CN112592878B - 增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过在游动放线菌中，利用强启动子kasOp*分别强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104，得到阿卡波糖高产突变菌株。增强正调控蛋白基因的表达，可以促进阿卡波糖生物合成基因的表达，最终明显提高阿卡波糖产量。与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株发酵产量分别提高了25％、18％、26％、22％、15％，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.29g/L、3.11g/L、3.32g/L、3.21g/L、3.03g/L。
Description
技术领域
本发明涉及的是生物工程领域，具体说是涉及一种增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法；通过在游动放线菌QQ-2中分别强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104，可以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而可提高阿卡波糖产量。
背景技术
糖尿病是一种代谢性疾病，其突出特点就是高血糖。目前，2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病患者总数的90%以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。
阿卡波糖被列为治疗2型糖尿病的一线用药，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓多糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。单独服用本类药物通常不会发生低血糖等副作用，同时由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。
阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌SE50及其基因工程改造后的高产菌株SE50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌SE50的基因组上成簇分布，组成acb基因簇。迄今为止，涉及阿卡波糖生物合成途径中相关转录调控因子及其调控机制的研究仍旧很少，并未有研究发现在acb基因簇内存在调控该合成途径转录的基因。在本研究中，挖掘到与acb基因簇转录控调相关的基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479、ACPL_8104，强化表达这些调控蛋白基因，可以提高阿卡波糖生物合成基因的转录水平，从而提高阿卡波糖的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过在游动放线菌QQ-2中分别强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104，可以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而可提高阿卡波糖产量。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中强化表达阿卡波糖生物合成基因簇转录控调相关的正调控蛋白基因，获得阿卡波糖高产菌株。
作为本发明的一个实施方案，所述正调控蛋白基因为正调控蛋白基因ACPL_1889、正调控蛋白基因ACPL_4236、正调控蛋白基因ACPL_7303、正调控蛋白基因ACPL_6479或正调控蛋白基因ACPL_8104，其序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的一个实施方案，所述游动放线菌包括游动放线菌QQ-2。
作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌中强化表达正调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889的整合型质粒I；
S2，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_4236的整合型质粒II；
S3，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_7303的整合型质粒Ш；
S4，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_6479的整合型质粒IV；
S5，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_8104的整合型质粒V；
S6，通过接合转移将整合型质粒I、II、Ш、IV、V分别导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因强化表达突变株。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取228 bp的ACPL_1889基因片段以及pDR3质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126bp的 kasOp* 基因片段和228 bp的ACPL_1889基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_1889-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_ 1889基因。
作为本发明的一个实施方案，使用kasOp-F/R, 通过PCR扩增得到kasOp*基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取462 bp的ACPL_4236基因片段以及pDR3质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126bp的kasOp* 基因片段和462 bp的ACPL_4236基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_4236-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_ 4236基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式从游动放线菌SE50/110基因组中获取337 bp的ACPL_7303基因片段，在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126 bp的kasOp* 基因片段和337 bp的ACPL_7303基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_7303-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_ 7303基因。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取489 bp的ACPL_6479基因片段以及从pDR3质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段（SEQ ID NO.5），在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126 bp的kasOp* 基因片段和489 bp的ACPL_6479基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_6479-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_ 6479基因片段。
作为本发明的一个实施方案，所述整合型质粒V的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取678 bp的ACPL_8104基因片段以及从pDR3质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126bp的kasOp* 基因片段和678 bp的ACPL_8104基因片段。
作为本发明的一个实施方案，使用引物GBACPL_8104-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_ 8104基因。
