CN116064267A - 一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法，属于分子生物学和生物工程技术领域。本发明将糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT31进行酵母密码子优化，分别在组合型启动子和G418抗性标签的作用下，插入ZW04BY酵母基因组的δ序列多拷贝位点，获得生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌。本发明通过在起始菌株ZW04BY酿酒酵母中异源过表达人参皂苷Rg3通路合成的2个关键酶实现了人参皂苷Rg3在酿酒酵母中的生产，使其产量达到254.07±56.49mg/L，本发明的方法为人工细胞高效合成人参皂苷Rg3奠定了基础。

Description

一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
背景技术
人参皂苷Rg3具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗抑郁、抗疲劳、抗衰老、治疗心血管疾病、减轻肺损伤和神经保护的作用，药用价值较高。人参皂苷Rg3作为一种活血产品，预防肿瘤术后复发转移，具有广阔的发展前景。实验已经证实，当Rg3作用于心脏、肝、肺、肾、骨髓和神经系统时，它是相对安全的。人参皂苷Rg3的分子式如式(Ⅰ)所示。
Figure BDA0003947629860000011
人参皂苷Rg3主要的获取方式主要是从人参属植物中提取，而人参属植物种植存在栽培周期长、连作障碍、农药及重金属残留等问题，有限的天然资源及人工栽培技术极大的限制了人参皂苷Rg3的推广和应用。另外，化学合成因使用昂贵的起始原料和繁琐的合成程序而黯然失色。因此，利用合成生物学技术改造微生物生产人参皂苷Rg3提供了一种最有潜力的替代方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法。通过ZW04BY酿酒酵母工程菌中异源表达人参皂苷Rg3通路合成的2个关键糖基转移酶实现了人参皂苷Rg3在酿酒酵母中的从头生产，其合成途径如图1所示，并且此工程菌人参皂苷Rg3产量较高。本发明的方法为人工细胞高效合成人参皂苷Rg3奠定了基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌，将糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT31进行酵母密码子优化，分别在组合型启动子和G418抗性标签的作用下，插入ZW04BY酵母基因组的δ序列多拷贝位点，获得生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌；
所述优化后的糖基转移酶PnUGT50的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；所述组合型启动子的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；所述优化后的糖基转移酶PnUGT31的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示。
进一步，优选的是，所述酿酒酵母基因组中整合过表达原人参二醇至人参皂苷Rg3中的所有基因，包括原人参二醇合成酶PPDS、糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT31。
本发明同时提供所述的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)P1基因盒重组载体的构建：
(1.1)以酵母菌株ZW04BY基因组为模板，采用引物LEU(Dn)+pADH1-F和LEU2-R进行PCR扩增，获得同源臂下游片段；
(1.2)以质粒pHDE-Cas9为模板，采用引物KANMX+LEU(up)-F和KAN MX+HindIII-RPCR进行PCR扩增，获得G418片段；
(1.3)以质粒UASTEF1+CIT1+CLB2为模板，采用引物UAS+PTDH3-R和UAS+KANMX-FPCR进行PCR扩增，获得UAS片段；
(1.4)将获得的同源臂下游片段、G418片段、UAS片段为模板，引物Leu2-up-F和UAS+pTDH3-R经融合PCR扩增，获得P1基因盒；
(1.5)P1基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P1基因盒重组载体；
(2)P2基因盒重组载体的构建：
(2.1)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物pTDH3+UAS-F和pTD H3+sPn50-R进行PCR扩增，获得启动子TDH3片段；
(2.2)以质粒PnUGT50为模板，采用引物sPn50+EGFP-R和sPn50+pT DH3-F进行PCR扩增，获得SnyPn50片段；
(2.3)以质粒pT4-CMV-GFP为模板，采用引物EGFP+sPnUGT50-F和EGFP+tPFK1-R进行PCR扩增，获得EGFP序列；
(2.4)将获得的TDH3、SnyPn50、EGFP为模板，采用引物pTDH3+UA S-F和EGFP+tPFK-R经融合PCR扩增，获得P2基因盒；
(2.5)P2基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P2基因盒重组载体；
(3)P3基因盒重组载体的构建：
(3.1)以酵母菌株ZW04BY基因组为模板，采用引物Leu2-up-F和LEU2(up)+KANMX-R进行PCR扩增，得到同源臂上游片段；
