CN103740627A - 庆大霉素ji-20b基因工程菌及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了庆大霉素JI-20B基因工程菌、构建与应用，属生物医药技术领域。本发明通过构建专一性穿梭载体pFD605，利用分子遗传学技术，导入小单孢菌，借助框内缺失原理，准确敲除绛红小单孢菌中的genB3和genP基因，永久灭活其生物催化功能，利用抗性标记，筛选双交换突变株MicromonosporapurpureaB3P1220（ΔgenB3P（gntJI））。突变株经发酵，提取代谢产物，结构分析，确认与预测吻合，定向合成庆大霉素JI-20B。本发明所构建工程菌B3P1220，不含任何抗性标记，庆大霉素JI-20B产量稳定。

Description

庆大霉素JI-20B基因工程菌及其构建与应用

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及庆大霉素JI-20B化合物的研制，包括庆大霉素JI-20B工程菌的构建及其制备，可应用于抗生素制药领域。 

背景技术

小单孢菌（Micromonospora）是一属能产生多种具有临床应用价值药物的微生物，在先后报道的60 种小单孢菌中，有40 多种产生抗生素，其中包括大环内酯类、氨基糖苷类、安莎类和蒽环类等。小单孢菌不仅可以产生链霉菌所产生的抗生素，还产生庆大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin) 等。小单孢菌具有合成潜在药物的巨大潜力，日益受到科学家的重视。 

庆大霉素(Gentamicin，GM) 可由绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)、棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora ）等稀有放线菌，经发酵生产氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用，对绿脓杆菌特别有效。是目前我国大规模生产的重要抗生素，可供全世界需要，成为我国大量出口的特色原料药。更为重要的是庆大霉素生物合成中间体，是开发新药的源泉，但至今未能取得显著突破，关键是获得庆大霉素生物合成中间体非常困难。 

庆大霉素各组分在结构上很接近，分别由绛红糖胺、2-脱氧链霉胺和加洛糖胺通过糖苷键连接而成。根据分子结构的差异可以分为庆大霉素C，庆大霉素A，庆大霉素B 和庆大霉素X 族等。庆大霉素C 是主组分。因绛红糖胺C6上的甲基化程度不同，形成了庆大霉素C1、C2 、C2a和C1a等。最新研究发现，氨基糖苷类抗生素还具有抗肿瘤和抗病毒[Henna Kim, Mi-Kyung Lee, Junsang Ko, Chin-Ju Park, Meehyein Kim, Yujeong Jeong, Sungwoo Hong, Gabriele Varani, Byong-Seok Choi. Aminoglycoside antibiotics bind to the influenza A virus RNA promoter. Mol. BioSyst ., 2012, 8, p2857–2859；Maruthi Chittapragada, Sarah Roberts and Young Wan Ham. Aminoglycosides: Molecular Insights on the Recognition of RNA and Aminoglycoside Mimics. Perspectives in Medicinal Chemistry 2009,3, p 21–37.]等新功效。庆大霉素JI-20B具有抗菌、抗原虫等功能，还是进一步合成抗病毒，抗肿瘤药物的重要前体。 

基于本研究在国内首先完成构建了庆大霉素生物合成基因文库（Genbank accession No.:JQ975418），国内外科学家对氨基糖苷类抗生素的生物合成途径理论推测逐步阐明[Sung Ryeol Park, Je Won Park, Yeon Hee Ban, Jae Kyung Sohng, Yeo Joon Yoon. 2-Deoxystreptamine-containing aminoglycoside antibiotics: Recent advances in the characterization and manipulation of their biosynthetic pathways. Nat. Prod. Rep. , 2013, 30, p11-20],为开发庆大霉素生物合成中间体奠定了重要基础。根据这一重要资源优势，引发了发明系列庆大霉素生物合成中间体的研制与开发，并取得了显著效果。 

根据生物信息学技术分析，genB3（gntJ）基因编码C6`氨基转移酶，而genP(gntI)与3’，4’双脱氧相关。因此，如果敲除这两个基因，将得到主产JI-20B的工程菌。 

科学研究所需的微量庆大霉素JI-20B是从庆大霉素的发酵液中分离得到。从庆大霉素生物合成途径中,制备庆大霉素JI-20B，非常困难。这种制备方法，工艺复杂，操作困难，条件难以控制，成本高，收率低，最终得到的目标产物,其纯度仍然不一定能达到所需的要求，因此，更不适合于规模化生产，导致国内外至今在制备庆大霉素JI-20B上无法实现产业化。 