作为本发明的一个实施方案，受体菌株为游动放线菌QQ-2，所述基因强化表达突变株为基因强化表达突变株WXM-01、WXM-02、WXM-03、WXM-04、WXM-05。
作为本发明的一个实施方案，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养30~36小时；按照10%~15%的接种量转接至二级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养24~28小时；按照10%~15%的接种量转接至发酵培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养90~96小时后收取发酵液。作为具体示例，将空载体整合菌株与基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于30°C、220 rpm的转速下培养32小时；按照10%的接种量转接至二级种子培养基中于30°C、220 rpm的转速下培养24小时；按照15%的接种量转接至发酵培养基中于30°C、220 rpm的转速下培养96小时后收取发酵液。
作为本发明的一个实施方案，所述固体培养基含有质量体积比为3%~5%的蔗糖、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.5%~1%的酪蛋白水解物、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化钾和0.005%~0.01%的硫酸亚铁。作为具体示例，所述固体培养基含有质量体积比为3%的蔗糖、0.5%的蛋白胨、0.5%的酵母提取物、0.1%的酪蛋白水解物、0.1%的磷酸氢二钾、0.05%的氯化钾和0.005%的硫酸亚铁。
作为本发明的一个实施方案，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5%~2%的葡萄糖、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的麦芽提取物、1%~2%的甘油、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.1%~0.2%的磷酸氢二钾和0.1%~0.2%的酪蛋白水解物。作为具体示例，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5%的葡萄糖、1%的麦芽糖、1%的麦芽提取物、1%的甘油、0.5%的蛋白胨、0.5%的酵母提取物、0.1%的磷酸氢二钾和0.1%的酪蛋白水解物。
作为本发明的一个实施方案，所述二级种子培养基含有质量体积比为4%~5%的黄豆饼粉、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的葡萄糖、1%~2%的甘油、1%~2%的可溶性淀粉和0.25%~0.5%的碳酸钙。作为具体示例，所述二级种子培养基含有质量体积比为4%的黄豆饼粉、1.5%的麦芽糖、1%的葡萄糖、1%的甘油、1%的可溶性淀粉和0.25%的碳酸钙。
作为本发明的一个实施方案，所述发酵培养基含有质量体积比为5%~10%的麦芽糖、1%~5%的葡萄糖、0.1%~0.5%的谷氨酸、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化铁、1%~5%的黄豆饼粉和0.1%~0.5%的碳酸钙。作为具体示例，所述发酵培养基含有质量体积比为5%的麦芽糖、3%的葡萄糖、0.3%的谷氨酸、0.1%的磷酸氢二钾、0.05%的氯化铁、1%的黄豆饼粉和0.25%的碳酸钙。
本发明具有如下有益效果：
1）通过在游动放线菌中分别强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104，可以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而可提高阿卡波糖产量；
2）本发明中通过在游动放线菌QQ-2中强化表达正调控基因ACPL_1889、ACPL_ 4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104，得到阿卡波糖高产菌株；与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株WXM-01、WXM-02、WXM-03、WXM-04和WXM-05发酵产量分别提高了25%、18%、26%、22%、15%，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.29 g/L、3.11 g/L、3.32 g/L、3.21 g/L、3.03 g/L。
附图说明
图1为强化表达基因ACPL_1889的质粒构建示意图；
图2为强化表达基因ACPL_4236的质粒构建示意图；
图3为强化表达基因ACPL_7303的质粒构建示意图；
图4为强化表达基因ACPL_6479的质粒构建示意图；
图5为强化表达基因ACPL_8104的质粒构建示意图；
图6为调控蛋白基因强化表达突变株与空载体整合菌株阿卡波糖发酵产量示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，并给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或制造厂商的建议条件。
本发明所涉及的质粒pSET152已经在SCI数据库文献《Bierman M, Logan R, O'Brien K, Seno ET, Rao RN, Schoner BE (1992) Plasmid cloning vectors for theconjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene,116, 43-49》中公开。
本发明所涉及菌株游动放线菌QQ-2已经在SCI数据库文献《Zhao QQ, Xie HX,Peng Y, Wang XR, Bai LQ. Improving acarbose production and eliminating theby-product component C with an efficient genetic manipulation system ofActinoplanes sp. SE50/110. Synthetic and Systems Biotechnology, 2017, 2(4):302−309》中公开。
实施例
本实施例为获取正调控基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104强化表达突变株WXM-01、WXM-02、WXM-03、WXM-04、WXM-05的具体过程。具体操作步骤如下：
步骤一：质粒pLQ1450的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物GBACPL_1889-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_1889基因,通过基因测序确认目的基因的正确性；以pDR3质粒为模板，使用kasOp-F/R, 通过PCR扩增得到kasOp*基因, 通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1450。在37°C水浴条件下，采用XbaI和BamHI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到350 bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤二：质粒pLQ1451的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物GBACPL_4236-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_4236基因, 通过基因测序确认目的基因的正确性；以pDR3质粒为模板，使用kasOp-F/R, 通过PCR扩增得到kasOp*基因, 通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pSET152的XbaI/NotI位点插入酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1451。