CN105002217B - 用于制备永生化细胞的转座子载体、系统及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于制备永生化细胞的载体、系统及其使用方法。本发明要解决的技术问题是为制备永生化细胞提供一种新选择。本发明的技术方案是用于制备永生化细胞的piggyBac转座子载体，含有SV40TAg，且在SV40TAg的两端有FRT位点，而且实际插入基因组中的片段(潮霉素‑SV40TAg或新霉素‑SV40TAg)两端含有piggyBac转座酶剪切位点。本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞。本发明还提供了用于制备永生化细胞的系统，包括所述的载体和piggyBac转座酶表达载体。采用本发明的载体可以更有效更快速地建立永生化细胞系。

Description

用于制备永生化细胞的转座子载体、系统及其使用方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于制备永生化细胞的转座子载体、系统及其使用方法。

背景技术

将DNA导入细胞的方法有多种，包括利用一些转染试剂如磷酸钙，聚乙二醇，脂质体等介导，还有通过电转法，或者利用病毒作为媒介等策略。但这些方法都存在一些缺点，如电转法容易在操作过程中造成污染，对细胞损伤大；通过转染试剂法，电转法或腺病毒方法导入细胞内的DNA很难整合到细胞本身的DNA中；慢病毒或逆转录病毒虽可介导外源DNA插入细胞基因组，但是对外源DNA的长度有限制；另外每一段新的DNA都需要构建并包装一种新的慢病毒，其制备过程繁琐费时费力；而且进入每个细胞的病毒量有限；在制备和操作慢病毒的过程中，操作的人员需承担安全风险。

能够克服以上诸多缺点的一种工具就是转座子(transposons)。它是指能在宿主基因组不同位置间移动的遗传因子，其从一个位置转至另一位置的过程称为转座(transposition)。转座子包含目的DNA，而其两端通常具有末端重复序列(TerminalRepeat sequence)，这些序列可被有活性的转座酶识别，剪切并插入到细胞内相应DNA序列之中，从而实现目的DNA的稳定导入，piggyBac是从低等动物中发现的，在哺乳动物细胞中也具有很强活性的转座子系统，相对于慢病毒而言，它不仅安全，高效，而且操作简便，省时少力。在已发现的在哺乳动物细胞中有活性的几种转座子系统中，它具有活性强，上载量大，可无痕切除等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为制备永生化细胞提供一种新选择。

本发明的技术方案是用于制备永生化细胞的载体，含有SV40TAg表达元件，且在该表达元件两端有piggyBac转座酶剪切位点；SV40TAg基因序列SEQ ID No.1所示。

其中，所述的载体在SV40TAg表达元件与一个piggyBac转座酶剪切位点之间有潮霉素表达元件或新霉素表达元件。

其中，所述的载体在SV40TAg基因的两端有两个同向的FRT片段，FRT片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2。

具体的，所述的含有潮霉素表达元件的载体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

具体的，新霉素表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞。

本发明还提供了用于制备永生化细胞的系统，包括所述的载体和piggyBac转座酶。

进一步的，所述的piggyBac转座酶为表达piggyBac转座酶的质粒载体或腺病毒载体。

具体的，所述的表达piggyBac转座酶的腺病毒含有绿色荧光标记蛋白GFP或红色荧光标记蛋白RFP。

本发明还提供了用于制备永生化细胞的系统的使用方法，将所述的载体与piggyBac转座酶同时导入目的细胞；或者先将所述的载体导入细胞，然后再于48小时以内导入转座酶质粒载体或腺病毒载体。

SV40TAg是一种有效的可导致细胞永生化的基因之一，其作用机制并不完全清楚，但目前认为其主要是通过抑制p53等的作用，从而阻止了细胞凋亡。

pMPH86与pMPN86质粒转入大肠杆菌中扩增过程通过Spectinomycin(壮观霉素)筛选。其能够整合进入真核细胞基因组的部分为3’PB-TR与5’PB-TR之间含抗生素与SV40TAg等多个元件的序列。在此设计中它们分别发挥如下功用：3’PB-TR和5’PB-TR，被piggyBac转座酶识别与剪切位点；PTK-Hygro-TKPa，潮霉素表达元件，Psv40-Neo-PAsv40新霉素表达元件；hEFH，SV40TAg启动子，其活性较温和，有利于使永生化的细胞保持其原有的基本特性；FRT-1、FRT-2，Flippase重组酶剪切识别位点，在piMEF实施例中，运用表达Flippase的腺病毒Ad-FLP可有效切除已永生化的piMEF中的SV40TAg(图9)。

