CN117737024A - 一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物shpl-49的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL‑49的方法。该方法以4‑(4‑甲氧苯基)‑1‑丁醇为原料，经酶催化体系催化获得SHPL‑49。所述酶催化体系包括糖基转移酶突变体和蔗糖合酶。所述糖基转移酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸，其比酶活是野生型的3.37倍。采用本发明所述方法，可实现一步法合成SHPL‑49，滴度能够达到6.5g/L，转化率达到95.0％，时空产率325.0mg/L/h。该方法合成工艺步骤短、产物构型单一、转化率高、生产操作简单、设备要求低、绿色环保，在SHPL‑49新药的开发上有较大的前景。

Description

一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药 物SHPL-49的方法

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法。

背景技术

脑卒中是全球第二大致死性疾病，对社会、政府和家庭都带来了巨大负担。中国是脑卒中的高发国家，每年有大约1300万脑卒中患者，新增病例约250万。其中，缺血性脑卒中占了总病例的大部分，年复发率高达17.7％。急性期的治疗对患者的康复至关重要，但目前缺乏确切有效的药物治疗。治疗缺血性脑卒中急性期的目标是改善脑血循环和神经保护，以减少神经细胞损伤和提高生活质量。治疗方法包括溶栓、抗血小板、抗凝、降纤等药物和血管内治疗。

糖苷类化合物在自然界中广泛存在，具备多种生物活性。特定结构的糖苷类化合物，包括其互变异构体、光学异构体、溶剂化合物、多晶型物、药学上可接受的盐、酯、前体药物或衍生物，具有预防和/或治疗缺血性脑血管疾病的潜力。这些化合物可用于干预与血管壁病变、血液成分变化和/或血流动力学变化相关的脑组织缺血的早期到晚期的各种症状和/或病理变化。研究发现，糖苷类化合物SHPL-49(结构下图所示)通过对造成缺血级联反应的兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎症反应等多通路的调控，发挥神经保护作用，该药目前已获得NMPA和FDA的临床试验许可。

目前化学合成糖苷类化合物的主要方法有：(1)Koenigs-Knorr苷化反应，使用α-卤代糖在碳酸银的作用下，与醇发生取代反应制备糖苷，该方法首先要合成糖基卤代物，并且使用昂贵的银试剂，这是最为常见的一种合成方法。(2)Schmidt三氯酰亚胺苷化反应，该方法使用三氯乙腈与糖基半缩醛在碱性条件下加成得到三氯乙酰亚胺酯，然后在路易斯酸催化下与醇或酚反应生产糖苷。该方法使用了3类致癌物质三氯乙腈以及反应过程中生产基因毒性副产物三氯乙酰胺。(3)Kahne苷化反应，该方法使用糖基亚砜经过三氟甲磺酸酐的活化，与醇、酚反应得到相应的糖苷化合物，该反应使用-30～-78℃的温度，条件较为苛刻。(3)其他糖苷合成方法，其他的糖苷化方法还有相转移催化法、三氟乙酸酯法等，都是经典方法的改进，但也都存在一些问题或者局限性。因此，现有技术中在如何高选择性、高效的、更经济、更绿色环保的合成制备SHPL-49仍然具有较多的难点与挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体及酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低、适合工业大规模生产。

本发明的第一方面是提供一种糖基转移酶突变体，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸得到糖基转移酶突变体，所述的糖基转移酶突变体的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二方面是提供编码前述的糖基转移酶突变体的核酸分子或表达前述的糖基转移酶突变体的宿主细胞或包含前述的糖基转移酶突变体的催化剂。该催化剂可以为表达前述的糖基转移酶突变体的宿主细胞(基因工程菌)。

本发明的第三方面是提供前述的一种糖基转移酶突变体在催化合成急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49中的应用。

本发明的第四方面是提供一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，采用酶催化体系催化急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的合成；所述酶催化体系包括前述的糖基转移酶突变体。

