CN110997928A - 判定多能干细胞的未分化状态的方法、多能干细胞的传代培养方法及这些方法中使用的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种判定多能干细胞的未分化状态的方法，其包含向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据，通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态；其中，所述多种对照培养用培养基含有用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。

Description

判定多能干细胞的未分化状态的方法、多能干细胞的传代培 养方法及这些方法中使用的装置
技术领域
本发明涉及判定多能干细胞的未分化状态的方法、多能干细胞的传代培养方法及这些方法中使用的装置。
背景技术
多能干细胞由于其可分化为所有组织的分化多能性，因此在组织分化的研究、药物试验及再生医疗等各种领域中被广泛使用。特别是在iPS细胞建立以后，该领域中的研究发展显著，面向实现再生医疗的各种尝试正在世界范围内开展。
然而，多能干细胞容易分化，而一旦分化，则有可能丧失多能性，因此多能干细胞的培养需要在维持多能干细胞的未分化状态的情况下进行，未分化状态的维持可以说是多能干细胞的培养中最重要的要素之一。
为了维持未分化状态，使用阻碍分化的药剂、除去开始了分化的多能干细胞等。多能干细胞的大量制备中，会成为最大障碍的问题之一是除去开始了分化的多能干细胞。在开始了分化的细胞的除去不充分的情况下，有可能诱导周围细胞的分化而对培养细胞整体产生不良影响。但是，多能干细胞是否为未分化状态的判断如果不是由熟练的技术人员进行也很难。因此，多能干细胞的大量制备中自然存在界限。因此，希望开发一种至少不依赖于熟练的技术人员的判断而确认多能干细胞是否为未分化状态的方法、及开发出能够自动判定开始了分化的多能干细胞的方法。
迄今为止，作为确认多能干细胞是否为未分化状态的方法，使用qRT-PCR法、免疫染色法、流式细胞法(非专利文献1)。但是，qRT-PCR法或免疫染色法在测定时需要破坏细胞。流式细胞法可非破坏测定，但需要将细胞以单个细胞的状态悬浮，有时需要繁杂的操作。因此，在再生医疗中的多能干细胞的培养中，要求非侵袭式的培养环境、细胞品质管理方法。
近年来，作为非侵袭性的培养环境、细胞品质的监测方法，由本发明者们报告有培养基分析成分分析技术。专利文献1中公开了一种多能干细胞的未分化状态的判定方法，其包含基于培养有多能干细胞的培养用培养基中所含的细胞外代谢物的变动值的经时变化来评价多能干细胞的未分化状态的工序，该细胞外代谢物为选自由L-谷氨酸、L-丙氨酸及氨组成的组中的至少一种。
专利文献2中公开了一种细胞分化状态的评价方法，其特征在于，其是以未分化状态未知的干细胞或由干细胞分化诱导的细胞为受试细胞，基于该受试细胞在培养基中规定的指标物质的存在量来评价该受试细胞的分化状态的方法，其中，指标物质为选自由鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、天冬氨酸、精氨酸、2-羟基丁酸、2-羟基戊酸、3-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸和核糖酸组成的组中的至少一种化合物。
在上述那样的培养基分析技术中，多能干细胞的培养中，通过测定培养用培养基中特定的标记代谢物，能够评价细胞的分化状态。作为标记代谢物测定方法，一般是将液相色谱仪(LC)、气相色谱仪(GC)、毛细管电泳(CE)等的成分分离方法与质谱分析器(MS)等的检测方法组合进行的测定，但有时存在测定设备大型化、数据获得的自由度低的情况。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/052558号公报
专利文献2：WO2017/068801号公报
非专利文献：
非专利文献1：Nature Biotechnology 25,803-816(2007)
发明内容
发明所要解决的课题
另一方面，已知对细胞外代谢物及其光谱信息进行回归分析，以光学方式简易且迅速地对细胞外代谢物进行定量的方法。但是通过本发明者们的研究可知，在多能干细胞的未分化状态的判定中，对于仅使用了从保持多能性的培养用培养基得到的教导数据(teaching data)的回归模型而言，作为分化状态的指标的代谢物的定量性低，不能用于判定。特别是在需要同时判定大量的多能干细胞的培养用培养基的情况下等，开发简易迅速的检查法的需求很高。
因此，本发明提供一种用于简易、迅速且高精度地进行多能干细胞的未分化状态的判定的新方法及装置。
用于解决课题的手段
本发明者鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，利用特定波长光来测定多种多能干细胞的对照培养用培养基，基于由所得的吸光度光谱数据制作的分析模型，能够简易、迅速且高精度地判定多能干细胞的未分化状态。本发明正是基于这样的见解而完成的。
本发明的一个实施方式的判定多能干细胞的未分化状态的方法包含下述工序：
向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据的工序，及
通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态的工序；
其中，所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
另外，本发明的一个实施方式的多能干细胞的传代培养方法包含回收传代所需的细胞的工序、和除去培养和/或传代所不需要的细胞的工序而成，其中，传代所需的细胞是通过上述判定方法判定为未分化的细胞的多能干细胞，培养和/或传代所不需要的细胞是通过上述判定方法判定为开始了分化的细胞的多能干细胞。
另外，本发明的一个方式的多能干细胞的未分化状态的细胞培养装置具备：
