CN113278638A

CN113278638A - 一种高产庆大霉素c组分的工程菌及其构建

Info

Publication number: CN113278638A
Application number: CN202110463433.0A
Authority: CN
Inventors: 董泽武; 常莹莹; 满航; 张徳重; 严宝冬; 孙明
Original assignee: Heilongjiang Green Health Biotechnology Co ltd
Current assignee: Heilongjiang Green Health Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2021-08-20

Abstract

本发明提供了一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建，通过GenP过表达以提升庆大霉素C组分产量的策略及所得高产工程菌，GenP过表达策略可通过位点整合和同源重组两种构建方式获得，使庆大霉素C组分(C1、C1a、C2、C2a)产量提高了34.5％，有望有效降低硫酸庆大霉素产品的生产成本。

Description

一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建。

背景技术

庆大霉素是由刺孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)产生的氨基糖苷类抗生素。它由2-脱氧链霉胺和两个糖基(加拉糖胺和绛红糖胺)组成，因C6’位甲基化程度不同而分为C1、C1a、C2、C2a及C2b五种组分。庆大霉素通过与靶细胞内核糖体30S亚基16S rRNA上的氨酰基位点结合，引起mRNA错译，从而干扰蛋白质的合成杀死病原菌。由于其具有广谱的抗菌活性和速效杀菌性，且价格低廉，被广泛应用于临床治疗革兰氏阴性菌感染，特别是对于具有多重耐药性的病原体感染，其具有良好的治疗效果。

在企业实际生产中，随着庆大霉素工业菌株的多次传代，菌株容易出现退化，庆大霉素产量有所下降，制约了庆大霉素的生产，因此寻求合适的策略以提升工业菌株庆大霉素C产量成为亟待解决的问题。传统的自然选育或人工诱变的方式，具有很大的随机性，缺少快速的筛选方法，使得定向获得庆大霉素C高产菌株极其困难，而依托理性的代谢工程改造以提高合成途径中中间体的转化效率，有望快速实现庆大霉素C的高产。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建，以解决传统的自然选育或人工诱变的方式，具有很大的随机性，缺少快速的筛选方法，使得定向获得庆大霉素C高产菌株极其困难的问题，快速实现庆大霉素C的高产。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种高产庆大霉素C组分的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二目的在于提供上述基因在构建高产庆大霉素C组分工程菌中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种高产庆大霉素C组分工程菌YC001、 YC003和YC004，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为 CCTCC No.M2021345，No.M2021346，No.M2021347。

本发明的第四目的在于上述高产庆大霉素C组分工程菌的构建方法，其特征在于：采用位点整合或同源重组进行构建。

位点整合型构建是通过attP整合位点将带有目的基因的质粒整个整合到基因组attB位点处，这样构建的菌株需要抗生素来维持其稳定性，否则会出现质粒的丢失，同时，质粒的存在可能会一定程度降低目标产物的产量，但是此构建周期较同源重组短，而同源重组构建是利用同源臂的重组仅将目的基因整合到染色体的固定位置，为稳定菌株，无需添加抗生素，对于工业生产来说，倾向于使用同源重组方式得到的稳定菌株。

优选地，位点整合包括以下步骤：

(1)以位点整合型质粒为载体，构建不同启动子控制GenP表达的质粒，所述质粒包括启动子、genP基因，启动子控制genP的表达；

(2)通过大肠杆菌介导的三亲本接合转移方法将所述质粒导入刺孢小单孢菌原始菌株；

(3)位点整合方式的GenP过表达菌株的筛选，首先筛选硫链丝菌素抗性菌株，后提取基因组进行PCR验证，筛选成功导入启动子-genP片段的菌株。

优选地，同源重组包括以下步骤：

(1)以复制型质粒为载体，构建GenP表达的同源重组质粒，所述质粒包括rpsLp-cf启动子、genP基因、上下同源臂，rpsLp-cf启动子控制genP 的表达；

(3)GenP过表达菌株的筛选，首先筛选有硫链丝菌素抗性菌株，经传代从中筛选硫链丝菌素敏感菌株，进而提取基因组进行PCR验证，筛选出 rpsLp-cf-genP片段正确整合于染色体的菌株。

