CN117821490A - 基因工程菌DNHc87-03和DNHc87-S-01的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种编码细胞色素P450酶的多功能基因CYP87D20构建基因工程菌DNHc87‑03的方法，该基因工程菌能催化葫芦二烯醇的C11氧化和C20位羟化生成葫芦素中间体11‑carbonyl‑Cuol和11‑carbonyl‑20β‑hydroxy‑Cuol；一种短链脱氢酶synHcSDR3构建的基因工程菌DNHc87‑S‑01能在11‑carbonyl‑Cuol和11‑carbonyl‑20β‑hydroxy‑Cuol的C3位进行脱氢反应形成酮基分别生成为11‑Carbonyl‑Cucurbita‑5,24‑dien‑3‑one和11‑Carbonyl‑20β‑hydroxy‑Cucurbita‑5,24‑dien‑3‑one，它们是合成葫芦素C/B/D/E/I等的重要中间体，采用酵母同源重组组装构建酿酒酵母底盘细胞生产目标化合物，极大地推动了对葫芦素生物合成分子机理的认知，也将为雪胆甲素和葫芦素的全合成奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及酿酒酵母基因工程菌DNHc87-03和DNHc87-S-01的构建方法及其应用。
背景技术
葫芦素(Cucurbitacin)是一种广泛分布于葫芦科多种植物中葫芦烷型四环三萜类化合物，药理活性研究表明其葫芦素具有良好的抗癌、抗炎、保肝、抗菌、抗病毒、抗高血糖和心脏保护特性，最显著的是抗炎、抗肿瘤作用，例如葫芦素B、D、I、E、F、IIa(25-acetoxy-23,24-dihydrocucurbitacinF)和IIb(23,24-Dihydrocucurbitacin F)等最为突出，其抗癌的作用机制包括诱导自噬、促凋亡和控制细胞增殖。此外，葫芦素与其他抗癌药物共用，能提高癌症治疗的效果。
葫芦素可根据化学结构分为12类，即葫芦素A～T；而且其分布有明显的物种特异性，如葫芦素A仅分布于黄瓜属(Cucumis)植物中，葫芦素C则仅存在于黄瓜(Cucumissativus L.)中；同样地，葫芦素F特异地存在于雪胆属(Hemsleya)植物中，多数植物葫芦素含量均非常低。雪胆属植物中雪胆甲素(cucurbitacin IIa)和雪胆乙素(cucurbitacinIIb)含量都非常低，主要药用部位块茎生长4年才会有良好的药理功能，提取分离需要较高的成本以及有毒溶剂的使用，研究还表明葫芦素制剂中含有的杂质可能会导致治疗指数低和非特异性毒性等问题。总之，尽管葫芦素具有高效的抗肿瘤活性，但是它药用价值的进一步研究和临床应用都受到严重限制。因此，找到高效制备葫芦素的方法迫在眉睫。
合成生物学是得到药效单体的关键途径之一，近年来，随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，越来越多的药用活性成分进行了异源重建及代谢工程化实现了生物合成，为药效单体的工业化生产提供了可能，如人参皂苷、长春碱、秋水仙碱、紫杉醇及青蒿素。然而，除前体葫芦二烯醇的异源合成外，至今尚无代谢工程生产葫芦素的报道，这主要是因为对其生物合成途径缺乏了解。
通常植物三萜的C-3位是由2,3-氧化鲨烯环化而来β-OH，但12类葫芦素中只有葫芦素C的C-3位为β-OH，其他均为酮基，少数特异为α-OH，如葫芦素F和P，这是葫芦素区别于其他三萜化合物的典型特征之一。然而，C-3位为酮基的葫芦素中间体也没有报道和生物合成。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的应用，为雪胆甲素及葫芦素的生物合成提供了足够的中间体。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法包括：利用组成型启动子HXT7p、TEF2p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和synHcOSC6基因的表达，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01。将YCplac33-PE-synHcCYP87D20基因转化质粒在所述酿酒酵母工程菌Cuol01中表达，将synHcCYP87D20引入到在酵母染色体中的rDNA位点，利用人工强启动子UAS-TDH3和终止子PRM9t控制synHcCYP87D20基因的表达，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742染色体中的rDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因G418，形成含有完整葫芦素中间体11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol生物合成途径的酿酒酵母工程菌DNHc87-03。
一种酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括：利用启动子TDH3p和终止子ADH1t控制HcSDR3基因的表达，插入到筛选标记基因LEU2中，用URA做筛选标签，形成含有葫芦素中间体11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one生物合成途径的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01。
作为优选，所述基因表达盒的构建方法，包括：将每个所述的组成型启动子、终止子和基因，营养选择标记用酵母基因组，或合成的基因和同源臂进行PCR扩增，分别用引物扩增获得功能模块，进行基因扩增，然后进行目的条带回收，得到基本片段；使用相邻的2～4个所述基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒；所述PCR扩增反应体系为95℃、5min；95℃、30S，58℃、15S，72℃、2min，35个循环；72℃、5min。
