CN115161208B - 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种编码短链脱氢酶的基因能催化葫芦二烯醇生成葫芦素中间体cucurbita‑5‑24‑dien‑3‑one，该酶在葫芦二烯醇的C3位进行脱氢反应形成酮基，形成多数葫芦素的骨架，这极大地推动了对葫芦素生物合成分子机理的认知，也将为葫芦素的全合成奠定基础。目前来源于雪胆、南瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜等16种葫芦科植物的短链脱氢酶已经被成功克隆验证功能，并使用来源于雪胆的HcSDR1基因，采用酵母同源重组组装构建酿酒酵母底盘细胞生产目标化合物cucurbita‑5‑24‑dien‑3‑one。

Description

酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用。
背景技术
葫芦素(Cucurbitacin)是一种广泛分布于葫芦科多种植物中葫芦烷型四环三萜类化合物，药理活性研宄表明其葫芦素具有显著的抗炎、抗肿瘤作用。葫芦素已被报道具有良好的抗癌活性，其中葫芦素B、D和葫芦素E、I细胞毒性显著。通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的JAK-STAT信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。此外，各种葫芦素还具有显著的降血糖作用，例如来自苦瓜中的葫芦烷糖苷和苦瓜苷。雪胆属植物块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，具有清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。
合成生物学方法是生产药效单体的重要途径。近年来，运用合成生物学策略可实现植物天然产物单体异源重建和生产，越来越多的药用活性成分在在微生物细胞和植物中实现了生物合成，为药效单体的工业化生产提供了可能，如紫杉醇前体、青蒿素前体青蒿酸、人参皂苷及其前体。最近还报道了莨菪烷类生物碱在酵母中的全合成，烟草中几乎完整的秋水仙碱异源生物合成途径。异源合成天然产物的关键在于生物合成途径的完全解析，这将直接影响其是否能从头合成。葫芦素仅见前体葫芦二烯醇的异源高效合成的报道，至今尚无代谢工程生产葫芦素单体的报道，这主要是对其完整生物合成途径缺乏了解。
葫芦素可根据化学结构分为12类，即葫芦素A～T；而且其分布有明显的物种特异性，如葫芦素A仅分布于黄瓜属(Cucumis)植物中，葫芦素C则仅存在于黄瓜(Cucumissativus L.)中；同样地，葫芦素F特异地存在于雪胆属(Hemsleya)植物中。葫芦素种类众多，分布有物种特异性，同时除少数植物(如Citrullus colocynthis)积累高含量的少数种类葫芦素单体外，多数植物葫芦素含量均非常低。雪胆属植物中雪胆甲素(cucurbitacinIIa)和雪胆乙素(cucurbitacin IIb)含量都非常低，而且仅能在4年以上植株块茎中检测到，即便是含量最高的盘龙七(H.panlongqi)中二者的含量也仅分别为0.46mg/g和4.37mg/g。因此，通过合成生物学方法异源合成单体葫芦素无疑将是我们必然选择。
近年来，发现葫芦素羟化修饰的关键CYP是相关研究的热点之一。前人发现黄瓜7个CYP参与葫芦素生物合成，但仅3个的功能得到验证。其中，CYP88L2是C19羟化酶，CYP81Q58则催化C25位羟化和C-C双键的转移；多功能的CYP87D20则连续地催化Cuol的C11氧化和C20位羟化，接下来，CYP81Q59催化其C2位的β羟化(图1)。
综上所述，尽管催化葫芦素部分位点羟化(C-2，C-3，C-19，C-20β-OH，C-25)以及C-11酮基合成的分子机理和相关基因已经被阐明，但是仍然有以下关键问题尚未解决：(1)C-3酮基者或者C-3α羟基(葫芦素F)；(2)C-22酮基；(3)C-16α羟基。通常植物三萜的C-3位是由2,3-氧化鲨烯环化而来β-OH，但12类葫芦素中只有葫芦素C的C-3位为β-OH，其他均为酮基，少数特异为或删除α-OH，如葫芦素F和P，这是葫芦素区别于其他三萜化合物的典型特征之一。
负责C3位酮基化修饰催化酶基因没被挖掘鉴定出来，其中主要包括氧化还原酶，比如CYP450酶、短链脱氢酶等；同时，C-3位为酮基的葫芦素中间体也没有报道和生物合成。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用。
本发明的技术方案为：一种酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p、TEF1p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t、PGK1t控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9、synHcOSC6和synHcSDR基因的表达，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one(cucurbitadienone)生物合成途径的酿酒酵母工程菌。
优选地，每一种所述基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接的，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δDNA位点。
优选地，所述酵母基因组的提取方法包括以下步骤：取酿酒酵母BY4742菌斑于YPD培养基中培养，收集菌体清洗，重悬于酵母破壁液后，用TENTS缓冲液重悬，然后用酚/氯仿抽提，上清液中加入乙醇和醋酸钠溶液放置，离心，得沉淀；所述沉淀用乙醇洗涤，干燥，双蒸水溶解，得到酵母基因组DNA。
优选地，所述YPD培养基选自YPD液体培养基或YPD固体培养基；所述YPD液体培养基包括以下质量百分比的组份：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％和余量的水；所述YPD固体培养基包括以下质量百分比的组份：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂粉2％和余量的水。
优选地，所述培养的条件为：在温度30℃的条件下，200rpm/min、摇瓶振荡培养24小时；所述酵母破壁液包括以下组分：酵母破壁酶25ul、山梨醇缓冲液470ul、B-ME5ul。
优选地，所述基因表达盒的构建方法包括以下步骤：将每个所述的启动子、基因、终止子，营养选择标记和同源臂进行PCR扩增，分别用引物扩增获得功能模块，进行基因扩增；在所述PCR扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收，得到基本片段；使用相邻的2–4个所述基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒。
优选地，所述PCR扩增反应体系为94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
本发明还提供了一种采用所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用。
本发明还提供了一种采用所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的构建方法，包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于SC-LEU液体筛选培养基中制备发酵种子液，离心收集菌体，将所述菌体转移至所述YPD液体培养基中培养，得到发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇静泡，超声提取，离心收集细胞菌体，取上清液检测产物。