在37°C水浴条件下，采用XbaI和NotI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到600 bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤三：质粒pLQ1452的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物GBACPL_7303-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_7303基因, 通过基因测序确认目的基因的正确性；通过PCR扩增得到kasOp*基因, 通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入酶切后的扩增片段得到质粒PLQ1452。在37°C水浴条件下，采用XbaI和BamHI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到500 bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤四：质粒pLQ1453的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物GBACPL_6479-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_6479基因片段,通过基因测序确认目的基因的正确性；以pDR3质粒为模板，使用kasOp-F/R，通过PCR扩增得到kasOp*基因片段，通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入酶切后的kasOp*和ACPL_6479扩增片段得到质粒PLQ1453。在37°C水浴条件下，采用XbaI和BamHI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到600 bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
步骤五：质粒pLQ1454的构建
以游动放线菌SE50/110的基因组DNA为模板，使用引物GBACPL_8104-F/R，通过PCR扩增得到ACPL_8104基因,通过基因测序确认目的基因的正确性；以pDR3质粒为模板，使用kasOp-F/R，通过PCR扩增得到kasOp*基因，通过基因测序确认目的基因的正确性。在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入酶切后的kasOp*和ACPL_8104扩增片段得到质粒PLQ1454。在37°C水浴条件下，采用XbaI和BamHI两种限制性内切酶进行酶切处理可以观察到800 bp左右的目标条带，表明质粒构建正确。
图1示意了在pSET152中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_1889的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ1450转化进入宿主E. coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E. coli ET12567于含有30 μg/mL安普霉素、50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB中37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1%的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株QQ-2的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2~3次后，与之前制备的宿主菌E. coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30°C培养箱培养36小时后取出平板，分别取30 mg/mL安普霉素和50 mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40 mL加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中继续培养。一般5~7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBACPL_1889-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株WXM-01。
图2示意了在pSET152中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_4236的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ1451转化进入宿主E. coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E. coli ET12567于含有30 μg/mL安普霉素、50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB中37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1%的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株QQ-2的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2~3次后，与之前制备的宿主菌E. coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30°C培养箱培养36小时后取出平板，分别取30 mg/mL安普霉素和50 mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40 mL加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中继续培养。一般5~7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBACPL_4236-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株WXM-02。
图3示意了在pSET152中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_7303的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ1452转化进入宿主E. coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E. coli ET12567于含有30 μg/mL安普霉素、50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB中37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1%的比例转接一次并培养4-5小时至OD600达到0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株QQ-2的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2~3次后，与之前制备的宿主菌E. coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30°C培养箱培养36小时后取出平板，分别取30 mg/mL安普霉素和50 mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40 mL加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中继续培养。一般5~7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBACPL_7303-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株WXM-03。
