は、投与対象の植物又は植物成長媒体に応じて、適宜決定することができる。

青枯病防除剤を投与する方法は、植物又は植物成長媒体を、当該青枯病防除剤に暴露することができる方法であれば任意である。青枯病防除剤を投与する方法は、例えば、青枯病防除剤を噴霧、注射すること、あるいは当該青枯病防除剤を植物又は植物成長媒体に浸透させることなどである。また、青枯病防除剤をポットの苗根部に添加してもよい。植物に注射する場合、当該防除剤を注射筒に入れ、圧迫接種してもよいし、注射針を介して接種してもよい。

当該青枯病防除剤を、噴霧などにより植物に投与することで、青枯病菌に未感染の植物であれば、該植物への青枯病菌の感染、あるいは青枯病菌の病害が該植物に及ぶことを防止できる。青枯病に感染後の植物であれば、当該青枯病防除剤を投与することで病害の拡大を阻止できる。

青枯病防除剤を植物成長媒体に投与することで、青枯病防除剤に含まれるバクテリオファージを、潜在的な青枯病菌に感染させることができる。この結果、青枯病を防除できる。なお、植物成長媒体は、植物が成長する媒体であれば任意のものでよい。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る青枯病防除剤は、幅広い青枯病菌を溶菌させることができる。このため、当該青枯病防除剤は、青枯病を防除できる。

なお、本実施の形態に係る青枯病防除剤に含まれるバクテリオファージは、種々の青枯病菌に特異的に感染する性質を有するため、特異性が高く、他の有用な微生物に影響を与えない。これにより、当該青枯病防除剤は、環境への影響を極力小さくすることができる。したがって、当該青枯病防除剤は、化学農薬よりも安全性が高く、耐性菌の増加、有効散布量の増大、環境汚染、残留農薬、健康への影響などの問題を回避できる。

また、本実施の形態に係る青枯病防除剤に含まれるバクテリオファージは、下記実施例８に示すように、長期に渡って青枯病菌による病害を防除することができる。

（実施の形態２）
本実施の形態に係る青枯病防除剤は、上記実施の形態１に係るバクテリオファージ（以下、「第１のバクテリオファージ」とする）に加え、第１のバクテリオファージと異なり、かつ青枯病菌に感染するバクテリオファージ（以下、「第２のバクテリオファージ」とする）をさらに含む。以下、本実施の形態について、上記実施の形態１と異なる点について主に説明する。

第２のバクテリオファージは、特に限定されないが、好ましくは、その宿主域が第１のバクテリオファージと異なる。さらに好ましくは、第２のバクテリオファージとして、第１のバクテリオファージによる溶菌活性が比較的低い青枯病菌の株に、第１のバクテリオファージによる溶菌活性よりも高い抗菌活性を示すものが挙げられる。好適には、第２のバクテリオファージは、第１のバクテリオファージが感染しない青枯病菌の株に感染する。また、第２のバクテリオファージは、その感染サイクルが、第１のバクテリオファージの感染サイクルと相違するものでもよい。

具体的には、第２のバクテリオファージは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−１０８５として受託されたφＲＳＭ１、同じく受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−１０８６として受託されたφＲＳＭ３、特開２００７−２５２３５１号公報に開示されたＲＳＡ１、Ｔ７型のバクテリオファージであるＲＳＢ１、及びＲＳＬ２等である。なお、本実施の形態に係る青枯病防除剤は、第２のバクテリオファージとして、１種類のバクテリオファージに限らず、複数種類のバクテリオファージを含んでもよい。

例えば、第１のバクテリオファージとしてのＲＳＦ１と、第２のバクテリオファージとしてのＲＳＢ１とを含む青枯病防除剤は、バクテリオファージとしてＲＳＦ１のみを含む青枯病防除剤と同様に、青枯病を防除できる。ＲＳＦ１とＲＳＢ１とを含む青枯病防除剤は、ＲＳＦ１の宿主域に含まれる青枯病菌及びＲＳＢ１の宿主域に含まれる青枯病菌のどちらにも有効である。

