JP6884868B2 - 多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法、多能性幹細胞の継代培養方法およびそれら方法に使用される装置 - Google Patents

多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法、多能性幹細胞の継代培養方法およびそれら方法に使用される装置 Download PDF

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Description

本開示は、多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法、多能性幹細胞の継代培養方法およびそれら方法に使用される装置方法に関する。
多能性幹細胞は、あらゆる組織に分化しうるその分化多能性ゆえに、組織分化の研究、薬物試験および再生医療などの様々な分野で幅広く用いられている。特にｉＰＳ細胞の樹立以降、この分野における研究の発展は著しく、再生医療実現に向けた様々な取り組みが世界中でなされている。
ところで、多能性幹細胞は、分化しやすく、一度分化してしまうと多能性を失う可能性があるため、多能性幹細胞の培養は、多能性幹細胞の未分化状態を維持しながら行う必要があり、未分化状態の維持は、多能性幹細胞の培養において最も重要な要素の一つであるといえる。
未分化状態を維持するためには、分化を阻害する薬剤の使用や、分化を開始した多能性幹細胞の除去などが行われる。多能性幹細胞の大量調製において、最も大きな障害となりうる問題の一つは、分化を開始した多能性幹細胞の除去である。分化を開始した細胞の除去が不十分な場合には、周囲の細胞の分化を誘導して培養細胞全体に悪影響を及ぼす可能性がある。しかし、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かの判断は、熟練した技術者によらなければ難しい。このようなことから、多能性幹細胞の大量調製には自ずと限界がある。そのため、少なくとも熟練した技術者の判断に依らずに多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法の開発や、分化を開始した多能性幹細胞を自動判定できる方法の開発が望まれていた。
これまで、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを確認する方法としては、ｑＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法、フローサイトメトリー法が使用されている（非特許文献１）。しかし、ｑＲＴ−ＰＣＲ法や免疫染色法は、測定に際し細胞を破壊する必要がある。フローサイトメトリー法は、非破壊測定が可能であるが、細胞をシングルセルの状態で懸濁する必要があり、煩雑な操作を要する場合がある。したがって、再生医療における多能性幹細胞の培養においては、非侵襲での培養環境、細胞品質管理手法が求められている。
近年、非侵襲的な培養環境、細胞品質のモニタリング手法として培地分析成分分析技術が本開示者らにより報告されている。特許文献１には、多能性幹細胞が培養された培養培地に含まれる細胞外代謝物の変動値の経時的変化に基づいて、多能性幹細胞の未分化状態を評価する工程を含んでなり、該細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニンおよびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１つである、多能性幹細胞の未分化状態の判定方法が開示されている。
特許文献２には、未分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞により分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養培地における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する方法であて、指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸およびリボン酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法が開示されている。
上述のような培地分析技術では、多能性幹細胞の培養において、培養培地における特定のマーカー代謝物を測定することによって、細胞の分化素状態を評価することが可能である。マーカー代謝物測定手法としては、液体クロマトフラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトフラフィー（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）等の成分分離手法と質量分析器（ＭＳ）等の検出手法を組み合わせた測定が一般的であるが、測定機器の大型化、データ取得の自由度が低い場合がある。
ＷＯ２０１６／０５２５５８号公報 ＷＯ２０１７／０６８８０１号公報
Nature Biotechnology 25, 803 - 816 (2007)
一方で、細胞外代謝物とそのスペクトル情報について回帰分析を行い、光学的に細胞外代謝物を簡易かつ迅速に定量する方法が知られている。しかしながら、多能性幹細胞の未分化状態の判定においては、多能性を保った培養培地から得られた教師データのみを使用した回帰モデルでは分化状態の指標となる代謝物の定量性が低く、判定に使用できないことが本開示者らの検討により明らかとなった。特に、大量の多能性幹細胞の培養培地を一斉に判定する必要がある場合などには、簡易迅速な検査法開発の要請が高い。
そこで、本開示は、簡易、迅速かつ高精度に多能性幹細胞の未分化状態の判定を行うための新規な方法および装置を提供する。
本開示者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、複数種の多能性幹細胞の対照培養培地を特定波長光によって測定し、得られた吸光度スペクトルデータから作成した解析モデルに基づき、簡易、迅速かつ高精度に多能性幹細胞の未分化状態の判定が可能であることを見出した。本開示は、このような知見に基づくものである。
本開示の一実施形態による多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法は、
波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得る工程、および
多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、上記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長またはその一部範囲の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定する工程
を含んでなり、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
を含んでなる方法である。
また、本開示の一実施形態による多能性幹細胞の継代培養方法は、継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなり、継代に必要な細胞が、上記判定方法により、未分化な細胞と判定された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、上記判定方法により、分化を開始した細胞と判定された多能性幹細胞である方法である。
