CN118272337A - 三个udp-糖基转移酶及其在合成齐墩果酸糖苷化合物中的应用 - Google Patents
三个udp-糖基转移酶及其在合成齐墩果酸糖苷化合物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
发明“三个UDP‑糖基转移酶及其在合成齐墩果酸糖苷化合物中的应用”属于生物工程与技术领域。本发明提供一种UDP‑糖基转移酶，涉及三个来源于油橄榄的UDP‑糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535，实现在齐墩果酸C28‑COOH特异性修饰一分子糖基生成28‑氧‑葡萄糖‑齐墩果酸；提供了一株工程化酿酒酵母菌株，以酿酒酵母为宿主，异源表达来源于甘草的β‑香树脂醇合酶(GgbAS)、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶(CYP716A12)、来源于迷迭香的还原酶(RoCPR)及来源于油橄榄的UDP‑糖基转移酶(Oe440)实现了利用微生物从头合成28‑氧‑葡萄糖‑齐墩果酸。本发明通过设计和创建微生物细胞工厂，发酵生产28‑氧‑葡萄糖‑齐墩果酸，既能有效控制原料供给，又能保护自然资源及环境，是一种绿色高效的新型生产模式。
Description
技术领域
本发明涉及来源于油橄榄的三个UDP-糖基转移酶及其基因序列，同时涉及一个UDP-糖基转移酶在酿酒酵母中合成齐墩果酸葡萄糖苷化合物的方法，属于生物工程与技术领域。
背景技术
齐墩果酸(OA)是一种典型的齐墩果烷型五环三萜化合物，具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化、抑制癌症、治疗肿瘤、治疗心血管疾病、治疗急慢性肝炎等。但在实际临床应用过程中，OA制剂种类单一、水溶性差、生物活性并未得到充分的开发利用，导致OA的应用受到极大限制。在OA C28-COOH引入1分子葡萄糖，得到28-氧-葡萄糖-齐墩果酸(OAFG)。28-氧-葡萄糖-齐墩果酸不仅增加水溶性、提高生物利用度，其抗癌、降糖等效果也更加显著。然而，目前主要通过植物提取获得28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，需要大量的有机溶剂萃取、反复纯化、过程复杂，不利于绿色发展。
利用生物法合成糖苷化合物可以解决以上问题，通过UDP-糖基转移酶实现底物特异性糖基修饰，其反应条件温和、过程简单、产物单一、纯化简单、环境友好，符合国家“双碳”战略。糖基化反应通常由UDP-糖基转移酶催化，以UDP-糖为糖基供体，常见的包括UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha)、UDP-阿拉伯糖(UDP-Ara)、UDP-木糖(UDP-Xyl)等；相对于UDP-糖基供体类型，糖基受体的种类繁多，包括单萜、倍半萜、二萜、四环三萜、五环三萜等多种类型化合物。目前已报道的UDP-糖基转移酶主要催化OA生成3-氧-葡萄糖-齐墩果酸。还未见报道特异性催化OAC28-COOH葡萄糖修饰的UDP-糖基转移酶。
同时，随着合成生物学的发展，设计和创建人工合成细胞发酵生产植物天然产物，既能有效控制原料供给，又能保护自然资源及环境，作为一种绿色高效的新型生产模式已被科学界及工业界认可。以酿酒酵母为底盘细胞，通过异源表达β-香树脂醇合酶、P450氧化酶和还原酶已经实现齐墩果酸的异源合成，目前尚无28-氧-葡萄糖-齐墩果酸从头合成的报道。为此，本发明挖掘UDP-糖基转移酶实现OA C28-COOH的特异性单葡萄糖基修饰，将编码该酶的基因导入到合成OA的酿酒酵母工程细胞中，实现28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的合成。
发明内容
基于本领域存在的上述不足，本发明提供了三个油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535，首次实现OA C28-COOH葡萄糖修饰；同时提供了一个工程化酿酒酵母菌株，使用遗传背景清晰、绝对生物安全并且生长周期短的酿酒酵母为宿主，异源表达β-香树脂醇合酶、P450氧化酶和还原酶，及UDP-糖基转移酶实现了利用微生物从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
本发明的技术方案如下：
1.一种UDP-糖基转移酶Oe440，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种UDP-糖基转移酶Oe139，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种UDP-糖基转移酶Oe535，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的一种UDP-糖基转移酶Oe440，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求2所述的一种UDP-糖基转移酶Oe139，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求3所述的一种UDP-糖基转移酶Oe535，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.6所示。
7.一种合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的生物法，其特征在于，采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示或基因序列如SEQ ID NO.4-6所示的UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535对底物进行催化反应。
8.根据权利要求7所述的一种合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的方法，其特征在于，所述催化反应的体系包括：25μM齐墩果酸、1mM UDP-葡萄糖、0.2μg/μL UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535，其余为PBS缓冲液；
优选地，所述催化反应条件为35℃，2h。
