CN115838699B - 一种乌蕨c-糖基转移酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种乌蕨C‑糖基转移酶及其编码基因与应用。该乌蕨C‑糖基转移酶其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的ScCGT1基因是首次发现的在非种子植物中能够表达C‑糖基转移酶的基因，其编码的C‑糖基转移酶对根皮素、2‑羟基柚皮素和2‑羟基圣草酚都具有催化活性，可用于生物合成这些化合物的碳糖基化产物，因此具有较高的经济价值和广阔的应用前景。

Description

一种乌蕨C-糖基转移酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种乌蕨C-糖基转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

黄酮类化合物是一类重要的次级代谢产物，在植物中广泛分布。植物中的类黄酮多以糖苷的形式存在，主要包括黄酮氧苷和黄酮碳苷。和氧苷相比，黄酮碳苷键能更强，具有较好的结构稳定性和水溶性。在植物中，黄酮碳苷可帮助植物抵御UV-B辐射，发挥抗菌作用，并参与植物化感作用和色素沉着等；不仅在植物生理学中发挥重要作用，黄酮碳苷还具有重要的药理学活性。典型的例子包括牡荆素和荭草苷，它们都具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌和潜在的抗糖尿病等活性。

目前，市售的黄酮碳苷主要依靠植物中分离提取，因此具有生产周期长、受植物资源限制等弊端；此外，化学合成或结构改造，过程复杂、收率低并使用有毒化学试剂等，对环境造成污染。因此，生物合成为规模化生产黄酮碳苷提供了一个新的前景。黄酮碳苷的生物合成由C-糖基转移酶(C-glycosyltransferase,CGT)催化。CGTs属于UDP依赖的糖基转移酶(UGTs)家族，利用活化的UDP-糖作为供体，将其转移到糖受体上。目前也存在一些关于黄酮碳苷生物合成的报道，但是产量还满足不了工业生产的需求。因此，筛选具有广谱催化活性的CGT，阐明它的催化活性，并将其用于黄酮糖苷的合成生物学研究具有重要的意义。

目前已研究的CGT多数来源于种子植物，而蕨类植物中还未被鉴定。乌蕨(Stenoloma chusanum)为鳞始蕨科(Lindsaeaceae)乌蕨属植物，富含黄酮碳苷类化合物，目前已分离得到的主要为荭草苷和牡荆素。然而，采用乌蕨通过分离提取的方法获得黄酮碳苷类化合物仍然存在生产周期长、受植物资源限制等弊端。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种乌蕨C-糖基转移酶及其编码基因与应用，本发明提供的乌蕨C-糖基转移酶能够催化合成黄酮碳苷。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种乌蕨C-糖基转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，记为ScCGT1；其中，SEQ ID No.1由476个氨基酸残基组成。

上述乌蕨C-糖基转移酶的编码基因也属于本发明的保护范围。因而另一方面，一种上述乌蕨C-糖基转移酶的编码基因，所述编码基因能够编码上述乌蕨C-糖基转移酶。

在一些实施例中，所述编码基因(ScCGT1)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，SEQ ID No.2由1431个核苷酸组成，其中第1-1428为编码序列，第1429-1431位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。

第三方面，一种含有上述编码基因的重组表达载体。所述重组表达载体为插入外源基因的表达载体，所述外源基因即为上述编码基因，从而表达编码基因所对应的乌蕨C-糖基转移酶。所述表达载体可以为质粒等。

在一些实施例中，所述重组表达载体为由上述编码基因与pET32a构建获得。

第四方面，一种含有上述编码基因的重组细胞。所述重组细胞为将不同来源的细胞器重新装配为具有生物活性的细胞，其中一种细胞器为上述重组表达载体。

在一些实施例中，所述重组细胞为重组细菌。例如大肠杆菌等。

第五方面，一种上述乌蕨C-糖基转移酶在催化制备黄酮碳苷类化合物中的应用。

较为具体地，乌蕨C-糖基转移酶催化根皮素制备nothofagin。

较为具体地，乌蕨C-糖基转移酶催化2-羟基柚皮素制备牡荆素和/或异牡荆素。

本发明的有益效果为：

本发明首次从乌蕨的转录组测序数据库中筛选出一个C-糖基转移酶基因，利用PCR技术从cDNA中获得基因的全长序列。构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导后获得目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明ScCGT1催化根皮素生成nothofagin；催化2-羟基柚皮素生成牡荆素和异牡荆素；催化2-羟基圣草酚生成荭草苷和异荭草苷。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中表达基因ScCGT1扩增产物电泳图。

