CN113498338A - 非染色体动态活性系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了分离的非染色体动态活性系统(ADAS)，包括高活性ADAS。本发明提供的这些ADAS可以通过各种方式获得。提供了制备和使用这些ADAS的各种相关方法。
Description
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年12月10日，名为51296-033WO2_Sequence_Listing_12.10.19_ST25，并且大小为51,393字节。
技术领域
本文提供了非染色体动态活性系统以及其制造和使用方法。
背景技术
需要能够靶向细胞并递送生物试剂的递送载体，含有此类递送载体的组合物，以及将所述载体递送至细胞，从而调节包括动物、植物和昆虫细胞、组织和生物体的生物系统的相关方法。
发明内容
本发明尤其提供了非染色体动态活性系统(ADAS)，例如，包含异源负载物的ADAS、其制备方法、含有其的组合物、以及递送ADAS和/或负载物和调节生物系统的相关方法。本发明至少部分基于申请人对在某些实施例中活性增强的非染色体动态活性系统(ADAS)(即，高活性ADAS)的发现。这些高活性ADAS具有提高的工作能力，这些工作诸如化学工作、蛋白质产生或递送负载物。
在一方面，本披露的特征在于一种用于制备包含多种ADAS的组合物的方法，该组合物基本上不含活细菌细胞，该方法包括：(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件，从而产生这些ADAS；以及(c)将这些ADAS与这些亲代细菌分离，从而产生包含多种ADAS的组合物，该组合物基本上不含活细菌细胞。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少40％同一性的多肽。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQID NO:1具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为minE多肽。
在一些实施例中，这些亲代细菌为大肠杆菌，并且该minE多肽为大肠杆菌minE。在其他实施例中，这些亲代细菌为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，并且该minE多肽为鼠伤寒沙门氏菌minE。
在一些实施例中，这些亲代细菌的Z-环抑制蛋白的水平或活性降低。在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少40％同一性的多肽。在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少40％同一性的多肽。在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的多肽。
在以上方面的一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为minC多肽或minD多肽。
在以上方面的一些实施例中，这些ADAS的至少两种Z-环抑制蛋白的表达降低，例如，minC多肽和minD多肽的表达降低。
在一些实施例中，这些ADAS的minC多肽、minD多肽和minE多肽的表达降低。
在以上方面的其他实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ IDNO:4具有至少40％同一性，例如与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA多肽。
在一些实施例中，这些亲代细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为枯草芽孢杆菌DivIVA。
在以上方面的一些实施例中，该水平或活性的降低由功能丧失突变引起。在一些实施例中，该功能丧失突变为minCDE操纵子缺失或DiVIVA缺失。
在以上方面的一些实施例中，这些ADAS的初始ATP浓度为至少1mM、1.2nM、1.3nM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、10mM、20mM、30mM或50mM。
在以上方面的一些实施例中，这些亲代细菌为以下中的任一种：埃希氏菌属(Escherichia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、鱼腥藻属(Anabaena)、产水菌属(Aquifex)、固氮弓菌属(Azoarcus)、固氮菌属(Azotobacter)、鲍特菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、伯克氏菌属(Burkholderia)、暂定种(Candidatus)、色杆菌属(Chromobacterium)、鳄球藻属(Crocosphaera)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、脱硫小杆菌属(Desulfotalea)、欧文氏菌属(Erwinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、粘杆菌属(Gloeobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、极地单胞菌属(Polaromonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、长命菌属(Rubrivivax)、沙门氏菌属(Salmonella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、志贺氏菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、栖热孢菌属(Thermotoga)、栖热菌属(Thermus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、束毛藻属(Trichodesmium)、弧菌属(Vibrio)、魏格沃斯菌属(Wigglesworthia)、沃廉菌属(Wolinella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳杆菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、嗜热梭菌属(Symbiobacterium)或热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为这些亲代细菌的内源minE或DivIVA。
在以上方面的一些实施例中，步骤(c)的该组合物包含少于100个菌落形成单位(CFU/mL)的活细菌细胞，例如，少于10CFU/mL、少于1CFU/mL或少于0.1CFU/mL的活细菌细胞。
在以上方面的一些实施例中，这些ADAS包含负载物。
在以上方面的一些实施例中，配制该组合物以递送至动物；配制以递送至植物；配制以递送至昆虫，和/或配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在另一方面，本披露的特征在于一种包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。在一些实施例中，这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.2nM、1.3nM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、2mM或2.5mM。
在仍另一方面，本披露的特征在于一种包含多种高活性ADAS的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少3mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
在一些实施例中，该具有ADAS的组合物的初始ATP浓度为至少4mM、5mM、10mM、20mM、30mM或50mM。
在该组合物的一些实施例中，在37℃下孵育12小时后，这些ADAS的ATP浓度增加至少50％、至少60％、至少75％、至少100％、至少150％或至少200％。
在该组合物的一些实施例中，这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌。
在仍其他方面，本发明的特征在于一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS不包含细胞分裂拓扑特异性因子，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
在又另一方面，本发明的特征在于一种包含多种ADAS的组合物，该组合物基本上不含活细菌细胞，并且通过包括以下的方法产生：(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件，从而产生这些高活性ADAS；以及(c)将这些ADAS与这些亲代细菌分离，从而产生基本上不含活细菌细胞的组合物。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少40％同一性的多肽。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为minE多肽。
在一些实施例中，这些亲代细菌为大肠杆菌，并且该minE多肽为大肠杆菌minE。
在一些实施例中，这些亲代细菌为鼠伤寒沙门氏菌，并且该minE多肽为鼠伤寒沙门氏菌minE。
在一些实施例中，这些亲代细菌为埃希氏菌属、不动杆菌属、农杆菌属、鱼腥藻属、产水菌属、固氮弓菌属、固氮菌属、鲍特菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、暂定种、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、极地单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通氏菌属、长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、栖热孢菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽孢杆菌属、嗜热梭菌属或热厌氧杆菌属，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为这些亲代细菌的内源minE或DivIVA。
在一些实施例中，这些ADAS的Z-环抑制蛋白的水平降低。
在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少40％同一性的多肽。
在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少40％同一性的多肽。
在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为minC多肽。
在一些实施例中，该Z-环抑制蛋白为minD多肽。
在一些实施例中，这些ADAS的至少两种Z-环抑制蛋白的表达降低。
在一些实施例中，这些ADAS的minC多肽和minD多肽的表达降低。
在一些实施例中，这些ADAS的minC多肽、minD多肽和minE多肽的表达降低。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少40％同一性的多肽。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA多肽。
在一些实施例中，这些亲代细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为枯草芽孢杆菌DivIVA。
在一些实施例中，该水平或活性的降低由功能丧失突变引起。
在一些实施例中，该功能丧失突变为基因缺失。
在一些实施例中，该功能丧失突变为诱导型功能丧失突变，并且其中通过将该亲代细胞暴露于诱导条件来诱导功能丧失。
在一些实施例中，该诱导型功能丧失突变为温度敏感性突变，并且其中该诱导条件为温度条件。
在一些实施例中，该亲代细胞具有minCDE操纵子缺失。
在一些实施例中，这些ADAS包含功能性转录系统和功能性翻译系统。
在一些实施例中，这些ADAS产生异源蛋白。
在一些实施例中，这些ADAS包含质粒，该质粒包含诱导型启动子和编码该异源蛋白的核苷酸序列，并且其中在适当条件下使这些ADAS与该诱导型启动子的诱导物接触引起该异源蛋白的产生。
在一些实施例中，在已与该诱导物接触的ADAS中，相对于尚未与该诱导物接触的ADAS，该异源蛋白的产生增加了至少1.6倍。
在一些实施例中，该异源蛋白的产生速率在这些ADAS与该诱导物接触3小时内达到目标水平。
在一些实施例中，该异源蛋白以至少0.1毫微微克/小时/ADAS的速率产生。
在一些实施例中，该异源蛋白产生了至少8小时的持续时间。
在一些实施例中，该组合物包含少于100个菌落形成单位(CFU/mL)的活细菌细胞。
在一些实施例中，该组合物包含少于10CFU/mL、少于1CFU/mL或少于0.1CFU/mL的活细菌细胞。
在一些实施例中，这些ADAS包含负载物。
在一些实施例中，该负载物为核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP)。
在一些实施例中，该负载物被这些ADAS包封。
在一些实施例中，该负载物附接于这些ADAS的表面。
在一些实施例中，该核酸为DNA、RNA或质粒。
在一些实施例中，该核酸编码蛋白质。
在一些实施例中，该酶改变底物以产生靶产物。
在一些实施例中，该底物存在于这些ADAS中，并且其中该靶产物在这些ADAS中产生。
在一些实施例中，该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。
在一些实施例中，这些ADAS包含异源细菌分泌系统。
在一些实施例中，该异源细菌分泌系统为3型分泌系统(T3SS)。
在一些实施例中，该负载物包含引导该细菌分泌系统输出的部分。
在一些实施例中，这些ADAS包含靶向部分。
在一些实施例中，该靶向部分为纳米抗体、碳水化合物结合蛋白或肿瘤靶向肽。
在一些实施例中，相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的蛋白酶水平或活性降低。
在一些实施例中，这些ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种蛋白酶的表达的亲代细菌产生。
在一些实施例中，相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的RNA酶水平或活性降低。
在一些实施例中，这些ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种RNA酶的表达的亲代细菌产生。
在一些实施例中，该RNA酶为内切核糖核酸酶或外切核糖核酸酶。
在一些实施例中，这些ADAS已经修饰以具有减少的脂多糖(LPS)。
在一些实施例中，这些ADAS由已经修饰以具有减少的LPS的亲代细菌产生。
在一些实施例中，该修饰为脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶(msbB)突变。
在一些实施例中，这些ADAS衍生自作为哺乳动物的病原体的亲代细菌，或衍生自与哺乳动物共生的亲代细菌。
在一些实施例中，这些哺乳动物共生细菌为葡萄球菌属(Staphylococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)或放线菌属(Actinomyces)物种，或这些哺乳动物病原细菌为肠出血性大肠杆菌(Escherichiacoli)(EHEC)、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、耶尔森氏肠杆菌(Yersinia enterolitica)或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
在一些实施例中，ADAS衍生自作为植物病原体的亲代细菌，或衍生自与植物共生的亲代细菌。
在一些实施例中，植物共生细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或恶臭假单胞菌(Psuedomonas putida)，或这些植物病原细菌为黄单胞菌属(Xanthomonas)物种或丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
在一些实施例中，ADAS衍生自营养缺陷型亲代细菌。
在一些实施例中，将这些ADAS冻干并重构，并且其中这些经重构ADAS的ATP浓度为未冻干ADAS的ATP浓度的至少95％。
在一些实施例中，这些经重构ADAS的ATP浓度至少等于未冻干ADAS的ATP浓度。
在一些实施例中，配制该组合物以递送至动物。
在一些实施例中，配制该组合物以腹膜内、静脉内、肌肉内、口服、局部、气雾化或雾化施用。
在一些实施例中，配制该组合物以递送至植物。
在一些实施例中，配制该组合物以递送至昆虫。
在一些实施例中，将该组合物配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在另一方面，本发明的特征在于一种用于将高活性ADAS递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性ADAS的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在仍另一方面，本发明的特征在于一种用于将ADAS递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在关于递送此多种ADAS的方法的一些实施例中，该靶细胞为动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
在又另一方面，本发明的特征在于一种用于将负载物递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在仍另一方面，本发明的特征在于一种用于将负载物递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在关于递送负载物的实施例中，该靶细胞为动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
在仍另一方面，本发明的特征在于一种调节植物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节植物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
在仍另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
在仍另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
在治疗该动物的一些实施例中，该动物患有癌症。
在一些实施例中，这些ADAS携带化疗负载物(例如，免疫疗法负载物)。
在又另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物或其有害生物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
在又另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物或其有害生物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS包含酶，并且其中该酶改变底物以产生靶产物。
在此组合物的一些实施例中，该底物存在于这些ADAS中，并且其中该靶产物在这些ADAS中产生。
在一些实施例中，该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。
在一些实施例中，该酶为二腺苷酸环化酶A，该底物为ATP，并且该靶产物为环二AMP。
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
附图说明
图1A为一组扫描电子显微照片，该组扫描电子显微照片显示了大肠杆菌亲代细菌细胞和由其衍生的非染色体动态活性细胞(ADAS)。左栏显示了大肠杆菌菌株MACH009的细菌细胞，该菌株尚未经修饰而不能产生ADAS。中栏显示了大肠杆菌菌株MACH060(ΔminCDE)的细菌细胞，该菌株经修饰以产生ADAS。可以看到ADAS和经历异常分隔事件的亲代细胞。右栏显示从MACH060(ΔminCDE)培养物纯化的ADAS。
图1B为一组显微照片，该组显微照片显示了衍生自MACH060(ΔminCDE)的ADAS。左图为显示粒子的位置的相位衬度图像。中图为显示DNA染色剂DAPI的定位的免疫荧光图像。右图为显示脂多糖(LPS)的染色剂的定位的免疫荧光图像。白色箭头指示ADAS，这些ADAS通过存在LPS染色和不存在DAPI染色来鉴别。标尺为10μm。
图1C为显示如使用
nCS1纳米粒子分析仪所测量，来自ADAS产生大肠杆菌菌株MACH124(ΔminCDE)的ADAS的经纯化群体中给定直径的粒子的浓度(个粒子/mL)的曲线。
图1D为显示经纯化ADAS制剂中直径为200与2000nm之间的粒子的聚集体体积的条形图。
图1E为显示以菌落形成单位(CFU)/mL计的浓度的在MACH124(ΔminCDE)培养物中以及从该培养物纯化的ADAS制剂中存在的活细菌细胞的条形图。
图1F为ADAS产生大肠杆菌菌株MACH060和MACH200(两者均为ΔminCDE)的培养物中以及从每种培养物纯化的ADAS制剂中DnaK和GroEL的免疫印迹的图像。提供10ng经纯化DnaK和GroEL作为对照(重组蛋白(Recomb.Prot.))。
图2A为显示如使用BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定所测量，来自大肠杆菌菌株MACH060(ΔminCDE)的ADAS的经纯化群体中ATP的平均浓度(mMol)的条形图。减去作为背景的亲代细菌产生的ATP浓度。
图2B为显示如使用BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定所测量，来自大肠杆菌菌株MACH060(ΔminCDE)的ADAS的经纯化群体的等分试样在0小时时或在37℃下在过量营养存在下振荡孵育2小时后的发光的条形图。
图2C为显示在MACH124(ΔminCDE)培养物中以及从该培养物纯化的ADAS制剂中GFP荧光(au)随时间变化的曲线，该MACH124(ΔminCDE)培养物和这些ADAS制剂在活化GFP表达的诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。亲代细菌的浓度等于在ADAS制剂中检测的CFU的数量(100CFU/mL)。
图2D为显示针对如使用
nCS1纳米粒子分析仪所测量的制剂中的ADAS数量归一化的图2C的GFP荧光数据的曲线。数据在曲线中以每108个ADAS粒子的诱导倍数显示。
图2E为显示图2C的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图2F为来自经纯化ADAS制剂的250μL等分试样中GFP的免疫印迹的一组图像，该ADAS制剂从MACH124(ΔminCDE)纯化并在诱导物无水四环素存在下生长0、2、4、17或24小时(上图)。如通过nCS1分析所确定，每个泳道对应于约5.2×107ADAS。GFP强度通过密度测定法定量，针对装载对照GroEL的强度归一化，并通过与在同一印迹上处理的经纯化重组GFP的分子标准品进行比较，转化为GFP的质量(ng)(下图)。
图3A为显示从MACH124(ΔminCDE)、MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)大肠杆菌亲代细菌菌株纯化的ADAS制剂中每108个ADAS粒子的GFP荧光(au)随时间变化的曲线。在诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育ADAS，该无水四环素活化GFP的表达。GFP荧光通过从每个诱导的重复样减去未诱导的重复样的平均值来计算。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。
图3B为显示图3A的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图3C为ADAS中GFP的免疫印迹的图像，该ADAS从MACH124(ΔminCDE)、MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)纯化并在诱导物无水四环素存在(+)或不存在(-)下生长。
图3D为显示图3C的免疫印迹的背景校正的条形图。
图3E为显示图3C的免疫印迹的归一化GFP密度的条形图。GFP强度通过密度测定法定量，并针对装载对照GroEL的强度归一化。
图3F为显示如使用
微孔板读取器所测量，从MACH124(ΔminCDE)、MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)纯化的ADAS中总GFP产生(荧光单位(au))的条形图。**指示p值为0.0021。***指示p值为0.0006。
图3G为显示从MACH124(ΔminCDE)、MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)纯化的ADAS中每小时GFP产生的条形图。
图3H为显示相对于从MACH124(ΔminCDE)产生的ADAS，从MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)纯化的ADAS中GFP产生百分比的条形图。将MACH124的蛋白质产生水平设定为100％，并且将MACH556和MACH557的相对蛋白质产生针对MACH124归一化。
图4为显示针对培养物的光密度(OD600)归一化的从MACH060和MACH284纯化的ADAS的DyLightTM550荧光团的荧光的条形图。MACH284表达可通过与DyLightTM550荧光团缀合的抗体检测的Neae-NB2(纳米抗体)融合蛋白。
图5A为显示THP1-DualTM单核细胞中THP1-DualTM系统的发光读数的条形图，这些THP1-DualTM单核细胞与从MACH060纯化的ADAS、从MACH198纯化的未诱导的ADAS和从MACH198纯化的已经用无水四环素诱导以产生酶去腺苷酸环化酶A(DacA)的ADAS接触。
图5B为显示THP1-DualTM单核细胞的表型的一组显微照片，这些THP1-DualTM单核细胞与从MACH060纯化的ADAS、从MACH198纯化的未诱导的ADAS和从MACH198纯化的已经用无水四环素诱导以产生酶DacA的ADAS接触。
图5C为显示如使用ELISA测定所测量，由THP1-DualTM单核细胞分泌到培养物中的干扰素β(IFN-B1)的浓度(pg/mL)的条形图，这些THP1-DualTM单核细胞与从MACH060纯化的ADAS、从MACH198纯化的未诱导的ADAS和从MACH198纯化的已经用无水四环素诱导以产生酶DacA的ADAS接触。
图6为显示欧洲玉米螟(European Corn Borer，ECB)幼虫中衍生自MACH301的DyLightTM800NHS酯标记的ADAS的荧光的一组显微照片。图A和图B显示DyLightTM800的荧光。图C和图D显示在700nm下幼虫自发荧光。图A和图C显示喂养PBS的对照幼虫，并且图B和图D显示喂养DyLightTM800NHS酯标记的ADAS的幼虫。
图7A为显示从MACH124(ΔminCDE)大肠杆菌亲代细菌菌株纯化的ADAS制剂中每108个ADAS粒子的GFP荧光(au)随时间变化的曲线，其中将该ADAS制剂在4℃下储存0天或3天。在诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育ADAS，该无水四环素活化GFP的表达。GFP荧光通过从每个诱导的重复样减去未诱导的重复样的平均值来计算。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。
图7B为显示从MACH556(ΔminC)大肠杆菌亲代细菌菌株纯化的ADAS制剂中每108个ADAS粒子的GFP荧光(au)随时间变化的曲线，其中将该ADAS制剂在4℃下储存0天或3天。在诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育ADAS，该无水四环素活化GFP的表达。GFP荧光通过从每个诱导的重复样减去未诱导的重复样的平均值来计算。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。
图7C为显示从MACH557(ΔminD)大肠杆菌亲代细菌菌株纯化的ADAS制剂中每108个ADAS粒子的GFP荧光(au)随时间变化的曲线，其中将该ADAS制剂在4℃下储存0天或3天。在诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育ADAS，该无水四环素活化GFP的表达。GFP荧光通过从每个诱导的重复样减去未诱导的重复样的平均值来计算。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。
图7D为显示图7A的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图7E为显示图7B的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图7F为显示图7C的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图7G为显示从MACH124(ΔminCDE)大肠杆菌亲代细菌菌株纯化的ADAS制剂中每108个ADAS粒子的GFP荧光(au)随时间变化的曲线，其中将该ADAS制剂冻干，储存6周并再水化。在诱导物无水四环素(100ng/mL)存在或不存在下孵育ADAS，该无水四环素活化GFP的表达。GFP荧光通过从每个诱导的重复样减去未诱导的重复样的平均值来计算。所有样品均在抗生素存在下生长，以阻止任何细菌生长。
图7H为显示图7G的诱导和未诱导的ADAS制剂之间的GFP荧光的倍数变化的曲线。倍数变化通过将诱导的重复样的平均值除以未诱导的重复样的平均值来计算。
图8A为显示ADAS制剂中亲代细菌细胞的数量(CFU/mL)的条形图，这些ADAS制剂从对照大肠杆菌亲代细菌细胞系MACH060或储存在无组氨酸和无甲硫氨酸培养基中的营养缺陷型大肠杆菌亲代细菌细胞系MACH002纯化。
图8B为显示ADAS制剂中亲代细菌细胞的数量(CFU/mL)的条形图，这些ADAS制剂从对照大肠杆菌亲代细菌细胞系MACH178或储存在无亮氨酸培养基中的营养缺陷型大肠杆菌亲代细菌细胞系MACH151纯化。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，术语“非染色体动态系统”或“ADAS”是指包含至少一个膜并且具有适用于容纳负载物(例如，以下中的一种或多种：核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP))的内部体积的无基因组非复制封闭膜系统。在一些实施例中，ADAS为衍生自亲代细菌细胞(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)的微型细胞或经修饰微型细胞。可以使用任何合适的方法，例如对亲代细胞进行遗传操作或者暴露于提高细菌微型细胞形成可能性的培养物或条件来从亲代细菌衍生ADAS。用于制备ADAS的示例性方法为破坏亲代细胞的细胞分裂机构的方法。在一些实施例中，ADAS可以包含亲代细胞表面的一种或多种内源或异源特征，例如，细胞壁、细胞壁修饰、鞭毛或菌毛，和/或亲代细胞内部体积的一种或多种内源或异源特征，例如，核酸、质粒、蛋白质、小分子、转录机构或翻译机构。在其他实施例中，ADAS可以缺乏亲代细胞的一种或多种特征。在仍其他实施例中，ADAS可以装载亲代细胞不包含的特征，或以其他方式被该特征修饰。
如本文所用，术语“高活性ADAS”是指具有高工作潜力的ADAS，例如，具有执行大量有用工作的能力的ADAS。工作可以为代谢工作，包括在合适条件下(例如，蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、聚合物或小分子的)化学合成、(例如，蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、聚合物或小分子的)化学修饰或转运(例如，输入、输出或分泌)。在某些实施例中，高活性ADAS以大量能量开始，例如，ATP形式的能量。在其他实施例中，ADAS具有从另一个来源吸收或产生能量/ATP的能力。可以通过以下鉴别高活性ADAS，例如，ATP浓度增加，产生ATP的能力增加，产生蛋白质的能力增加，蛋白质的产生速率或量增加，和/或对生物信号的反应性，例如，诱导启动子增加。
如本文所用，术语“亲代细菌细胞”是指从中衍生ADAS的细胞(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)。亲代细菌细胞典型地为活细菌细胞。术语“活细菌细胞”是指含有基因组并且能够进行细胞分裂的细菌细胞。优选的亲代细菌细胞衍生自表4中的任何菌株。
“基本上不含”亲代细菌细胞和/或活细菌细胞的ADAS组合物或制剂在本文中定义为具有不超过500个，例如，400个、300个、200个、150个、100个或更少的菌落形成单位(CFU)/mL的组合物。基本上不含亲代细菌细胞或活细菌细胞的ADAS组合物可以包括少于50、少于25、少于10、少于5、少于1、少于0.1或少于0.001CFU/mL。不包含细菌细胞。
术语“细胞分裂拓扑特异性因子”是指细菌物种中细胞分裂机构的一种组分，该组分参与确定隔膜的位点，并且通过限制细胞分裂机构的其他组分的位置，例如限制一个或多个Z-环抑制蛋白的位置来起作用。示例性细胞分裂拓扑特异性因子包括minE，该minE在大肠杆菌中首次发现，并且已经在大量革兰氏阴性细菌物种和革兰氏阳性细菌物种中鉴别(Rothfield等人,Nature Reviews Microbiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。minE通过将Z-环抑制蛋白minC和minD限制于细胞的极而起作用。第二示例性细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA，其在枯草芽孢杆菌中首次发现(Rothfield等人,Nature ReviewsMicrobiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。
术语“Z-环抑制蛋白”是指细菌物种中细胞分裂机构的一种组分，该组分参与确定隔膜的位点，并且通过抑制稳定FtsZ环的形成或将此种组分锚定至膜来起作用。Z-环抑制蛋白的定位可以通过细胞分裂拓扑特异性因子，例如MinE和DivIVA来调节。示例性Z-环抑制蛋白包括minC和minD，minC和minD在大肠杆菌中首次发现，并且已经在大量革兰氏阴性细菌物种和革兰氏阳性细菌物种中鉴别(Rothfield等人,Nature Reviews Microbiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005)。在大肠杆菌中和在其他物种中，minC、minD和minE存在于相同的遗传基因座中，该遗传基因座可以称为“min操纵子”、minCDE操纵子或min或minCDE遗传基因座。
如本文所用，术语“细胞拓扑特异性因子的水平或活性降低”是指通过标准方法检测，与参考样品(例如，由野生型细胞或具有野生型minCDE操纵子或野生型divIVA基因的细胞产生的ADAS)、参考细胞(例如，野生型细胞或具有野生型minC、minD、minE、divIVA或minCDE基因或操纵子的细胞)、对照样品或对照细胞中的水平相比，细胞拓扑特异性因子(例如，蛋白质或核酸(例如，基因或mRNA))的水平或活性总体降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多中的任一个。在一些实施例中，降低的水平或活性是指样品中的水平或活性降低，该水平或活性为参考样品、参考细胞、对照样品或对照细胞中细胞拓扑特异性因子的水平或活性的至少约0.9x、0.8x、0.7x、0.6x、0.5x、0.4x、0.3x、0.2x、0.1x、0.05x或0.01x。
如本文所用，术语“同一性百分比”是指通过标准技术比对后相对于参考多核苷酸或多肽序列的序列同一性百分比(％)。用于确定核酸或氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以在本领域技术人员能力范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、PSI-BLAST或Megalign软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较计算机程序BLAST产生序列同一性值百分比。作为说明，给定核酸或氨基酸序列A与、相比于或相对于给定核酸或氨基酸序列B的序列同一性百分比(其可以替代地表达为如下短语：与、相比于或相对于给定核酸或氨基酸序列B具有某种序列同一性百分比的给定核酸或氨基酸序列A)如下计算：
100×(分数X/Y)
其中X为在序列比对程序(例如，BLAST)比对A与B中被该程序评分为同一匹配的核苷酸或氨基酸的数量，并且其中Y为B中核苷酸或氨基酸的总数。在一些实施例中，例如，在MinE或DivIVA蛋白的同源物中，与本文披露的天然序列MinE(或minE)或DivIVA(或divIVA)序列的序列同一性将具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或甚至95％或更大的氨基酸或核酸序列同一性，替代地，至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列或核酸同一性。
如本文所用的短语“调节细胞的状态”是指如使用测量领域中已知的技术和方法(例如测量蛋白质、转录物、表观遗传标志物的水平或表达，或者测量生物路径活性的增加或减少的方法)所测量，细胞(例如，动物、植物或昆虫细胞)的状态(例如，转录组、蛋白质组、表观基因组、生物学效应或者健康或疾病状态)的可观察变化。调节细胞的状态可以引起相对于施用前变化至少1％(例如，相对于施用前至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少98％或更多；例如，相对于施用前高达100％)。在一些实施例中，调节细胞的状态涉及细胞提高细胞的参数(例如，蛋白质、转录物的水平或表达，或者生物路径的活性)。增加细胞的状态可以引起参数相对于施用前增加至少1％(例如，相对于施用前，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少98％或更多；例如，相对于施用前高达100％)。在其他实施例中，调节状态涉及降低细胞的参数(例如，蛋白质、转录物的水平或表达，或者生物路径的活性)。降低细胞的状态可以引起参数相对于施用前降低至少1％(例如，相对于施用前至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少98％或更多；例如，相对于施用前高达100％)。
如本文所用，术语“异源”是指并非天然存在状态下的细胞或组合物所固有的。在一些实施例中，“异源”是指分子；例如，负载物或有效负载(例如，多肽；核酸，诸如编码蛋白质的RNA或tRNA；或者小分子)或者不天然存在于ADAS或从中产生ADAS的亲代细菌(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)中的结构(例如，质粒或基因编辑系统)。
II.组合物
A.ADAS及高活性ADAS
本发明至少部分基于申请人对非染色体动态活性系统(ADAS)，包括高活性ADAS的发现，这些系统能够在大量环境中提供多种功能。“ADAS”为包含至少一个膜(在一些实施例中，两个膜，其中两个膜是不相交的)并且具有适用于容纳负载物(例如，核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP))的内部体积的无基因组非复制封闭膜系统。
在一些实施例中，ADAS为衍生自亲代细菌细胞(例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞)的微型细胞或经修饰微型细胞。可以使用任何合适的方法，例如对亲代细胞进行遗传操作或者暴露于提高细菌微型细胞形成可能性的培养物或条件来从亲代细菌衍生ADAS。
在一些实施例中，ADAS具有约100nm-500μm(例如，在某些实施例中，约：100-600nm，诸如，100-400nm；或约0.5-10μm和10-500μm之间)的长轴截面。在某些实施例中，ADAS的短轴截面在长轴的约：0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％至100％之间。在某些实施例中，ADAS的内部体积为约：0.001-1μm3、0.3-5μm3、5-4000μm3或4000-50x 107μm3之间。