照射部，其用于向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，
检测部，其用于检测照射到所述试样的光的反射光、透射光或透射反射光，
数据分析部，其通过基于使用多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或特定波长的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态；
所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
根据本发明，能够简单、迅速且高精度地判定多能干细胞的未分化状态。
附图说明
图1是整理了本发明的一个实施方式的步骤的流程图。
图2是表示本发明的一个实施方式的用于判定多能干细胞的未分化状态的细胞培养装置的构成的概略图。
图3是说明本发明的一个实施方式的实施例中的分析模型的制作中使用的培养用培养基的回收方法的示意图。
图4是表示对本发明的一个实施方式的实施例中得到的各培养用培养基测定波长240nm～300nm的UV光谱而得到的结果的图表。图4A表示各培养用培养基的UV光谱，图4B是对UV光谱进行二次微分处理而得到的图表。
图5是表示通过LC-MS测定对本发明的一个实施方式的实施例中得到的各培养用培养基的次黄嘌呤浓度进行测定而得到的结果的图表。
图6是表示对本发明的一个实施方式的实施例的仅使用对照细胞的培养第1天～第7天的样品制作的PLA-R分析模型中的预测值和实测值的决定系数的图表。
图7是表示对本发明的一个实施方式的实施例的使用对象细胞和诱导为各胚层的细胞的培养第1天～第7天的样品制作的PLA-R分析模型中的预测值和实测值的决定系数的图表。
图8是基于与本发明的一个实施方式相关的实验中得到的数据制作PLA判别分析(PLA-DA)模型时得到的图表。
具体实施方式
在本发明中，“多能干细胞的未分化状态的判定”是指判定作为对象的多能干细胞是否为未分化状态。
本发明中使用的“多能干细胞”是指具有分化为来源于三胚层中的任一种细胞的能力的细胞。本发明中使用的多能干细胞没有特别限定，优选可为灵长类细胞或啮齿类细胞等哺乳类的多能干细胞，更优选为人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛或山羊的多能干细胞，进一步优选为人的多能干细胞。作为本发明中使用的多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞或人工多能干细胞)、Muse细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell，多系分化持续应激细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)或胚胎生殖干细胞(EG细胞)等多能干细胞，优选为ES细胞或iPS细胞。因此，本发明中使用的多能干细胞优选为哺乳类的ES细胞或iPS细胞，更优选为灵长类或啮齿类等的ES细胞或iPS细胞，进一步优选为人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛或山羊的ES细胞或iPS细胞，最优选为人ES细胞或人iPS细胞。根据本发明，可以不使用饲养细胞(feeder cell)。
本发明中使用的“培养用培养基”(也简称为“培养基”)是指用于维持多能干细胞的未分化状态的培养用培养基。作为这样的培养用培养基，只要能够维持多能干细胞的未分化状态，则可以没有特别限制地使用。本发明中使用的培养用培养基没有特别限定，可优选为在能够培养多能干细胞的培养基中添加有有助于未分化维持的因子的培养用培养基。作为能够培养多能干细胞的培养基，只要能够培养多能干细胞，则可以无特别限制地使用，例如可举出Essential-8培养基、TeSR-E8培养基、ReproFF2培养基、mTeSR1等。作为有助于未分化维持的因子，例如可举出bFGF、TGF-β、胰岛素等。需要说明的是，培养用培养基是在培养工序中以规定时间周期更换为新的培养用培养基的培养基，详情后述。
本发明中使用的“分化诱导培养基”(也简称为“培养基”)是指用于诱导多能干细胞的分化状态的培养用培养基。作为这样的分化诱导培养基，只要能够分化诱导多能干细胞，则可以没有特别限制地使用。本发明中使用的分化诱导培养基并无特别限定，可优选为在能够培养多能干细胞的培养用培养基(Essential-8培养基、TeSR-E8培养基、ReproFF2培养基、mTeSR1等)中添加有有助于后述的分化诱导的因子的培养用培养基。
在本发明中，多能干细胞在添加有所述培养基的培养容器中培养。作为本发明中使用的培养容器，只要能够培养多能干细胞，则可以没有特别限制地使用。例如，能够使用培养皿、多孔板等。
吸光度光谱数据的获得
本发明的特征在于，向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，将得到的吸光度光谱数据中的测定全波长或特定波长的吸光度作为判定多能干细胞的未分化状态的指标。如后述的实施例所示，通过制作利用了特定的对照培养用培养基的分析模型、将受试培养用培养基的吸光度光谱作为指标，能够简易迅速地确定多能干细胞的未分化状态。
从跨越紫外线区域至近红外线区域地获得与有机化合物的吸收有关的大量信息的观点出发，如上所述，照射到受试培养用培养基的波长光的范围为190nm～2500nm的范围，优选为190nm～800nm，更优选为190nm～400nm，进一步优选为230nm～300nm。上述波长光300nm以下的范围存在大量有机化合物的多种官能团的激发波长，培养基中的代谢物的吸收的变化也比较大，因此在进行准确的定量分析方面是有利的。另外，上述波长光190nm至230nm以上的范围在避免吸光度测定中培养基中的各有机物的吸收变得难以分离方面是有利的。
