CN114703174B - 快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法是通过在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中引入多个靶向sgRNAs，从而实现通过PCR凝胶电泳完成长片段缺失的基因型检测以及G0代镶嵌性突变的表型检测方法，增加编辑效率；对于因繁殖周期较长或者不能实现实验室全生活史养殖而难以获得F1代的非模式动物，以及发育致死基因的功能研究，在G0代即能观察到镶嵌性突变表型。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用。
背景技术
非模式动物包括含有重要生物学意义和农业经济潜力的性状，其反向遗传学研究将从根本上解析非模式动物的独特性状和经济性状。但大多数非模式动物面临繁殖周期长和难以实现实验室全周期培养的瓶颈，在快速获得遗传操作纯系方面成本高，耗时长，难度大。
基因编辑技术是近年来研究基因功能和解析性状最直接有效的方法，在高等动物和模式动物中，基因编辑技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的TALENs、ZFNs基因编辑技术，到现在广泛应用的CRISPR/Cas9基因编辑技术。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)广泛存在细菌和古生菌内的免疫系统。作为一种编辑工具，CRISPR系统能够定点修饰基因组。与TALENs、ZFNs基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，自诞生以来便受到了广大科研人员的关注并得到迅速发展。CRISPR/Cas9技术一方面极大促进了模式物种尤其是非模式动物的基因功能研究，另一方面为重要农业物种经济性状的遗传解析提供了最直接有力的工具。目前，CRISPR系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面，研究者利用CRISPR/Cas9技术已成功的在人类、小鼠、拟南芥、高粱、斑马鱼、线虫、果蝇、山羊、牛、猪、家蚕、牡蛎、脊尾白虾等多种动植物中实现基因编辑。
CRISPR系统在缺乏供体模板的情况下，可以通过sgRNA在基因组的特定位点产生切割，继而引发宿主细胞的非同源末端连接NHEJ修复实现基因组编辑，NHEJ效率较高，随机产生片段插入和缺失，但单个sgRNA引发的缺失片段一般较短，无法快速筛选基因型突变体。此外，CRISPR系统在非模式动物的表型检测方面也存在许多局限，例如：因非模式动物繁殖周期长筛选F1代纯系周期长；因实验室全生活史培养体系受限无法获得F1代；因突变体致死无法获得纯系，而无法得到发育致死基因的突变体。
因此，在非模式动物中优化CRISPR系统，以实现简单、快速、高效的筛选突变体基因型和表型，研究靶基因功能的方法仍然有待进一步探索。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中引入多个靶向sgRNAs，从而实现通过PCR凝胶电泳完成长片段缺失的基因型检测以及G0代镶嵌性突变的表型检测方法，增加编辑效率。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，包含如下步骤：
针对靶基因设计2条以上sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现靶基因的长片段缺失突变；
提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；
对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型。
上述基因敲除方法在非模式动物基因编辑中的应用，其中，所述的非模式动物为水产经济贝类，例如长牡蛎。
一种长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，步骤如下：
针对长牡蛎β-tubulin基因设计5条sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1:1:1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现β-tubulin基因的长片段缺失突变；
提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；
对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型。
在一个具体的实施例中，所述将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中的方法为电穿孔法。
在一个具体的实施例中，所述电穿孔法的实验参数为40V/50ms。
在一个具体的实施例中，所述电穿孔法的100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL；受精卵的浓度为1000个/μL。
在一个具体的实施例中，所述5条sgRNAs由以下方法获得：
(1)根据SEQ ID NO:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的5个sgRNA位点，并针对这5个靶位点，设计5条长牡蛎β-tubulin基因sgRNA引物分别如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6所示；
(2)使用特异性引物SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6与通用引物合成sgRNAs的DNA模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5。
本发明技术方案的优点：
1、基于CRISPR系统中基因型检测耗时耗力的问题，在非模式动物中，面向靶基因设计2条以上sgRNAs，显著提高了基因敲除的效率，其中，使用5条sgRNAs的敲除效率为2条的5倍。
2、通过多条sgRNAs提高宿主DNA NHEJ修复系统中长片段修复的比率，继而提取编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，凝胶电泳观察目的条带大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速高效的检测到基因型突变；
3、本方法对于因繁殖周期较长或者不能实现实验室全生活史养殖而难以获得F1代的非模式动物，以及发育致死基因的功能研究，在G0代即能观察到镶嵌性突变表型。
附图说明
图1凝胶电泳法检测突变基因型；
图2β-tubulin基因原位杂交表型图；
图3野生型和突变型幼虫电镜表型图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，步骤如下：