如果能得到庆大霉素JI-20B产生菌，则可以像普通发酵那样制备庆大霉素JI-20B，以上所有难题将迎刃而解。总之，筛选或构建有意义的特定类型工程菌，成了各国科学家研究的热点、难点与重点，成了开发新型氨基寡糖药物的技术核心和制高点。获得庆大霉素族系列工程菌，也就意味着向开发新型抗虫，抗病毒和抗肿瘤氨基寡糖类药物迈出了关键的一步。获得庆大霉素系列工程菌的方法主要有经典诱变育种法和基因工程育种法。现代生物技术的诞生，微生物分子遗传学技术的开发，为人工构建特定工程菌奠定了基础[Wenrong Hong, Lingbin Yan. Identification of gntK, a gene required for the methylation of purpurosamine C-6’ in gentamicin biosynthesis. J. Gen. Appl. Microbiol., 2012, 58, 349-356；严凌斌, 洪文荣, 方志锴, 封成军. 绛红色小单孢菌G1008接合转移体系的构建. 中国抗生素杂志, 2011,36(12), p1-5]，也为获得庆大霉素系列新型药物提供了全新的研究方向。 

基于已经发明制备庆大霉素C1a化合物专利（一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用；201110331534.9），填补了国内外研究空白，为进一步探索发明制备庆大霉素JI-20B等更多功能性氨基寡糖系列化合物创造了条件。庆大霉素JI-20B研制是在继发明制备庆大霉素C1a之后的又一新成果。 

发明内容

本发明的目的在于提供主产庆大霉素JI-20B工程菌，提供该突变工程菌的构建方法，以及该基因工程菌的应用。 

庆大霉素JI-20B基因工程菌，命名为 Micromonospora purpurea B3P1220(△genB3P ) 。保藏编号：CGMCC No.8287，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期：2013 年9 月27日。 

所述的庆大霉素产生菌灭活了genB3-genP/gntJ-gntI基因功能。 

构建基因工程菌的菌株为产庆大霉素的所有小单孢菌。 

庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法具体如下： 

本发明通过框架内删除失活的方法破坏绛红小单孢菌中的genB3P（gntJI）基因（SEQ ID No.1），主要包括以下步骤：

（1）灭活genB3P（gntJI）基因穿梭载体的构建

本发明借助PCR 技术，分别获得 genBP基因上下游片段2275bp和 2310bp，删除 genB3P基因内部875bp左右的保守序列，达到灭活基因功能的目的。构建的重组穿梭质粒pFD605，含有缺失875bp 保守序列的genB3P（gntJI）基因及其上下游部分序列。

其中，所述的灭活基因的方法包括基因敲除，基因替换和基因灭活。 

（2）穿梭载体pFD605导入小单孢菌 

将所述的重组穿梭质粒pFD605转化绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea G1008)，得到转化子。所述的转化方法为接合转移。

（3）双交换阻断株的筛选 

根据抗性表型筛选，获得同源双交换突变株，对突变株在分子水平进行验证。提取突变株染色体DNA，用专一性引物进行定点PCR扩增，电泳检测，DNA测序，序列比对分析，最终确定双交换工程菌的遗传物质发生了定点改变。

（4）工程菌发酵代谢产物分析 

工程菌发酵液经酸碱处理和树脂吸附，并除杂后采用HPLC-MS 等方法分析，确定其化学结构。

庆大霉素JI-20B基因工程菌在生产庆大霉素JI-20B组分中的应用。 

庆大霉素JI-20B基因工程菌在制备庆大霉素JI-20B中的应用。 

本发明通过基因工程方法，将负责庆大霉素生物合成基因簇上的genB3P（gntJI）基因敲除，得到了积累庆大霉素JI-20B产物。所得工程菌主产庆大霉素JI-20B，遗传背景清楚，不发生回复突变。 

本发明为规模化制备庆大霉素JI-20B提供完整的整套技术方案。本发明的核心技术是推测并证明了绛红色小单孢菌（Micromonospora purpurea）生物合成结构基因genB3P（gntJI，1353bp,807bp）的功能，借助独特的分子遗传学技术，敲除genB3P基因，精确地阻断了庆大霉素C1a支路的生物合成，得到了积累庆大霉素JI-20B工程菌，首次发明了利用人造工程菌，直接发酵规模化制备庆大霉素JI-20B的方法。庆大霉素JI-20B是很好的抗原虫药，也是进一步开发抗病毒、抗肿瘤药物的前体，应用前景广阔，将产生极大的经济效益和社会效益，为开发新型药物奠定坚实基础。 

