ES2372187A1 - Procedimiento de identificación de animales vacunados frente a brucella. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de identificación de animales vacunados frente a Brucella.La presente invención se refiere al uso de una cepa de Brucella spp. que expresa la proteína Green Flourescent Protein (GFP) en la elaboración de medicamentos para la prevención de la brucelosis en mamíferos, a las vacunas frente a la brucelosis, y al método para la identificación de los mamíferos a los que se les ha administrado dichas vacunas. Preferiblemente, el método de la invención es un inmunoensayo, y aún más preferiblemente es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Description
Procedimiento de identificación de animales
vacunados frente a Brucella.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la Medicina Preventiva y Salud Pública, y se refiere tanto
al desarrollo y utilización de vacunas vivas de Brucella spp.
modificadas genéticamente, como al desarrollo y utilización de
técnicas de diagnóstico directo e indirecto que permiten la
identificación de animales que han sido vacunados de aquellos que
padecen una infección por cepas virulentas de Brucella
spp.
La brucelosis es una enfermedad que se transmite
de los animales al hombre. En los animales, la infección por
Brucella causa abortos, infertilidad, disminución de las
producciones y limitaciones en el comercio de animales y productos
derivados, lo que constituye un problema de Sanidad Animal con
repercusiones económicas. Además, la bacteria se transmite de los
animales infectados a los seres humanos, produciéndoles una
enfermedad debilitante y a menudo invalidante, frente a la que no
existen vacunas y cuyo tratamiento requiere de altas dosis de
antibióticos durante periodos prolongados, con frecuentes recidivas.
Por lo tanto, la brucelosis constituye un problema de Salud Pública
relevante. Se ha demostrado que la prevalencia de la brucelosis
humana está directamente relacionada con la prevalencia de la
brucelosis animal. Por ello y en ausencia de vacunas para uso en
humanos, la prevención de la enfermedad pasa necesariamente por el
control de la infección en los animales. En la mayoría de los
contextos socio-económicos, la única forma viable de
controlar la brucelosis es mediante programas basados en la
vacunación de los animales de producción, bien mediante programas de
vacunación masiva o mediante programas de vacunación, diagnóstico y
sacrificio de los animales infectados (Blasco 1997. Preventive
Veterinary Medicine 31: 275-
283).
283).
Las vacunas de referencia contra la brucelosis
animal son B. abortus S19 (lisa) para ganado vacuno y B.
melitensis Rev1 (lisa) para ganado ovino y caprino (OIE
Terrestrial Manual, 2009 -capítulos 2.4.3. y 2.7.2.-). Ambas son
vacunas vivas atenuadas, libres de adyuvantes, con bajo coste de
producción y adquisición, y altamente eficaces frente a las
infecciones por cepas de campo en rumiantes (principal fuente de
infección para los humanos). Sin embargo, presentan el inconveniente
técnico de generar una respuesta inmune, tras la vacunación,
indistinguible de la inducida tras la infección virulenta por cepas
de campo. Para solucionar este problema, se han realizado numerosos
esfuerzos científicos. Una de las estrategias ha sido el desarrollo
de cepas rugosas (R) de Brucella que, al carecer de la cadena
O del lipopolisacárido (LPS) -conocido factor de virulencia de
Brucella y principal antígeno utilizado en los ensayos de
diagnóstico serológico de la infección- ha permitido obtener cepas
atenuadas utilizables como vacunas vivas, que no interfirieren
significativamente en las pruebas de diagnóstico serológico. En este
contexto, en los años 90, se desarrolló (mediante subcultivos) el
mutante espontáneo con fenotipo R denominado B. abortus RB51
(Schurig et al., 1991. Veterinary Microbiology, 28:
171-188). La cepa RB51 se está utilizando
actualmente en algunos países contra la brucelosis bovina, con
resultados controvertidos. Tanto RB51 como una colección de mutantes
R derivados de B. melitensis y genéticamente bien
caracterizados en las distintas rutas de síntesis del
lipopolisacárido (González et al., 2008. PloS One, 3 (7):
e2760), reducen los problemas de interferencia en el diagnóstico
serológico de la infección virulenta, al carecer de antígeno
"O". Sin embargo, se ha demostrado que las vacunas R no
solucionan el problema, ya que la protección que confieren frente a
las infecciones de campo es muy inferior a la de las vacunas de
referencia B. abortus S19 y B. melitensis Rev1
(Moriyón et al., 2005. Veterinary Research,
35:1-38; Barrio et al., 2009. Vaccine,
27: 1741-1749). Por todo ello, se hace
imprescindible disponer de vacunas derivadas B. abortus S19 y
B. melitensis Rev1 modificadas genéticamente y de pruebas de
diagnóstico asociadas que permitan diferenciar mediante diagnóstico
directo e indirecto (serología) a los animales que han sido
vacunados de aquellos que padecen la infección
virulenta.
virulenta.
Existe una gran variedad de proteínas
fluorescentes GFP (Green Flourescent Protein), que se generan
en cantidad y con intensidad de fluorescencia variables, según el
sistema de expresión utilizado. Las proteínas GFP han sido
ampliamente utilizada en Biología Molecular y Celular para mareaje
genético y detección de microorganismos (incluyendo Brucella;
Celli et al., 2003. Journal of Experimental Medicine,
198(4): 545-556) células, plásmidos,
proteínas recombinantes y otros elementos con fines estrictamente
científicos. Asimismo, se han desarrollado algunas pruebas
inmunológicas tipo immunoblotting (Rajasekaran et al.,
2008. Applied and Environmental Microbiology, 74(22):
7051-7055) y ELISA sándwich para la detección y
cuantificación de diversas proteínas GFP expresadas en
microorganismos, células y tejidos (Cell Biolabs, Inc.; Cell
Signaling Technology, Inc.). También existen ensayos de diagnóstico
molecular tipo PCR para identificar determinadas variantes del gen
que codifican la proteína GFP en bacterias como E. coli
(Clontech Laboratories) o Staphylococcus epidermidis (Franke
et al., 2007. Journal of Microbiological Methods 71:
123-132).