また、本開示の一態様による多能性幹細胞の未分化状態の細胞培養装置は、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射する照射部と、
前記試料に照射された光の反射光、透過光または透過反射光を検出する検出部と、
多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長または特定波長の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定するデータ解析部と、を備え、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地
を含んでなる装置である。
本開示によれば、簡易、迅速かつ高精度に多能性幹細胞の未分化状態を判定することができる。
本開示の一実施形態における手順をまとめたフローチャートである。 本開示の一実施形態に係る多能性幹細胞の未分化状態を判定する細胞培養装置の構成を示す概略図である。 本開示の一実施形態の実施例における解析モデルの作成に用いた培養培地の回収方法を説明する模式図である。 本開示の一実施形態の実施例において得られた各培養培地に関して、波長２４０nm〜３００nmのＵＶスペクトルを測定した結果を示すグラフである。図４Ａは、各培養培地のＵＶスペクトルを示し、図４Ｂは、ＵＶスペクトルを２次微分処理を行って得られたグラフである。 本開示の一実施形態の実施例において得られた各培養培地のヒポキサンチン濃度をＬＣ−ＭＳ測定により測定した結果を示すグラフである。 本開示の一実施形態の実施例において、対照細胞の培養１日目〜７日目のサンプルのみを使用して作成したＰＬＡ−Ｒ解析モデルにおける、予測値および実測値の決定係数を示すグラフである。 本開示の一実施形態の実施例において、対象細胞と各胚葉に誘導した細胞の培養１日目〜７日目のサンプルを使用して作成したＰＬＡ−Ｒ解析モデルにおける、予測値および実測値の決定係数を示すグラフである。 本開示の一実施形態に関する実験において得られたデータに基づきＰＬＡ判別分析（ＰＬＡ−ＤＡ）モデルを作成した際に得られたグラフである。
発明の具体的な説明
本開示において、「多能性幹細胞の未分化状態の判定」とは、対象とする多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定することを意味する。
本開示で用いられる「多能性幹細胞」は、三胚葉のいずれの由来の細胞にも分化する能力を有する細胞を意味する。本開示で用いられる多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類の多能性幹細胞とすることができ、より好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヤギの多能性幹細胞とすることができ、さらに好ましくは、ヒトの多能性幹細胞とすることができる。本開示で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。従って、本開示で用いられる多能性幹細胞は、好ましくは、哺乳類のＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞であり、より好ましくは、霊長類若しくは齧歯類などのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本開示によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。
本開示で用いられる「培養培地」（単に「培地」ともいう）は、多能性幹細胞の未分化状態を維持するための培養培地を意味する。このような培養培地としては、多能性幹細胞の未分化状態を維持できれば、特に制限無く用いることができる。本開示で用いられる培養培地は、特に限定されないが、好ましくは、多能性幹細胞を培養することができる培地に未分化維持に寄与する因子が添加された培養培地とすることができる。多能性幹細胞を培養することができる培地としては、多能性幹細胞を培養することができれば、特に制限無く用いることができ、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８培地、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地、ｍＴｅＳＲ１等が挙げられる。未分化維持に寄与する因子としては、例えば、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン等が挙げられる。なお、培養培地は、培養工程中、所定時間周期で新しい培養培地に交換されるものであるが、詳細については後述する。
本開示で用いられる「分化誘導培地」（単に「培地」ともいう）は、多能性幹細胞の分化状態に誘導するための培養培地を意味する。このような分化誘導培地としては、多能性幹細胞を分化誘導できれば、特に制限無く用いることができる。本開示で用いられる分化誘導培地は、特に限定されないが、好ましくは、多能性幹細胞を培養することができる培養培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ―８培地、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地、ｍＴｅＳＲ１等）に、後述するような分化誘導に寄与する因子が添加された培養培地とすることができる。
本開示において、多能性幹細胞は、前記培地が添加された培養容器において培養される。本開示で用いられる培養容器としては、多能性幹細胞を培養することができれば、特に制限無く用いることができる。例えば、ディッシュ、マルチウェルプレート等を用いることができる。
吸光度スペクトルデータの取得
本開示においては、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射し、得られる吸光度スペクトルデータ中の測定全波長または特定波長の吸光度を、多能性幹細胞の未分化状態を判定の指標とすることを特徴としている。後述する実施例にも示される通り、特定の対照培養培地を利用した解析モデルの作成により、被検培養培地の吸光度スペクトルを指標とすることにより、多能性幹細胞の未分化状態を簡易迅速に特定することが可能であることが明らかとなった。
被検培養培地に照射する波長光の範囲は、紫外線領域から近赤外線領域に渡り有機化合物の吸収に関する多くの情報を取得する観点から、上述の通り、１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲とされるが、好ましくは１９０ｎｍ〜８００ｎｍであり、より好ましくは１９０ｎｍ〜４００ｎｍであり、さらに好ましくは２３０ｎｍ〜３００ｎｍである。上記波長光３００ｎｍ以下の範囲は、有機化合物の多種の官能基の励起波長が多く存在し、培地中の代謝物について吸収の変化も比較的大きいことから、正確な定量分析を行う上で有利である。また、上記波長光１９０ｎｍないし２３０ｎｍ以上の範囲は、吸光度測定において培地中の各有機物の吸収が分離困難となることを避ける上で有利である。