图4示意了在pSET152中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_6479的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ1453转化进入宿主E. coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E. coli ET12567于含有30 μg/mL安普霉素、50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB中于37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1%的比例转接一次并培养4-5小时至OD600为0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株QQ-2的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2~3次后，与之前制备的宿主菌E. coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30°C培养箱培养36小时后取出平板，分别取30 mg/mL安普霉素和50 mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40 mL加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中培养。一般5~7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBACPL_6479-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株。
图5示意了在pSET152中插入强启动子kasOp*和目的基因ACPL_8104的过程。具体操作如下：将已构建完成的基因强化表达的质粒pLQ1454转化进入宿主E. coli ET12567(含有pUZ8002质粒)中。取E. coli ET12567于含有30 μg/mL安普霉素、50 μg/mL卡那霉素和25 μg/mL氯霉素的LB中于37°C过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按1%的比例转接一次并培养4-5小时至OD600为0.6-0.8，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。与此同时制备出发菌株QQ-2的新鲜菌丝体，用新鲜LB溶液漂洗2~3次后，与之前制备的宿主菌E. coli ET12567分别稀释10倍后混合(菌丝体和宿主菌的比例约为1:1)均匀后涂布于SFM平板，待平板吹干后转移至30°C培养箱培养36小时后取出平板，分别取30 mg/mL安普霉素和50 mg/mL甲氧苄啶两种抗生素的储存液40 mL加入1 mL无菌水中混匀后覆盖在SFM平板上，将平板晾干后转移至30°C培养箱中培养。一般5~7天后可见平板上有单菌落接合子长出，将接合子挑出扩大培养，提取基因组，采用kasOp-F和GBACPL_8104-R为引物，通过PCR和抗性验证的方法验证接合子正确的基因过表达突变株。
上述步骤一、二、三中所用到的引物序列如表1所示：
表1
| 引物名称 | 碱基序列 |
| GB-ACPL_1889-F | TTGAAGAGGTGACGTCATGGCAGCCACTGGCACAGCT SEQ ID NO.7 |
| GB-ACPL_1889-R-BamHI | CTGGATCCTCACGCCTTCTTGCG SEQ ID NO.8 |
| GB-ACPL_4236-F | TTGAAGAGGTGACGTCATGGGAAGGCCGCGAGCGTT SEQ ID NO.9 |
| GB-ACPL_4236-R-NotI | CTGCGGCCGCTCACCGACAACGCTGATCTTGGC SEQ ID NO.10 |
| GB-ACPL_7303-F | TTGAAGAGGTGACGTCATGAAGCTGGTGACCGCGGT SEQ ID NO.11 |
| GB-ACPL_7303-R-BamHI | CTGGATCCTCAGAGGGCGTCGAGGC SEQ ID NO.12 |
| GB-ACPL_6479-F | TTGAAGAGGTGACGTCATGCCGTCTGAGTACGCGAAGTCAC SEQ ID NO.13 |
| GB-ACPL_6479-R-BamHI | CTGGATCCTCAGCTCGCGAAGAACGCCCG SEQ ID NO.14 |
| GB-ACPL_8104-F | TTGAAGAGGTGACGTCATGGATGAGGTACTGGCGCG SEQ ID NO.15 |
| GB-ACPL_8104-R-BamHI | CTGGATCCTCAGACCCGGGCGCGCCGGGCGAGAC SEQ ID NO.16 |
| kasOp-F-XbaI | GCTCTAGATGTTCACATTCGAACGGTCTC SEQ ID NO.17 |
| kasOp-R | GACGTCACCTCTTCAACTCAG SEQ ID NO.18 |
步骤四，利用HPLC检测阿卡波糖的发酵产量
使用Agilent公司的ZORBAX NH2柱进行色谱分析，采用DAD紫外检测器测定210 nm下的色谱吸收峰，流动相流速为1 mL/min；流动相A：35%磷酸盐，流动相B：65%乙腈。柱温：室温。
图6为强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889、ACPL_4236、ACPL_7303、ACPL_6479和ACPL_8104后阿卡波糖发酵水平检测结果。结果表明强化表达这些基因之后，阿卡波糖的发酵水平有明显的提高，和空载体整合菌株相比，阿卡波糖的发酵产量提高约25%、18、26%、22%、15%，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.29 g/L、3.11 g/L、3.32 g/L、3.21 g/L、3.03 g/L。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 增强正调控蛋白基因表达以提高阿卡波糖发酵水平的方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 228
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110(Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 1
atggcagcca ctggcacagc taccagtact gagaagggtc gtcgaatcgt cggtagcgag 60
cggcagtcgc tcgccaagga cctggtgaag cgttacacct cgggcgagag catccgggcg 120
cttgccgctt ccaccggccg ttcctatgga ttcgtccacc gcgtgctcac cgaatccggt 180
gtgcagttgc gccagcgtgg cggcgcccgc cgccgcaaga aggcgtga 228
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110(Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 2
atgggaaggc cgcgagcgtt cgacgagacc gaggtcgtgc gggccgcggc cgggctgttc 60
gcccggcgcg cgttcgacgg cgtctcggtc gacgacctgg tcgcccacct gggcgtccac 120
cgcaacagtc tctaccaggt gttcggcagt aaacgcgggc tctacctgcg ggcgctgcgc 180
tggagcctgc agcacgaggt cgggccgctg ctgcggcacg cggggccggg gtcgctgacc 240
gatcttgccg ccgacccggt gctcgatctg ctgctgctgg ccgccgcgga acgtgccccg 300
caggatccgg aggtcgccgc ggaggtcgcc gcggcgctcg ccgacctgga caccgccctg 360
ggcggtcagg cggccaccct gctcgggctg cggctgtgcg cccggatcaa ccccctcggg 420
aaggaggcgg cagatggccg ccaagatcag cgttgtcggt ga 462
<210> 3
<211> 339
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110(Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 3
atgaagctgg tgaccgcggt catcaagccg taccagctcg acgcggtgaa ggaggctctg 60
cacgccctgg gcgtcgccgg gctgaccgtg agcgaggtgc agggatacgg ccggcagaag 120
ggccacaccg aggtgtaccg gggcgccgag tacaccgtcg agttcctccc caagatcaag 180