Walsh y colaboradores (Walsh et al.,
2000. Journal of General Virology, 81,
709-718) propusieron la posible utilización de una
proteína GFP como marcador de una vacuna veterinaria. Sin embargo,
no consiguieron expresarla convenientemente en el virus de la Peste
Bovina.
Los autores de la presente invención describen
cómo una cepa derivada de B. abortus S19 (la vacuna prototipo
S19-GFPp), es capaz de expresar la GFP de manera
estable, sin alterar las características microbiológicas o
biológicas (atenuación y eficacia frente a la infección en animales
de experimentación) de la cepa S19 de referencia y, además, es capaz
de inducir la respuesta de anticuerpos anti-GFP
detectables mediante pruebas serológicas específicas, que permiten
diferenciar los hospedadores que han sido vacunados de aquellos
infectados por cepas virulentas de Brucella spp. También
describen un método ELISA indirecto de diagnóstico serológico capaz
de identificar específicamente a los animales que han sido
inmunizados con la nueva vacuna que expresa la proteína GFP.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención
se refiere al uso de una cepa de Brucella spp. que expresa de
forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y
que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador
equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y
además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por
métodos serológicos específicos, en la elaboración de un medicamento
o, alternativamente, a una cepa de Brucella sp. que expresa
de forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP)
y que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador
equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y
además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por
métodos serológicos específicos, para su uso como medicamento. En
una realización preferida de este aspecto de la invención, el
medicamento es una vacuna.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de una cepa de Brucella spp. que expresa de forma estable la
proteína Green Flourescent Protein (GFP) y que es capaz de
provocar una respuesta inmune en el hospedador equiparable a la
inducida por las cepas vacunales de referencia y además, genera
anticuerpos anti-GFP detectables por métodos
serológicos específicos, en la elaboración de un medicamento para la
prevención o el tratamiento de la brucelosis en un mamífero o,
alternativamente, a una cepa de Brucella spp. que expresa de
forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y
que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador
equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y
además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por
métodos serológicos específicos, para su uso en la prevención o el
tratamiento de la brucelosis en un mamífero.
En esta memoria, se entiende por Brucella
spp. cualquier organismo celular que puede ser definido como
taxonómicamente perteneciente al superreino Bacteria, phylum
Proteobacteria, clase Alphaproteobacteria, orden
Rhizobiales, familia Brucellaceae y género
Brucella. Se entiende por "mamífero" cualquier organismo
del superreino Eukaryota, reino Metazoa, phylum Chordata, subphylum
Craniata, superclase Gnathostomata y clase Mammalia. Se entiende por
rumiante cualquier mamífero perteneciente al superorden
Laurasiatheria, suborden Ruminantia. Y se entiende por bovino, ovino
y caprino, cualquier mamífero que puede ser clasificado como
perteneciente a la familia Bovidae.
La proteína verde fluorescente GFP producida por
la medusa Aequorea sp. (A victoria, A. aequorea, A.
forskalea) es una proteína que emite bioluminiscencia en la zona
verde del espectro visible. En el contexto de la presente invención,
GFP se define también por una secuencia de nucleótidos o
polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la
proteína GFP, y que comprendería diversas variantes procedentes
de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO:
1,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena
complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia
difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código
genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una
identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la
SEQ ID NO: 1,
en las que el polipéptido codificado por dichos
ácidos nucleicos posee la actividad y las características
estructurales de la proteína GFP.
En otra realización preferida de la invención,
la cepa de Brucella spp. pertenece a la especie B.
abortus. En una realización aún más preferida de este aspecto de
la invención, la cepa de Brucella es una cepa derivada de la
cepa de referencia B. abortus S19 (OIE Terrestrial Manual,
2009 -capítulo 2.4.3.-). En otra realización preferida, la cepa de
Brucella pertenece a la especie B. melitensis. En una
realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la
cepa de Brucella es una cepa derivada de la cepa de
referencia B. melitensis Rev 1 (OIE Terrestrial Manual, 2009
-capítulo 2.7.2.-).
"Brucella abortus S19" ó
"Brucella abortus bv. 1 str. S19" es una cepa
espontáneamente atenuada descubierta por el Dr. John Buck en 1923,
que se ha empleado en todo el mundo desde principios de 1930, como
una vacuna efectiva para prevenir la brucelosis en los animales, y
es considerada internacionalmente la vacuna de referencia para el
control de la brucelosis bovina (OIE Terrestrial Manual, 2009
-capítulo 2.4.3.-). El lote de siembra original puede obtenerse en
el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de América
(USDA, National Veterinary Services Laboratories -NVSL-, 1800 Dayton
Road, Ames, Iowa 50010, United States of America) y en el
Laboratorio de Referencia para Brucelosis de la OIE del Veterinary
Laboratories Agency (VLA; Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, Reino Unido). La cepa también es conocida como NCTC 8038
(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/brucella_group/GenomeDescriptions.html).
"Brucella melitensis Rev 1",
"Brucella melitensis bv. 1 str. Rev.1" es una cepa
también conocida como BCCN V4a,
(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/brucella_group/GenomeDescriptions.html)
espontáneamente atenuada y obtenida a partir de la cepa virulenta
B. melitensis 6056, mediante mutaciones espontáneas sucesivas
relacionadas con la dependencia a la estreptomicina y la posterior
reversión a dicha dependencia (Herzberg and Elberg 1953. Journal
of Bacteriology 66: 585-599; Herzberg and Elberg
1953. Journal of Bacteriology 66: 600-605.).
La cepa Rev 1 se ha empleado en todo el mundo desde los años 50 como
la única vacuna efectiva para prevenir la brucelosis en pequeños
rumiantes, y es considerada internacionalmente la vacuna de
referencia para el control de la brucelosis ovina y caprina (OIE
Terrestrial Manual, 2009 -capítulo 2.7.2.-). Los lotes de siembra
originales de Rev1 pueden obtenerse en el Laboratorio de Referencia
para Brucelosis de la OIE del AFSSA (94706
Maisons-Alfort, Francia) o en la Farmacopea Europea
(BP 907, 67029 Strasbourg Cedex 1, Francia).