光源としては、タンングステンランプ、重水素ランプを使用できるが、特に限定されるものではない。光源から発せられた光は、直接またはファイバープローブ等の照射手段を介して検体試料（培養培地）に照射することができる。後述のように、試料に照射する前に分光器によって分光する前分光方式を採用してもよいし、照射後に分光する後分光方式を採用してもよいが、前分光方式が好ましい。前分光方式の場合は、光源からの光をプリズムで一度に同時に分光する方法と、回折格子のスリット間隔を変化させることにより連続的に波長を変化させる方法とがある。後者の方法の場合には、光源からの光を所定の波長幅で分解することによって、連続的に波長を変化させた連続波長光が試料に照射される。後述の実施例では２３０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲の波長光を波長分解能０．１ｎｍで分解し、波長を０．１ｎｍずつ連続的に変化させた光を試料に照射している。
試料に照射された光の反射光、透過光または透過反射光が検出器により検出され、生の吸光度スペクトルデータが得られる。生の吸光度スペクトルデータをそのまま使用して解析モデルによる検査・判定を行ってもよいが、得られたスペクトル中のピークを分光学的手法あるいは多変量解析手法により要素ピークに分解するなどのデータ変換処理を行い、変換後の吸光度スペクトルデータを使用して解析モデルによる検査・判定を行うことが好ましい。上記データ変換処理は、特に限定されるものではないが、分光学的手法としては、例えば、２次微分処理やフーリエ変換が挙げられ、多変量解析手法としてはウェブレット変換、ニューラルネットワーク法等が挙げられるが、簡易なノイズ除去等の観点からは、２次微分処理を行うことが好ましい。
データの解析方法（解析モデルの作成）
本開示においては、上述のようにして得られた吸光度スペクトルデータの中の測定全波長またはその一部範囲の吸光度を解析モデルで解析することによって、多能性幹細胞の未分化状態の判定を行う。
本開示の解析モデルは、多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて作成したものであり、対照培養培地は、多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地とを含むものとされる。分化誘導方向が異なる複数種の分化誘導培地を利用し、それらの吸光度スペクトルデータと、その他の物性値を用いて解析モデルを作成することは、多能性幹細胞の未分化状態を精度よく判定する解析モデルを取得する上で特に有利である。
また、多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と共に解析モデル作成に使用される一種以上の分化誘導培地は、好ましくは外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地から選択される二種以上の分化誘導培地であり、より好ましくは外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる三種の分化誘導培地である。未分化培養培地と共に各胚葉への分化誘導培地を解析モデルの作成に使用することは、多能性幹細胞の未分化状態の判定精度の顕著な向上の観点から特に有利である。
本開示の解析モデルに用いられる外胚葉系細胞、中胚葉系細胞または内胚葉系細胞への分化誘導培地には、各胚葉系細胞への分化誘導に寄与する因子が添加された培養培地好適に使用される。かかる上記添加因子の種類および量は、解析モデルを用いた判定の精度に応じて当業者が適宜設定することができる。
外胚葉系細胞への分化誘導培地に含まれる添加因子としては、ＳＢ４３１５４２、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＣＫＩ−７、ＶＥＧＦ等またはそれらの組み合わせが挙げられる。
また、中胚葉系細胞への分化誘導培地に含まれる添加因子としては、ＢＭＰ４、レチノイン酸、ＳＣＦ等またはそれらの組み合わせが挙げられる。
また、内胚葉系細胞への分化誘導培地に含まれる添加因子としては、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ、Ｗｎｔ−３ａ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ等またはそれらの組み合わせが挙げられる。
本開示において、被検培養培地および対照培養培地はいずれも、培地交換により交換された使用済み培養培地を使用することが好ましい。培地交換により交換された使用済み培養培地を繰り返し使用して解析モデルを作成することにより、多能性幹細胞の経時的な状態変化のモニタリングを有利に実施することができる。
多能性幹細胞の培養工程中、培地交換の時間周期は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、１２〜７２時間、好ましくは、２４〜４８時間とすることができる。
ここで、「培養工程中」とは、多能性幹細胞が、前記培養培地が添加された培養容器に播種され、培養された後、継代されるまでを意味する。多能性幹細胞は、培養工程中、培地交換が１〜５回行われるような密度で播種することができるが、好ましくは、２〜４回、より好ましくは３〜４回培地交換が行われるような密度で播種することができる。
その他の培養条件については、使用する多能性幹細胞の状態に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。
本開示の多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法においては、未分化維持に使用した培地または各胚葉系細胞への分化誘導培地の情報に基づいて解析モデルが予め作成されていることを要する。もっとも、この解析モデルはスペクトル測定時にあわせて作成することとしてもよく、かかる態様は、本開示における「予め作成」に含まれる。
解析モデルは多変量解析によって作成可能である。例えば、多能性幹細胞の未分化状態について判定する場合、各対象培養培地のスペクトル測定により取得した全波長の吸収スペクトルを格納するデータ行列を特異値分解によりスコアとローディングとに分解し、試料中の未分化状態の変動を要約する主成分を抽出する（主成分分析）。これにより、共線性（＝説明変数間の相関が高いこと）の少ない独立な成分を重回帰分析に使用できるようになる。そして吸収スペクトルデータ（スコア）を説明変数とし、多能性幹細胞の未分化状態の指標となる対象培養培地の物性値を目的変数とする重回帰分析を適用する。これにより、測定全波長あるいは特定波長の吸収スペクトルから多能性幹細胞の未分化状態を推定する解析モデルを作成できる。これら一連の作業（多変量解析）は主成分回帰法（ＰＣＲ: Principal Component Regression）あるいはＰＬＳ（Partial Least Squares）回帰法として確立されている（参考文献：尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者のための多変量解析−ケモメトリックス入門」、講談社、2002年）。回帰分析法としてはこのほかにＣＬＳ（Classical Least Squares）法などが挙げられる。本開示の一つの態様によれば、解析モデルはＰＬＳ法である回帰分析により作成される。
上述のような本開示の解析モデルの作成においては、多能性幹細胞の未分化状態が適切な判定の観点から、説明変数および目的変数として当業者により対照培養培地の特性値が適宜設定される。説明変数としては、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光についての吸光度スペクトルデータが挙げられるが、好ましくは上述のような被検培養培地への照射光と同様とされる。