为了在使用过程中提供更多的抗性选择，发明人构建了另一种永生化载体pMPN86，它与pMPH86的不同之处仅在于用新霉素Neomycin表达元件(pMPN86中的Psv40-Neo-PAsv40包含的酶切位点见图5)替代了潮霉素Hygromycin表达元件(SEQ ID No.4代替SEQ ID No.3)，其他元件均与pMPH86相同。pMPH86载体，即pM-piggyBac-Hygromycin-FRT-SV40TAg-FRT的简称，其中PBTR-Hygromycin-FRT-SV40TAg-FRT-PBTR段可插入到细胞基因组DNA中。

为了增加重组效率，在载体构建的起初，采用了在原始FRT序列上游增加了重复序列的做法。为了构建载体的方便，合成FRT序列又添加了酶切位点(具体见实施例1)。

SEQ ID No.2FRT原始序列：

GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC

SEQ ID No.6FRT序列：

5’-gaagttcctattccGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’，下划线所示为增加的重复序列。

本发明的有益效果：本发明提供两种基于piggyBac转座原理的永生化载体。采用本发明的载体可以更有效更快速地建立永生化细胞系。同时本发明也还包括如何使用它们建立稳定永生化细胞系的方法。所述载体及方法可用于例如但不限于在体或离体的人，动物或植物原代细胞或未被永生化的细胞。本发明的永生化系统不用包装慢病毒，安全；每一个细胞有多个拷贝，效率高；所得到的永生化细胞的永生化状态可回复，在SV40Large T两端加有FRT位点，可通过外源表达重组酶Flippase(简写：FLP)切除SV40Large T，从而使已永生化的细胞回复到永生化前的状态。

附图说明

图1、pMPB2质粒图谱

3’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶3’末端识别位点；Psv40，Blasticidin启动子；Blasticidin，稻瘟霉素；sv40Pa，终止子；hEFH，目的基因启动子；sv40Pa(第二个)，目的基因终止子；5’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶5’末端识别位点；Ori，质粒固有骨架序列；SpnR，Spectinomycin-壮观霉素。

图2、pMPH86质粒图谱

3’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶3’末端识别位点；Ptk，Hygromycin启动子；Hygromycin，潮霉素；TKpA，Hygromycin终止子；hEFH，SV40large T-antigen启动子；FRT，Flippase重组酶识别位点；SV40large T-antigen，SV40大T抗原；sv40Pa，SV40large T-antigen终止子；5’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶5’末端识别位点；Ori，质粒固有骨架序列；SpnR，Spectinomycin-壮观霉素。

图3、pMPN86质粒图谱

3’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶3’末端识别位点；Psv40，Neomycin启动子；Neomycin，新霉素；PAsv40，Neomycin终止子；hEFH，SV40large T-antigen启动子；FRT，Flippase重组酶剪切识别位点；SV40large T-antigen，SV40大T抗原；sv40Pa，SV40largeT-antigen终止子；5’PB-TR/Coreins，piggyBac转座酶5’末端识别位点；Ori，质粒固有骨架序列；SpnR，Spectinomycin-壮观霉素。

图4、利用pMPH86与pMPN86永生化细胞的常规与备选方法流程图。

图5、pMPN86中的Psv40-Neo-PAsv40包含的酶切位点(1371bp)，通过在线分析工具生成。链接：(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)。

图6、pMPH86与pMPN86永生化载体构建流程图。

图7、永生化后的piMEF细胞可以长久存活(h表示小时，P表示细胞传代数)。

图8、piMEF细胞保持旺盛的增殖能力(a，台盼蓝染色法，b，WST-1(水溶性四唑盐测定法)。

图9、利用Ad-FLP(可识别FRT并切除两个FRT之间的序列)切除SV40T可使piMEF细胞增殖能力下降；a,piMEF细胞分别感染Ad-GFP，Ad-FLP腺病毒24小时后境下观察荧光；b,半定量PCR实验确认Ad-FLP有效切除sv40TAg(以GAPDH为内参对照)；c,d,结晶紫染色与定量分析显示Ad-FLP处理后细胞增殖变缓。