本发明还提供了一种采用所述酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的构建方法，包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中制备发酵种子液，将所述发酵种子液转移至所述YPD液体培养基中发酵，得发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用裂解液孵育，超声提取，然后用石油醚萃取，得到产物。
本发明提供了16条来源于葫芦科植物编码短链脱氢酶(short-chaindehydrogenase)的基因SDR(表1)，能催化葫芦二烯醇(Cuol)生成葫芦素中间体cucurbitadienon，选择转化率最高的雪胆来源的HcSDR基因元件构建酵母底盘Cuol03，为葫芦素的生物合成提供了足够的中间体原料。
表1 16条来源于葫芦科植物编码短链脱氢酶的基因SDR
序号11是本研究构建的底盘菌株Cuol03中生产cucurbita-5-24-dien-3-one产量最高的SDR酶元件。
本发明还提供了上述酿酒酵母工程菌Cuol03的构建方法。将来源于酿酒酵母BY4742的甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1和来源于植物雪胆中编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6、细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1以及短链脱氢酶synHcSDR，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2；形成含有完整葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol03。
进一步的，上述的一种酿酒酵母菌Cuol03的构建方法，所述酿酒酵母工程菌Cuol03提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子HXT7p、TEF2 p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p、TEF1p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t、PGK1t控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9、synHcOSC6和synHcSDR基因的表达，即生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one途径的代谢模块。
上述方法中，所述筛选标记基因为LEU2；
进一步的，上述的一种酿酒酵母菌Cuol03的构建方法，所述各个基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接的，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δDNA位点。
由上述的方法得到的酿酒酵母重组菌Cuol03是本发明保护的范围。
本发明还提供了一种生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的重组酿酒酵母底盘细胞Cuol03的应用，在制备葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的应用，生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的方法。
上述发酵采用的培养基为液体培养基，其中各组分及其终浓度如下：终浓度为1％(质量百分含量)Yeast Extract(酵母膏)、终浓度为2％(质量百分含量)Peptone(蛋白胨)、终浓度为2％(质量百分含量)Dextrose(葡萄糖)，用水补足体积：固体培养基需再加2％琼脂粉。
上述发酵的条件为：30℃、250rpm/min、摇瓶振荡培养5天。
本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下：
合成的synHcOSC6为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的葫芦二烯醇合酶编码基因，其编码的蛋白酶为葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase)；
合成的synHcCPR1为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1编码基因,其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶(NDPH-cytochrome P450reductase)；
合成的synHcSDR为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的短链脱氢酶编码基因,其编码的蛋白为短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductases)；
tHMG1为来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1编码基因，具体为酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1(3-hydroxy1-3-methylglutaryl-CoAreductase)；
ERG1为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase)；
ERG20为酵母法尼基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；
ERG9为酵母鲨烯合酶基因名，其编码的酶为鲨烯合酶(Squalene synthase)；
所述δDNA位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1-10个随机位置。
本发明的实验证明，本发明通过同源重组的手段，将生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块6个基因：tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9、synHcOSC6和synHcSDR基因均导入酿酒酵母中得到底盘酵母重组菌Cuol03，发现其可产生葫芦二烯醇和葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one，为人工合成葫芦素和相关中间体化合物单体奠定了基础。
本发明还提供了植物来源编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6、细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1密码子优化核苷酸序列和synHcSDR密码子优化核苷酸序列，同时提供了来源酵母编码ERG20、ERG9、ERG1和tHMG1等6个基因的核苷酸序列。
本发明还提供了来源于质粒pESC-LEU2的筛选标记基因LEU2核苷酸序列。