また、目的変数としては、多能性幹細胞の未分化状態が適切な判定の観点からは、多能性幹細胞の分化状態と関連しうる細胞外代謝物の含有量とすることが好ましい。かかる細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、リボン酸、およびそれらの組み合わせが挙げられる。細胞外代謝物の含量は、多能性幹細胞の培養中に、細胞から培養培地に分泌される代謝物から細胞で消費される代謝物を引いた量である。
培養培地における細胞外代謝物の測定手段としては、特に制限無く、細胞外代謝物の種類、性質に応じて選択することができる。測定手段としては、例えば、酵素電極法、比色法、ガスクロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ質量分析、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ質量分析、キャピラリー電気泳動質量分析等が挙げられる。好ましくは、酵素電極法を用いるBioFlow（商標）ＳＴＡＴバイオセンサＢＭ―７Ｍ（王子計測機器社製）等の市販の分析機器を使用することができる。
なお、上記方法は定量的解析モデル作成の場合であったが、定性的解析モデルの作成には、クラス判別用の主成分分析法（ＰＣＡ：Principal Component Analysis）、ＳＩＭＣＡ法（soft independent modeling of class analogy）、ＫＮＮ法（k nearest
neighbors）等の多変量解析を適用してよい。ＳＩＭＣＡ法は、複数のグループ（クラス）についてそれぞれ主成分分析を行い、各クラスの主成分モデルを作成する。そして、未知試料が各クラスの主成分モデルに対して比べられ、その未知試料が一番適合する主成分モデルのクラスに割り当てられる。また、ＳＩＭＣＡ法などのクラス判別解析は、パターン認識により吸収スペクトルや回帰ベクトルを各クラスに分類する方法ということができる。
上記多変量解析を使用した解析モデルの作成は、自作ソフトや市販の多変量解析ソフトを用いて行うことができる。また、多能性幹細胞の未分化状態の判定用プログラムとして使用目的に特化したソフトの作成により、迅速な解析が可能になる。
多能性幹細胞の未分化状態の判定は、上記測定により得られる解析モデルと比較してどの程度変動しているかを分析し、変動度が基準範囲内にあるとき、当該細胞は未分化状態であると判定し、変動度が基準範囲外であるとき、当該細胞は未分化状態でないと判定することができる。
例えば、多能性幹細胞の未分化状態の判定は、上記被検培養培地における吸光度と、当該解析モデルにより予め設定される閾値とを比較し、吸光度が閾値よりも高い場合には、細胞は分化状態にあると判定することができる。
このような多変量解析ソフトを用いて組み立てられた解析モデルをファイルとして保存しておき、未知試料の測定時にこのファイルを呼び出し、未知試料に対して解析モデルを用いた定量的または定性的な検査・診断を行う。これにより、簡易迅速な多能性幹細胞の未分化状態の非侵襲的な判定が可能になる。なお解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルをファイルとして保存しておき、各モデルは適宜更新されることが好ましい。
本開示によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を判定することは、コンピュータ等により全行程を自動化することができる。従って、本開示の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。具体的には、本開示によれば、多能性幹細胞が培養された培養培地の分析結果を得る工程と、分析結果に基づいて多能性幹細胞の未分化状態を自動判定する工程とをコンピュータに実行させるためのプログラムが提供される。本開示によればまた、本開示のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。本開示によればさらに、本開示のプログラムをその内部記録装置に記録したコンピュータまたは本開示のコンピュータを備えた多能性幹細胞の未分化状態の評価のための自動判定システムが提供される。
本開示のプログラムは、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記録し、コンピュータに読み込ませて実行させてもよい。記録媒体は、磁気ディスクや光ディスク等の着脱可能なものに限定されず、ハードディスク装置やメモリなどの固定型の記録媒体でもよい。また、本開示のプログラムを、インターネット等の通信回線（無線通信も含む）を介して頒布してもよい。さらに、同プログラムを暗号化したり、変調をかけたり、圧縮した状態で、インターネット等の有線回線や無線回線を介して、あるいは記録媒体に収納して頒布してもよい。
上述のような、本開示の多能性幹細胞を未分化状態の判定方法は、細胞培養方法において利用することができる。本開示の一態様としては、
（ａ）未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
（ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換を行う工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたインキュベーション済み培地に、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得る工程と、
（ｄ）多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長またはその一部範囲の吸光度を解析することにより多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
を含んでなり、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
を含んでなる、多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法が提供される。
本開示によれば、多能性幹細胞を破壊せずにその未分化状態を判定することができ、該方法により、未分化の細胞と判定されれば、培養を継続し、一方で、分化を開始した細胞と判定されれば、除去することができる。よって、本開示による判定方法は、多能性幹細胞の継代培養方法に適用することができる。
本開示の継代培養方法において、本開示の判定方法により分化を開始した細胞と判定された細胞は、培養および／または継代に不要な細胞として除去することができる。ここで、不要な細胞の除去は、培養中に行うこともできるし、あるいは、継代の際に行うこともできる。不要な細胞の除去は、また、培養培地の分析を行うという本開示の特徴から、光学顕微鏡等を用いた観察を併用して培養容器中において位置特異的に行ってもよい。培養容器中における位置特異的な細胞の剥離・除去は、例えば、ＷＯ2015/058841号公報の記載に基づき実施することができる。