在一些实施例中，本发明提供高活性ADAS。“高活性ADAS”为具有高工作潜力的ADAS，例如，具有执行大量有用工作的能力的ADAS。工作可以定义为例如，代谢工作，包括在合适条件下化学合成(例如，蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、聚合物或小分子的合成)、化学修饰(例如，蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、聚合物或小分子的修饰)或转运(例如，输入、输出或分泌)。在一些实施例中，高活性ADAS以大量能量开始，例如，三磷酸腺苷(ATP)形式的能量。在其他实施例中，ADAS具有从另一个来源吸收或产生能量(例如，ATP)的能力。术语“本发明提供的ADAS”涵盖本文描述的ADAS的所有实施例，包括特定实施例中的高活性ADAS，该组可以称为“本发明提供的高活性ADAS”，其为本发明提供的ADAS的亚组。
在一方面，本发明提供一种包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
在另一方面，本发明提供一种包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少3mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
在一些实施例中，高活性ADAS的初始ATP浓度为至少1nM、1.1.nM、1.2nM、1.3nM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、2mM、2.5mM、3nM、3.5nM、4mM、5mM、10mM、20mM、30mM或50mM。ATP浓度可以通过各种方式评价，包括某些实施例中关于裂解的ADAS的BacTiter-GloTM测定(普洛麦格公司(Promega))。
高活性可以另外或替代地以ADAS中ATP浓度随时间增加的速率或量评定。在一些实施例中，在合适的条件下孵育，例如在37℃下孵育12小时后，ADAS的ATP浓度增加至少50％、至少60％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％或超过200％。在某些实施例中，高活性ADAS的ATP产生速率在至少约：1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、1周或2周内大于约：0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2、3、5、10、15、20、30、40、50、75、100、200、300、500、1000、10000ATP/sec/nm2。
在其他方面，高活性以ATP浓度随时间的降低速率评定。在一些实施例中，高活性ADAS中的ATP浓度可能降低得慢于非高活性ADAS中的情况。在一些实施例中，例如如使用BacTiter-GloTM测定(普洛麦格公司(Promega))所测量，与初始ATP浓度(例如，每细胞体积的ATP)相比，制备后24小时的ADAS或ADAS组合物中的ATP浓度下降小于约50％(例如，小于约：45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。
高活性可以另外或替代地以ADAS的寿命指数评定。寿命指数以24小时与30分钟时的GFP产生速率的比率计算。在一些实施例中，高活性ADAS的寿命指数大于约：0.13、0.14、0.15、0.16、0.18、0.2、0.25、0.3、0.35、0.45、0.5、0.60、0.70、0.80、0.90、1.0或更高。在更特定实施例中，在含有具有物种适当启动子的功能性GFP质粒的ADAS中测量寿命指数，其中在30分钟和24小时时，用板读取器测量相对于ADAS的数量、每个ADAS的平均质粒数量和溶液体积的GFP浓度。
在一些方面，ADAS产生蛋白质，例如异源蛋白。在一些方面，高活性以产生蛋白质的速率、量或持续时间或者诱导蛋白质表达(例如，ADAS对信号的反应)的速率评定。例如，这些ADAS可以包含质粒，该质粒包含诱导型启动子和编码该异源蛋白的核苷酸序列，其中在适当条件下使这些ADAS与该诱导型启动子的诱导物接触引起该异源蛋白的产生。在一些方面，在已与该诱导物接触的ADAS，例如，高活性ADAS中，相对于尚未与该诱导物接触的ADAS，该异源蛋白的产生增加了至少1.6倍。例如，在一些实施例中，在已与该诱导物接触的ADAS，例如，高活性ADAS中，异源蛋白的产生增加了至少1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或超过10倍。在一些实施例中，高活性ADAS的异源蛋白产生速率在ADAS与诱导物接触后的特定持续时间内，例如，在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时或超过3小时内达到目标水平。在一些实施例中，蛋白质(例如，异源蛋白)以至少0.1毫微微克/小时/高活性ADAS，例如，至少0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、25、50、100、250、500、1000、2000、3000或3500fg/小时/ADAS的速率产生。在一些实施例中，ADAS的高活性以产生蛋白质的持续时间评定。高活性ADAS可以在至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时或超过48小时内产生蛋白质(例如，异源蛋白)。
B.衍生自细胞分裂拓扑特异性因子缺陷型亲代细菌的ADAS和高活性ADAS
如本文所述，ADAS可以衍生自细菌亲代细胞。
在一些方面，本发明提供了一种ADAS和/或包含多种ADAS的组合物，该ADAS和/或该组合物衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平、活性或表达降低的亲代细菌。
在一些方面，本发明提供了一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS不包含细胞分裂拓扑特异性因子，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
在一些方面，本发明提供了一种包含多种ADAS的组合物，该组合物基本上不含活细菌细胞，并且通过包括以下的方法产生：(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；(b)将该亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件，从而产生这些高活性ADAS；(c)将这些ADAS与该亲代细菌分离，从而产生基本上不含活细菌细胞的组合物。
在上述方面的一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与大肠杆菌minE多肽(SEQ ID NO:1)具有至少20％同一性，例如与SEQ ID NO:1具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为minE多肽。具有minE多肽的示例性物种如表4和Rothfield等人,Nature ReviewsMicrobiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005中所提供。
在一些实施例中，该亲代细菌为大肠杆菌，并且该minE多肽为大肠杆菌minE。在其他实施例中，该亲代细菌为鼠伤寒沙门氏菌，并且该minE多肽为鼠伤寒沙门氏菌minE。在又其他实施例中，该亲代细菌为埃希氏菌属、不动杆菌属、农杆菌属、鱼腥藻属、产水菌属、固氮弓菌属、固氮菌属、鲍特菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、暂定种、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、极地单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通氏菌属、长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、栖热孢菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽孢杆菌属、嗜热梭菌属或热厌氧杆菌属细菌，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为该亲代细菌的内源minE或DivIVA。
在上述方面的一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与枯草芽孢杆菌DivIVA多肽(SEQ ID NO:4)具有至少20％同一性，例如与SEQ ID NO:4具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA多肽。具有DivIVA多肽的示例性物种如表4和Rothfield等人,Nature Reviews Microbiology[自然评论微生物学],3:959-968,2005中所提供。在一些实施例中，该亲代细菌为枯草芽孢杆菌，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为枯草芽孢杆菌DivIVA。
在一些实施例中，该细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的ADAS或亲代细菌的一种或多种Z-环抑制蛋白水平也降低。
在一些实施例中，该Z环抑制蛋白为氨基酸序列与大肠杆菌minC多肽(SEQ ID NO:2)具有至少20％同一性，例如与SEQ ID NO:2具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽。在一些实施例中，该Z环抑制蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，该Z环抑制蛋白为minC多肽。
在一些实施例中，该Z环抑制蛋白为氨基酸序列与大肠杆菌minD多肽(SEQ ID NO:3)具有至少20％同一性，例如与SEQ ID NO:3具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性的多肽。在一些实施例中，该Z环抑制蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施例中，该Z环抑制蛋白为minD多肽。
在一些实施例中，这些ADAS或该亲代细菌的至少两种Z-环抑制蛋白的水平、活性或表达降低。在一些实施例中，这些ADAS或该亲代细菌的minC多肽和minD多肽的表达降低。在一些实施例中，这些ADAS或该亲代细菌的minC多肽、minD多肽和minE多肽的表达降低，例如minCDE操纵子(ΔminCDE)缺失。
可以使用任何合适的方法来实现细胞分裂拓扑特异性因子或Z-环抑制蛋白的水平、活性或表达的降低，例如ADAS中的降低或亲代细菌细胞中的降低。例如，在一些实施例中，该水平或活性的降低由功能丧失突变，如基因缺失引起。在一些实施例中，该功能丧失突变为诱导型功能丧失突变，并且通过将该亲代细胞暴露于诱导条件来诱导功能丧失，例如，该诱导型功能丧失突变为温度敏感性突变，并且其中该诱导条件为温度条件。
在一些实施例中，该亲代细胞具有minCDE操纵子(ΔminCDE)或同源操纵子缺失。
C.包含负载物的ADAS
在一些实施例中，本发明提供的ADAS包括包含在ADAS内部的负载物。负载物可以为设置在ADAS内部(例如，由ADAS包封)或与ADAS表面缀合的任何部分。在一些实施例中，该负载物包含核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP)或者前述物质的组合。
在一些实施例中，该核酸为DNA、RNA或质粒。在一些实施例中，该核酸(例如，DNA、RNA或质粒)编码蛋白质。在一些实施例中，该蛋白质在ADAS中转录和/或翻译。
在一些实施例中，该负载物为酶。在一些实施例中，该酶改变底物以产生靶产物。在一些实施例中，该底物存在于这些ADAS中，并且该靶产物在这些ADAS中产生。在其他实施例中，该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。
在某些实施例中，该负载物经修饰以与该负载物的未修饰形式相比稳定性改进。负载物的“稳定性”为未修饰负载物的半衰期与经修饰负载物半衰期的无单位比率，这些半衰期在相同环境条件下测量。在一些实施例中，通过实验控制环境，例如模拟的体液、无RNA酶水、细胞质、细胞外空间或“ADAS原生质”(即，ADAS内部体积的含量，例如在裂解后)。在一些应用中，其为农业环境，例如变田土壤、河水或海水。在其他实施例中，该环境为实际或模拟的：动物肠、动物皮肤、动物生殖道、动物呼吸道、动物血流或动物细胞外空间。在某些实施例中，该ADAS不会明显姜降解该负载物。
在某些实施例中，该负载物包含蛋白质。在某些实施例中，该蛋白质在细胞质或其他环境中的稳定性大于约：1.01、1.1、10、100、1000、10000、100000、100000、10000000。该蛋白质可以为任何蛋白质，包括生长因子；酶；激素；免疫调节蛋白；抗生素蛋白，诸如抗细菌、抗真菌、杀虫剂、蛋白质等；靶向剂，诸如抗体或纳米抗体等。在一些实施例中，该蛋白质为激素，例如旁分泌、内分泌、自分泌激素。
在一些实施例中，该负载物包含植物激素，诸如脱落酸、生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素或其组合。
在某些实施例中，该负载物为免疫调节剂，诸如免疫刺激剂、(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4)的检查点抑制剂、化学治疗剂、抑制剂、超抗原、小分子(环孢菌素A、环二核苷酸(CDN)或STING激动剂(例如，MK-1454))。
对于包含负载物的ADAS，在一些实施例中，该负载物为RNA，诸如环状RNA、mRNA、siRNA、shRNA、ASO、tRNA、dsRNA或其组合。在某些实施例中，该RNA在例如ADAS原生质中的稳定性大于约：1.01、1.1、10、100、1000、10000、100000、100000、10000000。在某些实施例中，RNA负载物可以例如用附加的台阶-环结构(step-loop structure)，诸如tRNA支架稳定。例如，非人类tRNALys3和大肠杆菌tRNAMet(Nat.Methods[自然方法],Ponchon 2007)。两者均已经充分表征并重组表达。然而，也可以使用各种其他类型，诸如适体、lncRNA、核酶等。在从没有一种或多种核糖核酸酶的亲代菌株获得ADAS的情况下，也可以对RNA进行稳定。
在一些特定实施例中，该RNA为编码蛋白质的mRNA。在更特定实施例中，编码蛋白质的mRNA编码酶(例如，赋予肝酶活性的酶，诸如人PBGD(hPBGD)mRNA)，或抗原(例如，引发免疫反应(诸如引发有效且持久的中和抗体滴度)的抗原，诸如编码CMV糖蛋白gB和/或五聚体复合物(PC)的mRNA)。在某些特定实施例中，该RNA为小的非编码RNA，诸如shRNA、ASO、tRNA、dsRNA或其组合。
在某些实施例中，本发明提供的ADAS包括包含基因编辑系统的负载物。“基因编辑系统”包括(或编码)如下蛋白质，这些蛋白质可以用合适的相关核酸修饰所关注DNA序列，诸如基因组DNA序列的，无论是通过插入还是使目的序列缺失，以及改变的甲基化状态。示例性基因编辑系统包括基于Cas系统诸如Cas9、Cpf1或其他RNA靶向系统及其伴随RNA的基因编辑系统，以及锌指核酸酶和与核酸酶缀合的TAL效应子。
本发明提供的ADAS的其他实施例包括DNA作为负载物，包括质粒，任选地，其中该DNA包含蛋白质编码序列。在某些实施例中，示例性DNA负载物包括编码目的RNA序列(参见以上实例)的质粒，例如，该目的RNA序列可以在每一侧侧接tRNA插入序列。本发明涵盖各种DNA负载物，该DNA负载物包括：ADAS产生(例如，驱动FTZ过表达，降解基因组的外切核酸酶)；长寿质粒(ATP合酶表达，视紫质表达)；表达稳定的非编码RNA、tRNA、lncRNA的负载物；表达分泌系统标签蛋白、NleE2效应结构域和定位标签；分泌系统T3/4SS、T5SS、T6SS；逻辑电路，其有条件地表达分泌系统；及其组合。在一些实施例中，逻辑电路包括诱导型表达或抑制盒，诸如IPTG诱导型Plac启动子和AND门的hrpR部分，以及例如，热诱导型启动子pL(来自噬菌体λ，其经常被热不稳定蛋白质抑制)和AND门的hrpS部分。为了工程化OR门，可以使用Rosado等人,PLoS Genetics[美国科学公共图书馆·遗传学],2018描述的系统。简而言之，可以使用在组成型启动子下编码RFP的顺式阻抑mRNA。然后可以在RAJ11 sRNA存在下去除阻抑。然后可以使用含有IPTG诱导型启动子PLac和热诱导型启动子pL的质粒，该两种启动子均诱导RAJ11 sRNA的表达。然后输出为RFP表达，其在响应于任一输入时观察到。这些系统可以进行调整以用于各种传感器型功能。
在一些实施例中，本发明提供的ADAS在膜中包括转运子。在某些实施例中，该转运子特异于葡萄糖、钠、钾、金属离子、阴离子溶质、阳离子溶质或水。
在一些实施例中，本发明提供的ADAS的膜包含酶。在特定实施例中，该酶为蛋白酶、氧化还原酶或其组合。在一些实施例中，该酶与该ADAS膜化学缀合，任选地通过接头与该外膜缀合。
D.包含分泌系统的ADAS
在某些实施例中，本发明提供的ADAS包含细菌分泌系统(例如，内源细菌分泌系统或异源分泌系统)。“细菌分泌系统”为一种蛋白质或蛋白质复合物，其可以从细菌细胞的细胞质(或例如，由其衍生的ADAS)向细胞外空间、革兰氏阴性细菌的周质空间或另一个细胞的细胞内空间中输出负载物。在一些实施例中，该细菌分泌系统由活性(例如，ATP依赖性或PMF依赖性)过程发挥作用，并且在某些实施例中，细菌分泌系统包含跨越宿主细胞(或ADAS)与靶细胞的管或刺突。在其他实施例中，该细菌分泌系统为跨膜通道。示例性细菌分泌系统包括T3SS和T4SS(以及下文定义的T3/T4SS)，其为含管结构，其中负载物穿过蛋白质管的内部和T6SS，T6SS在刺突末端运载负载物。其他示例性细菌分泌系统包括T1SS、T2SS、T5SS、T7SS、Sec和Tat，这些细菌分泌系统为跨膜细菌分泌系统。
在一些实施例中，该异源分泌系统为T3SS。
在一些实施例中，该ADAS包含负载物，其中该负载物包含引导该细菌分泌系统输出的部分，例如，在一些实施例中，该部分为Pho/D、Tat或合成肽信号。
在某些实施例中，本发明提供的ADAS为双膜ADAS。在更特定实施例中，该双膜ADAS还包含细菌分泌系统。在仍更特定实施例中，该细菌分泌系统选自T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS，任选地，其中T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS具有不影响靶细胞适应性的减弱或非功能的效应子。
在一些实施例中，本发明提供的ADAS包括细菌分泌系统。
在一些实施例中，该细菌分泌系统能够穿过ADAS外膜将负载物输出至靶细胞中，该靶细胞诸如动物、真菌、细菌或植物细胞，该细菌分泌系统诸如T3SS、T4SS、T3/T4SS或T6SS。
在更特定实施例中，该细菌分泌系统为T3/4SS。“T3/4SS”为基于T3SS或T4SS的分泌系统，包括混合系统以及未修饰形式，该分泌系统在细菌(或ADAS)与靶细胞之间形成蛋白管，从而连接两者并递送一种或多种效应子。靶细胞可以为动物、植物、真菌或细菌。在一些实施例中，T3/4SS包括效应子，其可以为经修饰效应子。T3SS系统的实例包括沙门氏菌SPI-1系统、肠出血性大肠杆菌(EHEC coli)ETT1系统、柑桔/油菜黄单胞菌(XanthamonasCitri/Campestri)T3SS系统，以及丁香假单胞菌T3SS系统。T4SS系统的实例包括农杆菌属Ti质粒系统、幽门螺杆菌T4SS。在某些实施例中，该T3/4SS具有改变的效应功能，例如，选自SopD2、SopE、Bop、Map、Tir、EspB、EspF、NleC、NleH2或NleE2的效应子。在更特定实施例中，改变的效应功能用于细胞内靶向，诸如易位至细胞核、高尔基体、线粒体、肌动蛋白、微绒毛、ZO-1、微管或细胞质中。在仍更特定实施例中，改变的效应功能为基于衍生自大肠杆菌的NleE2的细胞核靶向。在其他特定实施例中，改变的效应功能用于丝状伪足形成、紧密接合破坏、微绒毛消除或SGLT-1去活化。
在其他实施例中，包含细菌分泌系统的本发明提供的ADAS包含T6SS。在一些实施例中，T6SS在其天然宿主中靶向细菌并含有杀灭细菌的效应子。在某些特定实施例中，T6SS衍生自恶臭假单胞菌K1-T6SS，并且任选地，其中该效应子包含Tke2(登录号AUZ59427.1)的氨基酸序列，或其功能片段。在其他实施例中，T6SS在其天然宿主中靶向真菌并含有杀灭真菌的效应子，例如，T6SS衍生自粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescens)，并且效应子包含以下的氨基酸序列：Tfe1(Genbank：SMDB11_RS05530)或Tfe2(Genbank：SMDB11_RS05390)。
在含有细菌分泌系统的本发明提供的ADAS的其他实施例中，该细菌分泌系统能够在细胞外输出负载物。在某些更特定实施例中，该细菌分泌系统为T1SS、T2SS、T5SS、T7SS、Sec或Tat。
E.缺乏蛋白酶、RNA酶和/或LPS的ADAS
在另一方面，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的蛋白酶水平或活性降低。在一些方面，该ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种蛋白酶的表达的亲代细菌产生。
在另一方面，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的RNA酶水平或活性降低。在一些方面，该ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种RNA酶的表达的亲代细菌产生。在一些实施例中，该RNA酶为内切核糖核酸酶或外切核糖核酸酶。
在另一方面，本发明提供了一种包含多种ADAS的组合物，其中该ADAS经修饰以具有减少的脂多糖(LPS)。在一些实施例中，该修饰为脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶(msbB)突变。
在某些实施例中，本发明提供的ADAS缺乏一种或多种代谢非必需蛋白。“代谢非必需蛋白”非详尽地包括：菌毛、鞭毛、不期望的分泌系统、转座酶、效应子、噬菌体元件或其调节元件，诸如flhC或OmpA。在一些实施例中，本发明提供的ADAS缺乏RNA酶、蛋白酶或其组合中的一种或多种，并且在特定实施例中，缺乏一种或多种内切核糖核酸酶(诸如，RNA酶A、RNA酶h、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶PhyM)或外切核糖核酸酶(诸如RNA酶R、RNA酶PH、RNA酶D)；或丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶；或前述任一者的组合。
E.包含靶向部分的ADAS
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中该ADAS包含靶向部分。在一些实施例中，该靶向部分为纳米抗体、碳水化合物结合蛋白或肿瘤靶向肽。
在某些实施例中，该纳米抗体为针对肿瘤抗原诸如HER2、PSMA或VEGF-R的纳米抗体。在其他实施例中，碳水化合物结合蛋白为凝集素，例如甘露糖结合凝集素(MBL)。在仍其他实施例中，该肿瘤靶向肽为RGD基序或CendR肽。
F.衍生自共生或病原亲代菌株的ADAS
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中该ADAS衍生自作为哺乳动物病原体或哺乳动物共生细菌的亲代细菌。在一些情况下，该哺乳动物共生细菌为葡萄球菌属、双歧杆菌属、微球菌属、乳杆菌属或放线菌属物种，或该哺乳动物病原细菌为肠出血性大肠杆菌(EHEC)、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、耶尔森氏肠杆菌或幽门螺杆菌。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中该ADAS衍生自作为植物病原体或植物共生细菌的亲代细菌。在一些实施例中，该植物共生细菌为枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌，或该植物病原细菌为黄单胞菌属物种或丁香假单胞菌。
G.衍生自营养缺陷型亲代菌株的ADAS
在另一个实施例中，本发明提供了一种包含多种ADAS(例如，高活性ADAS)的组合物，其中该ADAS衍生自营养缺陷型亲代细菌，即不能合成生长所需的有机化合物的亲代细菌。此类细菌仅能在提供有机化合物时生长。
H.包含其他部分的ADAS
在某些实施例中，ADAS包括功能性ATP合酶，并且在一些实施例中，包括膜嵌入式质子泵。ADAS可以衍生自不同来源，包括：经工程化或诱导以产生无基因组封闭膜系统的亲代细菌菌株(“亲代菌株”)、经基因组切除的细菌、细菌细胞制备提取物(例如，通过机械或其他方法)或总合成过程，任选地包括细菌细胞制剂的级分。在一些实施例中，高活性ADAS的ATP合酶浓度为至少：1/10000nm2、1/5000nm2、1/3500nm2、1/1000nm2。
本发明提供的ADAS可以包括各种其他组分，包括例如光伏泵、一种或多种视黄醛产生盒、代谢酶、靶向剂、负载物、细菌分泌系统以及转运子，包括前述的组合，包括下文描述的某些特定实施例。在某些实施例中，这些ADAS缺乏其他元件，诸如代谢非必需基因和/或某些核酸酶或蛋白酶。
在某些实施例中，本发明提供的ADAS包含ATP合酶，任选地缺乏调节结构域，诸如缺乏ε结构域。缺失可以通过各种方式来实现。在某些实施例中，该缺失通过诱导天然ε结构域缺失进行。在某些实施例中，缺失可以通过侧接LoxP位点和诱导型Cre表达或CRISPR敲除实现，或者可以进行诱导(在ATP合酶敲除菌株中在tTa tet反式活化子存在下置于质粒上)
在一些实施例中，ADAS可以包括光伏质子泵。在某些实施例中，该光伏质子泵为变形杆菌视紫质。在更特定实施例中，该变形杆菌视紫质包含来自未培养的海洋细菌分支SAR86(GenBank登录号：AAS73014.1)的变形杆菌视紫质的氨基酸序列。在其他实施例中，该光伏质子泵为粘杆菌视紫质。在某些实施例中，该光伏质子泵为来自盐生盐杆菌(Halobiumsalinarum)、嗜盐碱单孢菌(Natronomonas pharaonis)、唐松草微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、土库曼嗜盐古菌(Haloterrigena turkmenica)或死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)的细菌视紫质、δ视紫质或嗜盐菌视紫质。
在一些实施例中，本发明提供的ADAS还包含视黄醛。在某些实施例中，本发明提供的ADAS还包含视黄醛合成蛋白(或蛋白系统)，或编码其的核酸。
在某些实施例中，本发明提供的ADAS还包含一种或多种糖酵解路径蛋白。在一些实施例中，糖酵解路径蛋白为磷酸果糖激酶(Pfk-A)，例如，包含UniProt登录号P0A796的氨基酸序列的磷酸果糖激酶或其功能片段。在其他实施例中，糖酵解路径蛋白为磷酸丙糖异构酶(tpi)，例如，包含UniProt登录号P0A858的氨基酸序列的磷酸丙糖异构酶或其功能片段。
I.ADAS组合物和配制品
本发明提供了含有本发明提供的ADAS的组合物或制剂，其尤其包括本发明提供的高活性ADAS制剂，或者如下ADAS制剂，其中多种个别ADAS缺乏细胞分裂拓扑特异性因子，例如，缺乏minE基因产物，并且任选地其中ADAS制剂基本上不含活细胞。这些总称为“本发明提供的多种组合物”或“本发明提供一种组合物”等，并且可以含有本发明提供的任何ADAS和本发明提供的ADAS的任何组合。
例如，在一些实施例中，本发明提供的组合物含有至少约：80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多含有细菌分泌系统的ADAS。在特定实施例中，该细菌分泌系统为T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS中的一种。
在一些实施例中，本发明提供的组合物含有包含T3SS的ADAS，其中这些ADAS在约40000、35000、30000、25000、19600、15000、10000或5000nm2中包含大于1的平均T3SS膜密度。在某些特定实施例中，该ADAS衍生自鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌亲代菌株。
本发明提供的组合物的某些实施例含有包含T3SS的ADAS，其中这些ADAS在约300000、250000、200000、150000、100000、50000、20000、10000、5000nm2中包含大于1的平均T3SS膜密度。在某些特定实施例中，该ADAS衍生自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)亲代菌株。
在另一方面，本发明提供了一种ADAS的组合物，其中至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多ADAS含有细菌分泌系统，该细菌分泌系统包括T3、T4、T3/4SS、T6SS，并且任选地包括以下中的一种或多种：外源碳水化合物、磷酸盐产生合酶、光反应蛋白、输入蛋白、酶、功能性负载物、有机体特异性效应子、融合蛋白。
将显而易见的是，本发明提供的组合物和制剂可以含有本发明提供的任何ADAS，诸如高活性ADAS或缺乏minE基因产物的ADAS。
本发明提供的组合物可以在任何合适的配制品中制备。例如，该配制品可以适用于IP、IV、IM、口服、局部(乳膏、凝胶、软膏、透皮贴剂)、气雾化或雾化施用。在一些实施例中，该配制品为液体配制品。在其他实施例中，该配制品为冻干配制品。
在一些实施例中，本文所述的ADAS组合物包含少于100个菌落形成单位(CFU/mL)的活细菌细胞，例如，少于50CFU/mL、少于20CFL/mL、少于10CFU/mL、少于1CFU/mL或少于0.1CFU/mL的活细菌细胞。
在一些实施例中，本发明提供了一种ADAS组合物，其中这些ADAS经冻干并重构，并且其中经重构ADAS的ATP浓度为未冻干ADAS的ATP浓度的至少90％，例如未冻干ADAS的ATP浓度的至少95％、98％或至少与该ATP浓度相等。
在一些实施例中，本发明提供了一种ADAS组合物，其中这些ADAS经储存，例如储存在4℃下，其中储存后ADAS的ATP浓度为未储存ADAS的ATP浓度的至少90％，例如未储存ADAS的ATP浓度的至少95％、98％或至少与该ATP浓度相等。在一些实施例中，该储存持续至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月、至少六个月或至少一年。
在一些实施例中，ADAS可以以“静止”状态保存或以其他方式处理，然后快速被活化。
在一些实施例中，配制该ADAS组合物以递送至动物，例如配制来用于腹膜内、静脉内、肌肉内、口服、局部、气雾化或雾化施用。
在一些实施例中，配制该ADAS组合物以递送至植物。
在一些实施例中，配制该ADAS组合物以递送至昆虫。
在一些实施例中，将该组合物配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
J.包含酶的ADAS
在一方面，本发明的特征在于一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS包含酶，并且其中该酶改变底物以产生靶产物。在一些实施例中，该底物存在于这些ADAS中，并且该靶产物在这些ADAS中产生。在其他实施例中，该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。在一些实施例中，该酶为二腺苷酸环化酶A，该底物为ATP，并且该靶产物为环二AMP。
III.制备ADAS的方法
A.制备ADAS和高活性ADAS
在一些方面，本发明的特征在于一种用于制备包含多种ADAS的组合物的方法，该组合物基本上不含活细菌细胞，该方法包括：(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件，从而产生这些高活性ADAS；以及(c)将这些高活性ADAS与这些亲代细菌分离，从而产生基本上不含活细菌细胞的组合物。
亲代细菌包括可以产生ADAS的任何合适的细菌物种(例如，可以使用本文所述的方法修饰以产生ADAS的物种)。表4提供了可以衍生ADAS的合适属的非限制性清单。
表4.用于ADAS产生的细菌物种
在一些方面，本发明的特征在于用于制备本文第I部分中描述的任何ADAS组合物，例如高活性ADAS组合物的方法。例如，本文提供了用于制备高活性ADAS的方法；用于制备缺乏细胞分裂拓扑特异性因子并且任选地缺乏Z-环抑制蛋白的方法(例如，由ΔminCDE亲代细菌制备ADAS的方法)，以及用于制备本文提及的任何ADAS的方法，其中该ADAS包含负载物。
前述权利要求中任一项所述的高活性ADAS可以由细菌细胞制备，其中亲代菌株选自植物细菌，诸如植物共生细菌(例如，枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌)或植物病原细菌(例如，黄单胞菌属物种或丁香假单胞菌)，或人细菌，诸如人共生细菌(例如，大肠杆菌、葡萄球菌属物种、双歧杆菌属物种、微球菌属物种、乳杆菌属物种或放线菌属物种)或人病原细菌(例如，大肠杆菌EHEC、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、耶尔森氏肠杆菌、幽门螺杆菌)，或嗜极生物，包括上述任一者的功能化衍生物，例如包括功能盒，诸如诱导细菌实施以下中的一个或多个的功能盒：分泌抗微生物剂，消化塑料，分泌杀虫剂，在极端环境中存活，制备纳米粒子，在其他生物体中整合，对环境作出反应，并产生报告信号。
亲代细菌可以包括前述任一者的功能化衍生物，例如包括功能盒，诸如诱导细菌实施以下中的一个或多个的功能盒：分泌抗微生物剂，消化塑料，分泌杀虫剂，在极端环境中存活，制备纳米粒子，在其他生物体中整合，对环境作出反应，并产生报告信号。
在一些实施例中，ADAS衍生自经工程化或诱导以过表达ATP合酶的亲代菌株。在一些更特定实施例中，该ATP合酶与亲代菌株异源。在某些特定实施例中，该亲代菌株经修饰以表达功能性FoF1 ATP合酶。
在某些实施例中，从在选自以下的条件下培养的亲代菌株获得本发明提供的ADAS：施加的电压(例如，37mV)，非大气氧浓度(例如，1％-5％O2、5％-10％O2、10％-15％O2、25％-30％O2)，低pH(约：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)或其组合。
如前述权利要求中任一项所述的由嗜极生物制备的高活性ADAS，其包括前述任一者的功能化衍生物，例如包括功能盒，诸如诱导细菌实施以下中的一个或多个的功能盒：分泌抗微生物剂，消化塑料，分泌杀虫剂，在极端环境中存活，制备纳米粒子，在其他生物体中整合，对环境作出反应，并产生报告信号。
由于细菌的多样性，可以制备具有经修饰膜的ADAS，例如，以改进施用于靶细胞后ADAS的生物分布。在某些实施例中，该膜经修饰以在植物或动物中具有较少免疫原性或免疫刺激性。例如，在某些实施例中，从亲代菌株获得ADAS，其中通过用洗涤剂、酶或用PEG官能化进行产生后处理来减少或消除该亲代菌株的免疫刺激能力。在某些实施例中，由亲代菌株制备ADAS，并且通过敲除亲代菌株中的LPS合成路径，例如通过敲除msbB来修饰该膜。在其他特定实施例中，ADAS由通过暴露于高渗条件产生细胞壁缺陷粒子的亲代菌株制备。
在一些实施例中，这些方法包括用诱导型DNA酶系统转化亲代菌株，该诱导型DNA酶系统诸如exoI(NCBI GeneID：946529)&sbcD(NCBI GeneID:945049)核酸酶，或I-CeuI(例如，Swissprot：P32761.1)核酸酶。在更特定实施例中，这些方法包括使用单种、两种、三种或四种营养缺陷型菌株，并在编码诱导核酸酶的质粒上具有互补基因。
在本发明提供的方法的一些实施例中，亲代菌株在选自以下的条件下培养：施加的电压(例如，37mV)，非大气氧浓度(例如，1％-5％O2、5％-10％O2、10％-15％O2、25％-30％O2)，低pH(4.5-6.5)或其组合。
在本发明提供的方法的某些实施例中，亲代菌株缺乏鞭毛和不期望的分泌系统，任选地其中使用λred重组工程去除鞭毛和不期望的分泌系统。
在本发明提供的方法的一些实施例中，通过例如插入含有靶向鞭毛控制基因，诸如flhD和flhC的CRISPR结构域的质粒，从亲代菌株基因组切除鞭毛控制组分。
在某些实施例中，本发明提供的方法用于制备高活性ADAS，其中在光存在下培养包含含有视紫质编码基因的质粒的ADAS。在更特定实施例中，该视紫质为来自SAR86未培养细菌的具有GenBank登录号：AAS73014.1的氨基酸序列的变形杆菌视紫质或其功能片段。在仍更特定实施例中，该培养物补充有视黄醛。在其他更特定实施例中，该视紫质为变形杆菌视紫质，并且该质粒另外含有合成视黄醛的基因(此种质粒为来自Kim等人,Microb CellFact[微生物细胞工厂],2012的pACYC-RDS质粒)。
在某些特定实施例中，该亲代菌株含有编码纳米抗体的核酸序列，然后该纳米抗体在该ADAS的膜上表达。
在本发明提供的方法的一些实施例中，亲代菌株含有编码一种或多种细菌分泌系统操纵子的核酸序列。示例性质粒包括沙门氏菌SPI-1T3SS、福氏志贺氏菌T3SS、农杆菌属Ti质粒和恶臭假单胞菌K1-T6SS系统。
在某些实施例中，该亲代菌株包含负载物。在一些实施例中，该亲代菌株含有编码一组合成小分子负载物的基因的核酸序列。
IV.ADAS和ADAS组合物的纯化
在本文提供的方法和组合物的一些实施例中，从包含活细菌，例如亲代细菌的组合物(例如，培养物)纯化ADAS。例如，本发明的特征在于一种用于制备包含多种ADAS的组合物的方法，该组合物基本上不含活细菌细胞，该方法包括：(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件，从而产生这些高活性ADAS；以及(c)将这些高活性ADAS与这些亲代细菌分离，从而产生基本上不含活细菌细胞的组合物。
纯化将ADAS与活亲代细菌细胞分离，这些活亲代细菌细胞较大并含有基因组。可以使用如本文所述的多种方法进行高活性ADAS与亲代细菌的分离。用于本文所述的纯化的示例性方法包括离心、选择性生长和缓冲液交换/浓缩方法。
在一些方面，本文提供ADAS组合物以及比较此类组合物的方法，其中这些组合物基本上不含亲代细菌细胞和/或活细菌细胞，例如，具有不超过500，例如400、300、200、150或100或少于50、少于25、少于10、少于5、少于1、少于0.1个菌落形成单位(CFU)/mL。在一些实施例中，基本上不含亲代细菌细胞的ADAS组合物可能不包括细菌细胞。
可以使用营养缺陷型亲代菌株来制备本发明提供的ADAS。如下文更详细描述，此类制备方法可用于纯化ADAS。例如，在ADAS产生之后，亲代细菌细胞可以通过在缺乏亲代细菌存活所必需的营养(例如，氨基酸)的培养基中生长来去除。在一些实施例中，本发明提供的ADAS衍生自以下中的至少1、2、3、4种或更多种的营养缺陷型亲代菌株：精氨酸(例如argA敲除，诸如菌株JW2786-1和NK5992)，半胱氨酸(cysE敲除，诸如菌株JW3582-2和JM15)，谷氨酰胺例如glnA敲除(诸如菌株JW3841-1和M5004)，甘氨酸例如glyA敲除(诸如菌株JW2535-1和AT2457)，组氨酸例如hisB敲除(诸如菌株JW2004-1和SB3930)，异亮氨酸例如ilvA敲除(诸如菌株JW3745-2和AB1255)，亮氨酸例如leuB敲除(诸如菌株JW5807-2和CV514)，赖氨酸例如lysA敲除(诸如菌株JW2806-1和KL334)，甲硫氨酸例如metA敲除(诸如菌株JW3973-1和DL41)，苯丙氨酸例如pheA敲除(诸如菌株JW2580-1和KA197)，脯氨酸例如proA敲除(诸如菌株JW0233-2和NK5525)，丝氨酸例如serA敲除(诸如菌株JW2880-1和JC158)，苏氨酸例如thrC敲除(诸如菌株JW0003-2和Gif 41)，色氨酸例如trpC敲除(诸如菌株JW1254-2和CAG18455)，酪氨酸例如tyrA敲除(诸如菌株JW2581-1和N3087)，缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸例如ilvd敲除(诸如菌株JW5605-1和CAG18431)。
在某些实施例中，这些方法包括使用单种、两种、三种或四种营养缺陷型亲代菌株，任选地其中所述亲代菌株还包括表达ftsZ的质粒。
V.使用ADAS的方法
A.递送ADAS的方法
在一方面，本发明的特征在于一种用于将高活性ADAS递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性ADAS的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在另一方面，本发明的特征在于一种用于将ADAS(例如，高活性ADAS)递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
靶细胞可以为例如动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
B.递送负载物的方法
在另一方面，本发明的特征在于一种用于将负载物(例如，核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP))递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
在另一方面，本发明的特征在于一种用于将负载物(例如，核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP))递送至靶细胞的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
负载物所递送到的靶细胞可以为例如动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。
