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Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung sowie ein Verfahren
zur Trennung co-kultivierter Zellpopulationen.
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Co-Kultivierung
ist für verschiedene biologische Systeme (Gewebe-/Zellarten)
möglich. Insbesondere werden oft tierische und humane embryonale
Stammzellen primär auf einem Feederzellen-Monolager kultiviert,
wobei die Feederzellen Wachstumsfaktoren liefern.
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Das
Hauptinteresse der Forschung an embryonalen Stammzellen gilt der
Differenzierung in spezialisierte Zellen, um diese für
mögliche Zellersatztherapien verfügbar zu machen.
Zur Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen
eingesetzt. Zellen eines Embryos werden dissoziiert und als Monolager
kultiviert. Die heterogene Zellpopulation kann durch Bestrahlung
oder Mitomycinbehandlung inaktiviert werden, sodass die Zellen sich
nicht mehr teilen können. Die Feederzellen sind jedoch
metabolisch noch aktiv. Die Proliferation embryonaler Stammzellen
ist von Substanzen abhängig, die von Feederzellen in das
Medium abgegeben werden. Um Stammzellen zu differenzieren, wird
die Gesamtkultur, inklusive der Feederzellen, von der verwendeten
Kultivierungsplatte entfernt. In Suspensionskulturen können
sich die Stammzellen zunächst in den so genannten hängenden
Tropfen zu „Embryoid Bodies" entwickeln. Diese „Embryoid
Bodies" sind eine Mischkultur aus Stammzellen und Feederzellen.
Auch in den nächsten Differenzierungsschritten, in denen
die Embryoid Bodies durch Zusatz spezifischer Botenstoffe in unterschiedliche
Zelltypen diffe renziert werden, sind die Kulturen durch Feederzellen
kontaminiert. Da sich die Stammzellen in den frühen Differenzierungsphasen
teilen, die Federzellen aber inaktiviert wurden, verändert
sich das quantitative Verhältnis des Stammzellen- und Feederzellenanteils.
Im Falle der Co-Kultivierung mit Feederzellen liegen die Stammzellen
also nicht rein, sondern in Mischung mit Feederzellen vor. Die Feederzellenkontamination
ist auch in geringem Ausmaß in differenzierten Zellpopulationen
nachzuweisen. Dies ist vor allem für regenerative Zellersatztherapien
problematisch, da die Feederzellen zusammen mit den Stammzellen
in entsprechende Organe transplantiert werden. Die Wirkung der heterogenen
Feederzellenpopulation im transplantierten Organ ist nicht beschrieben.
Es konnte allerdings in Untersuchungen gezeigt werden, dass die
Feederzellen die Funktion differenzierter Stammzellen modulieren
und dass transplantierte Feederzellen, auch einige Wochen nach Transplantation
im entsprechenden Organ nachzuweisen waren. Aus diesem Grund ist
eine vollständige Trennung von Stammzellen und Feederzellen
zu einem frühen Zeitpunkt unabdingbar.
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Aufgabe
der Erfindung ist es somit, co-kultivierte Zellpopulationen zu trennen.
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Die
Aufgabe wird durch die Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung
mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des
Anspruchs 1 und mit einem Verfahren zur Trennung mindestens zweier
co-kultivierter Zellpopulationen mit den Merkmalen des Anspruchs
5 gelöst. Die Unteransprüche enthalten zweckmäßige
bzw. vorteilhafte Ausführungsformen und Merkmale des Verfahrens
bzw. der Verwendung.
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Erfindungsgemäß wird
zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen
eine Vorrichtung verwendet, welche eine Mikroskopeinheit (1)
zur mikroskopischen Abtastung der Zellkultur (8), welche
mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen aufweist, in Kombination
mit einer Bilderfassungseinheit (2) und einer Bildauswerteeinheit
(3) zur Positionsdetektierung der Zellen in der Zellkultur (8),
eine Steuer- und Speichereinheit (4) zum Speichern der
detektierten Position der Zellen und ein Erntemodul (5)
mit einem Entnahmewerkzeug (10a) zur Entnahme der Zellen
an der detektierten Position der Zelle, umfasst.
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Die
Vorrichtung, welche erfindungsgemäß zum Einsatz
kommt, ist detailliert in der internationalen Anmeldung
PCT/EP2007/059951 beschrieben. Alle
in der
PCT/EP2007/059951 offenbarten
technischen Merkmale gehören zur Lehre der vorliegenden Erfindung.