图2为本发明实施例中ScCGT1蛋白SDS-PAGE电泳图；

其中：泳道1：ScCGT1的上清蛋白；

泳道2：ScCGT1的沉淀蛋白；

泳道3：ScCGT1的纯化蛋白。

图3为本发明实施例中ScCGT1以根皮素为底物的酶活反应的HPLC/LC-MS图谱。A.ScCGT1催化根皮素生成nothofagin反应式；B.糖基化反应的HPLC色谱图；C.产物nothofagin的负离子质谱图；D.产物nothofagin可能断裂方式。(1:根皮素；Glc:UDP-glucose；1a:nothofagin)。

图4为本发明实施例中ScCGT1以2-羟基柚皮素为底物的酶活反应的HPLC/LC-MS图谱。A.ScCGT1催化2-羟基柚皮素的反应过程图；B.糖基化反应的HPLC色谱图；C.产物的负离子质谱图；D.产物的可能断裂方式。(2:2-羟基柚皮素；Glc:UDP-glucose；2a:2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷；2b:牡荆素；2c:异牡荆素；vit：牡荆素标准品；isovit：异牡荆素标准品)。

图5为本发明实施例中ScCGT1以2-羟基圣草酚为底物的酶活反应的HPLC/LC-MS图谱。A.ScCGT1催化2-羟基圣草酚的反应过程图；B.糖基化反应的HPLC色谱图；C.产物的负离子质谱图；D.产物的可能断裂方式。(3:2-羟基圣草酚；Glc:UDP-glucose；3a:2-羟基圣草酚C-葡萄糖苷；3b:荭草苷；3c:异荭草苷；ori：荭草苷标准品；isoori：异荭草苷标准品)。

图6为本发明实施例中以根皮素为底物ScCGT1对不同糖供体的选择性研究。A.ScCGT1催化UDP-半乳糖(UDP-galactose)的HPLC色谱图；B.产物的负离子质谱图；C.ScCGT1催化UDP-葡萄糖醛酸(UDP-glucuronic acid)的HPLC色谱图；D.不同产物量化结果。(1：根皮素；1a:nothofagin；1b：根皮素3’-C半乳糖苷；Gal:UDP-galactose；GlcA,UDP-glucuronic acid；Glc,UDP-glucose)。

图7为本发明实施例中ScCGT1定点突变分析。A:ScCGT1和GgCGT的结构比较分析；B：ScCGT1和GgCGT的活性位点周围氨基酸比较分析；C：野生型ScCGT1和其突变蛋白对根皮素和2-羟基柚皮素的催化活性比较；D:分子对接后ScCGT1和ScCGT1-P164T突变蛋白与糖供体和糖受体结构比较。(1：根皮素；2:2-羟基柚皮素；Glc:UDP-glucose；1a:nothofagin；2a:2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷)。

图8为本发明实施例中在大肠杆菌BL21菌株W1和W2中合成nothofagin。A：以根皮素(1)为底物进行大肠杆菌W1的体内饲喂，底物浓度梯度设定为50μM、100μM和150μM；B：饲喂100μM底物在重组菌株W1和W2中生成的糖苷产物的定量分析；C：以根皮素(1)为底物饲喂重组菌株W1和W2的代谢产物HPLC图谱及产物的质谱鉴定。

图9为本发明实施例中利用大肠杆菌BL21菌株EA1和EA2合成牡荆素和异牡荆素。A：以柚皮素为底物生成牡荆素和异牡荆素的生物合成途径。B：以柚皮素为底物进行大肠杆菌EA1的体内饲喂，底物浓度梯度设定为50μM、100μM和150μM；C：饲喂100μM底物在重组菌株EA1和EA2中生成的糖苷产物的定量分析；D：以柚皮素为底物饲喂重组菌株EA1和EA2的代谢产物HPLC图谱及产物的质谱鉴定。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1.表达基因ScCGT1的克隆