本发明所述的编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，是由生物技术有限公司(中国上海)按酵母体内表达密码子优化后合成，synHcOSC6是由北京擎科生物科技有限公司(中国北京)按酵母体内表达密码子优化后合成；合成核苷酸序列后进行PCR扩增获得(表3)；酵母来源编码ERG1、ERG20、ERG9、tHMG1等4个基因是通过设计引物(表3)扩增酵母基因组获得。所述的生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的重组酿酒酵母底盘细胞Cuol03构建的一般程序描述如下(表2)表2这次研究中使用的酵母菌株
所述的生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的重组酿酒酵母细胞Cuol03构建的扩增引物如下所示：
表3用于构建酵母底盘细胞株的扩增引物
所述的生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的重组酿酒酵母底盘细胞Cuol03构建时产生的不同菌株产生的葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one产量如表4所示：
表4摇瓶中不同Cuol 03菌株产生的cucurbita-5-24-dien-3-one
该表中所有给定的数据均代表三个重复序列的平均值，并具有相应的标准偏差。Cuol 03-6是本研究构建的底盘菌株中cucurbita-5-24-dien-3-one产量最高的菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提出了一种编码短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase)的基因能催化葫芦二烯醇(Cuol)生成葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one，该酶在葫芦二烯醇的C3位进行脱氢反应形成酮基，形成多数葫芦素(葫芦素B、D、E、I)的骨架(图2)，这极大地推动了对葫芦素生物合成分子机理的认知，也将为葫芦素的全合成奠定基础。目前来源于雪胆、南瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜等18种葫芦科植物的短链脱氢酶已经被成功克隆验证功能，并使用来源于雪胆的HcSDR1基因，采用酵母同源重组组装构建酿酒酵母底盘细胞Cuol03生产目标化合物cucurbita-5-24-dien-3-one。
附图说明
图1为已经证明的葫芦素生物合成途径；
图2为本发明葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one生物合成途径；
图3为生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one推导的合成路径和构建示意图(Cuol03为构建在酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上)；
图4为生产葫芦二烯醇的基因表达盒构建示意图(用于生产完整cucurbita-5-24-dien-3-one的基因下游模块组合)；
图5为Cuol03中基因表达盒融合PCR扩增的7个融合片段(各个基因表达盒通过两步重叠延伸PCR连接)；
图6为TLC检测生产cucurbita-5-24-dien-3-one酿酒酵母底盘细胞的提取液；
图7为不同来源SDRs元件生产cucurbita-5-24-dien-3-one；
图8为GC-MS进一步鉴定cucurbita-5-24-dien-3-one目标产物；
图9为13C-NMR Spectrum of进一步鉴定cucurbita-5-24-dien-3-one目标产物；
图10为13H-NMR Spectrum of进一步鉴定cucurbita-5-24-dien-3-one目标产物；
图11为cucurbita-5-24-dien-3-one的HMBC相关及1H和13C NMR化学位移；
图12为紫外分光光度仪测定发酵罐发酵不同时间点的酵母在OD600处的吸光度；
图13为工程菌在发酵不同时间点取样的细胞干重；
图14为UHPLC检测工程菌在不同时间点取样的发酵产量。
具体实施方式
实施例1
基因元件克隆和基因表达盒的构建分为以下三步:
(1)酵母基因组DNA提取
取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)菌斑于YPD液体培养基(配方:1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(葡萄糖))中，30℃，200rpm，培养24h，10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul B-ME)，30℃温浴1h后离心:菌体用500ul TENTS缓冲液(10mMTris-HCI,pH 7.5；1mM EDTA,pH 8.0:100mM NaAc:2％triton-100；1％SDS)重悬，0℃水浴1h；酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH,1/10倍体积的3MNaAc，20℃冰箱放置2h:1300g，4℃，离心10min，倒掉上清，沉淀用70％EtOH，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20℃保存备用，得到酵母基因组DNA。
(2)HcOSC6和HcCPR1序列密码子优化
本发明所述的编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6以及细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1，是由生物技术有限公司(中国上海)按酵母体内表达密码子优化后合成，synHcOSC6是由北京擎科生物科技有限公司(中国北京)按酵母体内表达密码子优化后合成
(3)基因序列扩增和构建基因表达盒
本研究中使用或构建的所有菌株在表2中列出，用于构建质粒和菌株的引物在附件表3中列出，每种酵母菌株构建的一般程序描述如下：
首先，将每个启动子，基因，终止子，营养选择标记和同源臂进行PCR扩增，分别用表3中引物扩增获得功能模块，采用High-Fidelity DNA Polymerase(NEB:M0491)进行基因扩增。PCR反应体系为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
其次，PCR扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收(图5)。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，放-20℃冰箱中，保存备用。
最后，得到基本片段，相邻的基本片段均具有40-75bp的同源序列，用于重组或融合PCR；其次，使用相邻的2–4个基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒(如图3和图4所示)。
实施例2
酿酒酵母基因工程菌Cuol03的构建
生产葫芦二烯醇途径的下游模块基因表达盒(tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9构建完成后，通过标准醋酸锂转化方法(LiAc/ssDNA)将融合片段纯化，定量并共转化入酵母菌株，因为每个相邻的片段共享40-75bp的同源序列，它们将通过酵母同源重组连接在一起并整合到染色体δDNA位点上。具体步骤如下：