本実施の形態に係る青枯病防除剤における第１のバクテリオファージと第２のバクテリオファージとの配合比は、特に限定されず、任意に設定すればよい。例えば、青枯病防除剤は、滅菌水に懸濁した状態で第１のバクテリオファージを、１０^３〜１０^１４ｐｆｕ／ｍＬ、１０^４〜１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ又は１０^３〜１０^８ｐｆｕ／ｍＬで含み、第２のバクテリオファージを１０^３〜１０^１４ｐｆｕ／ｍＬ、１０^４〜１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ又は１０^３〜１０^８ｐｆｕ／ｍＬで含む。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る青枯病防除剤は、青枯病菌に感染する複数種のバクテリオファージを含む。宿主域が異なるバクテリオファージを用いることで、さらに幅広い青枯病菌を溶菌させることができる。また、感染サイクルが異なるバクテリオファージを用いることで、多様な溶菌活性特性を得ることができる。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

（実施例１：ＲＳＦ型ジャンボファージの単離及び精製）
試験に用いた青枯病菌株は、０．１％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸、１．０％（Ｗ／Ｖ）ペプトン及び０．５％（Ｗ／Ｖ）グルコースを含有するＣＰＧ培地において、２８℃で振盪培養した（２００〜３００ｒｐｍ）。

広島県世羅郡世羅町で採取した土壌からバクテリオファージを、次のように単離した。１ｇの土壌を２ｍＬの滅菌水に懸濁して調製した試料を、室温で１時間、激しく振った。次に、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルター（Ｓｔｅｒａｄｉｓｃ、クラボウ社製）に試料を通し、１００μＬをプラークアッセイに用いた。プラークアッセイでは、青枯病菌株ＭＡＦＦ１０６６０３を宿主として、１．５％寒天を含むＣＰＧプレート上に重層した０．４５％の軟寒天培地にプラークを形成させた。

得られたバクテリオファージ（以下、「ＲＳＦ１」とする）を、ＭＡＦＦ１０６６０３を宿主として増殖させた。ＭＡＦＦ１０６６０３の培地のＯＤ６００が０．５に達してから、ＲＳＦ１をＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０１〜０．１で培地に加えた。１２〜２４時間の培養後、ｈｉｍａｃＣＲ２Ｅ遠心機（日立製作所製）のＲ１２Ａ２ローターを用いて、４℃で１５分間、８，０００×ｇで遠心することで細胞を除去した。膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルターで上清を濾過し、さらに沈殿物をＳＭバッファー（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４及び０．０１％ゼラチン）に溶解した。

ＲＳＦ１をさらに精製するために、ＲＳＦ１懸濁液をＣｓＣｌ（９．４ｇ／２０ｍＬ）に混合し、ＣＰ１００β超遠心機（日立製作所製）のＰ２８Ｓローターを用いて、１８時間、１４５，０００×ｇで超遠心した。精製されたＲＳＦ１を使用時まで４℃で保存した。

（実施例２：ＲＳＦ１のファージ粒子の構造）
ＲＳＦ１のファージ粒子（１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ）をリンタングステン酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡（Ｈ６００Ａ、日立製作所製）で観察した。

（結果）
図１に示すように、ＲＳＦ１のファージ粒子は、頭部が約１１５ｎｍの正二十面体、尾部の長さが１８０ｎｍ、尾部の幅が２５ｎｍのｍｙｏｖｉｒｕｓ型であった。なお、図１中のバーは１００ｎｍの長さを示す。

（実施例３：ＲＳＦ１のゲノムのサイズの決定）
フェノール抽出によってファージ粒子からゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムのサイズを決めるため、精製したファージ粒子を０．５％低融点アガロース（ＩｎＣｅｒｔ（商標）アガロース、ＦＭＣ社製）に包埋した。次に、１ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ（メルク社製）及び１％（Ｗ／Ｖ）のＳａｒｋｏｓｙｌで処理し、核酸に対してＣＨＥＦＭＡＰＰＥＲ（商標）電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でパルスフィールドゲル電気泳動法を実施した。

（結果）
図２は、パルスフィールドゲル電気泳動法で得られたバンドを示す。レーン１はサイズマーカーであるラムダラダーのバンドを示す。レーン２に示すＲＳＦ１のゲノムのサイズは、約２３０ｋｂｐであった。