作为优选，所述酵母基因组的提取方法包括：取酿酒酵母BY4742菌斑于YPD培养基中培养，收集菌体清洗，重悬于酵母破壁液，再用TENTS缓冲液重悬，然后用酚-氯仿抽提，上清液中加入乙醇和醋酸钠溶液放置，离心，得沉淀；所述沉淀用乙醇洗涤，干燥，双蒸水溶解，得到酵母基因组DNA；所述酵母破壁液包括以下组分：酵母破壁酶25ul、山梨醇缓冲液470ul、B-ME5ul。
本发明还提供了一种所述的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01在生物合成葫芦素中间体中的应用。
作为优选，所述中间体为：11-carbonyl-Cuol，11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol，11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one，或11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one中的一种。
作为优选，所述生物合成葫芦素中间体的方法包括以下步骤：将所述的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01于SC-LEU、YPD+G418或SC-URA液体筛选培养基中制备发酵种子液，离心收集菌体，将所述菌体转移至YPD液体培养基中培养，得到发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇浸泡，超声提取，离心收集细胞菌体，取上清液，得到产物。
作为优选，所述生物合成葫芦素中间体的方法包括以下步骤：将所述的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01于SC-LEU、YPD+G418或SC-URA培养基中培养48h，再于YPD液体培养基中制备发酵种子液，将所述发酵种子液转移至所述YPD液体培养基中发酵，得发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇孵育，超声提取，然后用乙酸乙酯萃取，得到产物。
研究表明，发现葫芦素羟化修饰的关键CYP是相关研究的热点之一。葫芦素生物合成起始于2,3-氧化鲨烯环化形成的葫芦二烯醇(Cuol)，是由氧化鲨烯环化酶(OSCs)家族的葫芦二烯醇合酶(CBS)催化。葫芦二烯醇在细胞色素P450的催化下，通过引入羟基、羧基或环氧基进行特定部位的氧化修饰，从而产生多种多样的四环三萜类化合物。许多研究表明多功能的CYP87D20则连续地催化Cuol的C11氧化和C20位羟化，形成11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol(图1)。CYP87D20在葫芦素合成途径中是Cuol氧化过程的第一步。
本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下：
合成的synHcOSC6为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的葫芦二烯醇合酶编码基因，其编码的蛋白酶为葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase)；
合成的synHcCPR1为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1编码基因，其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶(NDPH-cytochrome P450reductase)；
合成的synHcSDR3为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的短链脱氢酶编码基因，其编码的蛋白为短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductases)；
合成的synHcCYP87D20为来源于雪胆(Hemsleya chinensis)的细胞色素P450氧化还原酶编码基因，其编码的蛋白为单加氧酶(Cytochrome P450s)；
tHMG1为来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1编码基因，具体为酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1(3-hydroxy1-3-methylglutaryl-CoAreductase)；
ERG1为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase)；
ERG20为酵母法尼基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；
ERG9为酵母鲨烯合酶基因名，其编码的酶为鲨烯合酶(Squalene synthase)；
所述δDNA位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1-10个随机位置，rDNA位点为酿酒酵母染色体上多个r基因中的10-100个随机位置。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用了一种多功能的CYP87D20能连续地催化葫芦二烯醇的C11氧化和C20位羟化，形成11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol。