C.调节细胞状态的方法
在一方面，本发明的特征在于一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节植物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节植物细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
在另一方面，本发明的特征在于一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
调节可以为如使用测量领域中已知的技术和方法(例如测量蛋白质、转录物、表观遗传标志物的水平或表达，或者测量生物路径活性的增加或减少的方法)所测量，细胞(例如，动物、植物或昆虫细胞)的状态(例如，转录组、蛋白质组、表观基因组、生物学效应或者健康或疾病状态)的任何可观察变化。在一些实施例中，调节细胞的状态涉及细胞提高细胞的参数(例如，蛋白质、转录物的水平或表达，或者生物路径的活性)。在其他实施例中，调节状态涉及降低细胞的参数(例如，蛋白质、转录物的水平或表达，或者生物路径的活性)。
D.治疗动物、植物或昆虫的方法
在一些方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
在其他方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
需要治疗的动物可能患有疾病，例如癌症。在一些实施例中，这些ADAS携带化疗负载物或免疫疗法负载物。
在一些方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物或其有害生物(例如，害虫)与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
在其他方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括：(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及(b)使该植物或其有害生物(例如，害虫)与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
在另一方面，本发明提供了调节靶细胞的方法。靶细胞可以为任何细胞，包括动物细胞(例如，包括人和非人动物，包括农场动物或家畜、宠物)、植物细胞(包括来自作物的植物细胞或有害生物)、真菌细胞或细菌细胞。细胞可以被分离，例如在体外，或在其他实施例中，在生物体内，在体内。这些方法需要提供有效量的本发明提供的ADAS或本发明提供的组合物来接近靶细胞。接近靶细胞可以为直接的，例如，其中靶细胞由ADAS直接调节，诸如通过邻近分泌某种邻近靶细胞的试剂或将该试剂注入靶细胞中，或者为间接的。靶细胞的间接调节可以通过靶向不同细胞进行，例如，通过调节与靶细胞相邻的细胞，该相邻细胞可以与靶细胞共生或对靶细胞具有病原性。相邻细胞如同靶细胞一样可以为体外或体内的——即在生物体中，其可以为共生或病原性的。这些方法总称为“本发明提供的使用方法”等。在一个相关方面，本发明提供了本发明提供的ADAS和组合物的目标用途，这些目标用途与本发明提供的使用方法一致。
例如，在一些实施例中，本发明通过提供有效量的本发明提供的ADAS或本发明提供的组合物接近动物细胞来提供调节动物细胞的状态的方法。在某些实施例中，提供该ADAS或组合物来在体内，在动物诸如哺乳动物诸如人中接近动物细胞。在一些实施例中，使健康动物中的动物细胞暴露于细菌。在更特定实施例中，该动物细胞为肺上皮细胞、免疫细胞、皮肤细胞、口腔上皮细胞、肠上皮细胞、生殖道上皮细胞或泌尿道细胞。在仍更特定实施例中，该动物细胞为肠上皮细胞，诸如来自患有炎性肠病，诸如克罗恩氏(Crohn'sdisease)或结肠炎的人受试者的肠上皮细胞。在又更特定实施例中，该动物细胞为来自患有炎性肠病的受试者的肠上皮细胞，并且该ADAS包含细菌分泌系统和包含抗炎剂的负载物。
在其他实施例中，使患病状态的动物细胞暴露于细菌。在某些实施例中，该动物细胞为病原性的，诸如肿瘤。在其他实施例中，使患病状态，诸如创伤、溃疡、肿瘤或炎性疾病的动物细胞暴露于细菌
在某些实施例中，该ADAS衍生自动物共生亲代菌株。在其他实施例中，该ADAS衍生自动物病原性亲代菌株。
在某些特定实施例中，使该动物细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该动物细胞中。在一些特定实施例中，提供该动物细胞来接近有效量的包含负载物和分泌系统的ADAS，其中该负载物在细胞外分泌并与该动物细胞接触。
在一些实施例中，该动物细胞的状态通过以下来调节：提供有效量的本发明提供的ADAS或本发明提供的组合物来接近动物细胞附近的细菌或真菌细胞。即，这些方法需要间接调节动物细胞的状态。在某些实施例中，该细菌或真菌细胞为病原性的。在更特定实施例中，该病原细菌或真菌细胞的适应性降低。在其他某些实施例中，该细菌或真菌细胞为共生的。在更特定实施例中，该共生细菌或真菌细胞的适应性增加。在仍更特定实施例中，该共生细菌或真菌菌株的适应性通过降低大量可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或真菌的适应性来增加。
在某些特定实施例中，使该动物细胞附近的细菌或真菌细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该细菌或真菌细胞中。在其他特定实施例中，提供该动物细胞附近的细菌或真菌细胞来接近有效量的细胞外分泌负载物的ADAS，该负载物接触该细菌或真菌细胞。
在某些实施例中，该ADAS衍生自作为该细菌或真菌细胞的竞争者的亲代菌株。在其他实施例中，该ADAS衍生自作为该细菌或真菌细胞的互利共生细菌的亲代菌株。
如将了解的，本发明提供的调节动物细胞的状态的各种使用方法可以容易地调整为用于调节植物、真菌或细菌细胞的状态的相应方法。出于说明性目的，将更特别地叙述用于调节植物细胞或真菌细胞的方法。
因此，在相关方面，本发明提供了通过提供有效量的本发明提供的ADAS或本发明提供的组合物接近以下来调节植物或真菌细胞的状态的方法：a)植物或真菌细胞，b)在植物或真菌细胞附近的相邻细菌或相邻真菌细胞，或c)在植物或真菌细胞附近的昆虫或线虫细胞。
在某些实施例中，提供该ADAS来原位，例如在如下植物内接近植物细胞：作物植物，诸如行栽作物，包括玉米、小麦、大豆和大米，以及蔬菜作物，包括茄科(solanaceae)，诸如西红柿和胡椒；葫芦科，诸如甜瓜和黄瓜；芸苔属，诸如卷心菜和西蓝花；绿叶菜类，诸如羽衣甘蓝和生菜；根和块茎，诸如土豆和胡萝卜；大种蔬菜，诸如豆和玉米；以及蘑菇。在一些实施例中，使健康植物或真菌中的植物或真菌细胞暴露于细菌。在其他实施例中，使患病状态的植物或真菌细胞暴露于细菌。
在某些实施例中，该植物或真菌细胞分裂，诸如分生细胞，或为病原性的，诸如肿瘤。在一些实施例中，使患病状态诸如创伤的植物或真菌细胞暴露于细菌，或者其中植物或真菌细胞不为人食品的一部分。
在某些实施例中，该ADAS衍生自共生亲代菌株。在其他实施例中，该ADAS衍生自植物或真菌病原性亲代菌株。
在一些实施例中，该ADAS包含T3/4SS或T6SS和负载物，并且该负载物被递送至植物或真菌细胞中。在其他实施例中，提供该植物或真菌细胞来接近有效量的包含细菌分泌系统和负载物的ADAS，其中该细菌分泌系统细胞外分泌该负载物，从而使该植物或真菌细胞与该负载物接触。
在一些实施例中，这些方法需要提供有效量的ADAS或组合物来接近植物或真菌细胞附近的相邻细菌或相邻真菌细胞。在更特定实施例中，相邻细菌或相邻真菌细胞为病原性的，任选地，其中该病原性相邻细菌或相邻真菌细胞的适应性降低。在其他更特定实施例中，相邻细菌或相邻真菌细胞为共生的，任选地，其中该共生相邻细菌或相邻真菌细胞的适应性增加。在仍更特定实施例中，该适应性通过减少可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或竞争真菌来增加。
在一些实施例中，使相邻细菌或相邻真菌细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该相邻细菌或相邻真菌细胞中。
在其他实施例中，提供该相邻细菌或相邻真菌细胞来接近有效量的包含细菌分泌系统和负载物的ADAS，其中该细菌分泌系统细胞外分泌该负载物，从而使该相邻细菌或相邻真菌细胞与该负载物接触。
在一些实施例中，该ADAS衍生自作为该相邻细菌或相邻真菌细胞的竞争者的亲代菌株。在其他实施例中，该ADAS衍生自作为该相邻细菌或相邻真菌细胞的互利共生细菌的亲代菌株。
在某些实施例中，这些方法包括提供有效量的ADAS或组合物来接近植物或真菌附近的昆虫或线虫细胞。在更特定实施例中，该昆虫或线虫为病原性的。在仍更特定实施例中，该病原昆虫或线虫细胞的适应性降低。在又更特定实施例中，该病原昆虫或线虫细胞的适应性通过调节该昆虫或线虫细胞中的共生生物来降低。在其他特定实施例中，该昆虫或线虫为共生的。在更特定实施例中，该共生昆虫或线虫细胞的适应性增加。在仍更特定实施例中，该适应性通过减少可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或真菌来增加。
在又另一方面，本发明提供了从环境中去除一种或多种不期望的材料的方法，这些方法包括使该环境与有效量的本发明提供的ADAS或本发明提供的组合物接触，其中该ADAS包含溶解、螯合或降解一种或多种不期望材料的一种或多种分子(诸如蛋白质、聚合物、纳米粒子、结合剂或其组合)。“环境”定义为不为细胞的靶标，诸如海洋、土壤、超级基金污染场址、皮肤、池塘、肠道腔以及容器中的食物。
在某些实施例中，该不期望的材料包括重金属，诸如汞，并且该ADAS包含结合重金属的一种或多种分子(诸如蛋白质、聚合物、纳米粒子、结合剂或其组合)，诸如用于汞的MerR。在一些实施例中，该不期望的材料包括塑料，诸如PET，并且该ADAS包含一种或多种塑料降解酶，诸如PET酶。在某些实施例中，该不期望的材料包括一种或多种小有机分子，并且该ADAS包含能够代谢所述一种或多种小有机分子的一种或多种酶。
E.RNA递送方法
在另一方面，本发明提供了一种含有本发明提供的细菌或ADAS的组合物，其中该细菌或ADAS包括T4SS、RNA结合蛋白质负载物和由该RNA结合蛋白结合的并且适合通过T4SS递送至靶细胞中的RNA负载物。在某些实施例中，该RNA结合蛋白为与VirE2和VirF融合的Cas9，该RNA负载物为引导RNA，并且任选地，该T4SS为来自农杆菌属的Ti系统。在其他实施例中，该RNA结合蛋白为与VirE2或VirF融合的来自香石竹意大利环斑病毒(CarnationItalian Ringspot Virus)的p19，该RNA负载物为siRNA，并且任选地，其中该T4SS为来自农杆菌属的Ti系统。
在一个相关方面，本发明提供了制备这些特定组合物的方法，此类方法需要将含有与VirE2和VirF融合的Cas9和RNA负载物的质粒转染至农杆菌属细胞中。
在另一相关方面，本发明提供了用于将RNA递送至植物细胞或动物细胞的方法，这些方法包括使所述植物细胞或动物细胞与细菌或ADAS接触，其中细菌或ADAS包含T4SS、RNA结合蛋白负载物和RNA负载物，其中将该RNA递送至该植物细胞或动物细胞。在更特定实施例中，也将该RNA结合蛋白负载物递送至该植物细胞或动物细胞。
实例
内容列表
实例1：通过遗传操作产生ADAS
可以通过数种方法从亲代细菌细胞产生ADAS。在此实例中，通过破坏参与调节亲代细胞分配功能的一种或多种基因，即，破坏Z-环抑制蛋白(例如，ΔminC或ΔminD)或破坏Z-环抑制蛋白和细胞分裂拓扑特异性因子(例如，ΔminCDE)来产生ADAS。此实例详细说明了通过破坏min操纵子或过表达隔膜机构组分FtsZ产生ADAS产生菌株的遗传方法。
A.通过min突变产生ADAS
为了破坏min操纵子，根据Datsenko和Wanner,PNAS[美国科学院院报],97(12):6640-6645,2000中设计的方案采用λ-RED重组工程方法。从耶鲁大学(Yale University)的大肠杆菌遗传储存中心(Coli Genetic Stock Center；CGSC)获得用于工程化且含有λ-Red系统的质粒的菌株。简而言之，设计引物以通过将约40个基因组同源性碱基对编码成引物的5'末端来非极性缺失大肠杆菌minC(产生亲代细菌菌株MACH061)、minD(产生亲代细菌菌株MACH062)或完整minCDE操纵子(产生亲代细菌菌株MACH060)的编码序列。这些引物的3'末端与λ-RED系统的质粒pKD3和pKD4同源，这些末端提供了用于选择遗传靶突变的亲代细菌菌株的抗生素标志物。用于缺失的引物序列如表1中所提供。根据Datsenko和Wanner,PNAS[美国科学院院报],97(12):6640-6645,2000，在用pKD3作为DNA模板使用引物进行标准PCR后，通过电穿孔将纯化的扩增子转化至经制备而具有pKD46(含有衍生自噬菌体的λ-RED同源重组系统的质粒)的细菌中。在具有35μg/mL氯霉素的LB琼脂上选择转化体。使用标准等位基因特异性PCR证实这些所得菌落具有遗传破坏(即，ΔminC、ΔminD或ΔminCDE)。表2中提供了菌株基因型。
表1：引物
| 引物名称 | 描述 | 序列 |
| oAF75 | KO MinCDE FWD | SEQ ID NO:10 |
| oAF76 | KO MinCDE REV | SEQ ID NO:11 |
| oAF77 | KO MinC FWD | SEQ ID NO:12 |
| oAF78 | KO MinC REV | SEQ ID NO:13 |
| oAF79 | KO MinD FWD | SEQ ID NO:14 |
| oAF80 | KO MinD REV | SEQ ID NO:15 |
| oAF167 | KO SalTy MinCDE FWD | SEQ ID NO:16 |
| oAF168 | KO SalTy MinCDE REV | SEQ ID NO:17 |
表2：菌株
B.通过过表达ftsZ产生ADAS
为从过表达隔膜机构产生ADAS，构建一种质粒，该质粒驱动自野生型大肠杆菌表达FtsZ Z-环蛋白。简而言之，使用计算工具从从头(De Novo)DNA从头优化强核糖体结合位点和大肠杆菌FtsZ蛋白的编码序列。此翻译单元被定制来从集成DNA技术(IDTTM)进行从头DNA合成，并使用标准克隆技术克隆到骨架中。得到的质粒pFtsZ(表3)具有TetR阻抑子、被TetR蛋白阻抑的TetA启动子、卡那霉素(kanamycin)抗性标志物和pMB1复制起点。当转化至相容的细菌中时，可以通过向培养物中添加无水四环素来诱导pFtsz过度产生FtsZ蛋白。然后，此蛋白质能够形成自发原丝，这些原丝引起亲代细菌细胞的不对称分裂，从而产生ADAS。
表3：质粒
实例2：ADAS的纯化
本实例描述了从ADAS产生细菌亲代菌株的培养物纯化ADAS群体的方法。此方法可以用于纯化本文所述的任何ADAS产生菌株，包括实例1或表3的菌株。纯化将ADAS与活亲代细菌细胞分离，这些活亲代细菌细胞较大并含有基因组。通过组合1)低速离心，2)选择性生长和3)缓冲液交换/浓缩从ADAS产生菌株的高细胞密度培养物纯化ADAS。使用低速离心程序选择性去除活亲代细菌细胞和大细胞碎片，同时在混合悬浮液中富集ADAS。使用选择性生长程序，通过添加直接抗微生物(即，对具有微生物基因组的细胞具有毒性)的化合物和/或增强通过低速离心进行的活细胞沉降的化合物来减少样品中存在的活亲代细菌细胞的数量。使用缓冲液交换/浓缩程序将ADAS从较大体积的细菌培养基转移至较小体积的1×PBS真空，同时去除培养添加剂和细胞碎片。
A.ADAS纯化
使用实例1中描述的分子克隆程序产生ADAS产生菌株，然后在培养基中培养至高细胞密度。培养物可以被放大，例如，从1mL放大至1000mL或更多培养基。
将培养物转移至离心管中，并进行低速离心程序以旨在将完整细胞和大细胞碎片粒化，而使ADAS保留在上清液中。在4℃或在室温下进行低速离心程序。在一些情况下，低速离心程序为在
X14R台式离心机(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))或EppendorfTM 5424R台式离心机(飞世尔科学公司(Fisher Scientific))上进行的在1,000×g、2,000×g、3,000×g和4,000×g下依序旋转10分钟的工序。在一些情况下，低速离心程序由在4℃下依序2,000×g旋转20分钟组成，其中在第二旋转之前将第一旋转的上清液倾析至无菌离心瓶中。在一些情况下，低速离心程序为在SorvallTM Lynx 6000超速离心机(Thermo ScientificTM)中，在4,000×g下单一旋转40分钟，其中转子加速度的速率设置为最低可能设置值。
低速离心后，将培养物上清液被倾析至无菌培养管中，并进行选择性生长过程。在某些情况下，将浓缩抗生素溶液(例如，头孢曲松(ceftriaxone)、卡那霉素、羧苄西林(carbenicillin)、庆大霉素(gentamicin)和/或环丙沙星(ciprofloxacin))或其他浓缩化学溶液(例如，氯化钠、氢氧化钠、M盐酸、葡萄糖、酪蛋白氨基酸和/或D-氨基酸)直接添加至培养物上清液中。在其他情况下，通过在10,000×g至20,000×g下高速离心5至60分钟将培养物上清液粒化，并将颗粒再悬浮在含有抑制活细胞的抗生素或其他化学溶液的浓缩物的新鲜培养基中。通过在250rpm的搅拌下在4℃至42℃下孵育ADAS 1至3小时来进行选择性生长。然后将ADAS转移至无菌离心管中，并在4℃，4,000×g下进行另一轮的低速离心15分钟。
选择性生长和低速离心后，对上清液进行缓冲液交换/浓缩程序。在一些情况下，此通过以下方法进行：使上清液通过0.2μm不对称聚醚砜(aPES)膜过滤器(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))，然后通过1至9体积的1×PBS。在其他情况下，通过在10,000×g至20,000×g下离心5至60分钟将ADAS粒化，在1至9体积的1×PBS中洗涤，再次粒化，并从起始培养体积以1至100,000倍浓度再悬浮在1×PBS中。
B.从营养缺陷型ADAS产生亲代菌株纯化ADAS
营养缺陷型，即不能合成生长所需的有机化合物的ADAS产生亲代菌株可用于制备ADAS。此类菌株仅能在提供有机化合物时生长。因此，可以通过在缺乏有机化合物的培养基中储存或培养ADAS制剂来选择营养缺陷型亲代菌株，从而提供减少ADAS制剂中亲代负荷的另一种方法。
营养缺陷型大肠杆菌亲代细菌的制备
获得了一种营养缺陷型ADAS产生亲代菌株，并产生第二菌株。MACH002(表2)获自耶鲁大学(Yale University)大肠杆菌遗传储存中心(Coli Genetic Stock Center；CGSC)(菌株CGSC14165)。MACH002为一种产生ADAS的具有minB破坏的组氨酸(his-53)和甲硫氨酸(metB65)双重营养缺陷型菌株。为构建第二营养缺陷型ADAS产生亲代菌株，将实例1和表3中所述的pFtsZ质粒转化至亮氨酸营养缺陷型(leu-)TOP10大肠杆菌菌株中，并用50μg/mL卡那霉素选择以产生MACH151(关于全基因型，参见表2)。当将无水四环素添加至培养物上清液中时，TetA启动子的TetR阻抑被缓解，FtsZ蛋白表达，并且亲代细菌产生ADAS(实例1)。根据实例2的方法产生大肠杆菌ADAS，但在培养基(对于MACH002)中包括组氨酸和甲硫氨酸，或在培养基(对于MACH151)中包括无水四环素和亮氨酸。使用实例2中的方法纯化ADAS，然后储存在没有组氨酸且没有甲硫氨酸的培养基(对于MACH002)或没有亮氨酸的培养基(对于MACH151)中。
来自营养缺陷型亲代菌株的ADAS的纯度增加
从营养缺陷型和非营养缺陷型亲代菌株产生ADAS。制备MACH060(非营养缺陷型)和MACH002(组氨酸甲硫氨酸营养缺陷型)ADAS，并通过实例2中概述的方法纯化。制备MACH178(非营养缺陷型FtsZ过表达系)和MACH151(亮氨酸营养缺陷型FtsZ过表达系)ADAS，并通过实例2中概述的方法纯化，其中对生长方案进行稍许改变：在生长期间向培养物中添加无水四环素至最终浓度为50ng/mL，以诱导由于FtsZ表达引起的ADAS产生。为测量ADAS制剂的纯度，在实例2中纯化过程的初始4000×g依序离心步骤后收集1mL上清液样品。这些样品含有ADAS和通过依序离心未去除的任何亲代细菌细胞。然后将100μl等分试样铺在非许可培养基(M9+0.2％葡萄糖)上，并在37℃下孵育过夜。第二天，通过计数每个板的CFU数量来列举亲代负荷(图8A和8B)。从野生型MACH060和MACH178产生的ADAS制剂具有大量亲代负荷，而来自MACH002和MACH151两种营养缺陷型的ADAS制剂均展现了不可检测水平的亲代细菌。因此，通过两种不同方法产生的营养缺陷型ADAS制剂各自的纯度高于来自非营养缺陷型ADAS的ADAS制剂。在一些非详尽实施例中，MACH002的亲代负荷显示至少比MACH060少106个；MACH151的亲代负荷显示至少比MACH178少104个。
实例3：ADAS的表征
本实例描述了使用各种途径表征ADAS的经纯化群体和/或未纯化的ADAS产生细菌培养物的方法，这些途径包括电子显微术、光学显微术和免疫荧光、纳米粒子表征、活细胞铺板、免疫印迹和流式细胞术。
扫描电子显微术(SEM)
使用SEM来观察分隔的过程，并证实在各种目的细菌菌株中ADAS群体的存在。为制备SEM样品，将玻璃盖玻片置于24孔板中，涂布0.01％聚赖氨酸并干燥。然后，使用实例1中描述的分子克隆程序产生目的菌株，培养至高细胞密度，并且在一些情况下进行实例2中所述的ADAS纯化程序。将目的菌株或纯化的ADAS悬浮在PBS中并转移至具有涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片的24孔板中，并使其在室温下沉降30分钟。将溶液小心地吸出并用SEM固定剂(含有2.5％甲醛-戊二醛的0.1M二甲胂酸钠(sod cac)缓冲液)替换。第二天去除固定剂，用水洗涤样品，从24孔板去除盖玻片并使用临界点干燥来干燥。干燥后，将盖玻片安装在Hitachi SEM安装台上的碳带上，溅射涂布10nm铂膜，并使用Hitachi S-4700场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)成像。图1A显示了MACH009(野生型大肠杆菌)、MACH060(具有minCDE缺失以使得能进行ADAS产生的大肠杆菌)以及来自MACH060的经纯化ADAS(参见表2)的代表性图像。MACH009野生型大肠杆菌菌株表现出大肠杆菌的正常表型，其中所有子代细胞具有同等尺寸(图1A，左面)。未纯化的MACH060菌株显示了尺寸多分散性增强且存在ADAS粒子的群体，这些ADAS粒子较小且为球形(图1A，中图)。经纯化MACH060仅显示ADAS群体(图1A，右图)。使用上述SEM，也可以在未纯化群体中观察使用不同的ADAS产生技术(分别为过表达ftsZ和minCDE缺失)由弧菌属和沙门氏菌属中的细菌物种产生的ADAS(数据未显示)。此外，在未纯化图像中，异常分隔事件很显著；异常分隔为在ADAS产生前的事件。
光学显微术和免疫荧光
使用实例1中描述的分子克隆程序产生MACH060大肠杆菌菌株，然后培养至高细胞密度过夜。分别用0.01％聚赖氨酸溶液涂布来自
的35mm培养皿的玻璃盖玻片底部5min；将溶液吸出，并将培养皿干燥。将1μL液滴形式的MACH060的致密悬浮液置于盖玻片底部并使其几乎干燥。然后添加1mL 2.8％多聚甲醛/0.04％戊二醛固定剂后维持30min。将样品在PBS中洗涤3次，用0.1％TritonTM X-100(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))渗透，用PBS洗涤2次，进一步用10μg/mL溶菌酶渗透，用PBS洗涤2次，用1％驴血清封闭，用PBS洗涤2次，用一抗(抗大肠杆菌LPS)染色，洗涤，并用与Alexa
555(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))结合的二抗染色。用DAPI将培养皿复染10min，并用PBS洗涤3次。在Olympus IX83倒置显微镜(奥林巴斯公司(Olympus))上使用100倍油浸物镜对最终培养皿进行成像。使用公开可用的软件包Fiji提供图像。图1B显示了100倍的相位显微术(左图)和荧光(中图和右图)的代表性图像，这些图像显示在亲代群体内存在具有LPS膜染色但缺乏基因组(没有DAPI阳性染色)的ADAS。
纳米粒子表征
使用实例1中描述的分子克隆程序产生大肠杆菌BW25113的ADAS产生菌株MACH124，然后在1L培养基中培养至高细胞密度并进行实例2中描述的ADAS纯化程序。将ADAS的经纯化群体悬浮在1×PBS中，稀释至107与109个粒子/mL之间的浓度，并添加
20(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))至最终浓度为0.1％(v/v)以最小化粒子聚集。将ADAS的此悬浮液稀释20倍，装载到TS2000柱(
Supplies有限公司)上，并在
nCS1TM纳米粒子分析仪上分析。nCS1TM通过在定义尺寸的收缩方向上施加偏置电压并监测电阻随时间的变化来测量悬浮液中个别粒子的大小和浓度(Fraikin等人,Nature Nanotechnology[自然纳米技术],6(5):308-313,2011)。测量了在200至2,000nm范围内的24,392个粒子。在其他实例中，测量的粒子的数量在10-100,000个粒子之间。将得到的数据绘制成累积尺寸分布(图1C)，累积尺寸分布揭示了在从MACH124纯化的ADAS的悬浮液中直径为200与2,000nm之间的粒子的浓度。从MACH124纯化的ADAS的最高浓度位于400至800nm的尺寸范围内。另外，将数据以积分范围报告的形式输出，该报告列举了经纯化ADAS的悬浮液中200至2,000nm粒子的聚集体体积(图1D)。总的来说，这些数据展现了经纯化ADAS的浓度和尺寸分布可以通过纳米粒子表征方法定量。另外，可以将在ADAS的经纯化群体中观察到的小分子(例如，ATP-实例4和5)、核酸或蛋白质(例如，GFP-实例4和5)的定量除以ADAS的聚集体体积或测定中存在的粒子的数量，从而使得能够计算ADAS的经纯化群体内目的小分子、核酸或蛋白质的平均浓度。
活细胞铺板
为确定纯化之前和之后存在的活亲代细菌细胞的浓度，通过活细胞铺板测定实例3C中描述的ADAS产生培养物和经纯化ADAS群体。通过将100μL ADAS产生培养物或ADAS的经纯化群体反复转移至900μL 1×PBS中来制备连续稀释物。然后，在选择性培养基上放置10μL每种稀释物，并在37℃下孵育，以允许活细胞生长。24小时后，计数含有1-100个菌落的稀释物，并且将此菌落计数乘以适当的稀释因子，以列举每毫升样品的菌落形成单位(CFU)的数量(即，每种样品中存在的活细胞浓度)(图1E)。MACH124培养物>108CFU/mL，与大肠杆菌的高密度培养物一致；然而，经纯化ADAS群体中存在的活细胞的数量小于此测定的检测限100CFU/mL。因此，可以通过活细胞铺板来列举样品中存在的活细胞的浓度，并且实例2中描述的ADAS纯化程序足以在一些实施例中将经纯化ADAS中存在的活细胞数量降低至至少低于100CFU/mL。
免疫印迹
为评价测量ADAS蛋白组成的能力，我们表征了ADAS中两种看家蛋白DnaK和GroEL的存在，已知这些蛋白存在于亲代大肠杆菌细菌细胞中。使用实例1中描述的分子克隆程序产生大肠杆菌BW25113的ADAS产生菌株(MACH060)和MG1655的ADAS产生菌株(MACH200)，然后在100mL培养基中培养至高细胞密度并进行实例2中描述的ADAS纯化程序。同时，将5mLADAS产生培养物的等分试样在20,000×g下粒化，并再悬浮在5mL 1×PBS中，然后在1×PBS中稀释100倍。将4×NuPAGETM LDS样品缓冲液(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))添加至100μL稀释培养物的等分试样中和经纯化ADAS中以裂解样品。将各种裂解物在85℃下孵育2分钟，然后在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离40μL的每个样品。包含10ng经纯化重组大肠杆菌GroEL蛋白(艾博抗公司(Abcam)，ab51307)或重组DnaK蛋白(艾博抗公司(Abcam)，ab51121)的阳性对照也在85℃下在1×LDS样品缓冲液中变性2分钟并在凝胶上分离。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，在室温下在
(PBS)封闭缓冲液
中封闭1小时，并在室温下与靶向GroEL(艾博抗公司(Abcam)，ab90522)或DnaK(艾博抗公司(Abcam)，ab69617)的抗体的1:1,000稀释物一起孵育过夜。然后将印迹在过量PBS+0.05％
20中洗涤，在室温下与缀合于荧光染料的抗小鼠(
926-68070)和抗兔(
926-32211)抗体一起孵育1小时，再次在过量的PBS+0.05％
20中洗涤，并在InvitrogenTM iBrightTM成像仪(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))上成像。对应于GroEL和DnaK的特定条带存在于含有来自ADAS产生培养物的裂解物的泳道和含有来自经纯化ADAS的裂解物的泳道中(图1F)；因此，可以通过免疫印迹检测ADAS的蛋白质含量。
实例4：测量ADAS活性
我们测试了ADAS执行细胞工作的能力和我们测量此工作的能力。我们通过检查ADAS中的三磷酸腺苷酶(ATP)的水平，并通过评定ADAS转录和翻译靶蛋白的能力来测量工作能力。细胞执行工作的能力与其ATP的水平直接相关。ATP为原核和真核生物体的主要能量载体，ATP在其三个磷酸基团之间的键内携带化学能量，该化学能量在这些键被破坏时释放。ATP是必需的细胞过程所需要的，这些细胞过程如转录、翻译、转运和代谢。
A.ATP测量
使用来自浓缩培养物上清液的选择性产物，如实例2中所述纯化衍生自MACH060(BW25113ΔminCDE；表2)亲代细菌的ADAS。如实例3中所述，对经纯化ADAS进行纳米粒子表征和活细胞铺板程序。经纯化ADAS制剂中ADAS的浓度为5×108ADAS/mL，并且存在的粒子的总体积为3.2×1016nm3/mL。CFU铺板揭示，存在于ADAS的经纯化群体内的活细胞(例如，亲代细胞)的浓度在检测限(100CFU/mL)或低于检测限。
按照制造商的说明书，使用BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega))一式三份地测量ADAS的经纯化群体中存在的ATP浓度。简而言之，向含有100μL经纯化ADAS或用作分子标准物的定义质量的ATP的孔中添加100μL再水化的测定缓冲液。将来自每个孔的发光信号记录在板读取器上。绘制log-对于定义质量ATP的转化的发光信号与log-转化的ATP质量的图，并且拟合这些数据的线以产生标准曲线。随后，将含有经纯化ADAS的孔中观察到的发光信号代入此标准曲线以计算该孔中存在的ATP的质量(图2A)。由活细胞污染物产生的ATP水平低于测定的检测限，并从总ADAS中作为背景扣除。将经纯化ADAS的每个孔内存在的ATP质量除以孔内存在的ADAS的聚集体粒子体积：此比率表示经纯化ADAS群体内存在的ATP的浓度<100CFU/mL。
B.ATP产生
为了确定ADAS在基因组不存在下产生ATP的能力，随时间测量了来自经纯化ADAS的ATP浓度。使用来自浓缩培养物上清液的选择性产物，如实例2中所示纯化衍生自MACH124(BW25113ΔminCDE；表2)的ADAS。向经纯化ADAS补充富含营养的培养基(10％路尼亚肉汤(Luria Broth))以及50μg/mL抗生素羧苄西林。将ADAS分为两个等分试样并平行测试；将一个等分试样立即储存在4℃下，并且将另一个等分试样在Eppendorf
中在37℃，800rpm下孵育2小时。孵育两小时后，如上所述测量两个等分试样的ATP浓度。孵育2小时使ATP的量增加54.9％，指示ADAS可以在基因组不存在下产生ATP(图2B)。
C.靶蛋白GFP的转录和翻译：
为测量ADAS转录和翻译靶基因的能力，用pGFP转化MACH060(BW25113ΔminCDE(表2))，pGFP为一种编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒。将此序列针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，并克隆至含有TetA启动子、TetR阻抑子(其阻抑TetA启动子)、pMB1复制起点和用于抗生素选择的卡那霉素(kanamycin)抗性基因的质粒中。然后，从此菌株(MACH124)衍生ADAS，并且使用来自浓缩培养物上清液的选择性产物，如实例2中所示纯化。通过CFU铺板确定亲代负荷处于检测限(<100CFU/mL)。为检查ADAS中的蛋白质表达，采用了两种方法：(1)使用板读取器测量GFP荧光随时间的变化，和(2)免疫印迹。
(1)板读取器法
将经纯化ADAS或亲代细菌在基本生长培养基(最小盐(M9)培养基，其具有0.2％酪蛋白氨基酸、0.2％葡萄糖和100μg/mL头孢曲松)中孵育。向经纯化ADAS样品补充抗生素，以阻止任何含基因组的亲代细菌生长。另外，对于诱导的样品，向培养基添加诱导物无水四环素至最终浓度为100ng/mL。在添加无水四环素后，TetA启动子的TetR阻抑减轻，并且GFP蛋白表达。分别使用479nm和520nm的发射和激发波长来进行GFP信号检测。图2C-2E展现了在MACH124 ADAS中，在12小时内，GFP转录和翻译的诱导物依赖性增加，如通过GFP荧光所测量。在诱导物不存在(未诱导)下，GFP信号没有增加。此发现显示ΔminCDE ADAS能够以诱导物依赖性方式转录和翻译靶基因。此外，图2C显示，由经纯化ADAS产生的GFP信号并非来源于亲代污染，因为100CFU/mL亲代细菌的GFP信号显著低于ADAS的GFP信号并且不随时间增加。
(2)免疫印迹方法
将MACH124经纯化ADAS以及补充有100μg/mL羧苄西林和无水四环素(1000ng/mL)诱导物的等体积路尼亚肉汤等分至无菌离心管中。将样品在37℃，800rpm下在Eppendorf
中孵育24小时。24小时后，将ADAS在4℃，20,000×g下离心10分钟。去除上清液，并将粒化的ADAS再悬浮在裂解缓冲液(1×BugBusterTM蛋白提取试剂(MilliporeSigmaTM)以及1×NuPAGETM LDS样品缓冲液(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)))中，并在85℃下加热2分钟。然后将等体积的裂解ADAS装载到4％-12％的BisTris聚丙烯酰胺凝胶中。将凝胶上的蛋白质分离，转移至硝酸纤维素膜，并在室温下在
(PBS)封闭缓冲液
中孵育60分钟。然后将膜与一抗(小鼠抗GroEL(艾博抗公司(Abcam)，ab90522)，1:500稀释，以及兔抗GFP(艾博抗公司(Abcam)，ab6556)，1:500稀释)在室温下一起孵育60分钟。将抗体再悬浮在补充有0.2％
20的
PBS封闭缓冲液中。随后将膜在1×PBS+0.05％
20中洗涤三次，然后在补充有相关二抗(山羊抗小鼠800(艾博抗公司(Abcam)，ab216772)和山羊抗兔680(艾博抗公司(Abcam)，ab175773)，均1:5,000稀释)且具有0.2％
20的
PBS封闭缓冲液中孵育。将膜在1×PBS+0.05％
20中洗涤三次，并在InvitrogenTMiBrightTM成像器(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))上成像。通过密度测定法定量带强度，并将GFP强度表示为针对装载对照GroEL归一化的形式。图2F展现了在诱导的ADAS中检测的GFP蛋白的量呈时间依赖性增加。
实例5：从ΔminCDE亲代产生的ADAS具有高活性
通过板读取器和免疫印迹测定从包含突变ΔminC、ΔminD或ΔminCDE的亲代细胞纯化的ADAS，以比较其转录和翻译GFP报告基因的能力。出乎意料地，发现衍生自ΔminCDE亲代细胞的ADAS的活性高于衍生自ΔminC或ΔminD亲代细菌细胞的ADAS。
A.从ΔminCDE、ΔminC或ΔminD培养物纯化ADAS
将ADAS产生菌株MACH124(BW25113ΔminCDE+pGFP)、MACH556(BW25113ΔminC+pGFP)和MACH557(BW25113ΔminD+pGFP)(参见表2)在1L培养基中培养至高细胞密度，并进行实例2中描述的ADAS纯化程序。表3中进一步详细描述了这些菌株中所有3种所具有的pGFP质粒。如实例3中所述，对经纯化ADAS进行纳米粒子表征和活细胞铺板程序。ADAS的浓度为：MACH124＝2.4×109ADAS/mL，MACH556＝1.86×109ADAS/mL，及MACH557＝1.98×109ADAS/mL。发现经纯化ADAS中存在的活亲代细菌细胞负荷低于CFU铺板的检测限(<100CFU/mL)。
B.通过板读取器测定的GFP表达动力学
如实例4C中所述，评定ADAS以诱导物依赖性方式表达GFP的能力。图3A和3B显示了MACH124、MACH556和MACH557 ADAS中持续12小时的GFP转录和翻译的诱导物依赖性增加。在诱导物不存在(未诱导)下，ADAS不产生GFP。将图3A和图3B中的数据如实例4C中所述归一化。衍生自所有三种最小基因座缺失菌株的ADAS能够在诱导后表达GFP，而衍生自MACH124(BW25113ΔminCDE)的ADAS随时间产生更高的GFP信号。在12小时，MACH124 ADAS GFP信号比MACH557ADAS高约119％，并且比MACH556 ADAS高约186％。因此，由ΔminCDE亲代产生的ADAS在诱导后GFP的表达水平高于由ΔminC或ΔminD亲代产生的表达水平。
使用对于MACH124、MACH556和MACH557观察到的原始GFP产生曲线来比较从每种菌株纯化并在诱导物存在下孵育的ADAS的总蛋白质产生和蛋白质产生的平均速率。根据每个数据集拟合回归线，并且使用GraphPad Prism计算曲线下面积，曲线下面积反映12小时的总GFP产生。MACH124 ADAS产生的GFP显著多于MACH556或MACH557 ADAS(图3D)。为评定实验过程中GFP产生的平均速率，将每个曲线下面积除以实验的持续时间。MACH124 ADAS 12小时的GFP产生平均速率显著大于MACH556或MACH557 ADAS(图3E)。最后，将MACH556和MACH557ADAS产生的GFP的总量表示为由MACH124 ADAS产生的GFP的百分比，将由MACH124ADAS产生的GFP归一化为100％。将这些数据绘制在(图3F)中。MACH124(ΔminCDE)ADAS产生的GFP总量大于MACH556(ΔminC)和MACH557(ΔminD)中的任一种。
C.通过免疫印迹测定的GFP表达
将MACH124、MACH556和MACH557 ADAS在37℃，800rpm下，在Eppendorf
中，在具有50μg/mL羧苄西林的50％LB培养基中并且在无水四环素(1μg/mL)存在或不存在下孵育24小时。如实例3中所述进行免疫印迹。24小时后，将ADAS在4℃，20,000×g下离心10分钟。去除上清液，并将粒化的ADAS再悬浮在裂解缓冲液(1×BugBusterTM蛋白提取试剂(MilliporeSigmaTM)以及1×NuPAGETM LDS样品缓冲液(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)))中，并在85℃下加热2分钟。然后将等体积的裂解ADAS装载到4％-12％的BisTris聚丙烯酰胺凝胶中。将凝胶上的蛋白质分离，转移至硝酸纤维素膜，并在室温下在
PBS封闭缓冲液中孵育60分钟。然后将膜与一抗(小鼠抗GroEL，1:500稀释，以及兔抗GFP，1:500稀释)在室温下一起孵育60分钟。将抗体再悬浮在补充有0.2％
20的
PBS封闭缓冲液中。随后将膜在1×PBS+0.05％
20中洗涤三次，然后在补充有相关二抗(山羊抗小鼠800和山羊抗兔680，均1:5,000稀释)的Intercept PBS封闭缓冲液+
20中孵育。将膜在1×PBS+0.05％
20中洗涤三次，并在InvitrogenTM iBrightTM成像器(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))上成像(图3C)。通过密度测定法定量带强度(图3C，中图)，并将GFP强度表示为针对装载对照GroEL归一化的形式(图3C，下图)。MACH124 ADAS展现了与MACH556和MACH557 ADAS相比，GFP的产生增加，指示MACH124(ΔminCDE)在蛋白质产生方面显示更高的活性。
实例6：具有膜呈现蛋白的ADAS
本实例展现了作为ADAS的模型靶向剂的纳米抗体的膜呈现。纳米抗体为已知的最小功能抗体片段，并且最近的研究显示其可以在大肠杆菌细胞的表面上表达(Salema和Fernandez,Microb Biotechnol[微生物生物技术],10(6),2017)。表面纳米抗体可以有效地结合靶蛋白，并且可以用于增强细胞特异性结合亲和力。本实例展现靶向剂(在此情况下为纳米抗体)可以在ADAS的表面上表达。
A.含有HER2靶向纳米抗体的大肠杆菌菌株的产生
为构建能够靶向HER2受体(与乳癌相关)的ADAS，合成了质粒(pNeae-NB2)(表3)，这些质粒具有与EHEC O157:H7菌株EDL933stx-的紧密素基因融合的纳米抗体序列。具体地，将紧密素基因(Neae)N末端部分的583个氨基酸与以下融合：E标签(SEQ ID NO:5)、甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸接头、NB2纳米抗体序列(SEQ ID NO:6)、丝氨酸-甘氨酸接头以及C末端FLAG标签(SEQ ID NO:7)。将此序列针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，并克隆至含有TetA启动子、TetR阻抑子(其阻抑TetA启动子)、CloDF13复制起点和用于抗生素选择的卡那霉素(kanamycin)抗性基因的质粒中以产生pNeae-NB2(参见表3)。在向培养物上清液中添加无水四环素后，TetA启动子的TetR阻抑减轻，并且Neae-NB2融合蛋白表达。Neae-NB2融合蛋白组装至具有该质粒的大肠杆菌亲代细菌细胞的外膜，NB2纳米抗体向外呈现。将pNeae-NB2质粒与氯霉素抗性盒一起转化至具有minCDE基因座缺失的大肠杆菌BW25113菌株中，并通过在生长培养基中添加50μg/mL卡那霉素和35μg/mL氯霉素进行选择而产生MACH284(参见表2)。