本发明的第五目的在于的高产庆大霉素C组分工程菌在生产庆大霉素C 组分的应用。

相对于现有技术，本发明所述的高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建具有以下有益效果：

通过GenP过表达以提升庆大霉素C组分产量的策略及所得高产工程菌， GenP过表达策略可通过位点整合和同源重组两种构建方式获得：一方面，使用链霉菌中常用启动子ermE*、rpsLp-cf分别控制GenP表达，利用attB/attP 位点整合方式构建对应的GenP过表达工程菌YC001、YC003，使庆大霉素 C组分(C1、C1a、C2、C2a)产量分别提高了16.9％、18.8％；另一方面，使用rpsLp-cf启动子控制GenP表达，利用同源重组方式构建稳定整合在菌株染色体上的GenP过表达工程菌YC004，使庆大霉素C组分(C1、C1a、 C2、C2a)产量提高了34.5％。有望有效降低硫酸庆大霉素产品的生产成本。

生物保藏说明：

YC001，分类命名：刺孢小单孢菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2021345，保藏日期：2021年4月9日。

YC003，分类命名：刺孢小单孢菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2021346，保藏日期：2021年4月9日。

YC004，分类命名：刺孢小单孢菌，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2021347，保藏日期：2021年4月9日。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为M.echinosporaJ1-020染色体简图；由外到内依次为编码基因(正义链)、编码基因(负义链)、tRNA和rRNA、CRISPR和基因岛、GC比、 GC-skew、测序深度；方框：庆大霉素合成基因簇位置；

图2为attB/attP位点整合方式的GenP过表达菌株构建原理及产量图；其中，A图为genP过表达的位点整合型质粒构建示意图；B图为工程菌 YC001、YC003与原始菌株M.echinosporaJ1-020庆大霉素产量对比图；

图3为同源重组方式的GenP过表达稳定菌株构建原理、PCR验证及产量图；其中，A图为genP过表达的同源交换及工程菌筛选验证原理图；B 图为工程菌筛选PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中，1、2和3号菌株为目标工程菌，4、5、6和7号菌株为回复到野生型菌株；C图为工程菌YC004 与原始菌株M.echinosporaJ1-020庆大霉素产量对比图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

以下实施例中所涉及的几种大肠杆菌和放线菌穿梭质粒均为本领域技术人员公知质粒。其中pWHU77、pYH7由武汉大学孙宇辉课题组提供， pWHU77质粒由pIB139以硫链丝菌素和氨苄青霉素抗性替换阿泊拉霉素抗性得到，属于位点整合型质粒(Specificity andpromiscuity at the branch point in gentamicin biosynthesis，Chemistry&biology，2014)，pYH7质粒为pIJ101衍生质粒，属于复制型质粒(Analysis of functions inplasmid pHZ1358 influencing its genetic and structural stability inStreptomyces lividans 1326，Appl Microbiol Biotechnol，2009)； pN2由武汉大学刘天罡课题组提供，包含rpsLp-cf启动子片段(Development of Streptomycessp.FR-008as anemerging chassis，Synthetic and Systems Biotechnology，2016)。刺孢小单孢菌原始菌株M.echinospora J1-020来自黑龙江格林赫思生物科技有限公司的工业生产菌株。

实施例1：GenP核苷酸序列的确定

M.echinosporaJ1-020全基因组测序由武汉未来组生物科技有限公司使用PromethION测序平台完成，测序了1个cell，质控后的数据用flye(参数： --nano-raw)进行组装后，用racon(参数：default)结合三代测序数据进行矫正，用pilon(参数：default)和nextpolish(参数：default)结合二代测序数据进行矫正。编码基因用prodigal(参数：-pNone-g 11)进行预测，保留完整的CDS。825.95Mb的测序数据组装成一个7,294,917bp大小的基因组，其包含6260个预测的完整编码区，平均GC含量为72.41％(图1)。

利用COG、KEGG、GO、Refseq、Pfam和TIGRFAMs数据库对编码蛋白进行功能注释。使用antiSMASH 3.0软件预测次级代谢产物合成基因簇，最终确定了M.echinosporaJ1-020基因组上存在与先前报道的M. echinosporaATCC15835庆大霉素合成基因簇(GenBank登录号：KY971520) 的基因序列一致性达到96.08％的基因簇，位于基因组上2,726,320 bp-2,768,160bp位置(图1)。通过BlastP同源比对，定位到GenP，得到 genP序列信息。

实施例2：attB/attP位点整合方式的GenP过表达菌株构建

步骤1：不同启动子控制的GenP过表达的位点整合型质粒构建

Primer 1:5’CCACATATGGTGAAGATGGTTGCAGCACC 3’

Primer 2:5’TACGAATTCTCAGAGAAATTCGTCCAGCAG 3’