1.1 CTAB-PVP法提取乌蕨总RNA

(1)称取三月生乌蕨新鲜叶片材料，双蒸水清洗干净后用滤纸吸去多余的水分，将其放于提前预冷的研钵中并加液氮研磨，使材料成粉末状。

(2)取适量粉末转移至提前预冷的2mL进口离心管中，迅速加入800μL 65℃预热的CTAB-PVP提取液，上下颠倒混匀。

(3)置于65℃温水中孵育30min，每隔10min上下颠倒混匀一次。

(4)将样品取出，待冷却至室温后加入等体积的氯仿，振荡使其充分混合。

(5)4℃13,000rpm离心10min。

(6)将上清转移至新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿，轻轻振荡混匀后4℃13,000rpm离心10min。

(7)重复实验操作第(6)步(即用氯仿抽提三次)。

(8)吸取上清液并将其转移至新的1.5mL离心管中，然后加入1/3体积的8M LiCl，于-20℃冰箱中静置过夜。

(9)次日，将样品4℃13,000rpm离心10min，弃上清。

(10)加入等体积的75％乙醇洗涤沉淀。4℃13,000rpm离心10min，弃上清。

(11)待多余的乙醇挥发后，加入30μLDEPC处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。

CTAB-PVP提取缓冲液配制方法如下：

100mM Tris·HCl(pH 8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇至0.2％；溶液配置用DEPC处理过的ddH₂O，高压灭菌后备用。

1.2 ScCGT1基因全长扩增

1.2.1 cDNA合成

以提取的乌蕨的总RNA为模板，以M5 HiPer First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒通过PCR技术获得cDNA模板链。

逆转录体系及逆转录程序如下：

1.将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、M5 M-MuLV RTase和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2.根据以下表格配制反应体系，总体积为13μL。

3. 70℃孵育10分钟，然后迅速冰浴2min。

4.短暂离心，继续向以上反应液中加入以下试剂：

逆转录程序：37℃，15min；85℃，15s；4℃保存。逆转录产物保存于-20℃，使用前取2μL稀释10倍，待用。

1.2.2引物设计

使用Bioxm 2.6软件找到ScCGT1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)。在非编码区(Untranslated Region,UTR)设计全长引物，以乌蕨cDNA为模板对基因进行扩增；

全长引物：

ScCGT1-F:GTGCCTGCGAGTATCACTGT；(SEQ ID No.3)

ScCGT1-R:GGCATAGATGCTCAGATGCT；(SEQ ID No.4)

1.2.3目的基因扩增

以逆转录的乌蕨cDNA为模板，以ScCGT1-F/R为引物进行扩增。

扩增体系及扩增程序如下：

将以上组分加入200μL进口PCR管混合均匀后，低转速离心，按照以下程序扩增：

①94℃，5min；

②94℃，30s；

③55℃，30s；

④72℃，1min；

⑤Go to②，30cycles；

⑥72℃，10min。

PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图1A)，将目的条带切胶回收：

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离(1.5％，W/V，g/100mL)，并用Mei5bio胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：

(1)将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，置于紫外灯下快速切下目的条带，放入1.5mL离心管中回收待用。

(2)加入100μL膜结合液MB，于50℃金属浴，使其完全溶解。

(3)柱平衡：将吸附柱置于收集管中，加入500μL柱平衡液BL，室温静置5min，然后12,000rpm离心30s，弃掉滤液。

(4)将上述溶胶液转移至吸附柱中，室温静置5-10min，然后13,000rpm离心30s，弃掉滤液。

(5)吸附柱中加入600μL漂洗液MW。13,000rpm离心30s，弃掉滤液。

(6)重复操作步骤(5)，弃掉滤液。

(7)13,000rpm离心2min，尽量去除多余的漂洗液。

(8)将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，室温放置至乙醇挥干。

(9)在吸附膜中加入30μL ddH₂O，室温静置5-10min，13,000rpm离心2min，收集DNA溶液于-20℃保存使用。

1.3目的片段平端载体连接

将上述胶回收产物片段按照以下反应体系连接到平端载体pTOPO：

将上述反应体系混匀并在25℃反应5min，将最终产物转入大肠杆菌DH5α。

1.4转化

取出-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞(50μL)置于冰上解冻，加入5μL连接产物，轻轻吹打混匀，冰置30min；42℃热击45s后，然后迅速冰置2min，加入500μL无抗LB液体培养基，37℃振荡孵育1h后，取200μL转化液涂于含100μg/mL氨苄抗性的LB固体培养基上，37℃静置培养12h。