9.一个工程化酿酒酵母从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，其特征在于，以人工合成V号染色体酵母菌株(SynV)为底盘宿主，异源表达来源于甘草的β-香树脂醇合酶(GgbAS)、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶(CYP716A12)及来源于迷迭香的还原酶(RoCPR)，实现齐墩果酸的从头合成。在此基础上，异源表达来源于油橄榄的UDP-糖基转移酶(Oe440)，实现从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
第一方面，本发明提供一种油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe440，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所述；一种油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe139，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所述；一种油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe535，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所述；一种编码油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe440基因，它是序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列；一种编码油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe139基因，它是序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列；一种编码油橄榄来源的UDP-糖基转移酶Oe535基因，它是序列表中SEQ ID No.6所述的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一个工程化酿酒酵母菌株，使用遗传背景清晰、绝对生物安全并且生长周期短的酿酒酵母为宿主，异源表达来源于甘草的β-香树脂醇合酶(GgbAS)、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶(CYP716A12)及来源于迷迭香的还原酶(RoCPR)，实现齐墩果酸的胞内合成(结构式如式一所示)，再异源表达来源于油橄榄的UDP-糖基转移酶(Oe440)实现了利用微生物从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸(结构式如式二所示)。
本发明首次提供了一种UDP-糖基转移酶，还提供了三个UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535及其编码的蛋白质，催化齐墩果酸C28-COOH葡萄糖修饰生成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
本发明提供了一个酵母工程菌，异源表达来源于甘草的β-香树脂醇合酶(GgbAS)、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶(CYP716A12)及来源于迷迭香的还原酶(RoCPR)，来源于油橄榄的UDP-糖基转移酶(Oe440)合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。利用细胞工厂高效合成齐墩果酸糖苷化合物28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，通过设计和创建微生物细胞工厂，发酵生产28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，既能有效控制原料供给，又能保护自然资源及环境，是一种绿色高效的新型生产模式。
附图说明
图1为本发明实施例2中UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535基因的DNA琼脂糖凝胶电泳图。图1中M：DNA分子量标准(DNA Marker)；图1中1-3：Oe440、Oe139、Oe535。
图2为本发明实施例4中UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535催化齐墩果酸和UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例4中Oe440催化生成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸高效液相色谱质谱图
图4为本发明实施例5中制备的28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的碳谱
图5为本发明实施例5中制备的28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的氢谱
图6为工程化酵母1合成齐墩果酸的气相色谱检测图。
图7为工程化酵母2合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的液相色谱-质谱联用检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535基因序列的获得
根据油橄榄基因组数据库筛选，分析得到UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535序列，通过密码子优化，化学合成优化的UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535基因片段。UDP-糖基转移酶Oe440的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示；UDP-糖基转移酶Oe139的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因序列如SEQ ID NO.5所示；UDP-糖基转移酶Oe535的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例2：构建表达UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535的大肠杆菌工程菌