作为光源，可以使用钨灯、氘灯，没有特别限定。从光源发出的光可以直接或介由光纤探头等照射单元照射到检体试样(培养用培养基)。如后所述，可以采用在对试样进行照射之前通过分光器进行分光的前分光方式，也可以采用在照射后进行分光的后分光方式，优选前分光方式。在前分光方式的情况下，有利用棱镜一次性同时对来自光源的光进行分光的方法、和通过使衍射光栅的狭缝间隔变化来使波长连续地变化的方法。在后者的方法的情况下，通过按规定的波长宽度对来自光源的光进行分解，使波长连续地变化得到的连续波长光照射到试样。在后述的实施例中，将230nm～300nm的范围的波长光按0.1nm的波长分辨率进行分解，向试样照射使波长每次0.1nm连续地变化而得到的光。
由检测器检测照射到试样的光的反射光、透射光或透射反射光，得到原始的吸光度光谱数据。可以直接使用原始的吸光度光谱数据进行基于分析模型的检查/判定，但优选进行通过分光学方法或多变量分析方法将得到的光谱中的峰值分解为要素峰值等的数据变换处理，使用变换后的吸光度光谱数据进行基于分析模型的检查/判定。上述数据变换处理没有特别限定，作为分光学方法，例如可举出二次微分处理或傅立叶变换，作为多变量分析方法，可举出小波变换、神经网络法等，但从简易的噪声除去等观点出发，优选进行二次微分处理。
数据的分析方法(分析模型的制作)
在本发明中，通过用分析模型分析如上所述得到的吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度，进行多能干细胞的未分化状态的判定。
本发明的分析模型是使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基而制成的模型，对照培养用培养基含有用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。利用分化诱导方向不同的多种分化诱导培养基，使用它们的吸光度光谱数据和其他物性值来制作分析模型在获得高精度地判定多能干细胞的未分化状态的分析模型方面是特别有利的。
另外，与用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基一起用于分析模型制作的一种以上的分化诱导培养基优选为选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的两种以上的分化诱导培养基，更优选为由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的三种分化诱导培养基。从多能干细胞的未分化状态的判定精度显著提高的观点考虑，将向各胚层分化诱导的分化诱导培养基与未分化培养用培养基一起用于分析模型的制作是特别有利的。
在本发明的分析模型中使用的向外胚层系细胞、中胚层系细胞或内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基优选使用添加有有助于向各胚层系细胞分化诱导的因子的培养用培养基。上述添加因子的种类和量可以由本领域技术人员根据使用了分析模型的判定的精度适当设定。
作为向外胚层细胞分化诱导的分化诱导培养基中所含的添加因子，可举出SB431542、Noggin、Dorsomorphin、CKI-7、VEGF等或它们的组合。
另外，作为向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基中所含的添加因子，可举出BMP4、视黄酸、SCF等或它们的组合。
另外，作为向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基中所含的添加因子，可举出Activin-A、Wnt-3a、BMP4、CHIR99021、Wortmannin等或它们的组合。
在本发明中，受试培养用培养基和对照培养用培养基均优选使用通过培养基更换而更换得到的使用过的培养用培养基。通过反复使用通过培养基更换而更换得到的使用过的培养用培养基来制作分析模型，能够有利地实施多能干细胞的经时的状态变化的监测。
在多能干细胞的培养工序中，培养基更换的时间周期只要是本领域技术人员就可以适当确定，例如可以为12～72小时、优选为24～48小时。
在此，“培养工序中”是指多能干细胞接种于添加有所述培养用培养基的培养容器中，培养后直至传代。多能干细胞可以以在培养工序中进行1～5次培养基更换的密度进行接种，优选可以以进行2～4次、更优选进行3～4次培养基更换的密度进行接种。
关于其他培养条件，本领域技术人员可以根据所使用的多能干细胞的状态来适当确定。
在判定本发明的多能干细胞的未分化状态的方法中，需要基于维持未分化所使用的培养基或向各胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基的信息来预先制作分析模型。当然，该分析模型也可以在光谱测定时一并制作，该方式包含在本发明中的“预先制作”中。
分析模型可通过多变量分析来制作。例如，在对多能干细胞的未分化状态进行判定的情况下，通过特异值分解将存储通过各对象培养用培养基的光谱测定获得的全部波长的吸收光谱的数据矩阵分解为得分和负载(loading)，提取影响试样中的未分化状态的变动的主成分(主成分分析)。由此，可以将共线性(＝解释变量间的相关性高)少的独立成分用于多元回归分析。然后，应用将吸收光谱数据(得分)作为解释变量、将作为多能干细胞的未分化状态的指标的对象培养用培养基的物性值作为目标变量的多元回归分析。由此，能够制作根据测定全波长或特定波长的吸收光谱来推定多能干细胞的未分化状态的分析模型。这一系列的操作(多变量分析)作为主成分回归法(PCR：Principal ComponentRegression)或者PLS(Partial Least Squares，偏最小二乘法)回归法而确立(参考文献：尾崎幸洋、宇田明史、赤井俊男「化学者のための多変量解析－ケモメトリックス入門」、講談社、2002年)。作为回归分析法，除此之外还可举出CLS(Classical Least Squares，经典最小二乘法)法等。根据本发明的一个方式，分析模型通过作为PLS法的回归分析制作。
