JP7440125B2 - バクテリオファージ、青枯病防除剤および青枯病防除方法 - Google Patents
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Description
バクテリオファージの分離:
土壌を水に懸濁した後、静置し、上清を得た。この上清を0.25μmのフィルターで濾過し、濾液を青枯病菌を宿主としたプラークアッセイに供試した。生じたプラークを単離する事でバクテリオファージRKP181を得た。
バクテリオファージRKP181の解析:
(1)電子顕微鏡解析
2X1011pfu/mLのファージ懸濁液を1%uranyl acetateで染色し、電子顕微鏡(JEM-1400Pus、日本電子社製)で撮影した。
フェノール・クロロホルム抽出によってファージ粒子からゲノムDNAを調整した。ゲノムのサイズを決めるため、精製したゲノムDNAに対して、0.3%アガロース(Agarose H、ニッポンジーン社製)を用いてMupid-2plus電気泳動装置(Mupid社製)でアガロースゲル電気泳動法を実施した。また、制限酵素EcoRI(東洋紡社製)およびEco81I(タカラバイオ社製)それぞれで処理をしたゲノムDNAに対して、0.8%アガロース(Agarose 1200 Standard Type、ピーエイチジャパン社製)または0.3%アガロース(Agarose H、ニッポンジーン社製)を用いてMupid-2plus電気泳動装置でアガロースゲル電気泳動法を実施した。
上記で精製したゲノムDNAを1本鎖DNA分解酵素(S1 Nuclease、プロメガ社製)およびDNA分解酵素(Recombinant DNase I、タカラバイオ社製)、RNA分解酵素(RNase A、タカラバイオ社製)、線状DNA分解酵素(BAL31 nuclease, ニュー・イングランド・バイオラボ社製)で処理し、上記実施例に記載の方法で電気泳動を実施した。また、ゲノムの末端構造は、線状DNA分解酵素(BAL31 nuclease)で経時的に処理したゲノムDNAを制限酵素Eco81I(タカラバイオ社)で処理し、上記実施例に記載の方法で電気泳動を実施し、決定した。
RKP181の全ゲノム塩基配列をPacBio RS II (PACIFIC BIOSCIENCES社製)によって決定した。決定した塩基配列のアセンブリをRS_HGAP Assembly2.3.0で行った。ゲノムの末端構造と末端配列の長さの推定にはPhageTerm(Galaxy)を用いた。また、末端重複配列をサンガー法(Applied Biosystems 3730xl DNA analyzer)によって決定した。全ゲノム配列による近縁株の検索はBLASTNによるホモロジー検索で実施した(表1)。オープンリーディングフレーム(ORF)はMiGAP ver2.23 (ライフサイエンス統合データベースセンター)におけるMetaGeneAnnotator 1.0 及び、tRNAscan-SE 1.23、BLAST 2.2.18を用いて推定した(表2)。さらに、検出されたORFの機能はMiGAP/BLASTおよびPSI-BLASTによるホモロジー検索で得られた最上位のものについてCOGおよびRefseq、TrEMBL、nrデータベースを用いることで予測した(表2)。DNA packaging protein B遺伝子のアミノ酸配列に基づく分子系統樹は、NCBIデータベースから近縁株のDNA packaging protein B遺伝子のアミノ酸配列を取得し、MEGA7.0.26のClustalWでアライメントし、Maximum Likelihood法で作成した(図2)。
PHASTERを用いてゲノム中の主要な遺伝子の地図を作成し、RKP181と特開2018-24589号公報のRalstonia phage RSB2(AB597179.1)とを比較した(図3)。また、比較ゲノムソフトLAGANを用いて、全塩基配列も比較した(図4)。