B.产生表达HER2纳米抗体的ADAS
制备MACH060(未修饰，阴性对照ADAS)和表面具有靶向抗体的MACH284ADAS，并通过实例2中概述的方法纯化，其中对生长培养基进行稍许改变。此处，在生长期间向培养物中添加无水四环素至最终浓度为50ng/mL，使得当从亲代产生ADAS时，这些ADAS从质粒表达靶向Neae-NB2融合蛋白。
C.ADAS表面上HER2纳米抗体呈现的证实
为证实在ADAS表面上表达Neae-NB2，我们进行了免疫荧光标记。如通过使用
nCS1TM纳米粒子分析仪的分析所确定，将来自MACH060和MACH284的ADAS在PBS中稀释至约5×108个粒子/mL的浓度。将靶向Neae-NB2融合物中的E标签特征的抗体(艾博抗公司(Abcam)，ab3397)添加至样品中，使得在1mL样品中的最终浓度为5μg/mL。将这些样品轻轻混合，并保留在冰上孵育2.5小时。孵育后，通过在4℃，15,000×g下离心10分钟来收集ADAS。丢弃上清液，并将颗粒轻轻再悬浮在800μL PBS+0.05％v/v
20中。将其重复洗涤两次，并将最终颗粒再悬浮在0.5mL PBS+0.05％
20中。将2.5μL与
550荧光团(艾博抗公司(Abcam)，ab98489)缀合的驴抗兔添加至样品中，轻轻混合，并在冰上孵育1小时。在此孵育后，通过在4℃，15,000×g下离心10分钟来收集ADAS。丢弃上清液，并将颗粒再悬浮在500μL PBS+0.05％
20中。将此洗涤总共重复三次，并将最终颗粒再悬浮在250μL缓冲液中。将200μL样品取出至黑壁透明底96孔聚丙烯板中。然后通过对孔使用区域扫描来读取此板在600nm下的光密度和
550荧光(激发：487nm，发射：528nm)。图4显示了使用针对光密度归一化的
550荧光的标记实验的结果。野生型MACH060ADAS显示可忽略的荧光，而呈现Neae-NB2纳米抗体的MACH284 ADAS显示荧光统计学上显著增加约10倍。因此，靶向纳米抗体有效地表达并呈现在ADAS的外膜上。
实例7：ADAS的负载物产生和递送
本实例展现本发明的ADAS能够产生并递送对靶细胞或生物体具有特异性作用的负载物。作为模型，我们产生了大肠杆菌ADAS，这些大肠杆菌ADAS产生特异性环二核苷酸(CDN)。具体地，ADAS经诱导以产生细菌核苷酸c-二-AMP，这些c-二-AMP通过哺乳动物细胞的RECON(还原酶控制的NF-κB)(Witte等人,Mol Cell[分子细胞],30(2):167-178,2008)，通过表达异源酶参与干扰素基因刺激因子(STING)路径。本实例进一步展现ADAS可以表达催化负载物产生的酶，该酶可以然后将该负载物递送至靶细胞。
A.刺激STING的大肠杆菌ADAS的构建
为产生能够活化STING路径的ADAS，在BW25113大肠杆菌ΔminCDE::CamR(MACH060)菌株中表达了二腺苷酸环化酶，如实例1中所制备。为此，将单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(登录号：Q8Y5E4)的二腺苷酸环化酶A(DacA)蛋白的氨基酸序列针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化，由综合DNA技术公司(IntegratedDNAtechnologies)从头合成，并克隆至含有TetA启动子(pTet)、TetR阻抑子(其阻抑TetA启动子)、pMB1复制起点和用于抗生素选择的β-内酰胺酶基因的质粒中，得到pSTING质粒(表3)。将此质粒转化至MACH060(BW25113大肠杆菌ΔminCDE::CamR)中，并通过在生长培养基中使用100μg/mL羧苄西林和35μg/mL氯霉素进行选择而产生菌株MACH198(表2)。当用添加至生长培养基中的无水四环素诱导时，MACH198产生DacA，DacA催化两个ATP分子缩合成有效的STING活化因子环-二-AMP。
B.MACH060和MACH198 ADAS的纯化
为进行STING活化测定，使用实例2中概述的方法制备MACH060和MACH198，其中进行微小改变。简而言之，使用两种MACH198培养物：一种正常成长(未诱导)，并且一种添加200ng/mL无水四环素(诱导)。浓缩ADAS，使用0.2μm瓶盖过滤器收获，并再悬浮在THP1-DualTM生长培养基(InvivoGen)中以使最终浓度为约109个粒子/mL。如通过实例2中概述的CFU铺板方法所评定，残余亲代负荷显示少于200CFU/mL的亲代细菌细胞。
C.使用哺乳动物细胞测定来评定功能
使用THP1-DualTM单核细胞细胞系(Invivogen)，使用发光读数来评定STING路径的活化。THP1-DualTM细胞的特征在于Lucia基因，其为在ISG54最小启动子以及五种IFN刺激的反应元件控制下的分泌型萤光素酶报告基因。当IFN刺激的反应元件例如通过暴露于c-二-AMP(例如，通过包含c-二-AMP的ADAS(例如，MACH198ADAS)的吞噬作用)活化时，ISG54最小启动子被活化，并且萤光素酶被转录，翻译并分泌到细胞培养基中。为定量萤光素酶，将底物QUANTI-LucTM(InvivoGen)添加至细胞培养基中。QUANTI-LucTM含有萤光素酶底物腔肠素，腔肠素在被萤光素酶水解时产生光信号，该光信号可以使用板读取器定量。
为评定ADAS是否活化THP1-DualTM细胞中的STING路径，根据InvivoGen的说明书培养THP1-DualTM细胞，并以5×105个细胞/mL的浓度以每孔125μL接种于96孔板中。以约4×107ADAS/mL以每孔100μL的体积添加来自MACH060、未诱导的MACH198和诱导的MACH198(表2)的ADAS。在37℃下孵育42小时后，将板在300×g下离心5分钟。最后，从每个孔取出20μL培养基，并置于每孔含有50μL QUANTI-LucTM的白壁板中。立即用板读取器读取发光。图5A显示了来自每个实验条件的样品的针对所添加ADAS的体积归一化的平均发光，如实例1中所述使用
nCS1TM纳米粒子分析仪所测定。每种ADAS条件包括6个生物重复样。从MACH060 ADAS获得极少发光信号至未获得发光信号，这些MACH060 ADAS不含DacA基因，并且基本上未触发THP1-DualTM细胞中IFN刺激的反应元件。然而，含有在pTet控制下的DacA基因的MACH198 ADAS却能刺激THP1-Dual细胞。在通过无水四环素存在下培养诱导DacA表达的样品中观察到最高刺激。此外，当单核细胞经历IFN基因的刺激时，细胞呈现活化表型并从悬浮液中的非粘附单核细胞转变为活化的粘附巨噬细胞。我们在暴露于各种ADAS群体的样品中观察到此转变。图5B显示在用无水四环素诱导的MACH198 ADAS处理THP1-DualTM细胞的样品中活化的粘附表型最明显。
下游I型干扰素反应的引发是STING路径的功能所必需的。此反应的特征为I型干扰素，诸如干扰素β(IFNB1)的分泌。为进一步阐明ADAS诱导功能性STING反应的能力，使用人IFN-βQuantikine ELISA试剂盒(DIFNB0，R&D
)对每个样品的IFNB1定量。从上述测定孔中吸出细胞上清液，并稀释至ELISA的线性范围内。根据制造商的说明书进行ELISA。图5C显示了ELISA的结果。MACH060ADAS和小分子STING激动剂(作为对照提供)显示IFNB1水平低于ELISA测定的检测限(<5pg/mL)，而未诱导的MACH198 ADAS显示痕量IFNB1(约7ng/mL)，并且诱导的MACH198显示在细胞上清液中分泌的IFNB1增加了40倍(约300ng/mL)。因此，ADAS展现了通过表达异源酶制备负载物的能力，该负载物被递送至靶细胞并诱导功能(在此情况下为免疫调节)反应。
实例8：用RNA负载物装载大肠杆菌ADAS
本实例描述了RNA负载物在ADAS中的表达和包装，在此情况下，该RNA负载物为靶向来自小菜蛾(Plutella xylostella)的胰凝乳蛋白酶的基因(chy1)的dsRNA。
A.含有dsRNA的大肠杆菌亲代系的构建
为构建包装有dsRNA的ADAS，将对应于小菜蛾胰凝乳蛋白酶chy1基因的编码区的一部分的412bp序列(SEQ ID NO:8)克隆至含有双重T7启动子、pMB1复制起点以及用于抗生素选择的氨苄西林(ampicillin)抗性基因的质粒L4440中(Fire等人,Nature[自然],391(6669):806-811,1999)，从而产生pRNAi(参见表3)。将此质粒转化至MACH300(表2)中，MACH300为含有氯霉素抗性盒的大肠杆菌HT115(DE3)ΔminCDE菌株，并通过在生长培养基中添加50μg/mL羧苄西林和35μg/mL氯霉素进行选择而产生MACH301(参见表2)。MACH301还带有编码RNA酶III的rnc基因的破坏以及四环素抗性盒，该RNA酶III降解dsRNA。此菌株另外带有DE3原噬菌体，该DE3原噬菌体编码在lac启动子后面的T7 RNA聚合酶基因的拷贝。当将异丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)添加至培养基时，T7 RNA聚合酶表达。然后T7RNA聚合酶从两个T7启动子转录插入的chy1序列，产生相应的dsRNA。
B.具有dsRNA的ADAS的产生
制备装载有dsRNA的MACH301 ADAS，并通过实例2中概述的方法纯化，其中对生长条件进行改变。简而言之，用含50μg/mL羧苄西林的LB 1:200稀释MACH301的过夜培养物，并生长至OD600＝0.4。随后向培养物中添加IPTG至最终浓度为1mM，并且继续生长4小时，以使得当从亲代产生ADAS时，这些ADAS从质粒表达dsRNA构建体。
C.ADAS中dsRNA负荷的定量
为定量ADAS中dsRNA的水平，我们通过凝胶电泳分析了核酸含量。通过在80℃下热处理如实例3中所述通过
nCS1TM纳米粒子分析仪分析所确定，在PBS中浓度为约3.3×1010个粒子/mL的ADAS 20分钟来裂解。此处理引起核酸释放，并且易于通过琼脂糖凝胶电泳观察。按照制造商推荐的设置，在2％琼脂糖E-GelTM EX(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))上运行20μL经热处理的ADAS裂解物，同时由125ng/μL体外转录的dsRNA的稀释系列产生标准曲线。使用InvitrogenTM iBrightTM成像仪(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))对核酸凝胶凝固物进行成像。用ImageJ定量带强度。装载的dsRNA的量经计算为97ng/109ADAS。本实例展现了ADAS可以有效地装载RNA负载物。
实例9：向鳞翅目(Lepidoptera)递送大肠杆菌ADAS
本实例描述了在向人工饮食添加ADAS后，ADAS在鳞翅目昆虫，特别是欧洲玉米螟中的荧光标记和观察。
A.荧光标记ADAS以进行观察
为了在欧洲玉米螟中观察ADAS，我们用NHS酯荧光染料将ADAS荧光标记。通过实例8中概述的方法制备并纯化MACH301 ADAS。将30μL 0.5M硼酸钠添加至1mL ADAS中，通过
nCS1TM纳米粒子分析仪分析测量，ADAS的浓度为1×1011。将与ADAS外膜表面上的含胺分子(例如，蛋白质的伯胺)反应的DyLightTM800NHS酯(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))以10mg/mL的浓度溶解在无水二甲基甲酰胺中。将20μL DyLightTM800NHS酯储备液添加至1.5mL管中的ADAS中并短暂涡旋。将随后的反应混合物包裹在箔中并在室温下置于摇床上一小时。为去除多余的染料，将ADAS在室温下在20,000×g下粒化10分钟，并再悬浮在1mL PBS中。将此洗涤重复3次，并将ADAS再悬浮在最终体积为1mL的PBS中。
B.向欧洲玉米螟(ECB)喂养标记的ADAS
从(班宗研究公司(Benzon Research Inc.))获得欧洲玉米螟(玉米螟虫(Ostrinia Nubilalis))卵，并用从班宗研究公司(Benzon Research Inc.)购买的人工饮食(通用夜蛾饮食)饲养。该饮食如下制备：将162g通用夜蛾饮食粉末添加至沸水中；将内含物充分混合15分钟，同时保持温度在80℃与90℃之间；将混合物冷却至70℃，添加5mL亚麻籽油并充分混合；将食物分配至饲养容器中并使其冷却且固化。
将ECB卵置于饮食上并使其可孵化和喂养。将所有饲养容器均维持在25℃，16小时:8小时明:暗循环和50％-60％湿度下。幼虫达到第2龄期后，将其用于喂养测定。为准备用于喂养的装备，制备25mL通用夜蛾饮食，倒入(趁热，70℃)0.4升容器(Sistema 1543KlipIt盒)的盖子中，并立即在固化时在食物中放置底部切除(从底部去除约2mm)的48孔PCR板，此产生个别孔，这些孔具有用于第2龄期幼虫的此喂养测定的正确量的饮食。为施用DyLightTM800NHS酯标记的ADAS或PBS作为对照，分别将2μL标记的ADAS或PBS添加至5个孔中并使其干燥。然后将个别第2龄期幼虫添加至每个孔中并喂养1小时。
C.欧洲玉米螟中荧光ADAS的观察
为观察ECB幼虫中的ADAS，将喂养PBS或DyLightTM800NHS酯标记的ADAS的幼虫从孔取出，放置在粘带上以将其固定，然后放置在成像表面上。使用700nm和800nm通道两者来扫描幼虫。700nm通道中的幼虫自发荧光；因此，使用此通道定位成像仪上的幼虫。使用800nm通道检测幼虫中标记的ADAS。
图6显示了喂养实验的结果，其中在喂养PBS的幼虫中在800nm通道中具有非常少的信号，而在喂养DyLightTM800NHS酯标记的MACH301 ADAS的幼虫中具有强荧光信号。因此，当添加至饮食中时，ADAS被欧洲玉米螟食用并存在于欧洲玉米螟中。
实例10：ADAS的储存
在本实例中，我们展现了使用大肠杆菌作为模型ADAS产生细菌来配制和储存ADAS的方法。根据实例1-3中提供的方法合成并纯化具有诱导型GFP质粒的大肠杆菌ADAS。然后将其储存在各种条件下，以评价其重构和存活的能力。
A.寒冷条件下ADAS的纵向储存
在本实例中，评定了ADAS在4℃下储存0天和3天后以诱导方式表达GFP的能力。ADAS衍生自三种菌株，这三种菌株含有在四环素诱导型启动子控制下驱动GFP表达的pGFP质粒(表3)：MACH124(BW25113ΔminCDE)、MACH556(BW25113ΔminC)和MACH557(BW25113ΔminD)，有关基因型信息，请参见表2。如实例2中所指示，使用来自浓缩培养物上清液的选择性产物纯化ADAS。对于经纯化的MACH124制剂，在纯化后立即测定ADAS的浓度为2.4×109ADAS/mL，并且在储存3天后为2.18×109ADAS/mL。对于经纯化的MACH556制剂，在纯化后立即测定ADAS的浓度为1.86×109ADAS/mL，并且在储存3天后为2.2×109ADAS/mL。对于经纯化的MACH557制剂，在纯化后立即测定ADAS的浓度为1.98×109ADAS/mL，并且在储存3天后为2.08×109ADAS/mL。所有ADAS浓度测量均使用
nCS1TM纳米粒子分析仪(如实例3中所概述)进行。如实例3中所述，对经纯化ADAS制剂进行纳米粒子表征和活细胞铺板程序。对于每种制剂，如实例3中所述，通过CFU铺板确定活细胞负荷为检测限(100CFU/mL)或低于检测限。如实例4C中所述，评定储存的ADAS以诱导物依赖性方式表达GFP的能力。在第0天(未储存)，观察到诱导物依赖性GFP信号，在所有三种菌株中该诱导物依赖性GFP信号在12小时内增加。储存3天后，我们观察到MACH124和MACH557 ADAS中持续12小时的GFP转录和翻译的诱导物依赖性增加(图7A-7F)。MACH556显示GFP信号诱导物依赖性增加直到约6小时，然后到12小时信号降回未诱导水平。在诱导物不存在(未诱导)下，对于任何测试菌株，GFP信号没有增加。将图7A-7F中的数据如实例4C中所述归一化。
B.ADAS的冻干和重构
为检查冻干后ADAS进行工作的能力，在冻干后1、2或6周的再水化ADAS中测量ATP水平。此外，还评定了冻干的ADAS在再水化后转录和翻译靶基因GFP的能力。如实例2中所示纯化来自MACH124的ADAS。为冻干ADAS，将经纯化ADAS在21,000×g下粒化20分钟，并再悬浮在微生物冻干缓冲液(OPS Diagnostics)中。将ADAS在液氮中快速冷冻，并在设定为0.3mbarr的真空的LabconcoTM FreeZone冷冻干燥器的自动设定上冷冻干燥18小时。将冷冻干燥的ADAS在室温下在Ziploc袋中储存在黑暗中直至再水化为止。为确定ADAS冻干后的ATP水平，将ADAS在冻干后1、2和6周再水化，并按照制造商的说明书使用BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))测量ATP水平。该测定显示，在储存1、2或6周后，冻干和再水化的ADAS保持类似水平的ATP，其中第2周和第6周的ATP水平与第1周测量的ATP水平相比略微增加(分别增加1.49和1.48倍)。此数据展现冻干、储存或再水化过程能维持ATP水平。
另外，使用实例4C中所述的方案测试再水化ADAS以诱导物依赖性方式转录和翻译GFP的能力。图7G和7H显示了持续15小时的再水化MACH124 ADAS中GFP信号的诱导物依赖性增加。在诱导物不存在(未诱导)下，GFP信号没有增加。将图7G和图7H中的数据如实例4C中所述归一化。
在再水化ADAS中观察到的活性指示冻干过程能维持ADAS完整性。
实例11.用于表征ADAS的补充方法
本实例描述了用于表征ADAS和亲代细胞的组成的各种补充分析方法。
A.电子显微术
如实例12中所述，从亲代细菌、细胞碎片和内毒素纯化ADAS。为观察包括鞭毛和分泌系统的周质结构，将ADAS在分离后以与先前方法类似的方式进行渗透压休克(H C Neu和L A Heppel.240:3685-3692,1965)。然后，按照Wu等人,Analyst[分析],2015的方案，在透射电子显微镜(日本东京电子株式会社(JEOL,Tokyo))中观察分离的周质结构。
B.荧光和光学显微术
使用荧光设备直立显微镜(Leica、Zeiss、CCD摄像机和宽谱光源)观察ADAS和亲代细菌。将6、12、24或96孔格式(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))的组织培养多孔、Transwell插入物(康宁公司(Corning))或涂有琼脂的聚苯乙烯皮氏培养皿(petri dish)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))内的样品进行实时成像。另外，可以将样品固定在这些容器中或玻璃盖玻片上以进一步分析。
C.浓度的OD600测量
为定量给定体积的培养基中存在的ADAS或亲代细菌的数量，在OD600下测量光密度，并采用以下等式：
ADAS的数量/ml＝OD600×A×B
其中A为与亲代细胞相比的ADAS的相对尺寸，并且B为与ADAS的OD600以及其LPS含量有关的校准曲线因子。此衍生自细菌细胞的标准AD600测量。
D.ADAS和亲代细菌的纳米粒子跟踪分析
纳米粒子跟踪分析典型地用于测量囊泡的纯度并进行改变以测量ADAS纯度。简而言之，使用构造成具有激光和高灵敏度数码相机的NanoSight LM10系统(英国埃姆斯伯里NanoSight有限公司(NanoSight Ltd,Amesbury,UK))进行纳米粒子跟踪。使用标准软件使用预期的粒度作为输入来收集并分析视频。将每个样品稀释至在108个粒子/ml范围内的已知浓度(使用分光光度定量)，并使用NanoSight的泵系统在受控流下施用和记录。摄像机以最大帧速率和分辨率操作。定量正确尺寸范围内的粒子的数量，以及该尺寸范围外的全部粒子(例如，亲代细胞)的百分比。
E.动态光散射和ζ电位
使用动态光散射(DLS)(来自马尔文仪器公司(Malvern Instruments Ltd.)的Zetasizer Nano S)测量ADAS和亲代细菌群体尺寸分布。通过将ADAS悬浮液暴露于光，通过使用公开的方案(Jorge Stetefield,Biophys Rev[生物物理学评论](2016)8:409-427)将散射光强度与溶液中的物体的扩散系数相关来测量流体动力学半径。这些研究先前已经用纳米粒子、细菌、蛋白质和核酸以类似方式进行。典型地使用一次性比色皿来进行ADAS尺寸测量以维持无菌和避免交叉样品污染。对于需要有机溶剂的一些应用，使用可再使用的玻璃比色皿，其中使用小心的清洁方案，这些方案包括用洗涤剂(Alconox)、5％乙酸、DI水和70％乙醇依序清洁，随后为彻底的干燥过程。
F.免疫荧光染色：
使用实例12中描述的方法从亲代细菌分离ADAS。将ADAS稀释并在500g下在洁净的玻璃盖玻片上旋转，并固定在4％多聚甲醛的PBS溶液中20分钟。洗涤样品，根据制造商的说明书在抗体的染色溶液中孵育，按照制造商的说明书安装到具有抗衰减封固剂的载玻片上，干燥并在共聚焦显微镜下成像。使用ImageJ处理图像。
G.流式细胞术：
按照制造商的说明书，在NanoFCM(中国NanoFCM公司(NanoFCM,China))上使用流式细胞术分析亲代细菌和ADAS。使用荧光ADAS，以单色或双色模式(暴露于488nm和555nm波长)证实ADAS的各种特性，包括质粒吸收、蛋白质表达和纯度。例如，如制造商所述，将荧光亲脂染料，诸如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedical))掺入ADAS膜中。如实例12中所说明将ADAS分选并纯化，然后在冷磷酸盐缓冲盐水(pH＝7)中洗涤，再粒化(40,000g，5min，4℃)，稀释至(1E5、1E6、1E7)ADAS/mL，并在488nm激发和535发射下测量DiOC6荧光强度。
H.PCR
将经纯化ADAS裂解，并根据制造商的说明(凯杰公司(Qiagen))，使用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化DNA。使用寡核苷酸引物23S-正义(59GAAAGG CGC GCG ATA CAG 39)和23S-反义(59GTC CCG CCC TAC TCATCG A39)扩增大肠杆菌基因组中七个拷贝中存在的23S核糖体RNA基因的70-bp片段，如Vilalta等人,Anal Biochem[分析生物化学],2001所述。根据制造商的说明书，使用TaqMan试剂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))进行扩增反应。
I.RNA SEQ
如Giannoukos等人,Genome Biol[基因组生物学],2012所述，使用RNAseq进行全转录组分析。简而言之，将ADAS纯化至在LB肉汤中OD600为约0.5，并通过在室温下在4,000×g下离心10分钟收获。将颗粒再悬浮在25ml RNAlater(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Ambion公司(Ambion,Carlsbad,CA,USA))中。将管在4℃下在旋转器上搅拌过夜，在4,000×g下离心10分钟，置于乙醇/干冰浴中以将颗粒快速冷冻并储存在-80℃下。
根据制造商的说明书，使用Ion Total RNA-seq试剂盒v2(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))进行RNA提取。根据制造商的说明书进行使用mRNA-ONLY原核mRNA分离试剂盒(Epicentre)的酶促反应。如下使用Ovation原核RNA-Seq系统(OvationProkaryotic RNA-Seq System，美国加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司(NuGENTechnologies,Inc.,San Carlos,CA,USA))。完整的RNA为如上所述处理并根据制造商的方案合成为cDNA的DNA酶。
将经纯化产物在凝胶上选择尺寸(约300至450bp)。样品富含Illumina PE1.0和PE2.0引物(每个1μM)、1×AccuPrime PCR缓冲液I(10×)、0.5U AccuPrime Taq高保真聚合酶(5U/μL；Invitrogen)，最终体积为25μL。使用Agencourt AMPure XP珠粒(0.8×反应体积)纯化富集的反应物。在Illumina GAII或Hi-Seq仪器上对文库测序。使用Picard管处理RNA-seq数据的原始读段。简而言之，使用程序HISAT2将读段比对并分配给参考基因组。将大肠杆菌的序列数据与相应的基因组序列比对。然后分析HISAT2比对的读段并根据GenBank提供的基因组注释分配给个别基因。
J.DNA SEQ
根据制造商的说明书，使用KingFisher Flex Express 96深孔自动化平台，使用resDNASEQ定量大肠杆菌DNA试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))测量来自亲代系的残留DNA，以自动化宿主细胞系残留DNA的提取。简而言之，制备两个洗涤和一个洗脱板，并装载样品。然后将样品裂解，并使用PrepSEQ_resDNA_v1方案在KingFisherFlex上处理。使用大肠杆菌亲代系产生标准曲线，使用主混合物扩增样品，并使用SDS软件读取结果并分析。
K.凝胶
使用标准方案提取来自ADAS和大肠杆菌亲代系的DNA，并按照制造商的说明书装载到琼脂糖凝胶上进行尺寸分析。基因组DNA为约4.5Mb，而质粒DNA为约3-5kb。
I.ELISA
将FluoroSELECT大肠杆菌测定试剂盒(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))用于亲代细胞的ELISA检测。该检测系统使用当被特定酶(在肽水解期间)水解时，产生荧光信号的荧光底物。简而言之，根据制造商的说明书制备样品，并使用荧光计读取。校准后，如果测量的P1>30,000，则样品为亲代系细胞阳性。如果P1<30,000，则测量P2。如果数值(P2-P1)<(3％×P1)，则样品为阴性。
实例12.用于产生大肠杆菌ADAS的补充方法
本实例描述了用于产生和表征来自大肠杆菌的ADAS的补充方法。
A.大肠杆菌ADAS的产生
为产生ADAS，在T7启动子下用过表达ftsZ蛋白的质粒转染大肠杆菌。替代地，通过用整合质粒转染大肠杆菌产生具有破坏的MIN基因的大肠杆菌突变体。由赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)商业上合成质粒。使用标准细菌转染方法(Thermo Fisher MolecularBiology Handbook[赛默飞世尔分子生物学手册])进行转染。简言之，将感受态细胞铺在室温琼脂板上。将0.5-2ng/ml DNA添加至小瓶中的感受态细胞中，并孵育20-30分钟。然后通过将管置于42℃水浴中30-60秒来使每个管热休克，以在细胞表面中产生瞬态孔。然后将细胞铺在琼脂凝胶上，这些琼脂凝胶已预装载选择性抗生素并生长过夜，因此只有用质粒转染的细菌存活。挑取单个菌落，并在37℃下在以120rpm连续振荡下在含有50-100μg/mL氨苄西林的LB培养基中培养。随着时间的推移，所选菌落连续增殖并产生ADAS。
实例13.用于纯化衍生自大肠杆菌的ADAS的补充方法和效率测量
本实例描述了从粗制剂纯化大肠杆菌ADAS的补充方法以及表征污染性活细菌量的方法。
A.大肠杆菌ADAS的纯化
为将ADAS与亲代细菌分离以进行高纯度生产，使用洗涤、离心、无菌过滤和抗生素处理的组合。利用从先前公开的方法采用的方案(Reeve,J 1979；Jivrajani 2013；Rampley等人,2017)，其中进行数种改变。简而言之，为纯化溶液，收集亲代细菌和ADAS溶液的混合物，并在4℃下从1000g至4000g以1000g增量以增加的速度离心(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))，每个步骤10分钟，其中自悬浮液去除增加分率的亲代细胞。为进一步确保已去除亲代细菌，添加100μg/mL有效抗生素(头孢曲松)，并将样品与最终上清液溶液在4℃下孵育过夜。第二天，将溶液在4℃，400g下离心以粒化任何细胞碎片，收集富含ADAS的上清液，然后在4℃，4000g下离心5分钟。最后，使用0.2μm膜过滤器将溶液无菌过滤，然后将ADAS以所需浓度与Ca2+和Mg2+一起再悬浮在无菌PBS中。
B.测量ADAS纯化效率
在ADAS产生的每个步骤中，收集上清液或沉积物，铺在琼脂板上并在37℃下孵育，从而在视觉上证实亲代细胞从溶液中去除。同时，使用血细胞计，使用光学显微术计算ADAS和亲代细菌的数量。另外，为确保ADAS不含残余DNA，使用NucBlue Live ReadyProbes试剂(Invitrogen，R37605)进行基于荧光的测定，从而如果ADAS的残余DNA呈阳性，则将出现UV荧光。按制造商的指导添加该试剂(每毫升样品2滴)，孵育15-30分钟，并在成像前用PBS溶液洗涤以去除过量的试剂。在暴露于405nm波长光后，如果该染料已经与任何剩余DNA偶联，则其将在蓝色光谱中激发。作为复染剂，使用红色荧光FM 4-64染料(Invitrogen)作为嵌入式亲脂膜基染料，该染料将ADAS和亲代细菌的外叶染色。将激发和发射光谱与核染色分开以确保可以收集唯一信号。样品的纯度以剩余群体中ADAS的百分比＝100×(红色数量-蓝色数量)/(红色数量)的形式计算。另外，使用动态光散射(DLS)方法(马尔文Zeta Sizer)，通过比较与约1μm(亲代细胞)和约500nm(ADAS)相关的峰的大小，并显示在纯度增加的样品中亲代细胞峰接近零来评价纯度。
替代地，使用Quant-iTTMPicoGreenTMDNA测定试剂盒(Invitrogen，目录号P11496)使用供应商建立的方案确定残余ADAS DNA。在PBS中收集ADAS并使用裂解缓冲液裂解。混合PicoGreen试剂，并使用荧光测量在样品中观察反应。
替代地，将ADAS浓缩并在合适的培养基中涂布至2.5×1011ADAS/mL，并将4mL铺在具有合适的生长琼脂的60mm板上，并在合适的条件下培养。2天后计数菌落以确定每1012个ADAS的活细菌数量。
替代地，按照实例11中的方案，使用纳米粒子跟踪、Zetasizer和其他尺寸分布跟踪方法来确定尺寸分布，并检查大粒子峰的存在，这指示活细菌。替代地，在qNano Gold(伊宗科学有限公司(Izon Science Ltd.))上测试样品，该qNano Gold使用可调谐电阻脉冲感测在样品通过纳米孔时测量粒度、浓度和电荷。
实例14.大型大肠杆菌ADAS的制备
实例12中的ADAS通过破坏引起非对称细胞分裂的分隔基因并从亲代细菌细胞菌株产生ADAS来制备。本实例展现了使用直接选择性地降解亲代细菌的基因组的外切核酸酶来进行ADAS的产生，该产生提供了数种优于实例12中描述的ADAS制备的优点，例如改善了细胞质组成的控制，增加了负载物拷贝数以及增加了ATP。
A.大型大肠杆菌ADAS的产生
构建了两种质粒，(1)含有阿拉伯糖启动子以过表达sbcB或sbcCD基因的质粒，该质粒编码在多种构象中降解DNA并且使得可天然表达RecBCD来消化基因组的外切核酸酶，以及(2)含有在IPTG诱导的lac启动子的控制下敲除recA基因的盒的质粒。商业上合成这些质粒，并且按照标准方案诸如实例12中的方案，将(1)、(2)或两者转染至大肠杆菌细胞中。
B.大型大肠杆菌ADAS的纯化
在细菌培养物达到600O.D后，使用0.1％阿拉伯糖和无葡萄糖培养基或IPTG或两者来活化Exo1基因。15min、1小时、2小时和6小时后，收集细胞，在4℃下离心5分钟，并再悬浮在PBS中。如实例15中所述，使用营养缺陷型ADAS来增加溶液纯度，溶液纯度使用实例2或12中的措施确定。
实例15.用于产生营养缺陷型ADAS产生细菌菌株以增加纯度的补充方法
本实例描述了从营养缺陷型亲代菌株进行的ADAS的合成，该合成用作降低污染ADAS制剂的活细菌的数量的机制。
A.营养缺陷型大肠杆菌亲代细菌的制备
使用大肠杆菌的营养缺陷型菌株，诸如精氨酸合成敲除(argA)菌株JW2786-1，产生了具有减少的数量的亲代细菌污染物的ADAS。根据实例12的方法但向培养基添加精氨酸来产生大肠杆菌ADAS。使用实例13的方法纯化ADAS，然后储存在无精氨酸培养基中。
B.从营养缺陷型菌株进行的大型大肠杆菌ADAS的制备
使用大肠杆菌的营养缺陷型菌株，诸如精氨酸合成敲除(argA)菌株JW2786-1，从营养缺陷型亲代菌株产生大型ADAS。根据实例14的方法但在含精氨酸培养基中培养来产生大肠杆菌大型ADAS。然后使用实例14中的方法纯化ADAS。
C.展现营养缺陷型大型和常规ADAS的纯度增加
使用上述方法制备大型和常规ADAS。还使用实例12、实例13和实例14中的方法制备来自非营养缺陷型亲代菌株的ADAS以及非营养缺陷型和大型ADAS。使用实例15中的方法测量ADAS纯度。
实例16.用于测量ADAS活性的补充方法
本实例描述了用于测量ADAS活性的补充方法。
A.ATP测量
将ADAS的样品分成两部分。按照制造商的说明书，通过BacTiter Glo测定(普洛麦格公司(Promega))测量一半样品的ATP。使用实例11的方案，通过纳米粒子跟踪或NanoFCM来测量另一半的尺寸和浓度。使用适当的公式计算ADAS的总膜表面积，并且将来自BacTiter Glo测定的ATP量除以该面积，得到每单位ADAS表面积的ATP。
B.ATP降低测量
将ADAS在37℃(对于哺乳动物相关ADAS)和30℃(对于非哺乳动物相关ADAS)下孵育，并且使用部分a)中的方法测量制备时和24小时后进行的测量之间的ATP浓度的比率。
C.寿命指数测量
用具有物种适当启动子的功能性GFP质粒合成ADAS。用板读取器在30分钟和24小时时测量相对于ADAS数量、每个ADAS的平均质粒数量和溶液体积的GFP浓度。寿命指数以24小时与30分钟时的GFP产生速率的比率计算。
D.ATP消耗测量
为评价亲代细菌和ADAS的活性，测量了ATP产生率。按照制造商的说明书，使用Seahorse XF(安捷伦公司(Agilent))测量ATP产生率。
替代地，将ADAS样品对半分。用ATP合成抑制剂，诸如二环己基碳化二亚胺处理一半的样品。然后根据制造商的说明书，用BacTiter-Glo(普洛麦格公司(Promega))测定该两半。两个样品的差异被认为是ATP产生率。
实例17.用于储存衍生自大肠杆菌的ADAS的补充方法
本实例描述了使用大肠杆菌作为模型ADAS来储存和配制ADAS的补充方法。根据实例12中的方法合成具有pBAD GFP质粒的大肠杆菌ADAS，并根据实例13中的方法纯化。然后将其储存在各种条件下，以展现其重构和存活的能力。
A.ADAS大肠杆菌的纵向储存
将ADAS储存在4℃下等渗缓冲液中，以维持结构完整性和化学活性。在临使用前，将ADAS再温热至37℃。
B.寒冷情况下ADAS的纵向储存
将ADAS储存在4℃下等渗缓冲液中0、30、60、90或180天。
C.ADAS的冻干和重构
将ADAS离心并再悬浮在以下溶液中：含20％w/vol脱脂乳的生长培养基，含20％w/vol脱脂乳的水，含12％w/vol蔗糖的水与生长培养基的50:50混合物，试剂18：胰蛋白胨大豆肉汤，1.5g；蔗糖，10g；牛血清白蛋白级分V，5g；蒸馏水，100ml，以及试剂20：蔗糖，20g；牛血清白蛋白级分V，10g；蒸馏水，100ml。将所有溶液通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。然后将ADAS在液氮中快速冷冻并冻干。将粉末在0℃、-20℃和25℃下储存0、30、60、90、180天。在测试期结束时，将粉末用水或LB肉汤重构。
使用实例16中的评价方法评价重构后的ADAS活性。
D.ADAS的冷冻和重构
将ADAS离心并再悬浮在10％、20％和30％vol/vol甘油和生长培养基中。将ADAS在液氮中快速冷冻，或者在Nalgene Mr.Frosty中缓慢冷冻。将ADAS储存在-20℃和-80℃下0、30、60、90、180天。在测试期结束时，将粉末用水或LB肉汤重构。
使用实例16中的评价方法评价储存后的ADAS活性。
E.ADAS的喷雾干燥和重构
将ADAS离心并再悬浮在含20％w/vol脱脂乳的生长培养基、含20％w/vol脱脂乳的水或含12％w/vol蔗糖的水与生长培养基的50:50混合物中。然后将ADAS在实验室规模的装置中喷雾干燥并收集。将粉末在0℃、-20℃和25℃下储存0、30、60、90、180天。在测试期结束时，将粉末用水或LB肉汤重构。
使用实例16中的评价方法评价喷雾干燥后的ADAS活性。
实例18.评定大型ADAS与亲代细菌的相似性
本实例描述了比常规ADAS更类似于亲代细菌的大型ADAS。
A.大型大肠杆菌ADAS与其他ADAS的比较
根据实例12中的方法合成大肠杆菌ADAS，并根据实例13中的方法纯化。将ADAS、大型ADAS和亲代细菌的样品铺到孔板中，并在初始铺板的30分钟内进行测定。使用RNAseq(实例14中所述)表征细胞质组成，以表征存在于不同样品中的不同RNA转录物。使用qPCR评价不同样品的拷贝数，以使用基于现有方案的方法，定量单个质粒的信号至已知拷贝数的质粒标准品的信号(Anindyajati等人,“Plasmid Copy Number Determination byQuantitative Polymerase Chain Reaction[通过定量聚合酶链反应确定质粒拷贝数]”Scientia pharmaceutica[药物科学]第84卷,1 89-101,2016年2月14日)。另外，使用实例11中描述的ATP活性测定来比较三种条件的寿命。
ADAS、大型ADAS和亲代细菌的样品均使用前述实例12-15中所述的方法制备和纯化。如实例12中所述，使用RNAseq进行全转录组分析，并注意到转录大小的差异。
实例19.用于展现营养缺陷型ADAS的较高纯度的补充方法
本实例描述了由营养缺陷型亲代制备的ADAS，在分离后，这些ADAS比由非营养缺陷型亲代制备的ADAS更纯。
A.营养缺陷型大肠杆菌亲代细菌的制备
使用大肠杆菌的营养缺陷型菌株，诸如精氨酸合成敲除(argA)菌株JW2786-1，产生了具有减少的亲代细菌污染物的ADAS。根据实例12的方法但向培养基添加精氨酸来产生大肠杆菌ADAS。使用实例13的方法纯化ADAS，然后储存在无精氨酸培养基中。
B.营养缺陷型大型大肠杆菌ADAS的制备
为产生营养缺陷型大型ADAS，使用大肠杆菌的营养缺陷型菌株，诸如精氨酸合成敲除(argA)菌株JW2786-1大肠杆菌。根据实例14的方法产生大型ADAS，其中具有如下改变：通过表达argA蛋白增加了sbcB质粒，从而使得仅具有sbcB的ADAS能在培养基中存活。使用实例14中的方法纯化ADAS。
C.展现营养缺陷型大型和常规ADAS的纯度增加
使用上述方法制备营养缺陷型大型和常规ADAS。还使用实例12、实例13和实例14中的方法制备非营养缺陷型ADAS以及大型ADAS。使用实例13中的方法测量ADAS纯度。
实例20.用于判定是否表达ATP合酶的ADAS具有较高活性的补充方法
ATP合酶表达和组装为所有生物体中的紧密调节过程。大肠杆菌抵抗含ATP合酶的质粒的转录，因为过表达可能对细胞致命。本实例描述了合成过表达ATP合酶的ADAS的两种策略。
A.过表达atpI的大肠杆菌ADAS的产生
使大肠杆菌K12系在正常培养条件下生长，使用TRIzol试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))纯化总RNA，并用2U无RNA酶的DNA酶处理1h。使用以下引物对atpI进行RT-PCR，atpI为参与由ATP合酶产生能量的基因：5'-TCAGGCAGTCAGGCGGCTT-3'，atpI-F；5'-TTACCCTTTGTTGTTAATTACAGC-3'，atpI-R，如Chen等人,Adv Mat Res[先进材料研究],2014所述。PCR条件包括在96℃下初始变性5min，然后在96℃下1min、在55℃下1min和在72℃下1min进行15个循环，以及在72℃下最终延伸7min。将PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上分离。通过Bio-Rad软件分析并比较预期条带的强度。为过表达能量代谢基因，采用表达载体pET15b。将atpI基因的PCR产物引入质粒pET15b中，得到表达载体pAtpI。将表达载体电穿孔至大肠杆菌BL21(DE3)中，并通过在OD550 0.4至0.5下添加IPTG诱导。
如实例12中所述从此系产生大肠杆菌ADAS，并如实例13中所述纯化。
B.用含有ATP合酶的质粒产生大肠杆菌ADAS
商业上合成如Brockmann等人,J Bacteriol[细菌学杂志],2013中所述的含有ATP合酶盒的质粒pBAD33.atp，并使用文章中描述的方法转染至大肠杆菌BL21(DE3)中。然后按照实例12从这些细胞产生ADAS，其中去除葡萄糖并向培养基添加0.03％wt/vol阿拉伯糖。然后使用实例13中的方法纯化ADAS。
C.大肠杆菌ADAS与具有ATP合酶的大肠杆菌ADAS的活性比较
使用实例15中的方法来合成和表征由上述方法制备的大肠杆菌ADAS和未添加ATP合酶的大肠杆菌ADAS。
实例21.用于ATP合酶ε组分经抑制的ADAS中活性增加的测定
细菌FoF1 ATP合酶的ε亚单位(atpC)为ATP合成/水解活性的固有抑制剂。与野生型细胞相比，此调节结构域缺陷型突变体在各种生长条件和应激源下表现出生长速率、摩尔生长产率、膜电位或细胞内ATP浓度没有显著差异(Klionsky等人,JBacteriol[细菌学杂志],1984)。在本实例中，大肠杆菌细胞通过诱导切除ε亚单位合成，或由敲除菌株制备。
