CN109456994B - 一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产生物基因工程领域，公开了一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，根据克隆得到厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长序列设计siRNA，采用不同参数设置分析不同脉冲模式对甲状腺素受体基因的敲减情况；收集电穿孔转染后96h的幼虫，提取幼虫RNA；设计甲状腺素受体基因引物，利用荧光定量PCR检测甲状腺素受体基因的表达情况。本发明与未加siRNA和无义siRNA处理后进行比较，结果显示加入甲状腺素受体基因siRNA显著降低了该基因的表达量，敲减效率近100％。
Description
技术领域
本发明属于水产生物基因工程领域，尤其涉及一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
厚壳贻贝Mytilus coruscus是广泛分布于我国沿海的海水经济贝类，隶属于软体动物门双壳纲，是我国重要的养殖经济贝类，我国浙江省嵊泗县是厚壳贻贝的主产区。厚壳贻贝个体大，肉质肥美，是含优质蛋白质的双壳贝类海产品，营养价值高，深受我国沿海地区人民的喜爱。
厚壳贻贝的苗种供应主要来源于人工育苗，幼虫附着变态是人工育苗中非常重要的一个阶段，若幼虫不能完成正常变态，则会出现大批量死亡现象。目前，厚壳贻贝人工繁殖技术中所存在的问题一直没有得到解决，育苗成活率和苗种品质一直不稳定，导致苗种供不应求。例如，浮游幼虫附着变态率低，且在附着变态阶段出现大规模死亡现象等问题。然而，海产贝类幼体的基础科学研究和遗传改造手段还远远不能满足应用研究的需要。海产贝类幼体的获得具有一定季节性，受精卵数量多且个体小，幼体成活率低，使得目前一直未建立一个稳定、高效的研究方法。
综上所述，现有技术存在的问题是：
通量低（换句话说就是在短时间无法完成大量无脊椎动物幼体的基因编辑技术），例如显微注射。
成本高，例如脂质体混合siRNA转染虽然通量较显微注射高，但是其价格非常昂贵（1.5 ml约2-4千元人民币），且转染效率在甲壳类藤壶中为60%。低与本方案中的双壳贝类厚壳贻贝。
目前基因敲除/敲减技术是通过对特定基因进行永久沉默或阻止其表达的方法。在海产贝类幼体中，显微注射因效率低且难以重复而极少使用。基于化学转化在海产贝类幼体研究中的报道也很少，例如，脂质体因价格昂贵而难以推广使用。电穿孔方法相比具有简便、相对稳定等优点。而目前对于利用电穿孔技术在海产贝类幼体中进行基因敲减的研究仍不成熟。本领域需要建立一种能够高效、稳定的电穿孔敲减基因表达的方法，观察特定靶基因缺失后的表型，并研究可能进一步对相关生命现象所造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。
解决上述技术问题的难度和意义：
解决上述技术问题的难度在于进行活体实验，也就是把厚壳贻贝的幼体通过电穿孔的方法仍能保持大量幼虫存活，并且基因敲减的效率能达到最优。在贝类中并没有任何报道，也没有相应所建立的针对在贝类幼体中依赖于电穿孔的方法；
意义：本发明需要建立一种能够在贝类中高效、稳定的电穿孔敲减基因表达的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法。本发明提高了转染的通量，也就是在短时间内可以对很多幼虫进行基因编辑，而且不需要脂质体，降低了转染的成本。
本发明是这样实现的，一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，所述厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法包括：
眼点幼虫的筛选：将厚壳贻贝从担轮幼虫在培养箱中培养至眼点幼虫阶段；
siRNA电穿孔转染:对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤海水清洗；将厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有无菌过滤海水和厚壳贻贝甲状腺素受体基因siRNA的电击杯中；进行方波脉冲处理；待眼点幼虫复苏后，转移至自然海水中培养，收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证；
荧光定量PCR验证：采用引物对基因进行厚壳贻贝甲状腺素受体基因及两个内参基因EF-1α和α Tubulin进行表达分析。
进一步，眼点幼虫的筛选中，将厚壳贻贝从担轮幼虫以5个/ml幼虫密度并在18℃培养箱中培养至眼点幼虫阶段。
进一步，眼点幼虫的筛选中，每两天更换一次海水，海水温度为18℃海水经混合纤维膜过滤，盐度为30‰；选用壳长为320μm、壳宽280μm且形状规则的眼点幼虫用于电穿孔转染。
进一步，siRNA电穿孔转染中，将100-300只厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有1ml无菌过滤海水和0.4μg或0.8μg厚壳贻贝甲状腺素受体（thyroid hormone receptor, TR）基因siRNA的0.4cm伯乐电击杯中；