（実施例４：ＲＳＦ１のゲノム解析）
ＲＳＦ１のゲノムＤＮＡのショットガン配列決定をＧＳＪｕｎｉｏｒＳｅｑｕｅｎｃｅＳｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）で行った。決定した塩基配列のアセンブリをＧＳＤｅＮｏｖｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒｖ２．６で行った。解析された塩基配列は、２２２，８８８ｂｐであった。「ＡＴＧ」で始まる１５０ｂｐより大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＧｌｉｍｍｅｒｖ３．０２で同定した。配列データベースに対してＢＬＡＳＴＰ／ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴでホモロジー検索を行った。ホモロジー検索では、著しい類似性のカットオフとして、Ｅ−ｖａｌｕｅが１ｅ−５未満とした。なお、配列データベースは、ＫＥＧＧＧＥＮＥＳ、ＮＣＢＩ／Ｃｄｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｏｍａｉｎｄａｔａｂａｓｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．１２）、ＵｎｉＰｒｏｔｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ２０１４＿０８）及びＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑｃｏｍｐｌｅｔｅｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｅｓｅｃｔｉｏｎｄａｔａｂａｓｅ（Ｒｅｌｅａｓｅ６７、２０１４年９月８日）である。ｔＲＮＡ遺伝子は、ｔＲＮＡＳｃａｎ−ＳＥ１．４（ｏｐｔｉｏｎ；−ＢｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｔＲＮＡｓ）を用いて同定した。環状ゲノム地図は、ＣＧＶｉｅｗで描いた。

（結果）
ＲＳＦ１の環状ゲノム地図を図３に示す。ゲノムは環状に重複した２２２，８８８ｂｐの二重鎖ＤＮＡであった。ゲノムには、計２３０個の遺伝子がコードされていた。２３０個の遺伝子のうち、５５個が時計回りにコードされていて、残りが反時計回りにコードされていた。配列データベースで生物学的に特徴づけられていたタンパク質との類似性に基づいて、２７個のＯＲＦのアノテーションを決定することができた。

ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ＲｐｏＢ）のＮ領域及びＣ領域は、それぞれＯＲＦ４０及びＯＲＦ５１にコードされていた。ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット（ＲｐｏＣ）のＮ領域及びＣ領域は、それぞれＯＲＦ４１及びＯＲＦ１９９にコードされていた。一方、初期発現ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット（ＲｐｏＢ）のＮ領域及びＣ領域は、それぞれＯＲＦ１２２及びＯＲＦ２１５にコードされていた。初期発現ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット（ＲｐｏＣ）のＮ領域及びＣ領域は、それぞれＯＲＦ２２７及びＯＲＦ２１４にコードされていた。

また、ＲＳＦ１のゲノムにおいて溶菌酵素であるＬｙｓＭ様ムレイン溶解酵素（キチナーゼ様）は、ＯＲＦ４２にコードされていた。また、溶菌酵素であるＳＬＴ糖転移酵素は、ＯＲＦ５５にコードされていた。

ＲＳＦ１のゲノムにおいてＤＮＡ複製に関連するタンパク質の遺伝子のホモログであるＯＲＦとしては、ＯＲＦ５７（ＲＮａｓｅＨ）、ＯＲＦ６３（ＳｂｃＣ−ＡＴＰａｓｅ）、ＯＲＦ１０５（ＤＮＡリガーゼ）及びＯＲＦ１２６（ＤｎａＢヘリカーゼ）が挙げられる。また、ＯＲＦ６８はＧＩＹ−ＹＩＧ型ヌクレアーゼに類似性が高い。

ＲＳＦ１のゲノムに含まれるヌクレオチドの代謝に関連する酵素のホモログとしては、ＯＲＦ１９０（チミジル酸キナーゼ）、ＯＲＦ１６４（チミジル酸シンターゼ）、ＯＲＦ７７及びＯＲＦ７８（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＯＲＦ１１８（リボヌクレオチドレダクターゼ αサブユニット）、ＯＲＦ１１７（リボヌクレオチドレダクターゼ βサブユニット）及びＯＲＦ１１９（嫌気性リボヌクレオチド二リン酸レダクターゼ）が挙げられる。

上記の他、宿主又はファージ相互作用関連のタンパク質及びファージ粒子を構成するタンパク質をコードする遺伝子に相同性を有するＯＲＦが同定された。

（実施例５：ｎａｎｏＬＣ−ＥＩＳＭＳ／ＭＳによる構造タンパク質の同定）
精製したファージ粒子について公知の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜１２％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミド）を行った。タンパク質のバンドは、クマシーブリリアントブルーでゲルを染色することで可視化し、ゲルから切り出して、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した後、トリプシンで断片化した。トリプシンペプチドをｓｈｏｒｔＯＤＳｃｏｌｕｍｎ（ＰｅｐＭａｐ１００；５μｍＣ１８、５ｍｍ×３００μｍＩＤ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてトラップし、ＯＤＳｃｏｌｕｍｎ（ＮａｎｏＨＰＬＣＣａｐｉｌｌａｒｙＣｏｌｕｍｎ、３μｍＣ１８、１２０ｍｍ×７５μｍＩＤ、日京テクノス社製）を用いたｎａｎｏ−ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ｎａｎｏＬＣ）で分離した。ｎａｎｏＬＣには、Ｕｌｔｉｍａｔｅ（商標）３０００ＲＳＬＣｎａｎｏｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用した。