具体实施方式

本发明载体是基于piggyBac原理构建的载体，piggyBac转座酶，分离自鳞翅目蛾类物种。piggyBac原理,指通过“剪切-粘贴”机制，将转座子整合进入细胞基因组。所述的永生化是指正常细胞获得无限增殖的能力。

下述为载体构建过程使用到的分子克隆方法

1.碱裂解法小量制备质粒

实验所需要的三种溶制备方法。

溶液I:含50毫摩尔葡萄糖,25毫摩尔Tris-Cl(pH 8.0),10毫摩尔乙二胺四乙酸(pH8.0)；

溶液II:93毫升双蒸水,2毫升氢氧化纳(10摩尔/升),5毫升2％十二烷基磺酸钠；

溶液III:醋酸钾(5摩尔/升)60毫升,冰醋酸11.5毫升,双蒸水28.5毫升。

步骤：取过夜培养的2毫升菌液至离心管中，14000g(g:重力加速度)离心1分钟，弃上清。加入溶液Ⅰ200微升，剧烈震荡，然后加入溶液Ⅱ200微升，颠倒混匀，再加入溶液Ⅲ200微升，充分混匀，14000g离心2分钟，上清液转移到另一个干净的1.5毫升离心管中，加入异丙醇500微升，振荡混匀，14000g离心5微升，弃上清。75％乙醇洗涤沉淀两次，晾干后用70微升双蒸水溶解。

2.HiFi高保真PCR反应

High Fidelity PCR(高保真聚合酶链式反应)扩增，运用高保真的DNA聚合酶(

High-Fidelity DNA Polymerase，美国NEB公司)结合梯度退火PCR可以最大程度的避免PCR扩增过程中发生突变。若PCR反应产物需回收，用此法；若不回收，则采用普通PCR反应体系及反应条件。

具体反应体系为：5×HF Buffer 4.0微升，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸，10毫摩尔/升)0.6微升，DMSO(二甲亚砜)1.0微升，氯化镁(50毫摩尔/升)1.0微升，PCR引物1#0.4微升，PCR引物2#0.4微升，

DNA聚合酶0.2微升，模板DNA 0.5-3微升，双蒸水补充至总体积为20微升。

梯度PCR反应条件为：95℃预变性45秒；92℃变性20秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒，13个循环(每个循环退火温度降低1℃)；92℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸75秒，15～20个循环；最后70℃延伸5分钟。

3.酒精沉淀DNA

将HiFi PCR或其他需要回收的DNA片段用去离子水稀释成总体积至200微升，再加入7.5M醋酸氨100微升、氯仿(pH8.0)250微升，充分混匀，震荡15秒，14000g室温离心1分钟。转移上清至1.5ml EP管中，加入3～5微升糖原和100％冰酒精600～700微升，充分混合，室温下14000g离心5分钟，去上清，75％酒精振荡洗涤2次，将所得DNA溶于一定体积的双蒸水中。

4.限制性内切酶处理插入片段和质粒载体

反应体系如下：10×buffer 10.0微升，BSA(牛血清白蛋白)2.0微升，DNA 10.0微升，限制性内切酶3微升，双蒸水补足至100微升。

37℃水浴孵育30分钟(若降背景酶切，只需15-20分钟)后，立即取出置于冰上，然后进行后续实验。

5.胶回收DNA片段

为了去除混入DNA中的杂质(蛋白，酶等)，或者为了获得不同大小DNA混合物中的特定大小的片段，通常需要进行胶回收，在质粒构建过程中，一般原则是只对插入片段(insert)进行胶回收，而不对质粒载体进行胶回收，一是因为减少载体在紫外光的累积暴露时间，减少突变发生的机率，二是大多数情况下在双酶切准备载体的过程中切下来的片段非常小(通常小于100bp)，而这些小片段在酒精沉淀过程中绝大部分已经去除了。