采用方波脉冲；参数设置：一次5ms的100V电场脉冲，然后是十次20ms的50V电场脉冲，每次脉冲电压之间间隔1s；
复苏时间：5~10min；待复苏时间后，将眼点幼虫转移至18℃的自然海水中培养96h，96h后收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证。
进一步，siRNA电穿孔转染中，所述siRNA根据厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长设计的长度为21 bp的双链siRNA5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′，无义siRNA5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′；
所述0.4cm伯乐电击杯的体积为1.5ml。
进一步，荧光定量PCR验证中，引物对为：
TR-F TCAACTTCATCCTCATCGTCAC；
TR-R CGCATCAGTACACACAACACAT；
EF-1α-F CACCACGAGTCTCTCCCTGA；
EF-1α-R GCTGTCACCACAGACCATTCC；
α Tubulin-F TTGCAACCATCAAGACCAAG；
α Tubulin-R TGCAGACGGCTCTCTGT。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
| 实验生物 | 基因敲降效率 | 价格 | ||
| 本方案技术 | 电穿孔siRNA转染 | 双壳纲厚壳贻贝幼体 | ~100%（图3） | （不需要脂质体） |
| 现有技术 | 脂质体siRNA转染 | 甲壳纲藤壶幼体 | ~60%（参考文献图4） | 脂质体1.5ml市场价6691 RMB（ThermoFisher） |
参考文献提供的藤壶幼虫经脂质体与siRNA混合后转染后p38 MAPK基因的表达如图4。
本发明人根据克隆得到厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长序列设计siRNA，采用不同参数设置分析不同脉冲模式对甲状腺素受体基因的敲减情况。收集电穿孔转染后96h的幼虫，提取幼虫RNA。设计甲状腺素受体基因引物，利用荧光定量PCR检测甲状腺素受体基因的表达情况。与未加siRNA和无义siRNA处理后进行比较，结果显示加入甲状腺素受体基因siRNA显著降低了该基因的表达量，敲减效率近100%（图3）。且参数设置{一次5ms的100V电场脉冲，然后是十次20ms的50V电场脉冲(每次脉冲电压之间间隔1s)}的敲减效果最好。此外，幼虫变态结果显示经甲状腺素受体基因siRNA电转后显著降低了53%厚壳贻贝幼虫变态率。综上所述，本发明成功敲减了厚壳贻贝甲状腺素受体基因的表达；优化了电穿孔的物理参数；本发明的方法通过电穿孔转染将外源基因导入厚壳贻贝幼虫体内，进而对特定靶基因产生敲减作用，从而可以广泛应用于海产贝类幼体生长和变态发育等方面的基础和应用研究。
（2015 Zhang — siRNA transfection in larvae of the barnacleAmphibalanus amphitrite）。该文采用脂质体（化学）方式对藤壶幼体进行转染，与本发明不同点在于采用不同的转染方式及不同的实验对象。本发明实验对象为软体动物门的厚壳贻贝，对照文献是节肢动物门的藤壶。本发明采用电穿孔转染，在方法上具有差异。
本发明与其相比：
目的基因敲降效率本方案为近100%，大于其60%（2015 Zhang）。
幼虫变态率本方案降低了53%，其约为55.8%（2015 Zhang）。
本发明采用的电转不需要购买昂贵的脂质体，1ml 脂质体需要2-4千元。本发明不但节省了成本，而且同样能达到效果。
附图说明
图1是本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法流程图。
图2是本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫经电穿孔转化siRNA后的激光共聚焦显微镜图。
图中：（a）、对照组；（b）处理组。
图3是本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫经电穿孔转化siRNA后厚壳贻贝甲状腺素受体基因的表达量图。
图4是本发明实施例提供的参考文献提供的藤壶幼虫经脂质体与siRNA混合转染后p38 MAPK基因的表达量图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前基因敲除/敲减技术是通过对特定基因进行永久沉默或阻止其表达的方法。在海产贝类幼体中，显微注射因效率低且难以重复而极少使用。基于化学转化在海产贝类幼体研究中的报道也很少，例如，脂质体因价格昂贵而难以推广使用。电穿孔方法相比具有简便、相对稳定等优点。而目前对于利用电穿孔技术在海产贝类幼体中进行基因敲减的研究仍不成熟。本领域需要建立一种能够高效、稳定的电穿孔敲减基因表达的方法，观察特定靶基因缺失后的表型，并研究可能进一步对相关生命现象所造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。