(1)构建长牡蛎β-tubulin基因的5条sgRNAs
①设计sgRNA引物
长牡蛎β-tubulin基因含有7个外显子，其CDS序列如SEQ ID NO:1：
SEQ ID NO:1：
依据sgRNA设计原则，在长牡蛎β-tubulin基因第4，5，6外显子上针对5个靶点，分别设计5条sgRNA引物，核酸序列如下：
sgRNA1引物：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGGTAAGTTTGAGTGTAGT
TTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:2)；
sgRNA2引物：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCATGAAGAAGTGGAGACGG
TTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:3)；
sgRNA3引物：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGTTGTGTTTCCGACGAGT
TTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:4)；
sgRNA4引物：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAGTAGCTGCTGTTCTTGTTC
GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:5)；
sgRNA5引物：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGGGATGTCACAGACGGG
TTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:6)。
②sgRNAs DNA模板扩增与纯化
使用上述5条特异性引物sgRNAs与通用引物合成sgRNAs DNA模板。
通用引物序列如下：
CRISPR_REV_universal：5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATA
ACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’(SEQ ID NO:7)；反应体系为32μL ddH2O，40μL 2×PrimeSTAR Max DNA(TAKALA)，4μL 10μM F primer,4μL10μM Rprimer；
PCR反应条件为：95℃30s；35个循环包含95℃15s，60℃15s，72℃15s；72℃5min。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海上工)纯化sgRNAs DNA模板。
③sgRNA体外转录
以上述②中纯化后的PCR产物为模板，使用T7体外转录试剂盒(Thermo，AM1334)转录sgRNA，使用RNA纯化试剂盒(RNA Clean&Concentrator-5，ZYMO)纯化sgRNA，纯化后的sgRNAs的平均浓度约为3000ng/μL。
(2)受精卵外源分子导入
①长牡蛎受精卵获得
挑选适量的亲贝进行人工解剖，获取卵子和精子。在光学显微镜下初步观察活力，以精子剧烈游动，卵子大部分呈现圆形为状态较好。
②人工授精
在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为一个卵上结合3-5个精子适宜，观察第一极体出现时间，大约10min左右出现第一极体，出现第一极体10min内使用电转的方法导入外源Cas9蛋白和5条sgRNAs。
③电穿孔实验
100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL(受精卵的浓度约为1000个/μL)。其中，电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物是将sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5和Cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1:1:1:1混合而成；sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL。
使用多功能电穿孔系统(BTX-ECM830)进行电穿孔实验，将配制好的电穿孔体系转移至1mm电转杯中，电穿孔实验参数为40V/50ms。
将电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养。
(3)突变体基因型检测
使用试剂盒(RoomTempTM Sample Lysis Kit，诺唯赞)，每3-5个胚胎或幼虫混合提取基因组DNA。
在5条sgRNA靶向两侧设计基因型检测引物序列为：
testF1：5’-GGAACCTATCATGGAGACTCAGACT-3’(SEQ ID NO:8)，
testR1：5’-TTCTCCCTCTTCCTCCTCAAACTC-3’(SEQ ID NO:9)。
使用待基因型检测的幼虫DNA作为模板，testF1和testR1作为引物，扩增包含目的位点的基因片段。对PCR产物进行凝胶电泳实验，观察胶图(图1)。testF1和testR1扩增的野生型条带(WT)大小为1029bp，在突变样品中出现了比野生型条带小的条带，约为600bp(图1中条带1)，该条带即为编辑后的基因片段，含有该片段的个体即为编辑成功的个体；由此可见，由于本发明采用多条sgRNAs进行基因编辑，最终获得了长片段缺失性突变的个体，因而获得的突变个体的基因型可以直接通过凝胶电泳实验检测，检测结果更加直观。
(4)突变体表型检测
收集编辑后幼虫，进行β-tubulin基因原位杂交实验，结果见图2，图中阴影处为长牡蛎担轮幼虫纤毛轮信号，野生型幼虫纤毛轮信号完整，突变型幼虫纤毛轮发生镶嵌性缺失突变，虚线处纤毛轮信号消失。借助扫描电镜检测突变体镶嵌性突变表型，结果见图3，野生型幼虫纤毛完整，突变型幼虫纤毛出现镶嵌性缺失突变。
上述结果表明，利用本发明提供的长片段缺失镶嵌性突变的长牡蛎CRISPR/Cas9基因编辑方法能够介导目的基因产生长片段缺失性突变，能够通过凝胶电泳检测的方法快速高效的检测到突变基因型，能够通过镶嵌性突变检测到突变表型。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)
<400> 1
atgagggaaa ttgtgcatat gcaagctggc cagtgcggaa accagattgg tgctaaattc 60
tgggaagtga tatctgatga acacggcatt gacccaacag gaacctatca tggagactca 120