gtggaggtga tcaccgacga gatcgacgtg gagaagatcg tcgacgcggt ggtgaccgcc 240
tcccggaccg gcaagatcgg cgacggcaag gtctgggtga cgacagtcga cgacgtcatc 300
cgggtccgca ccggcgagcg cggcctcgac gccctctga 339
<210> 4
<211> 489
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110(Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 4
atgccgtctg agtacgcgaa gtcactgggc gctcgtctgc gctccattcg ccagcagcag 60
ggcctgtccc tgcagggcgt cgaagagaag tccaacggcc gctggaaggc cgtcgtggtc 120
ggctcgtacg agcgtggcga ccgtgccgtg accgtctcgc gcctggccga gttggccgac 180
ttctaccggg tgcccgtctc cgagctgctg cccgacggca gcggcatccg cctcgaggcc 240
accaacaaga tcgtgctgga cctcgagaag ctgtacgaca ccaccggtga ggacctcgcc 300
tacgtggcgc ggtacgcccg ggcgatccag cagcagcgtg gcgactacaa cggccgggtc 360
ctctcgatcc gcgccgacga cctgcgcgcg ctcgccatcg tgtacgacat ctcgccgtcc 420
ggcttgatcg agcggctcac cgagcagggc gtcctggtgg ccgacccgcg ggcgttcttc 480
gcgagctga 489
<210> 5
<211> 678
<212> DNA
<213> 游动放线菌SE50/110(Actinoplanes sp. SE50/110)
<400> 5
atggatgagg tactggcgcg cagcgggatc ttccagggcg ttgacccgga agccgccgag 60
gcgctcgcca aggagatgga cacgatcgaa gtccgcaagg gcgacgtggt cttcaacgag 120
ggcgaggccg gcgacagcct gtatatcgtt ctgtccggga agatcaagct cggtcgacga 180
gcggcggacg gacgacagaa cctcgtctcc atcatgggac cgtccgacat gctgggcgag 240
ctgtccctct tcgacccggg cccgcgcacc gcgacggcca ccgcggtgac cgacagccgg 300
ctcgcccggc tgaagaagtc gtcgctgcgc ccgtggctga acaaccggcc ggagatcgcc 360
gagcagctgc tccgcgtgct ggcccggcgc ctgcggcgga ccaacgacgc gctggccgac 420
ctgatcttca ccgacgtgcc cggccgggtg gcgaaaaacc tgctgcagat ggccggccgg 480
ttcggcaccc gggacggtgg tgtgctgcgc gtcacgcacg acctcaccca ggaggagctg 540
gcccagctcg tcggcgcgtc ccgcgagacg gtgaacaagg cgctggccga cttcgcctcc 600
cgcgcgtggc tccggctgga cggcaagagc gtcatcatcc tcgatccgga gcgtctcgcc 660
cggcgcgccc gggtctga 678
<210> 6
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60
ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagttact agtatctgag ttgaagaggt 120
gacgtc 126
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgaagaggt gacgtcatgg cagccactgg cacagct 37
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggatcctc acgccttctt gcg 23
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgaagaggt gacgtcatgg gaaggccgcg agcgtt 36
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcggccgc tcaccgacaa cgctgatctt ggc 33
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgaagaggt gacgtcatga agctggtgac cgcggt 36
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggatcctc agagggcgtc gaggc 25
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgaagaggt gacgtcatgc cgtctgagta cgcgaagtca c 41
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctggatcctc agctcgcgaa gaacgcccg 29
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgaagaggt gacgtcatgg atgaggtact ggcgcg 36
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctggatcctc agacccgggc gcgccgggcg agac 34
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctctagatg ttcacattcg aacggtctc 29
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacgtcacct cttcaactca g 21
Claims (4)
1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌QQ-2中强化表达阿卡波糖生物合成基因簇转录控调相关的序列如SEQ ID NO.1所示的正调控蛋白基因ACPL_ 1889，获得阿卡波糖高产菌株。
2.如权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中强化表达正调控蛋白基因具体包括如下步骤：
S1，设计并构建用于强化表达正调控蛋白基因ACPL_1889的整合型质粒I；
S2，通过接合转移将整合型质粒I导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因强化表达突变株。
3.如权利要求2所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从游动放线菌SE50/110基因组中获取228 bp的ACPL_1889基因片段以及pDR3质粒中获取126 bp的强启动子kasOp*基因片段，在质粒pSET152的XbaI/BamHI位点插入126 bp的 kasOp* 基因片段和228 bp的ACPL_1889基因片段。
4.如权利要求2所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述阿卡波糖高产菌株的发酵包含下列步骤：将基因强化表达突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养30~36小时；按照10%~15%的接种量转接至二级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养24~28小时；按照10%~15%的接种量转接至发酵培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养90~96小时后收取发酵液。
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