本发明还采用了一种编码短链脱氢酶SDR的基因，能在11-carbonyl-Cuol和11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol的C3位进行脱氢反应形成酮基生产目标化合物11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one，形成多数葫芦素(葫芦素B、D、E、I、C)的中间体(图1)，采用酵母同源重组组装构建酿酒酵母底盘细胞DNHc87-S-01。这极大地推动了对葫芦素生物合成分子机理的认知，也将为雪胆甲素和葫芦素的全合成奠定基础。
附图说明
图1为基因工程菌DNHc87-03、DNHc87-S-01的构建；
图2为DNHc87-S-01产物检测；
图3为HcCYP87D20产物的NMR图谱(A、B)和HcSDR3产物的NMR图谱(C、D)；
图4为CYP87D20不同工程菌的产量比较；
图5为DNHc87-S-01工程菌的产量。
具体实施方式
下面结合对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
基因元件克隆和基因表达盒的构建分为以下三步:
(1)酵母基因组DNA提取
取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiae BY4742)菌斑于YPD液体培养基(配方:1％ Yeast Extract(酵母膏)，2％ Peptone(蛋白胨)，2％ Dextrose(葡萄糖))中，30℃，200rpm，培养24h，10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul B-ME)，30℃温浴1h后离心:菌体用500ul TENTS缓冲液(10mMTris-HCI,pH 7.5；1mM EDTA,pH 8.0:100mM NaAc:2％triton-100；1％ SDS)重悬，0℃水浴1h；酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH,1/10倍体积的3M NaAc，20℃冰箱放置2h:1300g，4℃，离心10min，倒掉上清，沉淀用70％ EtOH，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20℃保存备用，得到酵母基因组DNA。
(2)HcOSC6、HcCPR1和HcCYP87D20序列密码子优化
本发明所述的编码葫芦二烯醇合酶基因synHcOSC6、细胞色素P450还原酶基因synHcCPR1、synHcCYP87D20以及短链脱氢酶基因synHcSDR3，是由生物技术有限公司(中国上海)按酵母体内表达密码子优化后合成。
(3)基因序列扩增和构建基因表达盒
本研究中使用或构建的所有菌株在表1和表2中列出，用于构建质粒和菌株的引物在附件表7中列出，每种酵母菌株构建的一般程序描述如下：
首先，将每个启动子，基因，终止子，营养选择标记和同源臂进行PCR扩增，分别用表7中引物扩增获得功能模块，采用High-Fidelity DNA Polymerase(NEB:M0491)进行基因扩增。PCR反应体系为：95℃、5min；95℃、30S，58℃、15S，72℃、2min，35个循环；72℃、5min。
其次，PCR扩增结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收(图5)。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，放-20℃冰箱中，保存备用。
最后，得到基本片段，相邻的基本片段均具有40-75bp的同源序列，用于重组或融合PCR；其次，使用相邻的2-4个基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒(如图1所示)。
实施例2
酿酒酵母基因工程菌DNHc87-S-01的构建
生产葫芦二烯醇途径的下游模块基因表达盒(tHMG1、HcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9synHcOSC6构建完成后，通过标准醋酸锂转化方法(LiAc/ssDNA)将融合片段纯化，定量并共转化入酵母菌株，因为每个相邻的片段共享40-75bp的同源序列，它们将通过酵母同源重组连接在一起并整合到染色体δDNA位点上。然后将synHcCYP87D20整合到染色体rDNA，HcSDR3整合到LEU2上。具体步骤如下：
(1)出发菌酿酒酵母BY4742于YPD中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5mlEP管中，4C、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc：10mM DTT；0.6Msorbitol；10mM Tris-HCI(pH7.5)，处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml IM sorbitol(0.22um水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1M sorbitol重悬二次),到最终体积约为90u1，即为BY4742感受态细胞。
(2)在超净工作台中进行如下转化体系配比，PEG3350(50％(W/V过滤除菌)240ul，LiAc 1.0M(过滤除菌)36ul，SSDNA(2.0mg/ml)50ul，融合片段2ul，除菌水33ul，共360ul。用混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min；42℃热激40min，取150ul转化菌液涂布于SC-URA固体筛选培养基：2％葡萄糖，缺对应营养选择标记氨基酸URA；筛选培养的条件为：倒置放于30℃培养箱中培养2-3天，待转化子长出来，挑选单克隆，提基因组分别用引物进行PCR鉴定，得到全部6条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株DNHc87-S-01。