在上述那样的本发明的分析模型的制作中，从适当判定多能干细胞的未分化状态的观点出发，由本领域技术人员适当设定对照培养用培养基的特性值作为解释变量及目标变量。作为解释变量，可举出波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光的吸光度光谱数据，优选与上述那样的向受试培养用培养基照射的照射光相同。
另外，作为目标变量，从适当判定多能干细胞的未分化状态的观点出发，优选能够与多能干细胞的分化状态关联的细胞外代谢物的含量。该细胞外代谢物可举出L-谷氨酸、L-丙氨酸、氨、鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、2-羟基丁酸、2-羟基戊酸、3-羟基戊酸、2-羟基异戊酸、3-羟基异戊酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、核糖酸和它们的组合。细胞外代谢物的含量是从多能干细胞的培养中由细胞分泌至培养用培养基的代谢物中减去被细胞消耗的代谢物的量。
作为培养用培养基中的细胞外代谢物的测定手段，没有特别限制，可以根据细胞外代谢物的种类、性质进行选择。作为测定单元，例如可举出酶电极法、比色法、气相色谱法、气相色谱质谱分析、液相色谱法、高速液相色谱质谱分析、毛细管电泳质谱分析等。优选可使用使用酶电极法的BioFlow(商标)STAT生物传感器BM-7M(王子计测机器公司制)等市售的分析设备。
另外，上述方法是定量分析模型制作的情况，对于定性分析模型的制作而言，可以应用类别判别用的主成分分析法(PCA：Principal Component Analysis)、SIMCA法(softindependent modeling of class analogy，独立软模式类簇法)、KNN法(k nearestneighbors，最近邻算法)等多变量分析。SIMCA法针对多个组(类别)分别进行主成分分析，制作各类别的主成分模型。然后，未知试样与各类别的主成分模型对比，该未知试样被分配到最适合的主成分模型的类别。另外，SIMCA法等的类别判别分析可称为通过模式识别将吸收光谱、回归向量类别为各类别的方法。
使用了上述多变量分析的分析模型的制作可使用自制软件、市售的多变量分析软件来进行。另外，作为多能干细胞的未分化状态的判定用程序，通过制作专用于使用目的的软件，可进行迅速的分析。
对于多能干细胞的未分化状态的判定，分析与通过上述测定得到的分析模型相比发生了何种程度的变动，当变动度处于基准范围内时，可以判定该细胞为未分化状态，当变动度处于基准范围外时，可以判定该细胞不是未分化状态。
例如，对于多能干细胞的未分化状态的判定，将上述受试培养用培养基中的吸光度与通过该分析模型预先设定的阈值比较，当吸光度比阈值高时，可以判定细胞处于分化状态。
预先将使用这样的多变量分析软件建立的分析模型保存为文件，在测定未知试样时调用该文件，对未知试样进行使用了分析模型的定量或定性的检查/诊断。由此，能够进行简易迅速的多能干细胞的未分化状态的非侵袭性判定。另外，分析模型优选预先将定量模型、定性模型等多个分析模型保存为文件，并适当更新各模型。
根据本发明，基于培养有多能干细胞的培养用培养基的分析结果判定多能干细胞的未分化状态可通过计算机等使全行程自动化。因此，提供一种用于使计算机执行本发明的方法的程序。具体而言，根据本发明，提供一种用于使计算机执行下述工序的程序：获得培养有多能干细胞的培养用培养基的分析结果的工序、和根据分析结果自动判定多能干细胞的未分化状态的工序。根据本发明，提供一种记录有本发明的程序的计算机可读记录介质。根据本发明，还提供了一种用于评价多能干细胞的未分化状态的自动判定系统，该系统具备在其内部记录装置中记录有本发明的程序的计算机或本发明的计算机。
本发明的程序也可以记录在软盘或CD-ROM等记录介质中，使计算机读入并执行。记录介质不限于磁盘、光盘等可装卸的介质，也可以是硬盘装置或存储器等固定型的记录介质。另外，也可以将本发明的程序经由互联网等通信线路(也包括无线通信)来分发。此外，也可以对该程序进行加密、调制，或者在压缩的状态下，经由互联网等有线线路、无线线路，或者收纳在记录介质中进行分发。
如上所述的将本发明的多能干细胞判定为未分化状态的方法可用于细胞培养方法中。作为本发明的一个方式，提供一种用于将多能干细胞以未分化状态进行培养的细胞培养方法，其包含下述工序：
(a)对收纳有未分化状态的多能干细胞及培养基的培养容器进行温育的工序，
(b)在工序(a)结束后，对所述培养容器进行培养基更换的工序，
(c)向工序(b)中回收的温育完毕的培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据的工序，和
(d)通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞是否为未分化状态的工序，
所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
根据本发明，能够在不破坏多能干细胞的情况下判定其未分化状态，如果通过该方法判定为未分化的细胞，则继续培养，而如果判定为开始了分化的细胞，则可以除去。因此，本发明的判定方法可应用于多能干细胞的传代培养方法。
在本发明的传代培养方法中，通过本发明的判定方法判定为开始了分化的细胞的细胞可以作为培养和/或传代所不需要的细胞而除去。在此，不需要的细胞的除去既可以在培养中进行，或者也可以在传代时进行。另外，从进行培养用培养基的分析这样的本发明的特征出发，也可以并用使用光学显微镜等的观察，在培养容器中位置特异性地进行不需要的细胞的除去。培养容器中的位置特异性细胞的剥离/除去例如可以基于WO2015/058841号公报的记载来实施。
将以上说明的分析模型制作步骤及基于分析模型的未分化状态的判定步骤整理示于图1。在分析模型制作步骤中，例如对培养有多能干细胞的培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，接着对得到的吸光度光谱数据标注分化指标信息(作为细胞分化的指标的细胞外代谢物的含量等)，进行标准化、微分处理等前处理。然后，将吸光度光谱数据作为解释变量、将分化指标信息作为目标变量进行多变量分析，制作分析模型。使用如此制作的分析模型预先对未分化状态进行评分，进行未知样品(受试培养用培养基)的吸收光谱测定，经过标准化、微分处理等前处理，基于分析模型算出未知样品的未分化状态的判定分数，由此能够判定多能干细胞的未分化状态。如果得到与以前制作的分析模型相比评价更高的分析模型，则可以进行更新等适当地重构模型。
