CN111500577B - 一种rna干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中的应用 - Google Patents

一种rna干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种RNA干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中的应用；具体选取缢蛏为研究对象，多巴胺β‑羟化酶为目的基因，设计了siRNA，采用siRNA体外浸泡幼虫的方法，通过检测幼虫变态率、存活率以及靶基因表达量变化，即在缢蛏幼虫发育时期，siRNA有效降低靶基因的表达水平，幼虫的变态率和存活率出现了显著下降，因此表明了体外浸泡siRNA方法的可行性；本发明采用的体外浸泡法突破了活体注射siRNA的限制，实现了RNA干扰技术在贝类幼虫研究中的应用；本发明的实验操作简单易行，不受实验条件限制，能够排除其他基因干扰，从而更加准确地实现对单一目的基因的研究。

Description

一种RNA干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中 的应用
技术领域
本发明属于RNA干扰技术领域，具体涉及一种RNA干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中的应用。
背景技术
目前，由于软体贝类的个体和食性的限制，传统的干扰链RNA的导入方法不能满足实验的要求，所以国内外尚未报道在海水贝类幼虫发育中进行RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的研究。在已有的RNAi研究中，多采取注射和喂食的方法。在水生动物中，通过注射siRNA干扰草鱼出血病病毒，从而探索治疗病毒手段；注射dsRNA沉默目的基因，研究该基因对物种组织发育的影响。贝类幼虫存在变态发育的过程，是影响其苗种繁育成功率的重要因素之一，所以研究影响贝类幼虫变态发育的分子机制非常重要。RNAi作为研究基因功能的新技术，然而贝类幼虫个体非常小，大约为80-210μm，无法采用注射方法，因此探索RNAi应用于贝类幼虫的方法至关重要。此发明将为RNA干扰技术在贝类幼虫研究中的应用提供重要的技术支撑。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明建立了体外浸泡siRNA沉默目的基因的方法，探索了siRNA有效作用浓度和作用时间，为今后研究目的基因在贝类幼虫发育等过程中的功能提供了重要的方法。
因此，本发明的首要目的是提供一种RNA干扰技术在研究目的基因影响贝类幼虫变态发育过程中的应用。
本发明的第二个目的是提供RNA干扰技术在沉默多巴胺β-羟化酶表达中的应用。
本发明的第三个目的是提供RNA干扰技术在研究多巴胺β-羟化酶催化去甲肾上腺素合成过程中的应用。
本发明的第四个目的是提供设计合成的siRNA。
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
一种RNA干扰技术在研究目的基因影响贝类幼虫变态发育过程中的应用，即利用RNA干扰技术实现靶基因表达被抑制，导致靶基因功能受到影响，从而鉴定靶基因在贝类幼虫变态发育过程中的作用。
为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：
一种RNA干扰技术在在沉默多巴胺β-羟化酶(DβH)表达中的应用，其中，多巴胺β-羟化酶的基因序列为SEQ ID NO.1。
为达到上述第三个目的，本发明的解决方案是：
一种RNA干扰技术在研究多巴胺β-羟化酶催化去甲肾上腺素合成过程中的应用。
为达到上述第四个目的，本发明的解决方案是：
一种针对RNA干扰技术的siRNA， siRNA的正义链序列为SEQ ID NO.2；反义链序列为SEQ ID NO.3。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明的RNA干扰技术实现了RNA干扰在贝类幼虫中的研究，能够在贝类幼虫发育期应用RNA干扰技术，从而实现对目的基因的敲降；另外，本发明的实验操作简单易行，不受实验条件限制，能够排除其他基因干扰，从而更加准确地实现对单一目的基因的研究。
附图说明
图1为本发明的实施例1缢蛏幼虫变态率和siRNA浓度的变化曲线示意图。
图2为本发明的实施例1缢蛏幼虫存活率和siRNA浓度的变化曲线示意图。
图3为本发明的实施例2缢蛏幼虫靶基因表达量和siRNA干扰后不同时间的关系图。
具体实施方式
本发明提供了一种RNA干扰技术在研究目的基因影响贝类幼虫变态发育过程中的应用。具体选取缢蛏为研究对象，多巴胺β-羟化酶为目的基因，设计了siRNA(siRNA由上海吉玛公司合成并提供)，且采用体外siRNA浸泡贝类幼虫的方法，通过检测幼虫变态率、存活率以及靶基因表达量变化的结果，从而探索siRNA体外浸泡贝类幼虫方法的可行性。