附图说明

图1为庆大霉素JI-20B结构式。 

图2为庆大霉素JI-20B生物合成途径。 

图3为穿梭载体pFD605构建流程图。 

图4为工程菌发酵代谢产物的HPLC-MS分析结果，其中峰1= G-418；峰2和峰3 = JI-20B。 

具体实施方式

实施例1 ：穿梭载体pFD605的构建 

根据生物信息学技术，推测genB3P（gntJI）基因可能是分别负责催化庆大霉素生物合成途径中庆大霉素JI-20A和威大霉素合成的关键基因(图2)，灭活genB3P（gntJI）基因,有望阻断庆大霉素JI-20A和威大霉素的生物合成，主要积累庆大霉素JI-20B。根据绛红色小单孢菌（Micromonospora purpurea）中庆大霉素生物合成基因簇的DNA序列（Genbank accession No.: JQ975418），设计敲除genB3P（gntJI）基因策略,穿梭载体构建流程见图3。设计引物如下：

上游交换臂引物：P1：5’-GAATTCAGGTCACGGTCGATTTCAAC -3’（SEQ ID No.2）带有EcoRI酶切位点；P2： 5’-CTCGAGCTCCTTCTACGTGAAGACCAC -3’（SEQ ID No.3） 带有XhoI酶切位点。利用引物P1/P2扩增交换臂2275pb片段,命名为B3P1；

下游交换臂引物：P3: 5’–CTCGAGTACAACAGCTCCGGCGAGAT-3’（SEQ ID No.4） 带有XhoI酶切位点；P4: 5’–TCTAGTACGTCAACGTGCACGGGGT -3’（SEQ ID No.5）带有XbaI酶切位点。利用引物P3/P4扩增2310bp交换臂，命名为B3P2。

以绛红色小单孢菌G1008基因组作为PCR扩增模板，PCR 扩增到2275pb 和2310bp 两个片段，删除了genB3P基因中875bp 的关键序列。PCR 反应条件为：（1）95℃预变性5min ；（2）解链94℃×60s ；退火 62℃×60s ；延伸 72℃×2min ；30 个循环；（3）72℃×10 min。将PCR 产物B3P1和B3P2片段电泳回收，分别经TA-克隆到pMD-19上，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，获得重组质粒pFD601和pFD602；pFD601经XhoI和XbaI双酶切后，与经相同酶处理过的pFD602片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得重组质粒pFD603；pFD603经EcoRI XbaI双酶切后，与用相同酶处理过的pJTU412片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得重组质粒pFD604；pFD604经EcoRI单酶切后，插入安普霉素抗性基因，克隆产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆子，获得最终重组质粒，穿梭载体pFD605，穿梭载体构建完毕。 

实施例2 ：穿梭载体pFD605导入绛红小单孢菌 

将含有oriT 的穿梭载体pFD605转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002），得到供体菌E.coliET12567（pUZ8002：：pFD605）。将E.coliET12567（pUZ8002：：pFD605，）单菌落，接种于3 ml LB 培养基（含25μg/ml卡那霉素, 氯霉素25μg/ml和50 μg/ml安普霉素）中，37℃培养过夜，按10% 再次转种到50 ml含三种抗生素的LB 培养基中，37℃培养2.5-3.0 h，OD值为0.4-0.6，离心沉淀，收集细胞，用新鲜LB 培养基洗涤两次，最后将菌体悬浮于约2ml LB培养基或无菌水中，备用。 

小单孢菌孢子悬液制备： 

将新鲜孢子悬浮于5 mL 0.05 mol/L的TES（pH 8.0）缓冲液中，剧烈震荡以打散孢子；

a. 将孢子悬液置于37℃水浴中热激1min；

b. 冷却至室温后加等体积的预萌发培养基，混合均匀；

c. 于37℃摇床震荡培养2h；

d. 离心（8,000 rpm，5min），收集孢子并重悬浮于适量的TES中；

e. 在漩涡振荡器上打散孢子，作为受体菌。

将处理好的供体菌0.5 ml 与受体菌孢子悬液0.5 ml 于eppendorf 管中混合，离心沉淀，用少量的残液悬浮后涂布在小单孢菌平板培养基上。37℃培养20-24 h，用800 μl含安普霉素（浓度度50 μg/ml）和萘啶酮酸（终浓度25 μg/ml）的水溶液覆盖。37℃继续培养3-5d，直到平板上长出单菌落,即为接合子。 