步骤：在紫外灯下以最快的速度切下最小体积的含有DNA的琼脂糖凝胶块，置于胶回收纯化柱中，5000g离心10分钟；去除胶块，回收管底液体中的DNA，加双蒸水至200微升，加入100微升7.5M的醋酸铵，再加入250微升酚-氯仿，震荡15s，13000g离心1分钟，取上清加双蒸水至200微升；加入5微升糖原和700微升冰乙醇，剧烈震荡后14000g离心5分钟；70％乙醇洗涤2次，空气中晾干，用12微升双蒸水溶解DNA。

6.连接反应

T4DNA连接酶对经过双酶切和沉淀纯化等处理的插入片段和质粒载体进行连接，反应条件如下：5×Ligase缓冲液(Invitrogen)3.0微升，载体(50-100ng/微升)1.0微升，插入片段3.0微升，双蒸水7.0微升，T4DNA Ligase(BRL/Invitrogen)1.0微升。置于16℃孵育4小时。

取出加双蒸水至200微升；再加入5微升糖原、100微升7.5M醋酸胺，700微升冰乙醇，剧烈震荡后14000g离心5分钟；70％乙醇洗涤2次，空气中晾干后用30微升双蒸水溶解沉淀，备用。

7.降背景酶切

在连接过程中常会发生载体自连现象，在连接反应之后，电转之前进行特异性针对自连载体的酶切反应，可以很好的降低背景，提高连接成功率。

切背景反应与正常酶切反应有一些不同，一是内切酶的量是正常的是1/3，反应时间一般在15-20分钟。这主要是为了考虑到很多内切酶的纯度问题，避免对正确克隆的误切。

8.电转化和抗生素筛选：

取保存于-80℃低温冰箱的DH10B感受态细菌5微升，置于冰上解冻；准备1毫米电转杯(依次用双蒸水、70％乙醇和100％乙醇洗涤)，晾干后置于冰上预冷；取15微升连接产物，与DH10B感受态细菌混合后，将混合液加入预冷的电转杯中；1.8KV电压下进行电转化，随即加入500微升无抗生素LB培养液至电转杯中，抽吸混匀；取200微升混合液至LB平板(含100mg/ml壮观霉素)表面，涂布均匀后，倒置于37℃恒温培养15h后，观察菌落生长情况。

9.阳性克隆筛选

用10微升移液枪头挑取LB平板上生长的单菌落，安装于8道移液枪上，集满8个后，先在已经备好的PCR反应板中吹打数次，再在含有LB培养基的细菌培养板(96孔板)中吹打数次(PCR反应孔与培养板孔一一对应)，细胞培养板置于37℃，5％CO₂恒温中培养。

同时进行PCR筛选反应：10×PCR缓冲液1.0微升，dNTPS(10毫摩尔)1.2微升，二甲亚砜0.6微升，Primer1#(330纳克/微升)0.2微升，Primer2#(330纳克/微升)0.2微升，双蒸水6.7微升，Taq聚合酶0.1微升。

PCR筛选反应程序：95℃预变性2分钟；92℃变性20秒，55℃退火30秒，70℃延伸30秒，循环25次。

加入上样缓冲液，0.8％琼脂糖电泳(80伏，40分钟)，凝胶成像仪观察和成像。标记好PCR阳性克隆的编号，到细菌培养板上找到其对应位置，吸取孔内液体，加入3毫升LB肉汤培养基(含壮观霉素)，置于37℃水浴培养箱振摇过夜。

10.阳性克隆的鉴定

PCR筛选的克隆常常存在一定比例的假阳性，常规需要将质粒扩增后再鉴定，内容主要有三项：

(1)提取阳性克隆质粒，琼脂糖凝胶电泳观察比较与原载体分子量大小差异，正确的载体分子量应该等于原载体大小(减去酶切部位)加上插入部分之和。

(2)PCR法鉴定，引物针对插入序列设计(上游或下游在插入段，另一条在载体上对应)，理论上只有真正阳性克隆才会得到扩增。

(3)酶切鉴定，含3种，一是选理论上正确的位点切开质粒后通过凝胶电泳观察大小，看是否与理论一致，二是选载体上有而正确阳性克隆上没有的酶切位点，或者反过来，三是，选择连接时插入片段两端的两个酶切位点，对阳性克隆进行双酶切。观察是否有与插入片段大小一致的DNA片段被切出。

