CN114717248A - 仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚中的应用，所述仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为原料，在仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的催化下，生成苔黑酚，对于仙茅苔黑酚葡萄糖苷的生物合成调控研究具有重要意义。

Description

仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚的应用。

背景技术

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)为石蒜科多年生草本植物，苔黑酚葡萄糖苷是经仙茅根茎提取而来的一种有效酚苷类成分，含量为0.1795％～0.6239％，目前研究显示苔黑酚葡萄糖苷具有抗氧化、抗骨质疏松、抗抑郁、抗焦虑及免疫调节多种药理学活性。作为一种天然产物，苔黑酚大多数情况下是从中药仙茅中直接提取分离得到，然而该成分在药材中含量极少、提取分离工艺复杂、成本较高，摘自王波等，苔黑酚的合成，宁夏医科大学学报，20201030。

苔黑酚葡萄糖苷的生物合成前体为苔黑酚，苔黑酚C3或C5位上的羟基在糖基转移酶的催化下，进行一次糖基化生成苔黑酚葡萄糖苷，而苔黑酚则以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为前体物质缩合而成。

对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，要研究这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。目前尚无仙茅来源的苔黑酚合酶的相关报道，因此，生物合成前体苔黑酚对于苔黑酚葡萄糖苷生物合成调控研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚中的应用，所述仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1可作为苔黑酚的生物合成调控基因。

本发明第一方面，提供了一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1，其核苷酸序列为SEQID NO:1所示，序列全长1170bp。该基因具有催化1分子乙酰辅酶A 和3分子丙二酰辅酶A合成苔黑酚的活性。

本发明第二方面，提供一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1编码的蛋白质，编码了358个氨基酸残基。其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。该基因具有催化1分子乙酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A合成苔黑酚的活性。

本发明第三方面，还提供了一种含有所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1 的重组质粒。

作为优选，所述的重组质粒，通过将所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1 与pQE-80L载体同源重组获得，命名为pQE-80L-CoORS1。

本发明第四方面，提供一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有上述重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1。

作为优选，所述转基因工程菌为大肠杆菌M15菌株。

本发明第五方面，本发明还提供了所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1在制备苔黑酚中的应用。

作为优选，所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1在制备苔黑酚的应用中，以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为原料，在由上述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1 编码的蛋白质催化下生成苔黑酚，氨基酸系列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1，是从仙茅的根状茎中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的，采用RNA 试剂后提取仙茅根状茎的RNA，并反转录成cDNA后进行PCR扩增获得。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:

(1)测序技术的快速发展，极大地推进了苔黑酚生物合成路径关键酶基因的挖掘，本发明中苔黑酚的生物合成调控基因即仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1是首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产苔黑酚的新方法。本发明通过异源表达与体外酶催化的方式来获得目标产物，进行定向生产，具有方便，快捷等优点。

(2)本发明提供了含有仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成苔黑酚，进一步为苔黑酚葡萄糖苷生物合成调控研究奠定基础，还可减少化学合成困难，合成路径复杂等问题。所述仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1作为苔黑酚葡萄糖苷生物合成的关键基因，还可用仙茅等植物育种研究。

(3)本发明从仙茅中分离并鉴定的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1，可作为仙茅的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产苔黑酚的重要候选基因。

附图说明

图1为苔黑酚生物合成路径示意图。

图2为仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1片段琼脂糖凝胶电泳图谱示意图；其中，M为核酸Marker；泳道1、2为仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1片段检测结果。

图3为重组质粒pQE-80L-CoORS1的图谱示意图。

图4为仙茅苔黑酚合酶CoORS1的SDS-PAGE蛋白电泳检测图；其中，M 为蛋白质分子质量标准；泳道1为浓缩前200mM咪唑洗脱液下的蛋白；泳道2 为浓缩后200mM咪唑洗脱液下蛋白。

图5为仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1酶活反应的HPLC图谱示意图。

图6为标准品苔黑酚的质谱分析MS图谱示意图；理论分子量123。

图7为实验组反应产物的质谱分析MS图谱示意图；理论分子量123。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