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Im
Rahmen der Trennung verschiedener co-kultivierter Zellpopulationen
sind diverse Kombinationen von Zellpopulationen möglich.
Insbesondere können mindestens zwei co-kultivierte Zellpopulationen
getrennt werden, welche Feederzellen- und Stammzellenpopulationen
umfassen. Da die Aspirationsbedingungen den Kultivierungsbedingungen
angepasst werden können, kann die Methodik auch auf die
Trennung anderer co-kultivierter Zellpopulationen angewendet werden.
Weitere Ausführungsformen betreffen die Verwendung zur
Trennung von Endothelzellenpopulationen und Populationen von Zellen der
glatten Muskulatur sowie zur Trennung von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen.
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Es
konnte gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige
Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass
diese Methode der Stammzellenaufreinigung die Pluripotenz der Stammzellen
in keiner Weise beeinflusst.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung mindestens
zweier co-kultivierter Zellpopulationen umfasst das Ausführen
eines ersten Detektionsschritts zum Auswählen von Zellen
einer ersten Zellpopulation anhand von physischen und/oder physikali schen
Parametern und das Erfassen von Positionsdaten und Speichern der
erfassten Positionsdaten der ausgewählten Zellen in einer
Positionsdatenbank. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch folgende
Verfahrensschritte:
- – Ausführung
mindestens eines zweiten Detektionsschritts zur Erkennung mindestens
eines weiteren Parameters der Zellen der ersten Zellpopulation,
- – Erstellen von Vergleichsdaten aus den Daten des ersten
und zweiten Detektionsschritts und Zuordnen der Vergleichsdaten
zu den Positionsdaten,
- – Auswählen von Zellen anhand der Vergleichsdaten
und
- – Übergeben der mit den Vergleichsdaten verknüpften
Positionsdaten aus der Positionsdatenbank an eine Ernteeinheit.
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Das
Verfahren entspricht dem Verfahren, welches in der internationalen
Anmeldung
PCT/EP2007/059951 beschrieben
wurde. Alle in der
PCT/EP2007/059951 offenbarten
Verfahrensbesonderheiten gehören zur Lehre der vorliegenden
Erfindung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur
Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen dadurch
gekennzeichnet, dass die zu trennenden mindestens zwei co-kultivierten
Zellpopulationen Feederzellen- und Stammzellenpopulationen umfassen.
Ebenso ist es bevorzugt, das Verfahren zur Trennung von Endothelzellenpopulationen
und Populationen von Zellen der glatten Muskulatur sowie zur Trennung
von Endothelzellen- und Leberzellenpopulationen einzusetzen.
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Zur
Züchtung von Stammzellen werden beispielsweise Feederzellen
aus 13,5 Tage alten Mausembryonen gewonnen. Den Embryonen werden
Organe und Kopf entfernt. Die Zellen des Restembryos werden dissoziiert
und als Monolager kultiviert. Die heterogene Zellpopulation wird
durch Bestrahlung oder Mitomycinbehand lung inaktiviert, sodass die Zellen
sich nicht mehr teilen können, wobei die Feederzellen aber
metabolisch aktiv bleiben. Das erfindungsgemäße
Verfahren zur Trennung mindestens zweier co-kultivierter Zellpopulationen
umfasst die Auswahl von Zellen einer ersten Zellpopulation anhand
von physischen und/oder physikalischen Parametern. Wie beispielsweise
mittels Lichtmikroskopie erkennbar ist, weisen Feederzellen und
Stammzellen unterschiedliche Strukturen bzw. Formen auf (vgl.
1).
In der Lichtmikroskopie ist deutlich zu erkennen, dass Stammzellen
als fast runde Kolonien auf dem Monolager der lang gestreckten Feederzellen wachsen.
Entsprechend ist bei Verwendung der Vorrichtung aus
PCT/EP2007/059951 überraschenderweise
die Trennung der verschiedenen Zellpopulationen möglich.
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Das
Verwendung der Vorrichtung nach
PCT/EP2007/059951 sowie
das Verfahren sollen nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Trennung von Stamm- und Feederzellen
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Stammzellen
(D3) wurden für 5–8 Tage auf Neomycin resistenten
Federzellen kultiviert. Stammzellen einzelner Kolonien wurden mit
dem „Tool for non-floating cells" (Glaskapillare) unter
standardisierten Bedingungen (Saugdruck, Flüssigkeitsmenge) aspiriert.