A.通过诱导切除ATP合酶ε亚单位产生大肠杆菌亲代系
获得大肠杆菌菌株JW3709或atpC敲除的其他菌株。使用四环素控制的反式活化因子(tTA)构建质粒，以通过商业服务在四环素(tet)不存在下诱导表达atpC。将构建体电穿孔至atpC敲除菌株中，以允许在tet不存在下表达atpC并在没有tet的培养基中生长。使用实例12中描述的方案从这些细胞合成ADAS，并用实例13中的方法纯化。
使用实例15中的方法表征由上述方法在tet存在和不存在下制备的大肠杆菌ADAS、由菌株JW3709制备的大肠杆菌ADAS和常规大肠杆菌ADAS。
实例22.具有改变的糖酵解路径的高活性ADAS
由于糖酵解路径为合成ATP的方式之一，因此上调关键酶可以在细胞中产生更多ATP。本实例描述了从含有表达pfkA和tpi的质粒的大肠杆菌产生高活性ADAS，该大肠杆菌已显示产生更多ATP(参见Shimosaka等人,Ag.Bio.Chem[农业生物化学],1981)。
A.表达pfkA和tpi的ADAS的合成
使来自大肠杆菌遗传储存中心的大肠杆菌菌株pLC16-4生长，并使用市售质粒纯化试剂盒提取质粒pLC16-4。按照Eppendorf方案号4308 915.511，制备电转感受态大肠杆菌C600细胞，并用质粒pLC16-4电穿孔。简而言之，使细胞在37℃下在LB培养基中从大肠杆菌的新鲜过夜培养物生长至0.5-0.6的OD600的密度。然后将细胞放在冰上，冷冻离心，再悬浮在0℃的水中，在冷冻水中洗涤，并稀释至2×1011个细胞/mL的浓度。然后将40μL细胞与含10pg质粒的水混合并电穿孔。接着立即使细胞在37℃下在SOC培养基中生长长达30-60min，然后在标准培养条件下成长。接着根据实例12中的方案从含有和不含pLC16-4质粒的大肠杆菌C600制备大肠杆菌ADAS，并根据实例13纯化。
B.过表达pfkA和tpi的ADAS与常规ADAS的比较
使用实例15中的方案测量含有和不含pLC16-4质粒的大肠杆菌C600的活性。
实例23.用于在专用培养条件下合成的ADAS中活性增加的测定
培养条件可以显著改变体外细胞的生长、成熟、存活(Wang D,Yu X,GongyuanW.Pullulan production and physiological characteristics of Aureobasidiumpullulans under acid stress.[酸性应激下出芽短梗霉菌的普鲁兰多糖产生和生理学特征]Appl Microbiol Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]2013；97:8069-77)。本实例描述了增加细胞内ATP的化合物和条件的筛选。非详尽地，在初始强调pH、氧浓度和所施加电压下使用大肠杆菌。此代表了用于鉴别新培养基添加剂以调谐细胞ATP水平的补充方法。
使用实例12中描述的方法合成和分离ADAS。分离后，将ADAS在各种培养基条件下培养，并根据制造商的说明书，使用Seahorse(安捷伦公司(Agilent)，ATP测定试剂盒)测量ATP产生速率。使用0.1mM、0.3mM、0.4m、1mM或10mM葡萄糖作为基线。
A.在低pH下合成ADAS
使用逐滴添加柠檬酸和NaOH来调谐ADAS生长培养基的pH。使用pH 4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5的培养基，并使用Seahorse ATP测定立即以及在1、4、6、10小时后测量细胞内ATP。
我们的结果显示在较低pH，诸如4.5、5、5.5、6、6.5的条件中ATP供应提高。
B.低氧环境中ADAS的合成
为模拟低氧培养基条件，将培养基在暴露于ADAS之前在各种气体混合物(1％、5％、7.5％、10％、15％、20.95％O2)中孵育24小时。然后在预调节的培养基中培养大肠杆菌ADAS，并使用Seahorse ATP测定立即以及在2小时后测量细胞内ATP。
我们的结果显示，1％、5％、7.5％、10％、15％、20.95％氧浓度的培养基在2小时后使细胞内ATP增加。
C.施加交流电场下的ADAS的合成
根据先前为大肠杆菌培养开发的定义方案，将强度振幅为1-100V/cm之间的交流电场施加到刺激细胞内在标准LB培养基中生长的ADAS上(Zrimec等人,CELL.MOL.BIOL.LETT.[细胞与分子生物学快报]第7卷.第1期.2002)。简而言之，在两个平行的铂电极(0.75cm2有源区，分开2mm)之间建立电压，并且使用频率发生器(Metex MS-9150)施加电场。将样品保持在低温(在刺激期间<5℃)下，并且在没有DC分量下以及在50Hz至1000kHz范围内的频率下从0V至100V改变电极电压的幅度。
结果指示，如制造商规定使用BacTiter Glo测定(普洛麦格公司(Promega)所测量，在处于最高电压的样品中ADAS中的从头ATP产生增加。
实例24.用于去除鞭毛和其他非必需特征的ADAS中活性增加的测定
为使大肠杆菌ADAS中的非必需结构特征的存在达最少，用含有生长、分裂和代谢基因的必需物的简化基因组合成亲代系。研究显示，用此类“必需”基因组合成的大肠杆菌不仅存活和分裂，而且甚至可以提供一些有用的特性。Posfai等人,Science[科学],2006显示这些菌株显示高电穿孔效率以及准确地繁殖在其他未修饰菌株中不稳定的重组基因和质粒。因此，这些经修饰菌株不仅产生去除不必要结构的大肠杆菌ADAS，而且与来自未修饰亲代系的大肠杆菌ADAS相比具有增强的活性。
如Arigoni等人,Nature Biotech.[自然生物技术],1998和其他参考文献中所述，使用基于基因组的方法来鉴别大肠杆菌基因组中的必需基因。简而言之，将大肠杆菌基因组与其他细菌的基因组比较使得可鉴别参与生长、成熟和分裂的关键基因。系统基因破坏证实参与存活和分裂的关键基因。除此之外，使用计算机法分析基因组结构，以稳定最小基因组。使用CRISPR-Cas9和噬菌体介导的缺失来使基因组的大区域缺失。为了产生无痕缺失，使用从Tear等人,Applied Biochem Biotech[应用生物化学与生物技术],2015调整的方案。另外，生长培养基可以掩盖或增强此类基因缺失的影响，并且这些菌株需要在各种培养基上生长以充分测试这些影响(Ish-Am等人,PLoS One[美国科学公共图书馆·综合],2015)。产生了具有特定功能(例如，转运子、结构)所必需的不同数量非必需基因的菌株文库。
A.缺失鞭毛的大肠杆菌ADAS的产生
大肠杆菌MG1655(CGSC 6300)从大肠杆菌遗传储存中心获得，并且为缺乏flhDC启动子中的IS1元件的野生型菌株。这些突变体不可运动，并且具有在紧邻IS1元件下游处开始的各种长度的缺失，该IS1元件位于flhDC操纵子的调节区内，其编码鞭毛生物合成的主调节子FlhD4C2。使用实例12中描述的方案从这些细胞合成ADAS，并用实例13中的方法纯化。
B.缺失菌毛和TXSS的大肠杆菌亲代系的产生
使用快速且容易的大肠杆菌基因缺失试剂盒(Quick and Easy E.coli GeneDeletion Kit)(基因桥公司(Gene Bridges))产生了编码菌毛和TXSS蛋白的基因经破坏的多种亲代大肠杆菌系。此试剂盒使用Red/ET重组靶向DNA分子，这些DNA分子在大肠杆菌中通过同源重组精确改变，其表达衍生自噬菌体的蛋白对，RecE/RecT或Redα/Redβ。RecE和Redα为5'-3'外切核酸酶，并且RecT和Redβ为DNA退火蛋白。简而言之，将靶向目的基因的PCR产物插入pRedET表达质粒中，并且根据制造商的说明转化待修饰的大肠杆菌菌株。通过添加L-阿拉伯糖和温度偏移来诱导Red/ET表达。Red/ET介导的重组通过插入重复盒破坏靶基因座，并使用PCR验证结果。使用实例12中描述的方案从这些细胞合成ADAS，并用实例13中的方法纯化。
C.具有与不具有鞭毛、菌毛和TXSS的大肠杆菌ADAS的比较
从上述亲代系产生ADAS，并使用实例15中的方法测量活性。
实例25.用于具有光合能力的ADAS中活性增加的测定
本实例描述了具有将光转化为PMF或ATP的能力的高活性ADAS的合成，该合成通过添加表达可以收获光能的蛋白质的质粒来进行，其中使用各种视紫质作为模型蛋白。
A.表达变形杆菌视紫质的大肠杆菌ADAS的合成
使用Walter等人,PNAS[美国科学院院报],2007所述的方案产生表达变形杆菌视紫质(PR)的大肠杆菌系。简而言之，在T7启动子下在大肠杆菌细胞中表达含有SAR86γ-变形杆菌PR变体的质粒。使细胞在T肉汤中生长，并用1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导PR表达。使用实例12中的方法从含PR的大肠杆菌细胞和不含PR的大肠杆菌细胞合成ADAS，并根据实例13中的方法纯化，其中一些ADAS在暴露于70μmol光子//(m^2s)光下纯化，并且一些在黑暗中纯化。
按照Kim等人,Microb Cell Fact[微生物细胞工厂],2012中的方案的调整版产生表达PR和视黄醛所需基因的大肠杆菌细胞。简而言之，商业上合成文章中的pAcyc-RDS质粒，并按照制造商的说明书(NEB，方案C2527)转染至化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。简而言之，使细胞在冰上缓慢融化，将1pg-100ng的质粒DNA添加至细胞的管中，将细胞轻弹4-5次，在冰上静置30分钟，在42℃下热休克10s，置于冰上5min，向混合物中添加SOC，并在37℃下培养细胞60min。然后将细胞铺在氯霉素板上进行选择，并在含有氯霉素的LB培养基中生长。使用实例12中的方法从含PR的大肠杆菌细胞和不含PR的大肠杆菌细胞合成ADAS，并根据实例13中的方法纯化，其中一些ADAS在暴露于70μmol光子//(m^2s)光下纯化，并且一些在黑暗中纯化。
B.含有变形杆菌视紫质的ADAS与不含变形杆菌视紫质的ADAS的比较
使用实例15中的方案测量含有和不含PR并在黑暗或明亮下培养的大肠杆菌的活性。
C.含有变形杆菌视紫质的ADAS与含有视黄醛和变形杆菌视紫质的ADAS的比较
使用实例15中的方案测量含有PR且含或不含视黄醛并在黑暗或明亮下培养的大肠杆菌的活性。
实例26.用于产生具有稳定的核酸和蛋白质有效负载的大肠杆菌ADAS的补充方法
ADAS内稳定的细胞内RNA(例如，miRNA、siRNA和RNA适体)是对于产生新RNA递送技术重要的步骤，因为核酸可以被细胞质中的内切核酸酶容易地降解。另外，在进入宿主细胞后，然后tRNA-RNA支架在被细胞tRNA酶Z裂解后精确分离成5'tRNA和3'前miRNA，该细胞tRNA酶Z用于定义细胞tRNA的3'末端。利用最近开发的方案(RNA.2015年9月；21(9):1683-1689.)，可以使用TRNA酶Z切割引导RNA-tRNA融合。本实例描述了衍生自tRNA的非编码RNA的支架在大肠杆菌内表达作为说明性实例，然而，使用类似的支架基方法也可以在ADAS内稳定其他核酸、蛋白质和分子。
A.具有用tRNA稳定的重组RNA有效负载的大肠杆菌ADAS
简而言之，使用实例12和13所述的方法产生和纯化大肠杆菌ADAS。基于先前开发的方案，使用两种类型的tRNA：人类tRNALys3和大肠杆菌tRNAMet(Nat.Methods[自然方法],Ponchon 2007)。两者均已经充分表征并重组表达。原则上，可以包括终止用茎基序封端的任何结构化RNA。这些结构化RNA包括适体、lncRNA和核酶。简而言之，产生含有目的RNA序列的质粒，该目的RNA序列在每一侧侧接tRNA插入序列。在该实例中，使用用于编码GFP的mRNA。
在合成含有tRNA-mRNA构建体的ADAS之后，测量RNA和蛋白质的半衰期。简而言之，将细胞转移至孔板中并在不同时间点使用裂解缓冲液裂解，在包括1min、10min、50min、100min、200min、500min、1000min、2000min和长达1000000min的各个时间点进行RNASEQ，并使用相对丰度来评价稳定性。此外，通过裂解定义数量的细胞并通过板读取器测量荧光来在相同时间点观察GFP表达。
实例27.通过从大肠杆菌ADAS去除核糖核酸酶增加负载物稳定性
RNA酶E为RNA降解的通用引发物，并且大肠杆菌中的染色体缺失会破坏大肠杆菌菌株的菌落形成能力(CFA)。本实例显示，通过使RNA酶E处于条件启动子控制下，可以实现增强的蛋白质和RNA稳定性。
A.缺失RNA酶E的大肠杆菌亲代系的合成
通过在araBAD启动子控制下插入质粒具有的Eco-rne基因产生具有Eco-rne的染色体缺失的大肠杆菌亲代系，该Eco-rne编码RNA酶E，使用该大肠杆菌亲代系来使大肠杆菌能够在阿拉伯糖存在下合成RNA酶E。将质粒整合至大肠杆菌中的方法衍生自先前方案(Tamura等人,PLoS One[美国科学公共图书馆·综合],2017)。
B.无RNA酶的ADAS的合成
从缺乏染色体Eco-rne的亲代大肠杆菌系产生ADAS。在如实例12和13中所述进行ADAS合成和纯化之前，使亲代系在无阿拉伯糖培养基中生长1、2、3、4、8、12、24、48小时或3、4、5、10、14天以使得残余RNA酶E可降解。
C.代谢活性和mRNA稳定性指数
使无RNA酶和未修饰的ADAS在LB肉汤中生长，并在2h、12h、1d、7d和30d时使用Seahors XF(安捷伦公司(Agilent)，ATP速率测定)测量ATP产生。无RNA酶ADAS显示与未修饰ADAS的代谢水平相当。两种ADAS系均在用含有GFP的质粒转化后表达GFP。使用荧光成像测量GFP表达，并使用RNAseq测量mRNA水平。
D.抑制大肠杆菌ADAS的核糖核酸酶
为抑制RNA降解，抑制RNA降解是在大肠杆菌ADAS内产生和维持功能所必需的，可以抑制现有的核糖核酸酶。为此，使用RNA酶E的小分子抑制剂。RNA酶E被认为是大肠杆菌中RNA衰减的全局引发物，并形成可降解复合物的平台。N末端形成此酶的催化部分，因此，可以用小分子抑制。
将先前为完整大肠杆菌开发的小分子筛选方法(Kime等人,Sci.Rep.[科学报告],2015)调整来评定大肠杆菌ADAS中RNA酶E的抑制，并且在体外测试抑制的最佳候选者。使用随时间定量GFP的上述样品方法来计算稳定性指数。
实例28.具有Tat信号肽的枯草芽孢杆菌ADAS的合成
本实例描述了可用于通过通道样分泌系统分泌肽的ADAS，以及能够在较长的时间段内分泌较多蛋白质的高活性枯草芽孢杆菌ADAS。
A.分泌GFP的枯草芽孢杆菌ADAS的合成
使用改变的方法合成枯草芽孢杆菌ADAS(Feucht等人,Microbiology.[微生物学]2005年6月；151(Pt 6):2053-64.)，这些ADAS具有经标记以输出至细胞质空间中的“负载物”。替代地，通过靶向的divIVA1突变(JH Cha,GC Stewart-Journal of bacteriology[细菌学杂志],1997-Am Soc Microbiology[美国微生物学会])产生枯草芽孢杆菌ADAS，但如先前在实例12和实例13中所述另外进行收集、纯化和表征。将Tat分泌系统信号融合到靶蛋白上，以诱导从ADAS细胞质产生和输出至细胞外空间中。使掺入绿色荧光蛋白(GFP)中的TAT信号肽与PhoD Tat信号肽融合，并使用前述改良的方案(Wickner等人,Science[科学]2005,B.C.Berks,Mol.Microbiol.[分子微生物学]22,393,1996)从枯草芽孢杆菌分泌出。使用荧光显微术测量细胞外GFP。
B.高活性枯草芽孢杆菌ADAS的合成
通过为枯草芽孢杆菌调整实例20-25的方法，通过使用所鉴别的基因、启动子和质粒的枯草芽孢杆菌形式来合成高活性枯草芽孢杆菌ADAS。此外，将来自部分a)的融合TAT信号的GFP质粒转染至枯草芽孢杆菌中，从而引起GFP的分泌。在1、2、4、8、12、24、48、36和72小时时测试部分a)和部分b)合成的ADAS的蛋白质分泌。
实例29.用于肿瘤抑制的免疫调节ADAS
本实例描述了能够含有和递送对宿主免疫系统具有特定作用的负载物的高活性ADAS。作为不是此概念的唯一或限制性实施例的模型，产生了分泌特异性环二核苷酸(CDN)的高活性枯草芽孢杆菌ADAS。具体地，ADAS特异性分泌细菌核苷酸c-二-AMP，这些c-二-AMP通过哺乳动物细胞的RECON(还原酶控制的NF-κB)参与STING路径(Mol Cell.[分子细胞]2008；30:167-78)。
如先前实例28中所述合成枯草芽孢杆菌ADAS。简而言之，使用(MacFarland等人:Immunity.[免疫学]2017年3月21日；46(3):433-445.)中所述的改变的测定，使人外周血单核细胞暴露于(1E6、1E7、1E8、1E9、1E10)个枯草芽孢杆菌ADAS/mL浓度(10、20、30、60、120、1200min)。随后，使细胞裂解，并且使用PCR确定hPBMC中免疫刺激基因，诸如IRF3-、IFN-和NF-κB依赖性基因的增加倍数。
实例30.恶臭假单胞菌ADAS和高活性ADAS的合成
本实例描述了使用恶臭假单胞菌作为模型生物体，从表达T6SS和植物共生的细菌合成ADAS和高活性ADAS。
A.恶臭假单胞菌ADAS的合成
从ATCC获得恶臭假单胞菌KT2440，并根据制造商的说明书培养。由商业载体产生公司从pBBR1MCS-2骨架构建在诱导型pLac-1k-J23107启动子(Cook等人,J.Ind.Microb.Biotech.[工业微生物与生物技术学报],2018)下过表达恶臭假单胞菌ftsZ的质粒。恶臭假单胞菌ADAS亲代系通过按照Chen等人,Chin.J.Appl.Env.Bio.[中国应用环境生物学报],2010中描述的方案将质粒DNA电穿孔至细菌中合成。简而言之，使恶臭假单胞菌KT2440生长至0.6-0.75的OD600，在4℃下粒化，在3mmol/L HEPES中洗涤，在Bio-Rad基因脉冲器(Bio-Rad Gene Pulser)或等效机器中电穿孔，用SOC培养基重构，并在30℃下孵育。然后将细胞铺在LB卡那霉素琼脂上进行选择，并且根据制造商的说明书生长，其中添加IPTG以诱导ADAS形成。然后使用实例13中的方法纯化ADAS。
B.通过去除鞭毛和T3SS来合成高活性恶臭假单胞菌ADAS
获得恶臭假单胞菌EM42和EM383，或按照Martinez-Garcia等人,Microb.Cell.Fact.[微生物细胞工厂],2014和Martinez-Garcia等人,Environ.Microbiol.[环境微生物学],2013中的程序合成恶臭假单胞菌KT2440的另一种无鞭毛衍生物。简而言之，将PP4329和PP4297基因的上游750-bp区域(TS1)和下游816-bp区域(TS2)进行PCR扩增，并通过重叠PCR接合TS1和TS2片段(参见Horton等人,Gene[基因],1989)。用EcoRI和BamHI消化完整的TS1-TS2片段，并接合到质粒pEMG(GenBank：JF965437.1)中以产生质粒pEMG-鞭毛。将质粒转化至大肠杆菌DH5αλpir中，并电穿孔至恶臭假单胞菌KT2440中，该恶臭假单胞菌KT2440用I-SceI兆核酸酶在3-甲基苯甲酸酯启动子存在下制备，如Martinez-Garcia和de Lorenzo,Meth.Mol.Bio.[分子生物学方法],2012中所述。通过PCR扩增TS1-TS2片段来选择阳性共整合子，并通过使用15mM 3-甲基苯甲酸酯诱导衍生自pSW-I质粒的I-SceI酶来分离。将培养物铺在LB-Ap500琼脂板上，并通过PCR证实缺失。
使用部分a)中描述的方法从所得菌株产生ADAS。
C.表达高T6SS的ADAS
通过市售基因合成将Bernal等人,ISME J.[ISME杂志],2017中指示的K1 T6SS与其天然启动子一起以及与被pLac-1k-J23107启动子替代的天然启动子一起克隆至具有amp抗性的pBBR1起点载体中(Cook等人,J.Ind.Microb.Biotech.[工业微生物与生物技术杂志],2018)。然后使用上述方法将质粒转染至产生ADAS的恶臭假单胞菌系中，在含氨苄西林和卡那霉素的LB培养基中生长，并使用实例13的方法纯化ADAS。
D.确定ADAS上的T6SS数量
使用针对VgrG三聚体的量子点标记的抗体在ADAS的表面上标记活性T6SS分泌系统。通过共聚焦显微术将其成像，并通过点状点的存在手动计数活性T6SS。计算膜上T6SS之间的平均距离，进行平方，并视为每个T6SS覆盖的表面积。
实例31.作为抗微生物剂和植物保护剂的表达T6SS的ADAS
恶臭假单胞菌为一种在植物中发现的细菌，该细菌已展现由于T6SS攻击潜在植物病原体而具有植物保护活性。本实例使用大肠杆菌作为模型细菌和油菜黄单胞菌作为模型植物病原体描述了能够使用T6SS系统裂解细菌的恶臭假单胞菌ADAS。
A.使用恶臭假单胞菌ADAS杀灭大肠杆菌
使用实例30的方法合成恶臭假单胞菌ADAS和高活性ADAS。使用从Bernal等人,ISME J.[ISME杂志],2017调整的方案使用ADAS裂解大肠杆菌细胞。简而言之，对LB板进行竞争测定。将大肠杆菌在PBS中培养至OD600为1，并在板上与恶臭假单胞菌ADAS以1:1比率混合。还将板在没有任何恶臭假单胞菌ADAS的情况下生长。将板在30℃下孵育5h，并在抗生素选择的情况下计数菌落形成单位。
B.使用恶臭假单胞菌ADAS杀灭油菜黄单胞菌。
除了将油菜黄单胞菌细胞在板上培养24小时外，使用与部分b)中所描述相同的测定使用恶臭假单胞菌ADAS裂解油菜黄单胞菌细胞。运行相同的测定，展现恶臭假单胞菌ADAS减少了油菜黄单胞菌菌落的数量，并且高活性ADAS将该数量减少得更多。
C.使用恶臭假单胞菌ADAS作为植物保护剂
按照从Bernal等人,ISME J.[ISME杂志],2017调整的方案使用恶臭假单胞菌ADAS保护植物免受破坏。简而言之，通过将细菌浸润至本氏烟草(Nicotiana Benthamiana)叶片中进行原位竞争测定。将油菜黄单胞菌的过夜培养物调节至在PBS中OD600为0.1。将恶臭假单胞菌ADAS与这些细菌以1:1比率混合。使约100μL体积反向浸润1个月龄的叶片，并标记浸润区域。在植物室(23℃，16h明亮)中孵育24h后，确定菌落形成单位。从浸润区域切除一部分叶片，在PBS中均质化，随后连续稀释。通过荧光显微术观察叶片。按照Katzen等人,J.Bacteriol[细菌学杂志],1998，使用叶片组织颜色的可见变化，基于叶片的颜色评价坏死，叶片组织颜色可以从绿色转变为淡黄色(萎黄病)，从淡黄色转变为淡褐色，以及叶片发黑(坏死)，直到后期叶片完全腐烂。
实例32.作为模型抗真菌ADAS的粘质沙雷氏菌ADAS
粘质沙雷氏菌为一种杆状革兰氏阴性细菌，其最近已经展现通过T6SS递送效应子Tfe1和Tfe2杀灭真菌细胞(Trunk等人,Nat Microb[自然微生物学],2018)。本实例描述了使用粘质沙雷氏菌ADAS来降低真菌的适应性。
A.粘质沙雷氏菌ADAS的合成和纯化
将含有假单胞菌ampR启动子PampR和粘质沙雷氏菌ftsZ基因的质粒与合成RBS一起以类似于Yan和Fong,Appl.Microbiol.Biotech.[应用微生物学与生物技术],2017中的PQY38质粒的方式引入pUC19骨架中。按照Yan和Fong,Appl.Microbiol.Biotech.[应用微生物学与生物技术],2017中的方法，使用电穿孔将质粒引入来自隐杆线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center)的粘质沙雷氏菌Db10中。简而言之，通过冷冻离心机在冷水中冷洗涤细胞，再悬浮在冷水中，添加质粒DNA，并将混合物电穿孔。之后，使细胞在30℃下在1mL SOC培养基中生长60min，然后铺在LB amp琼脂板上。接着使具有ftsZ的粘质沙雷氏菌细胞在30℃下在具有0.1％酵母提取物、2％葡萄糖和200mg/L氨苄西林的M9培养基中生长。然后使用实例13中的方法纯化ADAS。
B.展现粘质沙雷氏菌ADAS杀灭真菌的能力
使用类似于来自Trunk等人,Nat Microb[自然微生物学],2018的共培养测定测量抗真菌活性。使用光密度归一化亲代系、ADAS和靶细胞。将靶细胞和亲代系、ADAS或对照大肠杆菌以1:1体积比率混合，并将12.5μl混合物放置在固体SC+2％葡萄糖培养基上。将培养物孵育2、7和24小时，并通过在用于去除细菌和ADAS的补充有链霉素的YPDA上连续稀释和活细胞计数来定量存活的真菌细胞。还使用DIC实时观察真菌细胞以测量细胞生长和分裂。将大肠杆菌用于共培养物中作为阴性对照。粘质沙雷氏菌亲代系和ADAS两者均能够在共培养7小时后杀灭真菌细胞。
实例33.通过过表达的T3SS将蛋白质递送至人肠道上皮细胞
将细胞内蛋白递送至哺乳动物细胞的能力可以在人治疗中提供各种应用。本实例描述了可以使用ADAS T3分泌系统将异源蛋白递送至人肠上皮细胞。此模型实施例可以应用于任何数量的动物和植物应用，其中细胞内蛋白可以对靶生物体具有显著作用。
在此实验中，使人肠上皮细胞暴露于各种浓度的ADAS(1E6、1E7、1E8、1E9、1E10ADAS/mL)，并且使用荧光显微术测量上皮细胞中的细胞内GFP。将GFP阳性细胞的数量除以各种条件的细胞总数，以计算递送和给药效率。
根据ATCC培养Caco-2哺乳动物细胞系。对细胞进行修饰以表达截短的GFP(tGFP)，如Huang和Bystroff,Biochemistry[生物化学],2009所述。此截短形式的GFP表达且正确地折叠，但在提供缺失的β股之前不能发荧光。分别如实例12和13中所述制备和纯化大肠杆菌和ADAS。简而言之，将其在37℃下在具有ATCC定制伊格尔最低必需培养基(目录号30-2003)的
组织培养烧瓶(T-25、75、T-150或T255，目录号430641)中培养，这些培养基含有非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1500mg/L碳酸氢钠，补充有20％胎牛血清。为了收获用于递送测定的Caco-2细胞，用不含二价阳离子(Ca2+和Mg2+)的PBS洗涤细胞，并向细胞表面添加2-3mL 0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.05mM-EDTA溶液10-15分钟，并且用6-8mL完全生长培养基淬灭酶活性。收获后，使用自动细胞计数器(Countess II，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))和活/死染料(钙黄绿素-活，溴乙啡锭二聚体-死)将细胞计数。
A.具有来自志贺氏菌SPI-1的T3SS的大肠杆菌ADAS的制备和纯化
使用实例12中所述的方法制备大肠杆菌ADAS。为增加ADAS表面上T3SS的丰度，引入编码HilA的质粒。HilA调节现有方案采用的SPI-1T3SS(Bajaj等人,MolecularMicrobiology[分子微生物学](1995)18(4),715-727)。使用实例13中所述的方法制备ADAS。使用免疫荧光显微术和TEM肉眼检查和计数T3SS。比较分离的高纯度T3SS表达ADAS与非纯化的T3SS表达ADAS之后。
B.蛋白质分泌系统标签融合
为能够使用功能性T3SS使蛋白质分泌，使用前述质粒设计方法(Evans等人,J.Virol.[病毒学杂志],2003年2月,第2400-2409页)将GFPβ股与T3SS分泌标签SopE的前104个氨基酸融合。使质粒在亲代大肠杆菌中表达，随后ADAS含有截短的SopE-GFP杂种。
C.蛋白质递送测定
在暴露于ADAS之前，将细胞在汇合后培养1天或3天或5天，以确保可再现的细胞成熟度和极化。对于每个样品，将ADAS添加至汇合的上皮样品中，并在37℃下孵育2hr。通过将荧光细胞的总数除以培养物中的细胞总数计算ADAS递送的效率，并比较各种条件。
实例34.用于靶向递送具有T3SS系统的大肠杆菌ADAS的补充方法
靶向递送在药物递送中很重要。本实例描述了使用纳米抗体作为ADAS的模型靶向剂。纳米抗体为已知的最小功能抗体片段，并且最近的研究显示其可以在大肠杆菌的表面上表达(Salema和Fernandez,Microb Biotechnol[微生物生物技术],2017)。表面纳米抗体可以有效地结合靶蛋白，并且可以用于对个别细胞类型产生特异性。
A.含有EGFR纳米抗体的大肠杆菌亲代系的合成
如Salema等人,MAbs[美国医学期刊],2016所述，合成了表达表皮生长因子(EGFR)的表面纳米抗体的亲代大肠杆菌系。简而言之，将编码EGFR的纳米抗体的序列(TYNPYSRDHYFPRMTTEYDY)克隆至大肠杆菌呈现载体pNeae2的位点中，从而使该纳米抗体与紧密素多肽Neae的C末端融合以使得可以进行表面表达。质粒pNeae2(CmR)为pNeae载体的衍生物，该质粒编码紧密素残基1-659(来自EHEC O157:H7菌株EDL933stx-)，后接E-标签、六组氨酸(His)表位和C末端myc-标签(EQKLISEED)。
使携带含纳米抗体的质粒的细菌在30℃下在琼脂板上的LB肉汤中生长，其中使用适当抗生素进行质粒选择。诱导前的LB板和接种前培养基含有2％(w/v)葡萄糖以用于阻抑lac启动子。预接种培养物始于个别菌落(用于单个克隆)或始于克隆的混合物(在文库的情况下)，这些菌落或克隆的混合物为新鲜生长的，并从板收获，稀释至初始OD600为0.5，并在静态条件下生长过夜。为进行诱导，除非另外指示，否则通过离心(4000×g，5min)收获细菌(对应于0.5的OD600)，并在搅拌下(160rpm)在具有0.05mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)但不含葡萄糖的相同培养基中生长3h。
B.表达EGFR纳米抗体的ADAS的合成
如实例12中所述从这些亲代系合成ADAS，并如上所述装载负载物(递送GFP的蛋白质和基因)。
C.具有EGFR纳米抗体的ADAS的特异性测定
根据制造商提供的标准细胞培养方案将Caco-2(人上皮结肠直肠腺癌)和A-431(表皮癌)细胞系共培养。然后将共培养物与上述经修饰亲代系或携带负载物(GFP)的ADAS一起孵育。使用FACS分离A-431与Caco-2细胞，并定量表达GFP的靶细胞的百分比。还使用荧光显微术定量个别细胞中的荧光水平以测量注入的蛋白质亚单位的数量或由于转染引起的蛋白质表达的量。还使用显微术基于细胞形态定量细胞类型中的GFP表达以区分Caco-2与A-431细胞，以及基于免疫细胞化学以标记特异性标志物。
实例35.用于通过T3SS向植物进行递送的柑桔黄单胞菌ADAS的合成
本实例描述了从植物病原细菌产生ADAS，以及使用其天然递送功能，其中使用柑桔黄单胞菌作为模型生物体。在植物病原体中发现的T3SS形成了向植物细胞的有效蛋白质递送系统的基础。由于来自柑桔黄单胞菌的T3SS效应子尚未充分表征，因此使用测量生物膜形成的测定来评定柑桔黄单胞菌ADAS中的T3SS能力。然后可以用报道蛋白(例如，GFP)替换这些效应子，以评定通过T3SS转移异源表达的蛋白质的能力。
A.T3SS缺陷型柑桔黄单胞菌的合成
T3SS为柑桔黄单胞菌中在感染期间形成生物膜所必要的，并且增加了毒力。T3SS缺陷型柑桔黄单胞菌通过产生hrpB操纵子缺陷突变体来产生，该hrpB操纵子编码关键的T3SS蛋白(由Dunger等人,Plant Pathol[植物病理学],2005所述)。使用的引物为5'-GAACTGGGCGGGAAGAACGACGAG-3'和5'-GCCGCCGCCGAAGAAGTGATG-3'。使用含基因组DNA(100ng)的50-μL反应混合物作为模板。在Eppendorf热循环仪中进行PCR，其中在94℃下变性5min，然后在94℃下30s、在62℃下40s和在72℃下1min进行30个循环，以及在72℃下最终延伸5min。在0.9％琼脂糖凝胶中分析PCR扩增的产物。使用通过用BamHI消化产生的Xachrp-突变体DNA片段进行Southern印迹杂交，通过电泳分级分离，然后转移到Hybond-N膜。使用用[α-32P]dATP标记的经扩增hrp840bp PCR产物进行杂交和检测方案。
通过质粒整合构建hrpB突变体。将扩增的产物克隆至用SmaI消化的自杀载体pK19mobGII中，分别产生pKmobB和pKmobF。通过从广宿主范围动员性大肠杆菌菌株S17-1双亲交配，将质粒转移至地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(X.axonopodis pv.citri)中。将细菌混合物放置在Hybond-C膜上，置于营养琼脂上，并在28℃下孵育48h。然后洗涤膜，并将细菌转移至选择性培养基中。地毯草黄单胞菌柑桔致病变种突变菌株通过载体编码的抗生素抗性(Km)选择，并通过Southern杂交验证。
B.柑桔黄单胞菌ADAS的合成
为产生柑桔黄单胞菌ADAS，类似于实例12，在阿拉伯糖启动子下用过表达ftsZ蛋白的质粒(Lacerda等人,Plasmid[质粒],2017)转染柑桔黄单胞菌(hrpB突变体和未转化的柑桔黄单胞菌)。ftsZ基因序列来自Kopacz等人,MicrobiologyOpen[开放式微生物学],2018。使用的引物序列为：正向-GAGCCCATGGCACATTTCGAACTGATTGAAAAAATGGCTCCCAACGCGGTCATC AAGG；反向-AGTTCATATGCGACGCAGCCGACGCTCCTCAG。由赛默飞世尔公司(ThermoFisher)商业上合成质粒。使用上述方法进行转染。随着时间的推移，所选菌落连续增殖并产生ADAS。
C.柑桔黄单胞菌ADAS在甜橙(Citrus sinensis)上形成生物膜的能力
T3SS是柑桔黄单胞菌形成生物膜所必需的。将来自hrpB突变体和正常菌株的ADAS用于甜橙植物中的感染测定。使所有植物在28℃下在具有白炽灯的生长室中以16h的光周期生长。将ADAS纯化至OD600为1，并以104至107cfu/ml再悬浮在10mM MgCl2中。将这些用无针注射器浸润到叶片上。从用不同菌株接种的20片橙叶计数溃疡，并且使用AdobePhotoshop软件从数字化图像测量计数叶片的面积。来自表达T3SS的柑桔黄单胞菌的ADAS显示溃疡形成显著多于来自T3SS缺陷型亲代系的ADAS。
实例36.使用T4SS进行作为植物转化剂的农杆菌ADAS的合成
本实例描述了产生可以用T4SS递送有效负载，诸如模型DNA质粒的ADAS。使用根癌农杆菌作为用天然T4SS系统转化植物的方法。此使得非复制型农杆菌属可在大田中以喷雾形式使用而没有逃逸的风险。
A.用质粒转染农杆菌属
对于本氏烟草转染，使用冻融法和农杆菌属转化试剂盒(MPbio)中所述的材料，将具有抗生素抗性基因的质粒引入农杆菌属菌株GV3101中。简而言之，使农杆菌属生长至OD600为1.0至2.0，再悬浮在转化溶液中，与质粒DNA混合，浸没在液氮中1分钟，在30℃下浸没在水浴中5分钟，并与质粒上的选择标志物一起在路尼亚-贝塔尼培养基(Luria-Bertanimedium)中再生长。
为进行番茄转染，使用制造商的说明书所述的方法将具有抗生素抗性基因的质粒引入农杆菌属菌株LBA4404 ElectroMAX细胞(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))中。简而言之，将农杆菌属在湿冰上融化并与无盐、乙醇和其他污染物的经纯化质粒DNA混合。将混合物电穿孔，与室温培养基立即混合，并再生长3小时。
然后将来自任一方案的细胞稀释并铺在具有选择所需抗生素的琼脂中。第二天，或者当菌落可见时，将其选用于测序。在证实质粒同一性之后，使适当的菌落在于含有必需的选择标志物的培养基(由制造商的说明书指定)中振荡下生长过夜。
B.农杆菌属ADAS的合成
商业上合成在pSRKGm骨架上含有农杆菌属ftsZ的质粒(Khan等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学],2008)。然后使用部分a)中所述的方法将其转染至农杆菌属中，以形成根癌农杆菌ADAS亲代系。然后根据制造商的说明书使亲代系在添加IPTG下生长，并使用实例15中的方法纯化ADAS。
C.大型农杆菌属ADAS的合成
商业上合成在pSRKGm骨架上含有外切核酸酶V的质粒(Khan等人,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学],2008)。然后使用部分a)中所述的方法将其转染至农杆菌属中，以形成根癌农杆菌ADAS亲代系。然后根据制造商的说明书使亲代系在添加IPTG下生长，并使用实例13中的方法纯化ADAS。
D.具有GFP有效负载的根癌农杆菌ADAS的合成
使用Baltes等人,The Plant Cell[植物细胞],2014中提及的质粒pLSLGFP.R。使用部分a)中所示的方法转染质粒pLSLGFP.R。使用部分b)或c)中的方法合成根癌农杆菌ADAS。
E.用具有GFP有效负载的农杆菌属ADAS转染植物
使烟草(烟草克桑西变种(Nicotiana tabacum var Xanthi))植物在21℃、60％湿度下，在16-h明亮和8-h黑暗循环下生长。将来自4至6周龄烟草植物的叶片(完全展开的上部叶片)用于ADAS转化。将每株植物一片叶片进行浸润。使用1-mL注射器，用农杆菌属浸润来自烟草植物的叶片。在浸润后，立即向植物浇水并盖上塑料圆顶以维持高湿度。浸润后约24h去除塑料圆顶。将植物用荧光读取器成像，并测量具有可见GFP的叶片的百分比。
实例37.测量ADAS分泌效率
为测量ADAS的分泌效率，测量了合成和分泌内源和异源表达的蛋白质的能力。
A.合成GFP的亲代大肠杆菌系
从ATCC订购含有携带GFP和氨苄西林抗性的载体的大肠杆菌系由ATCC(
25922GFPTM)，并且根据制造商的说明培养。
B.ADAS合成分子的能力
从表达GFP的大肠杆菌亲代系以及从天然大肠杆菌产生ADAS。从作为阳性对照的表达GFP的大肠杆菌亲代系进行荧光测量，并用作从ADAS测量GFP强度的基线。根据实例12合成ADAS，铺在96孔板上，并使用板读取器测量荧光。由于ADAS不需要合成生长或分裂所需的蛋白质，因此两种ADAS在蛋白质合成中均更有效，并表现出与亲代系相比较高的GFP强度。为测量细胞水平的强度，使用标准细胞制备方案，将大肠杆菌亲代系和ADAS固定并安装在玻璃载玻片上。使用共聚焦显微镜通过荧光成像对其进行成像。使用这些图像来测量每平方单位面积的荧光强度，并且用于与亲代系直接比较。
C.ADAS分泌分子的能力
大肠杆菌使用T1SS介导的脂肪酶分泌来促进感染。T1SS含有ABC转运子，这些ABC转运子识别所分泌蛋白质中的特异性C末端序列。产生表达天然T1SS和内源脂肪酶的亲代大肠杆菌，以及用含有GFP的质粒转染的另一种系，该GFP与转运用C末端序列融合，如Chung等人,Microb Cell Fact[微生物细胞工厂],2009所述。
简而言之，将脂肪酶ABC转运子结构域(LARD)设计来用于分泌融合蛋白。LARD包括四个包含β卷结构的富含甘氨酸的重复序列，并将其添加至测试蛋白的C末端。将Pro-Gly接头或因子Xa位点添加在融合蛋白与LARD之间。在分析GFP融合蛋白的分泌之前，检查了GFP融合蛋白的表达。这些蛋白质在大肠杆菌中表达，并通过Western印迹(宾夕法尼亚州洛克兰公司(Rockland Inc.,PA)，目录号KCA215)证实其预期尺寸。另外，展现了GFP的荧光。在紫外(UV)光下观察表达这些蛋白质的大肠杆菌的代表性菌落。分泌表型可以通过脂肪酶活性追踪。将大肠杆菌在三丁基锡琼脂上培养，以检测TliA融合蛋白的分泌。当也用针对GFP的抗体检测到GFP融合蛋白时，在细胞和上清液中检测到针对LARD的抗体检测到的相同条带。
还使用从Chung等人调整的方法来测量分泌，并概述于下文中。从实例12中概述的大肠杆菌亲代系产生ADAS。
为测量ADAS的脂肪酶分泌，将ADAS铺在固体培养基(LAT：LB肉汤、1.5％Bacto琼脂、0.5％三丁基锡)上。分泌的脂肪酶使得在菌落周围产生晕圈作为典型的表型。ADAS比亲代系更快地产生晕圈。除此之外，通过添加作为底物的棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)溶解在乙醇和Tris-HCL中的溶液来以分光光度法测量脂肪酶活性。将来自ADAS和亲代系培养物的50μL上清液添加至200μL底物中，使用板读取器测量420nm的吸光度。通过光密度的增加来测量活性。
由于脂肪酶为内源表达的蛋白质，所以使用GFP测量异源表达的蛋白质的分泌。使ADAS和亲代系在LB肉汤中生长，并收集来自肉汤的上清液以测量GFP表达。根据制造商的说明书，将标准免疫印迹(宾夕法尼亚州洛克兰公司(Rockland Inc.,PA)，目录号KCA215)与GFP特异性抗体一起使用以测量GFP分泌。
实例38.含有非杆状纳米粒子的ADAS(趋磁螺菌(Magnetospirillummagneticum))
本实例描述了ADAS可以从非杆状细菌合成，并且可以含有较大的结构，诸如纳米粒子。
A.趋磁螺菌ADAS的制备
为产生ADAS，在T7启动子下用过表达ftsZ蛋白(Q2W8K6_MAGSA)的质粒转染趋磁螺菌。由赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)商业上合成质粒。使用标准细菌转染方法(参见Thermo Fisher Molecular Biology Handbook[赛默飞世尔分子生物学手册])进行转染。简言之，将感受态细胞铺在室温琼脂板上。将0.5-2ng/ml DNA添加至小瓶中的感受态细胞中，并孵育20-30分钟。然后通过将管置于42℃水浴中30-60秒来使每个管热休克，以在细胞表面中产生瞬态孔。然后将细胞铺在已预装载选择性抗生素并生长过夜的琼脂凝胶上。只有转染有质粒的细菌才能存活。挑取单个菌落，并在37℃下在以120rpm连续振荡下在含有50-100μg/mL氨苄西林的LB培养基中培养。随着时间的推移，所选菌落连续增殖并产生ADAS。替代地，使用与实例14中所使用类似的方案来制备大型ADAS。
除此之外，缺失ftsZ样基因使这些细菌中产生超顺磁磁铁矿磁小体(Ding等人,JBacteriol.[细菌学杂志],2010)。
B.趋磁螺菌ADAS保留纳米粒子的表征
如Wang等人,Front Microbiol.[前沿微生物学],2013所述使用TEM分析ADAS磁小体的形态。简而言之，将20μL细胞滴至覆盖有用碳涂布的方华膜(formvar film)的铜TEM网格上维持2h，然后用灭菌的蒸馏水洗涤两次并在空气中干燥。通过测量TEM显微照片，将磁小体尺寸定义为(长度+宽度)/2，并且将形状因子定义为宽度/长度。
C.趋磁螺菌ADAS磁性的展现
