CN103602630A

CN103602630A - 一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法

Info

Publication number: CN103602630A
Application number: CN201310637730.8A
Authority: CN
Inventors: 刘玉珍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2014-02-26

Abstract

本发明公开了一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，包括以下步骤：步骤一，取小块人宫颈瘤变组织；步骤二，用I型胶原酶消化分解后制成细胞悬液；步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定；步骤四，将细胞悬液接种到低胎牛血清培养基且经鼠尾胶原包被的培养瓶中，等待细胞贴壁；步骤五，细胞贴壁后更换无血清培养基对宫颈上皮内瘤变细胞进行纯化，每周更换至少两次培养液，待细胞融合至80％～85％后传代；利用该方法培养出来的CIN细胞成活率高，纯度高，传代后细胞的形态与原代无明显改变，携带人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)；CIN细胞体外培养成功，为宫颈癌的治疗研究提供了技术保障。

Description

一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其涉及一种宫颈上皮内瘤变细胞的培养方法。

背景技术

宫颈癌是世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤，其发生是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的过程，时间可以从数年到数十年。这种癌前变化代表了一系列组织学异常的宫颈上皮细胞，故又称为宫颈上皮内瘤变(Cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)。根据细胞异常的程度，CIN又进一步分为CINI(轻度不典型增生)，CINII(中度不典型增生)和CINIII(重度不典型增生和原位癌)。CINI在大多数情况下会自然消退，因此，事实上不属于癌前病变的范畴；但是CINII和CINIII往往持续存在，其中20％～45％未经治疗CINII／III会进一步发展成宫颈癌，因此，CINII和CINIII被认为是高级别病变和宫颈癌前病变。研究认为，几乎所有高级别CIN都是由致癌性人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的持续感染引起的，而长期的病毒感染是CIN进一步发展的必要条件，但是，病毒没有自己独立的代谢系统，必须寄生在宿主细胞中才能繁殖，因此，HPV不能在进行细胞外培养。在CIN生物学特性的体内外研究中，培养自然HPV感染的CIN细胞具有重要意义。

由于技术和方法的问题，人CIN细胞的体外培养及特性等研究仍然很不成熟，特别是标本的大小问题。宫颈发生瘤变的组织往往较小，进行分离后很难得到足够的CIN细胞进行培养。到目前为止，只有两篇文献对CIN细胞的分离及培养方法进行了描述。其中一项研究中采用的是“组织块培养法”，对整块病变组织进行显微镜下分割后转入培养瓶中进行培养，收集从组织块中长出的角质细胞并接种到灭活的小鼠成纤维细胞滋养层上。该种方法的主要缺点在于经过辐射处理的小鼠滋养层细胞有病毒感染等潜在风险。此外，角质细胞收集的数量较少，且容易在培养中被快速生长的成纤维细胞所污染。另一项研究中，将CIN组织用II型胶原酶消化后接种到含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的DMEM-F12培养基中，与成纤维细胞共同培养。该培养方法的缺点在于培养方法相对复杂，培养过程中需剪除培养瓶上层，增加污染的风险，同时所需时间较长，需要五周传代。此外，培养基中的FBS增加了成纤维细胞污染的风险以及角质细胞的分化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成活率及纯度高且传代后细胞生物学特性无明显改变(即细胞无明显分化)，携带HPV的宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一，取小块人宫颈瘤变组织，小部分进行HPV分型检测，部分进行培养；

步骤二，用I型胶原酶消化分解后制成细胞悬液；

步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定；

步骤四，将细胞悬液接种到低胎牛血清培养基且经鼠尾胶原包被的培养瓶中，等待细胞贴壁；

步骤五，细胞贴壁后更换无血清培养基对宫颈上皮内瘤变细胞进行纯化，每周更换至少两次培养液，待细胞融合至80％～85％后传代。

步骤六，通过免疫荧光检测对细胞进行鉴定，通过PCR对HPV进行分型检测。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤一中，用3％～5％醋酸和卢格氏碘溶液标记病变组织，在阴道镜引导下活检钳钳取宫颈上皮内瘤变组织约2～3mm³，在甲硝唑液体中浸泡4～6分钟，将宫颈上皮内瘤变组织取出后置于转移培养基中3℃～5℃低温保存。

作为一种优选的技术方案，所述转移培养基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml链霉素和5ug／ml两性霉素。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤二中，取出宫颈上皮内瘤变组织放入陪替氏培养基中；在无菌条件下，将宫颈上皮内瘤变组织用含有青霉素、链霉素和两性霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～4次；

将宫颈上皮内瘤变组织剪碎，加入预热至36℃～38℃的I型胶原酶，然后将其移入无菌离心管中，用I型胶原酶冲洗陪替氏培养基并将冲洗液加入同一离心试管中；将离心试管放在置于电热恒温振荡器中，慢慢搅动25～35min，用吸液管吹打离散1～3min；