针对上面问题，下面结合具体分析对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法包括以下步骤：
S101:眼点幼虫的筛选：将厚壳贻贝从担轮幼虫以5个/ml幼虫密度并在18℃培养箱中培养至眼点幼虫阶段，期间每两天更换一次海水，所述海水温度为18℃海水经混合纤维膜过滤（孔径：1.2μm），盐度为30‰。选用壳长约在320μm、壳宽280μm且形状规则的眼点幼虫用于电穿孔转染。
S102:siRNA（5'CY3修饰）电穿孔转染:对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤海水清洗。将100-300只厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有1ml无菌过滤海水和0.4μg或0.8μg厚壳贻贝甲状腺素受体（thyroid hormone receptor, TR）基因siRNA的0.4cm伯乐电击杯中。采用方波脉冲；参数设置：一次5ms的100V电场脉冲，然后是十次20ms的50V电场脉冲（每次脉冲电压之间间隔1s）；复苏时间：5~10min。待复苏时间后，将眼点幼虫转移至18℃的自然海水中培养96h，96h后收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证。所述siRNA是根据厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长设计的长度为21 bp的双链siRNA（5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′SEQ ID NO：1），无义siRNA（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′SEQID NO：2）。所述0.4cm伯乐电击杯的体积为1.5ml。
S103:荧光定量PCR验证：采用下表中的引物对基因进行厚壳贻贝甲状腺素受体基因及两个内参基因EF-1α和α Tubulin进行表达分析。PCR体系
| 引物 | 序列 (5’-3’) | 用途 |
| TR-F SEQ ID NO：3 | TCAACTTCATCCTCATCGTCAC | qPCR |
| TR-R SEQ ID NO：4 | CGCATCAGTACACACAACACAT | qPCR |
| EF-1α-F SEQ ID NO：5 | CACCACGAGTCTCTCCCTGA | qPCR |
| EF-1α-R SEQ ID NO：6 | GCTGTCACCACAGACCATTCC | qPCR |
| α Tubulin-F SEQ ID NO：7 | TTGCAACCATCAAGACCAAG | qPCR |
| α Tubulin-R SEQ ID NO：8 | TGCAGACGGCTCTCTGT | qPCR |
图2是本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫经电穿孔转化siRNA后的激光共聚焦显微镜图。
图中：（a）、对照组；（b）处理组。
图3是本发明实施例提供的厚壳贻贝眼点幼虫经电穿孔转化siRNA后厚壳贻贝甲状腺素受体基因的表达量。
图4是本发明实施例提供的参考文献提供的藤壶幼虫经脂质体与siRNA混合后转染后p38 MAPK基因的表达量。
下面结合实例例对本发明的应用作进一步描述。
实施例
本发明实施例提供的厚壳贻贝眼电幼虫的电穿孔转染方法包括：
（1）眼点幼虫的筛选：
将厚壳贻贝从担轮幼虫在18±1℃培养箱中黑暗条件培养至眼点幼虫阶段，实验容器为2L烧杯，盐度为30‰，幼虫密度为5个/ml，培养期间每隔1天更换一次18℃的自然海水并每天投喂饵料（如纤细角毛藻），其投喂密度为 5×104cells/ml。筛选活力好，壳长大小在280-330 μm左右的眼点幼虫进行siRNA电穿孔转染实验。
（2）siRNA电穿孔转染:：
对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤自然海水清洗，所用无菌过滤自然海水为自然海水（盐度：30‰）首先经混合纤维膜过滤，再经121℃高温灭菌20 min即为无菌过滤自然海水。将清洗后的厚壳贻贝眼点幼虫（100-300只）转移至含有无菌过滤海水和0.4 μg或 0.8μg厚壳贻贝甲状腺素受体（thyroid hormone receptor, TR）基因siRNA的0.4cm伯乐电击杯中；所述siRNA根据厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长设计的长度为21 bp的双链siRNA5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′，无义siRNA5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′；进行方波脉冲处理；程序1：1次5ms的100V电场脉冲，然后是10次20ms的50V电场脉冲，每次脉冲电压之间间隔1s；程序2：10次20ms的50V电场脉冲，每次脉冲电压之间间隔1s；电转完后静止5-10 min，之后将眼点幼虫转移至自然海水中进行培养。