(3.2)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物tPFK1+EGFP-F和引物PNUGT31+tPFK1+SmaI-R进行PCR扩增，获得tPFK1片段；
(3.3)以PnUGT31为模板，采用引物PNUGT31+tPFK1-F和pADH 1+LE U2(Dn)-R进行PCR扩增获得PNUGT31片段；
(3.4)将获得的tPFK1、PNUGT31、同源臂上游片段为模板，引物tPFK1+EGFP-F和LEU2-R经融合PCR扩增，获得P3基因盒；
(3.5)P3基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P3基因盒重组载体；
(4)生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的获得：
将所得的P1基因盒、P2基因盒和P3基因盒重组载体质粒线性化一起转入起始菌株ZW04BY，在含有200mg/L G418的YPD固体平板中，于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子进行发酵测产，获得的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌。
进一步，优选的是，步骤(1.1)～(1.3)、(2.1)～(2.3)、(3.1)～(3.3)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
进一步，优选的是，步骤(1.4)、(2.4)、(3.4)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
本发明还提供一种人参皂苷Rg3的制备方法，将上述酿酒酵母工程菌发酵，从发酵液中获得人参皂苷Rg3。
进一步，优选的是，发酵培养基的配方为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，余量为水，发酵温度条件为30℃。
本发明中，所述糖基转移酶PnUGT50为如下a1)-a3)中任一种DNA分子：a1)如SEQID NO：1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性的cDNA分子或基因组DNA分子；
所述糖基转移酶PnUGT31为如下a1)-a3)中任一种DNA分子：a1)如SEQ ID NO：1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
a2)在严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性的cDNA分子或基因组DNA分子；
本发明中，酿酒酵母整合的糖基转移酶PnUGT50在组合型启动子TDH3-UASTEF1+CIT1+CLB2的控制之下，酿酒酵母整合的糖基转移酶PnUGT31在启动子ADH1和终止子CYC1的控制之下。
本发明将来自三七的催化原人参二醇生成人参皂苷Rh2的糖基转移酶PnU GT50和催化人参皂苷Rh2生成人参皂苷Rg3的糖基转移酶PnUGT31进行酵母密码子优化，然后分别在组合型启动子和G418抗性标签作用下，插入ZW04BY酵母基因组的δ序列多拷贝位点，获得生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌；
本发明发明人考虑在合成生物学中，酿酒酵母是较为常用的平台生物。酿酒酵母具有高效产生异戊二烯起始合成单位异戊二烯焦磷酸，丙二烯甲基焦磷酸以及关键中间代谢物香叶基二磷酸，法尼基二磷酸的能力，因此广泛用于甾醇、类固醇和其他萜类化合物的生产。另外，在萜类化合物生物合成中，真核生物的细胞膜对植物萜类转化酶如细胞色素P450等比原核生物更加适合。基于此，研究出一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌及其构建方法。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明构建的一种高产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌，能够利用葡萄糖发酵产254.07mg/L人参皂苷Rg3，酵母生长繁殖较快，仅需发酵罐就可以生产，无论是生态保护、土地利用面积或生产周期等均比植物生产提取高效，并可降低生产成本，同时也比化学合成更高效、绿色、无毒污染等优点。
附图说明
图1为人参皂苷Rg3在酿酒酵母中的生物合成路径示意图。其中实线代表本次改造插入的糖基转移酶。
图2为插入片段图谱。
图3为重组菌株生产人参皂苷Rg3的HPLC检测图。
图4为重组菌株生产的人参皂苷Rg3的LC-MS检测图。
图5为与起始菌株相比，重组菌株4在摇瓶发酵中人参皂苷Rg3产量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
一、本发明涉及的菌株和质粒来源如下：
1.出发菌株为ZW04BY(BY4742，HXT7p-tHMG1-ADH1t，TEF2p-synPgCPR1-TDH2t，TPIIp-ERG1-ENO2t，GPM1p-ERG20-CYC1t，PGK1p-ERG9-FBA1t，TDH3p-synDDS-PGT1t，TEF1p-synPPDS-PGK1t，ENO2p-ERG12-CPS1t，TEF2p-ERG13-IDP1t，TPIIp-ERG8-PRM5t，GPM1p-ERG19-HIS5t，PGK1p-IDI-PRM9t，TDH3p-ERG10-SPG5t，TEF1p-tHMG1-ADH1t TDH3p-synPPDS-CPS1t)，该菌株由本课题组按照参考文献(Wang P，Wei W，Ye W，Li X，Zhao W，YangC，Li C，Yan X，Zhou Z.Synthesizingginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiaecell factory at high-effic iency.Cell Discov.2019Jan 15；5:5.doi:10.1038/s41421-018-0075-5)中的方法构建。