(1)出发菌酿酒酵母BY4742于YPD中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5mlEP管中，4C、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc：10mM DTT；0.6Msorbitol；10mM Tris-HCI(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min.离心，弃上清，菌体中加入1ml IM sorbitol(0.22um水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M sorbitol重悬二次),到最终体积约为90u1，即为BY4742感受态细胞。
(2)在超净工作台中进行如下转化体系配比，PEG3350(50％(W/V过滤除菌)240ul，LiAc1.0M(过滤除菌)36ul，SSDNA(2.0mg/ml)50ul，融合片段2ul，除菌水33ul，共360ul。用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min；42℃热激40min，取150ul转化菌液涂布于SC-LEU固体筛选培养基：2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸LEU；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用表3引物进行PCR鉴定，得到全部6条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株Cuol03。
实施例3
工程菌生产Cucurbita-5,24-dien-3-one
1、工程菌摇瓶培养及产物提取
在固体筛选培养平板中活化高产葫芦二烯醇的底盘工程菌Cuol01(前期实验室成功构建)，采用醋酸锂法将构建好的Y33-SDRX质粒(X为16个物种来源的SDR酶)，分别转化到重组工程菌株Cuol01中；于SC-LEU液体筛选培养基中制备发酵种子液(30℃，250rpm，16小时)；离心收集菌体，转移至含50mlYPD液体培养基的250ml三角瓶中，调OD至0.5，各菌株相应的YPD液体培养基，30℃，250rpm/min。振荡培养生长96h，得到发酵产物。进一步使用高效液相检测产物，采用标准曲线定量分析测定cucurbita-5-24-dien-3-one含量，筛选出转化率最高的催化SDR酶元件。
提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用5ml甲醇静泡30min，超声提取30min，每10min摇晃一次；8000rpm离心5min收集细胞菌体，取上清液检测产物。
2、工程菌高密度发酵及产物提取
在YPD固体筛选培养平板中活化构建成功的底盘菌株Cuol03-1；于YPD液体培养基中制备发酵种子液(30℃，250rpm，16小时)；经火焰接种环，将250ml菌液转移至含1.75L发酵培养基的6L发酵罐中，发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH5.6，溶氧30％，空气流量4-6L·min-1，搅拌转速400-600rpm·min-1，溶氧与搅拌转速、通气量相偶联。分批补料发酵策略为：溶氧值大于60％时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵罐中葡萄糖浓度为10g·L-1。培养生长120h，停止发酵。高密度发酵过程每隔12h取样，进一步检测酵母OD值和产物Cucurbita-5,24-dien-3-one的含量。
提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用2L裂解液(20％KOH，50％EtOH)，90℃孵育30min，超声30min；用相同体积的石油醚萃取三次合并，得到提取产物；发酵液也用相同体积的石油醚萃取三次合并。
3、薄层色谱(TLC)鉴定产物Cucurbita-5,24-dien-3-one
将浓缩的萃取物点到TCL板上(薄层色谱法)，用溶剂环己烷/乙酸乙酯(15:1，体积比)展开，并用5％的硫酸乙醇显色剂染色显点，检测提取产物。
4、气相质谱(GC-MS)鉴定和测定Cucurbita-5,24-dien-3-one
将上述提取产物作经下述处理：
加入200ul正己烷至浓缩的萃取物中，通过GC-MS对代谢产物进行分析。
衍生化后的干燥样品重悬于200μL萃取溶剂中，即用1ml正己烷重新溶解，然后转移至玻璃自动进样器小瓶中的玻璃插件中。吸取每个样品的1μl直接进样到与ISQ型质谱联用的定量GC超气相色谱仪(THERMO Science)中检测。
使用7890B GC(安捷伦)和配有Zebron ZB5-HT色谱柱(Phenomenex)的电子轰击(EI)5977AMSD(安捷伦)进行GC-MS分析。色谱条件：以不分流模式(脉冲压力30psi)注入1μL样品(进样口250℃)，该程序涉及2分钟的柱箱温度170℃，以20℃/min的速度升至300℃在300℃下11.5分钟。在8分钟的溶剂延迟后，以扫描模式(60-800质量单位)进行检测，设置为7.2。使用MassHunter工作站(Agilent)软件进行数据分析。产物Cucurbita-5,24-dien-3-one保留时间为21.25min。采用标准曲线定量分析测定葫芦二烯醇含量：Y＝1137000000X+20510000(R＝0.9991)。
5、NMR鉴定Cucurbita-5,24-dien-3-one
使用指定的氘代吡啶溶剂，以傅立叶变换模式在1H的800MHz和13C NMR的800MHz或1H NMR的600MHz和13C NMR的600MHz的标称频率下记录NMR光谱，其核磁共振(NMR)包括1H、13C、HMBC和HSQC。化学位移以百万分率(ppm)记录，并参考残留溶剂峰。多重性描述为：s，单重态；d，双峰；dd，doublet的doublet；dt，三胞胎的双峰；t，三胞胎；q，四重奏；m，多重；br,broad；appt,apparent；coupling constants are reported in hertz。
6、结果
(1)薄层色谱(TLC)检测结果如图6所示，选取Y33-SDRX质粒(X为16个物种来源的SDR酶)，分别转化到重组工程菌株Cuol01成功的提取物检测，样品中有前体底物cucurbitadienol和标准品Rf值相近；同时提取物和纯化出Cucurbita-5,24-dien-3-one的Rf值相近，表明提取产物中有目标产物Cucurbita-5,24-dien-3-one，空质粒Y33导入Cuol01的发酵提取物没有对应的点。
(2)Cuol03:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742中引入外源的葫芦二烯醇合酶、细胞色素P450氧化还原酶基因和甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1得到的重组菌；其提取产物经葫芦二烯醇GC-MS分析，结果如图7所示，其中，TIC:cucurbitadienol为葫芦二烯醇标准品，空白对照(CK)，Cuol03-1：Cuol03-1的提取物，Cuol02-2：Cuol02-2的提取物；可以看出，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品保留时间为25.21min和25.22min，表明提取产物中有葫芦二烯醇，空质粒Y33导入Cuol01的发酵提取物没有对应的点。
(4)含量检测结果如图7所示，其中在第一代酵母工程菌中Cuol01进行质粒表达SDR基因，测定HcSDR酶转化葫芦二烯醇生产Cucurbita-5,24-dien-3-one的含量最高(如图7所示)。因此，采用HcSDR构建的底盘细胞后获得系列显著提高目标产物产量的工程菌Cuol03，各工程菌发酵120h时产量如图14所示，cub总产量最高为发酵120h测得257.91mg/L，cub-3-one总产量最高为发酵120h测得130mg/L。cub胞内产量最高为发酵120h测得194.75mg/L，cub胞外产量最高为发酵102h测得68.61mg/L，cub-3-one胞内产量最高为发酵120h测得121.08mg/L，cub-3-one胞外产量最高为发酵120h测得8.92mg/L。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