以上説明した解析モデル作成ステップ、および解析モデルによる未分化状態の判定ステップをまとめたものが図１に示される。解析モデル作成ステップでは、例えば、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を多能性幹細胞を培養した培養培地に照射し、続いて得られた吸光度スペクトルデータに、分化指標情報（細胞分化の指標となる細胞外代謝物の含有量等）をアノテーションし、正規化、微分処理等の前処理を行う。そして、吸光度スペクトルデータを説明変数、分化指標情報を目的変数として多変量解析を行い、解析モデルを作成する。こうして作成した解析モデルを用いて未分化状態を予めスコア化し、未知サンプル（被検培養培地）の吸収スペクトル測定を行い、正規化、微分処理等の前処理を経て、解析モデルに基づき未知サンプルの未分化状態の判定スコアを算出することで、多能性幹細胞の未分化状態を判定することができる。以前作成した解析モデルよりも評価の高い解析モデルが得られれば、更新するなどして適宜モデルを再構築すればよい。
次に、図２を参照して、本開示の一実施形態に係る多能性幹細胞の未分化状態を判定する細胞培養装置について説明する。図２は、本開示の一実施形態に係る装置の構成を示す概略図である。図２において、配線の接続は実線で示されており、培養培地に照射される波長光は破線で示されている。
本実施形態に係る装置１は、多能性幹細胞の未分化状態を判定する装置である。装置１は、細胞形態観察に基づく細胞状態判定と、細胞培養に使用された培地の成分分析に基づく細胞状態判定とを併用して、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定しながら（必要に応じて、当該判定で特定された、分化を開始した細胞を除去しながら）多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を未分化状態で培養することができる。
図２に示すように、装置１は、照射部２と、検出部３と、制御部４と、入力部５と、出力部６と、データ解析部７とを備えて構成することができる。以下では、各要素について説明する。
照射部２は、ＵＶランプ・ＬＥＤ等の光源８からの波長光（波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの全範囲またはその一部範囲）を測定対象である試料９に導く機能を有する。照射部２は、プローブを設けていてもよい。プローブは、例えば光ファイバー等のファイバープローブを選択し、ファイバーを介して測定対象（試料）に投光する構成とすることができる。
なお、光源８から発せられた光を直接測定対象である試料に照射する構成としてもよいが、その場合プローブは不要であり、光源が照射部として機能する。
上述のように、解析モデルが作成されれば、当該解析モデルによる未分化状態の判定に必要な波長光が決定される。本装置は、こうして決定された１または複数の波長域を試料に照射する構成とすることで装置構成をより単純化することができる。
本装置１は、照射部２において分光器１０をさらに備えている。図２のような培養培地に照射する前に分光器によって分光する前分光方式には、光源８からの光をプリズムで一度に同時に分光する方法と、回折格子のスリット間隔を変化させることにより連続的に波長を変化させる方法とがある。後者の方法の場合には、光源８からの光を所定の波長幅で分解することによって、連続的に波長を変化させた連続波長光が培養培地に照射される。例えば、２３０〜３００ｎｍの範囲の波長光を波長分解能０．１ｎｍで分解し、波長を０．１ｎｍずつ連続的に変化させた光を培養培地に照射することが可能である。なお、図２では、前分光方式を採用しているが、培養培地に照射後に分光する後分光方式を採用してもよく、本開示にはかかる態様も包含される。上述の分光器１０は、公知の手段によって構成することができる。
また、本装置１は、照射部２から培養培地に照射された波長光の反射光、透過光または透過反射光を検出する検出部３をさらに備えている。検出方法には３種類あり、反射光検出、透過光検出および透過反射光検出がある。反射光検出および透過光検出は、それぞれ、測定対象物からの反射光と透過光とを検出器によって検出する。透過反射光検出は、入射光が測定対象物内に入射した屈折光が物体内で反射し、再び物体外に放射された光を検出する。本装置の検出部３は、反射光検出、透過光検出および透過反射光検出のいずれの検出方式を採用するものであってもよい。
検出部３では、養培地に照射された波長光の反射光、透過光または透過反射光を検出する検出装置として、例えば半導体素子であるＣＣＤ（Charge Coupled Device）などを用いることができるが、勿論これに限定されるものではなく、他の受光素子を使用してもよい。
検出部３は、図示しないが、多能性幹細胞を培養する培養培地を収容した容器を設置する培養容器設置部、培養容器をインキュベーションするためのインキュベーション部、培地交換するため培地交換部と一体的にまたは別体として構成されていてもよい。培養容器設置部、インキュベーション部、培地交換部は特許文献２等に記載の公知技術に基づき当業者は設置することができる。
検出部から波長別の吸光度、即ち吸光度スペクトルデータが得られる。データ解析部は、後述する制御部４からの指示信号に従い、吸光度スペクトルデータをもとに、解析モデルの作成し、さらには作成した解析モデルを使用して、被検培培地に培養された未分化細胞の分化状態の判定を行う。
制御部４は、照射部２（光源８および分光器１０）、検出部３の動作を制御し、測定（受光）のタイミングや光源の強度等を制御することができる。制御部４は、例えば、ＣＰＵ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等を備えたコンピュータで構成され、細胞培養装置１において記憶されている各種データ、各種プログラム等に基づいて、各種処理を行う。
入力部５は、例えば、オペレータが操作するキーボード、マウス等のポインティングデバイスから構成され、オペレータからの指示（例えば、処理の開始指示、処理結果の表示指示等）、各処理に必要なデータの入力等の各種操作信号を入力する。入力されたデータは、制御部４により記憶される。
出力部６は、例えば、ディスプレイ等から構成され、各種手段によって取得または分析された結果（例えば、未分化細胞の分化状態の分析結果等）を出力する。特に、出力部６は、データ解析部７における解析結果を表示する。具体的には、解析モデルによる解析の結果得られた分化状態などを表示する。定性モデルの場合は、そのクラス判別結果に基づき、「分化している」「分化している可能性高い」「分化している可能性低い」「分化の程度高い」「分化の程度低い」「未分化状態」などといった表示を行う。なお、本装置を小型化とする場合は、出力部６を液晶等のフラットディスプレイとすることが好ましい。
データ解析部７は、例えば、主記記憶部１１と、補助記憶部１２と、演算処理部１３から構成される。特に、主記憶部１１は、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等で構成され、測定プログラムやデータを一時保存する。より具体的には、主記憶部１１は検出部３で受光した光の強度を記録する。補助記憶部１２は、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）などであり、例えば、主記憶部１１同様のデータを記録し、さらには、演算処理部１３の作成した解析モデルや判定結果等を記録することができる。演算処理部１３はＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）等であり、主記憶部１１、補助記憶部１２から供給されるデータおよびプログラムに基づき、解析モデルの作成や多能性幹細胞の未分化状態の判定等の演算処理を行う。なお、解析モデルは、定量モデル、定性モデルなど複数の解析モデルを用意しておき、定量的評価を行うか、あるいは定性的評価を行うかに応じて、異なるものを使用してもよい。