Primer 3:5’GCGAGTGTCCGTTCGAGTGG 3’

Primer 4:5’TCAGAGAAATTCGTCCAGCAG 3’

Primer5:5’AGGTCGACTCTAGTATGCATTCTAGAGGAACGATCGTTGGCTGCCCGCCGCGGGCGCTG 3’

Primer6:5’GGTGCTGCAACCATCTTCATATGGCGTATCCCCTTTCAGATA C 3’

Primer 7:5’TCTGAAAGGGGATACGCCATATGAAGATGGTTGCAGCACC 3’

Primer8:5’TTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCTCAGAGAAATTCGTCCAGCAG 3’

Primer 9:5’GGAACGATCGTTGGCTGCCCGCCGCGGGCGCTG 3’

以pWHU77质粒作为位点整合型质粒构建的载体，以M. echinosporaJ1-020基因组为模板、Primer 1/Primer 2为引物扩增得到 001-genP片段，得到的片段与载体均使用NdeI/EcoRI双酶切，后酶连、转化大肠杆菌DH10b感受态，得到的转化子进行菌落PCR验证，并提取质粒进行酶切及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变，验证正确质粒命名为pXS001；以pN2为模板、Primer 5/Primer 6为引物扩增得到rpsLp-cf片段，以M.echinosporaJ1-020基因组为模板、Primer 7/Primer 8为引物扩增得到003-genP片段，rpsLp-cf片段、003-genP片段与经过XbaI/EcoRI酶切的pWHU77载体使用多片段一步法快速克隆试剂盒(翊圣生物科技有限公司，中国)进行组装，组装产物转化大肠杆菌DH10b感受态，得到的转化子同pXS001验证方式进行验证，验证正确质粒命名为 pXS003。

步骤2：位点整合型质粒的接合子制备

质粒测序正确后，转化入DH10B中，挑取单克隆，于含有100μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，作为供体菌，同时于含有50 μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中培养菌株ET12567 (pUB307)，37度培养过夜，供体菌和ET12567(pUB307)过夜培养菌液均以1/100体积比分别转接至4mL含相应抗生素的LB中培养OD至0.6～0.8，离心收集菌体，等体积无抗LB洗涤菌体三次，后用100μL无抗LB重悬，得大肠杆菌悬浮液，备用。

将50mL使用平板液体培养基(玉米淀粉3％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.01％，硝酸钾0.3％，碳酸钙0.6％，pH7.2)培养至生长对数期的M.echinosporaJ1-020菌液离心，收集菌体，等体积LB洗涤菌体两次，5mL无抗LB重悬，作为受体菌。

将100μL供体菌悬液、100μL ET12567(pUB307)悬液和100μL受体菌悬液混合，均匀涂布于含有30mM Mg²⁺的ABB13平板，37度培养14～16 h，使用硫链丝菌素(12.5μg/mL)和甲氧苄啶(40μg/mL)覆盖平板，37度继续培养6-9d，长出接合子。

步骤3：位点整合方式的GenP过表达菌株的筛选

接合子在含硫链丝菌素(25μg/mL)的平板固体培养基(玉米淀粉3％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.2％，磷酸二氢钾0.01％，硝酸钾0.3％，碳酸钙 0.6％，琼脂2％，pH7.2)平板上培养，pXS001、pXS003对应的接合子培养所得的菌落提取基因组后，分别使用引物Primer 3/Primer 4、Primer 9/Primer 4进行PCR验证，验证正确菌株对应命名为YC001、YC003。

步骤4：工程菌株发酵及代谢产物分析

将于斜面培养基(可溶性淀粉1.0％，硝酸钾0.2％，磷酸氢二钾0.06％，氯化钠0.05％，碳酸钙0.1％，天冬酰胺0.002％，琼脂条1.6％，麸皮2.0％，pH 7.2)平板培养的工程菌取1×2cm菌块于50mL发酵培养基(玉米淀粉 6.0％，黄豆饼粉2.0％，硫酸铵0.3％，硝酸钾0.05％，葡萄糖0.3％，蛋白胨 0.60％，氯化钴0.0001％，碳酸钙0.60％)中，35度、250rpm培养70h后，加入1mL强酸性阳离子树脂，后继续培养至135h。