实施例3 ：双交换工程菌的筛选 

将筛选得到的接合子在含有萘啶酸和安普霉素的平板上，于37℃下，连续培养2代，然后逐个提取染色体DNA，作为模板，用P5/P6引物(P5：5’- GCCTCCTTGGTCGGGTTGAA-3＇（SEQ ID No.6）；P6：5’- TTCTCGGCGATGATCCAGTC -3＇（SEQ ID No.7）)，进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,得到1360 bp（P5/P6）和560 bp(P5/P6)两条目标条带,说明突变株发生了单交换，将其命名为Micromonospora purpurea B3P222；再以同源单交换突变菌株作为出发菌，在不含抗生素的斜面上于37℃下松弛培养2代左右，然后分离单菌落。将长好的单菌落分别影印到含50μg/ml安普霉素和不含安普霉素的平板上。在安普霉素平板上不生长，而在无抗性平板上正常生长的单菌落，可能为发生同源双交换或回复突变菌株。逐个提取染色体，作为模板，以引物P5/P6进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，得到1360bp单条带的是回复突变株；得到560 bp单条带的是目标菌株。其中一株目标菌株暂时命名为绛红色小单孢菌B3P1220（ΔgenB3P），简称B3P1220。以B3P1220的染色体作模板，用引物P5/P6进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，得到560bp的单条带，并对其PCR产物进行测序，结果与预测相符，证明B3P1220确实发生了同源双交换。目标工程菌构建完毕。

 实施例4 ：发酵与代谢产物分析 

（1）工程菌B3P1220发酵

斜面培养基(%)：麸皮1.5克，可溶性淀粉0.75，天冬素0.002，MgSO₄·6H₂O 0.05，KNO₃ 1.0,K₂HPO₄ 3H₂O 0.03，NaCl 0.05，CaCO₃ 0.1，琼脂18，pH7.0。

种子培养基（%）：葡萄糖 1.0g，淀粉2.0g，黄豆饼粉1.5g，玉米粉1.0g, 蛋白胨 0.5g，硫酸铵0.1g，CaCO₃ 0.2g,pH7.2。 

发酵培养基（%）:淀粉4.0g，黄豆饼粉2.5g，玉米粉1.0g, 蛋白胨 0.5g，CoCl₂ 0.001g, 硫酸铵0.1g，CaCO₃  0.5g, pH 7.2。 

工程菌B3P1220于斜面培养基上，37℃恒温培养9d后，接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于35℃，280rpm摇床振荡培养25-30h。将培养好的种子液以10％的接种量（v/v）接种于装有150mL发酵培养基的1000 mL三角瓶中，于35℃，280 rpm摇床振荡培养124h。发酵单位在620ug/mL以上，满足产业化要求。 

（2）代谢产物制备 

发酵液加浓硫酸调节到pH1.5，搅拌20min, 于12000rpm离心15min，取上清液，用NaOH中和到pH7.0,加入732-NH₄ ⁺树脂吸附过夜；吸附后的饱和树脂，装入离子交换柱,蒸馏水冲洗干净,然后经0.3% NH₄OH洗涤到流出液pH8.0左右为止，最后用10倍树脂量的4%NH₄OH洗脱，得到含工程菌代谢产物的洗脱液，加热除NH₃，用硫酸调到pH6.0，控制抗生素终浓度在1000u/mL左右，供HPLC-MS分析。

（3）HPLC-MS 分析 

采用HPLC-MS 分析法,确定代谢产物的分子量，结合已知的庆大霉素代谢途径，确定代谢产物的结构。HPLC-MS条件：电喷雾离子阱质谱，C18柱；流动相为0.2 mol/L三氟乙酸水溶液：甲醇（95:5）；流速为0.6 ul/min；柱温30℃，进样量1 uL。

HPLC-MS分析结果见图4。峰2和峰3分子量均为495（496-1=495），峰2和峰3互为立体异构体，但不影响其功能，与庆大霉素JI-20B的分子量吻合，结合图2庆大霉素生物合成途径，确认基因工程菌B3P1220主要产生庆大霉素JI-20B。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

 

<120>  庆大霉素JI-20B基因工程菌及其构建与应用

 

<130>  2013

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  2220

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gggtcagctc agagaaattc gtccagcagt tggatgtagg tcagcttgtg ctggttgacg    