本发明的RNA干扰技术可以显著降低贝类幼虫的变态率和存活率。具体地，其在沉默多巴胺β-羟化酶基因的表达中得以应用，通过抑制多巴胺β-羟化酶，影响去甲肾上腺素的合成。
其中，多巴胺β-羟化酶的基因序列为：SEQ ID NO.1。具体地，
CTCTTGATAAAAAACCGTATAAAAGGTTCGCAGTTCTAGCTATTGTTAGTTAGTCCCTAACAATAACATGCCACTTTACTCAACTATACAAACGATGGACGCTGCTTTACGCCTTTTCGTAGGCCTTGCGGTGACTTTGATGATAGTGGGCCACACCGAAAGTGCAGCGGTTGATGCTGTGACATCAGAACCCTTTGATTTCAGTGAAGTGCTGGATAGCAATGGAAACTATGTGCTATTCTGGAATTTCAACAGTGCACACGTGACCTTTGAAGTACACGTGCAGACCACAGGCTGGGTCGGGTTTGGACTCTCCGAAAATGGCAACATGTTCCCCAGCGACGTCGTTATAGGTTGGGTAGACGACTCTGGAAATGCCCATTTCTCCGATCGACACGCCAATGGTCATCGTCTGCCTCTTAAAGACAAGTCGCAGGACTGGCATCTTCTTCAAGGCTCGCAAGATGGCGCTAAAACTATCCTCAAATTCCAGCGCAAAATAGACACTTGCGATCCACAGGATCGAACTATTCCGGAAAACACAGCTCGGGTGATCTACGCTTACAATGACGAGGATCCTGTTTCTGATGACGCCATTCATTATCACGGAAGCACACGGGGAACGAAAAGTGTTTCTCTCCTGTCATCCATTCAGACTCCAACAAATCTACCATCTGATGTGAAATATATTGACATCCTCAGTAGAAATTACCTCTTGCCGCCTGCAAAGACGACGTACCATTGCTTCGCGTTTAAGATGCCCGATATTGGGAAACACCATATGATAAAGTTTGAGCCTATTGTAACCCCTGGTAACGAAGGCCATGTCCATCATTTTGTGCTGTCTCGATGCAATGTTTCCAACCCAGATGACATAGACGGCATCCATGGCATGTGCTACGACGACAGGCCGAAGGCACTACCACAGTGTAATGAACAAATTCTTGCTTGGGCTGTTGGCGGAGAGGCGTTTTACTTCCCGGAATCAGTCGGGTTTTCGATGGGAGGGCCAGAGGATGGTAATCTGTACGTTCTTGAGATTCATTACGATAACCCGTCACAGCGGTCTGGAGTTATTGATAACTCAGGTATCCGTCTAACTCTGACGTCATCACTACGCGCGGAGGAGGCTGGGATGCTTATGATTGGGGACACGGTTACTTTCAGTCAGCTTATCCCACCGGGCAGACAGAACTTCGTCACAGTGGGAATGTGCAATGATAAATGCATACAAGAGAGCCTGGAAAGTAGTAACCTGACTGAGATAAATATTTTTGCGATTTTCCAACACTCACATCTGATTGGTCGAGAAATCAGGACACGCCACTTCCGGAATGGAACGGAAATTGAACCACTTCAAAACGACCCATTTTACGACTTCAACTTTCAAGAGACTCGCAAATTGCCCAAAGTTGTAAAAGTTCGTCAAGGAGATAGTCTTAGCGTTGATTGTGTCTATGACTCCACGAGTCGAGTAGGACTTACCTTTGGGGGCCTGTCAACCTCCGATGAGATGTGCCTTTCATTCATTTACTACTACCCTAAGTTTCCACTATCAATCTGTACTTCACGCAGGACCTATAACGCCGTCAACTCACCACCGGCTCTGGCTTACCACGATCTGGTCTCTGTTGATTGGTCAAACCAAACGGAAGTGGCGTTTATTGAAGAAAAGATCGAACGTTCAAAGATCGCTGGACATTGCATTCGAACTGACCAACCGCCAAACTACTTTCAAGACTTCGATTCCACGATGTACAAGCAGCCGTTTGTTGCCCCACAAACAGTGTGTACAAACCGGAAGTAGATCAGTCGGACGTGAACGTCGGTCATATTTTGAACATTTCCCGTATTTCCGAACTAATGTACACATCCATAGATGTAGCAAATAGTAAATTAGTCAAAATTGTAACAATTGTTTGTATGTTCCAGTGTGTAATACTTCGGTGCTAAGCAAATTTACAAGCACTTAGTGACAGAATATACACTTGAATTACGTACAAGTAAACTGTGCCAAATGTGTGAAAATAAAAAAGAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