实施例3
酿酒酵母工程菌生产葫芦素中间体11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的应用。
1、工程菌摇瓶培养及产物提取
在固体筛选培养平板中活化高产11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的底盘工程菌DNHc87-S-01，于SC-URA液体筛选培养基中制备发酵种子液(30℃，200rpm，16小时)；离心收集菌体，转移至含50ml YPD液体培养基的250ml三角瓶中，调OD至0.5，各菌株相应的YPD液体培养基，30℃，200rpm/min。振荡培养生长5天，得到发酵产物。进一步使用高效液相检测产物，采用标准曲线定量分析测定11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one含量，筛选出转化率最高的催化SDR酶元件。
提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用5ml甲醇静泡30min，超声提取30min，每10min摇晃一次；8000rpm离心5min收集细胞菌体，取上清液检测产物。
2、工程菌高密度发酵及产物提取
在YPD固体筛选培养平板中活化构建成功的底盘菌株DNHc87-S-01；于YPD液体培养基中制备发酵种子液(30℃，200rpm，16小时)；经火焰接种环，将250ml菌液转移至含1.75L发酵培养基的6L发酵罐中，发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH5.6，溶氧30％，空气流量4-6L·min-1，搅拌转速400-600rpm·min-1，溶氧与搅拌转速、通气量相偶联。分批补料发酵策略为：溶氧值大于60％时，向发酵罐中加入补料培养基至发酵罐中葡萄糖浓度为10g·L-1。培养生长120h，停止发酵。高密度发酵过程每隔12h取样，进一步检测酵母OD值和产物11-carbonyl-Cuol和11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol的含量。
提取产物条件：发酵产物8000rpm离心5min收集细胞菌体，用2L裂解液(20％KOH，50％EtOH)，90℃孵育30min，超声30min；用相同体积的石油醚萃取三次合并，得到提取产物；发酵液也用相同体积的石油醚萃取三次合并。
3、薄层色谱(TLC)鉴定产物11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one
将浓缩的萃取物点到TCL板上(薄层色谱法)，用溶剂环己烷/乙酸乙酯(15:1，体积比)展开，并用5％的硫酸乙醇显色剂染色显点，检测提取产物。
4、气相质谱(GC-MS)鉴定和测定11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one
将上述提取产物作经下述处理：
加入200ul正己烷至浓缩的萃取物中，通过GC-MS对代谢产物进行分析。
衍生化后的干燥样品重悬于200μL萃取溶剂中，即用1ml正己烷重新溶解，然后转移至玻璃自动进样器小瓶中的玻璃插件中。吸取每个样品的1μl直接进样到与ISQ型质谱联用的定量GC超气相色谱仪(THERMO Science)中检测。
使用7890B GC(安捷伦)和配有Zebron ZB5-HT色谱柱(Phenomenex)的电子轰击(EI)5977AMSD(安捷伦)进行GC-MS分析。色谱条件：以不分流模式(脉冲压力30psi)注入1μL样品(进样口250℃)，该程序涉及2分钟的柱箱温度170℃，以20℃/min的速度升至300℃在300℃下11.5分钟。在8分钟的溶剂延迟后，以扫描模式(60-800质量单位)进行检测，设置为7.2。使用MassHunter工作站(Agilent)软件进行数据分析。产物11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one保留时间为21.25min。采用标准曲线定量分析测定葫芦二烯醇含量：Y＝1137000000X+20510000(R＝0.9991)。
5、NMR鉴定11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one
使用指定的氘代吡啶溶剂，以傅立叶变换模式在1H的800MHz和13C NMR的800MHz或1H NMR的600MHz和13C NMR的600MHz的标称频率下记录NMR光谱，其核磁共振(NMR)包括1H、13C、HMBC和HSQC。化学位移以百万分率(ppm)记录，并参考残留溶剂峰，如表3-6所示。
6、结果
(1)薄层色谱(TLC)检测结果如图2所示，选取重组工程菌株DNHc87-S-01成功的提取物检测，样品中有前体底物cucurbitadienol和标准品Rf值相近；同时提取物和纯化出11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的Rf值相近，表明提取产物中有目标产物11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one，空质粒Y33导入Cuol01的发酵提取物没有对应的点。
(2)DNHc87-S-01:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742中引入外源的葫芦二烯醇合酶、细胞色素P450氧化还原酶基因和甲羟戊酸途径的相关基因ERG20、ERG9、tHMG1得到的重组菌；其提取产物经葫芦二烯醇GC-MS分析，结果如图2所示，其中，TIC:cucurbitadienol为葫芦二烯醇标准品，空白对照(CK)，DNHc87-S-01：DNHc87-S-01的提取物，Cuol02-2：Cuol02-2的提取物；可以看出，样品中葫芦二烯醇和葫芦二烯醇标准品保留时间为25.21min和25.22min，表明提取产物中有葫芦二烯醇，空质粒Y33导入Cuol01的发酵提取物没有对应的点。