接着，参照图2，对用于判定本发明的一个实施方式的多能干细胞的未分化状态的细胞培养装置进行说明。图2是表示本发明的一个实施方式的装置的构成的概略图。在图2中，用实线表示布线的连接，用虚线表示照射到培养用培养基的波长光。
本实施方式的装置1是判定多能干细胞的未分化状态的装置。装置1将基于细胞形态观察的细胞状态判定与基于细胞培养中使用的培养基的成分分析的细胞状态判定并用，一边判定多能干细胞是否为未分化状态(根据需要，一边将提供该判定确定的开始了分化的细胞除去)一边培养多能干细胞，由此能够将多能干细胞以未分化状态培养。
如图2所示，装置1可构成为具备照射部2、检测部3、控制部4、输入部5、输出部6、数据分析部7。以下，对各要素进行说明。
照射部2具有将来自UV灯、LED等光源8的波长光(波长190nm～2500nm的整个范围或其一部分范围)引导至测定对象试样9的功能。照射部2也可以设置探头。探头例如可采用选择光纤等的光纤探头、介由光纤向测定对象(试样)投光的构成。
另外，也可采用将从光源8发出的光直接照射到作为测定对象的试样的构成，在该情况下不需要探头，光源作为照射部发挥功能。
如上所述，如果制作分析模型，则确定通过该分析模型判定未分化状态所需的波长光。本装置通过采用对试样照射如此确定的一个或多个波长区域的构成，能够使装置构成更加简单化。
本装置1在照射部2中还具备分光器10。对于图2那样的在向培养用培养基照射之前通过分光器进行分光的前分光方式而言，有利用棱镜一次性同时对来自光源8的光进行分光的方法、和通过使衍射光栅的狭缝间隔变化而使波长连续地变化的方法。在后者的方法的情况下，通过以规定的波长宽度分解来自光源8的光，将连续地使波长变化得到的连续波长光照射到培养用培养基。例如，可以将230～300nm的范围的波长光以0.1nm的波长分辨率分解，将波长每次连续变化0.1nm而得到的光照射到培养用培养基。需要说明的是，在图2中采用了前分光方式，但也可以采用在照射培养用培养基后进行分光的后分光方式，该方式也包含在本发明的方式中。上述分光器10可以由公知的单元构成。
另外，本装置1还具备检测部3，其对从照射部2照射到培养用培养基的波长光的反射光、透射光或透射反射光进行检测。检测方法有3种，有反射光检测、透射光检测以及透射反射光检测。反射光检测和透射光检测分别通过检测器检测来自测定对象物的反射光和透射光。透射反射光检测检测入射光入射到测定对象物内后的折射光在物体内反射、再次出射到物体外的光。本装置的检测部3可以采用反射光检测、透射光检测以及透射反射光检测中的任一种检测方式。
在检测部3中，作为检测照射到培养用培养基的波长光的反射光、透射光或者透射反射光的检测装置，例如可以使用作为半导体元件的CCD(Charge Coupled Device：电荷耦合器件)等，当然并不限定于此，也可以使用其他的受光元件。
虽未图示，但检测部3也可以设置容纳有用于培养多能干细胞的培养用培养基的容器的培养容器设置部、用于温育培养容器的温育部、用于培养基更换的培养基更换部一体或分体地构成。培养容器设置部、温育部、培养基更换部可基于专利文献2等中记载的公知技术来设置。
从检测部得到按波长分类的吸光度即吸光度光谱数据。数据分析部按照来自后述的控制部4的指示信号，根据吸光度光谱数据制作分析模型，进而使用所制作的分析模型，进行培养在受试培养用培养基中的未分化细胞的分化状态的判定。
控制部4能够控制照射部2(光源8以及分光器10)、检测部3的动作，控制测定(受光)的时机、光源的强度等。控制部4例如由具备CPU、RAM、ROM等的计算机构成，基于细胞培养装置1中存储的各种数据、各种程序等进行各种处理。
输入部5例如由操作者操作的键盘、鼠标等指示设备构成，输入来自操作者的指示(例如处理的开始指示、处理结果的显示指示等)、各处理所需的数据的输入等各种操作信号。所输入的数据由控制部4存储。
输出部6例如由显示器等构成，输出通过各种单元获得或分析的结果(例如未分化细胞的分化状态的分析结果等)。特别是，输出部6显示数据分析部7中的分析结果。具体而言，显示从通过分析模型分析的结果得到的分化状态等。在定性模型的情况下，基于其类别判别结果，进行“分化的”、“分化的可能性高”、“分化的可能性低”、“分化的程度高”、“分化的程度低”、“未分化状态”等这些的显示。其中，在将本装置小型化的情况下，优选将输出部6设为液晶等平板显示器。
数据分析部7例如由主存储部11、辅助存储部12、运算处理部13构成。特别是，主存储部11由RAM(Random Access Memory：随机存取存储器)等构成，暂时保存测定程序和数据。更具体而言，主存储部11记录在检测部3接收到的光的强度。辅助存储部12是HDD(HardDisk Drive：硬盘驱动器)等，例如能够记录与主存储部11相同的数据，此外记录运算处理部13所制作的分析模型、判定结果等。运算处理部13是CPU(Central Processing Unit：中央处理单元)等，基于从主存储部11、辅助存储部12供给的数据以及程序，进行分析模型的制作、多能干细胞的未分化状态的判定等运算处理。需要说明的是，分析模型也可以预先准备定量模型、定性模型等多个分析模型，根据进行定量评价还是进行定性评价，使用不同的分析模型。
如上所述，本装置1能够用于多能干细胞的未分化状态的判定。此处，多能干细胞的未分化状态的判定并不限于单纯地是否为未分化状态的判定，还包含分化度(未分化状态的程度)、分化的进展度的定量评价、分化风险的评价判定等与多能干细胞的分化状态相关的各种判定。
另外，根据本发明的一个实施方式，提供以下的(1)～(21)。
(1)一种判定多能干细胞的未分化状态的方法，其包含下述工序：，向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据的工序，及