针对RNA干扰技术的siRNA，siRNA的正义链序列为CCAACACUCACAUCUGAUUTT(SEQID NO.2)；siRNA的反义链序列为AAUCAGAUGUGAGUGUUGGTT(SEQ ID NO.3)。
利用siRNA体外浸泡贝类幼虫：
充分了解了缢蛏幼虫的发育过程和特点，在贝类幼虫的变态发育过程中，随着各个器官的发育，个体的形态也发生着变化，不同发育时期的持续时间不同，随着幼虫的发育，变态时间越来越长。本发明中表型观察选择了发育较快的时期，即担轮幼虫期到D型幼虫期；siRNA有效作用时间的检测，选择了发育持续时间较长的时期，即壳顶幼虫期到匍匐幼虫期，从而分别从表型和基因表达量来评估此方法的可行性。
其中，本实验中的siRNA由上海吉玛公司合成并提供。
本发明的利用RNA干扰技术作用于贝类幼虫的方法包括如下步骤：
步骤1：准备实验容器：六孔板、烧杯、1.5ml离心管、移液枪、枪头、RNA store、滤纸、小漏斗、100目筛绢和各浓度siRNA。
步骤2：取与幼虫生长相同盐度的海水，分别加入六孔板，每个孔加入8ml海水。用滤纸贴好漏斗内壁，过滤食用藻液，并用海水冲吸滤纸内壁的浓缩藻液，加入六孔板，每个孔加至10ml(每个孔2ml浓缩藻液)。实验组(加siRNA组)注意计算siRNA浓度，浓度不同，所加siRNA量不同，终浓度应为整个水体的siRNA浓度，即10ml水体的siRNA浓度。
步骤3：同步骤2，取海水加入烧杯，每个烧杯加入160ml海水，40ml浓缩藻液。
步骤4：取发育时期相同的幼虫，六孔板的每个孔加100只幼虫(显微镜下数)；同样，每个烧杯加入幼虫，幼虫可用100目筛绢富集，浓度至可铺满烧杯底部即可。注：每个烧杯内的幼虫只可取一次样。
步骤5：每2个小时取一次样，用100目筛绢富集烧杯中的幼虫，并收集于1.5ml离心管中，用移液枪移去多余海水，加入RNA store至满，于-20℃冻存。
步骤6：每4个小时在显微镜下观察一次六孔板中幼虫，待空白组(未作任何处理的组)变态率达90％以上时，计算各组的变态率和存活率。
计算公式：
变态率＝变态个数/总数×100％
存活率＝存活个数/总数×100％
步骤7：收集于离心管的样品可后续提取RNA，反转并作荧光定量，检测基因表达情况。
步骤7.1：采用Trizol法提取贝类幼虫的RNA。
(1-1)首先，将大量贝类幼虫直接放入研钵中，加入少量的液氮，迅速研磨，待贝类幼虫变软，再加入少量的液氮，再研磨，重复三次；
(1-2)将贝类幼虫组织样品按50-100mg加入1ml Trizol试剂，转移至离心管。另外组织体积不能超过Trizol体积的10％，再用电动均浆器充分均浆1-2min，冰上静置3min；
(1-3)按每毫升Trizol加入200微升的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置10min；
(1-4)在4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升Trizol加入500ul异戊醇，颠倒混匀放置室温5-10min；
(1-5)在4℃，12000g离心10min，弃上清液，按每毫升Trizol加入1ml的75％乙醇，用枪反复吹起，悬浮沉淀；
(1-6)吸取乙醇，沉淀在室温晾干或无菌操作台吹风5-10min，加入30-100ulRNase Free dH2O充分溶解RNA，再测260nm下吸光值定量RNA浓度，并泡1％琼脂糖胶，检测RNA降解情况。
步骤7.2：反转录为cDNA用于后续目的基因荧光定量检测。
反转录反应(使用Takara(日本)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)试剂盒)：
Figure BDA0002461581490000051
B.取10ul步骤A的反应液
Figure BDA0002461581490000052
步骤7.3：目的基因的荧光定量检测。
荧光定量pcr(real-time PCR)20ul体系：
Figure BDA0002461581490000053
收集CT值，用2-ΔΔct法分析数据。
其中，目的基因特异性引物F：GTGCTGTCTCGATGCAATGT(SEQ ID NO.4)。
目的基因特异性引物R：CCAACAGCCCAAGCAAGAAT(SEQ ID NO.5)。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
siRNA浸泡缢蛏幼虫的具体步骤如下：实验容器为六孔板和烧杯，分别用于表型观察和取样检测基因表达。
实施例1：