<160> 58
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 1
atgtggaagt tgaagattgg tggtgaatct gttggcaaga acgatgaaag attgttgaag 60
actgttaaca atcatttggg taggcaagtt tgggaattct ctaacgaatc tgattccgat 120
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ttgactagat catatccatg gttggaatta attaacccag ctgaaacctt cggggatatt 1680
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<210> 2
<211> 2124
<212> DNA
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ttgatgcaac caggtggtgt tagagcattg agaagtctgg gtatgattca atctatcaac 240
aacatcgaag catatcctgt taccggttat accgtctttt tcaacggcga acaagttgat 300
attccatacc cttacaaggc cgatatccct aaagttgaaa aattgaagga cttggtcaaa 360
gatggtaatg acaaggtctt ggaagacagc actattcaca tcaaggatta cgaagatgat 420
gaaagagaaa ggggtgttgc ttttgttcat ggtagattct tgaacaactt gagaaacatt 480
actgctcaag agccaaatgt tactagagtg caaggtaact gtattgagat attgaaggat 540
gaaaagaatg aggttgttgg tgccaaggtt gacattgatg gccgtggcaa ggtggaattc 600
aaagcccact tgacatttat ctgtgacggt atcttttcac gtttcagaaa ggaattgcac 660
ccagaccatg ttccaactgt cggttcttcg tttgtcggta tgtctttgtt caatgctaag 720
aatcctgctc ctatgcacgg tcacgttatt cttggtagtg atcatatgcc aatcttggtt 780
taccaaatca gtccagaaga aacaagaatc ctttgtgctt acaactctcc aaaggtccca 840
gctgatatca agagttggat gattaaggat gtccaacctt tcattccaaa gagtctacgt 900
ccttcatttg atgaagccgt cagccaaggt aaatttagag ctatgccaaa ctcctacttg 960
ccagctagac aaaacgacgt cactggtatg tgtgttatcg gtgacgctct aaatatgaga 1020
catccattga ctggtggtgg tatgactgtc ggtttgcatg atgttgtctt gttgattaag 1080
aaaataggtg acctagactt cagcgaccgt gaaaaggttt tggatgaatt actagactac 1140
catttcgaaa gaaagagtta cgattccgtt attaacgttt tgtcagtggc tttgtattct 1200
ttgttcgctg ctgacagcga taacttgaag gcattacaaa aaggttgttt caaatatttc 1260
caaagaggtg gcgattgtgt caacaaaccc gttgaatttc tgtctggtgt cttgccaaag 1320
cctttgcaat tgaccagggt tttcttcgct gtcgcttttt acaccattta cttgaacatg 1380
gaagaacgtg gtttcttggg attaccaatg gctttattgg aaggtattat gattttgatc 1440
acagctatta gagtattcac cccatttttg tttggtgagt tgattggtta ataa 1494
<210> 7
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 7
atggctgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60
caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120
agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180
tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240
ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300
ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360
gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420
ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480
tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540
ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600
atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660
gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720
gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780
catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840
gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900
gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960
aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020
actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080
ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140
gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200
aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260
tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320
caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380
aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440
tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500
gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560
tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584
<210> 8
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 8
aactgtggga atactcaggt atcgtaagat gcaagagttc gaatctctta gcaaccatta 60
tttttttcct caacataacg agaacacaca ggggcgctat cgcacagaat caaattcgat 120
gactggaaat tttttgttaa tttcagaggt cgcctgacgc atataccttt ttcaactgaa 180
aaattgggag aaaaaggaaa ggtgagaggc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa 240
gcgttcatga ctaaatgctt gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc 300
tattgttttt tccaataggt ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt 360
acatttcagc aatatatata tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctatg 420
tctgccccta agaagatcgt cgttttgcca ggtgaccacg ttggtcaaga aatcacagcc 480
gaagccatta aggttcttaa agctatttct gatgttcgtt ccaatgtcaa gttcgatttc 540
gaaaatcatt taattggtgg tgctgctatc gatgctacag gtgtcccact tccagatgag 600
gcgctggaag cctccaagaa ggttgatgcc gttttgttag gtgctgtggc tggtcctaaa 660
tggggtaccg gtagtgttag acctgaacaa ggtttactaa aaatccgtaa agaacttcaa 720
ttgtacgcca acttaagacc atgtaacttt gcatccgact ctcttttaga cttatctcca 780
atcaagccac aatttgctaa aggtactgac ttcgttgttg tcagagaatt agtgggaggt 840
atttactttg gtaagagaaa ggaagacgat ggtgatggtg tcgcttggga tagtgaacaa 900
tacaccgttc cagaagtgca aagaatcaca agaatggccg ctttcatggc cctacaacat 960
gagccaccat tgcctatttg gtccttggat aaagctaatc ttttggcctc ttcaagatta 1020
tggagaaaaa ctgtggagga aaccatcaag aacgaattcc ctacattgaa ggttcaacat 1080
caattgattg attctgccgc catgatccta gttaagaacc caacccacct aaatggtatt 1140
ataatcacca gcaacatgtt tggtgatatc atctccgatg aagcctccgt tatcccaggt 1200
tccttgggtt tgttgccatc tgcgtccttg gcctctttgc cagacaagaa caccgcattt 1260
ggtttgtacg aaccatgcca cggttctgct ccagatttgc caaagaataa ggttgaccct 1320
atcgccacta tcttgtctgc tgcaatgatg ttgaaattgt cattgaactt gcctgaagaa 1380
ggtaaggcca ttgaagatgc agttaaaaag gttttggatg caggtatcag aactggtgat 1440
ttaggtggtt ccaacagtac caccgaagtc ggtgatgctg tcgccgaaga agttaagaaa 1500
atccttgctt aa 1512
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 9
ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgacta cgcacagata ttataacatc 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 10
gaccggatgc aatgccaatt gtaatagctt tcccattgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 60
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 11
ggatatagga atcctcaaaa tg 22
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 12
gaggtcgctc ttattgacca cacctctacc ggcatgctgt tggaatagaa atcaactat 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 13
actagttagt agatgatagt tgatttctat tccaacagca tgccggtaga ggtgtggtc 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 14
gtttgaaaga tgggtccgtc acctgcatta aatcctaaag ttataaaaaa aataagtgt 59
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 15
actttaaaat ttgtatacac ttattttttt tataacttta ggatttaatg caggtgacg 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 16
cacaaaaaca aaaagttttt ttaattttaa tcaaaaaatg gctgcagacc aattggtga 59
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 17
ggtgacttca gttttcacca attggtctgc agccattttt tgattaaaat taaaaaaac 59