LB培养基组分(1L)：酵母提取物1g、胰蛋白胨2g、NaCl 2g，加水溶解后定容至200mL。固体培养基加入琼脂(1.2％)后，高压蒸汽灭菌(121℃灭菌20min)。

1.5重组子阳性克隆鉴定

随机挑选5个单克隆于200μL LB(含100μg/mL氨苄抗性)液体培养基，37℃振荡培养3h。以ScCGT1-F/R为引物，菌液为模板进行菌落PCR。体系如下：

扩增程序：

①94℃，5min；

②94℃，30s；

③55℃，30s；

④72℃，1min；

⑤Go to②，30cycles；

⑥72℃，10min。

菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出目的片段大小条带的为阳性克隆，将能扩增出大小合适条带的克隆送生工生物工程股份有限公司测序。阳性克隆存菌：930μL菌液加70μL DMSO，混和均匀后放于-80℃保存。

实施例2.原核表达分析

2.1提取ScCGT1-pTOPO质粒

用质粒小量提取试剂盒Mei5bio提取质粒：

(1)将所存菌株ScCGT1-pTOPO-DH5α划含氨苄抗性的LB板，37℃，12h后长出单克隆，挑取单克隆于6mL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃，110rpm培养10h。

(2)将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500μL buffer BL，室温静置2min，12,000rpm离心30s，弃掉废液，放置待用。

(3)取菌液室温12,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒掉上清。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL solution I，涡旋振荡至菌体完全悬浮。

(5)向离心管中加入250μL solution II，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(6)向离心管中加入350μL溶液solution III，立即快速的上下颠倒混匀，此时将出现絮状沉淀。静置2min后，12,000rpm离心5min。

(7)将上一步收集的上清液转移到处理过的吸附柱(吸附柱放入收集管中)。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(8)向吸附柱中加入500μL buffer WB2，12,000rpm离心45s，倒掉收集管中的废液。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)弃掉滤液，将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(11)将吸附柱置于一个干净的1.5mL离心管中，挥干乙醇后，向吸附膜的中间部分悬空滴加30μL蒸馏水，室温放置5min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

2.2扩增ScCGT1 ORF

以构建的阳性单克隆质粒为模板，用带酶切位点的引物对ScCGT1-BamH I-F/ScCGT1-Hind III-R和2X Ape x HF FS PCR Master Mix高保真酶扩增目的基因ScCGT1的ORF。

ScCGT1-BamH I-F:CGGGATCCATGGCGTCCTGCGACACTG；(SEQ ID No.5)

ScCGT1-Hind III-R:CCCAAGCTTTCAGAGATGGCCAAAAAGT；(SEQ ID No.6)

以ScCGT1-pTOPO质粒为模板，用上述引物扩增其ORF，扩增程序为：

①94℃，3min；

②94℃，30s；

③56℃，30s；

④72℃，1min；

⑤Go to②，30cycles；

⑥72℃，10min。

PCR产物经凝胶电泳分离后，按胶回收试剂盒进行胶回收(结果见图1B)。

2.3酶切

载体pET32a及胶回收片段分别用BamH I与Hind III进行酶切，酶切体系如下：

37℃，3h。反应结束后加入2μL 10×Loading buffer，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离并切下目的条带进行胶回收，方法同上。

2.4连接、转化及阳性验证

用DNA Ligation Kit AG11801试剂盒连接目的片段与载体：

上述各组分混合均匀后，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，将单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的阳性单克隆存菌并提取质粒。

2.5 ScCGT1蛋白表达

2.5.1原核表达

(1)将空载体pET32A和构建好的ScCGT1-pET32a分别转入表达型大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆。