通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态的工序；
其中，所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
(2)根据(1)所述的判定方法，其中，所述多种分化诱导培养基含有向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化的分化诱导培养基而成。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由SB431542、Noggin、Dorsomorphin、CKI-7和VEGF组成的组中的至少一种分化诱导剂而成。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由BMP4、视黄酸和SCF组成的组中的至少一种分化诱导剂而成。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，向所述内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由Activin-A、Wnt-3a、BMP4、CHIR99021和Wortmannin组成的组中的至少一种分化诱导剂而成。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的判定方法，其为非侵袭性地判定多能干细胞的未分化状态的方法。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的判定方法，其中，所述分析模型将多种对照培养用培养基对波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光的吸光度光谱数据作为解释变量。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，所述分析模型将多种对照培养用培养基中的细胞外代谢物的含量作为目标变量。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，所述细胞外代谢物为选自由L-谷氨酸、L-丙氨酸、氨、鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、2-羟基丁酸、2-羟基戊酸、3-羟基戊酸、2-羟基异戊酸、3-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸和核糖酸组成的组中的至少一种。
(10)根据(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，所述分析模型通过PLS法的回归分析来制作。
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的方法，其中，所述受试培养用培养基和对照培养用培养基是通过培养基更换而更换得到的使用过的培养用培养基。
(12)根据(11)所述的方法，其中，培养基更换的时间周期为24～48小时。
(13)一种程序，其用于使计算机执行(1)～(12)中任一项所述的方法。
(14)一种计算机可读记录介质，其记录有(13)所述的程序。
(15)一种计算机，其在内部存储装置中记录有(13)所述的程序。
(16)一种多能干细胞的未分化状态的自动判定系统，其具备(15)所述的计算机。
(17)一种多能干细胞的传代培养方法，其包含回收传代所需的细胞的工序、和除去培养和/或传代所不需要的细胞的工序而成，其中，传代所需的细胞是通过(1)～(12)中任一项所述的判定方法判定为未分化的细胞的多能干细胞，培养和/或传代所不需要的细胞是通过(1)～(12)中任一项所述的判定方法判定为开始了分化的细胞的多能干细胞。
(18)一种用于将多能干细胞以未分化状态培养的细胞培养方法，其包含下述工序：
(a)对收纳有未分化状态的多能干细胞及培养基的培养容器进行温育的工序，
(b)在工序(a)结束后，对所述培养容器进行培养基更换的工序，
(c)向工序(b)中回收的温育完毕的培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据的工序，和
(d)通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞是否为未分化状态的工序，
所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
(19)一种多能干细胞的未分化状态的判定装置，其具备：
照射部，其用于向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，
检测部，其用于检测照射到所述试样的光的反射光、透射光或透射反射光，
数据分析部，其通过基于使用多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或特定波长的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态；
所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
(20)根据(19)所述的装置，其还具备在照射前或照射后进行分光的分光部。
(21)根据(19)或(20)所述的装置，其中，所述数据分析部使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基来制作分析模型。
实施例
以下，根据具体的实施例详细地说明本发明，但不应理解为本发明受实施例的特定方式的限制。应理解为本发明包括实施例中公开的发明的所有改变和变更。
实施例1：对多能干细胞的未分化状态与培养用培养基成分的关系的研究
以下，对利用本发明方法评价细胞的分化状态的一个实施例进行说明。