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 18
cttctcgtag gaacaatttc g 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 19
ggggccgtat acttacatat ag 22
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 20
atggagacaa cttcatagag gaggattcag attccatgtt tagttaatta tagttcgtt 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 21
ttagaatata cggtcaacga actataatta actaaacatg gaatctgaat cctcctcta 59
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 22
aactaaatca ttaaagtaac ttaaggagtt aaatttatta ccaaacatct ctcaagtat 59
<210> 23
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 23
gcaaatgaac ggtagatact tgagagatgt ttggtaataa atttaactcc ttaagttac 59
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 24
cacagtgata tgcatatggg agatggagat gatacctgcg aaaagccaat tagtgtgat 59
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 25
gataaagcac ttagtatcac actaattggc ttttcgcagg tatcatctcc atctcccat 59
<210> 26
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 26
attcacccca tttttgtttg gtgagttgat tggttaataa agtgctttta actaagaat 59
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 27
cagaaaagac taataattct tagttaaaag cactttatta accaatcaac tcaccaaac 59
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 28
aatctataac tacaaaaaac acatacataa actaaaaaat gtctgctgtt aacgttgca 59
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 29
ttaatcaatt caggtgcaac gttaacagca gacatttttt agtttatgta tgtgtttt 58
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 30
ctgctcacaa atcttaaagt catacattgc acgactatat atctaggaac ccatcaggt 59
<210> 31
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 31
ggtaatcttc caccaacctg atgggttcct agatatatag tcgtgcaatg tatgac 56
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 32
caagaatctc tctctcctaa tttctttttc tgaagccatt tattgtaata tgtgtgtttg 60
<210> 33
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 33
tcttaataat ccaaacaaac acacatatta caataaatgg cttcagaaaa agaaattag 59
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 34
tcaggttgtc taactccttc cttttcggtt agagcggatc tatttgcttc tcttgtaaac 60
<210> 35
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 35
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaataga tccgctctaa ccgaaaagg 59
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 36
gcaaatgcct attatgcaga tgttataata tctgtgcgta gtcgagcgtc ccaaaacctt 60
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 37
ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga cgctcgacta cgcacagata ttataacatc 60
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 38
gaccggatgc aatgccaatt gtaatagctt tcccattgtt ttatatttgt tgtaaaaagt 60
<210> 39
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 39
ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat ataaaacaat gggaaagcta ttacaattg 59
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 40
actcattaaa aaactatatc aattaatttg aattaacttc acgctctgtg taaagtgtat 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 41
ttgggtttta ttatatatac actttacaca gagcgtgaag ttaattcaaa ttaattgata 60
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 42
acttcttgtt gttgacgcta acattcaacg ctagtatagt aagctactat gaaagactt 59
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 43
ttcgagttct ttgtaaagtc tttcatagta gcttactata ctagcgttga atgttagcg 59
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 44
tggatcgtta ccttgagcaa ccttcaactt ccacattttt gtttgtttat gtgtgttta 59