在上述三项鉴定均得到正确确认后，再将阳性克隆质粒送测序，本发明所提及质粒的构建均能过下图所示流程完成。因篇幅所限，在此只介绍所开发的几种工具质粒，而本发明后续实施例中用到的表达载体均是在各种piggyBac载体基础上建立的。

11.阳性克隆测序

测序样品准备：

(1)取阳性克隆菌5微升放入含有10ml LB培养基的50ml离心管中，37℃振摇培养过夜。

(2)取6-10ml过程夜培养的菌液，依Promega质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，得到100微升Wizard DNA(去除了绝大部分杂质及碎片的DNA)。

(3)取50微升Wizard DNA酒精沉淀后重新溶于10微升双蒸水中。

(4)准备至少10微升测序引物(浓度：30纳克/微升)，与质粒DNA一起送去测序中心。

实施例1 载体pMPH86与pMPN86的构建

构建pMPH86/pMPN86的工作流程如图6所示。具体步骤如下：

1.基础质粒pMP的制备。在piggyBac质粒pMPB2(该质粒来自美国芝加哥大学分子肿瘤实验室，其图谱见图1)的基础上，对其进行双酶切(Spe Ⅰ和Not Ⅰ)，平端化之后进行平端连接，经筛选鉴定，得到质粒pMP。在pMP基础之上构建pMPH86/pMPN86。

2.分别合成两端带有酶切位点(Kpn Ⅰ与BamH Ⅰ)的FRT-1的DNA单链，经退火(95℃，3分钟；25℃，25分钟)形成粘性末端双链DNA插入片段，即Kpn Ⅰ-FRT1-BamH Ⅰ。

正义链：cGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCg

反义链：tccGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCggtac

3.分别运用Kpn Ⅰ与BamH Ⅰ对pMP质粒先后进行酶切，回收载体。将载体与插入片段Kpn Ⅰ-FRT1-BamH Ⅰ进行连接反应。回收连接产物，铺板。

4.次日挑选阳性克隆，经筛选与鉴定得到中间产物pMP-FRT1质粒。

5.分别合成两端带有酶切位点(BstB Ⅰ与Nde Ⅰ)的FRT-2的DNA单链，经退火(95℃，3分钟；25℃，25分钟)形成粘性末端双链DNA插入片段。即BstB Ⅰ-FRT-2-Nde Ⅰ。

正义链：cgaaGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCca

反义链：tatgGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCtt

6.分别运用BstB Ⅰ与Nde Ⅰ对pMP-FRT-2质粒先后进行酶切，回收载体。将载体与插入片段BstB Ⅰ-FRT-2-Nde Ⅰ进行连接反应。回收连接产物，铺板。

7.次日挑选阳性克隆，经筛选与鉴定得到中间产物pMP-FRT-1-2质粒。

8.运用Xho Ⅰ与Nhe Ⅰ对pMPH质粒(该质粒来自美国芝加哥大学分子肿瘤实验室)进行双酶切，胶分离回收得到Xho Ⅰ-Hyg-Nhe Ⅰ插入片段；对pMPN质粒(该质粒来自美国芝加哥大学分子肿瘤实验室)进行双酶切，经胶分离回收得到Xho Ⅰ-Neo-Nhe Ⅰ插入片段。

9.先后运用Xho Ⅰ与Nhe Ⅰ对pMP-FRT1-1-2质粒进行酶切，回收载体。将载体与上一步得到的插入片段Xho Ⅰ-Hyg-Nhe Ⅰ进行连接反应产生pMPH-FRT-1-2。将载体与上一步得到的插入片段Xho Ⅰ-Neo-Nhe Ⅰ进行连接反应产生pMPN-FRT-1-2。将连接产物分别铺板。