2.质粒pHDE-Cas9由中国科学院天津工业生物技术研究所江会锋研究员赠予，pT4-CMV-GFP质粒为商业购买获得。
3.所用引物均由北京擎科生物科技有限公司(昆明分公司)合成，引物序列见表1。
表1
Figure BDA0003947629860000051
Figure BDA0003947629860000061
二、本发明所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
三、本发明涉及的基因如下：
1.优化后的糖基转移酶PnUGT50的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；
2.优化后的糖基转移酶PnUGT31的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示。
四、本发明涉及的培养基及配制
YPD培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，115℃灭菌25min即得。YPD+G418平板(即含有200mg/LG418的YPD固体平板)：无水葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，1.5％琼脂粉，去离子水配制为YPD固体培养基，115℃灭菌25min即得；G418用去离子水配制为100mg/ml母液，过滤除菌后加入2ml至1L的未凝固的YPD固体培养基中使G418终浓度为200mg/L，倒入平板获得YPD+G418平板。
实施例1：重组质粒的构建
(一)P1载体构建
(1)使用Solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒获得酵母菌株ZW04BY基因组，以此为模板，引物LEU(Dn)+pADH1-F和LEU2-R扩增获得同源臂下游片段；
(2)以质粒pHDE-Cas9为模板，引物KANMX+LEU(up)-F和KANMX+HindIII-R扩增获得G418片段；
(3)以合成的UASTEF1+CIT1+CLB2为模板，引物UAS+PTDH3-R和UAS+KANMX-F扩增获得UAS片段；
(4)将获得的同源臂下游片段、G418片段、UAS片段为模板，引物Leu2-up-F和UAS+pTDH3-R融合PCR扩增获得P1基因盒；
(5)P1基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit(北京全式金生物公司)连接pEASY载体构建重组载体，测序正确。
(二)P2载体构建
(1)使用Solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒获得酵母菌株W303基因组，以此为模板，引物pTDH3+UAS-F和pTDH3+sPn50-R为扩增获得启动子TDH3片段；
(2)以北京擎科生物科技有限公司合成的序列PnUGT50为模板，引物sPn50+EGFP-R和sPn50+pTDH3-F扩增获得SnyPn50片段；
(3)以质粒pT4-CMV-GFP为模板，引物EGFP+sPnUGT50-F和EGFP+tPFK1-R扩增获得EGFP序列；
(4)将获得的TDH3、SnyPn50、EGFP为模板，引物pTDH3+UAS-F和EGFP+tPFK-R融合PCR扩增获得P2基因盒。
(5)P2基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit(北京全式金生物公司)连接pEASY载体构建重组载体，测序正确。
(三)P3载体构建
(1)使用Solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒获得酵母菌株ZW04BY基因组，以此为模板，引物Leu2-up-F和LEU2(up)+KANMX-R扩增同源臂上游片段；
(2)使用Solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒获得酵母菌株W303基因组，以此为模板，引物tPFK1+EGFP-F和引物PNUGT31+tPFK1+SmaI-R扩增获得tPFK1片段；
(3)以北京擎科生物科技有限公司合成的序列PnUGT31为模板，引物PNUGT31+tPFK1-F和pADH1+LEU2(Dn)-R扩增获得PNUGT31片段；
(4)将获得的tPFK1、PNUGT31、同源臂上游片段为模板，引物tPFK1+EGFP-F和LEU2-R融合PCR扩增获得P3基因盒。
(5)P3基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司)连接pEASY载体构建重组载体，测序正确。
实施例中，所有用到的试剂盒均按照试剂盒说明书进行操作。
(一)P1载体构建中(1)～(3)、(二)P2载体构建中(1)～(3)、(三)P3载体构建中(1)～(3)中的PCR采用Q5 High-Fidelity DNA Polymeras es或Phusion Plus DNA聚合酶克隆试剂盒进行；PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；酶混合物为Q5 High-Fidelity DNA Polymerases或PhusionPlus DNA聚合酶克隆试剂盒中的相应试剂。PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