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 45
aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaaaatg tggaagttga agattggtg 59
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 46
taatgttctt taggtatata tttaagagcg atttgtttta gaacaaggca gctggatgt 59
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 47
tgttttgaat gaacaacatc cagctgcctt gttctaaaac aaatcgctct taaatatat 59
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 48
gcgtatttta agtttaataa ctcgaaaatt ctgcgttggt atactggagg cttcatgag 59
<210> 49
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 49
gcgcgaagga cataactcat gaagcctcca gtataccaac gcagaatttt cgagttatt 59
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 50
atctttcgaa ttcactgcca aaaccttggg tcaataggat ctcccatgtc tctactggt 59
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 51
aaagaagcac caccaccagt agagacatgg gagatcctat tgacccaagg ttttggcag 59
<210> 52
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 52
aaagcatagc aatctaatct aagttttaat tacaaaatgt catctaatgg tcaatctcc 59
<210> 53
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 53
tttttggaat ggatggagat tgaccattag atgacatttt gtaattaaaa cttagatta 59
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 54
ctcttgcatc ttacgatacc tgagtattcc cacagttagt gatcccccac acaccatag 59
<210> 55
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 55
tagaaacatt ttgaagctat ggtgtgtggg ggatcactaa ctgtgggaat actcaggta 59
<210> 56
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 56
aaggctaact ctcaacagac aacaacacct gcttcattta agcaaggatt ttcttaact 59
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 57
tgctgtcgcc gaagaagtta agaaaatcct tgcttaaatg aagcaggtgt tgttgtctg 59
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 58
aggagaactt ctagtatatt c 21

Claims (5)

1.一种酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：利用组成型启动子HXT7p、TEF2p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p、TEF1p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t、PGK1t依次分别控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9、synHcOSC6和synHcSDR基因的表达，分别构建形成基因表达盒HXT7p-tHMG1-ADH1t、TEF2p-synHcCPR1- TDH2t、TPIIp-ERG1-ENO2t、GPM1p-ERG20-CYC1t、 PGK1p-ERG9-FBA1t、TDH3p-synHc0SC6- PGT1t、TEF1p-synHcSDR- PGK1t，所述基因表达盒依次相连，相连两个表达盒之间具有同源臂序列，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母中，利用酵母同源重组将所述的基因表达盒和筛选标记基因LEU2整合到酿酒酵母BY4742中的δ DNA位点上，形成含有完整葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one生物合成途径的酿酒酵母工程菌；所述synHcOSC6基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述synHcCPR1基因的核酸序列如SEQ IDNO：2所示；所述synHcSDR基因的核酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于：每一种所述基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸PCR的方法连接的，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的δ DNA位点。
3.根据权利要求1-2任一种所述构建方法得到的酿酒酵母工程菌在生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one中的应用。
4.一种采用权利要求1-2任一种所述构建方法得到的酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的方法，其特征在于：包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于SC-LEU液体筛选培养基中制备发酵种子液，离心收集菌体，将所述菌体转移至YPD液体培养基中培养，得到发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇静泡，超声提取，离心收集细胞菌体，取上清液检测产物。
5.一种采用权利要求1-2任一种所述构建方法得到的酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体cucurbita-5-24-dien-3-one的方法，其特征在于：包括以下步骤：将酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中制备发酵种子液，将所述发酵种子液转移至YPD液体培养基中发酵，得发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用裂解液孵育，超声提取，然后用石油醚萃取，得到产物。
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