En una realización preferida de la invención, el
mamífero es un rumiante. En otra realización preferida de la
invención, el mamífero es un bovino, y aún más preferiblemente,
perteneciente a la subfamilia Bovinae o Caprinae.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición, de ahora en adelante "composición de la
invención", que comprende una cepa de Brucella spp. que
expresa la proteína GFP y, preferiblemente, un vehículo
farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la cepa
de Brucella pertenece a la especie B. abortus. En una
realización aún más preferida de este aspecto de la invención, la
cepa de Brucella es una cepa derivada de B. abortus
S19. En otra realización preferida, la cepa de Brucella
pertenece a la especie B. melitensis. En una realización aún
más preferida de este aspecto de la invención, la cepa de
Brucella es una cepa derivada de B. melitensis Rev 1.
En otra realización preferida, la composición es una vacuna. En otra
realización más preferida, la composición de la invención además
comprende un adyuvante. En otra realización más preferida, la
composición de la invención, que comprende una cepa de
Brucella spp. que expresa la proteína GFP, además comprende
otro principio activo.
La composición de la invención puede formularse
para su administración a un animal, y más preferiblemente a un
mamífero, incluyendo los rumiantes, en una variedad de formas
conocidas en el estado de la técnica, para usarse como inmunógeno.
Estos inmunógenos pueden también ser usados como vacunas en
animales, y más particularmente en mamíferos, o producir una
respuesta en la producción de anticuerpos en los mismos. Para la
formulación de tales composiciones, una cantidad efectiva
inmunológicamente de la cepa de Brucella spp. es mezclada con
un transportador adecuado aceptable fisiológicamente para la
administración a mamíferos incluyendo humanos. Así, la composición
de la invención puede encontrarse, pero sin limitarse, en disolución
acuosa estéril o en fluidos biológicos, tales como suero. Las
disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tener
componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes
adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica,
conservantes incluyendo, sin limitarse a, agentes antimicrobianos,
antioxidantes, quelantes y similares, y nutrientes incluyendo, pero
sin limitarse a, glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales.
Alternativamente, el principio activo puede prepararse para su
administración en forma sólida. El principio activo puede combinarse
con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo, sin
limitarse a, aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma
tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa;
agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz;
lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como
dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como
sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o
salicilato de metilo.
La composición de la invención puede
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero, preferiblemente a
un rumiante, y aún más preferiblemente perteneciente a las
subfamilias Bovinae o Caprinae, en una variedad de
formas, incluyendo, sin limitarse a, las vías intraperitoneal,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, conjuntival, intracecal,
intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o
dérmica.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores (como
por ejemplo, la edad, peso, sexo, estado fisiológico -como gestación
o lactancia-, tolerancia, estado del sistema inmune) del animal,
preferiblemente mamífero. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva"
se refiere a la cantidad de Brucella spp. que expresa la
proteína GFP de manera estable, produciendo el efecto deseado (la
generación de inmunidad y de anticuerpos anti-GFP).
Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente
aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
En esta memoria, el término "medicamento"
hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención,
diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en los
seres humanos y los animales. En el contexto de la presente
invención se refiere a la composición que comprende las cepas de
Brucella spp. que expresan la proteína GFP de manera estable,
y que son capaces de generar inmunidad frente a la brucelosis y
anticuerpos anti-GFP, o a la composición que
comprende Brucella spp. que expresa la proteína GFP de manera
estable, y que es capaz de generar inmunidad frente a la brucelosis
y anticuerpos anti-GFP y un vehículo
farmacéuticamente aceptable y/o adicionalmente, un adyuvante. El
término medicamento incluye, por tanto, a las vacunas.
En el contexto de la presente invención el
término "vacuna" se refiere a una composición o preparación
antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune
a una enfermedad. Son preparados de antígenos que una vez dentro del
organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la
producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica
produciendo inmunidad permanente o transitoria.
En esta memoria, el término "adyuvante" se
refiere a un agente, mientras no posea un efecto antigénico por sí
mismo, que puede estimular el sistema inmune incrementando su
respuesta a la vacuna. Aunque sin limitarse a ellas, las sales de
aluminio "fosfato de aluminio" e "hidróxido de aluminio"
son los dos adyuvantes más comúnmente empleados en las vacunas.
Otras sustancias, como por ejemplo el escualeno, también se pueden
emplear como adyuvantes.
Como se emplea aquí, el término "principio
activo", "substancia activa", "substancia
farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó
"ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier
componente que potencialmente proporcione una actividad
farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura,
mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que
afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros
animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un
cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el
mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad
específica o el efecto.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método para la identificación de mamíferos vacunados con la cepa o
la composición de la invención, de ahora en adelante "método de la
invención", que comprende:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada del mamífero,
- b)
- detectar la presencia del gen gfp que codifica la proteína GFP, o de los productos de su expresión, en la muestra biológica aislada de mamífero.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, el mamífero es un rumiante. En otra realización
preferida de la invención, el mamífero es un bovino, ovino o
caprino, y aún más preferiblemente, perteneciente a las subfamilias
Bovinae o Caprinae.