(一)P1载体构建中(4)、(二)P2载体构建中(4)、(三)P3载体构建中(4)中的PCR采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerases克隆试剂盒进行；PCR反应体系均为50μL：每个模板的量均为25ng-100ng，上游引物10mM2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；酶混合物为采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerases克隆试剂盒中的相应试剂。PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
总的来说，基因表达盒的建立需经过2轮PCR克隆，第一轮片段克隆采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerases或Phusion Plus DNA聚合酶克隆试剂盒获得基础片段。PCR反应体系均为50μL：由1μL模板，10mM的上游引物和10mM的下引物各2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL组成。PCR反应程序为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，-20℃冰箱中保存；第二轮融合PCR采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerases克隆试剂盒获得基础片段相连的基因表达盒，参与融合PCR的各个片段模板需相同浓度(25ng-100ng)，PCR反应程序及其余步骤均同第一轮PCR。最后获得的基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建重组载体。
以上获得的重组载体转化大肠杆菌TransT1保存，重组单菌落送测序公司测序。经测序确认无误后进行保种。方法为50％(W/V)甘油与菌液按1:1加入保种管，充分混匀后放入-80℃超低温冰箱中保存。
实施例2：重组菌株构建
(一)载体的线性化
(1)以所得的P1基因盒重组载体为模板，采用引物LEU2-up-F和UAS+pTDH3-R经PCR扩增获得LKG-1线性化片段；
(2)以所得的P2基因盒重组载体为模板，采用引物pTDH3+UAS-F和EGFP+tPFK-R进行PCR扩增获得LKG-2线性化片段；
(3)以所得的P3基因盒重组载体为模板，采用引物tPFK1+EGFP-F和LEU2-R进行PCR扩增获得LKG-3线性化片段；
以上PCR克隆采用Q5 High-Fidelity DNA Polymerases克隆试剂盒获取线性化片段。PCR反应体系均为50μL：由1μL模板，10mM的上游引物和10mM的下引物各2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL组成。酶混合物为采用Q5High-Fidelity DNA Polymerases克隆试剂盒中的相应试剂。PCR反应程序为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。
(二)酵母转化
取10ul酵母菌株甘油菌或活化后平板上的单菌落于2mL-3mL的YPD培养基中，放在30℃，200rpm摇床中过夜培养；将培养的菌液转至20mL YPD培养基中，使其初始OD值为0.2，在30℃，200rpm的摇床中培养3～4h至OD为0.6～0.9；无菌50mL离心管收菌，5000rpm离心5min，倒掉上清液，加入20mL无菌水洗涤一次，5000rpm离心5min之后倒掉上清液；加入1mL100mM LiAc洗涤，转移至无菌1.5mL管，8000rpm离心30s，弃上清液；加入200ul 100mM LiAc重悬，分装50ul到新无菌1.5mL cp管中，8000rpm离心30s，吸出上清液；分别加入无菌240ul50％(W/V)PEG4000 36ul 1M LiAc，10ul 10mg/mL鲑鱼精DNA，(400-800ng)基因表达盒重组片段(即加入400-800ng LKG-1线性化片段、400-800ng LKG-2线性化片段、400-800ng LKG-3线性化片段，三者浓度相同)和ddH2O补足至360ul，吹吸混匀。在30℃孵育30min，42℃孵育30min，涂于YPD+G418平板，在30℃培养箱中倒置培养2-3天。
将所得的LKG-1、LKG-2、LKG-3线性化片段一起转入起始菌株ZW04BY，其线性化后在酵母基因组中组合的插入片段如图2所示，在YPD+G418平板中于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子进行发酵测产，获得的高产人参皂苷Rg3的工程菌株。
实施例3：产人参皂苷Rg3的酿酒酵母基因工程菌的应用
1.工程菌的培养及产物提取
分别采用实施例2中重组菌生产人参皂苷Rg3。具体方法如下：活化重组菌，于YPD培养基中30℃、220rpm条件下培养48h，得到种子液。将种子液以1％的接种量接种于30mlYPD培养基中，在30℃、220rpm震荡培养4天。发酵结束后，取500微升发酵液与500微升甲醇充分混匀，超声30分钟，12000rpm离心20分钟。取200微升进行产物检测。
2.HPLC、LC-MS检测条件
HPLC分析：仪器：安捷伦超高效液相色谱仪1200；色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C18(100mm×3.0mm，2.7μm)，紫外检测器，检测波长203nm；流动相：A相为纯水；B相为乙腈；起始浓度：A:85％、B:15％，流速：0.9mL/min。进样体积5μL。