A.构建表达UDP-糖基转移酶Oe440的大肠杆菌工程菌
为了构建表达UDP-糖基转移酶Oe440的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe440，将由金唯智公司基因合成的pET28a-Oe440质粒，通过大肠转化化转法导入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂糖)平板上，37℃过夜培养。采用菌落PCR鉴定转化子。大肠单菌落可直接作为PCR模板，使用2×M5 Taq HiFi PCR Mix进行PCR验证，PCR反应体系如表1所示。
表1菌落PCR反应体系
2×M5 Taq HiFi PCR Mix反应程序如表2。退火温度根据上下游引物Tm值设置(Tm±5℃)。
表2菌落PCR反应程序
确定大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe440构建成功。
B.构建表达UDP-糖基转移酶Oe139的大肠杆菌工程菌
为了构建表达UDP-糖基转移酶Oe139的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe139，采用本实施例A中构建UDP-糖基转移酶Oe440的大肠杆菌工程菌相同的方法构建UDP-糖基转移酶Oe139的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe139。
C.构建表达UDP-糖基转移酶Oe535的大肠杆菌工程菌
为了构建表达UDP-糖基转移酶Oe535的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe535，采用本实施例A中构建UDP-糖基转移酶Oe440的大肠杆菌工程菌相同的方法构建UDP-糖基转移酶Oe535的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Oe535。
实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵及蛋白纯化
A.大肠杆菌基因工程菌的发酵
将构建成功的E.coli BL21接种到含有50μg/mL卡那青霉素的30mL LB液体培养基中(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)，37℃摇床过夜培养，按照体积分数1％的接种量，将种子液接种至新鲜400mL LB培养基中，37℃培养至OD600为0.8，加入终浓度是0.25mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃过夜诱导。8 000rpm，离心2min收集菌体，按照体积1：40加入50mM pH 7.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬菌体，在4℃，1 000bar条件下，利用低温超高压破碎仪破碎4次，12 000rpm，离心30min，收集上清，得到粗酶液。
B.UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535的纯化
用蛋白纯化系统AKTA purifier进行蛋白纯化。用5倍柱体积H2O清洗Ni2+柱，再用5倍柱体积蛋白纯化平衡液(50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、25mM咪唑、15mM NaCl，pH 7.4)平衡Ni2+柱，流速1.0mL/min，粗酶液流经Ni2+柱，用5倍柱体积含有75mM咪唑的洗脱液(50mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液、75mM咪唑、15mM NaCl，pH 7.4)清洗杂蛋白，用含有225mM咪唑的洗脱液(50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、225mM咪唑、15mM NaCl，pH 7.4)洗脱目标蛋白并收集到离心管，使用Nanodrop 2000c测定蛋白浓度，得到纯酶。50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配置参照赛默飞科技有限公司官网。
实施例4：UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139和Oe535催化齐墩果酸生成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸以齐墩果酸为受体底物，UDP-葡萄糖为糖供体，加入UDP-糖基转移酶Oe440，35℃反应2h，可实现齐墩果酸C30-COOH葡萄糖基修饰，合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
具体地，配制100μL反应体系：UDP-糖基转移酶Oe440/Oe139/Oe535(20μg)、UDP-葡萄糖(1mM)、齐墩果酸(25μM)以及PBS缓冲液(50mM，pH7.0)。置于35℃水浴反应2h，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心1min，将上清用0.22μm的有机滤膜过滤到液相小瓶中，用UHPLC进行分析，分析条件：使用岛津的Shim-pack GTST-HP C-18反相色谱柱，粒径3μm，2.1×150mm。检测波长203nm，柱温箱40℃，流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水溶液，具体流动比例为：0-0.3min 70％ B，1.3min 50％ B，3-3.3min 40％ B，4.3min 30％ B，7-7.3min15％ B，8min 10％ B，9min 5％ B，9.3min 70％ B。流速0.4mL/min，进样量为5μL。
实施例5：28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的制备及结构表征
(1)按实施例3的操作流程获得UDP-糖基转移酶Oe440，加入100mg UDP-葡萄糖，1ml、0.05M的DMSO齐墩果酸，反应每隔1h取一次样，利用UHPLC检测，观察齐墩果酸的转化率，若即将被转化完可补加齐墩果酸，35℃水浴，磁力搅拌转速100rpm，反应10h.