然后用吸液管吸取含有单个细胞的液体，用200目筛网过滤至无菌离心管中；用PBS冲洗离心管后将冲洗液过滤至同一离心管中；将含有单细胞悬液的离心管放置台式离心机上，以1000r／min离心4～6min；

弃上清液，重新加入完全培养液，用吸液管吹打成单细胞悬液；利用细胞计数板对细胞悬液进行细胞计数。

作为一种优选的技术方案，所述PBS中青霉素、链霉素和两性霉素的浓度分别为200U／ml、200ug／ml和5ug／ml。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤四中，将细胞分离后的细胞悬液接种在鼠尾胶原包被的培养瓶中，所用完全培养基为含有4％～6％FBS的无血清角质细胞培养基(K-SFM)；将培养瓶放置含4％～6％CO₂且温度为36℃～38℃的培养箱中培养，等待细胞贴壁。

作为一种优选的技术方案，在上述步骤五中，细胞贴壁后，进行细胞换液，所用完全培养基更换为K-SFM；每周至少2次更换培养液；用倒置显微镜观察细胞的生长状态；细胞融合至约80％～85％后传代。

作为一种优选的技术方案，所述培养瓶选用T25培养瓶。

由于采用了上述技术方案，一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，包括以下步骤：步骤一，取小块人宫颈瘤变组织；步骤二，用I型胶原酶消化分解后制成细胞悬液；步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定；步骤四，将细胞悬液接种到低胎牛血清培养基且经鼠尾胶原包被的培养瓶中，等待细胞贴壁；步骤五，细胞贴壁后更换无血清培养基对高级别宫颈上皮内瘤变细胞进行纯化，每周更换至少两次培养液，待细胞融合至80％～85％后传代；利用该方法培养出来的CIN细胞成活率高，纯度高，传代后细胞形态与原代比较无明显改变，HPV分型检测结果与培养前一致；CIN细胞体外培养成功，为宫颈癌的治疗研究提供了技术保障。

说明书附图

图1是原代培养细胞图；

图2是传代培养细胞图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，附图和描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。

一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一，取小块人宫颈瘤变组织，用3～5％醋酸和卢格氏碘溶液标记病变组织，醋酸含量选用5％最佳，在阴道镜引导下活检钳钳取宫颈上皮内瘤变组织约2～3mm³在甲硝唑液体中浸泡4～6分钟，本实施例选用5分钟，将宫颈上皮内瘤变组织取出后置于转移培养基中3℃～5℃低温保存，所述转移培养基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml链霉素和5ug／ml两性霉素，其中双抗浓度是常规浓度的10倍，目的是减少阴道内G⁺和G^-细菌的污染；

步骤二，取出宫颈上皮内瘤变组织放入直径9cm的塑料陪替氏培养基中；在无菌条件下，将宫颈上皮内瘤变组织用青霉素、链霉素和两性霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～4次，所述PBS中青霉素、链霉素和两性霉素的浓度分别为200U／ml、200ug／ml和5ug／ml；

用含有10％FBS的培养基对I型胶原酶进行消化，以减少消化过程中对细胞造成的损害；将宫颈上皮内瘤变组织剪碎，加入预热至36℃～38℃的I型胶原酶，以37℃最佳，然后用巴斯德吸管将其移入无菌离心管中，用2mlI型胶原酶冲洗陪替氏培养基并将冲洗液加入同一离心试管中；将离心试管放在置于电热恒温振荡器中，慢慢搅动25～35min，本实施例选用30min，用5ml的吸液管吹打离散1～3min，选用2min最佳；

然后用10ml的吸液管吸取含有单个细胞的液体，用200目筛网过滤至15ml的无菌离心管中；用5ml的PBS冲洗离心管后将冲洗液过滤至同一离心管中；将含有单细胞悬液的离心管放置台式离心机上，以1000r／min离心4～6min，离心5min即可；

弃上清液，重新加入5ml完全培养液，用5ml的吸液管吹打成单细胞悬液；利用细胞计数板对细胞悬液进行细胞计数。

步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定，台盼蓝拒染法为本领域的现有技术，这里不再赘述；

步骤四，将细胞分离后的细胞悬液接种在鼠尾胶原包被的培养瓶中，所述培养瓶选用T25培养瓶，所用完全培养基为含有4％～6％FBS的无血清角质细胞培养基(K-SFM)，本实施例选用含有5％FBS的无血清角质细胞培养基，该培养基可以促进细胞贴壁；将培养瓶放置含4％～6％CO₂且温度为36℃～38℃的培养箱中培养，在本实施例中，选用5％CO₂且温度为37℃的培养箱，等待细胞贴壁，细胞贴壁需要5天左右，5天后细胞贴壁能力逐渐减弱；