基于仙茅转录组Unigene基本功能注释信息，根据测序注释结果进行筛选 ORS候选基因，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，初步筛选出4个可能的候选基因。对候选基因经过克隆、同源重组、原核表达、体外酶促反应、高效液相检测及LC/MC鉴定等一系列工作后，最终鉴定出可以催化底物乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成苔黑酚的目标基因，命名为仙茅苔黑酚合酶CoORS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

阶段操作步骤如下，以下实施所用试剂、原料、仪器设备等均为市售:

(1)cDNA模板的制备

以仙茅根茎为材料，取鲜样，液氮速冻后，进行总RNA提取。RNA提取采用Magen，广州美基生物科技有限公司的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒，按试剂盒的操作步骤提取获得RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，根据其说明书，将RNA反转录成cDNA，-80℃保存备用。

(2)目的基因克隆

利用引物设计软件CE Design v1.04，设计扩增仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1 的引物ORS1-F和ORS1-R。以cDNA为模板，按高保真KOD酶使用说明书操作，用引物对ORS1-F/ORS1-R扩增仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1片段。采用高保真KOD酶进行仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1克隆，PCR程序为:94℃、5min， 94℃、30S，58℃、50S，72℃、90s，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，进行跑胶验证，如图2所示，确认扩增成功后采用EasyPure Quick GelExtraction Kit试剂盒进行目的条带回收进行。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。

引物序列如下:

ORS1-F:TCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGGGTTCGCTGGGC GATGTGA

ORS1-R:ACTGTTGTGCTTCGCTGCCCTTAAGGGTCGACCTGCAGCCAA GCTTA

(3)重组质粒载体构建

采用BamHI和SalI酶对大肠杆菌pQE-80L进行双酶切得到线性化载体，使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒回收线性化载体。同源重组时，按照同源重组酶的操作说明进行组装，根据插入片段和载体的浓度计算各组分用量，最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中，将苔黑酚合酶基因CoORS1与 pQE-80L载体同源重组获得重组质粒，将重组表达质粒转化到宿主菌株E.coli M15感受态细胞。组装完毕后，进行涂板，所用平板为添加了含100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养箱内暗培养12-15h。之后挑选平板上的单菌落，进行菌落PCR扩增、跑胶等，检测为阳性克隆后，送测序公司检测，作进一步最终确认。组装成功后进行保菌，得到仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组表达载体，命名为pQE-80L-CoORS1，如图3。

表1候选基因重组反应体系

其中X＝(0.02×pQE-80L碱基对数)ng/线化化pQE-80L浓度ng/μL；Y＝(0.02×pQE-80L碱基对数)ng/仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1回收浓度ng/μL；

(4)蛋白表达及纯化

经蛋白表达小试后确定仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的蛋白诱导条件为:16℃、0.1mM的IPTG、210rpm，诱导14h。再对重组表达菌株进行大摇，待 OD值在0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，混匀后在16℃摇床中进行培养，210rpm，诱导14h，之后在4℃条件下，5000rpm离心15min收菌。采用Tris-HCl缓冲液，PH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl，缓冲液对离心后菌体进行充分重悬，重悬结束后采用细胞破碎仪进行破碎；对破碎菌液在4℃条件下进行8000rpm离心30min，取上清；采用镍柱Ni NTA beads，对上清进行纯化，先利用两个柱体积的Tris-HCl，pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl，对镍柱进行一个平衡，再依次用分别含有20mM，40mM，60mM，80mM，100mM咪唑的 Tris-HCl缓冲液，pH:8.0，50mM Tris，200mMNaCl，洗去杂蛋白，之后用含有 200mM咪唑的Tris-HCl，pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl，洗脱得到目标蛋白，纯化结束后采用Millipore超滤管进行浓缩，得到纯酶，如图4。