60

 

ctgatgccgt accgccggag gaagtgctcg gcgtgcggcg gtccgtaacc ccagacgtcg   

120

 

tcctggccga tgttgtacag cgccagggcg aggtccatcc accggtccga cactccggcc   

180

 

cggtcgacgt cgaggacgcc ggccagggtc agcgtctccg gatcgaccag cacgttgtcg   

240

 

aggcagaagt caccgtggca gacgacgaga tcgtcctcgg ccgggggtgt catcttgctc   

300

 

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360

 

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420

 

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480

 

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540

 

gccctggtga ccacccacgc cagttcgtcg ttggcgtcga gggccaccac ctcggggacg   

600

 

ggcagtccct gggcggccag ccagcggagc cgctcggcct ccttggtcgg gttgaaccgg   

660

 

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720

 

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780

 

ccccagccag ccaccggtat cggtgctgca accatcttca ccggccctgt cgtctcctac   

840

 

gccagggtcc gggtcagttc tgtgcgggga tgagaaccgg cttgatgctc cggtcccggc   

900

 

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960

 

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1020

 

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1080

 

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1140

 

cctcgaaata caccccgaag tcgtgcgccg tcttgtagat ctcccaaccc agatcgtcgt  

1200

 

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1260

 

tggtcaggat ctcccgcatc ccgtccgcca gccgacgacc catcgcctcc gcgtgctcgt  

1320

 

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1380

 

cccgcgtgta cgtcccctgg atccccgaca cgtcgtacgc gtcgatgatg tcccggcgac  

1440

 

ccatcaccgc cgccaacgaa tgaccgttcg ccagaccctt gctgaccacc accacgtcag  

1500

 

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1560

 

ccatcatgaa cggcacgtcg taccgcgcgc acaacgcata catgcgctgg tagaactcga  

1620

 

cgtcgaagta caacagctcc ggcgagatca gcaccccggc gacctcgtta ccgaaggcct   

1680

 

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1740

 

ggtacccgaa cgtctcgccc gccaactgcc actcgtgcca gccgtggtac ccgcacgaca  

1800

 

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1860

 

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1920

 

ccaactccac ccgcggaacc gacagcgtcg acgcgaacgc cgtaccgaaa tcctgaatct  

1980

 

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2040

 

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2100

 

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2160

 

gggcccgctc gaccagcccc cggttcgtca agttggcaga atccatgtcc tggctacctt  

2220

 

 

<210>  2

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gaattcaggt cacggtcgat ttcaac                                         

26

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ctcgagctcc ttctacgtga agaccac                                        

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<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctcgagtaca acagctccgg cgagat                                         

26

 

 

<210>  5

<211>  25

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tctagtacgt caacgtgcac ggggt                                          

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<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gcctccttgg tcgggttgaa                                                

20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

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<400>  7

ttctcggcga tgatccagtc                                                

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Claims (10)

1.庆大霉素JI-20B基因工程菌，其特征是：该基因工程菌命名为 Micromonospora purpurea B3P1220(△genB3P/gntJI ) ，保藏编号：CGMCC 8287，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期：2013 年9月25日。

2.根据权利要求1所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌，其特征是：在庆大霉素产生菌中灭活genB3-genP/gntJ-gntI基因功能。

3.根据权利要求1所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌，其特征是：构建基因工程菌的菌株为产庆大霉素的所有小单孢菌。

4.如权利要求1所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）敲除genB3P基因所需穿梭载体pFD605的构建 ；

（2）穿梭载体pFD605导入小单孢菌；

（3）敲除genB3P基因单双交换突变株的筛选 ；

（4）工程菌M.purpurea B3P1220(△genB3P/gntJI )突变株发酵产物的分析。

5.根据权利要求4所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法，其特征是：所述的步骤（1）是借助PCR 技术，分别获得 genBP基因上下游片段2275bp和 2310bp，删除 genB3P基因内部875bp左右的保守序列，达到灭活基因功能的目的。

6.根据权利要求4所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法，其特征是：所述的步骤（3）双交换阻断株的筛选是根据抗性表型，获得双交换突变株，对突变株在基因水平和DNA水平上进行 PCR 扩增检测和DNA测序验证，从而筛选到特定代谢产物的重组子。

7.根据权利要求4所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法，其特征是：所述的步骤（4）发酵产物为变株和亲株代谢产物经MS确认。

8.根据权利要求5所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌的构建方法，其特征是：所述的灭活基因的方法包括基因敲除，基因替换和基因灭活。

9.如权利要求1所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌在生产庆大霉素JI-20B组分中的应用。

10.如权利要求1所述的庆大霉素JI-20B基因工程菌在制备庆大霉素JI-20B中的应用。

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