步骤五，细胞贴壁后，即大约五天后，进行细胞换液，所用完全培养基更换为K-SFM，目的是纯化CIN细胞，减少成纤维细胞的污染；每周2次更换培养液，首次换液时间由传统的第3天延长至第5天换液；用倒置显微镜观察细胞的生长状态；细胞融合至约80％～85％后传代。

步骤五结束后，原代培养结束，可以根据需要进行传代培养，传代培养的方法如下：

1、吸取瓶中培养液用PBS冲洗一次；

2.加入1mL0.05％-0.01％的胰蛋白酶-EDTA，轻轻摇动，30s；

3.37℃的环境下放置一段时间，直至角化细胞分离。

4.用5ml的PBS冲洗培养瓶后将细胞悬液移至离心管中以终止消化，以1000r／min离心5min；

5.弃上清，加入10ml完全培养液，用10ml的吸液管吹打成单细胞悬液。分别接种于两个培养瓶中，3天后换液，每周更换2次培养液。

6.用倒置显微镜观察细胞的生长状态；

7.细胞融合至约80％后传代。

步骤六，通过免疫荧光检测对细胞进行鉴定，通过PCR对HPV进行分型检测；免疫荧光检测及PCR技术为本领域的现有技术，这里不再赘述。

原代细胞的生长特点：

CIN组织中分离出的细胞数大约在5～10×10⁴，细胞的活性大约在95％以上。第一天和第三天时，分别有约30％和60％以上的细胞贴壁生长。收集第三天未贴壁的细胞进行细胞活性测定显示细胞活性仍在80％以上，但是在接下来的三天时仅有30％的细胞在新的培养基中贴壁，同时，可能由于细胞密度较低，贴壁的细胞逐渐凋亡。因此，我们将首次换液时间改为第五天，结果有70％～80％的细胞贴壁生长，明显提高了细胞的贴壁率。培养至第7-8天时，CIN细胞形成多个群落，并以其大小形态不一、细胞核增大、深染等特点与成纤维细胞形成鲜明的区别，当这两种细胞开始生长的时候，都保持着各自的生长和形态特点。培养至第12～14天时，成纤维细胞几乎消失，CIN细胞融合约80％以上。上述培养过程重复3次，所得结果基本相似，如图1和图2所示。

CIN细胞的传代培养特点：

与原代细胞相比，传代CIN细胞的生长行为略有不同。24小时后，几乎所有CIN细胞均贴壁生长。传代CIN细胞的生长速度较原代细胞快，大约传代后第10天，约80％的细胞融合。此外，CIN细胞传代后仍然保持其大小不一，形状异常的形态，没有明显的分化现象，与原代细胞没有明显的不同。传代3次后CIN细胞生长速度逐渐减慢并凋亡。

本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims

1.一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤二，用I型胶原酶消化分解后制成细胞悬液；

步骤三，利用台盼蓝拒染法对细胞的活性进行判定；

步骤五，细胞贴壁后更换无血清培养基对宫颈上皮内瘤变细胞进行纯化，每周更换至少两次培养液，待细胞融合至80％～85％后传代；

2.如权利要求1所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，在上述步骤一中，用3％～5％醋酸和卢格氏碘溶液标记病变组织，在阴道镜引导下活检钳钳取宫颈上皮内瘤变组织约2～3mm³，在甲硝唑液体中浸泡4～6分钟，将宫颈上皮内瘤变组织取出后置于转移培养基中3℃～5℃低温保存。

3.如权利要求2所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，所述转移培养基含有2000U／ml青霉素、2000ug／ml链霉素和5ug／ml两性霉素。

4.如权利要求2所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，在上述步骤二中，取出宫颈上皮内瘤变组织放入陪替氏培养基中；在无菌条件下，将宫颈上皮内瘤变组织用含有青霉素、链霉素和两性霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～4次；

5.如权利要求4所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于：所述PBS中青霉素、链霉素和两性霉素的浓度分别为200U／ml、200ug／ml和5ug／ml。

6.如权利要求1所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，在上述步骤四中，将细胞分离后的细胞悬液接种在鼠尾胶原包被的培养瓶中，所用完全培养基为含有4％～6％FBS的无血清角质细胞培养基(K-SFM)；将培养瓶放置含4％～6％CO₂且温度为36℃～38℃的培养箱中培养，等待细胞贴壁。

7.如权利要求6所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，在上述步骤五中，细胞贴壁后，进行细胞换液，所用完全培养基更换为K-SFM；每周至少2次更换培养液；用倒置显微镜观察细胞的生长状态；细胞融合至约80％～85％后传代。

8.如权利要求6所述的一种宫颈上皮内瘤变细胞的体外培养方法，其特征在于，所述培养瓶选用T25培养瓶。