(5)酶活性验证

仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的酶活性是通过发生聚酮反应合成苔黑酚确定的，在1.5mL离心管中进行，反应体系总体积为100μL。实验组:反应体系中混合物包含:1mM乙酰辅酶A、3mM丙二酰辅酶A、10μg纯化的仙茅苔黑酚合酶CoORS1蛋白，加入Tris-HCl缓冲液，pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl，至总体积100μL，在30℃下孵育2h后，等体积色谱甲醇终止反应，12000rpm离心 2min取上清。最后通过HPLC和LC-MS分析，进行反应产物检测。

对照组CK反应体系:1mM乙酰辅酶A、3mM丙二酰辅酶A、10μg灭活后纯化的仙茅苔黑酚合酶CoORS1蛋白，加入Tris-HCl缓冲液，pH:8.0，50mM Tris，200mM NaCl，至总体积100μL。

苔黑酚标准品:10mM苔黑酚标准品50μL。

(6)产物检测

对产物分别进行HPLC、LC/MS检测。

HPLC检测方法如下:

液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱子250×4.6mm，5.0μm。流动相为:0.1％甲酸水A和乙腈B。梯度洗脱程序如下:0～7min，7％B；17min，17％B； 20min，95％B；25min，7％B；30min，7％B。波长:275nm。流速1mL/min。柱温30℃。样品进样量10μL。高效液相检测结果见图5，表明实验组样品在仙茅苔黑酚合酶CoORS1的催化下有苔黑酚的产生。

LC/MS检测方法如下:

为了进一步确认所得到的产物为苔黑酚，采用Agilent Q-TOF 6540液相色谱质谱联用仪LC/MS进行检测，检测方法如下:

质谱条件:离子源采用的是负离子模式，电压:3500V；碎裂电压:175V；锥孔电压:65V；射频电压:750V；扫描范围:50-1700m/z。

液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱子250×4.6mm，5.0μm。流动相为:0.1％甲酸水A和乙腈B。梯度洗脱程序如下:0～7min，7％B；17min，17％B； 20min，95％B；25min，7％B；30min，7％B。波长:275nm。流速1mL/min。柱温30℃。样品进样量10μL。由检测结果图，如图5-6，可以看出，产物的特征碎离子均与标准品苔黑酚相吻合，确认反应产物为苔黑酚。最终得出仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1具有催化生成苔黑酚的能力。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1及在制备苔黑酚中的应用

<130> 20220412

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）

<400> 1

atgggctctc tgggtgatgt cattccgcga caggagaagg ctgccggtat ggctgccgta 60

ttaggaatcg gtactgccac ccctccctat gtggtcgagc agtcgagttt ccccgactac 120

tactttcggg ttaccaatag cgagcacatg tctgagctta agcacaagtt catcagactg 180

tgtgacaagt ccaagatccg aaagcgtcat atgtgcctga cggaacagat gctggctgaa 240

aaccccagca tggccgccta cagagctcct tccttggacg cacggcaaga gctgctcgac 300

gttgaggtcc cccgactcgg tgctgaggct gcagaaaagg ccattgccga ctggggccgt 360

cccaagagcg atctcacaca tctgattttc tgctcctcag gaggcgcctc tatgcctggt 420

gccgattacg acctcatcaa gctgctggat ttgccgctat caatccgtcg attcatgctc 480

taccagcagg gctgtttcgg tggcggcaca gtcctgcgac tcgcgaagga cctggcggag 540

aacaactatg gagctcgaat actggtcatc tgctgtgagg tgacctccat cggattccga 600

ggtccctgcg aagaccacat tgagaatctg gtgggacaag ctctgtttgg agatggtgct 660

tcggccgtcg tggtgggggc tgaccccgtg gccgcagctg cagagcgacc tctatttgag 720

atcgtttctg cgagtcagaa cattcttcct ggctcagatg gagccattgt cgggaaactt 780

cgggaggtgg gtctcatgtt ttccctccag cccgagattc cccagcacgt gtcgagatct 840

gtcgaaaaac ttgtgggtga agccctgcgg ccagttggta tcaccgactg gaacgacgcc 900

ttctgggttg tccatccagg aggacgcgcc attgtcgatg aggttggcaa gaagctcggc 960

ttgagggacg agaaacttgc tgccactcgc gaagttttgt ctgagtacgg aaacatgtgg 1020

tccgcgtgcg ttctttttgt gatggaagtc atgcgacgac gctcggagga gagaggcatg 1080

gagacggccg gcgagggcct ccagtgggga gtgctgttcg gctttggccc tggactcacc 1140

gctgaaactg tggtgcttcg atgtccttga 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）