发酵结束后，使用6N硫酸调节pH至约2.0，静置40min，用水清洗得到树脂，加入10倍体积的氨水(浓度不大于5％)洗脱，轻柔颠倒12h，后过膜并进行HPLC-ELSD检测。检测方法：色谱柱为月旭C18，250mm×4.6mm， 5μL；流动相：A相为1.5％三氟乙酸的水溶液，B相为纯甲醇溶液，A相： B相＝96:4，流速0.6mL/min，等度洗脱；进样量20μL；雾化器温度100度，气体流速2.5L/min；检测时间：65min。通过HPLC-ELSD检测对庆大霉素 C组分(C1、C1a、C2、C2a)进行定量。

结果如图2B所示，ermE*、rpsLp-cf启动子控制genP的GenP过表达工程菌YC001、YC003的庆大霉素C组分(C1、C1a、C2、C2a)产量较野生型菌株M.echinosporaJ1-020(1008±57mg/L)分别提高了16.9％(1178± 39mg/L)、18.8％(1198±46mg/L)。

实施例3：同源重组方式的GenP过表达稳定菌株构建

步骤1：GenP过表达的复制型质粒构建

Primer10:5’ACCTGCAGGTCGACTCTAGACACGTCTGAAGCTAGCGCACGTATCCTGGAGAATCCGTC 3’

Primer11:5’CCTCCAGCGCCCGCGGCGGGCAGCCAACGATCGTTCCTCACGCCTTGTGGATCGCCACC 3’

Primer12:5’CCTGGTGGCGATCCACAAGGCGTGAGGAACGATCGTTGGCTGCCCGCCGCGGGCGCTGG 3’

Primer13:5’AGACCACCGCGATCGTCGAGCGCCTCTGGGAGGACTGATCAGAGAAATTCGTCCAGCAG 3’

Primer14:5’GCTGACCTACATCCAACTGCTGGACGAATTTCTCTGATCAGTCCTCCCAGAGGCGCTCG 3’

Primer15:5’TAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCAGCGTGGACGGTGTCGAGTGCG 3’

Primer 16:5’CCGTTCACCGTGCCCTGGCTGCGCGAGGTG 3’

Primer 17:5’CTCGACCCGGCCGTCTGGATCGTGGCGAAG 3’

以复制型穿梭质粒pYH7为载体，以pXS003为模板、Primer 12/Primer 13 为引物扩增得到rpsLp-cf-genP片段，以M.echinosporaJ1-020基因组为模板、分别以Primer 10/Primer 11、Primer 14/Primer 15为引物扩增得到左右同源臂片段，扩增得到的3个片段与经过NheI/EcoRI酶切后的pYH7载体使用多片段一步法快速克隆试剂盒进行组装，组装产物转化大肠杆菌DH10b感受态，得到的转化子进行菌落PCR验证，并提取质粒进行酶切及测序验证，验证正确质粒命名为pXS004。

步骤2：复制型质粒的接合子制备及工程菌筛选

接合子制备方法与实施例2相同，长出的接合子在含有硫链丝菌素 (25μg/mL)的平板培养基平板上培养以验证抗性，后在5mL无抗平板液体培养基中培养2-3代，传代后所得菌液稀释涂板，长出的单菌落在含硫链丝菌素(25μg/mL)和无抗的平板培养基平板上影印验证抗性，将在抗性平板上不生长、无抗平板上生长的菌株提取基因组，使用引物Primer16/Primer17 进行PCR验证，验证正确菌株命名为YC004(图3AB)。

步骤3：工程菌株发酵及代谢产物分析

菌株发酵及代谢产物检测方法同实施例2。

结果如图3C，rpsLp-cf启动子控制genP过表达的片段以同源重组方式稳定整合到菌株染色体上的工程菌YC004的庆大霉素C组分(C1、C1a、 C2、C2a)产量(1427±37mg/L)较野生型菌株M.echinosporaJ1-020(1061 ±37U/mL)提高了34.5％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 黑龙江格林赫思生物科技有限公司

<120> 一种高产庆大霉素C组分的工程菌及其构建

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 刺孢小单孢菌(M. echinospora J1-020)