本装置１は、以上のように、多能性幹細胞の未分化状態の判定に用いることができる。ここで、多能性幹細胞の未分化状態の判定とは、単に未分化状態かどうかの判定に限らず、分化度（未分化状態の程度）や分化の進行度の定量的評価、分化リスクの評価判定など、多能性幹細胞の分化状態に関する種々の判定を含む意味である。
また、本開示の一実施態様によれば、以下の（１）〜（２１）が提供される。
（１）多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法であって、
波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得、
多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長またはその一部範囲の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定すること
を含んでなり、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
を含んでなる、方法。
（２）前記複数種の分化誘導培地が、外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地を含んでなる、（１）に記載の判定方法。
（３）外胚葉系細胞への分化誘導培地が、ＳＢ４３１５４２、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＣＫＩ−７およびＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの分化誘導剤を含んでなる、（１）または（２）に記載の方法。
（４）中胚葉系細胞への分化誘導培地が、ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＳＣＦからなる群から選択される少なくとも１つの分化誘導剤を含んでなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記内胚葉系細胞への分化誘導培地が、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ、Ｗｎｔ−３ａ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷｏｒｔｍａｎｎｉｎからなる群から選択される少なくとも１つの分化誘導剤を含んでなる、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）多能性幹細胞の未分化状態を非侵襲的に判定する方法である、（１）〜（５）のいずれかに記載の判定方法。
（７）前記解析モデルが、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光についての複数種の対照培養培地の吸光度スペクトルデータを説明変数とする、（１）〜（６）のいずれかに記載の判定方法。
（８）前記解析モデルが、複数種の対照培養培地における細胞外代謝物の含有量を目的変数とする、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸およびリボン酸からなる群から選択される少なくとも1つのものである、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記解析モデルが、ＰＬＳ法である回帰分析により作成される、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記被検培養培地および対照培養培地が、培地交換により交換された使用済み培養培地である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）培地交換の時間周期が、２４〜４８時間である、（１１）に記載の方法。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
（１４）（１３）に記載のプログラムを記録したコンピュータに読み取り可能な記録媒体。
（１５）（１３）に記載のプログラムを内部記憶装置に記録したコンピュータ。
（１６）（１５）に記載のコンピュータを備えた、多能性幹細胞の未分化状態の自動判定システム。
（１７）継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、（１）〜（１２）のいずれかに記載の判定方法により、未分化な細胞と判定された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、（１）〜（１２）のいずれかに記載の判定方法により、分化を開始した細胞と評価された多能性幹細胞である、方法。
（１８）多能性幹細胞を未分化状態で培養するための細胞培養方法であって、
（ａ）未分化状態の多能性幹細胞および培地が収容された培養容器に対してインキュベーションを行う工程と、
（ｂ）工程（ａ）の終了後に、前記培養容器に対して培地交換を行う工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で回収されたインキュベーション済み培地に、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得る工程と、
（ｄ）多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長または特定波長の吸光度を解析することにより多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定する工程と、
を含んでなり、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
を含んでなる、細胞培養方法。
（１９）波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射する照射部と、
前記試料に照射された光の反射光、透過光または透過反射光を検出する検出部と、
多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長または特定波長の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定するデータ解析部と、を備え、
前記複数種の対照培養培地が、
多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地
を含んでなる、多能性幹細胞の未分化状態の判定装置。
（２０）照射前または照射後に分光する分光部をさらに備える、（１９）に記載の装置。
（２１）前記データ解析部が、多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて解析モデルを作成する、（１９）または（２０）に記載の装置。
以下に、具体的な実施例に則して本開示を詳細に説明するが、本開示は実施例の特定の態様により制限されると理解されるべきではない。本開示には、実施例に開示された発明のあらゆる改変や変更が含まれると理解されるべきである。
実施例１：多能性幹細胞の未分化状態と培養培地成分との関係についての検討
以下、本開示の方法による細胞の分化状態評価の一実施例について説明する。
図３は本実施例による細胞分化状態の評価モデル作成用の培養培地サンプルを回収するための実施手順を示す模式図である。