优选的，所述的酶催化体系还包括蔗糖合酶；蔗糖合酶的序列如SEQ ID NO:3所示。

所述方法包括以下步骤：以4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇作为原料，添加蔗糖和UDP，糖基转移酶突变体用于将UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移到4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇的醇羟基上，蔗糖合酶则用于将UDP再生为UDP-葡萄糖。具体地，在UDP存在的条件下，蔗糖由蔗糖合酶催化生成葡萄糖、果糖和UDP-葡萄糖，生成的UDP-葡萄糖再次参与SHPL-49的合成。

优选的，首先加入UDP启动催化反应，酶组合中糖基转移酶突变体和蔗糖合酶来源于同一宿主细胞的细胞悬液或破胞粗酶液，或者糖基转移酶突变体和蔗糖合酶单表达菌株的细胞悬液混合液或破胞粗酶液混合液。

优选的，将糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因构建于同一个表达质粒上，导入宿主细胞，构建基因工程菌，更为优选的，表达质粒为pCDFDuet-1，宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

进一步的，所述基因工程菌发酵时采用补料分批发酵方法，在基础培养基被消耗完全后，通过向发酵液补加补料培养基来使基因工程菌细胞密度得以继续增加，待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD₆₀₀＝20～40时，向发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束，细胞浓度达到OD₆₀₀＝200～300。

优选的，在酶催化体系中加入所述基因工程菌，催化反应过程中添加的原料4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇，反应体系中原料的浓度为5～50mM。

优选的，酶催化体系中，细胞浓度为10～30g/L，pH值为7.0～9.0，反应温度为20～50℃，UDP的添加浓度为0.1mM～0.5mM，蔗糖的添加浓度为50mM～500mM，DMSO浓度(体积分数)为1％-10％；所述的细胞为前述的基因工程菌。

本发明具有的有益效果：本发明提供的糖基转移酶突变体及用于生产SHPL-49的方法，所产生的副产物易去除，无需复杂的分离工艺或不需要额外的分离工艺，简化了产品的后处理工艺；滴度能够达到6.5g/L，收率达到95.0％，时空产率325.0mg/L/h，充分利用了酶的催化活性，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，因此适合SHPL-49新药的大规模生产。

附图说明

图1糖基转移酶BlYjiC及其突变体的SDS-PAGE结果；(A)重组菌E.coli/pET28a-

BlYjiC诱导前后电泳结果，M，Marker；1，诱导前细胞；2，诱导后细胞；

3，诱导后细胞破碎上清；(B)纯化后蛋白；M，Marker；4，野生型BlYjiC；

5和6，糖基转移酶突变体P321S；

图2重组质粒pCDFDuet-BlYjiC-GmSuSy示意图，其中BlYjiC为糖基转移酶基因，

GmSuSy为蔗糖合酶基因；

图3共表达菌株诱导后SDS-PAGE分析结果，M，Marker；1，共表达菌株

M1(E.coli/pCDFDuet-BlYjiC-GmSuSy)；2，共表达菌株M2(E.coli/pCDFDuet-

BlYjiCP321S-GmSuSy)；

图4酶法制备SHPL-49示意图，其中BlYjiC为糖基转移酶或其突变体，GmSuSy为

蔗糖合酶；

图5共表达菌株M2催化前后HPLC分析图谱；(A)底物标准品HPLC分析结果；

(B)共表达菌株M2催化0h HPLC分析结果；(C)共表达菌株M2催化反应结束HPLC检测结果；

图6共表达菌株M2催化后反应液中SHPL-49的液相质谱结果；

图7共表达菌株催化合成SHPL-49时间曲线。

具体实施方式

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA聚合酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α，质粒pCDFDuet-1购自Novagen公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；基因合成、引物合成与序列测序工作由通用生物(安徽)股份有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

下列实施例的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为色谱柱：AQ-C18；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：UV 275nm；流动相：20％甲醇(含有0.1％甲酸)。