为表征趋磁螺菌ADAS的磁性特性，使用改自Ding等人,J Bacteriol.[细菌学杂志],2010的方案。简而言之，将样品冻干，并使用量子设计MPMS XL-5磁力计(灵敏度，5.0×10-10Am2)进行低温磁力测量。两次预处理后，在2.5-T磁场(在下文中，称为SIRM5K_2.5T)中在5K下获得的剩磁的热退磁经测量为5K至300K。第一预处理为在零场中将样品从300K冷却至5K(零场冷却[ZFC])，并且第二预处理为在2.5-T场中从300K冷却至5K(场冷却[FC])。Verwey转变温度(Tv)被定义为与FC曲线的最大一阶导数dM/dT对应的温度。在交变梯度磁力计(灵敏度，1.0×10-11Am2；MicroMag 2900型)上测量室温一阶反转曲线(FORC)。使用FORCinel 1.05版软件计算FORC图，其中平滑因子(SF)为2。FORC图提供关于磁性晶体的畴状态、矫顽性和静磁相互作用的信息。
实例39.环境反应性ADAS
可以在基因调节网络中编码基于布尔逻辑门(Boolean logic gate)的逻辑操作，以使细胞能够集成或区分不同的环境和细胞线索并相应地反应。可以设计定制的遗传逻辑电路，以将在天然细胞中未发现的各种细胞传感器与执行器连接。可以对这些修饰的细胞编程以响应于细胞内或细胞外的特定输入产生所要的结果。尽管存在一些缺点，诸如基因电路的非模块性和宿主体型的限制，但是其非常适用于工程化的生物体，并且在工程生物中非常有用，并且目前正在扩展遗传逻辑电路文库。已经描述了大肠杆菌中的多种此类电路，这些电路被掺入了大肠杆菌ADAS中。
这些电路形成了环境反应性ADAS的基础，其可以响应于输入(例如，代谢物、pH、热、光、外部配体)产生可调谐输出。这些电路经工程化而具有AND门来对多种输入的存在作出反应，或者具有OR门来对任何所编码的输入作出反应。此计算机指令系统可以进行扩展以包括其他逻辑门，诸如NOR、NAND、XOR等。
A.具有AND/OR门的大肠杆菌ADAS的合成
丁香假单胞菌含有一种称为hrpR/hrpS系统的III型分泌调节系统，该调节系统形成紧密调节T3SS表达的AND门。这两种蛋白质的表达是产生T3SS系统所必需的。使用标准分子生物学技术进行质粒构建和DNA操作，并且AND门的构建改自Wang等人,Nat Commun.[自然通讯],2011所述的方案。简而言之，构建了含有以下的质粒：a)IPTG诱导型Plac启动子和AND门的hrpR部分，和b)热诱导型启动子pL(来自噬菌体λ，其经常被热不稳定蛋白质抑制)和AND门的hrpS部分。输出为GFP蛋白表达，其含有T3SS启动子，并且当hrpR和hrpR两者均表达时表达。
按照标准分子生物学技术进行质粒构建和DNA操作。hrpR和hrpS基因启动子通过按照BioBrick标准通过GENEART合成。使用含有IPTG诱导型Plac的质粒pAPT110(p15Aori，Kanr)表征和具有AND门的hrpR(XbaI/KpnI)。获得了质粒pBAD18-Cm(pBR322 ori，Cmr)，该质粒含有热诱导型pL启动子并具有AND门的hrpS。使用pSB3K3(p15Aori，Kanr)克隆并表征合成AHL诱导型Plux启动子(BBa_F2620)，该启动子后来用于驱动hrpR(XbaI/PstI)。通过PCR扩增(使用来自Stratagene的PfuTurbo DNA聚合酶以及Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪)使用含有相应RBS和适当限制性位点的引物引入每个基因构建体的各种序列。替代地，所有构建体均为商业上合成的。所有构建体均在其用于靶细胞菌株中之前通过DNA测序验证(欧陆MWG操纵子公司(Eurofins MWG Operon))。
所有表征实验均在补充有适当碳源的M9基本培养基(11.28g M9盐/l、1mM硫胺素盐酸盐，0.2％(w/v)酪蛋白氨基酸、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2)中进行。使用具有不同碳源的两种M9培养基：M9-甘油(0.4％(v/v)甘油)和M9-葡萄糖(0.01％(v/v)葡萄糖)。使用的抗生素浓度为卡那霉素25μg/ml、氯霉素25μg ml-1和氨苄西林25μg/ml。使从新鲜划线板上的单个菌落接种的细胞在37℃下在振荡(200r.p.m.)下在14ml Falcon管中的4ml M9中生长过夜。除非另外说明，否则将过夜培养物以OD600＝0.05稀释至预温热的M9培养基中以用于当天培养物，将这些当天培养物进行诱导并在30℃下生长5h，随后进行分析。为通过荧光测定法进行荧光测定，将稀释的培养物装载于96孔微孔板(格瑞纳生物公司(Bio-Greiner)，黑色烟囱状(chimney black)，透明平底)中，并通过多通道移液管用5μL(对于单个输入诱导)或10μL(用于双重输入诱导)不同浓度的诱导物诱导，最终体积为200μL/孔的。
为了工程化OR门，使用Rosado等人,PLoS Genetics[美国科学公共图书馆·遗传学],2018描述的系统。首先，构建了在组成型启动子下编码RFP的顺式阻抑mRNA。在RAJ11sRNA存在下去除阻抑。合成了含有IPTG诱导型启动子PLac和热诱导型启动子pL的质粒，该两种启动子均诱导RAJ11 sRNA的表达。输出为RFP表达，该表达在响应于任一输入时观察到。
使用由转录因子LacI和pL调节的合成PL基启动子作为感测输入信号(IPTG和热)的元件。从先前研究(Rodrigo等人,PNAS[美国科学院院报],2012)获得系统RAJ11的核糖调节序列(sRNA和5'UTR)。通过PCR扩增(使用来自Stratagene的PfuTurbo DNA聚合酶以及Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪)使用含有相应RBS和适当限制性位点的引物引入每个基因构建体的各种序列。所有构建体均在其用于靶细胞菌株中之前通过DNA测序验证(欧陆MWG操纵子公司(Eurofins MWG Operon))。
将LB培养基用于过夜培养物，而M9基本培养基(1×M9盐、2mM MgSO4、0.1mMCaCl2、0.4％葡萄糖、0.05％酪蛋白氨基酸和0.05％硫胺素)用于表征培养物。使用50μg/mL浓度的氨苄西林和卡那霉素作为抗生素。
在荧光计(Perkin Elmer Victor X5)中测定GFP和RFP培养物，以测量吸光度(600nm吸光度滤光器)、绿色荧光(485/14nm激发滤光器、535/25nm发射滤光器)和红色荧光(570/8nm激发滤光器、610/10nm发射滤光器)。减去对应于M9基本培养基的吸光度和荧光的平均背景值，以校正读数。归一化的荧光以荧光和吸光度的比率计算。然后减去对应于用对照质粒转化的细胞的归一化的荧光的平均值，得到表达的最终估计值。
这些门为模型系统，并且可以进一步改变以用任何输入，包括其他化学品、细胞接触、pH和光活化。
B.具有AND/OR门的ADAS的产生
根据实例12中的方案产生ADAS，并根据实例13中的方法纯化。
C.逻辑门在ADAS中具有功能
如前所述，hrpR/hrpS需要两个输入来产生有效产生AND逻辑门的产物。使大肠杆菌ADAS经受四种条件：1.无IPTG/未加热，2.ITPG/未加热，3.无IPTG/加热和4.ITPG/加热。只有存在热和IPTG两者的条件4使hrpR/hrpS表达，从而引起GFP表达。
可以潜在地通过改变IPTG的浓度和刺激暴露的持续时间来调节GFP表达。将暴露于不同条件的大肠杆菌ADAS装载于96孔板上，并且使用荧光板读取器定量相对于不同条件的GFP表达。双盲实验证实，GFP的存在指示IPTG和热两者的存在，形成对刺激作出反应的系统的基础。
实例40.来自大肠杆菌和嗜极生物的重金属清除ADAS
重金属构成环境和健康风险，并且往往难以以有效且非侵袭性的方式去除。细菌可以经工程化以使用蛋白质如MerR的表达清除重金属诸如汞，该MerR为一种对汞具有高亲和力和选择性的金属调节蛋白。
A.表达MerR的大肠杆菌亲代系的合成
使用Bae等人,App Environ Microbiol[应用环境微生物学],2003所述的方法合成大肠杆菌亲代系。简而言之，使MerR与冰核蛋白(INP)融合以进行表面表达。将六组氨酸标签添加至融合蛋白的C末端以证实表达。
简而言之，如下构建INP-MerR融合物。使用引物merR1(5'CCGGGATCCTATGGAAAACAATTTGGAGA3')和merR2(5'CAGCTGCAGCCCTAAGGCATAGCCGAACC 3')从质粒pT7KB对merR片段进行PCR扩增。用BamHI和PstI消化扩增的片段，凝胶纯化，并亚克隆至含有插pUC18Not中的EcoRI-BamHI INP片段的经类似消化的pUNI中，产生pUNIM。所得构建体允许在大肠杆菌表面表达MerR。
为探测MerR的表面定位，将六组氨酸标签添加至INP-MerR融合物的C末端部分。用新反向引物merR3(5'ATTCTGCAGCTAATGATGATGGTGGTGGTGATAAGGCATAGCCGAACCTGCCAA GCTT3')再扩增merR片段，该引物在C末端编码六个组氨酸。制得所得质粒pUNIMH，该质粒编码INP-MerR-H6融合物。
通过在0、5、10、20、40、80、100、120、140和160μM浓度的HgCl2存在下，使细菌克隆与作为对照的未转化大肠杆菌一起在LB肉汤中生长来测量汞清除。在孵育16至120小时后，在600nm下测量每种细菌克隆的吸光度，以确定生长及其对汞的相对抗性。
B.大肠杆菌ADAS的合成和纯化
根据实例12中的方案产生ADAS，并根据实例13中的方法纯化。
C.大肠杆菌ADAS的汞清除
将大肠杆菌ADAS在含有0、5、10、20、40、80、100、120、140和160μM浓度的HgCl2的LB肉汤中孵育16和120小时。使用设计来检测汞至极低水平的测定(例如，由Brummer等人,Bioorg.Med.Chem.[生物有机与药物化学],2001设计的螯合带)来测试残余汞水平
实例41.大肠杆菌ADAS的乳糖吸收和代谢
大肠杆菌中的乳糖吸收通过膜结合的蛋白质β-半乳糖苷透性酶进行，这使得可将乳糖和其他β-半乳糖苷转运至细胞中。糖分子的转运伴有质子的共转运，这使得可使用pH敏感性染料进行吸收测定。
A.表达β-半乳糖苷透性酶的大肠杆菌亲代系的合成
使用仅含有乳糖作为糖源的肉汤合成大肠杆菌亲代系。大肠杆菌含有lac操纵子系统来在优选糖不存在的情况下吸收和利用作为糖源的乳糖。优选糖的去除诱导参与乳糖的吸收和代谢的蛋白质表达。由于吸收通过膜结合的转运子进行，所以需要诱导此系统以增加亲代系中的转运子表达，这部分决定了ADAS中的表达。另外，将含有lac操纵子系统的质粒引入大肠杆菌ADAS中以表达转运子。
B.大肠杆菌ADAS的乳糖吸收
如实例12和13中所述合成和纯化大肠杆菌ADAS。使用pH敏感性测定测量大肠杆菌ADAS的乳糖吸收。如Prabhala等人,FEBS Letters[欧洲生物化学会联合会快报],2014所述，使用pH敏感性染料8-羟基-1,3,6-三磺酸芘(pyranine)来测量乳糖吸收。简而言之，将大肠杆菌ADAS粒化，用含有140mM NaCl、5.4mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgSO4、0.3mM 8-羟基-1,3,6-三磺酸芘和不同浓度乳糖(1mM-5mM)的未缓冲克雷布斯溶液(Krebssolution)洗涤至少三次并再悬浮。将悬浮液的pH小心地调节至6.5，同时使氮气鼓泡通过悬浮液5min，并且在细胞悬浮液上方添加30mL液体石蜡，以避免由于二氧化碳溶解而改变pH。将细胞悬浮液直接转移到测定板以进行荧光测量(使用荧光计在455nm的激发波长和509nm的发射波长下)。使用空转化的大肠杆菌细胞作为阴性对照并使用亲代系作为阳性对照来进行对照实验。
C.将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖的大肠杆菌ADAS
在葡萄糖不存在下，大肠杆菌使用细菌操纵子lac操纵子来使用乳糖作为糖源。细菌操纵子为能够从一种mRNA转录物产生多种蛋白质的多顺反子转录物，在lac操纵子的情况下，细菌操纵子为lacZ、lacY和lacA。lacZ、lacY和lacA的基因产物为β-半乳糖苷酶，其将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖；β-半乳糖苷透性酶，其使得可将乳糖转运至细胞中；以及半乳糖苷乙酰转移酶，其为将乙酰基分别从乙酰-CoA转移至半乳糖苷、葡糖苷和乳糖苷的酶。乳糖转化为葡萄糖和半乳糖通过酶β-半乳糖苷酶介导，此酶的功能可以使用酶活性测定直接测量。
D.大肠杆菌ADAS的合成和纯化
如实例12和13中所述合成和纯化大肠杆菌ADAS。评价了葡萄糖不存在下大肠杆菌ADAS中的乳糖吸收。
E.通过大肠杆菌ADAS将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖
为评价酶β-半乳糖苷透性酶的活性，收集大肠杆菌ADAS，并首先使用具有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解，以防止蛋白质降解，例如如EMBL方案所述。
使用制造商的说明书，使用来自赛默飞世尔公司(ThermoFisher)(目录#K145501)的市售试剂盒来测量此酶的活性。简而言之，β-半乳糖苷酶催化β-半乳糖苷诸如邻硝基苯基-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的水解。ONPG对ONP阴离子的水解产生亮黄色。使用分光光度计或微孔板读取器定量溶液的β-半乳糖苷酶活性，以在420nm下确定转化的底物的量。
使用大肠杆菌亲代系作为阳性对照。大肠杆菌ADAS分解乳糖的能力将由乳糖转化指数(L)确定，其中L＝(大肠杆菌ADAS中的酶活性)/(亲代系中的酶活性)×100
实例42.用于降解塑料的表达PET酶的大肠杆菌ADAS
坂井艾德昂菌(ideonella sakaiensis)为一种从瓶回收设施外分离的细菌，该细菌可以分解并代谢普通塑料，聚-(对苯二甲酸乙二酯)或PET(Yoshida等人,Science[科学],2016)。其分泌酶PET酶将聚合物分解成单体。表达坂井艾德昂菌PET酶的大肠杆菌ADAS能够降解广泛使用的塑料PET(仅美国每年就有约35亿磅的PET瓶最终成为垃圾填埋场)。
A.转化大肠杆菌以表达PET酶
使用Han等人,Nat.Commun.[自然通讯],2017描述的方案合成能合成PET酶的大肠杆菌ADAS亲代系。简而言之，商业上克隆来自坂井艾德昂菌(GenBank登录号：GAP38373.1)的不含N末端29个氨基酸的PET酶，并接合到pET32a载体中。将野生型或变体形式的pET32a-PET酶质粒转化至大肠杆菌BL21trxB(DE3)细胞中，在37℃下在LB培养基中生长至OD600为约0.8，然后在16℃下用0.6mM异丙基β-d-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导24h。将亲代系与PET膜(如下在c中所述)一起孵育以证实PET酶活性。
B.大肠杆菌ADAS的合成和纯化
如实例12和13中所述合成和纯化大肠杆菌ADAS。评价了葡萄糖不存在下大肠杆菌ADAS中的乳糖吸收。
C.使用大肠杆菌ADAS的PET酶表达来降解PET
从BCRC获得坂井艾德昂菌201-F6，并根据制造商的说明书培养。将其用作测量表达PET酶的大肠杆菌的活性的阳性对照。
使用Yoshida等人,Science[科学],2016描述的方案来测量降解PET的能力。简而言之，将坂井艾德昂菌和大肠杆菌ADAS的经培养样品悬浮在具有低结晶度PET薄膜(PET膜)(约60mg，20×15×0.2mm，Mw：45×103，Mw/Mn：1.9，Tg：77℃，Tm：255℃，结晶度：1.9％，密度：1.3378g/cm3)的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将PET膜在70％乙醇中灭菌，并在无菌空气中干燥，随后置于试管中。在30℃下，将管以300冲次/min振荡。
使用CO2产生的定量作为PET分解的量度。将产生的CO2捕获在烧碱石棉中，测量重量以计算吸收的CO2。将生物膜样材料和经处理PET膜与培养基分离以确定降解的膜的碳重量。PET向CO2的转化率(R)如下计算。
R％＝CO2(PET+)×CO2(PET-)×100
_____________________________________
降解膜的碳重量
其中CO2(PET+)和CO2(PET-)分别指示在PET存在和不存在下培养产生的CO2的碳重量。
使用PET酶指数(Y)测量大肠杆菌ADAS的塑料降解效率，该PET酶指数如下计算：
Y＝R(大肠杆菌ADAS)/R(坂井艾德昂菌)
其中R指示上文所示的转化率。
可以进一步优化ADAS以表达突变的PET酶，这些PET酶已显示具有更大活性，并且增加了降解的塑料的范围，如Austin等人,PNAS[美国科学院院报],2018所述。
实例43.通过T4分泌系统分泌RNA
已经显示，T4SS能够分泌DNA，但尚未显示T4SS能够分泌RNA。本实例描述了通过将RNA结合蛋白与RNA偶联来分泌RNA。
A.具有RNA分泌型T4分泌系统的农杆菌属的合成
使为酿酒酵母(S.cerevisiae)(来自Generoso等人,J.Microbiol.Meth.[微生物学方法杂志],2016)和番茄丛矮病毒组p19(Uniprot Q66104)序列优化的Cas9与VirE2和VirF的N末端在virF启动子下融合。还在virF启动子控制下将sgRNA或siRNA序列置于此序列上。针对ILV1的sgRNA序列如Generoso等人,J.Microbiol.Meth.[微生物学方法杂志],2016所述。该方案如Vergunst等人,PNAS[美国科学院院报],2005和Vergunst等人,Science[科学],2000中所述，其中进行一些改变。简而言之，商业上合成质粒，并将其电穿孔至含有T4SS系统的农杆菌属和不含T4SS系统的农杆菌属中。然后将农杆菌属在LB板上培养，接着根据标准方案生长。通过Western印迹验证融合蛋白的存在。此外，sgRNA或siRNA序列在用市售小RNA分离试剂盒(来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))进行RNA分离后通过Quantigene测定验证。
B.展现T4SS向酵母递送RNA
用于T4SS向酵母递送的方案如Schrammeijer等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],2003中所述。简而言之，使农杆菌属菌株在具有抗生素的基本培养基中生长过夜，收获并在诱导培养基中稀释，然后在使用前生长5h。使酿酒酵母在标准培养基中生长过夜，1:10稀释，并额外再生长5h。将农杆菌属和酵母的培养物1:1混合在一起，并在纤维素硝酸盐过滤器上生长。在共培养6天后，通过铺在具有头孢噻肟(cefotaxim)的酵母培养基上分析混合物，使酵母菌落生长，并在用市售小RNA分离试剂盒(来自赛默飞世尔公司(ThermoFisher))进行RNA分离后通过Quantigene测定来分析递送的RNA的存在。
C.展现酵母中T4SS介导的DNA编辑
按照上述方案，使酵母菌落在没有异亮氨酸的培养基中生长，并且测量与具有和不具有T4SS以及具有和不具有sgRNA/Cas9盒的农杆菌属一起共培养的菌落。
其他实施例
本发明的一些实施例在以下编号的段落内。
1.一种分离的高活性非染色体动态活性系统(ADAS)。
2.如段落1所述的高活性ADAS，该高活性ADAS包含至少1/10000nm2、1/5000nm2、1/3500nm2、1/1000nm2的ATP合酶浓度。
3.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，其中该ADAS包含ATP合酶，任选地缺乏调节结构域，诸如缺乏ε结构域。
4.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS还包含光伏质子泵。
5.如段落4所述的高活性ADAS，其中该光伏质子泵为变形杆菌视紫质。
6.如段落5所述的高活性ADAS，其中该变形杆菌视紫质包含来自未培养的海洋细菌分支SAR86(GenBank登录号：AAS73014.1)的变形杆菌视紫质的氨基酸序列。
7.如段落4所述的高活性ADAS，其中该光伏质子泵为粘杆菌视紫质。
8.如段落4所述的高活性ADAS，其中该光伏质子泵为来自盐生盐杆菌、嗜盐碱单孢菌、唐松草微小杆菌、土库曼嗜盐古菌或死海盐盒菌的细菌视紫质、δ视紫质或嗜盐菌视紫质。
9.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS还包含视黄醛。
10.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS还包含视黄醛合成蛋白(或蛋白系统)，或编码其的核酸。
11.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS还包含一种或多种糖酵解路径蛋白。
12.如段落11所述的高活性ADAS，其中该糖酵解路径蛋白为磷酸果糖激酶(Pfk-A)。
13.如段落12所述的高活性ADAS，其中该Pfk-A包含UniProt登录号P0A796的氨基酸序列。
14.如段落12所述的高活性ADAS，其中该糖酵解路径蛋白为磷酸丙糖异构酶(tpi)。
15.如段落14所述的高活性ADAS，其中该tpi包含UniProt登录号P0A858的氨基酸序列。
16.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS缺乏一种或多种代谢非必需蛋白。
17.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS缺乏RNA酶、蛋白酶或其组合中的一种或多种，并且在特定实施例中，缺乏一种或多种内切核糖核酸酶(诸如，RNA酶A、RNA酶h、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶PhyM)或外切核糖核酸酶(诸如RNA酶R、RNA酶PH、RNA酶D)；或丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶；或前述任一者的组合。
18.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS还包含细菌分泌系统。
19.如段落18所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统能够穿过ADAS外膜将负载物输出至靶细胞，诸如动物、真菌、细菌或植物细胞中。
20.如段落18或19所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统为T3SS、T4SS或T6SS。
21.如段落18或19所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统为T3/4SS。
22.如段落21所述的高活性ADAS，其中该T3/4SS具有改变的效应功能，例如，选自SopD2、SopE、Bop、Map、Tir、EspB、EspF、NleC、NleH2或NleE2的效应子。
23.如段落22所述的高活性ADAS，其中该改变的效应功能用于细胞内靶向，诸如易位至细胞核、高尔基体、线粒体、肌动蛋白、微绒毛、ZO-1、微管或细胞质中。
24.如段落22所述的高活性ADAS，其中改变的效应功能为基于衍生自大肠杆菌的NleE2的细胞核靶向。
25.如段落22所述的高活性ADAS，其中该改变的效应功能用于丝状伪足形成、紧密接合破坏、微绒毛消除或SGLT-1去活化。
26.如段落18或19所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统为T6SS。
27.如段落26所述的高活性ADAS，其中该T6SS在其天然宿主中靶向细菌并含有杀灭细菌的效应子。
28.如段落26或段落27所述的高活性ADAS，其中该T6SS衍生自恶臭假单胞菌K1-T6SS，并且任选地，其中该效应子包含Tke2(登录号AUZ59427.1)的氨基酸序列。
29.如段落26所述的高活性ADAS，其中该T6SS在其天然宿主中靶向真菌并含有杀灭真菌的效应子。
30.如段落29所述的高活性ADAS，其中该T6SS衍生自粘质沙雷氏菌，并且该效应子包含以下的氨基酸序列：Tfe1(Genbank：SMDB11_RS05530)或Tfe2(Genbank：SMDB11_RS05390)。
31.如段落18所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统能够在细胞外输出负载物。
32.如段落31所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统为T1SS、T2SS、T5SS、T7SS、Sec或Tat。
33.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS在该膜中包含转运子。
34.如段落33所述的高活性ADAS，其中该转运子特异于葡萄糖、钠、钾、金属离子、阴离子溶质、阳离子溶质或水。
35.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，其中该膜包含靶向剂。
36.如段落35所述的高活性ADAS，其中该靶向剂为纳米抗体，诸如针对肿瘤抗原诸如HER2、PSMA或VEGF-R的纳米抗体。
37.如段落35所述的高活性ADAS，其中该靶向剂为碳水化合物结合蛋白，诸如凝集素，例如甘露糖结合凝集素(MBL)。
38.如段落35所述的高活性ADAS，其中该靶向剂为肿瘤靶向肽，诸如RGD基序或CendR肽。
39.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，其中该ADAS膜包含酶。
40.如段落39所述的高活性ADAS，其中该酶为蛋白酶、氧化还原酶或其组合。
41.如段落39或段落40所述的高活性ADAS，其中该酶与该ADAS膜化学缀合，任选地通过接头与该外膜缀合。
42.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS包含分散在ADAS的内部体积中的负载物，其中该负载物包含核酸、核糖体、肽、激素、氨基酸、碳水化合物、脂质、蛋白质、有机粒子、无机粒子、小分子或其组合。
43.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，其中该ADAS包含细菌分泌系统和负载物，任选地，其中该负载物包含引导该细菌分泌系统输出的部分，例如，在一些实施例中，该部分为Pho/D、Tat或合成肽信号。
44.如段落42或43所述的ADAS，其中该负载物经修饰以与该负载物的未修饰形式相比稳定性改进。
45.如段落42-44中任一项所述的高活性ADAS，其中该负载物包含蛋白质。
46.如段落45所述的高活性ADAS，其中该蛋白质为激素，例如旁分泌、内分泌、自分泌激素。
47.如段落60或段落61所述的高活性ADAS，其中该蛋白质在细胞质或其他环境中的稳定性大于约：1.01、1.1、10、100、1000、10000、100000、100000、10000000。
48.如段落42-44中任一项所述的高活性ADAS，其中该负载物包含植物激素，诸如脱落酸、生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素或其组合。
49.如段落42-44中任一项所述的高活性ADAS，其中该负载物为免疫调节剂，诸如免疫刺激剂、(例如，PD-1、PD-L1、CTLA-4)的检查点抑制剂、抑制剂、超抗原、小分子(环孢菌素A、环二核苷酸(CDN)或STING激动剂(例如，MK-1454))。
50.如段落42-44中任一项所述的高活性ADAS，其中该负载物包含RNA，诸如环状RNA、mRNA、siRNA、shRNA、ASO、tRNA或其组合。
51.如段落50所述的高活性ADAS，其中该负载物包含编码蛋白质的mRNA。
52.如段落51所述的高活性ADAS，其中该编码蛋白质的mRNA编码酶(例如，赋予肝酶活性的酶，诸如人PBGD(hPBGD)mRNA)，或抗原(例如，引发免疫反应(诸如引发有效且持久的中和抗体滴度)的抗原，诸如编码CMV糖蛋白gB和/或五聚体复合物(PC)的mRNA)。
53.如段落50所述的高活性ADAS，其中该RNA为小的非编码RNA，诸如shRNA、ASO、tRNA或其组合。
54.如段落50-53中任一项所述的高活性ADAS，其中该RNA例如用附加的台阶-环结构，诸如tRNA支架稳定。
55.如段落65-70中任一项所述的ADAS，其中该RNA在例如ADAS原生质中的稳定性大于约：1.01、1.1、10、100、1000、10000、100000、100000、10000000。
56.如前述段落中任一项所述的高活性ASAS，其中该高活性ADAS不会降解负载物。
57.如段落42或43所述的高活性ADAS，其中该负载物包含基因编辑系统。
58.如段落58所述的高活性ADAS，其中负载物为DNA，诸如质粒或环状RNA，任选地，其中该DNA或环状RNA包含蛋白质编码序列。
59.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，其中该ADAS为双膜ADAS。
60.如段落59所述的高活性ADAS，其中该双膜ADAS还包含细菌分泌系统。
61.如段落60所述的高活性ADAS，其中该细菌分泌系统选自T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS，任选地，其中T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS具有不影响靶细胞适应性的减弱或非功能的效应子。
62.如段落59-61中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS衍生自细菌亲代菌株，其中该亲代菌株选自植物细菌，诸如植物共生细菌(例如，枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌)或植物病原细菌(例如，黄单胞菌属物种或丁香假单胞菌)，或人细菌，诸如人共生细菌(例如，大肠杆菌、葡萄球菌属物种、双歧杆菌属物种、微球菌属物种、乳杆菌属物种或放线菌属物种)或人病原细菌(例如，大肠杆菌EHEC、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、耶尔森氏肠杆菌、幽门螺杆菌)，或嗜极生物，包括上述任一者的功能化衍生物，例如包括功能盒，诸如诱导细菌实施以下中的一个或多个的功能盒：分泌抗微生物剂，消化塑料，分泌杀虫剂，在极端环境中存活，制备纳米粒子，在其他生物体中整合，对环境作出反应，并产生报告信号。
63.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS衍生自选自以下的亲代菌株：大肠杆菌、农杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属、黄单胞菌属、边虫属(Anaplasma)、螺杆菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、沙门氏菌属或志贺氏菌属。
64.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS衍生自经工程化或诱导以过表达ATP合酶的亲代菌株。
65.如段落64所述的高活性ADAS，其中该ADAS包含与该亲代菌株异源的ATP合酶。
66.如段落64或65所述的高活性ADAS，其中该亲代菌株经修饰以表达功能性FoF1ATP合酶。
67.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS从在选自以下的条件下培养的亲代菌株获得：施加的电压(例如，37mV)，非大气氧浓度(例如，1％-5％O2、5％-10％O2、10％-15％O2、25％-30％O2)，低pH(约：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)或其组合。
68.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS衍生自以下中的至少1、2、3、4种或更多种的营养缺陷型亲代菌株：精氨酸(例如argA敲除，诸如菌株JW2786-1和NK5992)，半胱氨酸(cysE敲除，诸如菌株JW3582-2和JM15)，谷氨酰胺例如glnA敲除(诸如菌株JW3841-1和M5004)，甘氨酸例如glyA敲除(诸如菌株JW2535-1和AT2457)，组氨酸例如hisB敲除(诸如菌株JW2004-1和SB3930)，异亮氨酸例如ilvA敲除(诸如菌株JW3745-2和AB1255)，亮氨酸例如leuB敲除(诸如菌株JW5807-2和CV514)，赖氨酸例如lysA敲除(诸如菌株JW2806-1和KL334)，甲硫氨酸例如metA敲除(诸如菌株JW3973-1和DL41)，苯丙氨酸例如pheA敲除(诸如菌株JW2580-1和KA197)，脯氨酸例如proA敲除(诸如菌株JW0233-2和NK5525)，丝氨酸例如serA敲除(诸如菌株JW2880-1和JC158)，苏氨酸例如thrC敲除(诸如菌株JW0003-2和Gif 41)，色氨酸例如trpC敲除(诸如菌株JW1254-2和CAG18455)，酪氨酸例如tyrA敲除(诸如菌株JW2581-1和N3087)，缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸例如ilvd敲除(诸如菌株JW5605-1和CAG18431)。
69.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS由细菌细胞制得，其中该亲代菌株选自植物细菌，诸如植物共生细菌(例如，枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌)或植物病原细菌(例如，黄单胞菌属物种或丁香假单胞菌)，或人细菌，诸如人共生细菌(例如，大肠杆菌、葡萄球菌属物种、双歧杆菌属物种、微球菌属物种、乳杆菌属物种或放线菌属物种)或人病原细菌(例如，大肠杆菌EHEC、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、耶尔森氏肠杆菌、幽门螺杆菌)，或嗜极生物，包括上述任一者的功能化衍生物，例如包括功能盒，诸如诱导细菌实施以下中的一个或多个的功能盒：分泌抗微生物剂，消化塑料，分泌杀虫剂，在极端环境中存活，制备纳米粒子，在其他生物体中整合，对环境作出反应，并产生报告信号。
70.如前述段落中任一项所述的高活性ADAS，该高活性ADAS包含经修饰的膜。
71.如段落70所述的高活性ADAS，其中该膜经修饰以在植物或动物中具有较少免疫原性或免疫刺激性。
72.如段落71所述的高活性ADAS，该高活性ADAS由亲代菌株制备，其中通过用洗涤剂、酶或用PEG官能化进行产生后处理来减少或消除该亲代菌株的免疫刺激能力。
73.如段落71所述的高活性ADAS，该高活性ADAS由亲代菌株制备，并且通过敲除亲代菌株中的LPS合成路径，例如通过敲除msbB和/或purI来修饰该膜。
74.如段落71所述的高活性ADAS，该高活性ADAS由通过暴露于高渗条件产生细胞壁缺陷粒子的亲代菌株制备。
75.一种组合物，该组合物包含如前述段落中任一项所述的高活性ADAS。
76.一种包含ADAS的组合物，其中至少约：80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多该ADAS含有细菌分泌系统。
77.如段落76所述的组合物，其中该细菌分泌系统为T3SS、T4SS、T3/4SS或T6SS中的一种。
78.一种ADAS的组合物，该组合物包含T3SS，其中这些ADAS在约40000、35000、30000、25000、19600、15000、10000或5000nm2中包含大于1的平均T3SS膜密度。
79.如段落78所述的组合物，其中该ADAS衍生自鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌亲代菌株。
80.一种ADAS的组合物，该组合物包含T3SS，其中这些ADAS在约：300000、250000、200000、150000、100000、50000、20000、10000、5000nm2中包含大于1的平均T3SS膜密度。
81.如段落80所述的组合物，其中该ADAS衍生自根癌农杆菌亲代菌株。
82.一种ADAS的组合物，其中至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多ADAS含有细菌分泌系统，该细菌分泌系统包括T3、T4、T3/4SS、T6SS，并且任选地包括以下中的一种或多种：外源碳水化合物、磷酸盐产生合酶、光反应蛋白、输入蛋白、酶、功能性负载物、有机体特异性效应子、融合蛋白。
83.如段落75-82中任一项所述的组合物，其中这些ADAS为高活性ADAS。
84.如段落75-83中任一项所述的组合物，配制该组合物以用于IP、IV、IM、口服、局部(乳膏、凝胶、软膏、透皮贴剂)、气雾化或雾化施用。
85.如段落75-84中任一项所述的组合物，该组合物为液体配制品或冻干配制品。
86.一种制备如段落1-74中所述的ADAS中任一种的方法，该方法包括在促进ADAS形成的条件下培养亲代菌株，以及收集这些ADAS，任选地还包括将这些ADAS与任何残余亲代菌株细胞或其他污染物分离的步骤。
87.如段落86中任一项所述的方法，该方法包括使用单种、两种、三种或四种营养缺陷型亲代菌株，所述亲代菌株还包含表达ftsZ的质粒。
88.如段落86所述的方法，该方法包括用诱导型DNA酶系统转化亲代菌株，该诱导型DNA酶系统诸如exoI(NCBI GeneID：946529)&sbcD(NCBI GeneID:945049)核酸酶，或I-CeuI(例如，Swissprot：P32761.1)核酸酶。
89.如段落88所述的方法，该方法包括使用单种、两种、三种或四种营养缺陷型菌株，并在编码这些诱导核酸酶的质粒上具有互补基因。
90.如段落86所述的方法，其中该亲代菌株在选自以下的条件下培养：施加的电压(例如，37mV)，非大气氧浓度(例如，1％-5％O2、5％-10％O2、10％-15％O2、25％-30％O2)，低pH(4.5-6.5)或其组合。
91.如段落86所述的方法，其中该亲代菌株缺乏鞭毛和不期望的分泌系统，任选地其中使用λred重组工程去除鞭毛和不期望的分泌系统。
92.如段落86所述的方法，其中通过插入含有靶向鞭毛控制基因，诸如flhD和flhC的CRISPR结构域的质粒，从亲代菌株基因组切除鞭毛控制组分。
93.一种制备高活性ADAS的方法，其中在光存在下培养包含含有视紫质编码基因的质粒的ADAS。
94.如段落93所述的方法，其中该视紫质为来自SAR86未培养细菌的具有GenBank登录号：AAS73014.1的氨基酸序列的变形杆菌视紫质，并且任选地，该培养物另外补充有视黄醛。
95.如段落93或94所述的方法，其中该视紫质为变形杆菌视紫质，并且该质粒另外含有合成视黄醛的基因(此种质粒为来自Kim等人,Microb Cell Fact[微生物细胞工厂],2012的pACYC-RDS质粒)。
96.如段落86-95中任一项所述的方法，其中该亲代菌株含有编码纳米抗体的核酸序列，然后该纳米抗体在该ADAS的膜上表达。
97.如段落86-95中任一项所述的方法，其中该亲代菌株含有编码一种或多种细菌分泌系统操纵子的核酸序列。
98.如段落86-97中任一项所述的方法，其中亲代菌株包含负载物。
99.如段落86-97中任一项所述的方法，其中该亲代菌株含有编码一组合成小分子负载物的基因的核酸序列。
100.一种ADAS，其通过如段落86-99中任一项所述的方法制备。
101.一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括提供有效量的如前述段落中任一项所述的ADAS或组合物来接近该动物细胞。
102.如段落101所述的方法，其中提供该ADAS或组合物来在体内，在动物诸如哺乳动物诸如人中接近该动物细胞。
103.如段落102所述的方法，其中使健康动物中的该动物细胞暴露于细菌。
104.如段落103所述的方法，其中该动物细胞为肺上皮细胞、免疫细胞、皮肤细胞、口腔上皮细胞、肠上皮细胞、生殖道上皮细胞或泌尿道细胞。
105.如段落104所述的方法，其中该动物细胞为肠上皮细胞，诸如来自患有炎性肠病，诸如克罗恩氏或结肠炎的人受试者的肠上皮细胞。
106.如段落105所述的方法，其中该动物细胞为来自患有炎性肠病的受试者的肠上皮细胞，并且该ADAS包含细菌分泌系统和包含抗炎剂的负载物。
107.如段落102所述的方法，其中使患病状态的该动物细胞暴露于细菌。
108.如段落102所述的方法，其中该动物细胞为病原性的，诸如肿瘤。
109.如段落102所述的方法，其中使患病状态，诸如创伤、溃疡、肿瘤或炎性疾病的该动物细胞暴露于细菌
110.如段落102-109中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自动物共生亲代菌株。
111.如段落102-109中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自动物病原性亲代菌株。
112.如段落102中任一项所述的方法，其中使该动物细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该动物细胞中。
113.如段落102所述的方法，其中提供该动物细胞来接近有效量的包含负载物和分泌系统的ADAS，其中该负载物在细胞外分泌并与该动物细胞接触。
114.一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括提供有效量的如段落1-85中任一项所述的ADAS或组合物来接近该动物细胞附近的细菌或真菌细胞。
115.如段落114所述的方法，其中该细菌或真菌细胞为病原性的。
116.如段落115所述的方法，其中该病原细菌或真菌细胞的适应性降低。