Una "muestra biológica aislada" incluye,
sin limitarse a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un
mamífero, obtenidos mediante cualquier método conocido por un
experto en la materia. En una realización preferida, la muestra
biológica aislada es un fluido biológico, como por ejemplo, sin
limitarse a, leche, semen, fluido seminal, exudados vaginales,
secreciones conjuntivales, sangre, plasma o suero sanguíneo. Más
preferiblemente, el fluido biológico es el suero sanguíneo. En otra
realización preferida, la muestra biológica aislada son células que
se encuentran en la sangre, leche, semen, exudados vaginales o
secreciones conjuntivales del mamífero. En otra realización
preferida, son células o tejidos.
Múltiples métodos para la detección de la
presencia del gen gfp, o de los productos de su expresión, en
la muestra biológica aislada son conocidos en el estado del arte. En
esta memoria, como "productos de la expresión del gen
gfp" se incluyen, sin limitarse a, tanto la proteína GFP,
como los anticuerpos anti- GFP generados por el sistema inmunitario
del mamífero frente a dicha proteína o antígeno. Así, en otra
realización preferida de este aspecto de la invención, la detección
de la presencia del gen gfp o de los productos de su
expresión, en la muestra biológica aislada de mamífero se realiza
mediante la detección de los anticuerpos frente a la proteína GFP
(anticuerpos anti-GFP). La detección de los
anticuerpos anti-GFP puede realizarse por cualquier
método conocido en el estado de la técnica por ejemplo, sin
limitarse a, mediante inmunoensayo o inmunohistoquímica. En una
realización más preferida, el inmunoensayo es un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA.
Un antígeno o inmunógeno es una sustancia capaz
de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante la
activación de linfocitos. Los antígenos son usualmente proteínas o
polisacáridos. Los lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos
únicamente cuando se combinan con proteínas y polisacáridos. El
término "anticuerpo" tal como se emplea en esta memoria, se
refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones
inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es
decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que
se une específicamente (inmunorreacciona) con la proteína (antígeno)
GFP. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas:
IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
El término "anticuerpo
anti-GFP" se refiere a un anticuerpo capaz de
reaccionar con la proteína GFP, con una variante de la proteína GFP
o con un fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o
dicho fragmento sea funcionalmente equivalente. Preferiblemente, el
término anticuerpo anti-GFP se refiere a una
inmunoglobulina G (IgG).
El término "inmunoensayo", tal y como se
utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica
analítica que se basa en la reacción de la conjugación de una
anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en
el estado de la técnica son, pero sin limitarse: immunoblot,
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo
lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia,
x-map o chips de proteína o de
lipopolisacárido (LPS). Como se ha dicho, en una realización
preferida de este aspecto de la invención, el inmunoensayo es un
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA
se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o
anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo
luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el
reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador.
Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o
ELISA sándwich.
Los autores de la presente invención describen
un método de diagnóstico serológico capaz de identificar a los
animales que han sido vacunados con el prototipo de nueva vacuna
S19-GFPp y diferenciarlos de los infectados por
cepas virulentas de Brucella spp.
En una realización aún más preferida, el ELISA
es un ELISA indirecto, y aún más preferiblemente comprende los
siguientes pasos:
- (a)
- recubrir un soporte sólido con al menos la proteína GFP, una variante de dicha proteína, o un fragmento de la misma;
- (b)
- incubar el soporte recubierto del paso anterior con una muestra biológica obtenida del mamífero en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo de los anticuerpos frente a, al menos, el antígeno GFP, con sus variantes o sus fragmentos; y
- (c)
- incubar con un anticuerpo secundario, que reconoce a los anticuerpos frente al antígeno GFP, conjugado o unido a un compuesto marcador.
El término "compuesto marcador", tal y como
se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto
capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva
y/o quimioluminiscente que permita la detección del anticuerpo
anti-GFP. El compuesto marcador se selecciona de la
lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier
molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada
y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede
unirse directamente al anticuerpo o, indirectamente, a través de
otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se
unen directamente son, sin limitarse a, enzimas como la fosfatasa
alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como ^{32}P o
^{35}S, fluorocromos como fluoresceína, rodamina o sus derivados,
o partículas metálicas, para su detección directa mediante
colorimetría, auto- radiografía, fluorimetría, o metalografía
respectivamente.
En otra realización preferida, la detección de
la presencia del gen gfp o de los productos de su expresión,
en la muestra biológica aislada del mamífero se realiza por
iluminación ultravioleta de dicha muestra. En otra realización más
preferida, la detección de la presencia del gen gfp o de los
productos de su expresión, en la muestra biológica aislada del
mamífero se realiza por microscopía de fluorescencia.
En otra realización preferida, la detección de
la presencia del gen gfp o de los productos de su expresión,
en la muestra biológica aislada de mamífero se realiza mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Otro aspecto de la invención se refiere a un
"kit" de identificación de mamíferos vacunados con la cepa o la
composición de la invención, que comprende los medios adecuados para
llevar a cabo el método de la invención. Dicho kit puede contener
todos aquellos reactivos necesarios para analizar la presencia del
gen gfp, o de los productos de su expresión, en la muestra
biológica aislada de mamífero por medio de cualquiera de los métodos
descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, sin
limitarse a, anticuerpos específicos de la proteína GFP, anticuerpos
secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede
incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de
extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación,
inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. En el caso de
la detección por técnicas que impliquen la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) puede contener, pero sin limitarse, cebadores,
sondas y todos aquellos reactivos necesarios para determinar la
presencia del gen gfp, o de sus productos de expresión. El
kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de
tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima
de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado
el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios
para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit
comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de
la invención.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a
formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó
DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica",
"péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y
"proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren
a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud química
o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Crecimiento de la nueva vacuna
S19-GFPp y de la cepa parental S19 en placas de
agar tripticasa soja iluminadas con luz ultravioleta en un aparato
"Gel Doc" de Bio Rad y visualizadas con el filtro adecuado
(520DF30 nm, Bio Rad) (A) o en microscopio de fluorescencia (B).