实施例1糖基转移酶的克隆

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580基因组为模板，BlYjiC-F和BlYjiC-R为引物(序列编号分别为SEQ ID NO:4-5)，如表1所示，扩增糖基转移酶基因，其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示，命名为WT-BlYjiC，通过一步克隆试剂盒(ClonExpress IIOne Step Cloning Kit)将扩增的BlYjiC基因连接至pET-28a(+)质粒(C端加His-tag纯化标签)，构建重组质粒pET28a-BlYjiC。将该重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并检测，获得包含BlYjiC基因的重组工程菌。

表1克隆糖基转移酶所用引物

引物名称	引物序列
		BlYjiC-F	aagaaggagatatactgcagATGGGACATAAACATATCGCGA
BlYjiC-R	cggagctcgaattcggatccTTATTTTACTCCTGCGGGTGC

SEQ ID NO.1野生型BlYJiC氨基酸序列

MGHKHIAIFNIPAHGHINPTLALTASLVKRGYRVTYPVTDEFVKAVEETGAEPLNYRSTLNIDPQQIRELMKNKKDMSQAPLMFIKEMEEVLPQLEALYENDKPDLILFDFMAMAGKLLAEKFGIEAVRLCSTYAQNEHFTFRSISEEFKIELTPEQEDALKNSNLPSFNFEDMFEPAKLNIVFMPRAFQPYGETFDERFSFVGPSLAKRKFQEKETPIISDSGRPVMLISLGTAFNAWPEFYHMCIEAFRDTKWQVIMAVGTTIDPESFDDIPENFSIHQRVPQLEILKKAELFITHGGMNSTMEGLNAGVPLVAVPQMPEQEITARRVEELGLGKHLQPEDTTAASLREAVSQTDGDPHVLKRIQDMQKHIKQAGGAEKAADEIEAFLAPAGVK

实施例2重组糖基转移酶BlYjiC的表达及纯化

重组工程菌菌株接种到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，并在37℃的轨道培养摇床上以200rpm的速度培养12小时。将1mL培养物加入含有50mL LB培养基的250毫升烧瓶中，在37℃和200rpm的条件下进行好氧培养。当OD₆₀₀达到约0.6-0.8时，用0.1mM IPTG诱导细胞。在18℃诱导24小时后收获细胞。将细胞经离心处理，重悬于50毫米pH8.0的磷酸钾缓冲液中，并通过超声波破碎细胞。将细胞提取物以12000rpm的速度离心20分钟，上清即为粗酶溶液，将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，检测BlYjiC表达情况。结果如图1中的A所示，可以看出上清中的目的蛋白含量和总的目的蛋白含量相当，证明BlYjiC在大肠杆菌中能够高效可溶性表达。

采用镍柱亲和层析法对重组糖基转移酶BlYjiC进行纯化：

1)样品预处理：用上样缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，25mM咪唑，500mMNaCl)将菌体重悬，冰浴中超声破碎，4℃，12000rpm离心去除细胞碎片，上清再用0.22μm滤膜过滤；

2)上样：用10倍柱体积上样缓冲液冲洗镍柱，将1)中预处理样品缓慢上柱，使蛋白与镍柱充分结合；

3)洗杂：用10倍柱体积洗杂缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，50mM咪唑，500mMNaCl)冲洗镍柱；

4)目标蛋白洗脱：用洗脱缓冲液(20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，250mM咪唑，500mMNaCl)对目标蛋白进行洗脱；

5)超滤与保存：将收集的洗脱液移至超滤管中，通过4℃离心超滤对蛋白样品进行脱盐与浓缩；超滤后的蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果如图1中的B所示。SDS-PAGE检测表明纯化蛋白纯度合格，随后将纯化蛋白加入终浓度为20％的甘油，液氮速冻后放入-80℃保存。