分離における移動相は、溶媒Ａ（０．１％ギ酸）と溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）とした。流速３０μＬ／分で３分間、０．１％ＴＦＡでトラップカラムにトリプシンペプチドをロードした後、濃縮されたトリプシンペプチドをトラップカラムから溶出し、一連のアイソクラティック法と直線的濃度勾配法（０〜３分が溶媒Ａ、３〜３５分が０〜３５％（ｖ／ｖ）の溶媒Ｂ、そして１０分で９０％溶媒Ｂに増加して溶媒Ａで１５分の再平衡化）を用いて分離カラムで分離した。分離カラムからの溶出液をｎａｎｏＥＳＩソースに継続的に供給し、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で解析した。ＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルは、それぞれＯｒｂｉｔｒａｐ（マスレンジ：ｍ／ｚ３００〜１５００）及びＩｏｎｔｒａｐ（ＣＩＤを用いた上位５ピークのスキャン依存データ）を用いて陽イオンモードで取得した。

キャピラリソースの電圧は１．５ｋＶに設定し、トランスファーキャピラリの温度は２００℃に維持した。キャピラリ電圧及びチューブレンズ電圧は、それぞれ２０Ｖ及び８０Ｖとした。ＲＳＦ１のＯＲＦにコードされるトリプシンペプチドへのＭＳ／ＭＳデータの割り当ては、Ｘｃａｌｉｂｕｒプログラム（ｖｅｒ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行なった。

（結果）
図４はＲＳＦ１の構造タンパク質を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを示す。ＲＳＦ１のファージ粒子を構成するタンパク質に、ＯＲＦ４０、ＯＲＦ５１、ＯＲＦ４１及びＯＲＦ１９９由来のタンパク質が含まれていた。

比較のため、上記非特許文献１に開示されたジャンボファージＪ６（以下では、「ＲＳＬ２」とする）の構造タンパク質を同様に同定した。ＲＳＬ２はゲノムのサイズが約２２０ｋｂｐで、ＲＳＦ１と同様にファージ粒子がｍｙｏｖｉｒｕｓ型である。図５に示すように、ＲＳＬ２のファージ粒子を構成する構造タンパク質には、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットのＮ領域及びＣ領域をそれぞれコードするＯＲＦ３７及びＯＲＦ４８由来のタンパク質と、β’サブユニットのＣ領域をコードするＯＲＦ１９２由来のタンパク質が検出されたが、β’サブユニットのＮ領域をコードするＯＲＦ３８由来のタンパク質は検出されなかった。

（実施例６：ＲＳＦ１の宿主域の検討）
種々の青枯病菌株を用いた上記のプラークアッセイによって、ＲＳＦ１の宿主域を検討した。さらに、比較のため、ＲＳＬ２の宿主域も同様に検討した。

（結果）
表１は、ＲＳＬ２及びＲＳＦ１の宿主域を示す。ＲＳＬ２又はＲＳＦ１に対する感受性に関しては、「＋」は感受性があることを示し、「−」は感受性がない（抵抗性である）ことを示す。ＲＳＦ１は種々の植物を宿主植物とする１９種類の菌株に感染する。ＲＳＦ１が感染する菌株には、ＲＳＬ２が感染しないＰｓ６５、ＭＡＦＦ２１１５１４、ＭＡＦＦ３０１４８５及びＭＡＦＦ３０１５５８が含まれており、ＲＳＦ１は、ＲＳＬ２と比較して、日本由来の青枯病菌株に対して広い宿主域を示した。また、ＲＳＦ１は青枯病菌のみに感染し、腸内細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ及びグラム陽性菌などには感染しない。