117.如段落114所述的方法，其中该细菌或真菌细胞为共生的。
118.如段落117所述的方法，其中该共生细菌或真菌细胞的适应性增加。
119.如段落118所述的方法，其中该适应性通过降低大量可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或真菌的适应性来增加。
120.如段落114所述的方法，其中使该细菌或真菌细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该细菌或真菌细胞中。
121.如权利要求120所述的方法，其中提供该细菌或真菌细胞来接近有效量的细胞外分泌负载物的ADAS，该负载物接触该细菌或真菌细胞。
122.如段落114-121中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自作为该细菌或真菌细胞的竞争者的亲代菌株。
123.如段落114-121中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自作为该细菌或真菌细胞的互利共生细菌的亲代菌株。
124.一种调节植物或真菌细胞的状态的方法，该方法包括提供有效量的如段落1-85中任一项所述的ADAS或组合物来接近：a)该植物或真菌细胞，b)在该植物或真菌细胞附近的相邻细菌或相邻真菌细胞，或c)在该植物或真菌细胞附近的昆虫或线虫细胞。
125.如段落124所述的方法，其中提供该ADAS或组合物来原位，例如在如下植物内接近该植物细胞：作物植物，诸如行栽作物，包括玉米、小麦、大豆和大米，以及蔬菜作物，包括茄科，诸如西红柿和胡椒；葫芦科，诸如甜瓜和黄瓜；芸苔属，诸如卷心菜和西蓝花；绿叶菜类，诸如羽衣甘蓝和生菜；根和块茎，诸如土豆和胡萝卜；大种蔬菜，诸如豆和玉米；以及蘑菇。
126.如段落125所述的方法，其中使健康植物或真菌中的该植物或真菌细胞暴露于细菌。
127.如段落125所述的方法，其中使患病状态的该植物或真菌细胞暴露于细菌。
128.如段落125所述的方法，其中该植物或真菌细胞分裂，诸如分生细胞，或为病原性的，诸如肿瘤。
129.如段落125所述的方法，其中那个使患病状态诸如创伤的植物或真菌细胞暴露于细菌，或者其中该植物或真菌细胞不为人食品的一部分。
130.如段落124-129中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自共生亲代菌株。
131.如段落124-129中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自植物或真菌病原性亲代菌株。
132.如段落124所述的方法，其中该ADAS包含T3/4SS或T6SS和负载物，并且该负载物被递送至该植物或真菌细胞中。
133.如权利要求124所述的方法，其中提供该植物或真菌细胞来接近有效量的包含细菌分泌系统和负载物的ADAS，其中该细菌分泌系统细胞外分泌该负载物，从而使该植物或真菌细胞与该负载物接触。
134.如段落124所述的方法，该方法包括提供有效量的ADAS或组合物来接近该植物或真菌细胞附近的相邻细菌或相邻真菌细胞。
135.如权利要求134所述的方法，其中该相邻细菌或相邻真菌细胞为病原性的，任选地，其中该病原性相邻细菌或相邻真菌细胞的适应性降低。
136.如权利要求134所述的方法，其中该相邻细菌或相邻真菌细胞为共生的，任选地，其中该共生相邻细菌或相邻真菌细胞的适应性增加。
137.如段落136所述的方法，其中该适应性通过减少可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或竞争真菌来增加。
138.如段落134所述的方法，其中使该相邻细菌或相邻真菌细胞与有效量的包含T3/4SS或T6SS和负载物的ADAS接触，其中该负载物被递送至该相邻细菌或相邻真菌细胞中。
139.如段落134所述的方法，其中提供该相邻细菌或相邻真菌细胞来接近有效量的包含细菌分泌系统和负载物的ADAS，其中该细菌分泌系统细胞外分泌该负载物，从而使该相邻细菌或相邻真菌细胞与该负载物接触。
140.如段落134-139中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自作为该相邻细菌或相邻真菌细胞的竞争者的亲代菌株。
141.如段落134-139中任一项所述的方法，其中该ADAS衍生自作为该相邻细菌或相邻真菌细胞的互利共生细菌的亲代菌株。
142.如段落124所述的方法，该方法包括提供有效量的ADAS或组合物来接近该植物或真菌附近的昆虫或线虫细胞。
143.如段落142所述的方法，其中该昆虫或线虫为病原性的。
144.如段落142所述的方法，其中该病原昆虫或线虫细胞的适应性降低。
145.如段落144所述的方法，其中该病原昆虫或线虫细胞的适应性通过调节该昆虫或线虫细胞中的共生生物来降低。
146.如段落142所述的方法，其中该昆虫或线虫为共生的。
147.如段落146所述的方法，其中该共生昆虫或线虫细胞的适应性增加。
148.如段落147所述的方法，其中该适应性通过减少可能为中性、共生或病原性的竞争细菌或真菌来增加。
149.一种从环境中去除一种或多种不期望的材料的方法，该方法包括使该环境与有效量的ADAS，诸如如段落1-84中任一项所述的ADAS或组合物接触，其中该ADAS包含溶解、螯合或降解一种或多种不期望材料的一种或多种分子(诸如蛋白质、聚合物、纳米粒子、结合剂或其组合)。
150.如段落149所述的方法，其中该不期望的材料包括重金属，诸如汞，并且该ADAS包含结合重金属的一种或多种分子(诸如蛋白质、聚合物、纳米粒子、结合剂或其组合)，诸如用于汞的MerR。
151.如段落149所述的方法，其中该不期望的材料包括塑料，诸如PET，并且该ADAS包含一种或多种塑料降解酶，诸如PET酶。
152.如段落149所述的方法，其中该不期望的材料包括一种或多种小有机分子，并且该ADAS包含能够代谢所述一种或多种小有机分子的一种或多种酶。
153.一种包含细菌或ADAS的组合物，其中这些细菌或该ADAS包含T4SS、RNA结合蛋白质负载物和由该RNA结合蛋白结合的并且适合通过T4SS递送至靶细胞中的RNA负载物。
154.如段落153所述的组合物，其中该RNA结合蛋白为与VirE2和VirF融合的Cas9，该RNA负载物为引导RNA，并且任选地，其中该T4SS为来自农杆菌属的Ti系统。
155.如段落153所述的组合物，其中该RNA结合蛋白为与VirE2或VirF融合的来自香石竹意大利环斑病毒的p19，该RNA负载物为siRNA，并且任选地，其中该T4SS为来自农杆菌属的Ti系统。
156.一种制备如段落156所述的组合物的方法，其中将含有与VirE2和VirF融合的Cas9和RNA负载物的质粒转染至农杆菌属细胞中。
157.一种用于将RNA递送至植物细胞或动物细胞的方法，该方法包括使所述植物细胞或动物细胞与细菌或ADAS接触，其中这些细菌或该ADAS包含T4SS、RNA结合蛋白负载物和RNA负载物。
158.一种用于将RNA和蛋白质递送至植物细胞或动物细胞的方法，该方法包括使所述植物细胞或动物细胞与细菌或ADAS接触，其中这些细菌或该ADAS包含T4SS、RNA结合蛋白负载物和RNA负载物。
序列表
<110> 旗舰创业创新六公司（Flagship Pioneering Innovations VI, LLC）
<120> 非染色体动态活性系统
<130> 51296-033WO2
<150> US 62/777,305
<151> 2018-12-10
<160> 24
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 88
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Met Ala Leu Leu Asp Phe Phe Leu Ser Arg Lys Lys Asn Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ile Ala Lys Glu Arg Leu Gln Ile Ile Val Ala Glu Arg Arg Arg Ser
20 25 30
Asp Ala Glu Pro His Tyr Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile Leu Glu
35 40 45
Val Ile Cys Lys Tyr Val Gln Ile Asp Pro Glu Met Val Thr Val Gln
50 55 60
Leu Glu Gln Lys Asp Gly Asp Ile Ser Ile Leu Glu Leu Asn Val Thr
65 70 75 80
Leu Pro Glu Ala Glu Glu Leu Lys
85
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Ser Asn Thr Pro Ile Glu Leu Lys Gly Ser Ser Phe Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Val His Leu His Glu Ala Glu Pro Lys Val Ile His Gln Ala Leu
20 25 30
Glu Asp Lys Ile Ala Gln Ala Pro Ala Phe Leu Lys His Ala Pro Val
35 40 45
Val Leu Asn Val Ser Ala Leu Glu Asp Pro Val Asn Trp Ser Ala Met
50 55 60
His Lys Ala Val Ser Ala Thr Gly Leu Arg Val Ile Gly Val Ser Gly
65 70 75 80
Cys Lys Asp Ala Gln Leu Lys Ala Glu Ile Glu Lys Met Gly Leu Pro
85 90 95
Ile Leu Thr Glu Gly Lys Glu Lys Ala Pro Arg Pro Ala Pro Thr Pro
100 105 110
Gln Ala Pro Ala Gln Asn Thr Thr Pro Val Thr Lys Thr Arg Leu Ile
115 120 125
Asp Thr Pro Val Arg Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Ala Pro Gln Cys Asp
130 135 140
Leu Ile Val Thr Ser His Val Ser Ala Gly Ala Glu Leu Ile Ala Asp
145 150 155 160
Gly Asn Ile His Val Tyr Gly Met Met Arg Gly Arg Ala Leu Ala Gly
165 170 175
Ala Ser Gly Asp Arg Glu Thr Gln Ile Phe Cys Thr Asn Leu Met Ala
180 185 190
Glu Leu Val Ser Ile Ala Gly Glu Tyr Trp Leu Ser Asp Gln Ile Pro
195 200 205
Ala Glu Phe Tyr Gly Lys Ala Ala Arg Leu Gln Leu Val Glu Asn Ala
210 215 220
Leu Thr Val Gln Pro Leu Asn
225 230
<210> 3
<211> 270
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 3
Met Ala Arg Ile Ile Val Val Thr Ser Gly Lys Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ala Thr Gly Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Thr Val Val Ile Asp Phe Asp Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu
35 40 45
Ile Met Gly Cys Glu Arg Arg Val Val Tyr Asp Phe Val Asn Val Ile
50 55 60
Gln Gly Asp Ala Thr Leu Asn Gln Ala Leu Ile Lys Asp Lys Arg Thr
65 70 75 80
Glu Asn Leu Tyr Ile Leu Pro Ala Ser Gln Thr Arg Asp Lys Asp Ala
85 90 95
Leu Thr Arg Glu Gly Val Ala Lys Val Leu Asp Asp Leu Lys Ala Met
100 105 110
Asp Phe Glu Phe Ile Val Cys Asp Ser Pro Ala Gly Ile Glu Thr Gly
115 120 125
Ala Leu Met Ala Leu Tyr Phe Ala Asp Glu Ala Ile Ile Thr Thr Asn
130 135 140
Pro Glu Val Ser Ser Val Arg Asp Ser Asp Arg Ile Leu Gly Ile Leu
145 150 155 160
Ala Ser Lys Ser Arg Arg Ala Glu Asn Gly Glu Glu Pro Ile Lys Glu
165 170 175
His Leu Leu Leu Thr Arg Tyr Asn Pro Gly Arg Val Ser Arg Gly Asp
180 185 190
Met Leu Ser Met Glu Asp Val Leu Glu Ile Leu Arg Ile Lys Leu Val
195 200 205
Gly Val Ile Pro Glu Asp Gln Ser Val Leu Arg Ala Ser Asn Gln Gly
210 215 220
Glu Pro Val Ile Leu Asp Ile Asn Ala Asp Ala Gly Lys Ala Tyr Ala
225 230 235 240
Asp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gly Glu Glu Arg Pro Phe Arg Phe Ile
245 250 255
Glu Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Arg Leu Phe Gly Gly
260 265 270
<210> 4
<211> 164
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 4
Met Pro Leu Thr Pro Asn Asp Ile His Asn Lys Thr Phe Thr Lys Ser
1 5 10 15
Phe Arg Gly Tyr Asp Glu Asp Glu Val Asn Glu Phe Leu Ala Gln Val
20 25 30
Arg Lys Asp Tyr Glu Ile Val Leu Arg Lys Lys Thr Glu Leu Glu Ala
35 40 45
Lys Val Asn Glu Leu Asp Glu Arg Ile Gly His Phe Ala Asn Ile Glu
50 55 60
Glu Thr Leu Asn Lys Ser Ile Leu Val Ala Gln Glu Ala Ala Glu Asp
65 70 75 80
Val Lys Arg Asn Ser Gln Lys Glu Ala Lys Leu Ile Val Arg Glu Ala
85 90 95
Glu Lys Asn Ala Asp Arg Ile Ile Asn Glu Ser Leu Ser Lys Ser Arg
100 105 110
Lys Ile Ala Met Glu Ile Glu Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys Val Phe
115 120 125
Arg Thr Arg Phe Gln Met Leu Ile Glu Ala Gln Leu Asp Leu Leu Lys
130 135 140
Asn Asp Asp Trp Asp His Leu Leu Glu Tyr Glu Val Asp Ala Val Phe
145 150 155 160
Glu Glu Lys Glu
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 8
<211> 412
<212> DNA
<213> 小菜蛾
<400> 8
gattttctga acgtccagga cacaagtaga ggactggata gtactcgtgt acaggtctat 60
gaggacttct gagtggggac taccgttggc ctgaaagaag aatttatggt gagcaatctg 120
actggctaaa ccactctccg atgattaacc ctagtcaaac tctattgttt atcaccgaca 180
cggtaatagt atattgaatg gacatttagt agataatgta cgattactgc taaaccacca 240
atattaccaa taaggatact cactctagtt ttcccccaac cagtcgcctt aacaggcaca 300
ttttcgccaa tcaggtcata gctcagcggc accggctgga tgagattcgt gaggtggatg 360
ggggcggcgg cgagcagcat gcccaggtcg ttcttgatct cgtcgtgatg ca 412
<210> 9
<211> 383
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 9
Met Phe Glu Pro Met Glu Leu Thr Asn Asp Ala Val Ile Lys Val Ile
1 5 10 15
Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ala Val Glu His Met Val Arg Glu
20 25 30
Arg Ile Glu Gly Val Glu Phe Phe Ala Val Asn Thr Asp Ala Gln Ala
35 40 45
Leu Arg Lys Thr Ala Val Gly Gln Thr Ile Gln Ile Gly Ser Gly Ile
50 55 60
Thr Lys Gly Leu Gly Ala Gly Ala Asn Pro Glu Val Gly Arg Asn Ala
65 70 75 80
Ala Asp Glu Asp Arg Asp Ala Leu Arg Ala Ala Leu Glu Gly Ala Asp
85 90 95
Met Val Phe Ile Ala Ala Gly Met Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Pro Val Val Ala Glu Val Ala Lys Asp Leu Gly Ile Leu Thr Val
115 120 125
Ala Val Val Thr Lys Pro Phe Asn Phe Glu Gly Lys Lys Arg Met Ala
130 135 140
Phe Ala Glu Gln Gly Ile Thr Glu Leu Ser Lys His Val Asp Ser Leu
145 150 155 160
Ile Thr Ile Pro Asn Asp Lys Leu Leu Lys Val Leu Gly Arg Gly Ile
165 170 175
Ser Leu Leu Asp Ala Phe Gly Ala Ala Asn Asp Val Leu Lys Gly Ala
180 185 190
Val Gln Gly Ile Ala Glu Leu Ile Thr Arg Pro Gly Leu Met Asn Val
195 200 205
Asp Phe Ala Asp Val Arg Thr Val Met Ser Glu Met Gly Tyr Ala Met
210 215 220
Met Gly Ser Gly Val Ala Ser Gly Glu Asp Arg Ala Glu Glu Ala Ala
225 230 235 240
Glu Met Ala Ile Ser Ser Pro Leu Leu Glu Asp Ile Asp Leu Ser Gly
245 250 255
Ala Arg Gly Val Leu Val Asn Ile Thr Ala Gly Phe Asp Leu Arg Leu
260 265 270
Asp Glu Phe Glu Thr Val Gly Asn Thr Ile Arg Ala Phe Ala Ser Asp
275 280 285
Asn Ala Thr Val Val Ile Gly Thr Ser Leu Asp Pro Asp Met Asn Asp
290 295 300
Glu Leu Arg Val Thr Val Val Ala Thr Gly Ile Gly Met Asp Lys Arg
305 310 315 320
Pro Glu Ile Thr Leu Val Thr Asn Lys Gln Val Gln Gln Pro Val Met
325 330 335
Asp Arg Tyr Gln Gln His Gly Met Ala Pro Leu Thr Gln Glu Gln Lys
340 345 350
Pro Val Ala Lys Val Val Asn Asp Asn Ala Pro Gln Thr Ala Lys Glu
355 360 365
Pro Asp Tyr Leu Asp Ile Pro Ala Phe Leu Arg Lys Gln Ala Asp
370 375 380
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
ggatgagagg gatgaaaaac tcaaggcaga gataactctg attacacgtc ttgagcgat 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
ataaatggga gggtgacttg cctcaatata atccagacta ctgacatggg aattagcca 59
<210> 12
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Cys Gly Thr Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Ala Gly Cys Gly Ala Thr
50 55
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
ctggcgatga ttaatagcta attgagtaag gccaggactg acatgggaat tagcca 56
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
acaagcgttt gaggaagcct ttcttctctt cttcaatgaa attacacgtc ttgagcgat 59
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
caaggaattt ctatggcacg cattattgtt gttacttcgg ctgacatggg aattagcca 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
ttgagtaagg ccaggatgtc aaacacgcca atcgagcttt tgtgtaggct ggagctgct 59
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
ctttttgctc aagctggacg gtaaccattt ccggatcgat cggctgacat gggaattagc 60
<210> 18
<211> 3882
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt ggctttgttg aataaatcga 60
acttttgctg agttgaagga tcagcagtgc tcttgtgggt ccgattcgcc agatgataag 120
gaacagagac gggaccaaaa cgaaaaaagg cccccctttc gggaggcctc ttttctggaa 180
tttggtaccg aggcattcag tctgcctgct ttcgcaggaa cgccggaatg tccagataat 240
ccggctcttt ggctgtctga ggagcattat cattaacaac tttggcgact ggtttctgct 300
cctgcgtaag gggcgccata ccatgttgtt gatagcggtc catcacaggc tgctgaacct 360
gtttattagt cactaaggta atttctggtc ttttatccat gccgattccc gtggcgacaa 420
ccgttacgcg cagttcatca ttcatgtcag ggtctaagga ggtacctata actacggtcg 480
cgttgtctga ggcaaatgct ctaatggtgt ttcccacagt ctcgaactca tctaaccgaa 540
gatcgaaacc ggcagtaata tttacaagaa caccgcgggc gccggacaaa tcaatatcct 600
ctaataacgg tgaagatata gccatctcag cagcttcttc tgcgcgatcc tccccagatg 660
ccacgcctga gcccatcatg gcatagccca tctctgacat cactgtcctc acatccgcaa 720
aatctacgtt cataagccca ggtcgggtga tcaattcggc tataccctga accgcgcctt 780
tcagaacatc attagccgca ccgaacgcat ccagcagtga gattcctcgc cccaggactt 840
taagcagttt atcatttggg atcgtgatca atgaatcaac atgtttagaa agctccgtga 900
tgccctgctc cgcaaatgcc atacgtttct taccttcaaa gttgaacggt ttggtaacta 960
cggcaacggt cagaataccc agatctttgg ccacctccgc cacaaccggc gccgcgcccg 1020
tccccgtgcc gccgcccatg cctgcggcga taaaaaccat atctgcccct tccaatgcgg 1080
ctctcaaggc gtcgcgatcc tcatccgccg cgttgcgtcc tacttccgga ttcgccccag 1140
cacccaaacc tttggtgatg cctgacccga tctgaatagt ttgacctacg gcggttttac 1200
ggagtgcctg agcatctgtg ttcactgcaa agaattccac accctcaatg cgttctctaa 1260
ccatatgctc aacagcgttg ccgccaccac cgccgactcc tatgacttta ataaccgcat 1320
cgttggtaag ttccattggc tcaaacatct gatcctcctt agtatagtga cctcttaaac 1380
aaaattattt gtagaggcgc tttcgtcctc acggactcat cagaacggga agcacacccg 1440
ttgagcgctt tcacttttct ctatcactga tagggagtgg taaaataact ctatcaatga 1500
tagagtgtca acaaaaatta ggaattaatg atgtctagat tagataaaag taaagtgatt 1560
aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc 1620
gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct 1680
ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta gataggcacc atactcactt ttgcccttta 1740
gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt aataacgcta aaagttttag atgtgcttta 1800
ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat 1860
gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta tgccaacaag gtttttcact agagaatgca 1920
ttatatgcac tcagcgctgt ggggcatttt actttaggtt gcgtattgga agatcaagag 1980
catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca cctactactg atagtatgcc gccattatta 2040
cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt 2100
gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa cttaaatgtg aaagtgggtc ttaaaatcag 2160
agaatataaa aagccagatt attaatccgg cttttttatt atttcgtctc ggtggaaggg 2220
ctcggagttg ccaggataca tagattacca cccgtagaaa agatcaaaag atcttcttga 2280
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctac ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 2340
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggctttagc 2400
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 2460
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 2520
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 2580
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 2640
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 2700
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 2760
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2820
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2880
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatttccgc tactgaacta 2940
ctcgatgtca gagccagcgt cttgcataaa aaaacccgcc gaagcgggtt tttacgttat 3000
tattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 3060
ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 3120
caaagaatgg caaggtcctg gtaacggtct gcgattccga cccgtccaac atcaatacaa 3180
cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 3240
actgaatccg gtgagaatgg caagagcttg tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc 3300
cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt catgcgtgat 3360
tgcgcctgag caagacgaaa tacacgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc 3420
gaatgtaacc ggcgcaggaa cacggccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga 3480
tattcttcta atacctggaa ggctgttttc ccaggaatcg cggtggtgag taaccacgca 3540
tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcgggagag gcataaactc cgtcagccag 3600
ttgaggcgga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga 3660
aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aagcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg 3720
acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcgt ccatgttgga gtttaagcgc 3780
ggacgggagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt 3840
atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt ta 3882
<210> 19
<211> 3449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
ctcacttttg ccctttagaa ggggaaagct ggcaagattt tttacgtaat aacgctaaaa 60
gttttagatg tgctttacta agtcatcgcg atggagcaaa agtacattta ggtacacggc 120
ctacagaaaa acagtatgaa actctcgaaa atcaattagc ctttttatgc caacaaggtt 180
tttcactaga gaatgcatta tatgcactca gcgctgtggg gcattttact ttaggttgcg 240
tattggaaga tcaagagcat caagtcgcta aagaagaaag ggaaacacct actactgata 300
gtatgccgcc attattacga caagctatcg aattatttga tcaccaaggt gcagagccag 360
ccttcttatt cggccttgaa ttgatcatat gcggattaga aaaacaactt aaatgtgaaa 420
gtgggtctta aaatcagaga atataaaaag ccagattatt aatccggctt ttttattatt 480
tcgtctcggt ggaagggctc ggagttgcca ggatacatag attaccaccc gtagaaaaga 540
tcaaaagatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctacttg caaacaaaaa 600
aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 660
aggtaactgg ctttagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 720
taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 780
taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 840
agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 900
tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 960
cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 1020
agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 1080
gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 1140
aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 1200
tttccgctac tgaactactc gatgtcagag ccagcgtctt gcataaaaaa acccgccgaa 1260
gcgggttttt acgttattat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 1320
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 1380
actcaccgag gcagttccaa agaatggcaa ggtcctggta acggtctgcg attccgaccc 1440
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 1500
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa gagcttgtgc atttctttcc 1560
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 1620
cgttattcat gcgtgattgc gcctgagcaa gacgaaatac acgatcgctg ttaaaaggac 1680
aattacaaac aggaatcgaa tgtaaccggc gcaggaacac ggccagcgca tcaacaatat 1740
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaaggc tgttttccca ggaatcgcgg 1800
tggtgagtaa ccacgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc gggagaggca 1860
taaactccgt cagccagttg aggcggacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1920
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg 1980
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcgtcca 2040
tgttggagtt taagcgcgga cgggagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 2100
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgatgat atatttttat 2160
cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg gctttgttga ataaatcgaa 2220
cttttgctga gttgaaggat cagcagtgct cttgtgggtc cgattcgcca gatgataagg 2280
aacagagacg ggaccaaaac gaaaaaaggc ccccctttcg ggaggcctct tttctggaat 2340
ttggtaccga ggcatttact tatacaactc gtccatacca tgagtaattc cggcagccgt 2400
aacgaactcc agcaggacca tgtggtcgcg tttctcgttg ggatcttttg ataaaacaga 2460