Fig. 2. Amplificación por PCR de la región
ery en la nueva vacuna S19-GFPp (menor
peso molecular), en comparación con la de la cepa virulenta B.
abortus 2308.
Fig. 3. Proporción de bacterias
intracelulares y extracelulares en células HeLa infectadas con la
nueva vacuna S19-GFPp o con la cepa parental
S19, una hora después de la infección. Las células HeLa se
infectaron con 200 UFC/célula y, 1 hora después, se fijaron y
marcaron por doble inmunofluorescencia con rodamina y FITC,
siguiendo protocolos anteriormente descritos
(Chaves-Olarte et al., 2002. Cellular
Microbiology 4(10): 663-675).
Fig. 4. Replicación de la nueva vacuna
S19-GFPp y de la cepa parental S19 en células HeLa y
en macrófagos Raw 264.7, a las 48 horas
post-infección. Las células se infectaron con
200 UFC/célula y se determinó el número de UFC/mL, siguiendo
protocolos anteriormente descritos (Chaves-Olarte
et al., 2002. Cellular Microbiology 4(10):
663-675; Celli et al., 2003. Journal of
Experimental Medicine, 198(4):
545-556).
Fig. 5. Cinética esplénica de la nueva vacuna
S19-GFPp y de la cepa parental S19 en el modelo
murino. Grupos de 30 ratones fueron inoculados por vía
intraperitoneal con 1x10^{5} UFC de la nueva vacuna
S19-GFPp o de la cepa parental S19. A los 7, 14, 25,
40 y 60 días después de la infección, 6 ratones de cada grupo fueron
sacrificados para determinar el número de UFC/bazo de cada cepa
vacunal y construir las correspondientes curvas de multiplicación
esplénica, siguiendo protocolos anteriormente descritos (Sangari
et al., 1998. Vaccine, 16(17): 1640-
1645).
1645).
Fig. 6. Ensayo de protección en ratones
BALB/c inmunizados con la nueva vacuna S19-GFPp.
Grupos de 6 ratones fueron inmunizados, por vía subcutánea, con
1x10^{5} UFC de la nueva vacuna S19-GFPp o de la
cepa parental S19. Como control, se inoculó un grupo de ratones con
PBS estéril. Después de 60 días, todos los ratones fueron infectados
experimentalmente, por vía intraperitoneal, con 5x10^{4} UFC de la
cepa virulenta de referencia B. abortus 2308 y, 2 semanas
después, fueron sacrificados para recuento del número de UFC de 2308
por bazo. Los animales vacunados con S19-GFPp
mostraron niveles de protección similares a los mostrados por la
vacuna de referencia S19.
Fig. 7. Respuesta de anticuerpos contra LPS
de Brucella en ratones inmunizados con la nueva vacuna
S19-GFPp y la cepa parental S19. Se obtuvieron
muestras de sueros en ratones no inmunizados (controles) y en
ratones inmunizados por vía intraperitoneal, con 1x10^{5} UFC de
la nueva vacuna S19-GFPp o de la cepa parental S19,
a los 7, 14, 25 y 60 días después de la inmunización. Estos sueros
se diluyeron 1/200 en PBS y se midió su Densidad Óptica (D.O.) a 405
nm en un ELISA indirecto contra LPS utilizado habitualmente para el
diagnóstico de la brucelosis animal. Cada punto de la gráfica
representa el promedio de 5 sueros de ratones diferentes. Todos los
animales desarrollaron anticuerpos frente al LPS de
Brucella.
Fig. 8. Determinación del grado de pureza e
inmunogenicidad en ratones de la proteína GST-GFP
recombinante obtenida. A) La proteína recombinante
GST-GFP purificada por afinidad, mostró una sola
banda en SDS-PAGE. B) La proteína
GST-GFP usada como inmunógeno en ratones indujo
anticuerpos anti-GFP. La reacción de inmunodifusión
se realizó con diluciones seriadas (pocillos 2 a 32) de suero
monoespecífico contra 10 \mug/30 \muL de GFP (pocillo G) y, como
control, se utilizó PBS solo (pocillo -). Las bandas de
precipitación muestran que el suero inmune anti-GFP
obtenido en ratones presentó un título de 1/16.
Fig. 9. Curvas estándar en el
ELISA-GFP desarrollado, utilizando sueros de ratones
(a) o de ovejas (b) previamente inmunizados con la proteína
recombinante GST-GFP).
Fig. 10. Intensidad de la respuesta de
anticuerpos contra GFP en sueros de ratones inoculados con la nueva
vacuna S19-GFPp o con la vacuna de referencia
S19. La intensidad de la reacción de cada suero individual se
calculó de acuerdo al porcentaje de positividad de la muestra con
respecto al control (D.O. del suero positivo/D.O. del suero muestra
X 100). Cada punto representa el promedio de 10 sueros de ratones
diferentes.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores.
La vacuna de referencia B. abortus S19
(obtenida del Laboratorio de Referencia para Brucelosis de la OIE
del AFSSA, Francia) se modificó genéticamente, mediante
electroporación con un plásmido que codifica la GFP. El plásmido
utilizado fue pBBR-2-gfp, derivado
del plásmido pBBRIMCS-2, que contiene un inserto de
resistencia a kanamicina (Kovach et al., 1995. Gene.
Vol 166: 175-176) y un inserto con el gen que
codifica la GFP, bajo el control del promotor lac. Se sabe
que este plásmido genera GFP constitutivamente, sin integrarse en el
cromosoma de Brucella (Celli et al., 2003. Journal
of Experimental Medicine, 198(4):
545-556).
2.1. Se comprobó que las bacterias
S19-GFPp emiten fluorescencia detectable mediante
iluminación directa de los cultivos con luz ultravioleta y posterior
visualización de los mismos con un filtro adecuado (Fig. 1A) o
mediante observación de tejidos o exudados infectados en microscopio
de fluorescencia (Fig. 1B). Por lo tanto, el plásmido
pBBR-2-gfp permite la expresión de
GFP en Brucella en proporciones adecuadas para que la nueva
vacuna S19-GFPp pueda ser identificada a simple
vista tras su aislamiento.