实施例3野生型糖基转移酶WT-BlYjiC的活力测定

将50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、2mM 4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇、5mM UDP-葡萄糖以及适量的酶混合，在30℃和1000rpm的条件下反应30min。通过添加4倍甲醇体积来终止反应，并通过高效液相色谱法(HPLC)进行分析。酶活性单位的定义为在标准测定条件下，每分钟催化产生1μM产物所需的酶量为1个活力单位。HPLC检测采用C18柱(ZORBAX SB-C18，Agilent，美国)，在30℃下以1mL/min的流速分析糖基化产物，检测波长275nm。

实施例4野生型糖基转移酶WT-BlYjiC的理性改造

本发明通过将野生型糖基转移酶WT-BlYjiC氨基酸序列的321位脯氨酸(Pro)定点突变为丝氨酸(Ser)，得到了BlYjiC突变体P321S，显著提高了BlYjiC的酶活，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体步骤如下：

(1)突变体的构建

本发明通过设计特异性引物(见表2，序列编号对应SEQ ID NO:6-7)，利用Quickchange技术(An efficient onestepsite-directed and site-saturationmutagenesis protocol[J].Nucleic AcidsResearch,2004,32(14):e115)在野生型糖基转移酶BlYjiC基因序列引入突变，构建了P321S突变体。

具体的，PCR反应体系为：ddH₂O 2μL，DNA聚合酶5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL。PCR扩增条件：1)预变性94℃2min；2)变性98℃10s，退火60℃15s，延伸72℃35s(此步骤循环30次)；后延伸72℃10min。PCR产物在37℃下经Dpn I限制性酶消化20分钟。然后经消化的产物被转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB/Kan固体平板上37℃培养过夜。

表2糖基转移酶BlYjiC理性设计所用引物

注：小写部分的密码子编码突变后的氨基酸

SEQ ID NO.2糖基转移酶突变体P321S氨基酸序列

MGHKHIAIFNIPAHGHINPTLALTASLVKRGYRVTYPVTDEFVKAVEETGAEPLNYRSTLNIDPQQIRELMKNKKDMSQAPLMFIKEMEEVLPQLEALYENDKPDLILFDFMAMAGKLLAEKFGIEAVRLCSTYAQNEHFTFRSISEEFKIELTPEQEDALKNSNLPSFNFEDMFEPAKLNIVFMPRAFQPYGETFDERFSFVGPSLAKRKFQEKETPIISDSGRPVMLISLGTAFNAWPEFYHMCIEAFRDTKWQVIMAVGTTIDPESFDDIPENFSIHQRVPQLEILKKAELFITHGGMNSTMEGLNAGVPLVAVPQMSEQEITARRVEELGLGKHLQPEDTTAASLREAVSQTDGDPHVLKRIQDMQKHIKQAGGAEKAADEIEAFLAPAGVK

(2)突变体酶活检测

挑选阳性克隆子并送测，确定突变成功后采用实施例2所述方法对突变子P321S进行表达和纯化，纯化结果如图1中的B所示，纯化蛋白纯度符合要求。采用实施例3所述方法对野生型糖基转移酶和突变子P321S比酶活进行检测，结果如表3所示。结果表明，突变体P321S的比活力分别由野生型1.17U/mg提高到3.95U/mg，是野生型的3.37倍。

表3糖基转移酶BlYjiC及其突变子比酶活

酶	比酶活
		WT	1.17±0.43
P321S	3.95±0.56

实施例5共表达糖基转移酶和蔗糖合酶的基因工程菌的构建

(1)共表达野生型糖基转移酶和蔗糖合酶的基因工程菌的构建

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580基因组为模板将野生型糖基转移酶BlYjiC基因克隆至表达质粒pCDFDuet-1的BamH I和Hind III两个位点之间；连接质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌E.coliBL21(DE3)/pCDFDue-BlYjiC。