(2)挑取阳性单克隆接种于4mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。

(3)取菌液按照1:200的比例接种到400mL含氨苄抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.4-0.6，加入1M的IPTG使其终浓度为0.5mM。

(4)16℃，110rpm继续培养18h诱导蛋白表达。

2.5.2蛋白的分离纯化

(1)将菌液分几次加入到50mL离心管中，5,000rpm离心5min后弃上清，收集菌体。

(2)将收集的菌体用适量缓冲液(Binding buffer)重悬，5,000rpm离心5min，弃上清。洗涤两次。

(3)按5-10mL Binding buffer/g菌体的比例加入缓冲液。

(4)将菌液置于冰水混合物中，超声破碎菌体。

(5)4℃，12,000rpm离心30min。收集上清液转移至新的离心管中，然后过镍柱纯化，留20μL上清液和沉淀样品备电泳。

(6)向镍柱中加入蛋白上清液，然后用10mL含10mM咪唑的Binding buffer洗脱杂蛋白，最后用5mL咪唑浓度为250mM Elution buffer洗脱目的蛋白，收集馏分。

(7)将收集的蛋白液置于提前预冷的超滤管中，3,500g离心10min，用移液枪轻轻吹打混匀。使总蛋白液浓缩至1mL左右时，加入4mL Binding buffer重复以上述步骤，连续两次。最后，用移液枪轻轻吹打混匀，吸取浓缩液，测定蛋白浓度，并留样电泳。

(8)浓缩后的蛋白立即使用或者加入适量80％甘油保存，并将蛋白分装成50μL/管保存。

Binding buffer：称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl加水充分溶解，调pH8.0，定容至1L，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇混匀，4℃保存。

Elution buffer：称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl、34g imidazole，加水溶解，调pH8.0，定容至1L，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇，4℃保存。

2.5.3蛋白的浓度测定

采用碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。

(1)蛋白标准品BSA(5mg/mL)完全溶解后，取10μL用0.9％NaCl稀释10倍，使其终浓度为0.5mg/mL作为标准品。

(2)标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL分别加到96孔板中，加0.9％NaCl补齐到20μL。各做三个平行。

(3)用0.9％NaCl稀释留取的蛋白样品，同样加至20μL。

(4)各孔加入200μL G250染色液，室温放置3-5min。

(5)用酶标仪测定595nm处的吸光值(A595)，根据标准品蛋白浓度和对应的吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

2.5.4蛋白SDS-PAGE电泳

目的蛋白的表达及分离纯化用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium DodecylSulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)进行检测。观察结果，蛋白电泳结果如图2。

SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配制溶液及比例如下：

2.6体外酶活

测定ScCGT1的体外酶活功能，以加入pET32a蛋白的反应体系为阴性对照组。分别以根皮素、2-羟基柚皮素和2-羟基圣草酚为底物。反应体系(100μL)如下：

将各组分混匀，30℃反应1h，反应结束后加入100μL甲醇或者用1M HCl终止反应，13,000rpm离心10min后，采用HPLC进行酶活反应分析(实验结果如图3～5)。

HPLC分析采用反向色谱柱XDB-C18(5μm，4.6×150mm)。当底物为根皮素时，HPLC液相分析条件为：A相，含0.1％甲酸的水；B相，甲醇；流速为1mL/min，进样体积为20μL。流动相如下：

当底物为2-羟基柚皮素或者2-羟基圣草酚，用甲醇终止反应时，HPLC液相分析条件为：A相，含0.1％甲酸的水；B相，甲醇；流速为0.8mL/min，进样体积为20μL。流动相如下：

当底物为2-羟基柚皮素或者2-羟基圣草酚，用HCl终止反应时，HPLC液相分析条件为：A相，含0.1％甲酸的水；B相，甲醇；流速为0.8mL/min，进样体积为20μL。流动相如下：

LC-MS用于酶活产物鉴定。分析方法和分析柱同上。

2.7糖供体选择性分析

测定ScCGT1对不同糖供体的选择性时，以根皮素为糖受体，分别以UDP-galactose、UDP-glucuronic acid和UDP-glucose为糖供体进行分析。酶活反应体系和液相分析条件如上所述(结果见图6)。

2.8酶学动力学参数测定

Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中，30℃反应，进行ScCGT1的酶学动力学分析将底物浓度分别设为5、10、20、50、75、100、150、200、300μM。反应在蛋白加入时开始计时，反应15min，加等体积甲醇终止反应，平行实验3次，实验结果见表1。

表1 ScCGT1动力学参数

Note:Phl,phloretin；2-OHNA,2-hydroxynaringenin.