（3）荧光定量PCR验证：
在自然海水中进行培养96h后，收集siRNA电转后的眼点幼虫样品用于RNA提取和荧光定量PCR验证。RNA提取按照Takara公司的RNAiso Plus说明书进行。采用下表中的引物对基因进行厚壳贻贝甲状腺素受体基因及两个内参基因EF-1α和α Tubulin进行表达分析。荧光定量PCR（qPCR）采用Roche公司的 FastStart Essential DNA Green Master 试剂。qPCR体系如下：
荧光定量PCR结束后进行数据分析，保证扩增效率在90%-110%，R2>0.99，以及溶解曲线单峰，必要时可采用1%琼脂糖凝胶电泳验证产物的是否属于单一条带，并确认条带的大小。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcugaaaucc ugcuguuuat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaacttcat cctcatcgtc ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcatcagta cacacaacac at 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccacgagt ctctccctga 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgtcacca cagaccattc c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgcaaccat caagaccaag 20
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcagacggc tctctgt 17
Claims (1)
1.一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，其特征在于，所述厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法包括：
眼点幼虫的筛选：将厚壳贻贝从担轮幼虫以5个/ml幼虫密度并在18℃培养箱中培养至眼点幼虫阶段；每两天更换一次海水，海水温度为18℃，海水经混合纤维膜过滤，盐度为30‰；选用壳长为320 μm、壳宽280 μm且形状规则的眼点幼虫用于电穿孔转染；
siRNA电穿孔转染:对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤海水清洗；将100-300只厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有1 ml无菌过滤海水和0.4 μg或0.8 μg厚壳贻贝甲状腺素受体基因siRNA的0.4 cm伯乐电击杯中；进行方波脉冲处理；待眼点幼虫复苏后，将眼点幼虫转移至18℃的自然海水中培养96 h，96 h后收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证；
所述0.4 cm伯乐电击杯的体积为1.5 ml；
所述方波脉冲处理的参数设置为：一次5 ms的100 V电场脉冲，然后是十次20 ms的50V电场脉冲，每次脉冲电压之间间隔1 s；
所述眼点幼虫复苏的时间为：5~10 min；
所述siRNA是根据厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长设计的长度为21 bp的双链siRNA5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′，无义siRNA5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′；
所述荧光定量PCR验证为：采用引物对对所述厚壳贻贝甲状腺素受体基因及两个内参基因EF-1α和α Tubulin的表达进行分析；
所述引物对为：
TR-F TCAACTTCATCCTCATCGTCAC；
TR-R CGCATCAGTACACACAACACAT；
EF-1α-F CACCACGAGTCTCTCCCTGA；
EF-1α-R GCTGTCACCACAGACCATTCC；
α Tubulin-F TTGCAACCATCAAGACCAAG；
α Tubulin-R TGCAGACGGCTCTCTGT。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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