柱温：30℃，检测器：PDA检测器。梯度洗脱程序：采用线性梯度洗脱，(浓度为B相百分比)0-7min 15％ B线性变化至30％ B，7-11min 30％ B线性变化至40％ B，11-17min40％ B线性变化至42％ B，17-25min 42％B线性变化至100％ B，25-27min保持100％ B。重组菌株的发酵产物的HPLC检测图如图3所示。
LC-MS测量使用Micro ToF MS(Bruker Daltonics)配备HP1100系列LC系统(安捷伦科技)，质谱参数：采用Dual AJS ESI离子源，离子扫描模式为ESI负离子或正离子扫描；扫描范围：m/z 100～1700。重组菌株产生人参皂苷Rg3的LC-MS检测图如图4所示。
3.结果
重组菌株发酵产量如图5所示，重组菌株KLG31人参皂苷Rg3产量为254.07±56.49mg/L。其中，副产物为35.42±5.37mg/L的人参皂苷Rh2和721.36±71.37mg/L的PPD。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
Figure BDA0003947629860000111
Figure BDA0003947629860000121
SEQ ID NO.2
Figure BDA0003947629860000122
Figure BDA0003947629860000131
SEQ ID NO.3
Figure BDA0003947629860000132

Claims (7)

1.一种生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌，其特征在于：将糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT31进行酵母密码子优化，分别在组合型启动子和G418抗性标签的作用下，插入ZW04BY酵母基因组的δ序列多拷贝位点，获得生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌；
所述优化后的糖基转移酶PnUGT50的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；所述组合型启动子的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；所述优化后的糖基转移酶PnUGT31的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母基因组中整合过表达原人参二醇至人参皂苷Rg3中的所有基因，包括原人参二醇合成酶PPDS、糖基转移酶PnUGT50和糖基转移酶PnUGT31。
3.权利要求1所述的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)P1基因盒重组载体的构建：
(1.1)以酵母菌株ZW04BY基因组为模板，采用引物LEU(Dn)+pADH 1-F和LEU2-R进行PCR扩增，获得同源臂下游片段；
(1.2)以质粒pHDE-Cas9为模板，采用引物KANMX+LEU(up)-F和KANMX+HindIII-RPCR进行PCR扩增，获得G418片段；
(1.3)以质粒UASTEF1+CIT1+CLB2为模板，采用引物UAS+PTDH3-R和UAS+KANMX-FPCR进行PCR扩增，获得UAS片段；
(1.4)将获得的同源臂下游片段、G418片段、UAS片段为模板，引物Leu2-up-F和UAS+pTDH3-R经融合PCR扩增，获得P1基因盒；
(1.5)P1基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P1基因盒重组载体；
(2)P2基因盒重组载体的构建：
(2.1)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物pTDH3+UAS-F和pTDH3+sPn50-R进行PCR扩增，获得启动子TDH3片段；
(2.2)以质粒PnUGT50为模板，采用引物sPn50+EGFP-R和sPn50+pTDH3-F进行PCR扩增，获得SnyPn50片段；
(2.3)以质粒pT4-CMV-GFP为模板，采用引物EGFP+sPnUGT50-F和EGFP+tPFK1-R进行PCR扩增，获得EGFP序列；
(2.4)将获得的TDH3、SnyPn50、EGFP为模板，采用引物pTDH3+UAS-F和EGFP+tPFK-R经融合PCR扩增，获得P2基因盒；
(2.5)P2基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P2基因盒重组载体；
(3)P3基因盒重组载体的构建：
(3.1)以酵母菌株ZW04BY基因组为模板，采用引物Leu2-up-F和LEU2(up)+KANMX-R进行PCR扩增，得到同源臂上游片段；
(3.2)以酵母菌株W303基因组为模板，采用引物tPFK1+EGFP-F和引物PNUGT31+tPFK1+SmaI-R进行PCR扩增，获得tPFK1片段；
(3.3)以PnUGT31为模板，采用引物PNUGT31+tPFK1-F和pADH 1+LEU2(Dn)-R进行PCR扩增获得PN UGT31片段；
(3.4)将获得的tPFK1、PNUGT31、同源臂上游片段为模板，引物tPFK1+EGFP-F和LEU2-R经融合PCR扩增，获得P3基因盒；
(3.5)P3基因盒通过pEASY-Blunt Cloning Kit连接pEASY载体构建P3基因盒重组载体；
(4)生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的获得：
将所得的P1基因盒、P2基因盒和P3基因盒重组载体质粒线性化一起转入起始菌株ZW04BY，在含有200mg/L G418的YPD固体平板中，于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子进行发酵测产，获得的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌。