实施例3.定点突变ScCGT1以筛选出更高催化活性的突变体。

以来自甘草(Glycyrrhiza glabra)中的GgCGT(6L5P)的晶体结构作为模板，利用http://swissmodel.expasy.org/interactivew网站对ScCGT1进行同源模拟，并将ScCGT1与GgCGT进行结构比较(图7)。使用Schrodinger Suites软件对ScCGT1的蛋白和UDP-glucose及根皮素进行分子对接。

选择可能影响蛋白活性的关键氨基酸进行定点突变：H26A、L143T、P164T、L301G、D141I/P142D和S108D/H109P/V110F/L111F(命名为4M)。根据突变位点，在网站Primer X(http://www.bioinformatics.org/primerx/)上设计突变引物：

ScGT1-H26A-F：AGGGCGCCATTCAGCCTTTC(SEQ ID No.7)

ScGT1-H26A-R：GAAAGGCTGAATGGCGCCCT(SEQ ID No.8)

ScGT1-L143T-F：TCGACCCTACAGTAACTGTC(SEQ ID No.9)

ScGT1-L143T-R：GACAGTTACTGTAGGGTCGA(SEQ ID No.10)

ScGT1-P164T-F：ATCTTCTTCACCGCATCTGC(SEQ ID No.11)

ScGT1-P164T-R：GCAGATGCGGTGAAGAAGAT(SEQ ID No.12)

ScGT1-L301G-F：CTTTGGGAGTGGCGCCACCT(SEQ ID No.13)

ScGT1-L301G-R：AGGTGGCGCCACTCCCAAAG(SEQ ID No.14)

ScGT1-D141I/P142D-F：CTTGATCCTCATAGATTTAG(SEQ ID No.15)

ScGT1-D141I/P142D-R：CTAAATCTATGAGGATCAAG(SEQ ID No.16)

ScGT1-4M-F：GACCCTTTCTTCCTCAGCAAGAC(SEQ ID No.17)

ScGT1-4M-R：GAAGAAAGGGTCCTTCTCAATA(SEQ ID No.18)

按照Stratagene QuikChange定点突变的方法，以ScCGT1-pET32a质粒为模板，扩增得到目的条带切胶后按照上述方法进行胶回收；使用DpnI消化酶解后，产物转入大肠杆菌DH5α中，随机挑取单克隆5个进行阳性鉴定，阳性克隆测序成功后，按上述方法转化入大肠杆菌BL21中诱导并纯化出目的蛋白，以UDP-glucose为糖供体，分别以根皮素和2-羟基柚皮素为底物进行酶活分析(结果如图7B)。

通过定点突变找到了一个关键氨基酸位点P164T，突变体ScCGT1-P164T对根皮素和2-羟基柚皮素的催化活性显著提高。通过ScCGT1和ScCGT1-P164T的分子对接模型对比可以观察到，糖供体C-1位置和受体的C-3’更加靠近，有利于糖基化反应的进行(结果如图7C)。

实施例4.ScCGT1生物合成碳苷类化合物

4.1利用大肠杆菌ScCGT1-pET32a-BL21(W1)和ScCGT1-P164T-pET32a-BL21(W2)生产化合物nothofagin。

为了研究底物浓度以及体内饲喂培养时间对糖苷产物的影响，我们以根皮素为底物对重组菌株W1进行体内饲喂实验，具体实验操作如下：

(1)活化菌株：采用划线法将菌液在含氨苄抗性的固体培养基中活化，挑取单克隆接种至2mL LB液体培养基中，37℃培养箱震荡培养6h；

(2)按照1:100的比例接种到10mL的抗性LB培养基中，37℃，110rpm培养至OD600约0.6-0.8，加IPTG使其终浓度为0.5mM，16℃恒温培养6h；