表型观察实验使用六孔板，每个孔中有100只缢蛏幼虫，10ml的海水(包含2.5×105的金藻和2.5×105的角毛藻)，不同浓度的siRNA或DEPC试剂。每4h观察一次变态率，当海水组完全变态时，计算各组的变态率和存活率。最终从表型的数据上来看，与空白组和DEPC组相比，所有的siRNA组中幼虫的变态率随着siRNA浓度的升高而降低，从表型可以看出，在缢蛏幼虫发育时期，siRNA使得缢蛏的变态率(图1)和存活率(图2)出现了显著抑制。由此可以推断，在缢蛏幼虫的发育阶段，当siRNA沉默目的基因-多巴胺β羟化酶时，其活性被抑制，目的酶基因作用的去甲肾上腺素合成通路收到干扰，去甲肾上腺素的合成量减少，缢蛏幼虫的变态不能正常进行，所以siRNA组的变态率有明显的降低，由于变态是贝类幼虫重要的发育时期，变态的正常进行也关乎着幼虫的存活，所以当变态发育时期的幼虫变态率降低时，其存活率也有了显著的抑制。
实施例2：
本实施例选取壳顶期到匍匐期的缢蛏幼虫在干扰后不同时间点收集样本。共设计5个时间点，分别是：0h、4h、8h、12h和24h，并分别设计对应的DEPC组，且每组三个重复。在实验中使用500ml体积的烧杯，每个烧杯中含有200ml海水以及缢蛏幼虫。在每个时间点进行缢蛏幼虫的收集，用富集网收集缢蛏幼虫，吸管抽取缢蛏幼虫至1.5ml离心管中，离心并去除多余海水，加入RNA store于-20℃冰箱内保存，用于后期基因表达的检测。
最终从基因表达的结果来看：在缢蛏幼虫从壳顶到匍匐期发育过程中，在不同浸泡时间检测到siRNA对目的基因的抑制作用(图3)，从而表明了siRNA对于目的的基因的沉默作用，如在8-12h时对目的基因的表达量较低，从而有效降低了靶基因的表达水平，因此可以得出，siRNA体外浸泡贝类幼虫的方法可行。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002461581490000071
/>
Figure BDA0002461581490000081
/>
Figure BDA0002461581490000091
/>
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 一种RNA干扰技术研究目的基因在贝类幼虫变态发育过程中的应用
<141> 2020-04-22
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2079
<212> DNA
<213> 多巴胺β-羟化酶的基因序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
ctcttgataa aaaaccgtat aaaaggttcg cagttctagc tattgttagt tagtccctaa 60
caataacatg ccactttact caactataca aacgatggac gctgctttac gccttttcgt 120
aggccttgcg gtgactttga tgatagtggg ccacaccgaa agtgcagcgg ttgatgctgt 180
gacatcagaa ccctttgatt tcagtgaagt gctggatagc aatggaaact atgtgctatt 240
ctggaatttc aacagtgcac acgtgacctt tgaagtacac gtgcagacca caggctgggt 300
cgggtttgga ctctccgaaa atggcaacat gttccccagc gacgtcgtta taggttgggt 360
agacgactct ggaaatgccc atttctccga tcgacacgcc aatggtcatc gtctgcctct 420
taaagacaag tcgcaggact ggcatcttct tcaaggctcg caagatggcg ctaaaactat 480
cctcaaattc cagcgcaaaa tagacacttg cgatccacag gatcgaacta ttccggaaaa 540
cacagctcgg gtgatctacg cttacaatga cgaggatcct gtttctgatg acgccattca 600
ttatcacgga agcacacggg gaacgaaaag tgtttctctc ctgtcatcca ttcagactcc 660
aacaaatcta ccatctgatg tgaaatatat tgacatcctc agtagaaatt acctcttgcc 720
gcctgcaaag acgacgtacc attgcttcgc gtttaagatg cccgatattg ggaaacacca 780
tatgataaag tttgagccta ttgtaacccc tggtaacgaa ggccatgtcc atcattttgt 840
gctgtctcga tgcaatgttt ccaacccaga tgacatagac ggcatccatg gcatgtgcta 900
cgacgacagg ccgaaggcac taccacagtg taatgaacaa attcttgctt gggctgttgg 960
cggagaggcg ttttacttcc cggaatcagt cgggttttcg atgggagggc cagaggatgg 1020