<400> 2

Met Gly Ser Leu Gly Asp Val Ile Pro Arg Gln Glu Lys Ala Ala Gly

1 5 10 15

Met Ala Ala Val Leu Gly Ile Gly Thr Ala Thr Pro Pro Tyr Val Val

20 25 30

Glu Gln Ser Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu

35 40 45

His Met Ser Glu Leu Lys His Lys Phe Ile Arg Leu Cys Asp Lys Ser

50 55 60

Lys Ile Arg Lys Arg His Met Cys Leu Thr Glu Gln Met Leu Ala Glu

65 70 75 80

Asn Pro Ser Met Ala Ala Tyr Arg Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln

85 90 95

Glu Leu Leu Asp Val Glu Val Pro Arg Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu

100 105 110

Lys Ala Ile Ala Asp Trp Gly Arg Pro Lys Ser Asp Leu Thr His Leu

115 120 125

Ile Phe Cys Ser Ser Gly Gly Ala Ser Met Pro Gly Ala Asp Tyr Asp

130 135 140

Leu Ile Lys Leu Leu Asp Leu Pro Leu Ser Ile Arg Arg Phe Met Leu

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Gly Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys

165 170 175

Asp Leu Ala Glu Asn Asn Tyr Gly Ala Arg Ile Leu Val Ile Cys Cys

180 185 190

Glu Val Thr Ser Ile Gly Phe Arg Gly Pro Cys Glu Asp His Ile Glu

195 200 205

Asn Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ser Ala Val Val

210 215 220

Val Gly Ala Asp Pro Val Ala Ala Ala Ala Glu Arg Pro Leu Phe Glu

225 230 235 240

Ile Val Ser Ala Ser Gln Asn Ile Leu Pro Gly Ser Asp Gly Ala Ile

245 250 255

Val Gly Lys Leu Arg Glu Val Gly Leu Met Phe Ser Leu Gln Pro Glu

260 265 270

Ile Pro Gln His Val Ser Arg Ser Val Glu Lys Leu Val Gly Glu Ala

275 280 285

Leu Arg Pro Val Gly Ile Thr Asp Trp Asn Asp Ala Phe Trp Val Val

290 295 300

His Pro Gly Gly Arg Ala Ile Val Asp Glu Val Gly Lys Lys Leu Gly

305 310 315 320

Leu Arg Asp Glu Lys Leu Ala Ala Thr Arg Glu Val Leu Ser Glu Tyr

325 330 335

Gly Asn Met Trp Ser Ala Cys Val Leu Phe Val Met Glu Val Met Arg

340 345 350

Arg Arg Ser Glu Glu Arg Gly Met Glu Thr Ala Gly Glu Gly Leu Gln

355 360 365

Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ala Glu Thr Val

370 375 380

Val Leu Arg Cys Pro

385

Claims (9)

1.一种仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1，其特征在于，该基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1编码的蛋白质，其特征在于，该编码蛋白为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有所述的基因。

4.根据权利要求3所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒通过仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1与pQE-80L载体同源重组获得，命名为pQE-80L-CoORS1。

5.一种根据权利要求3或4所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒制备的转基因工程菌，其特征在于，转基因工程菌含有权利要求3或4所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒制备的转基因工程菌，其特征在于，基因组中整合有外源的权利要求1所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1。

7.如权利要求5所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1的重组质粒制备的转基因工程菌，其特征在于，转基因工程菌为大肠杆菌M15菌株。

8.根据权利要求2所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1编码的蛋白质的应用，其特征在于，该编码蛋白在制备苔黑酚中的用途。

9.根据权利要求8所述的仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1编码的蛋白质的应用，其特征在于，以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为原料，在仙茅苔黑酚合酶基因CoORS1编码的蛋白质催化下，生成苔黑酚。

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