(3)向菌液中加入根皮素，设定底物浓度梯度为50、100和150μM，放入16℃继续培养一段时间；

(4)分别取饲喂12h、18h、24h和36h样品，600μL/管，加入等体积的正丁醇萃取2次，合并有机相，吹干样品，加入100μL 80％甲醇重溶，用HPLC分析产物。底物浓度及饲喂时间对糖苷产物的影响结果如图8；表2。

结果表明，从经济角度考虑，能够达到最大转化率糖苷产物的最佳底物浓度是100μM。因此，在100μM的底物浓度下，按照上述操作方法对重组菌株W1和W2进行饲喂实验，实验结果如图8；表2。

4.2构建大肠杆菌共表达载体

本发明提供的一个小蛇苔黄酮合酶和黄烷酮2-羟化双功能酶CjFNS I/F2H，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.19所示。根据pETDuet载体和目的基因ScCGT1和CjFNS I/F2H设计引物如下：

ScCGT1-D-BglII-F：GAAGATCTATGGCGTCCTGCGACACTGG(SEQ ID No.20)(同ScCGT1-P164T-D-BglII-F引物)

ScCGT1-D-KpnI-R：GGGGTACCTCAGAGATGGCCAAAAAGT(SEQ ID No.21)(同ScCGT1-P164T-D-KpnI-R引物)

CjFNS I/F2H-BamHI-F：CGGGATCCATGGCTCCACCCGGTGTTAC(SEQ ID No.22)

CjFNS I/F2H-HindIII-R：CCCAAGCTTCTATTCGGTGGCTCCTTCA(SEQ ID No.23)

以CjFNS I/F2H-pET32a为模板，CjFNS I/F2H-BamHI-F/CjFNS I/CjF2H-HindIII-R为引物，PCR扩增目的片段，具体操作步骤见1.2.3。

PCR产物电泳并回收，载体pETDuet及回收的片段用BamHI与HindIII进行酶切，酶切体系如下：

37℃酶切反应3h。具体操作步骤见2.3。连接目的片段与载体,具体操作步骤见2.4。

上述各组分混合均匀后，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，将单克隆验证阳性并送测序，测序正确后存菌并提取质粒CjFNS I/F2H-pETDuet。

以ScCGT1-pET32a质粒为模板，ScCGT1-D-BglII-F/ScCGT1-D-KpnI-R为引物，按上述方法PCR扩增目的片段，并用限制性内切酶BglII和KpnI分别酶切ScCGT1片段和重组质粒CjFNS I/F2H-pETDuet，将酶切片段连接到载体多克隆位点II，16℃过夜连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。验证阳性、测序成功后摇菌提取质粒CjFNS I/F2H-ScCGT1-pETDuet。并将此质粒转入大肠杆菌BL21中，命名为EA1；按照相同的方法构建质粒CjFNS I/F2H-ScCGT1-P164T-pETDuet，将含此质粒的BL21菌株命名为EA2。

为了研究底物浓度及饲喂反应时间对牡荆素和异牡荆素产量的影响，以柚皮素为底物对重组菌株EA1进行饲喂实验，底物浓度梯度设为50、100和150μM，具体操作参考4.1。HPLC分析黄酮碳苷的含量，液相分析方法同2.6，液相分析结果如图9。

通过饲喂条件的优化，发现最佳底物浓度为100μM。用该方法以100μM的柚皮素分别饲喂重组菌株EA1和EA2，HPLC/LC-MS分析产生的碳苷产物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乌蕨C-糖基转移酶，其特征是，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述乌蕨C-糖基转移酶的编码基因，所述编码基因能够编码上述乌蕨C-糖基转移酶。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征是，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

4.一种含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征是，所述重组表达载体为由上述编码基因与pET32a构建获得。

6.一种含有权利要求2所述编码基因的重组细胞，其特征是，所述重组细胞为重组细菌。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征是，所述重组细胞为大肠杆菌。

8.一种权利要求1所述的乌蕨C-糖基转移酶在催化制备黄酮碳苷类化合物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征是，乌蕨C-糖基转移酶催化根皮素制备nothofagin。

10.如权利要求8所述的应用，其特征是，乌蕨C-糖基转移酶催化2-羟基柚皮素制备牡荆素和/或异牡荆素。