(4)含量检测结果如图5所示，其中在第一代酵母工程菌中Cuol01进行人工强启动子导入synHcCYP87D20到酵母基因组的rDNA位点，11-carbonyl-Cuol和11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol产生并且后者更高，HcSDR3酶将其催化为11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one。因此，获得系列显著提高目标产物产量的工程菌DNHc87-S-01-3，产量为40.77mg/L±0.49。
所述的生产葫芦素中间体11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的重组酿酒酵母细胞DNHc87-03和DNHc87-S-01产量如表1和表2所示。
表1工程菌摇瓶发酵结果
| 菌株 | Cuol(mg/L) | 11-carbonyl-Cuol(mg/L) | 11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol(mg/L) |
| Cuol01-1 | 133.21±2.01 | - | - |
| Cuol01-1-PHc87 | 123.56±3.27 | 4.27±0.68 | 1.52±0.08 |
| Cuol01-1-PCm87 | 120.88±1.46 | 4.83±0.89 | 1.65±0.09 |
| DNHc87-01 | 102.37±3.93 | 10.43±0.34 | 5.58±0.10 |
| DNCm87-01 | 99.42±2.76 | 16.55±0.89 | 8.47±0.21 |
| DNCs87-01 | 116.71±3.56 | 7.21±0.58 | 3.62±0.18 |
| DNCl87-01 | 110.35±1.39 | 6.81±0.21 | 3.77±0.07 |
| DNHc87-02 | 74.19±3.83 | 21.57±0.93 | 28.45±0.14 |
| DNHc87-03 | 64.21±2.38 | 15.85±0.62 | 46.41±0.15 |
表2工程菌DNHc87-S-X摇瓶发酵结果
本表中所有给定数据均表示三次重复的平均值，并带有相应的标准偏差。
表3 DNHc87-03产物(2)13C&1H NMR(500MHz，溶剂：CDCl3)数据(J in Hz，δin ppm)
表4 DNHc87-03产物(3)13C&1H NMR(500MHz，溶剂：CDCl3)数据(J in Hz，δin ppm)
| Carbon(11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol) | δH(1H) | δC(13C) |
| 1 | 1.40(m),1.46(m) | 20.72 |
| 2 | 1.64(m),1.76(m) | 28.72 |
| 3 | 3.46(m) | 76.30 |
| 4 | / | 41.79 |
| 5 | / | 139.67 |
| 6 | 5.65(d,J＝6.0Hz) | 120.82 |
| 7 | 1.91(m),2.37(m) | 24.02 |
| 8 | 1.94(d,J＝8.0Hz) | 43.20 |
| 9 | / | 49.08 |
| 10 | 2.26(d,J＝12.0Hz) | 35.55 |
| 11 | 2.52(d,J＝13.4Hz) | 214.78 |
| 12 | 2.93(d,J＝14.5Hz) | 48.76 |
| 13 | / | 48.96 |
| 14 | / | 50.02 |
| 15 | 1.29(m),1.37(m) | 33.99 |
| 16 | 1.90(m),1.99(m) | 23.13 |
| 17 | 2.03(t,J＝9.3Hz) | 50.99 |
| 18 | 0.91(s) | 18.92 |
| 19 | 1.11(s) | 20.25 |
| 20 | / | 75.13 |
| 21 | 1.27(s) | 26.24 |
| 22 | 1.39(m),1.46(m) | 44.33 |
| 23 | 1.83(m) | 21.97 |
| 24 | 5.08(t,J＝7.0Hz) | 124.35 |
| 25 | / | 132.10 |
| 26 | 1.67(s) | 25.93 |
| 27 | 1.60(s) | 17.87 |
| 28 | 1.16(s) | 25.58 |
| 29 | 1.02(s) | 27.51 |
| 30 | 1.03(s) | 18.54 |
表5 DNHc87-S-01产物(2a)13C&1H NMR(500MHz，溶剂：CDCl3)数据(J in Hz，δinppm)
表6 DNHc87-S-01产物(3a)13C&1H NMR(500MHz，溶剂：CDCl3)数据(J in Hz，δinppm)
所述的生产葫芦素中间体11-carbonyl-Cuol、11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol、11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one和11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one的重组酿酒酵母细胞DNHc87-03和DNHc87-S-01构建的扩增引物如下所示：
表7各工程菌株引物表