4.根据权利要求1所述的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1.1)～(1.3)、(2.1)～(2.3)、(3.1)～(3.3)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
5.根据权利要求1所述的生产人参皂苷Rg3的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1.4)、(2.4)、(3.4)中PCR反应体系均为50μL：模板1μL，上游引物10mM 2μL，下游引物10mM 2μL，酶混合物25μL，去离子水补足50μL；PCR反应程序均为：94℃、5min；94℃、30S，56℃、1.5min，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
6.一种人参皂苷Rg3的制备方法，其特征在于，将如权利要求1～2任一项所述的酿酒酵母工程菌发酵，从发酵液中获得人参皂苷Rg3。
7.根据权利要求6所述的人参皂苷Rd的制备方法，其特征在于，发酵培养基的配方为20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸粉，余量为水，发酵温度条件为30℃。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116396876A (zh) * 2022-11-17 2023-07-07 云南农业大学 一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484389A (zh) * 2013-09-05 2014-01-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用
CN104232723A (zh) * 2013-06-07 2014-12-24 中国科学院上海生命科学研究院 一组糖基转移酶及其应用
CN110343678A (zh) * 2019-06-12 2019-10-18 云南农业大学 一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用
CN114150012A (zh) * 2021-11-17 2022-03-08 天津大学 异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母及其构建方法
CN116396876A (zh) * 2022-11-17 2023-07-07 云南农业大学 一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232723A (zh) * 2013-06-07 2014-12-24 中国科学院上海生命科学研究院 一组糖基转移酶及其应用
CN103484389A (zh) * 2013-09-05 2014-01-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 产人参皂苷元的重组酿酒酵母及其构建方法与应用
CN110343678A (zh) * 2019-06-12 2019-10-18 云南农业大学 一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用
CN114150012A (zh) * 2021-11-17 2022-03-08 天津大学 异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母及其构建方法
CN116396876A (zh) * 2022-11-17 2023-07-07 云南农业大学 一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SUK-CHAE JUNG等: "Two Ginseng UDP-Glycosyltransferases Synthesize Ginsenoside Rg3 and Rd", 《PLANT CELL PHYSIOL.》, 14 October 2014 (2014-10-14) *
YUAN LIN等: "Reconstruction of engineered yeast factory for high yield production of ginsenosides Rg3 and Rd", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》, 19 June 2023 (2023-06-19) *
朱大伟;王宇;李玉花;: "真菌β-葡萄糖苷酶在转化人参皂苷单体中的应用进展", 天然产物研究与开发, no. 06, 15 June 2017 (2017-06-15) *
李晓波;杨紫刚;沈勇;孟珍贵;陈军文;张广辉;杨生超;: "HPLC法同时测定野三七中三七皂苷R_1及人参皂苷Rg_1、Rb_1、Rd的含量", 中国药师, no. 10, 5 October 2012 (2012-10-05) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116396876A (zh) * 2022-11-17 2023-07-07 云南农业大学 一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法

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