(2)将反应产物5000rpm离心20分钟，用20ml甲醇重悬沉淀，并用0.22孔径有机滤膜过滤制成样品。
(3)用半制备液相分离纯化产物，方法如下：
流动相配比，A：乙腈；B：0.1％甲酸水溶液，流动相溶液均需经过0.22μm孔径滤膜过滤并超声波震荡脱气。流速为5mL/min，检测波长为203nm。液相色谱柱为岛津C18硅胶柱，20x250 mm。初始B组分比例为80％，第18min时B组分比例降至65％，第24min降至50％，第64min降至35％，第72min降至15％，第90min降至5％，第96min时B组分比例升至80％。取待测步骤1所得样品5mL，使用注射进样的方式，上样分离，对UV线中每个峰进行液体的收集，并用分析型高效液相色谱仪进行检测以判断糖基化衍生物对应的保留时间并判断纯度。收集完所有样品后，使用真空浓缩仪进行浓缩，并用冷冻干燥机干燥成粉末，放于4℃保存留用。
(4)将产物的粉末溶于氘代甲醇，使用Bruker Ascend 700M核磁共振波谱仪进行1H谱、13C谱，确定产物结构。
实施例6：合成齐墩果酸的酿酒酵母工程菌株构建
以人工合成V号染色体酵母菌株(SynV)为底盘宿主，异源表达来源于甘草的β-香树脂醇合酶(GgbAS)、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶(CYP716A12)及来源迷迭香于的还原酶(RoCPR)，构建工程酵母菌1，利用YPD培养基(10g/L酵母膏，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨)，对其进行培养7天，如图6所示，实现了利用工程化酵母1从头合成齐墩果酸。
实施例7：合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的酿酒酵母工程菌株构建
以实施例6中的工程化酵母1为基础，异源表达来源于油橄榄的UDP-糖基转移酶(Oe440)，构建工程化酵母2，利用YPD培养基对其进行培养7天，如图7所示，实现了利用工程化酵母2从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，首次利用酿酒酵母合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
Claims (9)
1.一种UDP-糖基转移酶Oe440，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种UDP-糖基转移酶Oe139，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种UDP-糖基转移酶Oe535，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的一种UDP-糖基转移酶Oe440，其特征在于，其基因序列如SEQID NO.4所示。
5.根据权利要求2所述的一种UDP-糖基转移酶Oe139，其特征在于，其基因序列如SEQID NO.5所示。
6.根据权利要求3所述的一种UDP-糖基转移酶Oe535，其特征在于，其基因序列如SEQID NO.6所示。
7.一种合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的生物法，其特征在于，采用氨基酸序列如SEQ IDNO.1-3所示或基因序列如SEQ ID NO.4-6所示的UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535对底物进行催化反应。
8.根据权利要求7所述的一种合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸的方法，其特征在于，所述催化反应的体系包括：25μM齐墩果酸、1mM UDP-葡萄糖、0.2μg/μL UDP-糖基转移酶Oe440、Oe139、Oe535，
其余为PBS缓冲液；
优选地，所述催化反应条件为35，℃2h。
9.一个工程化酿酒酵母从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸，其特征在于，以人工合成V号染色体酵母菌株SynV为底盘宿主，异源表达来源于甘草的β-香树脂醇合酶GgbAS、来源于蒺藜苜蓿的P450氧化酶CYP716A12及来源于迷迭香的还原酶RoCPR，实现齐墩果酸的从头合成，在此基础上，异源表达来源于油橄榄的UDP-糖基转移酶Oe440，实现从头合成28-氧-葡萄糖-齐墩果酸。
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