蔗糖合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该序列由通用生物(安徽)股份有限公司合成至载体pUC57上，以该质粒为模板将糖基转移酶突变体基因克隆至表达质粒pCDFDue-BlYjiC的Nde I和Xho I两个位点之间；连接质粒经测序验证无误后命名为pCDFDue-BlYjiC-GmSuSy，如图2所示。将该质粒转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到共表达重组菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDue-BlYjiC-GmSuSy(M1)。

(2)共表达糖基转移酶突变体P321S和蔗糖合酶的基因工程菌的构建

本发明通过设计特异性引物(见实施例4中表2)，利用Quickchange技术(Anefficient onestepsite-directed and site-saturation mutagenesis protocol[J].Nucleic AcidsResearch,2004,32(14):e115)，通过全质粒PCR技术在pCDFDue-BlYjiC-GmSuSy中糖基转移酶BlYjiC基因序列引入突变，构建了pCDFDue-BlYjiCP321S-GmSuSy突变体。

具体的，PCR反应体系为：ddH₂O 2μL，DNA聚合酶5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL。PCR扩增条件：1)预变性94℃2min；2)变性98℃10s，退火60℃15s，延伸72℃40s(此步骤循环30次)；后延伸72℃10min。PCR产物在37℃下经Dpn I限制性酶消化20分钟。然后经消化的产物被转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB/Kan固体平板上37℃培养过夜。挑选克隆子送测，突变成功后的菌株命名为E.coli/pCDFDue-BlYjiCP321S-GmSuSy(M2)甘油管保藏。

SEQ ID NO.3(蔗糖合酶GmSuSy序列)

MATDRLTRVHSLRERLDETLTANRNEILALLSRIEAKGKGILQHHQVIAEFEE

IPEENRQKLTDGAFGEVLRSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYLRVNVHALV

VEELQPAEYLHFKEELVDGSSNGNFVLELDFEPFNAAFPRPTLNKSIGNGVQFL

NRHLSAKLFHDKESLHPLLEFLRLHSVKGKTLMLNDRIQNPDALQHVLRKAE

EYLGTVPPETPYSEFEHKFQEIGLERGWGDNAERVLESIQLLLDLLEAPDPCTL

ETFLGRIPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPDTGGQVVYILDQVRALENEML

HRIKQQGLDIVPRILIITRLLPDAVGTTCGQRLEKVFGTEHSHILRVPFRTEKGIV

RKWISRFEVWPYLETYTEDVAHELAKELQGKPDLIVGNYSDGNIVASLLAHK

LGVTQCTIAHALEKTKYPESDIYWKKLEERYHFSCQFTADLFAMNHTDFIITST

FQEIAGSKDTVGQYESHTAFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADQTIYFPH

TETSRRLTSFHPEIEELLYSSVENEEHICVLKDRSKPIIFTMARLDRVKNITGLVE

WYGKNAKLRELVNLVVVAGDRRKESKDLEEKAEMKKMYGLIETYKLNGQF

RWISSQMNRVRNGELYRVICDTRGAFVQPAVYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATC

NGGPAEIIVHGKSGFHIDPYHGDRAADLLVDFFEKCKLDPTHWDKISKAGLQR

IEEKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRRESRRYLEMFYALKYRKLAE

SVPLAAE

实施例6：基因工程菌的发酵

(1)菌种活化：采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的共表达基因工程菌在LB/Sm琼脂固体培养基表面上划线，平皿倒置于37℃恒温培养箱，培养12小时；

(2)种子培养：将活化后的菌种再接种到50mL的一级种子培养基中，37℃下振荡培养12h，得到一级种子液；然后，将一级种子液移入500mL二级种子培养基中，37℃下振荡培养10h，得到二级种子液；

其中，一级种子培养基为LB培养基，10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH＝7.0，121℃灭菌20min，接种前加入链霉素浓度为50μg/mL。二级种子培养基为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物16.43g/L K₂HPO₄·3H₂O，2.31g/L KH₂PO₄，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入链霉素浓度为50μg/mL。