gacttgcagt tagaaagaat taatgtctac tacaatgaag caacaggtgg aaaatatgta 180
cctcgtagca ttcttatcga tcttgagcca ggaaccatgg actcagtccg atcaggccca 240
ttcggacaaa ttttcagacc agacaacttc gtgttcgacc ccgacagaat catgaacact 300
ttttccgttg tcccatctcc aaaagtatcc gacaccgtgg tggaacccta caacgctacc 360
ctctctgttc accaacttgt cgagaacacc gacgaaacat actgcattga taacgaggct 420
ctatatgaca tctgcttccg tacactcaaa cttaccaccc caacatacgg cgacctcaac 480
catctcatct cagctaccat gtccggagtc acaacatgtc tgagattccc tggtcaattg 540
aacgctgact taagaaagat cgctgtcaac atggtcccct tccctcgtct ccacttcttc 600
atgcctggat ttgctccatt gacatcacgt ggtagccagc agtacagggc tctgaccgtc 660
ccagaactga cccagcagat cttcgatgcc aagaacatga tggctgcctg cgatccacgt 720
cacggaagat acttaactgt cagcgccctc ttccgtggac gcatgtcaat gaaagaggtt 780
gacgaacaga tgttgaacgt ccagaacaag aacagcagct acttcgtgga atggatcccc 840
aacaacgtca agaccgccgt ctgtgacatc ccaccacgtg gtctgaaaat gtccgccacc 900
ttcgtcggaa acacaactgc catccaggaa ctcttcaaac gcgtgtctga acaattcact 960
gccatgttcc gtcgtaaggc tttcttgcat tggtacactg gtgagggtat ggacgagatg 1020
gagtttactg aggccgagtc caacatgaac gatttggtgt ctgagtacca acagtaccag 1080
gacgccaccg ccgaggagga gggcgagttt gaggaggaag agggagaaga ggaggcgcaa 1140
taa 1143
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaattaata cgactcacta tagggtggta agtttgagtg tagttttaga gctagaaata 60
gc 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaattaata cgactcacta taggcatgaa gaagtggaga cggttttaga gctagaaata 60
gc 62
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaattaata cgactcacta taggcagttg tgtttccgac gagttttaga gctagaaata 60
gc 62
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaattaata cgactcacta taggagtagc tgctgttctt gttcgtttta gagctagaaa 60
tagc 64
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaattaata cgactcacta tagggtggga tgtcacagac gggttttaga gctagaaata 60
gc 62
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60
gctatttcta gctctaaaac 80
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaacctatc atggagactc agact 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctccctct tcctcctcaa actc 24
Claims (2)
1.一种长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，步骤如下：
针对长牡蛎β-tubulin基因设计5条sgRNAs；将sgRNAs与Cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1:1:1:1的浓度配比制备成sgRNA和Cas9蛋白复合物；将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中，实现β-tubulin基因的长片段缺失突变；
提取基因编辑后幼虫基因组DNA，PCR扩增目的片段，通过凝胶电泳观察目的条带的大小，确定长片段缺失的突变条带，能够快速检测到基因型突变；
对基因编辑后的幼虫进行原位杂交并借助扫描电镜检测，能够在G0代即观察到镶嵌性突变表型；
所述将sgRNA和Cas9蛋白复合物导入受精卵中的方法为电穿孔法；
所述电穿孔法的实验参数为40V/50ms；
所述电穿孔法的100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL；受精卵的浓度为1000个/μL。
2.根据权利要求1所述长牡蛎中快速获得基因型和表型突变的CRISPR/Cas9基因敲除方法，其特征在于，所述5条sgRNAs由以下方法获得：
(1)根据SEQ ID NO:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的5个sgRNA位点，并针对这5个靶位点，设计5条长牡蛎β-tubulin基因sgRNA引物分别如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6所示；
(2)使用特异性引物SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:6与通用引物合成sgRNAs的DNA模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5。
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