本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞株ＰＦＸ#９を使用した。また、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えたものを被検細胞とし、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えなかったもの（即ち、未分化状態を維持したもの）を対照細胞とした。以下、本実施例における細胞培養から培養培地サンプル（培養上清）の分析までの手順について説明する。
対照細胞およびその培養培地サンプルを以下の手順に従い用意した。
［対照細胞の培養および培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）コートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ａでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。維持培地としてはＴｅＳＲ−Ｅ８（STEMCELL Technologies社）を使用し、毎日培地の交換を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目(day0)として７日目(day7)まで培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養培地を質量分析用サンプルとした。
対照細胞から外胚葉細胞、中胚葉細胞、内胚葉細胞に誘導した細胞およびその培養培地サンプルを以下の手順に従い取得した。
［外胚葉分化細胞の培養および培養培地の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図３では簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降は外胚葉分化誘導因子（ＳＢ４３１５４２(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide、和光純薬工業株式会社）およびＮｏｇｇｉｎ（PeproTech社）)をそれぞれ終濃度10
μM、500 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより外胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目(day0)として７日目(day7)まで培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養培地を質量分析用サンプルとした。
［中胚葉分化細胞の培養および培養培地の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図３では簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降は中葉分化誘導因子（ＢＭＰ−４）を終濃度40 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより中胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目(day0)として７日目(day7)まで培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養培地を質量分析用サンプルとした。
［内胚葉分化細胞の培養および培養培地の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図３では簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目に内葉分化誘導因子（アクチビン−Ａ（Activin-A、PeproTech社）、Ｗｎｔ３ａ（Wingless-type MMTV integration site family, member 3A、PeproTech社）、ＢＭＰ−４（Bone Morphogenetic Proteins-4、PeproTech社））をそれぞれ終濃度100 ng/mL、40 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換した。２日目以降はアクチビン−ＡとＢＭＰ−４をそれぞれ終濃度100 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより内胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目(day0)として７日目(day7)まで培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養培地を分析用サンプルとした。
［培養培地のＵＶスペクトル測定］
得られた各培養培地サンプルに関して、ＵＶ測定装置（ＵｌｔｒｏＳｐｅｃ３３００ｐｒｏ，ＧＥヘルスケア社）を用いて波長２４０nm〜３００nmのＵＶスペクトルを測定し、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いて２次微分処理を行った。得られたＵＶスペクトルは図４Ａに示される通りであり、２次微分処理を行った結果は図４Ｂに示される通りであった。すなわち、図４Ａは、対照細胞の培養培地、外胚葉分化細胞の培養培地、中胚葉分化細胞の培養培地および内胚葉分化細胞の培養培地の０〜７日のＵＶ測定結果を併せて表示したものであり、図４Ｂはその２次微分処理を行った結果である。
［目的代謝物（ヒポキサンチン）のＬＣ−ＭＳ測定］
また、得られた各培養培地サンプルについて、以下の手順に従い、ヒポキサンチン濃度をＬＣ−ＭＳ測定により測定した。
前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mMイソプロピルリンゴ酸水溶液を20 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離（15,000 rpm、室温、15分間）して上清を回収し、超純水（Milli-Q（登録商標）水、メルク株式会社）で10倍希釈してＬＣ−ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析では、島津製作所製の「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ 細胞培養プロファイリング」（以下「ＭＰ」と略す）に収録された分析条件に従った。ＭＰは培地に含まれる化合物及び細胞から分泌される代謝物をＬＣ−ＭＳで分析するための分析条件パラメータが集約されたものである。化合物の同定は、ＭＰに登録されている標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±0.3分以内であること、定量イオン、確認イオンの両ピークが検出されていること、強度値が1000以上であることを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオン（定量イオン）についてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。
得られたヒポキサンチン濃度の結果は図５に記載の通りであった。
［ＰＬＳ法によるモデル解析］
得られたＵＶスペクトルデータを説明変数とし、ヒポキサンチンを目的変数としてＲ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いてＰＬＳ−Ｒ（Partial Least Squares Regression）により、Ａ）対照細胞の培養１日目〜７日目のサンプルのみを使用したモデル、Ｂ）対象細胞と各胚葉に誘導した細胞の培養１日目〜７日目のサンプルを使用したモデルの２種類を作成した。