2.2. Se comprobó que la expresión de la proteína
GFP en Brucella no altera el tamaño y fase coloniales de S19
en cultivos bacteriológicos, ni sus características bacteriológicas
clásicas. Para ello, el tamaño colonial se determinó midiendo el
diámetro de las colonias obtenidas en placas de agar, tras 3 días de
incubación. Paralelamente, la fase colonial se determinó mediante
observación de los crecimientos bacterianos en una lupa de
iluminación oblicua y tinción por la técnica de inundación con una
solución de cristal violeta-oxalato (Alton et
al. 1988. Techniques for the brucellosis laboratories. In. INRA
(Ed.), Paris, France; 1988, 190 pp). Además, la nueva cepa obtenida
se analizó microbiológicamente mediante las técnicas estándar para
la identificación y tipificación de Brucella spp. Brevemente,
la identificación al nivel de género se llevó a cabo mediante las
pruebas de catalasa, oxidasa, ureasa y aglutinación con acriflavina.
Para la identificación al nivel de especie se utilizó la prueba de
sensibilidad a los bacteriófagos Tb, Wb, Iz y R/C. Finalmente, para
la tipificación al nivel de biovariedad se utilizaron las pruebas de
aglutinación con los sueros monoespecíficos anti-A y
anti-M y de crecimiento en placas de agar y de agar
suplementado con un 10% de suero bovino estéril
(agar-S; Seromed, Biochrom) conteniendo las
concentraciones estándar de colorantes (20 \mug/mL de tionina, 20
\mug/mL de fucsina y 100 \mug/mL de safranina; Panreac),
antibióticos (5 UI/mL de penicilina; Sigma) y eritritol (1 mg/mL;
Merck). Las placas conteniendo agar y agar-S (placas
control), sin o con las distintas concentraciones de todos estos
productos, se incubaron durante 2-4 días a 37ºC en
atmósfera aerobia y, en paralelo, en atmósfera con un 10% de
CO_{2} (Alton et al. 1988. Techniques for the brucellosis
laboratories. In. INRA (Ed.), Paris, France; 1988, 190 pp).
2.3. Se comprobó que tanto la incorporación como
la actividad del plásmido portador del gen gfp en la cepa
S19-GFPp es estable tras su actividad in
vitro e in vivo. Para ello, se realizaron subcultivos
seriados de la cepa S19-GFPp en placas de agar y,
tras varios pases seriados, se realizaron recuentos bacterianos en
placas de agar y agar suplementado con kanamicina (antibiótico
utilizado como marcador del plásmido). Como resultado, se observó
que el número de UFC en ambos medios de cultivo era similar y que
todas las CFU de S19-GFPp conservaban la
fluorescencia, indicando que la incorporación y actividad del
plásmido GFP en B. abortus S19 es estable tras doce
subcultivos in vitro. Esta misma comprobación se realizó tras
el aislamiento de la bacteria a partir de cuatro pases sucesivos en
cultivos celulares y tres pases sucesivos en tejidos de ratones
previamente inoculados con S19-GFPp (ver los
estudios de caracterización biológica presentados más abajo),
indicando que la incorporación y actividad del plásmido GFP en B.
abortus S19 es estable también tras la actividad bacteriana
in vivo, en cultivos celulares y animales de experimentación
(ratones). Los plásmidos que codifican la proteína GFP permanecieron
estables en B. abortus S19, después de congelar en 50%
glicerol a -80ºC ó -20ºC, demostrando que todas las colonias que se
recuperaron emitían fluorescencia tras la descongelación.
2.4. Se comprobó que la cepa
S19-GFPp mantiene el genotipo clásico de B.
abortus S19, conservando la característica deleción de 702 pb
(pares de base) en el gen ery (banda de bajo peso molecular,
Fig. 2) y que permite diferenciar la cepa vacunal S19 de las cepas
virulentas de B. abortus (banda de mayor peso molecular, Fig.
2).
3.1. En modelos celulares se comprobó que:
- 3.1.1 -
- la nueva vacuna S19-GFPp posee una capacidad de adherencia e internalización en células epiteliales humanas HeLa prácticamente idéntica a la de la vacuna de referencia (Fig. 3).
- 3.1.2 -
- la capacidad de replicación de la nueva vacuna S19-GFPp en células HeLa y en macrófagos es prácticamente idéntica a la cepa parental S19 (Fig. 4).
3.2. En modelos animales se comprobó que:
- 3.2.1 -
- la nueva vacuna S19-GFPp posee una atenuación en ratones prácticamente idéntica a la de la vacuna clásica S19 (Fig. 5), indicando que la expresión del gen gfp utilizado no modifica la cinética esplénica (capacidad de multiplicación y persistencia) de la vacuna clásica parental.
- 3.2.2 -
- la nueva vacuna S19-GFPp confiere una protección prácticamente idéntica a la conferida por la vacuna clásica parental en el modelo murino (Fig. 6), indicando que la expresión de GFP no disminuye la eficacia de la vacuna clásica parental S19.
- 3.2.3 -
- la respuesta de anticuerpos contra el antígeno LPS de B. abortus inducida por la nueva vacuna S19-GFPp, medida por un ELISA indirecto convencional contra LPS (Marín et al., 1999. Clinical & Diagnostic Laboratory Immunology 6(2): 269-272), es semejante a la generada por la vacuna clásica S19 (Fig. 7). Lo que demuestra que la nueva vacuna S19-GFPp conserva intactas sus propiedades inmunogénicas.