<400> 1

gtgaagatgg ttgcagcacc gataccggtg gctggctggg gtgacaagga cgacccgtgg 60

gagtgcctgg gcgagcgttc gtccggcgcg acggtctacc gcgtggggga gggaccctcc 120

ttctacgtga agaccacgcc gcccaggcac cccgacgacc accggttcaa cccgaccaag 180

gaggccgagc ggctccgctg gctggccgcc cagggactgc ccgtccccga ggtggtggcc 240

ctcgacgcca acgacgaact ggcgtgggtg gtcaccaggg cgctgcccgg gcggcccgcc 300

gcccggcact ggaagccgga ggaacgctgg cgggtgatcg acgtcgtcgc cgacgtcgca 360

cgcacgctgc acgcgcttcc ggtggcggag tgcccgttcg agcgtcggct ggccgacctg 420

atccaccagg ccagctcctc gatggcgctg ggcgcgctcg acctcgacga cgtggacccc 480

tcgcacgagg gctggacggc tcagcagctc tgggacgagc tgagcaagat gacacccccg 540

gccgaggacg atctcgtcgt ctgccacggt gacttctgcc tcgacaacgt gctggtcgat 600

ccggagacgc tgaccctggc cggcgtcctc gacgtcgacc gggccggagt gtcggaccgg 660

tggatggacc tcgccctggc gctgtacaac atcggccagg acgacgtctg gggttacgga 720

ccgccgcacg ccgagcactt cctccggcgg tacggcatca gcgtcaacca gcacaagctg 780

acctacatcc aactgctgga cgaatttctc tga 813

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 刺孢小单孢菌(M. echinospora J1-020)

<400> 2

Val Lys Met Val Ala Ala Pro Ile Pro Val Ala Gly Trp Gly Asp Lys

1 5 10 15

Asp Asp Pro Trp Glu Cys Leu Gly Glu Arg Ser Ser Gly Ala Thr Val

20 25 30

Tyr Arg Val Gly Glu Gly Pro Ser Phe Tyr Val Lys Thr Thr Pro Pro

35 40 45

Arg His Pro Asp Asp His Arg Phe Asn Pro Thr Lys Glu Ala Glu Arg

50 55 60

Leu Arg Trp Leu Ala Ala Gln Gly Leu Pro Val Pro Glu Val Val Ala

65 70 75 80

Leu Asp Ala Asn Asp Glu Leu Ala Trp Val Val Thr Arg Ala Leu Pro

85 90 95

Gly Arg Pro Ala Ala Arg His Trp Lys Pro Glu Glu Arg Trp Arg Val

100 105 110

Ile Asp Val Val Ala Asp Val Ala Arg Thr Leu His Ala Leu Pro Val

115 120 125

Ala Glu Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ala Asp Leu Ile His Gln Ala

130 135 140

Ser Ser Ser Met Ala Leu Gly Ala Leu Asp Leu Asp Asp Val Asp Pro

145 150 155 160

Ser His Glu Gly Trp Thr Ala Gln Gln Leu Trp Asp Glu Leu Ser Lys

165 170 175

Met Thr Pro Pro Ala Glu Asp Asp Leu Val Val Cys His Gly Asp Phe

180 185 190

Cys Leu Asp Asn Val Leu Val Asp Pro Glu Thr Leu Thr Leu Ala Gly

195 200 205

Val Leu Asp Val Asp Arg Ala Gly Val Ser Asp Arg Trp Met Asp Leu

210 215 220

Ala Leu Ala Leu Tyr Asn Ile Gly Gln Asp Asp Val Trp Gly Tyr Gly

225 230 235 240

Pro Pro His Ala Glu His Phe Leu Arg Arg Tyr Gly Ile Ser Val Asn

245 250 255

Gln His Lys Leu Thr Tyr Ile Gln Leu Leu Asp Glu Phe Leu

260 265 270

Claims

1.一种高产庆大霉素C组分的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的基因在构建高产庆大霉素C组分工程菌中的应用。

3.高产庆大霉素C组分工程菌YC001、YC003和YC004，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC No.M2021345，No.M2021346，No.M2021347。

4.权利要求3所述的高产庆大霉素C组分工程菌的构建方法，其特征在于：采用位点整合或同源重组进行构建。

5.根据权利要求4所述的高产庆大霉素C组分工程菌的构建方法，其特征在于：位点整合包括以下步骤：

6.根据权利要求4所述的高产庆大霉素C组分工程菌的构建方法，其特征在于：同源重组包括以下步骤：

(1)以复制型质粒为载体，构建GenP表达的同源重组质粒，所述质粒包括rpsLp-cf启动子、genP基因、上下同源臂，rpsLp-cf启动子控制genP的表达；

(3)GenP过表达菌株的筛选，首先筛选有硫链丝菌素抗性菌株，经传代从中筛选硫链丝菌素敏感菌株，进而提取基因组进行PCR验证，筛选出rpsLp-cf-genP片段正确整合于染色体的菌株。

7.权利要求4-6任一项所述的高产庆大霉素C组分工程菌在生产庆大霉素C组分的应用。