（実施例７：ＲＳＦ１の感染サイクルの評価）
ワンステップ増殖法で感染サイクルを評価した。培養によりＯＤ６００が０．１に達したＭＡＦＦ７３０１３８株を遠心（６０００×ｇ）で回収し、最終培養液量が１０ｍＬとなるようにＣＰＧ培地に懸濁した（およそ１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ）。ＲＳＦ１をＭＯＩ＝０．１となるように加えて、２８℃で１０分間吸着させた。遠心後、当初の量のＣＰＧに試料を再懸濁し、最終液量が１０ｍＬになるように希釈系列を調製した。細胞を２８℃でインキュベーションした。試料を３０分ごとに採取し、タイターをプラークアッセイで決定した。

（結果）
細胞あたりのＲＳＦ１の数の経時変化を図６に示す。ＲＳＦ１は、ＭＡＦＦ７３０１３８株を宿主とした場合、潜伏期が９０分、かつ４時間の感染サイクルで、バーストサイズが約８０ｐｆｕ／細胞であった。なお、ＲＳＬ２の感染サイクルを同様に評価すると、潜伏期が１５０分、かつ４．５時間の感染サイクルで、バーストサイズが約４０〜５０ｐｆｕ／細胞であった。ＲＳＬ２は、ファージ粒子にビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットの一部を欠くため、初期の発現に宿主のＲＮＡポリメラーゼに依存するのに対し、ＲＳＦ１は、ファージ粒子にビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット及びβ’サブユニットをフルセットで有するため、潜伏期及び感染サイクルが短いと考えられる。これにより、ＲＳＦ１の感染効率が、ＲＳＬ２よりも高められている。

（実施例８：トマトにおけるＲＳＦ１の青枯病防除効果の評価）
青枯病菌株ＭＡＦＦ２１１５１４を、２８℃で１〜２日、ＣＰＧ培地で培養した。遠心後、細胞を１．５×１０^９細胞／ｍＬ（ＯＤ６００＝１．０）の濃度で滅菌水に懸濁した。５ｍＬの細胞懸濁液を、断根したトマト苗（ＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＬ．、品種「大型福寿」）のポット内の土壌に投与した（対照区）。なお、トマト苗として、葉が４〜６枚の１ヶ月苗を用いた。土壌１ｇあたりの細胞の濃度は、約１×１０^６ｃｆｕである。ファージ処理区には、細胞懸濁液を投与する１日前に、５ｍＬのＲＳＦ１懸濁液（１．５×１０^１０ｐｆｕ）を苗根部に添加した。

（結果）
図７（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ対照区及びファージ処理区のトマト苗に現れた病徴を示す。病徴指数「０」は変化なし、「１」は子葉から上に向かい第１葉が萎凋、「２」は第２葉が萎凋、「３」は第３葉が萎凋、「４」は第４葉が萎凋、「５」は枯死、を示す。図７（Ａ）に示すように、対照区のトマト苗には、細胞懸濁液の投与から約１週間後に顕著な青枯病の病徴が出現した。約２週間後には対照区のトマト苗の８０％が枯死した。一方、図７（Ｂ）に示すように、ファージ処理区では、３週間後でもトマト苗に変化がなかった。その後、ファージ処理区のトマト苗には、少し萎えた第１葉が若干観察されたがこれは青枯病の病徴とは異なっていた。ファージ処理区のトマト苗は、１ヶ月後でも青枯病の発症はなかった。また、潜在的に発生するＲＳＦ１に対する耐性菌は、病原性を喪失していると考えられる。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１５年１２月１７日に出願された日本国特許出願２０１５−２４５７７２号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２０１５−２４５７７２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明は、青枯病の防除、拡大防止又は青枯病菌の駆除に好適である。

Claims

ゲノムのサイズが２００，０００ｂｐ以上であって、
ファージ粒子を構成するタンパク質に、ビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットとビリオン関連ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットとを含み、
Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染する、
バクテリオファージ。
前記ゲノムには、
２種類以上の溶菌酵素がコードされている、
請求項１に記載のバクテリオファージ。
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１５年１２月１０日に受託された受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０２１７６で示されるＲＳＦ１である、
請求項１又は２に記載のバクテリオファージ。
請求項１から３のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含む、
青枯病防除剤。
請求項１から３のいずれか一項に記載のバクテリオファージと、
前記バクテリオファージと異なり、かつＲａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに感染するバクテリオファージと、
を含む、青枯病防除剤。
請求項４又は５に記載の青枯病防除剤を、植物又は植物成長媒体に投与する投与ステップを含む、
青枯病防除方法。