图3是表示用于回收本实施例的细胞分化状态的评价模型制作用的培养用培养基样品的实施顺序的示意图。
在本实施例中，使用人iPS细胞株PFX#9。另外，将对人iPS细胞株赋予分化诱导刺激的细胞作为受试细胞，将未对人iPS细胞株赋予分化诱导刺激的细胞(即维持了未分化状态的细胞)作为对照细胞。以下，对本实施例中的从细胞培养到培养用培养基样品(培养上清液)的分析为止的顺序进行说明。
按照以下的顺序准备对照细胞及其培养用培养基样品。
[对照细胞的培养及培养上清液的回收]
将上述PFX#9株接种于实施了波连蛋白-N(Vitronectin-N，Life Technologies公司)涂层的3片培养皿(直径为60mm)中进行培养(图1A中，为了简化仅示出了一个培养皿)。作为维持培养基，使用TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司)，每天进行培养基的更换。将进行了细胞的接种(传代)的那天记为第0天(day 0)，持续培养至第7天(day 7)，将各天的培养基更换时从培养皿回收的培养用培养基作为质谱分析用样品。
按照以下顺序从对照细胞获得诱导为外胚层细胞、中胚层细胞、内胚层细胞的细胞及其培养用培养基样品。
[外胚层分化细胞的培养及培养用培养基的回收]
将上述PFX#9株接种于实施了波连蛋白-N涂层的3片培养皿(直径为60mm)中进行培养(图3中，为了简化仅示出了一个培养皿)。作为培养基，使用TeSR-E8，每天进行培养基的更换，继续培养至达到满铺。将进行传代的那天记为第0天，第1天以后更换为添加有外胚层分化诱导因子(SB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide，和光纯药工业株式会社)和Noggin(PeproTech公司))的终浓度分别达到10μM、500ng/mL的培养基，由此进行外胚层分化诱导刺激。将进行细胞的接种(传代)的那天记为第0天(day 0)，持续培养至第7天(day 7)，将各天的培养基更换时从培养皿回收的培养用培养基作为质谱分析用样品。
[中胚层分化细胞的培养及培养用培养基的回收]
将上述PFX#9株接种于实施了波连蛋白-N涂层的3片培养皿(直径为60mm)中进行培养(图3中，为了简化仅示出了一个培养皿)。作为培养基，使用TeSR-E8，每天进行培养基的更换，继续培养至达到满铺。将进行传代的那天记为第0天，第1天以后更换为添加有中胚层分化诱导因子(BMP-4)的终浓度达到40ng/mL的培养基，由此进行中胚层分化诱导刺激。将进行细胞的接种(传代)的那天记为第0天(day 0)，持续培养至第7天(day 7)，将各天的培养基更换时从培养皿回收的培养用培养基作为质谱分析用样品。
[内胚层分化细胞的培养及培养用培养基的回收]
将上述PFX#9株接种于实施了波连蛋白-N涂层的3片培养皿(直径为60mm)中进行培养(图3中，为了简化仅示出了一个培养皿)。作为培养基，使用TeSR-E8，每天进行培养基的更换，继续培养至达到满铺。将进行传代的那天记为第0天，第1天以后更换为添加有内胚层分化诱导因子(激活素-A(Activin-A，PeproTech公司)、Wnt3a(Wingless-type MMTVintegration site family，PeproTech公司)、BMP-4(Bone Morphogenetic proteins-4，骨形态发生蛋白，PeproTech公司))的终浓度分别达到100ng/mL、40ng/mL、0.5ng/mL的培养基。在第2天以后，通过更换为添加有激活素-A和BMP-4的终浓度分别达到100ng/mL、0.5ng/mL的培养基，进行内胚层分化诱导刺激。将进行细胞的接种(传代)的那天记为第0天(day0)，持续培养至第7天(day 7)，将各天的培养基更换时从培养皿回收的培养用培养基作为分析用样品。
[培养用培养基的UV光谱测定]
关于得到的各培养用培养基样品，使用UV测定装置(UltroSpec 3300pro.GEHealthcare公司)测定波长240nm～300nm的UV光谱，使用R version 3.3(pps：//www.r-project.org/)进行二次微分处理。得到的UV光谱如图4A所示，进行二次微分处理的结果如图4B所示。即，图4A是一并表示对照细胞的培养用培养基、外胚层分化细胞的培养用培养基、中胚层分化细胞的培养用培养基和内胚层分化细胞的培养用培养基的0～7天的UV测定结果的图，图4B是进行了其二次微分处理的结果。
[目标代谢物(次黄嘌呤)的LC-MS测定]
另外，对得到的各培养用培养基样品按照以下的顺序，通过LC-MS测定来测定次黄嘌呤浓度。
在上述样品100μL中添加作为内部标准物质的0.5mM异丙基苹果酸水溶液20μL，混合后，添加200μL乙腈进行除蛋白。然后，将样品离心分离(15000rpm、室温、15分钟)，回收上清液，用超纯水(Milli-Q(注册商标)水、Merck株式会社)稀释10倍，供于LC-MS分析。在LC-MS分析中，按照收录在岛津制作所制的“LC/MS/MS方法包细胞培养分析”(以下简称为“MP”)中的分析条件。MP汇集了用于利用LC-MS分析培养基中所含的化合物和由细胞分泌的代谢物的分析条件参数。化合物的鉴定以在MP中登记的标准品的保持时间与样品中的化合物的保持时间之差在±0.3分钟以内、检测出定量离子、确认离子的两峰、强度值为1000以上为基准进行。另外，化合物的定量通过对样品中的各化合物的特征性离子(定量离子)算出质谱图的面积的方法来实施。
得到的次黄嘌呤浓度的结果如图5所记载。
[基于PLS法的模型分析]
将得到的UV光谱数据作为解释变量，将次黄嘌呤为目标变量，使用R version3.1.3(https：//www.r-project.org/)，通过PLS-R(Partial Least Squares Regression)制作A)仅使用了对照细胞的培养第1天～第7天的样品的模型、B)使用了对象细胞和诱导为各胚层的细胞的培养第1天～第7天的样品的模型这2种。