BLASTPを用いてRKP181の尾部繊維遺伝子がコードするORF45のアミノ酸配列(配列番号2)のホモロジー検索を行った(表3)。また、ORF45のアミノ酸配列と相同性のある公知の尾部繊維遺伝子産物をMEGA7.0.26のClustalWでアライメントし、Maximum Likelihood法で分子系統樹を作成した(図5)。さらにBLASTPを用いてORF45のドメインを検索した。T7の尾部繊維遺伝子(AAM43540.1)のファージ本体(tail tube)接続部位1-149アミノ酸配列とRKP181のORF45(配列番号2に記載)の1-148アミノ酸の相同性比較は、BLASTPによって行った。続いて、同定された2つのドメイン、すなわちN末端側のアミノ酸配列1-160とC末端側の161-711について、BLASTPによってホモロジー検索を行った(表4、表5)。RKP181とT7とRSB2の尾部繊維遺伝子産物の相同性比較は、NCBIのデータベースからRSB2の尾部繊維遺伝子(ORF46)の配列(BAJ51834.1)とT7の尾部繊維遺伝子gp17の配列(P03748.1)を取得し、MEGA7.0.26におけるClustalWを用いて、相同性比較を行った(図6)。
以上の結果より、バクテリオファージRKP181は以下の性質を有することが分かった。
・RKP181はカウドウイルス(Caudovirales)目ポドウイルス(podovirus)科T7様ウイルス属 (T7-like virus)に分類される。
・RKP181のゲノムは線状2本鎖DNAである。
・ゲノム構造は短鎖末端重複配列構造を有するT7型である。
・ゲノムサイズは39,200bp~39,500bpで、好ましくは39,455bp(2つの末端重複配列を含む)、または39,216bp(末端重複配列を一つ含む)。
・ゲノム末端には200~250bp、好ましくは239bpの末端重複配列があってもよい。
・GC含量は62.6%である。
・既知の最近縁株はRalstonia phage phiITL-1株で、相同性87%である。次いでRalstonia phage RSB2株で、相同性77%である。
・tail fiber proteinの宿主認識部位を含むC末端側のアミノ酸配列が配列番号1で示されるアミノ酸配列である。
青枯病菌の分離およびその防除:
(1)発病株からの分離
発病株の茎を切断し、菌泥を回収した。その菌泥を滅菌水で適当に希釈した。その希釈液を改変SMSA培地に塗布し、生じたコロニーをCPG寒天培地(1L当たりペプトン10g、カザミノ酸1g、グルコース5g、寒天1.7%)に分離した。
土壌と水をよく混合し、静置後、上清を分離した。分離した上清を水で適当に希釈し、その希釈液を改変SMSA培地に塗布した。生じたコロニーはCPG寒天培地に分離した。
<改変SMSA培地(1L当たり)>
ペプトン 10g
グルコース 5g
カザミノ酸 1g
寒天 18g
バシトラシン(10 mg/mL) 2.5mL
ポリミキシンB硫酸塩(50mg/mL) 2mL
クロラムフェニコール(10 mg/mL) 0.5mL
ぺニシリンGカリウム塩(1 mg/mL) 0.5mL
クリスタルバイオレット(1mg/mL) 5mL
テトラゾリウムクロライド(10mg/mL) 5ml
上記した方法によって1圃場から1株の青枯病菌を分離し、ナス科、ショウガ科、シソ科などを宿主とする計70株以上の青枯病菌株を分離した。
RKP181の宿主域の検討:
(1)感染の有無
感染の有無はプラークアッセイまたはスポットテストによって調べた。
青枯病菌をCPG培地(1L当たりペプトン10g、カザミノ酸1g、グルコース5g)で28℃、一晩培養した。この菌培養液をCPG培地でOD600が0.25となるよう調整した。また、ファージ液については段階希釈液を調整した。菌液とファージ希釈液を混合し、28℃で静置した。30分後、トップアガー(1L当たりペプトン3g、カザミノ酸0.3g、グルコース1.7g、寒天5g)3mlに上記の菌/ファージ混合液を混ぜ、CPG寒天培地に重層した。28℃で一晩培養後、感染の有無をプラークの有無で確認した。
CPG培地で28℃、一晩培養した青枯病菌培養液をCPG培地でOD600が0.25となるよう調整した。この菌液250μLとトップアガー3mlを混合し、CPG寒天培地に重層した。トップアガーが固まった後、ファージ液をスポットし、溶菌斑の有無を観察し、感染の有無を調べた。
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構農業生物資源ジーンバンク(茨城県つくば市)から入手可能な表6に記載の34株を含む自然界から分離したナス科、ショウガ科、シソ科などを宿主とする計100株以上の青枯病菌株全てに感染することが分かった。
ワンステップ増殖法による感染サイクルの評価