- 3.2.4 -
- la GFP expresada en la cepa vacunal de Brucella S19-GFPp es altamente inmunogénica en animales. Todos los ratones inmunizados con S19-GFPp desarrollan anticuerpos específicos contra la GFP, durante al menos 90 días después de la vacunación, con positividad de aproximadamente el 40% (estadísticamente superior a la mostrada por el control positivo) en el prototipo de ELISA-GFP descrito en esta memoria.
4.1. En primer lugar, se expresó y purificó la
proteína GFP recombinante (GST-GFP), de acuerdo con
protocolos descritos previamente (Harlow y Lane 1988. Antibodies: a
laboratory manual. 1^{st}. ed. Cold Spring Harbor, Laboratory, N.
Y. pp. 179-179). Brevemente, la proteína de fusión
GST-GFP se expresó en el sistema E. coli
XL1-Blue con el plásmido pGEX-GFP,
se purificó mediante cromatografía de afinidad y su pureza se
determinó mediante electroforesis en gel de acrilamida (Fig.
8A).
4.2. A continuación, se obtuvieron sueros
control contra GFP en ratones, siguiendo los protocolos de
inmunización convencionales. Para ello, se administró una inyección
de 100 \mug de proteína GST-GFP junto con
adyuvante de Freund completo, seguida de 2 inmunizaciones
consecutivas separadas por una semana con la proteína
GST-GFP junto con adyuvante de Freund incompleto.
Las inmunizaciones se realizaron durante varias semanas hasta
comprobar que los sueros de los animales inmunizados con
GST-GFP mostraban bandas de precipitación en
inmunodifusión en gel contra la proteína purificada GFP (Fig. 8B).
Estos anticuerpos control, no mostraron reacciones cruzadas con
ningún antígeno de Brucella (resultados no mostrados).
Adicionalmente, se obtuvieron sueros control
contra GFP en ovinos, siguiendo los protocolos de inmunización
convencionales. Para ello, se administró una inyección de 100 \mug
de proteína GST-GFP junto con adyuvante de Freund
completo, seguida de 5 inmunizaciones consecutivas separadas por dos
semanas con la proteína GST-GFP junto con adyuvante
de Freund incompleto. Las inmunizaciones se realizaron durante dos
meses hasta comprobar que los sueros de los animales inmunizados con
GST-GFP mostraban bandas de precipitación en
inmunodifusión en gel contra la proteína purificada GFP (resultados
no mostrados). Estos anticuerpos control, no mostraron reacciones
cruzadas con ningún antígeno de Brucella (resultados no
mostrados).
4.3. Para la estandarización del ELISA indirecto
capaz de detectar específicamente anticuerpos contra la proteína GFP
(ELISA-GFP) en sueros de ovejas y en suero de los
ratones vacunados con la nueva vacuna S19-GFPp, se
procedió de la siguiente manera:
- 4.3.1.
- Recubrimiento de las placas de 96 pocillos Immunolon II (Nunc Co.) con 1 \mug de GST-GFP por pocillo, contenidos en un volumen de 100 \muL/pocillo de una solución tampón de 0.01% de Tween 20 en PBS (PBST, de Sigma). Las placas se cubrieron con plástico adherente (Sigma) y se incubaron a 37ºC durante 2 horas bajo agitación, seguido de otra incubación a 4ºC durante 15 horas sin agitación. Por último, se agregó un 30% de glicerol en cada pocillo, las placas se taparon con plástico adherente y se congelaron a -20ºC hasta su uso.
- 4.3.2.
- Para establecer la curva patrón con sueros de ratones, las placas descritas en el punto 4.3.1. se dejaron descongelar a temperatura ambiente y se lavaron 4 veces con una solución con 0.01% Tween y 0.1% de albúmina bovina deslipidada en PBS (PBST-BSA). A continuación, se agregaron 100 \muL/pocillo, por triplicado, de diluciones comprendidas entre 1/300 y 1/60000 del suero inmune anti-GFP de ratones descrito en el punto 4.2. Como controles negativos, se utilizaron sueros convencionales de ratones libres de Brucella y como blanco, PBS. Las placas se incubaron, durante 1 hora, a 25ºC, en agitación; se lavaron 4 veces con PBST-BSA; se agregó un conjugado (obtenido en conejo) unido a peroxidasa (HRP) contra la IgG (H+L) de ratón; por segunda vez, se incubaron (1 hora, a 25ºC, en agitación) y se lavaron (4 veces) como se ha descrito anteriormente; y, por último, se agregó sustrato para peroxidasa ABTS (Sigma). La lectura de la D.O. generada en cada pocillo, se realizó a 405 nm de longitud de onda, en un lector de ELISA y se estableció la curva estándar como se muestra en la Fig. 9.a.
- 4.3.3.
- Para establecer la curva patrón con sueros de ovejas, las placas descritas en el punto 4.3.1. se dejaron descongelar a temperatura ambiente y se lavaron 4 veces con una solución con 0.01% Tween y 0.1% de albúmina bovina deslipidada en PBS (PBST-BSA). A continuación, se agregaron 100 \muL/pocillo, por triplicado, de diluciones comprendidas entre 1/59 y 1/128000 del suero inmune anti-GFP de oveja descrito en el punto 4.X. Como controles negativos, se utilizaron sueros convencionales de ovejas libres de Brucella y como blanco, PBS. Las placas se incubaron, durante 1 hora, a 37ºC, en agitación; se lavaron 4 veces con PBST; se agregó Proteína G peroxidasa (Sigma) en una dilución 1:2000 en PBS pH 7.2; por segunda vez, se incubaron (1 hora, a 25ºC, en agitación) y se lavaron (4 veces) como se ha descrito anteriormente; y, por último, se agregó sustrato para peroxidasa ABTS (Sigma). La lectura de la D.O. generada en cada pocillo, se realizó a 405 nm de longitud de onda, en un lector de ELISA y se estableció la curva estándar como se muestra en la Fig. 9.b.
- 4.3.4.