Mit der Vorrichtung nach
PCT/EP2007/059951 war
es möglich, Stammzellen, die von verschiedenen Kolonien
innerhalb einer Petrischale gepickt wurden, individuell in spezifischen Wells
zu transportieren, so dass einzelne Klone untersucht werden konnten.
Der Feederzellenmonolayer wurde mit dem Neomycin-Resistenzgen transfiziert.
Dieses Gen wird nicht in der Stammzelllinie D3 exprimiert. Nach
der erfolgreichen Trennung der Zellpopulationen sollte das Neomycin-Resitenzgen
entsprechend nicht in den aspirierten Stammzellklonen nachzuweisen
sein. Die Trennung von Stamm- und Feederzellen ist in den
2A bis
2E dargestellt.
Diese Abbildungen zeigen die wiederholte Aspiration von Stammzellen
einer Kolonie (mikroskopische Analyse). Eine Expressionsanalyse
(RT-PCR) des in Feederzellen exprimierten Neomycin-Gens ist in
3 zu
sehen. Die mikroskopische Analyse und die daran anschließende
Expressionsanalyse verdeutlichen, dass die Aspiration der Stammzellen mehrmals
wiederholt werden konnte, bevor die Federzellen des Monolagers mit
aspiriert wurden. Erst nach der fünften Wiederholung wurden
auch Feederzellen aspiriert. Der Nachweis erfolgte anhand der Expression
des Neomycin-Gens in Spur E des elektrophoretisch aufgetrennten
Agarosegels.
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Beispiel 2
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Nachweis der funktionellen Integrität
der Stammzellen nach Aufreinigung (Trennung von Feederzellen)
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Embryonale
Stammzellen sind pluripotent, d. h. sie können in vitro
in unterschiedliche Zelltypen differenziert werden. Um nachzuweisen,
dass die frühe Trennung der embryonalen Stammzellen von
den Feederzellen die Fähigkeit der Stammzellen zur Differenzierung
in spezifische Zelltypen nicht attenuiert, wurden das Differenzierungspotential
von Feeder-freien Stammzellen und Stammzellen, die nach dem Standardverfahren,
also mit Feederzellen kultiviert wurden, anhand der neuronalen Differenzierung verglichen.
Die neuronale Differenzierung wurde anhand morphologischer Kriterien,
aber auch anhand der Expression von Markern, die in den verschiedenen
Phasen der neuronalen Differenzierung exprimiert werden, analysiert.
Es konnten zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im Differenzierungspotential
der Feeder-freien und der nach Standard-Protokoll differenzierten
Stammzellen gefunden werden (vgl. 3). Es konnte
gezeigt werden, dass eine reproduzierbare und vollständige
Trennung von Feeder- und Stammzellen erreicht werden kann und dass
diese Methode der Stammzellenaufreinigung die Pluripotenz der Stammzellen
in keiner Weise beeinflusst (vgl. 4).
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Beschreibung der Abbildungen/Figuren
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1:
Lichtmikroskop-Aufnahme von Stamm- und Feederzellen (Stammzellen,
die auf Feederzellen kultiviert wurden)
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2A bis 2E:
wiederholte Aspiration von Stammzellen einer Kolonie (mikroskopische Analyse)
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3:
Expressionsanalyse (RT-PCR) des in Feederzellen exprimierten Neomycin-Gens
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4:
Nachweis des Differenzierungspotentials (Vergleich Feeder-freier
und nach Standard-Protokoll differenzierter Stammzellen)
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1:
Vorrichtung nach
PCT/EP2007/059951 in
einer beispielhaften Ausführungsform
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- 1
- Mikroskopeinheit
- 1a
- Umlenkprisma
- 1b
- Linsensystem
- 2
- Bildaufnahmeeinheit
- 3
- PC
- 3a
- Bildauswerteeinheit
- 4
- Steuer-
und Speichereinheit
- 4a
- Monitor,
Display
- 5
- Erntemodul
- 5a
- Hubsäule
- 5b
- Verfahrantrieb
- 6
- Beleuchtung
- 7
- Beleuchtungsfilter
- 8
- Zellkultur
- 9
- xy-Tisch
- 10
- Werkzeugkopf
- 10a
- Entnahmewerkzeug
- 11
- Vereinzelungsbatterie
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 2007/059951 [0007, 0007, 0011, 0011, 0013, 0014, 0015, 0021]