(3)分批补料发酵：

先配制2L基础培养基置于发酵罐中，初始pH＝7.0，121℃灭菌20min，将200mL二级种子液接入发酵罐，进行发酵，控制发酵温度37℃，通过通气与搅拌控制溶氧维持在5～30％之间，用氨水控制发酵液pH＝7.0。另配1L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却到室温后，待用。待基础培养基营养物质耗尽(表现为溶氧急剧上升)，开始补料。发酵6h后，测得发酵液的OD₆₀₀＝20左右，将发酵液温度降至28℃，加入诱导剂IPTG 0.5mM，继续发酵到48h，期间溶氧维持在20～30％；补料速率为0.05L/h。

将发酵液进行5000rpm离心20min，弃上清，得到基因工程菌菌泥，对诱导表达后的基因工程菌菌泥进行SDS-PAGE验证，结果如图3所示。结果表明糖基转移酶或其突变体与蔗糖合酶均成功共表达。

实施例7：共表达菌株催化生产SHPL-49

反应体系(200mL)：20mM底物4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇，0.5mM UDP，50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，400mM蔗糖，5％ DMSO，20g/L重组细胞(即基因工程菌)。烧瓶置于水浴中、控制水浴温度为30℃，开启搅拌。其中，共表达菌株M2催化反应前后HPLC色谱图如图5所示，质谱分析结果如图6所示，产物符合SHPL-49分子量。共表达菌株M1和M2反应过程曲线如图7所示，图中可以看出反应20h共表达菌株M1和M2分别产生12.8mM(4.4g/L)和19.0mM SHPL-49(6.5g/L)，转化率分别为64.0％和95.0％，时空差率分别达到220.0mg/L/h和325.0mg/L/h。表明本发明所采用的糖基转移酶突变体与蔗糖合酶组合制备SHPL-49的方法具有很高的催化效率和转化率，应用潜力巨大。

以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第321位脯氨酸突变为丝氨酸得到糖基转移酶突变体，所述的糖基转移酶突变体的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1所述的糖基转移酶突变体的核酸分子或表达权利要求1所述的糖基转移酶突变体的宿主细胞或包含权利要求1所述的糖基转移酶突变体的催化剂。

3.权利要求1所述的一种糖基转移酶突变体在催化合成急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49中的应用。

4.一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，采用酶催化体系催化急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的合成；所述酶催化体系包括权利要求1所述的糖基转移酶突变体。

5.根据权利要求4所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，所述的酶催化体系还包括蔗糖合酶；蔗糖合酶的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇作为原料，添加蔗糖和UDP，糖基转移酶突变体用于将UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移到4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇的醇羟基上，蔗糖合酶则用于将UDP再生为UDP-葡萄糖。

7.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，糖基转移酶突变体基因和蔗糖合酶基因构建于同一个表达质粒上，导入宿主细胞，构建基因工程菌。

8.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，所述基因工程菌发酵时采用补料分批发酵方法，在基础培养基被消耗完全后，通过向发酵液补加补料培养基来使基因工程菌细胞密度得以继续增加，待发酵液中基因工程菌的细胞浓度达到OD₆₀₀＝20～40时，向发酵液中加入异丙基硫代半乳糖苷诱导基因工程菌产酶，直至发酵结束，细胞浓度达到OD₆₀₀＝200～300。

9.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，在酶催化体系中加入所述基因工程菌，催化反应过程中添加的原料4-(4-甲氧苯基)-1-丁醇，反应体系中原料的浓度为5～50mM。

10.根据权利要求5所述的一种酶法制备急性缺血性脑卒中候选药物SHPL-49的方法，其特征在于，酶催化体系中，细胞浓度为10～30g/L，pH值为7.0～9.0，反应温度为20～50℃，UDP的添加浓度为0.1mM～0.5mM，蔗糖的添加浓度为50mM～500mM，DMSO浓度为1％-10％；所述的细胞为基因工程菌。