taatctgtac gttcttgaga ttcattacga taacccgtca cagcggtctg gagttattga 1080
taactcaggt atccgtctaa ctctgacgtc atcactacgc gcggaggagg ctgggatgct 1140
tatgattggg gacacggtta ctttcagtca gcttatccca ccgggcagac agaacttcgt 1200
cacagtggga atgtgcaatg ataaatgcat acaagagagc ctggaaagta gtaacctgac 1260
tgagataaat atttttgcga ttttccaaca ctcacatctg attggtcgag aaatcaggac 1320
acgccacttc cggaatggaa cggaaattga accacttcaa aacgacccat tttacgactt 1380
caactttcaa gagactcgca aattgcccaa agttgtaaaa gttcgtcaag gagatagtct 1440
tagcgttgat tgtgtctatg actccacgag tcgagtagga cttacctttg ggggcctgtc 1500
aacctccgat gagatgtgcc tttcattcat ttactactac cctaagtttc cactatcaat 1560
ctgtacttca cgcaggacct ataacgccgt caactcacca ccggctctgg cttaccacga 1620
tctggtctct gttgattggt caaaccaaac ggaagtggcg tttattgaag aaaagatcga 1680
acgttcaaag atcgctggac attgcattcg aactgaccaa ccgccaaact actttcaaga 1740
cttcgattcc acgatgtaca agcagccgtt tgttgcccca caaacagtgt gtacaaaccg 1800
gaagtagatc agtcggacgt gaacgtcggt catattttga acatttcccg tatttccgaa 1860
ctaatgtaca catccataga tgtagcaaat agtaaattag tcaaaattgt aacaattgtt 1920
tgtatgttcc agtgtgtaat acttcggtgc taagcaaatt tacaagcact tagtgacaga 1980
atatacactt gaattacgta caagtaaact gtgccaaatg tgtgaaaata aaaaagaaga 2040
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2079
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> siRNA的正义链序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ccaacacuca caucugauut t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> siRNA的反义链序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
aaucagaugu gaguguuggt t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 目的基因特异性引物F序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
gtgctgtctc gatgcaatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 目的基因特异性引物R序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
ccaacagccc aagcaagaat 20

Claims (2)

1.一种降低贝类幼虫变态率的方法，采用siRNA体外浸泡贝类幼虫，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示；所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.3所示；所述贝类幼虫为缢蛏幼虫。
2.一种降低贝类幼虫变态率的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.2所示；所述siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.3所示；所述贝类幼虫为缢蛏幼虫。
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