10.次日分别挑选阳性克隆，经筛选与鉴定得到中间产物pMPH-FRT-1-2质粒与pMPN-FRT-1-2质粒。

11.运用高保真HiFi PCR扩增SV40T Antigen(大T抗原)，PCR引物序列(引物序列中带下划线的碱基为酶切位点BamH Ⅰ与Sal Ⅰ)：

上游引物：cgcggatcc ACCACC atg gat aaa gtt tta aac aga gag

下游引物：CGCGTCGAC tca agg ttc agg ggg agg tgt ggg agg

12.回收PCR产物，先后运用BamH Ⅰ与Sal Ⅰ进行酶切，回收酶切产物，得到两端分别为BamH Ⅰ与Sal Ⅰ粘性末端的插入片段BamH Ⅰ-SV40 T-Sal Ⅰ。

13.先后运用BamH Ⅰ与Sal Ⅰ对pMPH-FRT-1-2质粒进行酶切，将回收产物(载体)与插入片段BamH Ⅰ-SV40T-Sal Ⅰ进行连接。铺板。

14.先后运用BamH Ⅰ与Sal Ⅰ对pMPN-FRT-1-2质粒进行酶切，将回收产物(载体)与插入片段BamH Ⅰ-SV40 T-Sal Ⅰ进行连接。铺板。

15.次日分别挑选阳性克隆，经筛选与鉴定得到最终产物pMPH-FRT1-SV40T-FRT2质粒，即pMPH86(载体图谱见图2)，和pMPN-FRT1-SV40T-FRT2质粒，即pMPN86(载体图谱见图3)。

实施例2运用piggyBac永生化载体构建小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系

为了说明前述载体工具的有效性，本实施例提供运用pMPH86制作小鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的实施例。永生化细胞系的流程应该参见图4之常规方案。

1.CD1小鼠受孕(以检到阴栓为受孕首日)后分笼单独饲养，12.5-13.5天后进行安乐死处理(二氧化碳箱5分钟后断颈)。

2.分离胚胎，10毫升无菌PBS漂洗，去除内部头颈，四肢，尾部及所有内脏；充分剪碎，并通过在存在18号注射器(美国BD公司)反复抽吸5次，加入0.25％胰蛋白酶。37℃孵育15分钟；

3.用含10％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(即完全培养基，下同，购自美国invitrogen公司)中和胰蛋白酶，离心收集细胞。

4.将完全培养基重悬的细胞铺到细胞培养皿中，并在37℃下温育24小时。

5.胰酶消化贴壁细胞，加入新鲜培养基终止消化，用移液器移除组织块，离心收集细胞。

6.将原代MEF细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)接种在25平方厘米培养瓶中，密度以80％左右为宜。

7.贴壁后进行共转染：将永化化质粒pMPH86和piggyBac转座酶表达质粒“SuperPiggyBac”(购自美国SBI公司)各5微升一起加入含100微升空白DMEM培养基的EP管中，另取10微升Lipofectemine 2000(购自美国Invitrogen公司)加入另一含100微升空白DMEM培养基的离心管中，混匀后将两者混合，室温静置20分钟。原代培养的MEF细胞用空白DMEM培养基漂洗一次后，再加入2.5ml空白DMEM，置于37℃孵箱中10-15分钟后，加入之前准备好的质粒与脂质体混合液，轻轻转动培养瓶混匀。

8. 4小时后吸去转染培养基，加入完全培养基继续培养。

9. 3天后开始加入潮霉素(Hygromycin，0.4毫克/毫升)筛选，2轮，一周后撤药，继续培养，至此piMEF稳定系建立。

10. piMEFs细胞(永生化的小鼠胚胎成纤维细胞)收集后于液氮罐中保存。

结果见图7，采用pMPH86建立的永生化细胞系piMEF保持了小鼠胚胎成纤维细胞的基本特性。永生化了的piMEFs比原代的MEFs细胞折光性更好，细胞形态即使在传至15代后仍保持的比较好，而原代的MEF细胞在传代后状态变差。