CPG培地でOD600が0.15となるまで培養した青枯病菌MAFF730131株の培養液990μLとRKP181ファージ液(2X1010pfu/mL)10μLを混合した後、室温で静置し、菌とファージを吸着させた。10分後、5,000Xgで10分間遠心し、上清を回収した後、プラークアッセイを行い、吸着したファージ数を算出した。沈殿物は1mLのCPG培地に再懸濁したのち、150μLを29,850μLのCPG培地に添加し、28℃で振盪培養した。振盪培養開始後から100分間、10分毎に10μLを採取し、990μLのCPG培地に混和した。混和後必要に応じ段階希釈し、直ちに10μLを採取し、OD600が0.22~0.24となるよう調整したMAFF730131株の培養液250μLに添加攪拌し、直ちに全量をトップアガーに加え、撹拌後CPG培地に重層した。生じたプラーク数を計測し、力価を算出した。各時間の力価と吸着したファージ数から1感染サイクルから生じるファージ数(バーストサイズ)を算出した。結果は図7に図示し、表7にまとめた。
遺伝的安定性:
RKP181を10世代継代増幅し、7個のプラークを単離した。単離した7個のファージを更にもう1世代増幅した上でゲノムを調整し、ゲノムサイズを上記電気泳動法によって確認した(図8:左)。さらに、調整したゲノムを制限酵素Eco81I処理し、制限パターンを調べ、上記実施例1の記載事項と違いないことを確認し、遺伝的に安定であることを明らかにした(図8:右)。
防除試験:
トマト大玉種世界一のセル苗(10株)に1X109pfu/mLのファージ液を5mL株元灌注した。対照区(10株)は無処理とした。6日後、ポットに定植するとともに、OD660=0.1(約1X108cfu/mL相当)に調整したMAFF730131株の菌培養液5mLを株元に灌注した。その後、22日間観察を続けた。結果を表8に示す。
青枯病防除剤の調製:
実施例1で分離したバクテリオファージRKP181を、1X109pfu/mLの力価に調整して青枯病防除剤とした。
Claims (8)
- tail fiber proteinの宿主認識部位を含むC末端側のアミノ酸配列が配列番号1で示されるアミノ酸配列であり、
青枯病菌に感染すること、
を特徴とする第1群、カウドウイルス目、ポドウイルス科に属するバクテリオファージ。 - 頭部の径が30~90nmであり、尾部の長さが5~30nmであり、幅が5~20nmであり、
ゲノム鎖が2本鎖であり、
ゲノムサイズが6,000~280,000bpであり、
GC含量が55~75%であり、
10~330個の遺伝子を有し、
ゲノムDNAが制限酵素Eco 81 Iにより断片となる請求項1に記載のバクテリオファージ。 - 青枯病菌が、MAFF107624株、MAFF211266株、MAFF211270株、MAFF211543株、MAFF301859株、MAFF311644株、MAFF730103株、MAFF730131株、MAFF302745株、MAFF311632株、MAFF211536株、MAFF331041株、MAFF730139株、MAFF211280株、MAFF211533株、MAFF211468株、MAFF211516株、MAFF311101株、MAFF311102株、MAFF211479株、MAFF211471株、MAFF211483株、MAFF211484株、MAFF211486株、MAFF211272株、MAFF211276株、MAFF211278株、MAFF211490株、MAFF211492株、MAFF211497株、MAFF211476株、MAFF211414株、MAFF211429株およびMAFF301558株である請求項1または2に記載のバクテリオファージ。
- RKP181(NITE BP-03186)である請求項1~3の何れか1に記載のバクテリオファージ。
- 請求項1~4の何れか1に記載のバクテリオファージを有効成分とする青枯病防除剤。
- 請求項5記載の青枯病防除剤を植物または植物生長媒体に投与することを特徴とする植物の青枯病防除方法。
- 配列番号1で示されるtail fiber proteinの宿主認識部位を含むC末端側のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 配列番号1で示されるtail fiber proteinの宿主認識部位を含むC末端側のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸。
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