ctgcgtgcta agatagtgat tgtcgggtaa aaggaccggc ccgtccccaa tgggcgtatt 2520
ttgttgatag tggtcagcaa gctgaactga cccatcttcc acgttgtggc gaatcttaaa 2580
gttagcttta atcccgttct tctgtttgtc agcggtaatg tagacgttat gtgaattaaa 2640
gttgtactcc agcttgtgcc caagaatatt tccatcttct ttaaagtcga tccctttcaa 2700
ctcaatgcgg ttaaccaaag tgtccccttc gaacttcact tcagcgcgag ttttataggt 2760
cccgtcgtct ttgaacgaga ttgtgcgctc ttgcacatag ccttccggca ttgcgctctt 2820
aaagaaatcg tgacgcttca tgtgatctgg ataacgagag aaacattgaa cgccgtaagt 2880
taaagtcgtc accagagtag gccagggcac tggcaacttc ccagtagtgc agataaactt 2940
aagggttaac ttcccattag tagcgtcccc ttccccttcc ccacgtacgc tgaacttatg 3000
gccgtttacg tcaccgtcta attcgaccaa gatgggtact acaccggtga acaattcctc 3060
tcccttggac atatttacct cccctatggt tcgctgcaac ttaaacaaaa ttatttgtag 3120
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
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gcggccctgc tgttttgcct cacatgttag tcccctgctt atccacggaa tctgtgggta 4800
actttgtatg tgtccgcagc gcttccgcta ctgaactact cgatgtcaga gccagcgtct 4860
tgcataaaaa aacccgccga agcgggtttt tacgttatta ttagaaaaac tcatcgagca 4920
tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tga 4973
<210> 23
<211> 3017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 60
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 120
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 180
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 240
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 300
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 360
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 420
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 480
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 540
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 600
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 660
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 720
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 780
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 840
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 900
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 960
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 1020
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 1080
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 1140
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 1200
gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 1260
atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 1320
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt 1380
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1440
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1500
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1560
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1620
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1680
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1740
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1800
gctacagggc gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 1860
gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 1920
ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc 1980
gtaatacgac tcactatagg gattttctga acgtccagga cacaagtaga ggactggata 2040
gtactcgtgt acaggtctat gaggacttct gagtggggac taccgttggc ctgaaagaag 2100
aatttatggt gagcaatctg actggctaaa ccactctccg atgattaacc ctagtcaaac 2160
tctattgttt atcaccgaca cggtaatagt atattgaatg gacatttagt agataatgta 2220
cgattactgc taaaccacca atattaccaa taaggatact cactctagtt ttcccccaac 2280
cagtcgcctt aacaggcaca ttttcgccaa tcaggtcata gctcagcggc accggctgga 2340
tgagattcgt gaggtggatg ggggcggcgg cgagcagcat gcccaggtcg ttcttgatct 2400
cgtcgtgatg cacctatagt gagtcgtatt aatttcgata agccaggttg cttcctcgct 2460
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 2520
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 2580
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 2640
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 2700
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 2760
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 2820
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 2880
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 2940
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3000
agcgaggtat gtaggcg 3017
<210> 24
<211> 3528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
gatacgggag ggcttaccat ctggccccag ggctgcaata ataccgcggg acccacgctc 60
accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 120
tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag cgagagtaag 180
aagttcgcca gttaagagtt tgcgcaacgt tgttgccata gctacaggca tcgtggtgtc 240
acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 300
atgatcaccc atgttgtgca aaaaagcggt aagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 360
aagtaagttg gccgccgtgt tatcactcat ggttatggca gcgctgcata attcgcgtac 420
tgtcatgccg tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 480
agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 540
gccacagagc agaactttaa aagtgctcat cattgggaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 600
ctcaagaatc ttaccgctgt tgaggtccag ttcgatgtaa cccacacgtg cacccaactg 660
atcttcggca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 720
tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatat tcttcctttt 780
tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataga tatttgaatg 840
tatttagcag tgctcttgtg ggtccgattc gccagatgat aaggaacaga gacgggacca 900
aaacgaaaaa aggcccccct ttcgggaggc ctcttttctg gaatttggta ccgaggcatt 960
cattcagatt tccctccttt ccatttagaa aaaatacttg gttttttcgc agtaacagtt 1020
accaattctt tcaggagaat tttatgcagc tcctcctcag aaacatctcg aaacagctcg 1080
ccacctttgg tcagggatat accgccggtt tcttctgata caacaatagt aatcgaatca 1140
gtgacttccg atatacccaa cgccgcgcgg tgacgagtac ccaactcttt tgataggaac 1200
ggactatcgc tcagcggaag atatgatgct gcggaagcga tttcgttgcc ctttataata 1260
acagccccat catgaagcgg cgtattaggg ataaatatgt taataaggag ctgactagaa 1320
atcttggcat tcagcggaat tccagtctcg atataatcat ccattcccgt atcacgcgcg 1380
acgctgatca gtgcgccaat tcgccgttta gccatatact gtgttgactt ttcaattgat 1440
tcgatcagat gatgttgttc ccgttcaatt ctactgccgt agcgcgtgaa aatattccct 1500
cggcccaggg tttcaagcgc tcttcgcagc tccggctgga agataatgat aatagccagg 1560
aacccccaag tcaacatttg atctgtgatc cattccacgg tttgcaaccc aaaaaaaccg 1620
ctcaggagtt taaccgcaat aataataaag attcctttca gcagttgaac cgccttggtg 1680
cctcgaatca gcataattac tttgtaaatc acaaaccaca caactagaat gtctacgata 1740
ttggctaagt agtggaggat gctcatgttg gaaaagtcca taaaaacctg cttaatcggg 1800
taagagctta aacaaaatta tttgtagagg cgctttcgtc ctcacggact catcagaacg 1860
ggaagcacac ccgttgagcg ctttcacttt tctctatcac tgatagggag tggtaaaata 1920
actctatcaa tgatagagtg tcaacaaaaa ttaggaatta atgatgtcta gattagataa 1980
aagtaaagtg attaacagcg cattagagct gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac 2040
aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt agagcagcct acattgtatt ggcatgtaaa 2100
aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc cattgagatg ttagataggc accatactca 2160
cttttgccct ttagaagggg aaagctggca agatttttta cgtaataacg ctaaaagttt 2220
tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg agcaaaagta catttaggta cacggcctac 2280
agaaaaacag tatgaaactc tcgaaaatca attagccttt ttatgccaac aaggtttttc 2340
actagagaat gcattatatg cactcagcgc tgtggggcat tttactttag gttgcgtatt 2400
ggaagatcaa gagcatcaag tcgctaaaga agaaagggaa acacctacta ctgatagtat 2460
gccgccatta ttacgacaag ctatcgaatt atttgatcac caaggtgcag agccagcctt 2520
cttattcggc cttgaattga tcatatgcgg attagaaaaa caacttaaat gtgaaagtgg 2580
gtcttaaaat cagagaatat aaaaagccag attattaatc cggctttttt attatttcgt 2640
ctcggtggaa gggctcggag ttgccaggat acatagatta ccacccgtag aaaagatcaa 2700
aagatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tacttgcaaa caaaaaaacc 2760
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 2820
aactggcttt agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 2880
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 2940
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 3000
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 3060
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 3120
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 3180
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 3240
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 3300
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatttc 3360
cgctactgaa ctactcgatg tcagagccag cgtcttgcat aaaaaaaccc gccgaagcgg 3420
gtttttacgt tattattacc aatgcttaat cagggaggca cctatctcag cgatctggcg 3480
attacgttcg tccatagttg cctggctccc cgtcgtgtag ataactac 3528
Claims (130)
1.一种用于制备包含多种ADAS的组合物的方法，该组合物基本上不含活细菌细胞，该方法包括：
(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；
(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件；以及
(c)将这些微型细胞与这些亲代细菌分离，从而产生包含多种ADAS的组合物，该组合物基本上不含活细菌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性的多肽。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQID NO:1具有至少95％同一性的多肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为minE多肽。
5.如权利要求4所述的方法，其中这些亲代细菌为大肠杆菌，并且该minE多肽为大肠杆菌minE。
6.如权利要求4所述的方法，其中这些亲代细菌为鼠伤寒沙门氏菌，并且该minE多肽为鼠伤寒沙门氏菌minE。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中这些亲代细菌的Z-环抑制蛋白的水平或活性降低。
8.如权利要求7所述的方法，其中该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的多肽。
9.如权利要求7或8中任一项所述的方法，其中该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ IDNO:3具有至少90％同一性的多肽。
10.如权利要求8所述的方法，其中该Z-环抑制蛋白为minC多肽。
11.如权利要求9所述的方法，其中该Z-环抑制蛋白为minD多肽。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中这些ADAS的至少两种Z-环抑制蛋白的表达降低。
13.如权利要求12所述的方法，其中这些ADAS的minC多肽和minD多肽的表达降低。
14.如权利要求13所述的方法，其中这些ADAS的minC多肽、minD多肽和minE多肽的表达降低。
15.如权利要求1所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的多肽。
16.如权利要求15所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQID NO:4具有至少95％同一性的多肽。
17.如权利要求1、15和16中任一项所述的方法，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA多肽。
18.如权利要求17所述的方法，其中这些亲代细菌为枯草芽孢杆菌，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为枯草芽孢杆菌DivIVA。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该水平或活性的降低由功能丧失突变引起。
20.如权利要求19所述的方法，其中该功能丧失突变为minCDE操纵子缺失或DiVIVA缺失。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1mM、1.2nM、1.3nM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、2mM、2.5mM、3mM、4mM、5mM、10mM、20mM、30mM或50mM。
22.如权利要求21所述的方法，其中这些亲代细菌为埃希氏菌属、不动杆菌属、农杆菌属、鱼腥藻属、产水菌属、固氮弓菌属、固氮菌属、鲍特菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、暂定种、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、极地单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通氏菌属、长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、栖热孢菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽孢杆菌属、嗜热梭菌属或热厌氧杆菌属，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为这些亲代细菌的内源minE或DivIVA。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中步骤(c)的该组合物包含少于100个菌落形成单位(CFU/mL)的活细菌细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中步骤(c)的该组合物包含少于10CFU/mL、少于1CFU/mL或少于0.1CFU/mL的活细菌细胞。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中这些ADAS包含负载物。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中配制该组合物以递送至动物。
27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中配制该组合物以递送至植物。
28.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中配制该组合物以递送至昆虫。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中该组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
30.一种包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
31.如权利要求30所述的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.2nM、1.3nM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、2mM或2.5mM。
32.一种包含多种高活性ADAS的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少3mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
33.如权利要求32所述的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少4mM、5mM、10mM、20mM、30mM或50mM。
34.如权利要求30-33中任一项所述的组合物，其中在37℃下孵育12小时后，这些ADAS的ATP浓度增加至少50％、至少60％、至少75％、至少100％、至少150％或至少200％。
35.如权利要求30-34中任一项所述的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌。
36.一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS不包含细胞分裂拓扑特异性因子，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞。
37.一种包含多种ADAS的组合物，该组合物基本上不含活细菌细胞，并且通过包括以下的方法产生：
(a)制备、提供或获得细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的多种亲代细菌；
(b)将这些亲代细菌暴露于允许形成微型细胞的条件；以及
(c)将这些微型细胞与这些亲代细菌分离，从而产生基本上不含活细菌细胞的组合物。
38.如权利要求30-37中任一项所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽。
39.如权利要求38所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQID NO:1具有至少95％同一性的多肽。
40.如权利要求30-37中任一项所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为minE多肽。
41.如权利要求40所述的组合物，其中这些亲代细菌为大肠杆菌，并且该minE多肽为大肠杆菌minE。
42.如权利要求42所述的组合物，其中这些亲代细菌为鼠伤寒沙门氏菌，并且该minE多肽为鼠伤寒沙门氏菌minE。
43.如权利要求37-42中任一项所述的组合物，其中这些亲代细菌为埃希氏菌属、不动杆菌属、农杆菌属、鱼腥藻属、产水菌属、固氮弓菌属、固氮菌属、鲍特菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、暂定种、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、极地单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通氏菌属、长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻属、栖热孢菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽孢杆菌属、嗜热梭菌属或热厌氧杆菌属，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为这些亲代细菌的内源minE或DivIVA。
44.如权利要求30-43中任一项所述的组合物，其中这些ADAS的Z-环抑制蛋白的水平降低。
45.如权利要求44所述的组合物，其中该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的多肽。
46.如权利要求44所述的组合物，其中该Z-环抑制蛋白为氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的多肽。
47.如权利要求44所述的组合物，其中该Z-环抑制蛋白为minC多肽。
48.如权利要求44所述的组合物，其中该Z-环抑制蛋白为minD多肽。
49.如权利要求44-48中任一项所述的组合物，其中这些ADAS的至少两种Z-环抑制蛋白的表达降低。
50.如权利要求49所述的组合物，其中这些ADAS的minC多肽和minD多肽的表达降低。
51.如权利要求50所述的组合物，其中这些ADAS的minC多肽、minD多肽和minE多肽的表达降低。
52.如权利要求35-51中任一项所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的多肽。
53.如权利要求52所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为氨基酸序列与SEQID NO:4具有至少95％同一性的多肽。
54.如权利要求52或53所述的组合物，其中该细胞分裂拓扑特异性因子为DivIVA多肽。
55.如权利要求53或54所述的组合物，其中这些亲代细菌为枯草芽孢杆菌，并且该细胞分裂拓扑特异性因子为枯草芽孢杆菌DivIVA。
56.如权利要求35-51中任一项所述的组合物，其中该水平或活性的降低由功能丧失突变引起。
57.如权利要求56所述的组合物，其中该功能丧失突变为基因缺失。
58.如权利要求56或57所述的组合物，其中该功能丧失突变为诱导型功能丧失突变，并且其中通过将该亲代细胞暴露于诱导条件来诱导功能丧失。
59.如权利要求58所述的组合物，其中该诱导型功能丧失突变为温度敏感性突变，并且其中该诱导条件为温度条件。
60.如权利要求59所述的组合物，其中该亲代细胞具有minCDE操纵子缺失。
61.如权利要求1-60中任一项所述的组合物，其中这些ADAS包含功能性转录系统和功能性翻译系统。
62.如权利要求61所述的组合物，其中这些ADAS产生异源蛋白。
63.如权利要求62所述的组合物，其中这些ADAS包含质粒，该质粒包含诱导型启动子和编码该异源蛋白的核苷酸序列，并且其中在适当条件下使这些ADAS与该诱导型启动子的诱导物接触引起该异源蛋白的产生。
64.如权利要求63所述的组合物，其中在已与该诱导物接触的ADAS中，相对于尚未与该诱导物接触的ADAS，该异源蛋白的产生增加了至少1.6倍。
65.如权利要求64所述的组合物，其中该异源蛋白的产生速率在这些ADAS与该诱导物接触3小时内达到目标水平。
66.如权利要求64-65中任一项所述的组合物，其中该异源蛋白以至少0.1毫微微克/小时/ADAS的速率产生。
67.如权利要求62-66中任一项所述的组合物，其中该异源蛋白产生了至少8小时的持续时间。
68.如权利要求1-67中任一项所述的组合物，其中该组合物包含少于100个菌落形成单位(CFU/mL)的活细菌细胞。
69.如权利要求68所述的组合物，其中该组合物包含少于10CFU/mL、少于1CFU/mL或少于0.1CFU/mL的活细菌细胞。
70.如权利要求1-69中任一项所述的组合物，其中这些ADAS包含负载物。
71.如权利要求70所述的组合物，其中该负载物为核酸、质粒、多肽、蛋白质、酶、氨基酸、小分子、基因编辑系统、激素、免疫调节剂、碳水化合物、脂质、有机粒子、无机粒子或核糖核蛋白复合物(RNP)。
72.如权利要求71所述的组合物，其中该负载物被这些ADAS包封。
73.如权利要求71所述的组合物，其中该负载物附接于这些ADAS的表面。
74.如权利要求71所述的组合物，其中该核酸为DNA、RNA或质粒。
75.如权利要求71或74所述的组合物，其中该核酸编码蛋白质。
76.如权利要求71所述的组合物，其中该酶改变底物以产生靶产物。
77.如权利要求76所述的组合物，其中该底物存在于这些ADAS中，并且其中该靶产物在这些ADAS中产生。
78.如权利要求76所述的组合物，其中该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。
79.如权利要求1-78中任一项所述的组合物，其中这些ADAS包含异源细菌分泌系统。
80.如权利要求79所述的组合物，其中该异源细菌分泌系统为3型分泌系统(T3SS)。
81.如权利要求79-80中任一项所述的组合物，其中该负载物包含引导该细菌分泌系统输出的部分。
82.如权利要求1-81中任一项所述的组合物，其中这些ADAS包含靶向部分。
83.如权利要求82所述的组合物，其中该靶向部分为纳米抗体、碳水化合物结合蛋白或肿瘤靶向肽。
84.如权利要求1-83中任一项所述的组合物，其中相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的蛋白酶水平或活性降低。
85.如权利要求84所述的组合物，其中该ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种蛋白酶的表达的亲代细菌产生。
86.如权利要求1-85中任一项所述的组合物，其中相对于由野生型亲代细菌产生的ADAS，这些ADAS的RNA酶水平或活性降低。
87.如权利要求86所述的组合物，其中该ADAS由已经修饰以降低或消除至少一种RNA酶的表达的亲代细菌产生。
88.如权利要求86或87所述的组合物，其中该RNA酶为内切核糖核酸酶或外切核糖核酸酶。
89.如权利要求1-88中任一项所述的组合物，其中这些ADAS已经修饰以具有减少的脂多糖(LPS)。
90.如权利要求60所述的组合物，其中该ADAS由已经修饰以具有减少的LPS的亲代细菌产生。
91.如权利要求89所述的组合物，其中该修饰为脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶(msbB)突变。
92.如权利要求1-91中任一项所述的组合物，其中该ADAS衍生自亲代细菌，这些亲代细菌为哺乳动物病原体或哺乳动物共生细菌。
93.如权利要求92所述的组合物，其中该哺乳动物共生细菌为葡萄球菌属、双歧杆菌属、微球菌属、乳杆菌属或放线菌属物种，或该哺乳动物病原细菌为肠出血性大肠杆菌(EHEC)、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、耶尔森氏肠杆菌或幽门螺杆菌。
94.如权利要求1-91中任一项所述的组合物，其中该ADAS衍生自亲代细菌，这些亲代细菌为植物病原体或植物共生细菌。
95.如权利要求94所述的组合物，其中该植物共生细菌为枯草芽孢杆菌或恶臭假单胞菌，或该植物病原细菌为黄单胞菌属物种或丁香假单胞菌。
96.如权利要求1-95中任一项所述的组合物，其中该ADAS衍生自营养缺陷型亲代细菌。
97.如权利要求1-96中任一项所述的组合物，其中将这些ADAS冻干并重构，并且其中这些经重构ADAS的ATP浓度为未冻干ADAS的ATP浓度的至少95％。
98.如权利要求97所述的组合物，其中这些经重构ADAS的ATP浓度至少等于未冻干ADAS的ATP浓度。
99.如权利要求1-98中任一项所述的组合物，其中配制该组合物以递送至动物。
100.如权利要求99所述的组合物，其中配制该组合物以腹膜内、静脉内、肌肉内、口服、局部、气雾化或雾化施用。
101.如权利要求1-98中任一项所述的组合物，其中配制该组合物以递送至植物。
102.如权利要求1-97中任一项所述的组合物，其中配制该组合物以递送至昆虫。
103.如权利要求99-102中任一项所述的组合物，其中该组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
104.一种用于将高活性ADAS递送至靶细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性ADAS的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
105.一种用于将ADAS递送至靶细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
106.如权利要求104或105所述的方法，其中该靶细胞为动物细胞。
107.如权利要求104或105所述的方法，其中该靶细胞为植物细胞。
108.如权利要求104或105所述的方法，其中该靶细胞为昆虫细胞。
109.一种用于将负载物递送至靶细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
110.一种用于将负载物递送至靶细胞的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，这些ADAS包含负载物，并且该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该靶细胞与步骤(a)的该组合物接触。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中该靶细胞为动物细胞。
112.如权利要求109或110所述的方法，其中该靶细胞为植物细胞。
113.如权利要求109或110所述的方法，其中该靶细胞为昆虫细胞。
114.一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
115.一种调节植物细胞状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
116.一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
117.一种调节动物细胞的状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该动物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该动物细胞的状态。
118.一种调节植物细胞状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该植物细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该植物细胞的状态。
119.一种调节昆虫细胞的状态的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该昆虫细胞与步骤(a)的该组合物接触，从而调节该昆虫细胞的状态。
120.一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
121.一种治疗有需要的动物的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该动物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该动物。
122.如权利要求120或121所述的方法，其中该动物患有癌症。
123.如权利要求120-122中任一项所述的方法，其中该ADAS携带化疗负载物。
124.如权利要求120-122中任一项所述的方法，其中该ADAS携带免疫疗法负载物。
125.一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种高活性非染色体动态活性系统(ADAS)的组合物，其中这些ADAS的初始ATP浓度为至少1.25mM，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该植物或其有害生物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
126.一种治疗有需要的植物的方法，该方法包括：
(a)提供包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS衍生自细胞分裂拓扑特异性因子的水平或活性降低的亲代细菌，并且其中该组合物基本上不含活细菌细胞；以及
(b)使该植物或其有害生物与有效量的步骤(a)的该组合物接触，从而治疗该植物。
127.一种包含多种ADAS的组合物，其中这些ADAS包含酶，并且其中该酶改变底物以产生靶产物。
128.如权利要求127所述的组合物，其中该底物存在于这些ADAS中，并且其中该靶产物在这些ADAS中产生。
129.如权利要求127或128所述的组合物，其中该底物存在于靶细胞或这些ADAS所递送到的环境中。
130.如权利要求127-129中任一项所述的组合物，其中该酶为二腺苷酸环化酶A，该底物为ATP，并且该靶产物为环二AMP。
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