采用相近数目的MEFs和piMEF细胞以较低密度接种，然后在不同的时间点测量细胞的数目，结果显示本发明所制备的piMEF细胞保持旺盛的增殖能力(见图8)。

利用Ad-FLP(可识别FRT并切除两个FRT之间的序列)切除SV40TAg后使piMEF细胞增殖能力下降(图9)。这一实验是一方面可以反向验证TAg的作用，另一方面也显示出此系统具有可回复性。Ad-FLP是表达Flippase重组酶的腺病毒(Ad-GFP、Ad-FLP根据已发表文献构建：Jingyong Luo,etc.(2007)Nature Protocols 2(5):1236-1247)，Flippase可以特异性的识别DNA上的FRT序列，通过基因重组达到将两个FRT序列之间的DNA片段去除的目的。

贴壁生长的piMEF细胞长至70-80％汇合时，分别感染Ad-GFP与Ad-FLP腺病毒，4小时后换液，24小时后荧光镜下拍照记录感染效率(见图9a)。结果显示两组细胞病毒感染率相近，荧光信号分布均匀，细胞生长状态良好。

两组细胞感染36小时后，去除培养基，运用TRIZOL(购自Invitrogen公司)试剂提取总RNA，通过M-MuLV逆转录酶(购自New England Biolabs公司)转换成cDNA模板。采用半定量PCR法(以GAPDH为内参)比较两组细胞中SV40TAg mRNA的表达(见图9b)。结果显示Ad-FLP处理组细胞中SV40TAg mRNA表达水平明显降低，说明Ad-FLP通过FLP/FRT重组原理有效地切除了piMEF细胞基因组中的TAg序列。

PCR反应程序如下：

第一阶段：94℃ 2分钟 1×循环

第二阶段：92℃ 20 秒

68℃ 30 秒 12×循环(自68℃起每个循环降低1℃)

72℃ 40 秒

第三阶段：92℃ 20 秒

55℃ 30秒 25×循环

70℃ 40 秒

第四阶段：70℃ 5分钟 1×循环

半定量PCR中所用到的PCR引物序列如下：

GAPDH上游：GGCTGCCCAGAACATCAT，下游：CGGACACATTGGGGGTAG

SV40TAg：上游：GGTGGGTTAAAGGAGCATGA，下游：TAGTGGCTGGGCTGTTCTTT

piMEF细胞分别用Ad-GFP与Ad-FLP处理不同时间，去除培养基，直接用0.2％结晶紫室温下染色20分钟，流水小心洗去非特异染色。扫描仪下对细胞培养板照相，结果见图9c。

对结晶紫染色细胞进行定量检测，上述处理的细胞用10％醋酸溶解，室温20分钟，利用分光光度计检测570-590nm波长下各样本OD值(结果见图9d)。

图9c与图9d的结果显示，通过运用Ad-FLP病毒感染已永生化的piMEF细胞，从而切除TAg基因，导致piMEF细胞“去永生化”之后，不同时相点的结晶紫染色实验显示细胞的增殖能力明显下降。

Claims (3)

1.用于制备永生化细胞的系统，其特征在于：包括含有仅表达SV40TAg的表达元件的载体和表达piggyBac转座酶的载体，所述表达piggyBac转座酶的载体为表达piggyBac转座酶的质粒载体或腺病毒载体；所述含有仅表达SV40TAg的表达元件的载体中,所述表达元件的启动子是hEFH，所述SV40TAg 基因的两端有两个同向的FRT片段，且在该表达元件两端有piggyBac 转座酶剪切位点；SV40TAg 基因序列如 SEQ ID No.1 所示，FRT 片段的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示；在 SV40TAg 表达元件与一个 piggyBac 转座酶剪切位点之间有潮霉素表达元件或新霉素表达元件，所述潮霉素表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述新霉素表达元件的核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示。

2.如权利要求1所述的用于制备永生化细胞的系统，其特征在于：所述表达piggyBac转座酶的腺病毒载体表达绿色荧光标记蛋白 GFP 或红色荧光标记蛋白 RFP。

3.权利要求1或2所述用于制备永生化细胞的系统的使用方法，其特征在于：将所述含有仅表达SV40TAg的表达元件的载体与表达piggyBac 转座酶的载体同时导入目的细胞；或者先将所述含有仅表达SV40TAg的表达元件的载体导入细胞，然后再于 48 小时以内导入所述表达piggyBac转座酶质粒载体或腺病毒载体。

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