Ａにおいて得られた予測値相関図は図６であり、Ｂにおいて得られた予測値相関図は図７に示される通りであった。図６および図７において、縦軸は予測値であり、横軸は実測値である。ＰＬＳ解析により得られた解析モデルを用いて、各生化学物質の量を高精度に予測することができた。図６では予測値と実測値の決定係数が０．５９であったのに対して、図７のモデルでは、決定係数が０．９１となり、大幅な向上が認められた。
また、図８に示される通り、本実験において得られた培養４日目〜７日目のデータに基づきＰＬＡ判別分析（ＰＬＡ−ＤＡ）モデルを作成した。ＰＬＡ−ＤＡモデルから培養培地の分光情報のみから多能性幹細胞の未分化状態をモニターできることが判る。
１ 細胞培養装置
２ 照射部
３ 検出部
４ 制御部
５ 入力部
６ 出力部
７ データ解析部
８ 光源
９ 試料
１０ 分光器
１１ 主記憶部
１２ 補助記憶部
１３ 演算処理部

Claims (16)

  1. 多能性幹細胞の未分化状態を判定する方法であって、
    波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射し、その反射光、透過光または透過反射光を検出して吸光度スペクトルデータを得る工程、および
    多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長またはその一部範囲の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定する工程
    を含んでなり、
    前記複数種の対照培養培地が、
    多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
    外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
    を含んでなり、
    前記被検培養培地が、多能性幹細胞の培養に使用しているかまたは使用済みの培養培地である、方法。
  2. 前記複数種の分化誘導培地が、外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地、および内胚葉系細胞への分化誘導培地を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記外胚葉系細胞への分化誘導培地が、ＳＢ４３１５４２、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＣＫＩ−７およびＶＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの添加因子を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記中胚葉系細胞への分化誘導培地が、ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＳＣＦからなる群から選択される少なくとも１つの添加因子を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記内胚葉系細胞への分化誘導培地が、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ａ、Ｗｎｔ−３ａ、ＢＭＰ４、ＣＨＩＲ９９０２１およびＷｏｒｔｍａｎｎｉｎからなる群から選択される少なくとも１つの添加因子を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 多能性幹細胞の未分化状態を非侵襲的に判定する方法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記解析モデルが、波長１９０ｎｍ〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光についての複数種の対照培養培地の吸光度スペクトルデータを説明変数として作成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記解析モデルが、複数種の対照培養培地における細胞外代謝物の含有量を目的変数として作成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞外代謝物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、アンモニア、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、３―ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸およびリボン酸からなる群から選択される少なくとも1つのものである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記解析モデルが、ＰＬＳ法である回帰分析により作成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記被検培養培地および対照培養培地が、培地交換により交換された使用済み培養培地である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 培地交換の時間周期が、２４〜４８時間である、請求項１１に記載の方法。
  13. 継代に必要な細胞を回収する工程と、培養および／または継代に不要な細胞を除去する工程とを含んでなる、多能性幹細胞の継代培養方法であって、継代に必要な細胞が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の判定方法により、未分化な細胞と判定された多能性幹細胞であり、培養および／または継代に不要な細胞が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の判定方法により、分化を開始した細胞と判定された多能性幹細胞である、方法。
  14. 波長１９０〜２５００ｎｍの範囲またはその一部範囲の波長光を、多能性幹細胞を培養する被検培養培地に照射する照射部と、
    前記試料に照射された波長光の反射光、透過光または透過反射光を検出する検出部と、
    多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて予め作成した解析モデルに基づき、前記吸光度スペクトルデータ中の測定全波長または特定波長の吸光度を解析することにより多能性幹細胞の未分化状態を判定するデータ解析部と、を備え、
    前記複数種の対照培養培地が、
    多能性幹細胞の未分化状態の維持に使用した培地と、
    外胚葉系細胞への分化誘導培地、中胚葉系細胞への分化誘導培地および内胚葉系細胞への分化誘導培地からなる群から選択される一種以上の分化誘導培地と
    を含んでなり、
    前記被検培養培地が、多能性幹細胞の培養に使用しているかまたは使用済みの培養培地である、細胞培養装置。
  15. 照射前または照射後に分光する分光部をさらに備える、請求項１４に記載の装置。
  16. 前記データ解析部が、多能性幹細胞の培養に使用した複数種の対照培養培地を用いて解析モデルを作成する、請求項１４または１５に記載の装置。
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