A中得到的预测值相关图是图6，B中得到的预测值相关图如图7所示。在图6和图7中，纵轴是预测值，横轴是实测值。使用通过PLS分析得到的分析模型，高精度地预测了各生化物质的量。图6中，预测值和实测值的决定系数为0.59，与此相对，图7的模型中，决定系数为0.91，可见大幅度的提高。
另外，如图8所示，基于本实验中得到的培养第4天～第7天的数据制作PLA判别分析(PLA-DA)模型。可知通过PLA-DA模型仅根据培养用培养基的分光信息即可监测多能干细胞的未分化状态。
符号说明
1 细胞培养装置
2 照射部
3 检测部
4 控制部
5 输入部
6 输出部
7 数据分析部
8 光源
9 试样
10 分光器
11 主存储部
12 辅助存储部
13 运算处理部

Claims (16)

1.一种判定多能干细胞的未分化状态的方法，其包含下述工序：，
向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，检测其反射光、透射光或透射反射光，得到吸光度光谱数据的工序，及
通过基于使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或其一部分范围的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态的工序；
其中，所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种分化诱导培养基含有向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化的分化诱导培养基而成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由SB431542、Noggin、Dorsomorphin、CKI-7和VEGF组成的组中的至少一种添加因子而成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由BMP4、视黄酸和SCF组成的组中的至少一种添加因子而成。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述向所述内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基包含选自由Activin-A、Wnt-3a、BMP4、CHIR99021和Wortmannin组成的组中的至少一种添加因子而成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其为非侵袭性地判定多能干细胞的未分化状态的方法。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述分析模型将多种对照培养用培养基对波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光的吸光度光谱数据作为解释变量。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述分析模型将多种对照培养用培养基中的细胞外代谢物的含量作为目标变量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞外代谢物为选自由L-谷氨酸、L-丙氨酸、氨、鸟氨酸、2-氨基己二酸、脱氧胞苷、谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸、次黄嘌呤、尿苷、2-羟基丁酸、2-羟基戊酸、3-羟基戊酸、2-羟基异戊酸、3-羟基异戊酸、尿素、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸和核糖酸组成的组中的至少一种。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述分析模型通过PLS法的回归分析来制作。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述受试培养用培养基和对照培养用培养基是通过培养基更换而更换得到的使用过的培养用培养基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，培养基更换的时间周期为24～48小时。
13.一种多能干细胞的传代培养方法，其包含回收传代所需的细胞的工序、和除去培养和/或传代所不需要的细胞的工序而成，其中，传代所需的细胞是通过权利要求1～12中任一项所述的判定方法判定为未分化的细胞的多能干细胞，培养和/或传代所不需要的细胞是通过权利要求1～12中任一项所述的判定方法判定为开始了分化的细胞的多能干细胞。
14.一种细胞培养装置，其具备：
照射部，其用于向培养多能干细胞的受试培养用培养基照射波长190nm～2500nm的范围或其一部分范围的波长光，
检测部，其用于检测照射到所述试样的波长光的反射光、透射光或透射反射光，
数据分析部，其通过基于使用多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基预先制作的分析模型，对所述吸光度光谱数据中的测定全波长或特定波长的吸光度进行分析，判定多能干细胞的未分化状态；
所述多种对照培养用培养基含有：
用于维持多能干细胞的未分化状态的培养基，和
选自由向外胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基、向中胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基以及向内胚层系细胞分化诱导的分化诱导培养基组成的组中的一种以上的分化诱导培养基。
15.根据权利要求14所述的装置，其还具备在照射前或照射后进行分光的分光部。
16.根据权利要求14或15所述的装置，其中，所述数据分析部使用在多能干细胞的培养中使用的多种对照培养用培养基来制作分析模型。
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