- Para determinar la intensidad de la respuesta de anticuerpos contra GFP inducida en los ratones inoculados con la nueva vacuna, se utilizaron sueros "problema" de ratones inoculados (1x10^{5} UFC/ratón, vía intraperitoneal) con la nueva vacuna S19-GFPp o con una de la cepa parental S19 no marcada, y los animales fueron sangrados periódicamente, entre las 3 y 14 semanas post-inmunización (Fig. 10). Como controles positivos se utilizaron los sueros descritos en el punto 4.2. y como controles negativos, los descritos en el punto 4.3.2. Todos estos sueros se diluyeron en proporción 1/200 en PBST y el ELISA-GFP se llevó a cabo de la siguiente manera: las placas descritas en el punto 4.3.1. se lavaron tal como se describe en el punto 4.3.2.; a continuación, se añadieron 100 \muL/pocillo de los sueros descritos anteriormente (diluidos 1/200) ó 100 \muL/pocillo de PBS, como blanco de la reacción; y, por último, las placas se procesaron como se describe en el punto 4.3.2. El porcentaje de positividad de cada suero individual se calculó con respecto a la densidad óptica (D.O._{405}=0,9) del suero control positivo (100% positividad) y del blanco (0% positividad). Todos los animales inoculados con S19-GFPp presentaron una intensa reacción serológica contra GFP (alrededor del 40% positividad; Fig. 10) mientras que los animales inoculados con la cepa S19 se comportaron como los libres de Brucella (controles negativos) no reaccionando contra la proteína GFP (Fig. 10).
En conclusión, los trabajos realizados
demuestran que la proteína GFP puede expresarse en cepas vacunales
de Brucella, sin alterar las propiedades biológicas de la
cepa parental e induciendo en los animales una respuesta serológica
claramente distinguible de la inducida por otras cepas de
Brucella. Los anticuerpos generados frente a la proteína GFP
pueden identificarse mediante el ensayo ELISA indirecto contra GFP
desarrollado en esta patente. Además, la incorporación del gen
gfp en Brucella permite tanto la identificación visual
(mediante iluminación ultravioleta o microscopio de fluorescencia)
como la identificación molecular (mediante una PCR que amplifica el
gen gfp; PCR-GFP) de las cepas vacunales de
Brucella desarrolladas, a partir tanto de cultivos
bacteriológicos como de muestras de tejidos, exudados o fluidos
animales.
Claims (26)
1. Uso de una cepa de Brucella spp. que
expresa la proteína Green Flourescent Protein (GFP) en la
elaboración de un medicamento.
2. Uso de una cepa de Brucella spp. según
la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la
prevención de la brucelosis en mamíferos.
3. Uso de una cepa de Brucella spp. según
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la
cepa de Brucella pertenece a la especie B.
abortus.
4. Uso de una cepa de Brucella spp. según
la reivindicación 3, donde la cepa de Brucella es una cepa
derivada de la cepa de referencia B. abortus S19.
5. Uso de una cepa de Brucella spp. según
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la
cepa de Brucella pertenece a la especie B.
melitensis.
6. Uso de una cepa de Brucella spp. según
la reivindicación 5, donde la cepa de Brucella es una cepa
derivada de la cepa de referencia B. melitensis Rev 1.
7. Uso de una cepa de Brucella spp. según
cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde el
mamífero es un rumiante.
8. Uso de una cepa de Brucella spp. según
la reivindicación 7, donde el rumiante pertenece a la subfamilia
Bovinae.
9. Uso de una cepa de Brucella spp. según
la reivindicación 7, donde el rumiante pertenece a la subfamilia
Caprinae.
10. Composición que comprende una cepa de
Brucella spp. que expresa la proteína Green Flourescent
Protein (GFP) según cualquiera de las reivindicaciones
1-9.
11. Composición según la reivindicación anterior
que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 10-11, que es una vacuna.
13. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, que además comprende un
adyuvante.
14. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, que adicionalmente comprende
otro principio activo.
15. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la composición según cualquiera de las reivindicaciones
10-14, que comprende:
- a.
- obtener una muestra biológica aislada del mamífero,
- b.
- detectar la presencia del gen gfp, o de los productos de su expresión, en la muestra biológica aislada del mamífero.
16. Método para la identificación de mamíferos
tratados según la reivindicación anterior, donde la muestra
biológica aislada del mamífero es un fluido biológico.
17. Método para la identificación de mamíferos
tratados según la reivindicación 15, donde la muestra biológica
aislada del mamífero son células o tejidos.
18. Método para la identificación de mamíferos
tratados según cualquiera de las reivindicaciones
15-17, donde la detección de los productos de
expresión del gen gfp en la muestra biológica aislada de
mamífero se realiza mediante la detección de los anticuerpos
anti-GFP.
19. Método para la identificación de mamíferos
tratados según la reivindicación 18, donde la detección de los
anticuerpos anti-GFP se realiza mediante
inmunoensayo.
20. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la cepa o la composición según la reivindicación 19,
donde el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA).
21. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la cepa o la composición según la reivindicación 20,
donde el ELISA es un ELISA indirecto.
22. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las
reivindicaciones 15-17, donde la detección del gen
gfp, o de los productos de su expresión, se realiza por luz
ultravioleta.
23. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las
reivindicaciones 15-17 y 22, donde la detección del
gen gfp, o de los productos de su expresión, se realiza por
microscopía de fluorescencia.
24. Método para la identificación de mamíferos
tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las
reivindicaciones 15-17, donde la detección del gen
gfp, o de los productos de su expresión, se realiza mediante
la reacción en cadena de la polimerasa.
25. Kit de identificación de mamíferos tratados
con la cepa o la composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, que comprende los medios
adecuados para llevar a cabo un método de identificación según
cualquiera de las reivindicaciones 15-24.
26. Kit de identificación según la
reivindicación anterior, que comprende los medios adecuados para
detectar los anticuerpos anti-GFP.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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