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以上结合对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种酿酒酵母基因工程菌DNHc87-03的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用组成型启动子HXT7p、TEF2p、TPI1p、GPM1p、PGK1p、TDH3p和终止子ADH1t、TDH2t、ENO2t、CYC1t、FBA1t、PGT1t控制tHMG1、synHcCPR1、ERG1、ERG20、ERG9和synHcOSC6基因的表达，分别构建形成基因表达盒成为生产葫芦二烯醇合成途径的下游模块；
S2、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742中的δ DNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因LEU2，形成含有完整葫芦二烯醇生物合成途径的酿酒酵母工程菌Cuol01；
S3、将YCplac33-PE-synHcCYP87D20基因转化质粒在所述酿酒酵母工程菌Cuol01中表达，将synHcCYP87D20引入到在酵母染色体中的rDNA位点，利用人工强启动子UAS-TDH3和终止子PRM9t控制synHcCYP87D20基因的表达；
S4、运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742染色体中的rDNA位点上，利用酵母同源重组能力组装和含有筛选标记基因G418，形成生物合成途径的酿酒酵母基因工程菌DNHc87-03。
2.一种酿酒酵母基因工程菌DNHc87-S-01的构建方法，其特征在于，包括：利用启动子TDH3p和终止子ADH1t控制synHcSDR3基因的表达，插入到上述基因工程菌DNHc87-03菌株的筛选标记基因LEU2中，用URA做筛选标签，运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母BY4742染色体中的rDNA位点上，形成生物合成途径的酿酒酵母基因工程菌DNHc87-S-01。
3.根据权利要求1-2任一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述δ DNA位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1-10个随机位置，rDNA位点为酿酒酵母染色体上多个r基因中的10-100个随机位置。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述基因表达盒的构建方法，包括：将每个所述的组成型启动子、终止子和基因，营养选择标记用酵母基因组，或合成的基因和同源臂进行PCR扩增，分别用引物扩增获得功能模块，进行基因扩增，然后进行目的条带回收，得到基本片段；使用相邻的2～4个所述基本片段作为模板，进行融合PCR，得到每个融合片段构建形成基因表达盒；所述PCR扩增反应体系为95 ℃、5 min；95 ℃、30 S，58 ℃、15 S，72 ℃、2 min，35个循环；72 ℃、5min。
5.根据权利要求4所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述酵母基因组的提取方法包括：取酿酒酵母BY4742菌斑于YPD培养基中培养，收集菌体清洗，重悬于酵母破壁液，再用TENTS缓冲液重悬，然后用酚-氯仿抽提，上清液中加入乙醇和醋酸钠溶液放置，离心，得沉淀；所述沉淀用乙醇洗涤，干燥，双蒸水溶解，得到酵母基因组DNA；所述酵母破壁液包括以下组分：酵母破壁酶25ul、山梨醇缓冲液470ul、B-ME5ul。
6.根据权利要求3所述的酿酒酵母基因工程菌在生物合成葫芦素中间体中的应用。
7.根据权利要求6所述的酿酒酵母基因工程菌在生物合成葫芦素中间体中的应用，其特征在于，所述中间体为：11-carbonyl-Cuol，11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol，11-Carbonyl-Cucurbita-5,24-dien-3-one，或11-Carbonyl-20β-hydroxy-Cucurbita-5,24-dien-3-one中的一种。
8.根据权利要求6所述的酿酒酵母基因工程菌在生物合成葫芦素中间体中的应用，其特征在于：所述生物合成葫芦素中间体的方法包括以下步骤：将所述的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01于SC-LEU、YPD+G418或SC -URA液体筛选培养基中制备发酵种子液，离心收集菌体，将所述菌体转移至YPD液体培养基中培养，得到发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇浸泡，超声提取，离心收集细胞菌体，取上清液，得到产物。
9.根据权利要求6所述的酿酒酵母基因工程菌在生物合成葫芦素中间体中的应用，其特征在于，所述生物合成葫芦素中间体的方法包括以下步骤：将所述的酿酒酵母工程菌DNHc87-S-01于SC-LEU、YPD+G418或SC -URA培养基中培养48 h，再于YPD液体培养基中制备发酵种子液，将所述发酵种子液转移至所述YPD液体培养基中发酵，得发酵产物；所述发酵产物离心收集细胞菌体，用甲醇孵育，超声提取，然后用乙酸乙酯萃取，得到产物。
10.植物来源编码synHcCPR1、synHcOSC6、synHcCYP87D20、synHcSDR3核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
11.酵母来源编码tHMG1、ERG1、ERG20、ERG9的核苷酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8。
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